CN1240397C - 从孕马尿液中制备结合雌激素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从孕马尿液(PMU)中制备结合雌激素的方法，该方法包括以下步骤：(a)用碱性溶剂处理PMU物质；(b)过滤经处理的PMU物质以去除粘液物质和固体；(c)将经过滤的PMU产物与足量的聚苯乙烯吸收剂树脂接触；以及(d)用水混溶性溶剂洗脱树脂以分离结合雌激素和树脂，然后获得结合雌激素的粗提取物。

Description

从孕马尿液中制备结合雌激素的方法

本发明涉及从孕马尿液(PMU)中制备结合雌激素的方法。

结合雌激素是治疗更年期综合征的有效药物。人们发现来自诸如孕马尿液(PMU)的天然来源的结合雌激素对治疗更年期综合征特别有效。

从PMU中用极性有机溶剂提取可获得含结合雌激素的提取物。然而，这种液-液提取法有很多问题，如起泡，沉淀，乳化和相分离不佳。因此，研发了一种固-液提取法，以便从PMU中提取结合雌激素。

H.L.Bradlow等，类固醇，11(1968)，第265-272页，公开了AmberliteXAD-2(一种苯乙烯-二乙烯苯共聚物，由Rohm&Haas提供)，它被建议用于从尿液中提取结合雌激素。然而，所得的吸附能力较低。通过使用Bradlow的方法，提取物中的混合残余物通常含有10％或更低的尿液固体。

1973年10月30日公告的Thompson L.美国专利3,769,401提出使用Dowex 1-X2-C1以从尿液中提取结合雌激素，Dowex 1-X2-C1是一种含有季铵官能团的强碱性阴离子交换树脂，该季铵官能团附着到苯乙烯二乙烯苯共聚物上。

1965年Hahnel，R.，Anal Biochem以及1969年Hobkrik，R.，Musey，P.I.和Nilsen，M.，类固醇中，发现DEAE-Sephadex(二乙基氨基乙基，DEAESephadex)可用于分离结合雌激素。然而，结果表明为了洗脱雌激素结合物必需有盐梯度。P.I.Musey等，1997年5月，类固醇，Vol.29，No.5，第657-668页创造了一种分离雌激素结合物的等浓度法(isocraticmethod)，取代以前的色谱分离法，以便不使用梯度体系便可获得更高程度的分离度。DEAE-Sephadex可购自Pharmacial Piscataway。

1998年3月3日公告的Ivan Ban等的美国专利5,723,454，公开了一种方法，即通过混合物的固相提取，在非-离子半-极性聚合吸附剂树脂上，从孕马尿液中获得含结合雌激素天然混合物的提取物的方法。该法包括的步骤有：用微量过滤法过滤PMU，接触Amberlite XAD-7^TM，用NaOH清洗至pH为12.5-13.5，然后用EtOH∶水(30∶70)的溶液洗脱至pH约为12。美国专利5,723,454使用Amberlite XAD-7^TM作为一种半-极性聚合吸附剂树脂，这是一种由Rohm和Haas制造的大孔交联脂族聚羧酸酯。

1998年9月29日公告的Ivan Ban等的美国专利5,814,624公开了一种方法，即在反相(reverse-phase)(RP)硅胶上，通过混合物的固相提取，从孕马尿液中获得含结合雌激素天然混合物提取物的方法。该方法包括复杂的步骤：用沙床或微量过滤法过滤PMU，用NaOH调节PH值到大约13，然后用HCl调节PH到大约8-8.5，接触RP硅胶，用醋酸/醋酸钠缓冲液清洗，再用EtOH-水混合液清洗。美国专利5,814,624举例说明了由Merck制造的作为RP硅胶的硅胶60/二甲基硅烷衍生物。

尽管已研发的固相提取法克服了由液-液提取法带来的大部分弊端，但仍存在一些问题。例如，这种方法耗时；所用的树脂贮存期限有限并且成本高；对于大规模的生产，经吸附剂树脂处理的原材料的粘度太高；结合雌激素的总回收率较低，一般来讲，低于80％。

因此，本领域中需要有更有效高产的方法，从孕马尿液中回收雌激素。

本发明提供了从孕马尿液(PMU)中制备结合雌激素的方法，该方法使结合雌激素的回收率非常高，同时避免了常规使用的液-液和固-液提取法所产生的弊端。

通过从孕马尿液(PMU)中制备结合雌激素的方法可达到本发明的目，该方法包括以下步骤：(a)用碱性溶剂处理PMU物质；(b)过滤经处理的PMU物质以去除粘液物质及固体；(c)将经过滤的PMU产物与足量的聚苯乙烯吸收剂树脂接触；和(d)用水混溶性溶剂洗脱树脂以分离结合雌激素和树脂，然后获得结合雌激素的粗提取物。

本发明提供了从孕马尿液(PMU)中制备结合雌激素的方法，该方法包括以下步骤：(a)用碱性溶剂处理PMU物质；(b)过滤经处理的PMU物质以去除粘液物质和固体；(c)使经过滤的PMU产物与足量的聚苯乙烯吸收剂树脂接触；和(d)用水混溶性溶剂洗脱树脂以分离结合雌激素和树脂，然后获得结合雌激素的粗提取物。

一般来讲，原PMU的pH值为7-8。在本方法的步骤(a)中，在PMU中加入一定量的碱性溶剂，其足以提供pH值约9-12，优选9-11，以降低PMU的粘度，去除一些内酯和酚类物质如酚酸，并除去尿的气味。碱性溶剂的量可根据其浓度和PMU的量而变化。适合的碱性溶剂包括碱金属或碱土金属的氢氧化物或碳酸盐。优选的碱性溶剂包括氢氧化钠，氢氧化钾，碳酸钠和碳酸钾。最优选的碱性溶剂是氢氧化钠，其可使结合雌激素的回收率达到大约100％。

在本方法的步骤(b)中，过滤步骤(a)中用碱性溶剂处理的PMU物质以去除粘液物质和固体。按照本发明，最好用离心法来进行过滤。

在本方法的步骤(c)中，使步骤(b)中过滤的PMU产物接触足量的聚苯乙烯吸收剂树脂以吸收结合雌激素。聚苯乙烯吸收剂树脂优选的表面积为500-1500m²/g，孔容积为1.2-2.5ml/g，孔面积为80-350。术语“聚苯乙烯”是指含苯乙烯(苯基乙烯)单体的聚合物。典型地，聚苯乙烯吸收剂树脂含有下列结构式的部分：

用于本发明的适合的聚苯乙烯吸收剂树脂有由Mitsubishi制造的Diaion HP20和Sepabeads SP700。Diaion HP20的表面积约为600m²/g，孔容积约为1.5ml/g，孔面积为200到300。Sepabeads SP700表面积约为1200m²/g，孔容积约为2.1ml/g，孔面积为90到100。Diaion HP20和Sepabeads SP700均可达到大约100％的回收率。一般来讲SepabeadsSP700更优选。

在本方法的步骤(d)中，用足以分离结合雌激素和树脂的一定量的溶剂洗脱步骤(c)中的含结合雌激素的树脂，然后获得结合雌激素提取物。适合用于本发明的洗脱溶剂可以是任何一种水混溶性溶剂，优选低级链烷醇，如甲醇和乙醇，以及低级脂肪族酮，如丙酮。术语“低级”是指含有至多8个碳原子的化合物。

为了便于更深入地理解本发明，下面的实施例仅为阐明本发明的目的，而不构成对本发明的限制。

实施例1

收集45升孕马原尿液(PMU)，其pH值的范围在7到8，然后用10N NaOH溶液调节pH至11，并将其过滤。得到10.5升经NaOH处理的PMU，将其与20ml Sepabeads SP700接触。将所得吸附后的20ml的SP700，用230ml乙醇洗脱。获得137.004mg提取的结合雌激素，其回收率约为100％。

实施例2

重复实例1的步骤，不同的是：用KOH取代了NaOH，并且处理后的pH为9-11。回收率：93.53％。

实施例3

重复实例1的步骤，不同的是：用NaCO₃取代了NaOH，并且处理后的pH为9-11。回收率：85.44％。

实施例4

重复实例1的步骤，不同的是：用K₂CO₃取代了NaOH，并且处理后的pH为9-11。回收率：87.14％。

这些实施例显示了与现有技术的相比，本发明的方法能够得到更高的回收率。

应当理解本文描述的这些实施例仅为阐明本发明的目的，本领域熟练技术人员可以据此作出不同的修改和变化，这些修改和变化包括在本发明的构思和所附权利要求的范围内。

Claims (11)

1.从孕马尿液(PMU)中制备结合雌激素的方法，其依次包括以下步骤：

(a)用碱性溶剂处理PMU物质；

(b)过滤经处理的PMU物质以去除粘液物质和固体；

(c)使经过滤的PMU产物与足量的聚苯乙烯吸收剂树脂接触；和

(d)用水混溶性溶剂洗脱树脂以分离结合雌激素和树脂，然后获得结合雌激素的粗提取物。

2.如权利要求1的方法，其中所述碱性溶剂选自碱金属或碱土金属的氢氧化物或碳酸盐。

3.如权利要求2的方法，其中所述碱性溶剂选自氢氧化钠，氢氧化钾，碳酸钠和碳酸钾。

4.如权利要求3的方法，其中所述碱性溶剂是氢氧化钠。

5.如权利要求1至4中任一种方法，其中用碱性溶剂处理后的PMU溶液的pH值为9-11。

6.如权利要求1的方法，其中用离心法进行过滤。

7.如权利要求1的方法，其中所述聚苯乙烯吸收剂树脂含有下列结构式部分：

8.如权利要求1的方法，其中所述聚苯乙烯吸收剂树脂的表面积为600m²/g，孔容积为1.5ml/g，孔面积为200到300。

9.如权利要求1的方法，其中所述聚苯乙烯吸收剂树脂的表面积为1200m²/g，孔容积为2.1ml/g，孔面积为90到100。

10.如权利要求1的方法，其中所述洗脱溶剂选自低级链烷醇和低级脂肪族酮。

11.如权利要求10的方法，其中所述洗脱溶剂选自甲醇，乙醇或丙酮。