KR101158535B1 - 감초 또는 감초 추출물에서의 개선된 리퀴리티게닌의 추출 방법 - Google Patents

감초 또는 감초 추출물에서의 개선된 리퀴리티게닌의 추출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 감초에 물, 유기용매 또는 물과 유기용매의 혼합용매를 이용하여 리퀴리틴이 함유된 생성물을 추출하는 단계(단계 1); 및 상기 단계 1에서 추출된 리퀴리틴이 함유된 생성물에 물, 유기용매 또는 물과 유기용매의 혼합용매를 넣고 산 또는 염기를 첨가하여 가수분해시켜 리퀴리티게닌이 함유된 생성물을 제조하는 단계(단계 2)를 포함하는 감초 또는 감초 추출물에서의 개선된 리퀴리티게닌의 추출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 고가의 용매가 필요하지 않으며, 컬럼 크로마토그래피의 공정도 생략할 수 있어 단계를 간소화시키면서, 종래보다 높은 함량(약 8~23%)의 리퀴리티게닌을 함유하는 추출물을 얻을 수 있으므로, 리퀴리티게닌 추출시 유용하게 사용될 수 있다.
감초, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 함량 증가

Description

감초 또는 감초 추출물에서의 개선된 리퀴리티게닌의 추출 방법{Extraction method for improved liquiritigenin content in Glycyrrhiza uralensis or Glycyrrhizae radix extract}
본 발명은 감초 또는 감초 추출물에서의 개선된 리퀴리티게닌의 추출 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 감초(Glycyrrhiza uralensis)는 장미목 공과의 여러해살이풀로 뿌리는 적갈색으로 땅속 깊이 내려가고 모난 줄기는 1~1.5 m 정도로 곧게 자란다. 잎은 어긋나며 달걀형이고 끝이 뾰족하다. 잎의 길이는 2~5 cm 너비는 1~3 cm이며 톱니는 없다. 꽃은 콩과 비슷하며 여름에 남자색으로 피며 총상화서이다.
예부터 약방의 감초라는 말도 있듯이 감초는 한방에서 두루 쓰이는 약재 중의 하나이다. 감초의 약리작용을 살펴보면 간장에서 유독 물질과 결합, 해독 작용을 하기 때문에 간장기능을 회복시켜 주며 약물중독, 간염, 두드러기, 피부염, 습진 등에 유효하다. 또한, 진해 거담 작용도 있으며 항히스타민, 항아세칠콜린작용 도 있다. 근육이나 조직의 급격한 긴장에 의하여 생기는 통증을 풀어주는 작용, 체중의 증가, 백혈구증가, 이뇨작용, 항염증작용이 있으며 특히 리퀴리틴, 리퀴리티게닌 등의 성분은 소화성궤양의 발생을 억제하고 있다.
<동의보감>에서는 "감초는 모든 약의 독성을 해소시켜 주며 72종의 석약(광물성약)과 1200종의 초약등을 서로 조화시켜서 약효가 잘 나타나게 하는 작용이 있어서 별명을 나라의 원로라는 뜻의 국로(國老)라고 했다. 5장 6부의 한열과 사기를 주로 다스리며 이목구비와 대소변의 생리를 정상화하고 모든 혈맥의 소통을 잘 시키며 근육과 뼈를 튼튼히 하고 전신의 영양상태를 좋게 해준다." 라고 기록되어 있다.
민간요법으로는 죽순이나 버섯류에 중독되었을 때 달여서 복용하였으며, 연초에 취하였을 때나 약물중독, 기타 중독에 감초를 달여 먹으면 잘 낫는다고 한다. 그러므로 감초는 모든 중독의 해독제로 이용되고 있으며, 진해거담제, 교미 교취제, 완화제 등 한방뿐만 아니라 신약, 민간약으로 아주 중요한 생약으로 널리 쓰이고 있다.
감초 추출물(Glycyrrhizae radix extract)은 리퀴리틴(liquiritin), 리퀴리티게닌(liquiritigenin), 리퀴리틴 아피오시드(liquiritin apioside), 이소리퀴리틴(isoliquiritin), 이소리퀴리틴 아피오시드(isoliquiritin apioside)와 아글리콘(aglycones)을 포함하는 플라보노이드(flavonoids)를 높은 용량으로 함유하고 있으며, 메탄올용매 분획은 대부분 리퀴리틴과 리퀴리틴 아포이시드를 함유한 다(Kamei, J., et al., Eur. J. Pharmacol., 469, pp159-63, 2003). 이중 리퀴리티게닌은 항치매, 항균, 항산화, 항혈관신생, 항피부암, 카드뮴유발 독성제거 등의 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 알려져 있다.
상기 리퀴리티게닌과 관련된 종래 기술로는 대한민국 등록특허 제535872호에 리퀴리티게닌을 함유한 중금속 중독으로 인한 질환의 치료 및 예방용 조성물을 개시하였으며, 대한민국 등록특허 제697056호에 리퀴리티게닌을 유효성분으로 포함하는 간질환의 예방 및 치료용 조성물을 개시하였다.
이렇게 다양한 생리활성을 갖는 리퀴리티게닌은 일반적으로 감초로부터 물 또는 저급 알코올을 사용하여 통상적인 방법을 통하여 추출되나, 추출물 내에 함유된 리퀴리티게닌은 매우 소량이기 때문에 감초 추출물 내에 리퀴리티게닌의 함량을 높이기 위하여 많은 연구들이 진행되고 있다.
일례로 대한민국 등록특허 제592482호에서는 감초를 잘게 세절한 후 100 ℃에서 물로 환류추출하여 여과한 뒤 여액을 동결건조하는 단계와; 상기 단계에 의해 동결건조한 건조물을 당가수분해 활성을 갖는 미생물, 또는 그 미생물 효소액으로 처리한 후 20~50 ℃에서 10분~36시간 정치하는 단계와; 상기 단계에 의해 배양된 배양물에 2배 내지 10배량의 에탄올을 가하여 에탄올 가용부와 불용부로 나눈 후 에탄올 가용부를 감압농축하여 추출물을 얻는 단계와; 상기 단계에 의해 얻어진 추출물을 증류수에 분산하여 디클로로메탄으로 3회 분배 추출한 후 가용성 분획을 농축하는 단계와; 상기 단계에 의해 분획된 7번째 분획을 디클로로메탄과 메탄올의 혼합용매에서 재결정화를 행하여 순수한 리퀴리티게닌을 얻는 단계;로 진행함을 특징으로 하는 감초의 리퀴리티게닌 추출물 함량을 증강하는 방법을 개시하였다.
그러나 상기 방법은 단계가 복잡하고, 미생물 또는 미생물 효소액을 사용함으로써 비용이 상승하는 문제가 있다.
대한민국 등록특허 제37789호에는 감초 또는 감초 추출물 중 유효성분인 리퀴리티게닌의 함량증대 방법으로서 리퀴리틴을 DMSO에 녹이고 1M HCl을 넣어 중탕가열하여 리퀴리틴을 산가수분해한 후, 산성분을 중화시키기 위하여 동량의 1N NaOH를 가하고, 산가수분해 중 발생하는 당성분과 소금 등의 불순물들을 제거하기 위하여 클로로포름-아세톤 용매조합을 사용하여 실리카겔 칼럼크로마토그래피를 실시하는 방법을 개시하였다.
그러나 상기 방법에서 사용되는 DMSO는 끓는점이 높아 용매를 제거하기가 어렵기 때문에 잔류 용매를 체크해야하는 등 다루는데 번거로움이 따르며, HCl을 사용하여 산가수분해하는 경우 가수분해 반응이 느려 시간이 오래걸리며, 리퀴리티게닌 수득시 순도가 좋지 않은 문제가 있다.
이에 본 발명자들은 간단하고, 높은 효율성으로 감초 추출물로부터 리퀴리티게닌의 함량을 증가시키는 방법을 연구한 결과, 감초를 물, 유기용매 또는 유기용매의 혼합 용매를 넣고 초음파를 이용하여 추출한 추출물에 80~100 ℃에서 물과 강산 또는 염기를 첨가하면 리퀴리티게닌이 함유된 생성물이 침전물로 발생함으로써 분리가 용이하고 간단한 방법으로 감초 추출물로부터 리퀴리티게닌의 추출함량을 높일 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 감초 또는 감초 추출물에서의 개선된 리퀴리티게닌의 추출 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
감초에 물, 유기용매 또는 물과 유기용매의 혼합용매를 이용하여 리퀴리틴이 함유된 생성물을 추출하는 단계(단계 1); 및 상기 단계 1에서 추출된 리퀴리틴이 함유된 생성물에 물, 유기용매 또는 물과 유기용매의 혼합용매를 넣고 산 또는 염기를 첨가하여 가수분해시켜 리퀴리티게닌이 함유된 생성물을 제조하는 단계(단계 2)를 포함하는 감초 또는 감초 추출물에서의 개선된 리퀴리티게닌의 추출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법은 고가의 용매가 필요하지 않으며, 컬럼 크로마토그래피의 공정도 생략할 수 있어 단계를 간소화시키면서, 종래보다 높은 함량(약 8~23%)의 리퀴리티게닌이 함유된 추출물을 얻을 수 있으므로, 리퀴리티게닌 추출시 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 감초에 물, 유기용매 또는 물과 유기용매의 혼합용매를 이용하여 리퀴리틴이 함유된 생성물을 추출하는 단계(단계 1); 및
상기 단계 1에서 추출된 리퀴리틴이 함유된 생성물에 물, 유기용매 또는 물과 유기용매의 혼합용매를 넣고 산 또는 염기를 첨가하여 가수분해시켜 리퀴리티게닌이 함유된 생성물을 제조하는 단계(단계 2)를 포함하는 감초 또는 감초 추출물에서의 개선된 리퀴리티게닌의 추출 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 단계별로 상세하게 설명한다.
먼저, 단계 1은 감초에 물, 유기용매 또는 물과 유기용매의 혼합용매를 이용하여 리퀴리틴이 함유된 생성물을 추출하는 단계이다.
감초에는 리퀴리티게닌의 함유량이 거의 0%에 가깝기 때문에 먼저 감초에서 리퀴리틴을 추출한 후 가수분해 시켜 리퀴리티게닌을 얻을 수가 있다.
상기 단계에서 추출시 용매는 물, 유기용매 또는 물과 유기용매의 혼합용매를 사용하는 것이 바람직하며, 이때 유기용매는 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, t-부탄올 등의 저급 알콜, 아세톤, 아세토나이트릴, 에칠아세테이트, 테트라하이드로퓨란, 디메틸에테르, 디에틸에테르 및 디메틸포름아미드, 벤젠, 톨루엔, 자일렌 등을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 용매는 감초 무게의 2배 내지 10배를 첨가하여 추출하는 것이 바람직하고, 4배 내지 8배를 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 추출온도는 30 ℃ 내지 100 ℃인 것이 바람직하며, 80℃ 내지 100℃인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 추출시간은 1시간 내지 10시간인 것이 바람직하며, 4시간 내지 8시간인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 추출방법은 가온교반 추출, 환류 추출, 초음파 추출, 냉침 등을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 추출 회수는 1회 내지 5회인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 의하여 리퀴리틴이 함유된 감초 추출액을 추출한 후, 수득한 추출액을 여과, 감압농축하여 리퀴리틴이 함유된 생성물을 수득할 수 있다.
다음으로 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 추출된 리퀴리틴이 함유된 생성물에 물, 유기용매 또는 물과 유기용매의 혼합용매를 넣은 후, 산 또는 염기를 첨가하여 생성물에 함유된 리퀴리틴을 가수분해시켜 리퀴리티게닌이 함유된 생성물을 제조하는 단계이다.
이때 사용되는 유기용매는 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, t-부탄올 등의 저급 알콜, 아세톤, 아세토나이트릴, 에칠아세테이트, 테트라하이드로퓨란, 디메틸에테르, 디에틸에테르 및 디메틸포름아미드, 벤젠, 톨루엔, 자일렌 등을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 산은 강산을 사용하는 것이 바람직하며, 예를 들면 염산, 황산, 질산 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다. 바람직하게는 황산을 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 1~5M의 황산을 사용할 수 있다. 또한 염기로는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 수산화칼슘을 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 1~5M의 수산화칼슘을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 반응 온도는 50~100 ℃인 것이 바람직하며, 80~100 ℃인 것이 더욱 바람직하다.
가수분해 후, 실온으로 냉각시키면 리퀴리티게닌의 물에 녹지 않는 성질 때문에 침전물이 생기는데, 이때 리퀴리티게닌의 함량은 약 5~15%이다. 이후, 상기 침전물을 유기용매에 용해시키고, 물로 여러 번 세척한 후, 유기층을 감압 농축 후 건조하여 리퀴리티게닌의 함량을 8~23%로 증가시킬 수 있다. 이때 사용되는 유기용매는 n-부탄올, t-부탄올 등의 저급 알콜, 에칠아세테이트, 디메틸에테르, 디에틸에테르 및 디메틸포름아미드, 벤젠, 톨루엔, 자일렌 등을 사용할 수 있다.
이때, 사용되는 유기용매를 건조시에는 열풍건조보다는 감압건조하는 것이 바람직하며, 침전물의 유기용매를 감압건조한 후 에탄올에 다시 녹여 감압건조하는 공정을 추가로 수행하면 잔류용매의 함량을 더욱 낮출 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 고가의 용매가 필요하지 않으며, 컬럼 크로마토그래피의 공정도 생략할 수 있어 단계를 간소화시키면서, 종래보다 높은 함량(약 8~23%)의 리퀴리티게닌이 함유된 추출물을 얻을 수 있으므로, 리퀴리티게닌 추출시 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 리퀴리티게닌 제조 1
(1) 리퀴리틴 함유 감초 추출물 제조
감초를 한약 건재상에서 구입하여 정확히 감별한 후 잘게 절단(감초 절편)하여 사용하였다. 상기 감초에 포함된 리퀴리틴의 함량은 1% 내외이다. 상기 감초 절편 100 g에 800 ml의 80~90% 메탄올을 가한 후, 85 ℃에서 8시간 동안 가온교반하였다. 이후, 냉각 및 여과한 다음 감압농축하여 25.8 g의 리퀴리틴 함유 추출물을 얻었다.
1H NMR (CD3OD, 300 MHz) δ 7.61 (1H, d, 8.6 Hz) 7.08 (2H, d, 8.4 Hz) 6.81 (2H, d, 8.4 Hz) 6.49 (1H, dd, 8.6Hz), 6.37 (1H, d, 2.4 Hz), 5.41 (1H, dd, 13.2, 3.1) 5.37 (2H, dd, 13.0, 2.9 Hz), 3.49 (3H, t, 2.4 Hz), 3.05 (1H, dd, 17.0, 13.0), 2.68(1H, dd, 17.0, 2.9)
수득한 감초 추출물에서 리퀴리틴 함량은 아래와 같은 방법에 따라 측정하였다. 구체적으로 추출물 0.5 g을 정밀하게 달아 80% 메탄올 50 ml에 초음파추출한 다음 여과하여 검액으로 하고, 따로 리퀴리틴표준품 약 10 mg을 정확하게 50 ml로 하여 표준액으로 한 후, 상기 검액 및 표준액 20 ㎕를 가지고 다음 조건으로 액체 크로마토그래프법에 따라 시험하여 희석배수를 고려하여 함량을 측정하였다.
* 검출기 : 자외부흡광광도계(측정파장: 254 nm)
* 칼럼 : 옥타데실실리카겔, 5 ㎛, 4.6 mm × 15 cm
* 이동상 : 1% 아세트산혼합액:ACN=9:1
* 유속 : 1 ml/min
상기 방법에 따라 측정한 결과, 수득한 감초 추출물의 리퀴리틴 함량은 2.3%로 나타났다.
(2) 리퀴리티게닌 제조
상기 (1)에서 얻은 추출물 100 g을 물 500 ml에 넣고 분산시킨 후, 3M 황산 250 ml를 넣고 2시간 동안 90~100 ℃에서 가온교반 하였다. 이후, 실온으로 냉각시켜 생성된 침전물을 여과 및 건조하여 흑갈색의 물질을 34 g 수득하였다(리퀴리티게닌 함량: 8.5%).
이후, 상온에서 상기 물질 30 g을 에칠아세테이트 300 ml에 용해시킨 후, 물 300 ml로 두 번 세척하고 감압 농축 및 건조하여 용매를 제거함으로써 흑갈색의 결정 22 g을 얻었다(리퀴리티게닌 함량: 11%).
1H NMR (CD3OD, 300 MHz) δ 7.73 (1H, d, 8.6 Hz, H-5) 7.33 (2H, d, 8.4 Hz) 6.81 (2H, d, 8.4 Hz) 6.49 (1H, dd, 8.6Hz), 6.35 (1H, d, 2.4 Hz) 5.37 (1H, dd, 13.0, 2.9 Hz), 3.05 (1H, dd, 17.0, 13.0), 2.68(1H, dd, 17.0, 2.9)
이때, 상기 리퀴리티게닌 함량은 아래와 같은 방법에 따라 측정하였다. 구체적으로 생성물 0.1 g을 정밀하게 달아 80% 메탄올 50 ml에 초음파 추출한 다음 여과하여 검액으로 하고, 따로 리퀴리티게닌표준품 약 10 mg을 정확하게 50 ml로 하여 표준액으로 한 후, 상기 검액 및 표준액 20 ㎕를 가지고 다음 조건으로 액체 크로마토그래프법에 따라 시험하여 희석배수를 고려하여 함량을 측정하였다.
* 검출기 : 자외부흡광광도계(측정파장: 254 nm)
* 칼럼 : 옥타데실실리카겔, 5 ㎛, 4.6 mm × 15 cm
* 이동상 : 0.01M 인산:ACN=67:33
* 유속 : 1 ml/min
< 실시예 2> 리퀴리티게닌 제조 2
상기 감초에 80% 에탄올을 가하여 추출물을 제조하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 흑갈색의 물질을 23 g 수득하였다(리퀴리티게닌 함량: 11.2%).
< 실시예 3> 리퀴리티게닌 제조 3
상기 감초에 80% 메탄올을 가하여 수득한 추출물에 2차적으로 100% 메탄올을 가하여 리퀴리틴 함유 추출물(2.9%)을 수득한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 흑갈색의 물질을 23 g 수득하였다(리퀴리티게닌 함량: 11.8%).
< 실시예 4> 리퀴리티게닌 제조 4
상기 감초를 80% 에탄올로 두번 추출한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 흑갈색의 물질을 25 g 수득하였다(리퀴리티게닌 함량: 12.1%).
< 비교예 1> 종래 리퀴리티게닌 제조방법 1
감초절편 100 g에 800 ml의 80~100% 메탄올을 가한 후 실온에서 48시간 동안 두었다. 이후, 여과한 후 감압농축하여 추출물 18.4~21.1 g을 얻었다(리퀴리틴 함량: 1.3~1.6). 수득한 추출물을 DMSO 200 ml에 녹이고 여기에 1N HCl 100 ml을 넣어 100 ℃로 6시간 동안 중탕가열 하였다. 실온으로 식힌 후 산성분을 중화시키기 위하여 동량의 1N NaOH를 가한 후 동결건조를 48시간 하여 28g의 추출물을 얻었다(리퀴리티게닌 함량: 0.8%).
< 비교예 2> 종래 리퀴리티게닌 제조방법 2
용매로서 메탄올 대신 에탄올을 사용한 것을 제외하고는 비교예 1과 동일한 방법으로 수행하여 리퀴리티게닌 함유 추출물 29 g을 수득하였다(리퀴리티게닌 함량: 0.7%)
< 실험예 1> 리퀴리틴의 고효율 추출실험
(1) 추출용매에 따른 리퀴리틴의 함량
추출용매에 따른 감초 추출물 내의 리퀴리틴의 함량을 알아보기 위하여 감초절편 100 g에 하기 표 1의 추출용매 및 추출온도에서 8시간 동안 가온교반하여 감초 추출물을 수득한 후, 추출물 내 리퀴리틴 함량을 실시예 1의 리퀴리틴의 함량 측정법을 이용하여 측정하고 표 1에 나타내었다.
추출용매 추출온도(℃) 리퀴리틴 함량(%)
메탄올 85 2.2
에탄올 85 1.9
이소프로판올 85 1.9
n-프로판올 85 1.9
n-부탄올 85 1.7
t-부탄올 85 1.6
디메틸포름아미드 85 1.8
아세톤 80 1.7
아세토나이트릴 80 1.7
에칠아세테이트 80 1.8
테트라하이드로퓨란 80 1.8
디메틸에테르 50 1.1
디에틸에테르 55 1.2
n-헥산 70 0.2
벤젠 85 0.7
톨루엔 85 0.8
자일렌 85 0.8
디클로로메탄 40 0.3
클로로포름 40 0.4
표 1에 나타난 바와 같이, 감초 추출물 내의 리퀴리틴 함량은 추출용매가 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, n-프로판올, n-부탄올, t-부탄올, 아세톤, 에칠아세테이트, 테트라하이드로퓨란, 디메틸에테르, 디에틸에테르, 디메틸포름아미드, 아세토나이트릴에서 1~2%의 함량을 나타냄을 알 수 있으며, n-헥산, 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 디클로로메탄, 클로로포름에서는 리퀴리틴 추출이 잘 이루어지지 않음을 확인하였다.
(2) 추출용매 내의 메탄올 또는 에탄올 함량에 따른 리퀴리틴의 함량
추출용매 내의 메탄올 또는 에탄올 함량에 따른 감초 추출물 내의 리퀴리틴의 함량을 알아보기 위하여 감초절편 100 g에 추출용매로서 메탄올 또는 에탄올을 50~100%로 변경하면서 85 ℃에서 8시간 동안 가온교반하여 감초 추출물을 수득한 후, 추출물 내 리퀴리틴 함량을 실시예 1의 리퀴리틴의 함량 측정법을 이용하여 측정하고 표 2에 나타내었다.
추출용매 리퀴리틴 함량(%)
50% 메탄올 1.7
60% 메탄올 1.9
70% 메탄올 2.0
80% 메탄올 2.3
90% 메탄올 2.3
100% 메탄올 2.2
50% 에탄올 1.6
60% 에탄올 1.5
70% 에탄올 2.1
80% 에탄올 2.3
90% 에탄올 2.0
100% 에탄올 1.9
표 2에 나타난 바와 같이, 감초 추출물 내의 리퀴리틴 함량은 메탄올 또는 에탄올이 80~100%일 때 높은 함량을 나타냄을 알 수 있다.
(3) 추출온도에 따른 리퀴리틴의 함량
추출온도에 따른 감초 추출물에서의 리퀴리틴의 함량을 알아보기 위하여 다음과 같이 수행하였다.
감초절편 100 g에 80~100%의 메탄올 또는 에탄올을 800 ml 넣고 85 ℃에서 8시간 동안 가온교반하여 추출하였다. 비교예로는 같은 방법으로 실온에서 24시간 동안 추출하였다. 이후 수득한 추출물에서 리퀴리틴의 함량을 실시예 1의 리퀴리틴의 함량 측정법을 이용하여 측정하고 표 3에 나타내었다.
추출용매 리퀴리틴 함량(%)
실온(25 ℃) 85 ℃
80% 메탄올 1.4 2.3
90% 메탄올 1.3 2.3
100% 메탄올 1.6 2.2
80% 에탄올 1.7 2.3
90% 에탄올 1.5 2.0
100% 에탄올 1.6 1.9
표 3에 나타난 바와 같이, 상기 리퀴리틴은 80 ℃ 이상에서 추출할 때 실온에서보다 약 1.5배 이상 추출되는 것으로 나타났다.
따라서, 감초에서 리퀴리틴을 고효율로 추출하기 위하여는 추출용매로서 80~100%의 메탄올 또는 에탄올을 사용하며, 80 ℃ 이상의 높은 온도에서 추출하는 것이 유리함을 알 수 있다.
(4) 초음파 추출에 따른 리퀴리틴의 함량
추출온도와 초음파 추출에 따른 감초 추출물에서의 리퀴리틴의 함량을 알아보기 위하여 다음과 같이 수행하였다.
감초절편 100 g에 80~100%의 메탄올 또는 에탄올을 800 ml 넣고 60 ℃에서 8시간 동안 초음파를 이용하여 추출하였다. 비교예로는 같은 방법으로 실온에서 8시간 동안 추출하였다. 이후 수득한 추출물에서 리퀴리틴의 함량을 실시예 1의 리퀴리틴의 함량 측정법을 이용하여 측정하고 표 4에 나타내었다.
추출용매 리퀴리틴 함량(%)
실온(25 ℃) 60 ℃
80% 메탄올 1.8 2.4
90% 메탄올 1.6 2.3
100% 메탄올 1.5 2.3
80% 에탄올 1.8 2.5
90% 에탄올 1.7 2.4
100% 에탄올 1.6 2.1
표 4에 나타난 바와 같이, 상기 리퀴리틴은 60 ℃ 에서 초음파 추출할 때 실온에서보다 약 1.4배 이상 추출되는 것으로 나타났다.
따라서, 감초에서 리퀴리틴을 고효율로 추출하기 위하여는 추출용매로서 80~100%의 메탄올 또는 에탄올을 사용하며, 60 ℃ 이상의 높은 온도에서 초음파를 이용하여 추출하는 것이 유리함을 알 수 있다.
< 실험예 2> 리퀴리틴의 리퀴리티게닌으로의 가수분해 실험
(1) 가수분해 온도에 따른 리퀴리티게닌 함량
본 발명에 따라 리퀴리틴이 함유된 감초 추출물에 산을 가하여 상기 리퀴리틴을 리퀴리티게닌으로 가수분해함에 있어서, 가수분해 온도에 따른 가수분해 후 생성되는 리퀴리티게닌 함량을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
상기 <실험예 1>에서 수득한 리퀴리틴 함유 감초 추출물 100 g을 500 ml의 물에 넣고 분산시킨 후, 3M 황산 250 ml를 넣고 가수분해 반응을 진행시켰다. 이때 가수분해 반응 온도를 50~100 ℃로 변화시키면서 2시간 동안 반응시켰다. 이후 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키면 침전물이 형성되고, 이 침전물을 여과 및 건조시켜 리퀴리티게닌이 함유된 생성물을 수득하였다. 상기 생성물 내 리퀴리티게닌의 함량을 실시예 1의 리퀴리티게닌의 함량 측정법을 이용하여 측정하고 표 5에 나타내었다.
반응 온도 (℃) 리퀴리티게닌 함량(%)
50 2.4
60 3.7
70 5.2
80 7.2
90 8.5
100 8.5
표 5에 나타난 바와 같이, 반응온도가 증가할수록 가수분해되어 생성되는 리퀴리티게닌이 증가함을 알 수 있으며, 90~100 ℃에서 가수분해반응을 수행할 경우 8.5%까지 리퀴리티게닌 함량을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
(2) 산의 종류에 따른 리퀴리티게닌 함량
본 발명에 따라 리퀴리틴이 함유된 감초 추출물에 물에 넣고 분산시킨 후, 산을 가하여 상기 리퀴리틴을 리퀴리티게닌으로 가수분해함에 있어서, 산의 종류에 따른 리퀴리티게닌 함량을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
상기 <실험예 1>에서 수득한 리퀴리틴 함유 감초 추출물 100 g을 500 ml의 물에 넣고 분산시킨 후, 1M~5M 염산, 황산, 질산 및 이의 혼합 용액 250 ml를 넣고 100 ℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키면 침전물이 형성되고, 이 침전물을 여과 및 건조시켜 리퀴리티게닌이 함유된 생성물을 수득하였다. 상기 생성물 내 리퀴리티게닌의 함량을 실시예 1의 리퀴리티게닌의 함량 측정법을 이용하여 측정하고, 표 6에 나타내었다.
산 리퀴리티게닌 함량(%)
1M 염산 2.2
3M 염산 4.3
5M 염산 5.1
1M 황산 7.3
3M 황산 8.5
5M 황산 7.9
1M 질산 7.2
3M 질산 8.1
5M 질산 7.2
3M 염산+3M 황산 7.4
3M 염산+3M 질산 7.3
3M 질산+3M 황산 8.1
표 6에 나타낸 바와 같이 산으로서 황산 또는 질산을 사용할 경우 고함량의 리퀴리티게닌 추출물을 얻을 수 있으며, 특히 3M의 황산을 사용할 경우 리퀴리티게닌 함량을 8.5%까지 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
(3) 염기의 종류에 따른 리퀴리티게닌 함량
본 발명에 따라 리퀴리틴이 함유된 감초 추출물을 물에 넣고 분산시킨 후, 염기를 가하여 상기 리퀴리틴을 리퀴리티게닌으로 가수분해함에 있어서, 염기의 종류에 따른 리퀴리티게닌 함량을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
상기 <실험예 1>에서 수득한 리퀴리틴 함유 감초 추출물 100 g을 500 ml의 물에 넣고 분산시킨 후, 1M~5M 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘 및 이의 혼합 용액 250 ml를 넣고 100 ℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키면 침전물이 형성되고, 이 침전물을 여과 및 건조시켜 리퀴리티게닌이 함유된 생성물을 수득하였다. 상기 생성물 내 리퀴리티게닌의 함량을 실시예 1의 리퀴리티게닌의 함량 측정법을 이용하여 측정하고, 표 7에 나타내었다.
염기 리퀴리티게닌 함량(%)
1M 수산화나트륨 1.5
3M 수산화나트륨 3.2
5M 수산화나트륨 5.7
1M 수산화칼륨 2.1
3M 수산화칼륨 4.3
5M 수산화칼륨 6.2
1M 수산화칼슘 2.2
3M 수산화칼슘 4.4
5M 수산화칼슘 6.5
3M 수산화나트륨+3M 수산화칼륨 6.1
3M 수산화나트륨+3M 수산화칼슘 6.3
3M 수산화칼륨+3M 수산화칼슘 6.4
표 7에 나타낸 바와 같이 염기로서 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘을 사용할 경우 리퀴리티게닌 추출물을 얻을 수 있으며, 특히 5M의 수산화칼슘을 사용할 경우 리퀴리티게닌 함량을 6.5%까지 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 표 6에서보다 함량이 떨어지는 이유는 리퀴리티게닌의 용해도가 염기성 용액에서 증가되기 때문에 모두 침전 되지 않고 용액 속에 어느정도 녹아 손실되었기 때문이라 사료된다.
(4) 용매에 따른 리퀴리티게닌 함량
본 발명에 따라 리퀴리틴이 함유된 감초 추출물을 물에 넣고 분산시킨 후, 산을 첨가하여 리퀴리틴을 리퀴리티게닌으로 가수분해하는 반응에 있어서, 물 이외에 유기 용매 첨가시, 유기용매에서의 리퀴리티게닌 함유량의 변화를 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 대조군으로는 유기 용매 첨가 없이 물만 사용하였다.
상기 <실험예 1>에서 수득한 리퀴리틴 함유 감초 추출물 100 g을 유기용매 500 ml과, 물 500 ml를 3M 황산 250 ml를 넣고 85 ℃에서 2시간 동안 가온교반하거나 리퀴리틴 함유 감초 추출물 100 g을 유기용매 500 ml과 3M 황산 250 ml에 해당하는 황산만을 첨가한 후 85 ℃에서 2시간 동안 가온교반하였다. 이후 실온으로 냉각시킨 후 유기층을 분리하여 물로 2번 세척한 후, 감압 농축 및 건조하여 리퀴리티게닌이 함유된 생성물을 수득하였다. 단 물과 섞이는 유기용매는 바로 감압 농축 및 건조하였다. 상기 생성물 내 리퀴리티게닌의 함량을 실시예 1의 리퀴리티게닌의 함량 측정법을 이용하여 측정하고, 표 8에 나타내었다.
가수분해용매 리퀴리티게닌 함량(%)
(유기용매+물)		 리퀴리티게닌 함량(%)
(유기용매)
물 8.5
메탄올 6.9 5.4
에탄올 6.3 4.5
이소프로판올 6.4 3.1
n-프로판올 5.3 3.4
n-부탄올 7.2 3.2
t-부탄올 6.2 2.8
디메틸포름아미드 7.3 5.4
아세톤 6.1 4.7
에칠아세테이트 7.5 6.4
테트라하이드로퓨란 6.9 5.8
디메틸에테르 5.2 2.8
디에틸에테르 5.3 2.3
n-헥산 6.9 0.9
벤젠 5.7 3.2
톨루엔 5.9 3.8
자일렌 5.9 3.7
디클로로메탄 4.7 1.4
클로로포름 4.8 1.8
표 8에 나타낸 바와 같이, 가수분해시 물과 유기용매를 함께 넣은 경우에는 물만 사용할 때 보다 리퀴리티게닌 함량이 다소 낮으며 유기용매 단독으로 할 경우보다는 높은 리퀴리티게닌 함량을 나타냄을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 방법에서는 리퀴리틴이 함유된 감초 추출물에 물을 넣고 분산시킨 후 곧바로 산을 첨가하며, 반응 온도를 높여 리퀴리티게닌 함량을 증가시켰다.
< 실험예 3> 리퀴리티게닌 침전물의 함량증진방법
(1) 용매에 따른 리퀴리티게닌 함량
본 발명에 따라 리퀴리틴이 함유된 감초 추출물에 산을 가하여 상기 리퀴리틴을 리퀴리티게닌으로 가수분해 후 침전물을 유기용매에 녹이고 정제수로 세척한 후 불순물들의 제거와 리퀴리티게닌 함량이 얼마나 증가되는지를 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
상기 <실험예 2>에서 수득한 리퀴리티게닌 함유 감초 추출물 10 g(리퀴리티게닌함량: 8.5%)을 100 ml의 유기용매에 넣어 녹인 후, 물 100 ml로 두 번 씻은 후 유기용매를 감압증류 및 건조시켜 리퀴리티게닌이 함유된 생성물을 수득하였다. 상기 생성물 내 리퀴리티게닌의 함량을 실시예 1의 리퀴리티게닌의 함량 측정법을 이용하여 측정하고, 표 9에 나타내었다.
유기용매 리퀴리티게닌 함량(%) 감초 또는 감초 추출물 무게(g)
n-부탄올 10.3 8.6
t-부탄올 10.7 8.1
에칠아세테이트 11.5 7.5
디메틸에테르 8.9 9.3
디에틸에테르 9.2 9.6
디메틸포름아미드 10.4 8.2
n-헥산 안녹음
벤젠 8.6 9.1
톨루엔 9.0 9.4
디클로로메탄 8.7 9.8
클로로포름 8.5 9.9
표 9에 나타난 바와 같이, 극성용매인 부탄올, 에칠아세테이트 디메틸포름아미드 등에서 10%대가 넘는 리퀴리티게닌의 함량을 보였으며 무극성용매에서는 잘 녹지 않거나 리퀴리티게닌의 함량증가가 미미하였다. 이는 유기용매에 녹인 후 물로 씻는 과정에서 리퀴리티게닌이 아닌 불순물들이 제거되는 것을 확인하였다.
(2) 감초의 리퀴리틴 함량에 따른 리퀴리티게닌 함량
감초에 함유된 리퀴리틴 양에 따른 리퀴리티게닌 함량을 알아보기 위하여 각각 다른 리퀴리틴의 함량을 가지고 있는 감초를 가지고 상기 <실시예 4> 방법과 동일한 방법으로 수행하여 리퀴리티게닌이 함유된 생성물을 수득한 후, 상기 생성물 내 리퀴리티게닌의 함량을 실시예 1의 리퀴리티게닌의 함량 측정법을 이용하여 측정하고, 그 결과를 표 10에 나타내었다.
리퀴리틴 함량(%) 리퀴리티게닌 함량(%) 감초 또는 감초 추출물 무게(g)
0.52 5.7 6.1
0.78 8.4 6.2
0.98 11.5 6.3
1.35 14.2 6.3
1.81 18.3 6.8
2.54 23.1 7.1
표 10에 나타난 바와 같이, 감초의 리퀴리틴 함량이 높을수록 리퀴리티게닌 함량 및 감초 또는 감초 추출물의 수율이 증가함을 알 수 있다. 수율을 높이기 위해 리퀴리틴의 함량이 많은 감초를 선택하여 추출하는 것이 바람직하다.
< 실험예 4> 리퀴리티게닌이 함유된 감초 추출물의 건조 방법
본 발명에 따라 상기 <실시예 1>에서 리퀴리티게닌이 함유된 침전물을 에칠아세테이트에 녹인 후 에칠아세테이트를 건조하는 공정에서 아래와 같은 방법을 사용하여 건조 후 리퀴리티게닌 함유 감초추출물의 잔류용매를 측정하고, 그 결과를 표 11에 나타내었다.
1) 열풍건조의 방법으로 40 ℃에서 48시간 동안 건조하였다.
2) 열풍건조의 방법으로 50 ℃에서 48시간 동안 건조하였다. 추출물이 서로 엉겨 고점성의 추출물이 되는 양상을 보였다.
3) 감압건조의 방법으로 50 ℃에서 24시간 동안 건조하였다.
4) 감압건조의 방법으로 60 ℃에서 24시간 동안 건조하였다.
5) 감압건조의 방법으로 70 ℃에서 24시간 동안 건조하였다.
6) 감압건조의 방법으로 50 ℃ 이상에서 5시간 건조 후, 건조물 30 g에 에탄올 300 ml를 넣어 녹인 다음 감압건조의 방법으로 50 ℃에서 24시간 동안 건조하였다.
7) 감압건조의 방법으로 50 ℃ 이상에서 5시간 건조 후, 건조물 30 g에 에탄올 300 ml를 넣어 녹인 다음 감압건조의 방법으로 60 ℃에서 24시간 동안 건조하였다.
8) 감압건조의 방법으로 50 ℃ 이상에서 5시간 건조 후, 건조물 30 g에 에탄올 300 ml를 넣어 녹인 다음 감압건조의 방법으로 70 ℃에서 24시간 동안 건조하였다.
건조방법 잔류용매 (%)
에칠아세테이트 에탄올 합계
1) 7.2 0 7.2
2) 6.4 0 6.4
3) 2.7 0 2.7
4) 2.5 0 2.5
5) 2.2 0 2.2
6) 0 1.4 1.4
7) 0 1.1 1.1
8) 0 0.7 0.7
표 11에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 1>에서 리퀴리티게닌이 함유된 침전물을 에칠아세테이트에 녹인 후 에칠아세테이트를 건조하는 방법으로 열풍건조보다 감압건조 방법을 사용하는 것이 잔류용매의 함량을 낮추는 데에 바람직하며, 감압건조시 온도가 높을수록 잔류용매의 함량이 낮아짐을 알 수 있다.
또한, 침전물을 에칠아세테이트에 녹인 후, 감압건조한 다음 다시 에탄올에 녹여 감압건조할 때 잔류용매의 함량이 대폭 감소함을 확인하였다.
따라서, 리퀴리티게닌이 함유된 침전물을 유기용매에 녹인 후 건조시 감압건조의 방법을 사용하며, 건조 후, 다시 에탄올에 녹여 감압건조하는 방법을 추가로 사용할 수 있다.

Claims (12)

  1. 감초에 물, 유기용매 또는 물과 유기용매의 혼합용매를 이용하여 리퀴리틴이 함유된 생성물을 추출하는 단계(단계 1); 및
    상기 단계 1에서 추출된 리퀴리틴이 함유된 생성물에 물을 가하고, 산을 첨가하여 상기 리퀴리틴을 가수분해시켜 리퀴리티게닌이 함유된 침전물을 제조하는 단계(단계 2)를 포함하는 감초 또는 감초 추출물에서의 개선된 리퀴리티게닌의 추출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 1의 유기용매는 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, t-부탄올, 아세톤, 아세토나이트릴, 에칠아세테이트, 테트라하이드로퓨란, 디메틸에테르, 디에틸에테르 및 디메틸포름아미드, 벤젠, 톨루엔, 자일렌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 감초 또는 감초 추출물에서의 개선된 리퀴리티게닌의 추출 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 메탄올 또는 에탄올은 70~100% 메탄올 또는 70~100% 에탄올인 것을 특징으로 하는 감초 또는 감초 추출물에서의 개선된 리퀴리티게닌의 추출 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계 1의 추출은 30~100 ℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 감초 또는 감초 추출물에서의 개선된 리퀴리티게닌의 추출 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단계 1의 추출 방법은 가온교반 추출, 환류 추출 또는 초음파 추출 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 감초 또는 감초 추출물에서의 개선된 리퀴리티게닌의 추출 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단계 2에서 사용되는 산은 황산, 염산, 질산 또는 이의 혼합용액인 것을 특징으로 하는 감초 또는 감초 추출물에서의 개선된 리퀴리티게닌의 추출 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단계 2에서 사용되는 산은 1~5M 황산 또는 1~5M 질산인 것을 특징으로 하는 감초 또는 감초 추출물에서의 개선된 리퀴리티게닌의 추출 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단계 2의 가수분해 반응은 50~100 ℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 감초 또는 감초 추출물에서의 개선된 리퀴리티게닌의 추출 방법.
  9. 제1항에 있어서, 단계 2에서 수득한 리퀴리티게닌을 유기용매에 용해시키고, 물로 여러 번 세척한 후, 유기층을 감압 농축 및 건조하여 리퀴리티게닌의 함량을 증가시키는 단계를 더 포함하는 감초 또는 감초 추출물에서의 개선된 리퀴리티게닌의 추출 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 유기용매는 n-부탄올, t-부탄올, 에칠아세테이트, 디메틸에테르, 디에틸에테르 및 디메틸포름아미드, 벤젠, 톨루엔 및 자일렌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 감초 또는 감초 추출물에서의 개선된 리퀴리티게닌의 추출 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 건조는 감압건조인 것을 특징으로 하는 감초 또는 감 초 추출물에서의 개선된 리퀴리티게닌의 추출 방법.
  12. 제9항에 있어서, 단계 2에서 수득한 리퀴리티게닌을 유기용매에 용해시키고, 물로 여러번 세척한 후, 유기층을 감압 농축 및 건조한 다음 다시 에탄올에 녹인 후 감압건조하여 잔류용매의 함량을 감소시키는 단계를 더 포함하는 감초 또는 감초 추출물에서의 개선된 리퀴리티게닌의 추출 방법.
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