CN101113132B - 高纯度竹红菌乙素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种高纯度竹红菌乙素的制备方法。是从竹黄菌或竹红菌药材中提取并通过分离、结晶、酸碱转化、中和、洗涤、干燥及产品纯度分析得到高纯度竹红菌乙素(纯度大于90.0％以上)。本发明的提取物可分别制成软膏剂、酊剂、气雾剂、片剂、胶囊剂和注射剂等多种剂型，应用范围广泛。本发明的制备方法操作性强，提取率高，使用的溶剂价廉易得，对环境无污染。
Description
技术领域
本发明涉及中药材中提取方法，具体地说是从竹红菌或竹黄菌中提取高纯度竹红菌乙素(纯度大于90.0％)的方法，以及高纯度竹红菌乙素的应用。
背景技术
竹红菌乙素(HB)是从竹黄菌中药材中提取并通过分离、结晶、洗涤、酸碱处理、萃取、干燥等工艺制得的有效药用物质，其分子结构式见附图1。竹黄菌是我国一种传统的寄生性药用真菌，通常寄生在竹的幼茎、细嫩杆、枝上，是竹杆内分泌液干燥后的块状，分布于云南、江苏、浙江、安徽、福建、江西、湖北、湖南以及亚洲的日本等地。它具有清热化痰、清心定惊、舒筋活络、祛痛散淤等功效，民间多用竹红菌或竹黄菌浸酒，用于治疗风湿性关节炎、坐骨神经痛、腰肌劳损、跌打损伤、胃气痛、小儿惊风、急性肝炎等等。近年来，国内外学者对竹黄的生物学特性、化学成分、临床应用等方面进行了一系列的研究，取得了一些进展，竹黄独特的生理生化性质在医药、食品领域越来越受到人们的关注。为了全面评价竹红菌乙素的药理作用以及在医药生物领域的应用前景，现就竹红菌乙素理化特性、药理作用等方面作一简要综述。
1.理化特性
化学分析表明，竹黄中含有多种单体化合物。王景祥等人从福建仙游县出产的竹黄中，经醇提、硅胶柱层析分离等技术，分离鉴定了4种晶体，分别是甘露醇、硬脂酸、竹红菌甲素(hypocrelline A，HA)、竹红菌乙素(hypocrelline B，HB)。胡晓等人以四川峨眉山出产的野生竹黄为原料，分别以石油醚、乙酸乙酯为溶媒浸提，通过硅胶柱层析和制备薄层层析分离，分离鉴定出5种单体化合物，分别是竹红菌甲素、竹红菌乙素、六孢素、硬脂酸乙酯和硬脂酸。KIShi等人采用甲醇浸提、柱层析、制备性薄层析分离等技术成功地从野生竹黄中分离出了丙素(hypocrelline C，HC)。
在竹黄的众多活性成分中，以多种苝醌类衍生物的混合物为主，而竹红菌乙素的应用前景已引人瞩目。竹红菌乙素是竹黄的主要有效成分之一，也是竹黄中红色色素部分，它易溶于乙醇、乙醚、氯仿，部分溶于丙酮、甲醇，微溶于石油醚，不溶于水。醇溶液显暗红色，在紫外灯下观察显樱红色荧光，在碱溶液中颜色由暗红变绿。作为一种重要的天然光敏色素，竹红菌乙素在医药和食品领域有着巨大的潜在应用价值。
2.药理作用
现代医学研究表明，竹黄的药用价值主要体现在抗炎、镇痛、抗菌、抗肿瘤等方面。在1980年左右，云南省微生物研究所和云南省第一人民医院的科学工作者们就将竹红菌素用于外阴白色病变和软化疤痕疙瘩(肥厚性癍痕)的治疗，进而推广到光疗皮肤淀粉样变苔癣、牛皮癣、头癣等皮肤病。而后协和医院皮肤科又成功地将之用于光疗色素缺乏？刻皮肤白癫疯的治疗。
作为一种分布于自然界生物中的光敏色素，竹红菌乙素还具有良好的光敏杀伤肿瘤细胞和抑制爱滋病毒HIV的作用，这也是众多学者对于竹黄这一传统药用真菌表现出浓厚兴趣的主要原因。王景祥等对HB进行了小鼠肝癌H22的抑制作用研究，结果表明小鼠ig HB150mg/kg，作用7d，在光照下对鼠移植瘤株H22有明显的抑制作用，抑瘤率为34.0％-41.6％。
周乃康等采用竹红菌乙素-PDT与血卟啉衍生物-PDT对人肺癌细胞杀伤效应的比较研究表明，HB-PDT对人肺癌细胞株具有很强的杀伤效应，其IC50为33.82ng/ml，而HpD人肺癌细胞株的IC50为316.88ng/ml，二者比较差异有统计学意义(P＜0.01)。HB-PDT对肺癌细胞株的杀伤效应明显优于HpD-PDT，是一种对肿瘤细胞杀伤所需浓度范围小，杀伤强度高的新一代光敏剂。竹红菌乙素作为一种光动力学物质，具有很强的抗菌活性。万象义等用纸片法对竹红菌乙素进行了抑菌实验，结果表明竹红菌素在光照下可以抑制某些微生物优其是革兰氏阳性菌)的生长，不同光源、不同光照强度对其抑菌强度均有影响。松枝澄等则认为竹黄的一些活性成分(竹红菌乙素)可以作为植物素抑制某些菌类的代谢.其中机理可能与细胞类脂过氧化机制有关。
3.在食品生物领域的应用
竹红菌乙素是竹红菌和竹黄菌中主要活性成分，就是竹黄的红色色素部分，可溶于乙醇、氯仿和丙酮等有机溶剂，色泽暗红且富有保健功能，所以它作为一种脂溶性食品添加剂(食用色素)，具有独特的优点和广阔的应用前景。寇娴等对市售竹黄浸泡液利用制备性薄层层析、重结晶等技术进行红色素的提取与鉴定，并对成色物质竹红菌甲素和竹红菌乙素进行了热稳定性和酸碱稳定性的研究，认为它能在酸性至pH8.2范围内保持鲜红的色泽，且具有较强的热稳定性。广泛地在医药、食品、农药等领域得到应用，造福人类。
然而，现有的从竹红菌或竹黄菌中提取竹红菌乙素的方法，所提取得到的竹红菌乙素的纯度不高，造成资源的浪费和影响药物的疗效。本发明的制备方法操作性强，提取率高(＞90％)；使用的溶剂价廉易得，对环境无污染；可将竹红菌甲素有效转化为竹红菌乙素，有效活性成分纯度高，使用更安全有效。
发明内容
本发明的目的是提供一种从竹红菌或竹黄菌中分离、纯化制得高纯度竹红菌乙素(纯度大于90.0％)的制备方法。
本发明的高纯度竹红菌乙素(Hypocrellin B)的制备方法按以下步骤进行：
1)粗提：以竹红菌药材为原料，将竹红菌药材粉碎成粗粉；加5～20倍量75％～95％乙醇热回流0.5～4小时，放冷至室温，倾出上清夜，药渣加乙醇重复回流提取2次，合并前后3次的乙醇提取溶液；
2)浓缩、自然结晶：将乙醇提取液分别转入蒸馏瓶中，减压回收乙醇至原体积的2/3，静置，使其自然结晶；
3)酸、碱处理：倾去母液，结晶尽量挥尽乙醇，结晶用20～80℃纯化水洗涤3次，尽量倾尽水液，将水不溶物溶入5～40倍0.5～20％氢氧化钠或氢氧化钾溶液中，并用氯仿萃取至有机相基本无色，收集有机相；水相中再加入与氢氧化钠溶液等浓度和等体积的盐酸溶液，摇匀，放冷；用氯仿萃取，直至水相变为茶色而有机相基本无色，收集有机相；这样用酸碱处理重复萃取2～5次后，挥尽有机相得到结晶体；
4)结晶体用20～80℃的石油醚洗涤至石油醚溶液几乎无色，真空干燥即得高纯度竹红菌乙素，纯度大于90％；
然后进行高效液相色谱(HPLC)分析：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈∶甲醇∶2％醋酸(9∶2∶1)为流动相；检测波长为465nm，流速为0.8ml/min；柱温为25℃；进行含量测定，结果见附图2。
用本发明的提取物可分别制成软膏剂、酊剂、气雾剂、片剂、胶囊剂和注射剂等多种剂型，以及食品添加剂等，应用范围广泛。
本发明的高纯度竹红菌乙素的制备方法优点是：(1)制备方法操作性强，提取率高(＞90％)；(2)使用的溶剂价廉易得，对环境无污染；(3)可将竹红菌甲素有效转化为竹红菌乙素；(4)按本发明的制备方法制得纯度大于99.6％纯品，用于制备药物制剂的标准品，用于该药物制剂有效成分的质量控制和分析检测。
附图说明
图1是竹红菌乙素分子结构式；
图2是本发明提取的竹红菌乙素HPLC图谱。
具体实施方式
实施例1：
高纯度竹红菌乙素按以下步骤提取：
1)粗提：取竹红菌药材1.0Kg，粉碎成粗粉，加5倍量95％乙醇热回流1小时，放冷至室温，倾出上清夜，药渣加乙醇重复回流提取2次，合并前后3次的乙醇提取溶液；
2)浓缩、自然结晶：将乙醇提取液分别转入蒸馏瓶中，减压回收乙醇至原体积的2/3，静置，使其自然结晶；
3)酸、碱处理：倾去母液，结晶尽量挥尽乙醇，结晶用20℃纯化水洗涤3次，尽量倾尽水液，将水不溶物溶入1000ml 0.5％氢氧化钠溶液中，并用氯仿萃取至有机相基本无色，收集有机相；水相中再加入与氢氧化钠溶液等浓度和等体积的盐酸溶液，摇匀，放冷；用氯仿萃取，直至水相变为茶色而有机相几乎无色，收集有机相；这样用酸碱处理重复萃取2次后，挥尽有机相；
4)结晶体用20℃的石油醚洗涤至石油醚溶液基本无色，真空干燥即得高纯度竹红菌乙素，纯度大于99％；
实施例2：
高纯度竹红菌乙素按以下步骤提取：
1)粗提：取竹红菌药材1.0Kg，粉碎成粗粉，加20倍量75％乙醇热回流4小时，放冷至室温，倾出上清夜，药渣加乙醇重复回流提取2次，合并前后3次的乙醇提取溶液；
2)浓缩、自然结晶：将乙醇提取液分别转入蒸馏瓶中，减压回收乙醇至原体积的2/3，静置，使其自然结晶；
3)酸、碱处理：上述结晶用80℃纯化水洗涤3次，将水不溶物溶入200ml的10％氢氧化钾溶液中，并用氯仿萃取至有机相基本无色，收集有机相；水相中再加入与氢氧化钠溶液等浓度和等体积的盐酸溶液，摇匀，放冷；用氯仿萃取，直至水相变为茶色而有机相几乎无色，收集有机相；这样用酸碱处理重复萃取5次后，挥尽有机相得到结晶体。
4)结晶体用50℃的石油醚洗涤至石油醚溶液基本无色，真空干燥即得高纯度竹红菌乙素，纯度大于99.5％；
然后用高效液相色谱(HPLC)分析：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈∶甲醇∶2％醋酸(9∶2∶1)为流动相；检测波长为465nm，流速为0.8ml/min；柱温为25℃；进行含量测定。
Claims (1)
1.一种高纯度竹红菌乙素的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：
1)粗提：以竹红菌药材为原料，将竹红菌药材粉碎成粗粉；加5～20倍量75％～95％乙醇热回流0.5～4小时，放冷至室温，倾出上清夜，药渣加乙醇重复回流提取2次，合并前后3次的乙醇提取溶液；
2)浓缩、自然结晶：将乙醇提取液分别转入蒸馏瓶中，减压回收乙醇至原体积的2/3，静置，使其自然结晶；
3)酸、碱处理：上述结晶用20～80℃纯化水洗涤3次，将水不溶物溶加入0.5～20％氢氧化钠或氢氧化钾溶液中，并用氯仿萃取至有机相基本无色，收集有机相；水相中再加入与氢氧化钠溶液等浓度和等体积的盐酸溶液，摇匀，放冷；用氯仿萃取，直至水相变为茶色而有机相基本无色，收集有机相；按上述方法酸碱处理重复萃取2～5次后，挥尽有机相，得结晶体；
4)结晶体用20～50℃的石油醚洗涤至石油醚溶液基本无色，真空干燥即得高纯度竹红菌乙素，纯度大于95％。
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