CN112679571A

CN112679571A - 一种罗汉果醇衍生物单体、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN112679571A
Application number: CN202011549094.XA
Authority: CN
Inventors: 宋静茹; 李典鹏
Original assignee: Guangxi Institute of Botany of CAS
Current assignee: Guangxi Institute of Botany of CAS
Priority date: 2020-12-24
Filing date: 2020-12-24
Publication date: 2021-04-20

Abstract

本发明公开了一种罗汉果醇衍生物单体、其制备方法及应用，属于植物活性成分结构改造技术领域。所述罗汉果醇衍生物单体，其为式2所示的化合物，

本发明还公开了上述罗汉果醇衍生物单体的制备方法及应用。本发明的罗汉果醇衍生物单体，在保持罗汉果醇四环母核上各位点手性及功能基团不变的前体下，选择性将罗汉果醇的C‑24位衍生为单一羧基，而羧基的高反应活性便于进一步的衍生化。

Description

一种罗汉果醇衍生物单体、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种罗汉果醇衍生物单体、其制备方法及应用，属于植物活性成分结构改造技术领域。

背景技术

罗汉果，学名Siraitia grosvenorii(Swingle.)C.Jeffrey，葫芦科多年生藤本植物的干燥果实，具有润肺通便、止咳化痰的功效。罗汉果醇，英文名称mogrol，是罗汉果皂苷ⅠA1、ⅠE1、ⅡE、Ⅲ、Ⅳ、ⅣE、Ⅴ和赛门苷I等的母核苷元，属葫芦烷型四环三萜，该类三萜由于多羟基、高氧化、空间效应等因素造成化学修饰较难开展。

罗汉果醇是罗汉果体内代谢后的入血产物。在现有的研究中，利用罗汉果醇C-24,25位的邻羟基结构可以利用高碘酸氧化得到C-24位醛基的中间产物，进而利用醛基的反应活性制备胺基衍生产物。但是，由于天然产物的结构复杂性，相较于小分子反应，罗汉果醇C-24位醛基在各类型化学反应中的活性表现不佳，反应类型多有受限，因而限制了结构衍生的多样化。而羧基在天然三萜的结构修饰中有更广泛的应用。但纵观为数不多的罗汉果醇的结构改造，目前还没有羧基类化合物的合成方法及抗炎功效的研究。

发明内容

本发明的目的之一，是提供一种新结构的罗汉果醇衍生物单体。本发明的罗汉果醇衍生物单体，在保持罗汉果醇四环母核上各位点手性及功能基团不变的前体下，选择性将罗汉果醇的C-24位衍生为单一羧基，而羧基的高反应活性便于进一步的衍生化。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种罗汉果醇衍生物单体，其为式2所示的化合物，

本发明的罗汉果醇衍生物单体的有益效果是：

本发明的罗汉果醇衍生物单体，在保持罗汉果醇四环母核上各位点手性及功能基团不变的前体下，选择性将罗汉果醇的C-24位衍生为单一羧基，而羧基的高反应活性便于进一步的衍生化。

本发明的目的之二，是提供上述罗汉果醇衍生物单体的制备方法。本发明的方法选取了便宜易得的氧化剂来源，在较温和的反应条件下制得羧基单体。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种上述罗汉果醇衍生物单体的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：制备中间产物M-1

取罗汉果醇1.5g-3.0g，溶解于15mL-50mL丙酮中，加入15mL-50mL纯水，升温至40℃-60℃搅拌5min-15min,得到罗汉果醇溶液；

取15mL-30mL丙酮、15mL-30mL纯水和0.3mL-1.0mL乙酸，混合均匀后，得到混合液A；

取1.5g-3.0g高碘酸钠，溶解于上述混合液A中，混合均匀后，得到混合液B；

将上述混合B缓慢滴加至上述罗汉果醇溶液中，滴加完毕后于40℃-60℃避光反应16h-30h，降至室温，减压除去丙酮后，萃取，有机相经干燥后浓缩，再硅胶柱色谱分离，得到如式1所示的中间产物M-1；

步骤2：制备罗汉果醇衍生物单体

在室温下，将0.7g-2.0g步骤1得到的中间产物M-1溶解在10mL-20mL叔丁醇中，随后加入2mL-7mL的2-甲基-2-丁烯，得到混合液C；

将0.7-2.5g亚氯酸钠和1.2g-4.0g二水合磷酸二氢钠溶解于20mL-40mL纯水中，得到混合液D；

将上述混合物D缓慢滴加至所述混合液C中，薄层色谱跟踪反应进度至反应结束，反应混合液经淬灭、萃取、干燥、浓缩与硅胶柱色谱分离，得到如式2所示的单体M-2，即为罗汉果醇衍生物单体，

本发明的罗汉果醇衍生物单体的制备方法的原理是：

第一点，本发明的步骤1中，罗汉果醇，分子式为C₃₀H₅₂O₄，分子量为476.3866，CAS号为88930-15-8。本发明的罗汉果醇可以市售购买，如可以购自德思特生物技术有限公司，纯度>98％。中间产物M-1，分子式为C₂₇H₄₄O₃，分子量为416.3290。本发明的步骤1以罗汉果醇为原料，经氧化裂解，制备得到中间产物M-1。该中间产物M-1的纯度>98％，可以更有利于后续步骤2中制备罗汉果醇衍生物单体。

其中，将上述混合B缓慢滴加至上述罗汉果醇溶液中，是指在30min时间内滴加完毕。室温，是指20℃-30℃的环境温度。

第二点，本发明的步骤2中，亚氯酸钠为氧化剂，磷酸二氢钠为缓冲剂，过量2-甲基-2-丁烯为反应助剂，选择叔丁醇与纯水的混合液为反应溶剂，室温下完成对醛基的选择性氧化。

本发明的罗汉果醇衍生物单体的制备方法的有益效果是：

(1)本发明首先利用高碘酸钠氧化裂解市售罗汉果醇得C-24位醛基中间产物M-1，再经本发明选取的氧化条件在对M-1无任何保护的条件下选择性氧化为羧基单体M-2。

(2)本发明的制备方法反应条件温和，操作简单，氧化剂便宜易得，成本低廉，适合规模化推广应用。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，步骤1中，所述萃取采用二氯甲烷、三氯甲烷和乙酸乙酯中的任意一种。

采用上述进一步的有益效果是：采用上述溶剂，可以使有机物充分的溶解于有机相中，除去各种无机盐，以达到分离的目的。

进一步，步骤1中，所述干燥采用无水硫酸钠或者无水硫酸镁。

采用上述进一步的有益效果是：将有机相中的极少量水分充分干燥，以方便进一步的柱色谱分离。

进一步，步骤1中，所述浓缩是采用旋转蒸发仪浓缩至5mL。

采用上述进一步的有益效果是：可以将萃取的有机溶液浓缩，以满足硅胶柱色谱分离上柱量。

进一步，步骤1中，所述硅胶柱色谱分离采用的硅胶为200目-300目，采用的洗脱剂为二氯甲烷与乙酸乙酯按体积比为4:1组成的混合液。

采用上述进一步的有益效果是：从反应混合物中快速有效的分离纯化出中间产物M-1。

进一步，步骤2中，所述薄层色谱的条件为：硅胶GF₂₅₄板，展开剂为二氯甲烷与甲醇按体积比20:1组成的混合液，显色剂喷雾显色，原料点消失即为反应完全。

采用上述进一步的有益效果是：采用上述参数，可以有效跟踪反应进程，及时知晓反应进度。

更进一步，所述显色剂为浓硫酸与无水乙醇按照体积比5:95组成的混合液，所述浓硫酸的体积浓度为98％。

进一步，步骤2中，所述淬灭采用饱和氯化铵水溶液。

采用上述进一步的有益效果是：氯化铵作为强酸弱碱盐，在安全缓慢的淬灭氧化剂的同时可以避免对其它化学基团造成影响，且能够减少对固体的吸附，从而使萃取液两相分层更清晰。

进一步，步骤2中，所述萃取采用二氯甲烷、三氯甲烷和乙酸乙酯中的任意一种。

进一步，步骤2中，所述干燥采用无水硫酸钠或者无水硫酸镁。

采用上述进一步的有益效果是：将有机相中的极少量水分充分干燥，以方便进一步的硅胶柱色谱分离。

进一步，步骤2中，所述浓缩采用旋转蒸发仪浓缩至5mL。

进一步，步骤2中，所述硅胶柱色谱分离采用的填充材料为200目-300目的硅胶，采用的洗脱剂为二氯甲烷与甲醇按体积比为20:1组成的混合液。

采用上述进一步的有益效果是：采用上述参数的硅胶柱色谱分离，可以将式2所示的罗汉果醇衍生物单体M-2从反应后所得的混合物中分离纯化出来。

本发明的目的之三，是提供一种上述罗汉果醇衍生物单体在制备抗炎产品中的应用。本发明的上述罗汉果醇衍生物单体可以用于制备抗炎产品，具有广阔的市场空间。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述罗汉果醇衍生物单体在制备抗炎产品中的应用。

本发明进行了罗汉果醇衍生物单体对NO释放抑制作用研究。结果显示，在单体浓度为10μM时，巨噬细胞RAW 264.7的增值率达到89.6％，说明该浓度下对巨噬细胞基本无毒。对比LPS对照组(NO释放量18.351μmol/L)，加药组显著减少了由LPS诱导的RAW 264.7细胞的NO释放(10.928μmol/L)，显示出较好的抑制NO释放的作用。由此可见，本发明得到的罗汉果醇衍生物单体在抗炎产品的开发与应用具有广阔的前景。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述抗炎产品的剂型为口服制剂、膏剂、糊剂、涂剂、凝胶剂、涂剂和喷雾剂中的任意一种。

采用上述进一步的有益效果是：根据产品自身的性能和消费者的需求，本发明的抗炎产品可以制备成多种剂型以满足不同的用药要求。为实现上述抗炎产品剂型，需在制备这些产品时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂或增量剂、抗菌剂、等渗剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、胶粘剂、保湿剂、赋形剂、软化剂、惰性稀释剂等。填充剂或增量剂包括：淀粉、乳糖、甘露糖醇、甲壳素、蔗糖、葡萄糖、硅酸等，抗菌剂包括：苯酚、山梨酸、三氯叔丁醇等，等渗剂包括：各种糖类、氯化钠等，崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、琼脂、碳酸钙、交联羧甲基纤维素纳等，润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等，助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等，粘合剂包括：水、乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、明胶溶液、蔗糖溶液、聚乙烯比咯烷酮等，甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸、罗汉果甜苷等，矫味剂包括：甜味剂及各种香精，胶粘剂包括明胶、淀粉、琼脂、甘露聚糖、海藻酸、聚丙烯酸及其盐类、糊精、甲基纤维素、甲基乙烯基醚、顺丁烯二酸酐的共聚物、阿拉伯胶、西黄芪胶、梧桐胶、槐树豆胶等，保湿剂包括乙二醇、二甘醇、聚乙二醇、甘油、山梨醇、丙二醇等，赋形剂包括高岭土、粘土、滑石粉、碳酸钙、氧化锌等，软化剂包括蓖麻油及其它油脂等，惰性稀释剂包括：水、乙醇、丙二醇、玉米油、蓖麻油、橄榄油、花生油、甘油、聚乙二醇、及上述试剂的混合物等。

附图说明

图1为本发明实施例1制备得到的罗汉果醇衍生物单体的氢谱图。

图2为本发明实施例1制备得到的罗汉果醇衍生物单体的碳谱图。

图3为本发明实施例1制备得到的罗汉果醇衍生物单体的阳离子质谱图。

图4为本发明实施例1制备得到的罗汉果醇衍生物单体的阴离子质谱图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

本实施例的罗汉果醇衍生物单体的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：制备中间产物M-1

取罗汉果醇1.5g，溶解于15mL丙酮中，加入15mL纯水，升温至40℃搅拌5min,得到罗汉果醇溶液。

取15mL丙酮、15mL纯水和0.3mL乙酸，混合均匀后，得到混合液A。

取1.5g高碘酸钠，溶解于上述混合液A中，混合均匀后，得到混合液B。

将上述混合B缓慢滴加至上述罗汉果醇溶液中，滴加完毕后于40℃避光反应16h，降至20℃室温，减压除去丙酮后，乙酸乙酯萃取两次，第一次的用量为20mL，第二次的用量为10mL，有机相经无水硫酸钠后，旋转蒸发仪浓缩至5mL，再硅胶柱色谱分离，所述硅胶柱色谱分离采用的硅胶为200目，采用的洗脱剂为二氯甲烷与乙酸乙酯按体积比为4:1组成的混合液，分离得到0.72g中间产物M-1，分离收率55％。

中间产物M-1结构鉴定：白色粉末，m/z为416.3290，分子式为C₂₇H₄₄O₃。¹H-NMR(500MHz,CDCl₃)δ9.69(s,1H),5.50(d,J＝5.0Hz,1H),3.85(dd,J₁＝11.0Hz,J₂＝5.0Hz,1H),3.39(s,1H),2.41-2.27(m,4H),2.16(d,J＝13.0Hz,1H),1.92-1.82(m,2H),1.76-1.72(m,4H),1.60(d,J＝7.0Hz,1H),1.48-1.56(m,1H),1.40-1.36(m,2H),1.25-1.11(m,5H),1.07(s,3H),1.05(s,3H),0.99(s,3H),0.85(d,J＝6.5Hz,3H),0.81(s,3H),0.76(s,3H)；¹³C-NMR(125MHz,CDCl₃)δ203.1,142.0,121.0,78.7,76.4,50.1,49.4,47.2,43.0,42.00,41.1,40.1,39.7,35.7,35.5,34.1,29.2,28.2,27.9,26.4,25.8,25.7,25.4,24.1,19.0,18.4,16.7。

结构式如式1所示。

步骤2：制备罗汉果醇衍生物单体

在20℃室温下，将0.72g步骤1得到的中间产物M-1溶解在10mL叔丁醇中，随后加入2mL的2-甲基-2-丁烯，得到混合液C。

将0.70g亚氯酸钠和1.2g二水合磷酸二氢钠溶解于20mL纯水中，得到混合液D。

将上述混合物D缓慢滴加至所述混合液C中，薄层色谱跟踪反应进度至反应结束。所述薄层色谱的条件为：硅胶GF₂₅₄板，展开剂为二氯甲烷与甲醇按体积比20:1组成的混合液，以浓硫酸与无水乙醇按照体积比5:95组成的混合液为显色剂，所述浓硫酸的体积浓度为98％，喷雾显色，原料点消失即为反应完全。

反应混合液经5mL饱和氯化铵水溶液淬灭，乙酸乙酯萃取两次，第一次的用量为20mL，第二次的用量为10mL，无水硫酸钠干燥、旋转蒸发仪浓缩至5mL，再硅胶柱色谱分离，所述硅胶柱色谱分离采用的填充材料为200目的硅胶，采用的洗脱剂为二氯甲烷与甲醇按体积比为20:1组成的混合液，得到0.71g单体M-2，分离收率94.5％。

单体M-2结构鉴定：白色粉末，m/z为432.3240，分子式为C₂₇H₄₄O₄。¹H－NMR和¹³C-NMR数据如表1所示。

表1 M-2的¹H－NMR和¹³C-NMR数据(氘代氯仿，500MHz核磁仪)

结构式如式2所示，即为罗汉果醇衍生物单体。

本实施例还提供上述罗汉果醇衍生物单体在制备抗炎产品中的应用。

所述抗炎产品的剂型为口服制剂、膏剂、糊剂、涂剂、凝胶剂、涂剂和喷雾剂中的任意一种。

实施例2

步骤1：制备中间产物M-1

取罗汉果醇2.5g，溶解于30mL丙酮中，加入30mL纯水，升温至60℃搅拌10min,得到罗汉果醇溶液；

取20mL丙酮、20mL纯水和0.6mL乙酸，混合均匀后，得到混合液A。

取2.5g高碘酸钠，溶解于上述混合液A中，混合均匀后，得到混合液B。

将上述混合B缓慢滴加至上述罗汉果醇溶液中，滴加完毕后于60℃避光反应24h，降至25℃室温，减压除去丙酮后，二氯甲烷萃取两次，第一次的用量为25mL，第二次的用量为10mL，有机相经无水硫酸钠后，旋转蒸发仪浓缩至5mL，再硅胶柱色谱分离，所述硅胶柱色谱分离采用的硅胶为300目，采用的洗脱剂为二氯甲烷与乙酸乙酯按体积比为4:1组成的混合液，分离得到1.9g如式1所示的中间产物M-1，分离收率87％。

步骤2：制备罗汉果醇衍生物单体

在25℃室温下，将1.3g步骤1得到的中间产物M-1溶解在15mL叔丁醇中，随后加入5mL的2-甲基-2-丁烯，得到混合液C。

将1.3g亚氯酸钠和2.2g二水合磷酸二氢钠溶解于30mL纯水中，得到混合液D。

反应混合液经5mL饱和氯化铵水溶液淬灭，二氯甲烷萃取两次，第一次的用量为20mL，第二次的用量为10mL，无水硫酸钠干燥、旋转蒸发仪浓缩至5mL、再硅胶柱色谱分离，所述硅胶柱色谱分离采用的填充材料为300目的硅胶，采用的洗脱剂为二氯甲烷与甲醇按体积比为20:1组成的混合液，得到1.303g罗汉果醇衍生物单体M-2，分离收率96.6％。

结构鉴定，同实施例1。

实施例3

步骤1：制备中间产物M-1

取罗汉果醇3.0g，溶解于50mL丙酮中，加入50mL纯水，升温至60℃搅拌15min,得到罗汉果醇溶液。

取30m丙酮、30mL纯水和1.0mL乙酸，混合均匀后，得到混合液A。

取3.0g高碘酸钠，溶解于上述混合液A中，混合均匀后，得到混合液B。

将上述混合B缓慢滴加至上述罗汉果醇溶液中，滴加完毕后于60℃避光反应30h，降至30℃室温，减压除去丙酮后，三氯甲烷萃取两次，第一次的用量为20mL，第二次的用量为10mL，有机相经无水硫酸钠后，旋转蒸发仪浓缩至5mL，再硅胶柱色谱分离，所述硅胶柱色谱分离采用的硅胶为200目，采用的洗脱剂为二氯甲烷与乙酸乙酯按体积比为4:1组成的混合液，分离得到2.28g如式1所示的中间产物M-1，分离收率86％。

步骤2：制备罗汉果醇衍生物单体

在30℃室温下，将2.0g步骤1得到的中间产物M-1溶解在20mL叔丁醇中，随后加入7mL的2-甲基-2-丁烯，得到混合液C。

将2.5g亚氯酸钠和4.0g二水合磷酸二氢钠溶解于40mL纯水中，得到混合液D。

反应混合液经5mL饱和氯化铵水溶液淬灭，三氯甲烷萃取两次，第一次的用量为30mL，第二次的用量为20mL，无水硫酸钠干燥、旋转蒸发仪浓缩至5mL，再硅胶柱色谱分离，所述硅胶柱色谱分离采用的填充材料为200目的硅胶，采用的洗脱剂为二氯甲烷与甲醇按体积比为20:1组成的混合液，得到1.99g罗汉果醇衍生物单体M-2，分离收率96.2％。

结构鉴定，同实施例1。

对比例1

现有技术中，是使用弱氧化剂将醛基转化为羧基。但由于天然产物的结构复杂性，常规的试剂不一定能够实现预期氧化效果。对比例1考察了常用的斐林试剂氧化中间产物M-1以制备罗汉果醇羧基衍生物单体M-2的效果。

斐林试剂制备与使用方法：称取6.92g的CuSO₄.5H₂O溶解于40mL纯水中，再加入0.1mL的浓硫酸，纯水稀释定容至100mL，得A液；称取34.6g酒石酸钾钠和10g氢氧化钠，溶解于80mL纯水中，再用纯水稀释定容至100mL，得B液。使用时以铜离子为计量，取等体积的A液与B液混合，直接加入到中间产物M-1的二氯甲烷溶液中。

跟实施例2不同的是，对比例1中，采用现有技术常用的斐林试剂氧化体系，替代实施例1的亚氯酸钠体系，溶剂体系为二氯甲烷和纯水按体积比为1:2组成的混合液。对比例1得到0g罗汉果醇衍生物单体,分离效率为0％。

由此可见，斐林试剂在20℃-30℃的环境温度下不能氧化中间产物M-1。

对比例2

跟实施例2不同的是，对比例2中将反应温度提升至40℃，其余都相同。对比例2得到0g罗汉果醇衍生物单体,分离效率为0％。

由此可见，斐林试剂在40℃下仍不能氧化中间产物M-1。

由此可见，本发明的制备方法反应条件温和，无需高温即可完成对醛基的选择性氧化，且罗汉果醇衍生物单体的分离效率高。

实验例1：罗汉果醇衍生物单体M-2对巨噬细胞RAW 264.7毒性检测

取处于对数生长期生长状态良好的RAW 264.7细胞，以5×10³个/孔，接入96孔板，同时设空白组，37℃培养过夜，在细胞孔周围孔内加入100μL的无菌PBS。按照下列a-d的分组对细胞进行处理，其中a组为空白组，b组为对照组，c组和d组均为药物组。在实施例1得到的罗汉果醇衍生物单体M-2作用12h后，将3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)加入96孔板中，每孔10μL，置于37℃培养箱中反应4h后，弃去上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜，微量振荡器上振荡10min，用酶标仪测定每孔在570nm处的吸光度，计算细胞的增殖率，结果如表2所示。

a组：RAW264.7。

b组：RAW264.7+1μg/mL LPS。

c组：RAW264.7+10μM的实施例1制备得到的M-2。

d组：RAW264.7+40μM的实施例1制备得到的M-2。

表2各组细胞增殖率

	空白组a	对照组b	加药组c	加药组d
					细胞增殖率(％)	100	65.3	89.6	69.6

实验结果表明，罗汉果羧基衍生物单体M-2在10μM浓度时，RAW264.7细胞增值率达到89.6％，远高于对照组的65.3％，说明该浓度下的样品对细胞基本无毒，可以在该浓度下测试抗炎活性。

实验例2：罗汉果醇衍生物单体M-2抑制NO释放检测

1、细胞处理

取处于对数生长期，生长状态良好的RAW 264.7细胞，以5×10³个/孔，接入96孔板，37℃培养过夜，在细胞孔周围孔内加入100μL的无菌PBS。按照下列a-c的分组对细胞进行处理，其中a组为空白组，b组为对照组，c组为加药组。在实施例1得到的罗汉果醇衍生物单体M-2作用12h后加入LPS刺激24h，取上清液用于进一步的NO释放检测。

a组：RAW264.7。

b组：RAW264.7+1μg/mL LPS。

c组：RAW264.7+1μg/mL LPS+10μM的实施例1制备得到的M-2。

2、试剂及配置

NO试剂检测盒，购自南京建成生物工程研究所，货号为A013-2。该试剂盒中自带试剂：

试剂一：液体20mL，4℃保存。

试剂二：液体10mL，4℃保存。

试剂三：液体10mL，4℃避光保存。过饱和溶液，如有晶体析出，60℃以上加热溶解完全后再使用。

试剂四：液体3mL，4℃避光保存。

试剂五：液体3mL，4℃保存。

标准品：液体1mL，1支，亚硝酸钠2mmol/L。

显色剂的配制：按体积试剂三:试剂四:试剂五＝2.5:1:1，现配现用，颜色变深后不可使用。

2、实验操作：实验例2中上清液于3000rpm离心10min，取上清液100μL，加试剂一200μL，混匀，加试剂二100μL，涡旋充分混匀后静置10min，3500rpm，离心15min，取上清液160μL操作。操作按表3所示。

表3操作程序

	空白孔	标准孔	测定孔
				双蒸水(mL)	0.16
20μmol/L亚硝酸钠标准液(mL)		0.16
				上清液(mL)		0.16
显色剂(mL)	0.08	0.08	0.08

混匀，静置15min，550nm比色，酶标仪比色，测各孔OD值,计算NO含量。

活性测试结果如表4。

表4 NO含量结果

	空白组a	对照组b	加药组c
				NO含量(μmol/L)	6.598	18.351	10.928

实验结果证明，罗汉果醇羧基衍生物M-2在10μM浓度下的NO释放量为10.928μmol/L,低于对照组的18.351μmol/L近一倍，说明罗汉果醇羧基衍生物单体能够显著抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞的NO释放，具有一定的抗炎活性。该发明为发现罗汉果系列羧基类抗炎药物提供了有效的方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种罗汉果醇衍生物单体，其特征在于，其为式2所示的化合物，

2.一种罗汉果醇衍生物单体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：制备中间产物M-1

取罗汉果醇1.5g-3g，溶解于15mL-50mL丙酮中，加入15mL-50mL纯水，升温至40℃-60℃搅拌5min-15min,得到罗汉果醇溶液；

取1.5g-3g高碘酸钠，溶解于上述混合液A中，混合均匀后，得到混合液B；

步骤2：制备罗汉果醇衍生物单体

在室温下，将0.7g-2g步骤1得到的中间产物M-1溶解在10mL-20mL叔丁醇中，随后加入2mL-7mL的2-甲基-2-丁烯，得到混合液C；

将0.7g-2.5g亚氯酸钠和1.2g-4.0g二水合磷酸二氢钠溶解20mL-40mL纯水中，得到混合液D；

3.根据权利要求2所述的罗汉果醇衍生物单体的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述萃取采用二氯甲烷、三氯甲烷和乙酸乙酯中的任意一种；所述干燥采用无水硫酸钠或者无水硫酸镁；所述浓缩是采用旋转蒸发仪浓缩至5mL。

4.根据权利要求2所述的罗汉果醇衍生物单体的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述硅胶柱色谱分离采用的硅胶为200目-300目，洗脱剂为二氯甲烷与乙酸乙酯按体积比为4:1组成的混合液。

5.根据权利要求2所述的罗汉果醇衍生物单体的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述薄层色谱的条件为：硅胶GF₂₅₄板，展开剂为二氯甲烷与甲醇按体积比20:1组成的混合液，显色剂喷雾显色，原料点消失即为反应完全。

6.根据权利要求5所述的罗汉果醇衍生物单体的制备方法，其特征在于，所述显色剂为浓硫酸与无水乙醇按照体积比5:95组成的混合液，所述浓硫酸的体积浓度为98％。

7.根据权利要求2所述的罗汉果醇衍生物单体的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述淬灭采用饱和氯化铵水溶液；所述萃取采用二氯甲烷、三氯甲烷和乙酸乙酯中的任意一种；所述干燥采用无水硫酸钠或者无水硫酸镁；所述浓缩采用旋转蒸发仪浓缩至5mL。

8.根据权利要求2-7任一项所述的罗汉果醇衍生物单体的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述硅胶柱色谱分离采用的填充材料为200目-300目的硅胶，采用的洗脱剂为二氯甲烷与甲醇按体积比为20:1组成的混合液。

9.权利要求1所述的罗汉果醇衍生物单体在制备抗炎产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗炎产品的剂型为口服制剂、膏剂、糊剂、涂剂、凝胶剂、涂剂和喷雾剂中的任意一种。