CN110143992A - 具有抗炎活性的麦角甾醇类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了如结构式所示的紫芝中具有抗炎活性的麦角甾醇类化合物,同时还公开了该类化合物的制备方法和在制药中的应用。该类化合物可以作为NO抑制剂用于制备抗炎药物。
Description
技术领域
本发明属于药物技术领域,具体涉及从紫芝中提取分离得到的麦角甾醇类化合物及其制备方法和它们作为NO抑制剂在制备抗炎药物中的应用。
背景技术
一氧化氮(NO)是具有生物学调控功能的化学物质,在对炎症研究方面具有重要的参考和应用价值。研究证明当巨噬细胞受到毒素物质、炎症介质等刺激时,会导致一氧化氮合成酶(iNOS)的大量生成,一氧化氮合成酶(iNOS)通过催化其底物中的L-精氨酸,产生NO为主要产物的免疫应答反应,因此在炎症活性筛选中NO的生成量的多少可以作为受试药物抗炎活性的重要指标。用LPS诱导小鼠巨噬细胞(RAW 264.7)建立体外炎症模型,应用Griess试剂显色法检测培养上清液中NO水平,以受试药物抑制NO释放的能力作为筛选指标,评价化合物的抗炎活性。
灵芝在我国已有2000多年的应用历史,被历代医药家视为滋补强壮、扶正固本的神奇珍品。灵芝产于欧洲、美洲、非洲、亚洲东部。我国普遍分布,但以长江以南为多,分布于长江以南高温多雨地带,具体省份为:湖南、安徽、江西、福建、广东、广西。目前,已知灵芝属(Ganoderma)真菌约100余种,分布最广的为赤芝(G.lucidum),其次为紫芝(G.sinense),还有树舌灵芝(G.applanatum)、松杉灵芝(G.tsugae)和簿树芝(G.capense)等均供药用。国内外药理研究证明,灵芝具有多方面的生物活性,如抗炎(Liu,C.D.;Yang,N.;Song,Y.;Wang,L.X.Int.Immunopharmacol.2015,27,224-231;Hasnat,M.A.;Pervin,M.;Cha,K.M.;Kim,S.K.;Lim,B.O.Phytochemistry 2015,114,25-136.),免疫调节(Shi,Y.L.;Cai,D.H.;Wang,X.J.;Liu,X.S.Int.J.Vitam.Nutr.Res.2012,82,383-390;Jan,R.H.;Lin,T.Y.;Hsu,Y.C.;Lee,S.S.;Lo,S.Y.BMC Immunol.2011,12,31.),肝保护(Liu,Y.J.;Du,J.L.;Cao,L.P.;Jia,R.Int.Immunopharmacol.2015,25,112-120.),抗肿瘤(Liang,Z.G.;Yi,Y.J.;Guo,Y.T.;Wang,R.C.;Hu,Q.Int.J.Mol.Sci.2014,15,9103-9116;Sun,X.B.;Zhao,C.;Pan,W.;Wang,J.P.;Wang,W.J.Carbohydr.Polym.2015,123,283-287;Yu,Q.;Nie,S.P.;Wang,J.Q.;Huang,D.F.;Li,W.J.;Xie,M.Y.J.Agric.Food Chem.2015,63,517525.)等作用。现有技术中未见有麦角甾醇类化合物及其作为NO抑制剂在制备抗炎药物中的应用的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一系列麦角甾醇类化合物及其制备方法和应用。该类化合物可以作为NO抑制剂用于制备抗炎药物。
为了实现本发明的上述目的,本发明提供了如下的技术方案:
具有如下结构式所示的麦角甾醇类化合物,
本发明同时提供了麦角甾醇类化合物的制备方法,该方法包括以下步骤:
(1)采用紫芝的干燥子实体为原料,用体积分数为50-95%的乙醇水溶液回流提取1-3次,每次提取1-6小时,合并得到提取液,将提取液去除溶剂得到总浸膏;
(2)将总浸膏用有机溶剂进行萃取,得到有机萃取液,将有机萃取液浓缩后得到有机溶剂层浸膏;所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚及正丁醇中的一种或几种;
(3)将有机溶剂层浸膏通过色谱分离法进行分离。
如所述的制备方法,其中步骤(1)中所述的乙醇水溶液浓度为70-95%。
如所述的制备方法,其中步骤(3)中使用硅胶柱色谱,采用二氯甲烷/甲醇或三氯甲烷/甲醇系统梯度洗脱,洗脱梯度为100︰1-0︰1。
如所述的制备方法,其中流分C6(二氯甲烷/甲醇系统20:1-10:1)经反相RP-18柱层析,甲醇/水10%-100%洗脱得4个亚流分;流分C6-3(二氯甲烷/甲醇系统15:1-10:1)经HPLC(MeCN/H2O,20%-60%,8mL/min)得到化合物1(6mg,tR=12.4min),2(4mg,tR=18.3min),和3(2mg,tR=20.1min)。
本发明的麦角甾醇类化合物的制备方法包括以下步骤:紫芝子实体粉碎,95%乙醇回流提取2h,合并提取液并减压回收溶剂的粗提物,将粗提物混悬于水中,用等体积乙酸乙酯萃取三次,合并萃取液减压浓缩的乙酸乙酯萃取物,该萃取物经硅胶200-300目柱色谱,三氯甲烷/甲醇系统100:1,50:1,20:1,10:1,5:1,2:1,1:1和0:1v/v梯度洗脱,收集得到7个流分,流分C6经反相RP-18柱层析,甲醇/水10%-100%洗脱得4个亚流分,C6-3流分经HPLC,MeCN/H2O,20%-60%,8mL/min,得到化合物1,2和3。
本发明另外还提供了一种药物组合物,包含所述的麦角甾醇类化合物和药学上可接受的赋形剂。
和一种药物制剂,含有治疗有效量的所述的麦角甾醇类化合物或所述的药物组合物和药学上可接受的载体和/或赋形剂。
此外,本发明还提供了所述的麦角甾醇类化合物或药物组合物或药物制剂在制备抗炎药物中的应用。
以及,所述的麦角甾醇类化合物或药物组合物或药物制剂作为NO抑制剂在制药中的应用。
根据本领域公知的筛选用脂多糖(LPS)诱导的RAW246.7小鼠巨噬细胞建立体外炎症模型,应用Griess试剂显色法检测培养上清液中NO水平,以受试药物抑制NO释放的能力作为筛选指标,评价化合物的抗炎活性。研究发现化合物1-3能明显抑制脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞的NO生成,表明本发明所述化合物具有明显的抗炎活性,可用于抗炎药物的制备。
本发明麦角甾醇类可以直接应用,也可以与其它药物包括植物提取物组成复方的形式使用,可以使用不同的药用辅料,制成多种固体制剂和液体制剂。本发明的药物可经口服和注射两种形式给药。使用量可根据给药途径、患者的年龄、体重、所治疗疾病的类型和严重程度等变化进行一次或多次使用。
本发明相对现有技术具有如下的优点及效果:(1)提供了一系列结构新颖的化合物;(2)运用体外活性筛选体系进行活性评价,发现本发明涉及的麦角甾醇类化合物及其作为NO抑制剂用作抗炎药物、用于制备抗炎药物的应用或者用于治疗验证疾病的用途。
附图说明
图1为本发明的麦角甾醇类化合物的结构示意图。
具体实施方式:
下面结合附图,用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容,但并不以此来限定本发明。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明的范围。
实施例1:
化合物的分离纯化:
制备化合物的方法,紫芝子实体粉碎,95%乙醇回流提取2h,合并提取液并减压回收溶剂的粗提物,将粗提物混悬于水中,用等体积乙酸乙酯萃取三次,合并萃取液减压浓缩的乙酸乙酯萃取物,该萃取物经硅胶200-300目柱色谱,三氯甲烷/甲醇系统(100:1,50:1,20:1,10:1,5:1,2:1,1:1和0:1v/v)梯度洗脱,收集得到7个流分。流分C6经反相RP-18柱层析,甲醇/水10%-100%洗脱得4个亚流分。C6-3流分经HPLC(MeCN/H2O,20%-60%,8mL/min)得到化合物1(6mg,tR=12.4min),2(4mg,tR=18.3min),和3(2mg,tR=20.1min)。
通过理化常数和现代波谱学手段(MS、NMR),结合文献相关数据,鉴定了它们的结构,化合物1-3均为未见文献报道的新化合物,如下所示:
化合物1-3的结构鉴定数据:
表1化合物1-3的氢谱和碳谱数据
1H(600MHz)and 13C(150MHz)NMR.Measured in MeOD.
The assignments were based on HSQC,HMBC,COSY and ROESY experiments.
所得各化合物的物理化学常数如下:
化合物1:无色晶体(MeOH),mp 245-246.[α]18 D=+103.1(c 1.8,MeOH).UV(MeOH)λmax(logε)240(3.27),211(2.61)nm.IR(KBr)3350,2945,1660,1454,1114,1031cm-1.1H(600MHz)and 13C NMR(150MHz)data(methanol-d4):数据见表1;HRESIMS:m/z447.34702[M+H]+(calcd for C28H47O4 +,447.34689).
化合物2:无色晶体(MeOH),mp:225-228.[α]20 D=+38.6(c 0.4,MeOH).UV(MeOH)λmax(logε)240(3.36),210(2.84)nm.IR(KBr)3348,2945,1645,1454,1114,1031cm-1.1H(600MHz)and 13C NMR(150MHz)data(methanol-d4):数据见表1;HRESIMS at m/z469.32913[M+Na]+(calcd for C26H34NO8Na,469.32883).
化合物3:无色晶体(MeOH),mp:234-235.White powder.[α]24 D=+6.8(c 0.3,MeOH).UV(MeOH)λmax(logε)240(2.94),211(2.28)nm.IR(KBr)3338,2945,1646,1452,1114,1031cm-1.1H(600MHz)and 13C NMR(150MHz)data(methanol-d4):数据见表1;HRESIMS at m/z 447.34693[M+H]+(calcd for C28H46O4Na+,447.34689).
实施例2:
抗炎活性试验
将单体化合物1-3分别作用于脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞,用Griess试剂显色法检测培养上清液中NO水平,以受试药物抑制NO释放的能力作为筛选指标,评价化合物的抗炎活性。
1.药物溶液的配制:
(1)将单体化合物1-3分别用DMSO配制成100μg/ml溶液,置于-4℃保存;
(2)LPS:E.Coli O111:B4(美国默克密理博公司,产品编号:LPS25),用重蒸水配制成100μg/mL溶液,-20℃保存。
2.细胞株:RAW264.7小鼠巨噬细胞,由中国科学研究院上海分院提供。
3.试验方法:
(1)单个小鼠巨噬细胞悬液用含10%的胎牛血清培养液配制而成,取对数期的小鼠巨噬细胞RAW264.7接种到96孔板中,每孔100μL,设置3个复孔。
(2)经过24小时培养,每孔加入不同浓度的受试药物,同时加入1μg/mL LPS。
(3)经37℃培养18小时后,每孔加Griess A、B溶液100μL,继续培养5分钟,停止培养。
(4)用酶联免疫检测仪测取570nm波长处的光密度(OD)值,并计算NO抑制率。
化合物1-3对细胞系的NO抑制作用(IC50)如表2所示。
表2.化合物1-3对RAW 264.7细胞中NO的抑制作用(IC50,μM;apositive control).
由表2中数据可见,化合物1-3均对脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7中NO的生成量有明显抑制,表明本发明所述化合物具有明显的抗炎活性。因此可以用于制备新的抗炎活性药物。
实施例3:
注射液制剂的制备:
按实施例1的方法先得到本发明的化合物1、2、3,取其中一种或几种化合物50mg,将其溶解于2毫升丙二醇中,过滤所得溶液在无菌条件下装入安瓿瓶中。
实施例4:
粉剂的制备:
按实施例1的方法先得到本发明的化合物1、2、3,取其中一种或几种化合物与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂,制成粉剂。
实施例5:
片剂的制备:
按实施例1的方法先得到本发明的化合物1、2、3,取其中一种或几种化合物,按其与赋形剂重量比为1:5-1:10的比例加入赋形剂,制粒压片。
实施例6:
口服液制剂的制备:
按实施例1的方法先得到本发明的化合物1、2、3,取其中一种或几种化合物,按常规口服液制法制成口服液。
实施例7:
胶囊剂、颗粒剂、或冲剂的制备:
按实施例1的方法先得到本发明的化合物1、2、3,取其中一种或几种化合物,按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂,制成胶囊或颗粒剂或冲剂。
虽然本发明已将较佳实施例揭示如上,然而其并非用以限定本发明的内容,任何熟悉此技艺者,在不脱离本发明的主要精神和内容范围内,当可作各种更改与润饰,因此发明的保护范围应以本申请的实质性内容为准。
Claims (10)
1.具有如下结构式所示的麦角甾醇类化合物,
2.权利要求1所述的麦角甾醇类化合物的制备方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
(1)采用紫芝的干燥子实体为原料,用体积分数为50-95%的乙醇水溶液回流提取1-3次,每次提取1-6小时,合并得到提取液,将提取液去除溶剂得到总浸膏;
(2)将总浸膏用有机溶剂进行萃取,得到有机萃取液,将有机萃取液浓缩后得到有机溶剂层浸膏;所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚及正丁醇中的一种或几种;
(3)将有机溶剂层浸膏通过色谱分离法进行分离。
3.如权利要求2所述的麦角甾醇类化合物的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述的乙醇水溶液浓度为70-95%。
4.如权利要求2所述的麦角甾醇类化合物的制备方法,其特征在于,步骤(3)中使用硅胶柱色谱,采用二氯甲烷/甲醇或三氯甲烷/甲醇系统梯度洗脱,洗脱梯度为100︰1-0︰1。
5.如权利要求4所述的麦角甾醇类化合物的制备方法,其特征在于,流分C6(二氯甲烷/甲醇系统20:1-10:1)经反相RP-18柱层析,甲醇/水10%-100%洗脱得4个亚流分;流分C6-3(二氯甲烷/甲醇系统15:1-10:1)经HPLC(MeCN/H2O,20%-60%,8mL/min)得到化合物1(6mg,tR=12.4min),2(4mg,tR=18.3min),和3(2mg,tR=20.1min)。
6.制备权利要求1所述的麦角甾醇类化合物的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:紫芝子实体粉碎,95%乙醇回流提取2h,合并提取液并减压回收溶剂的粗提物,将粗提物混悬于水中,用等体积乙酸乙酯萃取三次,合并萃取液减压浓缩的乙酸乙酯萃取物,该萃取物经硅胶200-300目柱色谱,三氯甲烷/甲醇系统100:1,50:1,20:1,10:1,5:1,2:1,1:1和0:1v/v梯度洗脱,收集得到7个流分,流分C6经反相RP-18柱层析,甲醇/水10%-100%洗脱得4个亚流分,C6-3流分经HPLC,MeCN/H2O,20%-60%,8mL/min,得到化合物1,2和3。
7.一种药物组合物,包含权利要求1所述的麦角甾醇类化合物和药学上可接受的赋形剂。
8.一种药物制剂,含有治疗有效量的权利要求1所述的麦角甾醇类化合物或权利要求7所述的药物组合物和药学上可接受的载体和/或赋形剂。
9.权利要求1所述的麦角甾醇类化合物或权利要求7所述的药物组合物或权利要求8所述的药物制剂在制备抗炎药物中的应用。
10.权利要求1所述的麦角甾醇类化合物或权利要求7所述的药物组合物或权利要求8所述的药物制剂作为NO抑制剂在制药中的应用。
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