CN113429452A

CN113429452A - 一种作为抗炎剂的罗汉果酸酰化衍生物以及一种抗炎组合物

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Publication number: CN113429452A
Application number: CN202110725387.7A
Authority: CN
Inventors: 李伟; 黄华学; 贺进军; 黄�俊; 宋谷良; 江小龙
Original assignee: Hunan Huacheng Biotech Inc
Current assignee: Hunan Huacheng Biotech Inc
Priority date: 2021-06-29
Filing date: 2021-06-29
Publication date: 2021-09-24
Anticipated expiration: 2041-06-29
Also published as: CN113429452B

Abstract

本发明涉及一种作为抗炎剂的罗汉果酸酰化衍生物和一种抗炎组合物，所述罗汉果酸酰化衍生物为3‑O‑马来酰罗汉果酸甲，化学结构如下式(I)所示。所述抗炎组合物包括式(I)所示罗汉果酸酰化衍生物，花青素、鱼腥草提取物和穿心莲提取物。本发明提供的抗炎组合物能够有效降低大鼠炎性介质水平，对炎性症状有抑制作用，效果和蒲地蓝消炎片接近。

Description

一种作为抗炎剂的罗汉果酸酰化衍生物以及一种抗炎组合物

技术领域

本发明涉及罗汉果酸衍生物技术领域，具体涉及一种作为抗炎剂的罗汉果酸酰化衍生物以及一种抗炎组合物。

背景技术

罗汉果是我国南方特有的一种植物，作为天然甜味剂已经广泛使用，是国家首批批准的“药食两用”材料之一。我国罗汉果鲜果的种植、生产加工以及罗汉果甜苷的终端应用已经颇具规模，且发展迅速。但是目前的生产实际中，对罗汉果的工业化生产利用，主要集中在对罗汉果鲜果中甜苷的提取和分离，主要目标产物是罗汉果甜苷，特别是罗汉果甜苷V，目前已经有很多上市销售的基于罗汉果甜苷V的甜味剂，食品添加剂，饮料等。但是每年对罗汉果采收时，大量的罗汉果根、茎、叶等自然资源并未加以利用，而是当成废弃物处理。由于罗汉果种植和生产加工的规模日益增大，每年都有大量的罗汉果根、茎、叶被废弃。现代科学研究发现，罗汉果根中存在丰富的天然活性成分，包括黄酮类化合物、三萜皂苷、萜酸、多糖等。这些天然化合物，有特殊的生理保健功效。

因此，深度研发罗汉果根、茎、叶等资源，从中提取和分离各种天然活性成分的方法，变废为宝，对于环境保护，促进罗汉果整体产业的发展，以及促进种植地区农业经济的发展都具有重要的现实意义。据报道，罗汉果根提取物具有抗炎，镇痛，解痉等多种生理活性。国内学者王雪芬等从罗汉果根乙醇提取物的乙酸乙酯部位已分离了多种游离的罗汉果酸，包括罗汉果酸甲、罗汉果酸乙、罗汉果酸丙、罗汉果酸丁、罗汉果酸戊(王雪芬等，1996，1998；斯建勇等，1999)。国内学者卢凤来等从罗汉果根中定性并定量分析了两种水溶性较好的三萜酸糖苷——罗汉果酸苷甲Ⅱ、罗汉果酸苷乙Ⅱ(卢凤来等，2010)。

罗汉果酸甲，罗汉果酸乙的化学结构如下所示：

罗汉果酸丙，罗汉果酸丁的化学结构如下所示：

罗汉果酸水溶性极差，限制了其药物剂型、使用方式和人体吸收量；且如果作为药物直接使用，其半衰期短，影响了疗效并增大了用量。再加上罗汉果酸在天然植物中的含量稀少、分离纯化难度较大、应用研究还处在初级阶段等原因，导致其在食品、保健品、化妆品及药品等领域的应用都受到了局限。罗汉果酸甲和罗汉果酸丁具有羟基，可以方便的被其它基团取代从而制得新型的罗汉果酸衍生物。如果可以通过化学反应，对罗汉果酸的分子结构加以修饰，使其转化为各种类型的衍生物，在保留其原有的生理活性的前提下，不但可以改善其溶解性、延长半衰期，还可能获得新的生理活性。

目前针对炎症，主要以西药进行干预和治疗，但是长期使用抗生素、激素类的西药，比如可的松、氢化可的松、地塞米松，会导致肝肾的损伤，因为药物进入体内通过肝肾代谢，加重肝肾负担，严重甚至造成衰竭；对于口服抗炎药物，对肠胃也有刺激作用，会诱发胃炎，胃溃疡等；此外，还可能出现菌群失调，恶心，呕吐，周身乏力等现象。据新闻报道，我国滥用抗生素比较严重，消费前20位的药物中，有10种以上是抗生素，住院患者抗生素使用率高达80％，远远超过国际平均水平。目前有一些抗炎作用中成药，比如金银花颗粒，蒲地蓝，蒲公英颗粒，黄连上清片，栀子金花丸等中成药上市。缓解了抗生素，激素类药物滥用，过度使用的趋势。因此，寻找安全有效、具有抗炎活性的天然活性成分和天然化合物衍生物，取代传统的抗炎药物有着广泛的研究前景。

申请人前期的专利CN2021104885752公开了一种从罗汉果根中提取分离罗汉果酸的方法，CN2021105977484公开了一种罗汉果酸酰化衍生物及其制备方法。发现罗汉果酸上的羟基酰化后，水溶性提高，抗炎活性也得到了提高。因此，基于罗汉果酸酰化衍生物的抗炎药物的研制具有很高的可行性。

发明内容

发明人预料不到地发现3-O-马来酰罗汉果酸甲其具有明显提升的抗炎活性，提供了一种基于改罗汉果酸酰化衍生物的抗炎药物。

具体而言，本发明提供了以下技术方案：

一种作为抗炎剂的罗汉果酸酰化衍生物，为3-O-马来酰罗汉果酸甲，化学结构如下式(I)所示：

本发明还提供了式(I)所示罗汉果酸酰化衍生物的制备方法，是罗汉果酸甲和马来酸酐进行酰化反应得到。

进一步地，所述酰化反应是在缚酸剂和催化剂条件下，10-30℃下进行。所述缚酸剂为三乙胺、三甲胺、环己胺、丙二胺、吡啶、咪唑、甲基咪唑、二甲胺、二乙胺、中的至少一种，所述催化剂为常规脱水用催化剂，比如DIC，EDCI，DCC，DMAP，优选采用DCC/DMAP。酰化试剂，缚酸剂和催化剂的用量没有特别的限定，为本领域所熟知。比如，酰化试剂是罗汉果酸甲或罗汉果酸丁的的1-1.5当量，缚酸剂用量为罗汉果酸甲或罗汉果酸丁的1.1-1.5当量，DCC用量是罗汉果酸甲或罗汉果酸丁的1.1-1.3当量，DMAP是罗汉果酸甲或罗汉果酸丁的0.1-0.15当量。

酰化反应的溶剂没有特别限定，一般为非质子溶剂，比如乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、苯、甲苯中的至少一种，有机溶剂的用量为罗汉果酸重量的5-20倍(ml/g)。

进一步地，酰化反应后进行后处理，一般为水洗，干燥，纯化水洗的目的之一是除去反应液中过量的催化剂，目的之一是除去酰化反应的副产物等杂质，以提高反应产物的纯度。所述干燥剂为无水硫酸镁、无水硫酸钠、无水硫酸钙，干燥剂的用量是有机溶剂用量的2％-10％(g/ml)。使用干燥剂的目的是，浓缩之前除去溶液中的水，防止浓缩过程中由于水、酸碱和高温的条件下，反应产物发生分解。纯化为萃取、柱层析分离、重结晶等常规纯化分离方法，如果需要可以多种纯化方法一起联用。

本发明还提供了一种抗炎组合物，包括以下原料：式(I)所示罗汉果酸酰化衍生物，花青素、鱼腥草提取物和穿心莲提取物。

花青素是一种广泛存在于植物中具有多种生理活性的天然活性成分。目前已报道的花青素有22大类600多种，其中最常见的有矢车菊色素、飞燕草色素、天竺葵色素、银葵色素、芍药色素和牵牛花色素6种。富含花青素的天然植物有紫甘薯、黑米、蓝莓、黑豆皮、越橘、玫瑰茄和桑葚等。大量研究结果证实，花青素具有较强的抗氧化、抗炎、抗癌等特性。

所述花青素自于紫甘薯、黑米、蓝莓、黑豆皮、越橘、玫瑰茄或桑葚，花青素的含量为25-80％，优先40％-60％。

鱼腥草是国家卫健委批准的第一批药食同源的中药品种。这种水生植物既能当蔬菜供人们食用，为身体补充丰富营养；这种植物又能入药，是一种能消炎、杀菌、抗病毒的中药材，对维持身体健康有极大的好处。临床报道，鱼腥草广泛用于治疗上呼吸道感染、流感、肺脓疡、癌性胸水、肺癌、宫颈糜烂、急性细菌性痢疾、急性黄疸性肝炎、流行性腮腺炎等多种病症。国外还从鱼腥草中分离出一种防癌抗癌物质；除对胃癌有效外，对中晚期肺癌、绒毛膜癌、恶性葡萄胎、直肠癌也有一定的治疗作用。在日本，鱼腥草受到青睐，除采用传统汉方、药膳食疗外，还以功能性保健食品(茶、饮料等)方式应用。

穿心莲除了具有良好的解热解毒、凉血消肿疗效以外，对于实验性炎症也有显著的抑制作用。穿心莲有着非常好的消炎作用，临床上曾应用于多种感染性疾病，包括外伤感染、疖、痈、丹毒、上呼吸道感染、急慢性扁桃体炎、急慢性咽喉炎、急慢性支气管炎、急性菌痢、急性胃肠炎、尿路感染、子宫内膜炎、盆腔炎、中耳炎、牙周炎等，均有不同程度的疗效。穿心莲清热解毒的作用，对于缓解炎症有好处，而且还可以预防尿路感染或者是肠胃疾病，对预防女性妇科疾病也有好处。

传统中医认为罗汉果不具有抗炎作用，现有技术中很少有将罗汉果提取物当作抗炎主要成分的文献报道。目前，尚无罗汉果酸酰化衍生物的相关报道。本发明探究了酰化罗汉果酸衍生物、花青素、鱼腥草提取物和穿心莲提取物协同配合在抗炎组合物中的应用。

进一步地，所述抗炎组合物，包括以下质量份的原料：2-4份式(I)所示罗汉果酸酰化衍生物，3-5份花青素、7-12份鱼腥草提取物，10-15份穿心莲提取物。

进一步地，所述抗炎组合物还包括任选地赋形剂、稀释剂、矫味剂中的至少一种。所述赋形剂选自淀粉、明胶、硬脂酸镁，碳酸钙的至少一种，所述稀释剂选自甘露醇，山梨醇，木糖醇，赤藓糖醇，淀粉；所述矫味剂选自葡萄糖、三氯蔗糖中的至少一种。上述辅料的用量为本领域技术人员根据实际需要可以实际调整。

根据实际需要，本发明抗炎组合物还可以包括润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂和保鲜剂中的至少一种，上述辅料的种类和用量为本领域所熟知，在此不再赘述。

本发明还提供了所述抗炎组合物的制备方法，包括以下步骤：

称取规定质量份的式(I)所示罗汉果酸酰化衍生物，花青素，鱼腥草提取物，穿心莲提取物，粉碎后过筛，可选地，还加入辅料，混合均匀即得。

进一步地，所述鱼腥草提取物是鱼腥草粉碎后，加热条件下用水提取得到；所述穿心莲提取物是穿心莲粉碎后用醇提取。

更进一步地，所述鱼腥草提取物是通过包括以下步骤的制备方法得到：取干燥鱼腥草，粉碎后，加入鱼腥草干燥全草重量10-20倍的纯水，加热至85-95℃，搅拌提取2-3小时，粗过滤，弃渣，得提取液；将提取液用陶瓷膜过滤；陶瓷膜滤液减压浓缩、喷雾干燥，得鱼腥草提取物；所述穿心莲提取物通过包括以下步骤的制备方法得到：取干燥穿心莲，粉碎；加入穿心莲干燥全草重量10-15倍的体积分数70％-95％乙醇水溶液，加热至沸腾，回流提取2-3小时；粗过滤，弃渣，得提取液；将提取液用陶瓷膜过滤；陶瓷膜滤液减压浓缩、喷雾干燥，得穿心莲提取物。

本发明抗炎组合物可以根据各使用目的，按照常规方法配制成各种形式，例如粉末、颗粒、片剂、胶囊、悬浮液、乳液、糖浆、气雾剂等口服制剂。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明的技术方案做进一步地的解释说明但应该说明的是，具体实施方式只是对本发明技术方案实质的一种具体化的实施和解释，不应该理解为是对本发明保护范围的一种限制。

本发明实施例所使用的罗汉果酸来自湖南华诚生物资源股份有限公司，是从天然植物罗汉果根提取、再由高压制备色谱分离纯化得到，经高效液相(HPLC)法测定，罗汉果酸甲含量均大于95％。花青素购自湖南华诚生物资源股份有限公司，是从玫瑰茄提取而来，花青素的含量为45％。

实施例所用试剂和仪器均可以从市售商品购买，检测方法为本领域所熟知的常规方法。若无特别说明，所述份为质量份，所述％为质量百分比。

制备例3-O-马来酰罗汉果酸甲的制备

(1)酰化反应：取罗汉果酸甲4.72g(0.01mol)，2.47g(0.012mol)DCC，1.5g三乙胺溶于35mL乙酸乙酯，冰浴下搅拌30min，再缓慢滴加15mL溶有1.18g(0.012mol)马来酸酐和0.12gDMAP的乙酸乙酯溶液，1h内滴加完毕，室温下搅拌反应8小时，HPLC检测反应完全。

(2)后处理：反应毕，将反应液用水洗至中性，加入2.5g无水硫酸钠脱水，减压浓缩，真空干燥，得到白色固体，以乙酸乙酯：石油醚＝1:2(v/v)为展开溶剂，最终得到4.72g产品白色结晶3-O-马来酰罗汉果酸甲，HPLC检验纯度97.80％，收率80.91％。¹H NMR(CDCl₃)0.76(3H，s，C28)，0.94(3H，d，C21),1.18(3H，d，C29),1.22(3H，s，C18),1.38(1H，m，C20)，1.45(1H，d,C8),1.56(2H，m，C2)，1.61(1H，t，C17),1.85(3H，s，C26)，2.13(1H，d，C10)，2.52(1H，d，C12-H_a)，2.63(1H，d，C4),2.70(1H，d，C12-H_b)，3.54(1H，d，C19-H_a)，3.80(1H，t，C3),4.65(1H，d，C19-H_b)，6.87(1H，t，C24)，7.06(2H，m).ESI:MS(M+):570.6。

发明人在前的专利CN2021105977484对所得3-O-马来酰罗汉果酸甲进行抗炎活性验证，是以小鼠的肿胀耳为动物模型，以饮用水为阴性对照组，以氢化可的松为阳性对照组，度小鼠肿胀耳抑制率进行测试，结果如下表1所示：

表1

*表示P<0.05，n＝10，具有显著性差异。

表1数据说明3-O-马来酰罗汉果酸甲的抗炎活性明显高于罗汉果酸甲，而且高于对照组氢化可的松，说明对罗汉果酸甲的酰化改性是成功的。发明人还对其他酰化的罗汉果酸甲，比如乙酰化，丙酰化的衍生物进行了测试，发现其抗炎活性不如3-O-马来酰罗汉果酸甲明显。说明以3-O-马来酰罗汉果酸甲作为抗炎药物组合物是可行的。

制备例2鱼腥草提取物的制备

取鱼腥草干燥全草1kg，粉碎至粒径为2-5mm；加入20L纯水，加热至90℃，搅拌提取3小时；粗过滤，弃渣，得提取液；将提取液用陶瓷膜过滤；陶瓷膜滤液减压浓缩(真空度-0.09Mpa、温度80℃)至固形物浓度为46％的浓缩液，将浓缩液喷雾干燥，得鱼腥草提取物265g。

制备例3穿心莲提取物的制备

取穿心莲干燥全草1kg，粉碎至粒径为2-5mm；加入12L乙醇(体积分数85％)，加热至沸腾，回流提取3小时；粗过滤，弃渣，得提取液；将提取液用陶瓷膜过滤；陶瓷膜滤液减压浓缩(真空度-0.08Mpa、温度70℃)至固形物浓度为37％的浓缩液，将浓缩液喷雾干燥，得穿心莲提取物193g。

实施例1

称取2份的式(I)所示罗汉果酸酰化衍生物，5份花青素，10份制备例2制得的鱼腥草提取物，13份制备例3制得的穿心莲提取物，粉碎后过筛，得到活性成分粉末，加入所述活性成分粉末8wt％的甘露醇，5wt％乙二醇，1.2wt％硬脂酸镁，0.2wt％三氯蔗糖，混合均匀，压片即得。

实施例2

其他条件和操作和实施例1相同，区别在于式(I)所示罗汉果酸酰化衍生物用量改为4份。

实施例3

其他条件和操作和实施例1相同，区别在于式(I)所示罗汉果酸酰化衍生物用量改为1份。

对比例1

其他条件和操作和实施例1相同，区别在于不加入式(I)所示罗汉果酸酰化衍生物。

应用例

筛选合格大鼠84只，雌雄各半以15％氨水喷至大鼠咽部，一天2次，每次约0.2mL，连续造模4天，使大鼠咽部组织呈暗红色，形成急性咽炎模型。空白组(12只)是用喷雾器喷相同剂量的生理盐水。之后将造模后的大鼠随机分为6组，每组12只分别模型对照组(灌胃等量蒸馏水)，阳性对照组(灌胃蒲地蓝消炎片)，模型组1-4(灌胃实施例1-3，对比例1的组合物)，从第5天开始给药，连续给药7天，给药剂量0.5g/kg/d。最后一次给药后，腹腔主动脉取血，测试IL-6，TNF-α的含量。结果如下表2所示：

表2

通过表1数据可以发现，经过氨水咽部喷雾后，大鼠咽部黏膜组织收到刺激发炎，IL-6和TNF-α水平显著高于空白组(P＜0.05)，而本发明提供的组合物以及商购蒲地蓝消炎片都能降低IL-6和TNF-α水平，其中模型组1-2和模型对照组相比，显著差异(P＜0.05)，模型组4中没有加入式(I)所示罗汉果酸酰化衍生物，IL-6和TNF-α水平降低程度下降。说明本发明包含式(I)所示罗汉果酸酰化衍生物的组合物可以有效降低模型大鼠血清中炎性介质水平，对炎性症状有抑制作用，效果和蒲地蓝消炎片接近。

Claims

1.一种作为抗炎剂的罗汉果酸酰化衍生物，为3-O-马来酰罗汉果酸甲，化学结构如下式(I)所示：

2.权利要求1所述式(I)所示罗汉果酸酰化衍生物的制备方法，是罗汉果酸甲和马来酸酐进行酰化反应得到。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述酰化反应是在缚酸剂和催化剂条件下，10-30℃下进行。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所所述缚酸剂为三乙胺、三甲胺、环己胺、丙二胺、吡啶、咪唑、甲基咪唑、二甲胺、二乙胺中的至少一种，所述催化剂为常规脱水用催化剂，比如DIC，EDCI，DCC，DMAP，优选采用DCC/DMAP。

5.一种抗炎组合物，包括以下原料：权利要求1所述的式(I)所示罗汉果酸酰化衍生物，花青素、鱼腥草提取物和穿心莲提取物。

6.根据权利要求5所述的抗炎组合物，其特征在于，花青素的含量为25-80％，优先40％-60％。

7.根据权利要求5所述的抗炎组合物，其特征在于，包括以下质量份的原料：2-4份式(I)所示罗汉果酸酰化衍生物，3-5份花青素、7-12份鱼腥草提取物，10-15份穿心莲提取物。

8.根据权利要求5所述的抗炎组合物，其特征在于，所述抗炎组合物还包括任选地赋形剂、稀释剂、矫味剂中的至少一种；所述赋形剂选自淀粉、明胶、硬脂酸镁，碳酸钙的至少一种，所述稀释剂选自甘露醇，山梨醇，木糖醇，赤藓糖醇，淀粉；所述矫味剂选自葡萄糖、三氯蔗糖中的至少一种。

9.权利要求5-8任一项所述抗炎组合物的制备方法，包括以下步骤：称取规定质量份的式(I)所示罗汉果酸酰化衍生物，花青素，鱼腥草提取物，穿心莲提取物，粉碎后过筛，可选地，还加入辅料，混合均匀即得。

10.权利要求5-8任一项所述抗炎组合物，其特征在于，组合物为口服制剂，比如粉末、颗粒、片剂、胶囊、悬浮液、乳液、糖浆或气雾剂。