CN103720720A - 天然孕马结合雌激素纯化精制方法及其所用非离子非极性精细分离树脂的应用 - Google Patents

Abstract

一种天然孕马结合雌激素纯化精制方法及其所用非离子非极性精细分离树脂的应用，该方法包括第一步用非离子非极性精细分离树脂吸附含有孕马结合雌激素粗提物的起始液体、第二步用洗脱溶剂从负载有结合雌激素混合物的非离子非极性精细分离树脂上洗脱并获得纯化精制的结合雌激素混合物液体。本发明与现有技术相比，使所得结合雌激素纯度达到42.6%至61.8%，总结合雌激素收率为90.8%至97.2%，且没有异味、色泽明显变淡，呈细腻的淡黄色，这对于制备高质量的结合雌激素原料药和制剂产品是非常重要的，其工艺简单，精制效率高，特别适于大规模化生产。

Description

天然孕马结合雌激素纯化精制方法及其所用非离子非极性精细分离树脂的应用

技术领域

本发明涉及利用精细分离树脂对天然孕马结合雌激素粗提物进行纯化精制的技术领域，是一种天然孕马结合雌激素纯化精制方法及其所用非离子非极性精细分离树脂的应用。

背景技术

结合雌激素类药物主要用于激素替代疗法（Hormone Replacement Therapy, HRT），用于缓解任何雌激素不足的临床症状，治疗和预防女性生理或人工绝经后出现的更年期综合症，能够预防和治疗骨质疏松症，冠心病和老年痴呆症最新的临床研究发现早期HRT可以预防冠心病和老年痴呆。天然的结合雌激素以其好的疗效和耐受性得到了长久的应用。

结合雌激素来源于生物样品，成份复杂多样，目前发现，孕马尿提取物中至少含有200种以上的成份，许多成份的结构至今还不明确，它们的化学性质和生物活性尚未完全探明。

孕马尿中的化学成份复杂，要从孕马尿中提取分离有效成份，即结合雌激素，必须要借助于不断发展的提取分离技术，提取分离技术的发展过程往往也是提取设备以及分离材料多元化、现代化的过程。从20世纪30年代至今，结合雌激素的提取分离等方面的研究一直是国内外的研究热点，已有大量的专利公开和文献报道。

早期报道的结合态雌激素提取方法的专利有美国专利：NO.2429398、NO.2519516、NO. 2696265、NO. 2711988、NO. 2834712，主要是利用有机溶剂萃取法获得结合雌激素。现今，申请号为NO.2004072814的美国专利文献以及公开号为CN1691951A中国专利文献也公开使用了多种液-液萃取系统用于获得结合雌激素。

上世纪60年代开始出现利用活性炭，离子交换树脂以及凝胶色谱填料从孕马尿中获得结合雌激素的方法。另外，1998年9月29日公告的Ivan Ban等人的美国专利5814624公开了一种方法，即在反相(reverse—phase)(RP)硅胶上，通过固相提取，从孕马尿液中获得含结合雌激素天然提取物的方法。

从上世纪九十年代末应用新型的大孔树脂从孕马尿中获取结合雌激素开始逐渐显露出前所未有的优势。大孔吸附树脂是20世纪60年代初开发出的一类新型高分子分离材料，它是一种高聚物吸附剂，根据其孔径、比表面积及构成类型分为许多型号。根据其本身的特点，不同型号的大孔吸附树脂，从孕马尿中获得天然结合雌激素的方法也不同。公开的专利文献有：美国专利NO. 5723454，美国专利NO. 5814624,中国专利文献CN 1308083A、CN 1381240A、CN1526721A。

采用上述已公开的方法获取的天然结合雌激素提取物或提取液中除含有具有生物活性的结合态雌激素外，还含有其它尿内成份，如酚酸类，无机酸盐类。另外，其中还含有相当一部分为亲脂类成份，如：非结合型类黄酮，非结合型异类黄酮，主要包括各种黄酮，异黄酮，异戊二烯衍生物和类似化合物，例如专利文献WO2004/035067报道的7-羟基-4’-甲氧异黄酮，染料木黄酮，大豆黄素，鸡豆黄素等；非结合型类固醇类成份，主要包括非结合态孕激素以及非结合态雄激素，例如：3β，20β-二醇-5α-孕烷、孕酮、3β-羟基-16-酮-5α-雄烷、甲基睾丸素等成份；非结合型雌激素类成份。这些亲脂类化合物主要来源于妊娠孕马体内代谢产物，如激素等，摄入的植物等。这些亲脂化合物常以游离态形式存在，它们不是结合雌激素的活性有效成份，本身具有所不期望的生理作用，是结合雌激素提取物的杂质成份。这些杂质成份的存在还对结合雌激素提取物的品质构成了影响，如：结合雌激素提取物色泽较深，并带有不良的异味。以这种提取物为原料制备的药物制剂外观、气味不好，影响患者用药的依从性。另外，虽然结合雌激素天然混合物的组成不会应为额外存在的非结合型亲脂化合物而有所改变，但是基于干物质的结合雌激素含量却会因此降低。通过针对性地去除非结合型亲脂成份，可以提高所获得的提取物中活性成份（结合雌激素）的浓度。因此，为了去除结合雌激素提取物的杂质，淡化结合雌激素提取物的色泽，去除结合雌激素提取物的异味，提高结合雌激素基于干物质的比例，精制结合雌激素提取物提高结合雌激素的纯度，获得高质量结合雌激素，人们利用进一步的液-液萃取或进一步的树脂固相提取法对结合雌激素提取物进行精制，以下是已经公开报道的结合雌激素的精制方法。

美国专利No.2429398中，将溶剂萃取法所获得的结合雌激素浓缩物用粗苯或乙醚萃取进一步精制。美国专利No.2834712公开了高纯度低毒性雌激素混合物的制备方法，采用了多种溶剂和不同pH的萃取，其中需要应用大量溶剂如己烷和粗苯。这些毒性很强的有机溶剂在现在的制药工业化中是禁止或限制使用的。除了对环境污染严重的问题外，溶剂残留问题也直接影响到药物的安全性。

美国专利No.2551205中描述的是将获取的萃取液通过随后的萃取步骤和沉淀作用进一步提纯。萃取液浓缩后调酸至pH4-5,迅速用与水不溶的脂环烃或氯化烃类有机溶剂进行萃取将脂类、油或酚类杂质转移至有机相中去除。由于结合雌激素适宜的存在环境为中性至微碱性，上述酸性环境会导致有效成份部分水解，降低收率。因此一般需要该操作步骤非常迅速。但是，液-液萃取法固有的缺陷就是容易产生泡沫及发生乳化现象，液-液分相时间很长，因此很难达到快速的效果，从而导致有效成份损失较多。另外，美国专利No.2551205使用的脂环烃（例如己烷、粗苯、甲苯、环己烷）或氯化烃类（如氯仿、二氯乙烯、三氯乙烯、四氯化碳、氯苯）有机溶剂，这些毒性很强的有机溶剂，也存在环境污染和溶剂残留的问题。

中国专利公开号为CN1691951A中描述了通过液-液萃取的方法从酚类物质已经被贫化的孕马尿液中进一步通过溶剂萃取法将非结合型亲脂化合物去除从而获得精制的结合雌激素，用以制备符合制剂要求的结合雌激素药物。该专利中使用了乙酸乙酯等较为安全的有机溶剂，但是由于乙酸乙酯等溶剂对结合雌激素也有萃取溶解能力，操作条件不当会导致有效成份大量损失。液-液萃取方法一般很难一次把杂质成份完全萃取干净，一般需要反复萃取，其结果是导致更多的有效成份损失。另外，专利中将水性起始项调节pH至4.0-6.0，优选4.7-5.3。

另外，还有使用多步骤大孔树脂固相提取法用于精制纯化结合雌激素。美国专利NO.6855704中在使用了Dowex XAD2与RELITE ^TM  EXL 04树脂后，获得结合雌激素提取物，接着使用的DIAION HP20树脂以及利用正丁醇进行萃取都是对结合雌激素提取物进行进一步的精制。应用多种大孔树脂的同时再采用萃取的方法精制结合雌激素的步骤繁琐，精制步骤越多，结合雌激素有效成份流失越多，造成精制效率较低。

由现有技术已知的方法，结合雌激素的精制效率和产率上或者在所获得的结合雌激素精制物的纯度方面均不能达到满意的结果；需要诸多不同方法步骤和应用大量有机溶剂，操作复杂，造成运行成本庞大以及污染环境。液-液萃取调节酸性又会使结合雌激素不稳定。因此，寻找一种新型的精细分离树脂以及可工业化的简单易行的精制方法对树脂固相提取或液-液溶剂萃取法所得的结合雌激素提取物进行精制，去除酚类和亲脂类杂质提高结合雌激素的纯度，祛除异味，淡化色泽是本发明所要解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种天然孕马结合雌激素纯化精制方法及其所用非离子非极性精细分离树脂的应用；首次提出了非离子非极性精细分离树脂用于从孕马尿中提取天然结合雌激素的纯化精制工艺工程；其克服了现有技术之不足，避免了液-液萃取使用大量毒性有机溶剂，环境污染和有毒溶剂残留于药物的问题，还解决了现有精制效率较低、所得结合雌激素纯度低、收率不高的问题；本发明使所得结合雌激素纯度高、总结合雌激素收率高、且没有异味、色泽明显变淡，呈细腻的淡黄色，本发明工艺简单，精制效率高，特别适于大规模化生产。

本发明的技术方案之一是这样来实现的：一种天然孕马结合雌激素纯化精制方法，该方法包括第一步用非离子非极性精细分离树脂吸附含有孕马结合雌激素提取物的起始液体、第二步用洗脱溶剂从负载有结合雌激素混合物的非离子非极性精细分离树脂上洗脱并获得精制的结合雌激素混合物液体。

第一步中，含有孕马结合雌激素提取物的起始液体为：为孕马尿液经过溶剂萃取法提取获得的结合雌激素混合物溶解于水配制成的溶液或孕马尿液经过大孔树脂提取所获得的结合雌激素混合物溶解于水配制成的溶液。

例如，孕马尿液经过溶剂萃取法提取获得的结合雌激素混合物或孕马尿液经过大孔树脂提取所获得的结合雌激素混合物可以是：

1)孕马尿液经过溶剂液-液萃取法所获得的含有结合雌激素的混合物。该混合物可以通过例如美国专利NO.2696265、美国专利NO.2834712、国际专利申请书WO 01/27134以及国际专利申请WO 2004/035067中描述的方法获取。

孕马尿液使用大孔吸附树脂提取方法所获得的含有结合雌激素的混合物。该混合物可以通过例如已经在美国专利NO. 5723454和NO. 5814624或中国专利文献CN1133639C、CN1691951A、CN1589150A中描述的方法获取；

3)孕马尿液经过大孔吸附树脂提取和液-液萃取组合方法所获得的含有结合雌激素的混合物。该混合物可以通过上述列举的专利方法的组合所获取。

孕马尿液经过预选过滤、浓缩、纯化等方法步骤处理后所得的结合雌激素的混合物。

下面是对上述技术方案之一的进一步优化和/或选择：

含有孕马结合雌激素提取物的起始液体为：为孕马尿液经过溶剂萃取法获得的结合雌激素混合物溶解于水配制成的溶液或孕马尿液经过大孔树脂所获得的结合雌激素混合物溶解于水配制成的溶液。

上述非离子非极性精细分离树脂选用聚苯乙烯二乙烯基苯类非离子非极性精细分离树脂。

上述聚苯乙烯二乙烯基苯类非离子非极性精细分离树脂的平均粒径为4微米至200微米、比表面积为400平方米/克至1000平方米/克。

上述聚苯乙烯二乙烯基苯类非离子非极性精细分离树脂选用MCI GEL-CSP207P、MCI GEL-CHP55Y、MCI GEL-CHP20Y、MCI GEL-CHP20P、MCI GEL-CHP2MGP牌号的精细分离树脂中的一种或一种以上。

上述含有孕马结合雌激素提取物的起始液体，在10℃至60℃温度条件下，pH值为5至10、固形物浓度为0.01克/毫升至0.25克/毫升、速度为0.04体积份至5体积份的上述溶液/1体积份树脂/小时通过非离子非极性精细分离树脂。为确保流速的可控，可以在该溶液通过树脂时给予一定的压力。

上述洗脱溶剂为水或含有能与水混溶的低级烷醇水溶液或含有能与水混溶的低级脂肪酮水溶液,该能与水混溶的低级烷醇或该能与水混溶的低级脂肪酮所占比例的体积百分数为0至60%，优选的体积百分数为0％至40％。

上述洗脱溶剂，在10℃至60℃温度条件下，在pH值为5至10、洗脱溶剂的量为0.5体积份至30体积份洗脱溶剂／1体积份树脂、洗脱速度为0.1体积份至10体积份的洗脱溶剂/1体积份树脂/小时下，对负载有结合雌激素的非离子非极性精细分离树脂进行洗脱。为确保流速的可控，可以在该洗脱溶剂通过树脂时给予一定的压力。

收集所有流出树脂的洗脱液，可以用浓缩、干燥等已知的常规方法获得结合雌激素精制物，或可进一步经提纯处理。

本发明的技术方案之二是这样来实现的：一种非离子非极性精细分离树脂在天然孕马结合雌激素纯化精制中的应用。

下面是对上述技术方案之二的进一步优化和/或选择：

上述非离子非极性精细分离树脂选用聚苯乙烯二乙烯基苯类非离子非极性精细分离树脂。

上述聚苯乙烯二乙烯基苯类非离子非极性精细分离树脂的平均粒径在4至200微米范围内、比表面积在400至1000m ² /g范围内。

上述聚苯乙烯二乙烯基苯类非离子非极性精细分离树脂选用MCI GEL-CSP207P、MCI GEL-CHP55Y、MCI GEL-CHP20Y、MCI GEL-CHP20P、MCI GEL-CHP2MGP牌号的精细分离树脂中的一种或一种以上。上述MCI GEL-CSP207P、MCI GEL-CHP55Y、MCI GEL-CHP20Y、MCI GEL-CHP20P、MCI GEL-CHP2MGP牌号的精细分离树脂都是三菱化学MITSUBISHI CHEMICAL生产并在市场上销售的产品。

本发明惊人地发现，通过HPLC检测，往往在孕马结合雌激素粗提物的起始液体中可以检测到的一些非结合型类黄酮，非结合型异类黄酮杂质成份，如：鸡豆黄素，大豆黄素，芒柄花素，以及游离甾体类杂质成份，如：游离态雌酮，游离态马烯雌酮等，通过该非离子非极性精细分离树脂纯化后所得的结合雌激素精制物中， HPLC没有检测到这些杂质成份，这些杂质成份被吸附于该非离子非极性精细分离树脂上，不随流出液流出，也不被该纯化精致方法所用的洗脱溶剂洗脱下来，这些杂质成份意想不到地被去除了。非结合型类黄酮，非结合型异类黄酮在中国专利文献CN1691951A中都是作为需要去除的杂质，而游离甾体类杂质成份则是结合雌激素质量控制的一个重要指标，结合雌激素原料药中对游离甾体都有限量要求。该发明使用的精细分离树脂所使用的精细分离树脂具有去除亲脂类杂质的效果。

本发明惊人发现，特别是该方法所获得的结合雌激素精制物与孕马尿液经过溶剂萃取法或孕马尿液经过大孔树脂提取所获得的结合雌激素提取物相比，结合雌激素基于干物质的比例提高了20%-30%，同时没有明显的有效成份的损失。

本发明最明显的优点为：经过简单的精制过程所得的结合雌激素精制物没有异味、色泽明显变淡，呈细腻的淡黄色，这对于制备高质量的结合雌激素原料药和制剂产品是非常重要的。

本发明首次提出了非离子非极性精细分离树脂在天然孕马结合雌激素纯化精制中的应用,上述聚苯乙烯二乙烯基苯类非离子非极性精细分离树脂，其结构单元是聚苯乙烯二乙烯基苯，没有任何官能团以及离子基团取代，它是在三菱化学Diaion和Sepabeads大孔吸附树脂基础上设计的，是一种精细分离树脂。而其用于结合雌激素的精制还是第一次。

本发明方法与以往的多步骤大孔树脂纯化精制结合雌激素方法相比，步骤简单，只需要利用一种精细分离树脂以及简单的一步吸附-洗脱过程就可以达到纯化精制结合雌激素的目的，而美国专利NO.6855704中采用多步骤大孔树脂固相提取法用于精制纯化结合雌激素，使用了2种大孔树脂以及多个萃取步骤才达到精制纯化的目的，精制工艺极其烦琐，精制步骤越多，结合雌激素有效成份流失越多，造成精制效率低下。

另外，本发明方法与以往的液-液萃取法用以精制结合雌激素所使用的溶剂比较，使用的洗脱溶剂是可以与水相溶的低级烷醇或低级脂肪酮，溶剂毒性很低，使用量很小，一步完成，不需要反复提取。而液-液萃取去除亲脂性杂质方法所能使用有机溶剂一般选择为对结合雌激素几乎不溶的有机溶剂，如己烷、粗苯、甲苯、环己烷、氯仿、二氯乙烯、三氯乙烯、四氯化碳、氯苯）等这些毒性很强的有机溶剂，例如美国专利No.2429398和美国专利No.2551205，而这一类溶剂在现在的制药工业化中是禁止或限制使用的。虽然后来的中国专利CN1691951A使用了较为安全的有机溶剂乙酸乙酯等，但是由于乙酸乙酯等溶剂对结合雌激素也有萃取溶解能力，操作条件不当会导致有效成份大量损失。液-液萃取方法一般很难一次把杂质成份完全萃取干净，一般需要反复萃取，其结果是导致更多的有效成份损失并且会使用大量的有机溶剂。液-液萃取法运行成本庞大，容易产生泡沫，发生沉降和乳化现象从而降低其精制效率。

与以往的液-液萃取法的pH比较，本方法的中性或弱碱性环境更加能保证结合雌激素的稳定性。美国专利No.2551205中描述，将浓缩物酸化至pH2-6，优选4-5，然后进行萃取。美国专利No.2834712用盐酸调节pH约为5，用粗苯并随即用乙醚萃取。中国专利CN1691951A将水性起始项调节pH至4.0-6.0，优选4.7-5.3，然后用乙酸乙酯萃取，这些专利的弱酸性甚至酸性环境会导致结合雌激素水解生成游离的硫酸和游离的雌激素，游离的雌激素在应用时几乎没有活性。

本发明中所使用的非离子非极性精细分离树脂的再生优质性能也令人惊异，特别是其重复使用率，在重复使用50次后，该精细分离树脂的吸附能力以及分离性能都没有下降。其再生过程为70%至95%乙醇梯度洗脱至该树脂再生性能恢复，供下次精致使用。

在本发明中：起始液体为孕马尿液经过溶剂萃取法获得的结合雌激素混合物溶解于水配制成的溶液或孕马尿液经过大孔树脂所获得的结合雌激素混合物溶解于水配制成的溶液。

因为该精细分离树脂对各种方法所获得的结合雌激素提取物的溶液或经过过滤与浓缩所得的孕马尿液富集良好，又能选择性吸附结合雌激素的有效成份。

在本发明的范围内特别优选孕马尿液经过大孔树脂提取所获得的结合雌激素提取物的起始液体。

本发明与现有技术相比，首次提出了非离子非极性精细分离树脂在天然孕马结合雌激素纯化精制中的应用，只用简单的精制方法就能去除结合雌激素提取物中的杂质，这些杂质包括非结合态黄酮类、非结合态异黄酮类、非结合态类固醇类以及非结合态雌激素类等物质，使用的洗脱溶剂是可以与水相溶的低级烷醇或低级脂肪酮，溶剂毒性很低，使用量很小。使结合雌激素基于干物质的比例提高了20%-30%，结合雌激素有效成没有明显损失，所得到结合雌激素精制物色泽淡黄色，无异味，所使用的非离子非极性精细分离树脂其品质优秀，分离性能高，可以反复使用，因此特别适于大规模生产化需要，该发明方法为制备高质量的结合雌激素原料药以及结合雌激素制剂产品奠定了良好坚实的基础。

具体实施方式

实施例1，该天然孕马结合雌激素纯化精制方法包括第一步用非离子非极性精细分离树脂吸附含有孕马结合雌激素提取物的起始液体、第二步用洗脱溶剂从负载有结合雌激素混合物的非离子非极性精细分离树脂上洗脱并获得纯化精制的结合雌激素混合物液体，

其中，含有孕马结合雌激素混合物的起始液体指：为孕马尿液经过溶剂萃取法获得的结合雌激素混合物溶解于水配制成的溶液或孕马尿液经过大孔树脂所获得的结合雌激素混合物溶解于水配制成的溶液。

实施例2，与实施例1的不同之处在于：非离子非极性精细分离树脂选用聚苯乙烯二乙烯基苯类非离子非极性精细分离树脂。

实施例3，与上述实施例2的不同之处在于：聚苯乙烯二乙烯基苯类非离子非极性精细分离树脂的平均粒径为4微米至200微米、比表面积为400平方米/克至1000平方米/克。

实施例4，与上述实施例3的不同之处在于：聚苯乙烯二乙烯基苯类非离子非极性精细分离树脂选用MCI GEL牌号的精细分离树脂中的一种以上。

实施例5，与上述实施例3的不同之处在于：含有孕马结合雌激素提取物的起始液体，在10℃至60℃温度条件下，pH值为5至10、固形物浓度为0.01克/毫升至0.20克/毫升、起始溶液的体积为0.4至20体积份／1体积份树脂，速度为0.04体积份至5体积份的上述溶液/1体积份树脂/小时通过非离子非极性精细分离树脂；或/和，洗脱溶剂为水或含有能与水混溶的低级烷醇水溶液或含有能与水混溶的低级脂肪酮水溶液,该能与水混溶的低级烷醇或该能与水混溶的低级脂肪酮所占比例的体积百分数为0至60%，优选的体积百分数为0％至40％；或/和，洗脱溶剂，在10℃至60℃温度条件下，在pH值为5至10、洗脱溶剂的量为0.5体积份至30体积份洗脱溶剂／1体积份树脂、洗脱速度为0.1体积份至10体积份的洗脱溶剂/1体积份树脂/小时下，对负载有结合雌激素的非离子非极性精细分离树脂进行洗脱。

实施例6、实施例7、实施例8、实施例9、实施例10，与上述实施例5的不同之处在于如表1和表2所示。

通过上述实施例结果我们可以惊奇地发现：

使用上述三菱公司的MCI GEL系列精细分离树脂对上述含有孕马结合雌激素粗提物的起始液体进行精制后的结合雌激素的纯度可以达到42.6%至61.8%，总结合雌激素收率为90.8%至97.2%，且结合雌激素精制物色泽由棕色或棕黄色变成淡黄色，异味去除；另外，该分离填料对结合雌激素吸附与解吸附性能高；可重复使用，再生简单易行，仅用乙醇或丙酮就能再生。该精制工艺简单易行。

综上所述，本发明首次提出了非离子非极性精细分离树脂用于从孕马尿中提取天然结合雌激素的纯化精制工艺工程，另外，本发明出人意料的简单，只经过一步固相提取，不用反复进行也没有繁琐步骤。使用的洗脱溶剂是可以与水相溶的低级烷醇或低级脂肪酮，溶剂毒性很低，使用量很小。避免了液-液萃取使用大量毒性有机溶剂，环境污染和有毒溶剂残留于药物的问题。该方法的pH控制为中性或微碱性，可以使结合雌激素在中性或微碱性环境下较保持稳定。该发明不仅去除了酚类和亲脂类杂质，其精制效果更是意想不到的好：使结合雌激素基于干物质的比例提高了20%-30%，结合雌激素有效成份没有明显损失，所得到结合雌激素精制物色泽淡黄色，无异味，达到精制的目的。

Claims (10)

1.一种天然孕马结合雌激素纯化精制方法，该方法包括第一步用非离子非极性精细分离树脂吸附含有孕马结合雌激素提取物的起始液体、第二步用洗脱溶剂从负载有结合雌激素混合物的非离子非极性精细分离树脂上洗脱并获得纯化精制的结合雌激素混合物液体; 其中，含有孕马结合雌激素混合物的起始液体指：为孕马尿液经过溶剂萃取法获得的结合雌激素混合物溶解于水配制成的溶液或孕马尿液经过大孔树脂提取所获得的结合雌激素混合物溶解于水配制成的溶液。

2.根据权利要求1所述的天然孕马结合雌激素纯化精制方法,其特征在于非离子非极性精细分离树脂选用聚苯乙烯二乙烯基苯类非离子非极性精细分离树脂。

3.根据权利要求2所述的天然孕马结合雌激素纯化精制方法,其特征在于聚苯乙烯二乙烯基苯类非离子非极性精细分离树脂的平均粒径为4微米至200微米、比表面积为400平方米/克至1000平方米/克。

4.根据权利要求2或3所述的天然孕马结合雌激素纯化精制方法,其特征在于聚苯乙烯二乙烯基苯类非离子非极性精细分离树脂选用MCI GEL牌号的精细分离树脂中的一种以上。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的天然孕马结合雌激素纯化精制方法，其特征在于含有孕马结合雌激素提取物的起始液体，在10℃至60℃温度条件下，pH值为5至10、固形物浓度为0.01克/毫升至0.20克/毫升、起始溶液的体积为0.4至20体积份／1体积份树脂，速度为0.04体积份至5体积份的上述溶液/1体积份树脂/小时通过非离子非极性精细分离树脂；或/和，洗脱溶剂为水或含有能与水混溶的低级烷醇水溶液或含有能与水混溶的低级脂肪酮水溶液,该能与水混溶的低级烷醇或该能与水混溶的低级脂肪酮所占比例的体积百分数为0至60%；或/和，洗脱溶剂，在10℃至60℃温度条件下，在pH值为5至10、洗脱溶剂的量为0.5体积份至30体积份洗脱溶剂／1体积份树脂、洗脱速度为0.1体积份至10体积份的洗脱溶剂/1体积份树脂/小时下，对负载有结合雌激素的非离子非极性精细分离树脂进行洗脱。

6.根据权利要求5所述的天然孕马结合雌激素纯化精制方法，其特征在于洗脱溶剂为水或含有能与水混溶的低级烷醇水溶液或含有能与水混溶的低级脂肪酮水溶液,该能与水混溶的低级烷醇或该能与水混溶的低级脂肪酮所占比例的体积百分数为0％至40％。

7.一种非离子非极性精细分离树脂在天然孕马结合雌激素纯化精制方法中的应用。

8.根据权利要求7所述的非离子非极性精细分离树脂在天然孕马结合雌激素纯化精制中的应用,其特征在于非离子非极性精细分离树脂选用聚苯乙烯二乙烯基苯类非离子非极性精细分离树脂。

9.根据权利要求8述的非离子非极性精细分离树脂在天然孕马结合雌激素纯化精制中的应用,其特征在于聚苯乙烯二乙烯基苯类非离子非极性精细分离树脂的平均粒径在4至200微米范围内、比表面积在400至1000m²/g范围内。

10.根据权利要求8或9所述的非离子非极性精细分离树脂在天然孕马结合雌激素纯化精制中的应用,其特征在于聚苯乙烯二乙烯基苯类非离子非极性精细分离树脂选用MCI GEL牌号的精细分离树脂中的一种以上。