KR20080097987A - 식물 및 동물 기원의 약리 활성 성분을 분리하는 방법 - Google Patents

식물 및 동물 기원의 약리 활성 성분을 분리하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20080097987A
KR20080097987A KR1020087015601A KR20087015601A KR20080097987A KR 20080097987 A KR20080097987 A KR 20080097987A KR 1020087015601 A KR1020087015601 A KR 1020087015601A KR 20087015601 A KR20087015601 A KR 20087015601A KR 20080097987 A KR20080097987 A KR 20080097987A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
conjugated
resin
diaion
water
mixture
Prior art date
Application number
KR1020087015601A
Other languages
English (en)
Inventor
지안카를로 마쫄라
안나 안자니
Original Assignee
에벌티스 에스.아.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에벌티스 에스.아. filed Critical 에벌티스 에스.아.
Publication of KR20080097987A publication Critical patent/KR20080097987A/ko

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/22—Urine; Urinary tract, e.g. kidney or bladder; Intraglomerular mesangial cells; Renal mesenchymal cells; Adrenal gland
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
    • B01J20/264—Synthetic macromolecular compounds derived from different types of monomers, e.g. linear or branched copolymers, block copolymers, graft copolymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
    • B01J20/265—Synthetic macromolecular compounds modified or post-treated polymers
    • B01J20/267—Cross-linked polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/22—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4
    • C07D311/26—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4 with aromatic rings attached in position 2 or 3
    • C07D311/34—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4 with aromatic rings attached in position 2 or 3 with aromatic rings attached in position 3 only
    • C07D311/36—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4 with aromatic rings attached in position 2 or 3 with aromatic rings attached in position 3 only not hydrogenated in the hetero ring, e.g. isoflavones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/22—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4
    • C07D311/26—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4 with aromatic rings attached in position 2 or 3
    • C07D311/40—Separation, e.g. from natural material; Purification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

식물 수성 추출물 또는 생리적 유체(physiological fluid)를 친지성 수지 상에 흡착시키는 단계, 탈착시키고 용출물을 회수하는 단계에 의해 식물 수성 추출물 또는 생리적 유체로부터 접합된 형태의 천연 친수성 수용성 생성물을 회수하고 정제하는 방법으로서, 상기 수지는 600 m2/g 면적, 1.3 ml/g 용적(건조 중량), 약 200 옹스트롬의 세공 크기를 갖는, 스티렌 및/또는 디비닐벤젠 부분에서 브롬화된 다공성 스티렌-디비닐 벤젠 중합체인 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
접합 에스트로겐, 이소플라본, 추출물.

Description

식물 및 동물 기원의 약리 활성 성분을 분리하는 방법{A process for the isolation of pharmacologically active principles of vegetable and animal origin}
본 발명은 동물 또는 식물 원료(source)로부터 약리적 활성을 갖는 천연 화합물를 분리하고 정제하는 방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 무기산에 접합된(conjugated) 형태, 예를 들면, 술페이트의 형태 또는 글리코실화 형태로 원료에 존재하는 친수성 및 수용성 화합물의 추출에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 높은 친지성 수지 상에 상기 화합물을 포함하는 원료를 흡착시키는 단계, 및 탈착 및 용출물(eluate)을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 수득 가능한 화합물의 바람직한 예는 항산화제 및 항종양 활성과 같은 다양한 치료 또는 예방적 약리 활성을 갖는 동물 또는 식물 기원의 스테로이드계 폴리페놀 구조(steroidal, polyphenolic structure)에 완전히 접합된 에스트로겐, 피토에스트로겐(이소플라본)을 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 높은 순도 및 재현성으로 수득 가능한 화합물은 자궁암 및 전립선암, 및 급성 또는 만성 염증과 같은 일차 질환(primary pathology)과 월경전 증후군 및 긴장, 고령화 및/또는 호르몬 변화와 관련된 골다공증 및 죽상경 화증과 같은 이상 생리적 상태(paraphysiological condition)의 치료를 위한 약제 또는 식품 보충제의 제조를 위해 유용하다.
조성 및 재현성이 사용된 추출 기법에 따라 크게 변하는 식물요법 추출물(phytotherapic extract)에 기반한 다수의 식품 보충제가 존재한다. 그와 같은 변화들은 주로 원하는 생성물과 다른 생성물의 존재에 관계된다. 그 결과, 상기 추출물은 일정한 조성 및 다른 화합물의 부재의 필수 요건을 충족시키지 못하기 때문에, 약제로서 사용될 수 없다.
WO 93/23069, WO 99/43335 및 EP 1174144는 게니스테인(genistein), 다이드제인(daidzein), 포르모노네틴(formononetin) 및 비오카닌(biochanin) A를 포함하는 대두 또는 클로버 추출물을 개시한다.
EP 1174144는 건조되고, 미세하게 분쇄된 식물 물질의 물에 침연(maceration)시키는 단계, 뒤이은 수-혼화성 용매(일반적으로 에탄올)의 첨가에 의해 추출하는 단계; 식물 잔류물을 분리하는 단계; 왁스 및 지방을 제거하기 위해, 지방족 탄화수소에 의해 수용액을 처리하는 단계; 상을 분리하고 탄화수소층을 제거하는 단계; 및 진공 상태에서 상기 수-혼화성 유기 용매를 증류시켜 여과시키고 건조한 고체(수-불용성 이소플라본 아글리콘(isoflavone aglycone))를 생성하는 단계에 의해 이소플라본 아글리콘, 특히, 트리폴리움 프라텐시스(Trifolium pratensis)로부터 유래된 이소플라본 아글리콘을 추출하는 방법을 청구한다. HPLC에 의해 분석된 아글리콘 함량은 19.5% 내지 38% w/w였고, 수율은 출발 물질 기준 으로 0.6% 내지 2.2%였다.
WO 93/23069는 물:수용성 유기 용매(예를 들면, 에탄올) 혼합물로 건조 식물 물질을 추출하는 단계, 상기 물-유기용매 추출물을 분리하는 단계, 상기 유기 용매를 증류에 의해 제거하는 단계 및 수성 상을 농축하는 단계에 의해 수득된 이소플라본 피토에스트로겐이 풍부한(enriched) 조성물을 개시한다.
WO 99/43335는 "방향족 발색단(aromatic chromophore)"(게니스테인, 다이드제인, 포르모노네틴 및 비오카닌-A)의 존재를 특징으로 하는 이소플라본-함유 클로버 추출물의 제조를 개시한다. 추출 절차는 HPLC에 의한 이소플라본의 추가적인 정제/분리 단계를 포함하나, 실질적으로 WO 93/23069에 개시된 것과 동일하다.
임신한 동물로부터의 소변과 같은 동물의 생리적 유체(physiologic fluid)의 경우, 상이한 반극성(semipolar)이나, 현저하게 친수성인, 비-이온성 흡착성 수지, 예를 들면, 앰버라이트(Amberlites)®, 디아이온 세파비드(Diaion Sepabeads)® 또는 HPD-500®의 사용에 의해 접합 에스트로겐(conjugated estrogen) 혼합물을 제조하는 방법이 개시된다. 예를 들면, US 5723454는 이전에 모래층(sand bed)을 통한 여과, 원심분리 또는 한외여과(ultrafiltration)에 의해 맑게 정화한 임신한 암말의 소변이 (현탁 상태에서의 접촉 또는 컬럼 상에서의 삼출(percolation)에 의해) 중간 극성(1.5 내지 2.0 Debye 범위의 쌍극자 모멘트) 및 400 내지 500 m2/g의 비면적(specific area)을 갖는 Amberlite® 비-이온성 수지(가교된 폴리아크릴 에스테르, 예를 들면, Rohm & Haas의 XAD-7)에 노출되는 것인, 임신한 암말 소변으로부터 접합 에스트로겐을 추출하는 방법을 개시한다. 상기 수지는 알칼리 수에 의해 반 복적으로 세척되고, 그 후, 알칼리 수:혼화성 유기 용매 혼합물에 의한 용리에 의해 에스트로겐 혼합물이 회수되고, 진공 상태에서 농축 및 건조에 의해 고체 형태로 수득된다.
US 2005/0014738, US 2003/0105344 및 US 2004/0072812는 도웩스(Dowex) ® XAD2, Dowex ®, Optipore와 같은 중간-극성의, 주로 친수성인 수지를 이용한, 접합 에스트로겐의 동일한 흡착/탈착 방법을 개시한다. US 2002/0156303은 역시 중간 극성을 갖는, Diaion ® HP-20 및 Sepabeads ® SP-700 (Mitsubishi) 수지의 용도를 개시한다. CN 1308038은 유사한 특징을 갖는, Hebej Cangzhou Chemical Factory에 의해 제조된 반-극성 수지 HPD-500을 이용한다. 흡착된 물질의 접촉 및 추출 단계도 유사하다.
모든 상기 방법들은 비-이온성, 중간-극성이고 주로 친수성인 수지의 이용에 기반하고, 상기 수지는 부족한 흡착 선택성을 가져서, 접합 및 비접합(unconjuated) 에스트로겐의 혼합물, 및 검출가능한 양의 크레졸 유도체를 생성한다. 이는 흡착 후 일련의 정제 단계 및 종종 비접합 에스트로겐 또는 다른 폴리페놀계 불순물의 허용가능하지 않는 함량 때문에 생산된 배치의 제거까지 수반한다.
따라서, 전술된 문제들을 극복하여, 동물 및 식물 기원 접합물(conjuate)의 조성이 일정하고 비접합 생성물 또는 기타 불순물을 포함하지 않게 하는, 재현가능한 방법에 대한 요구가 명확하게 존재한다.
놀랍게도, 두 개의 중합체 성분들 중 하나의 브롬화(brominaiton)를 특징으로 하는, 면적 600 m2/g, 용적 1.3 ml/g(건조 중량), 약 200 옹스트롬의 세공 크기를 갖는 높은 다공성의 스티렌-디비닐 벤젠 중합체의 이용이 전술된 화합물의 고수율 정제 및 약학 분야에서 그들의 용도를 제공한다는 것이 확인되었다.
본 발명의 방법은 공지된 방법으로 식물 또는 동물 원료로부터 수득된 정제되지 않은 출발 액체 또는 고체 추출물로 정의되는 "일차 추출물(primary extract)", 및 생리적 유체 모두에 적용될 수 있다.
식물 기원의 생성물의 예는 다양한 식물 원료에 단당류-접합된, 수용성 형태(monosaccharide-conjugated, water-soluble form)로 존재하는, 이소플라본 또는 리그난, 예를 들면, 게니스테인, 다이드제인, 포르모노네틴, 비오카닌 A, 코우메스테롤, 페룰산 및 이소페룰산을 포함한다.
생리적 유체로부터 추출가능한 생성물의 예는 임신한 암컷 소변에 존재하는, 무기산과 접합된, 에스트론 및 에스트라디올과 같은 스테로이드계 에스트로겐을 포함한다. 특히, 임신한 암말 소변은 에스트론, 에퀼린, △8,9-데히드로에스트론, 17α-에스트라디올; 17α-디히드로에퀼린, 17β-디히드로에퀼린, 17β-에스트라디올, 에퀼레닌, 17α-디히드로에퀼레닌; 17β-디히드로에퀼레닌 및 선택적으로 17β-△8,9-데히드로에스트라디올; 17α-△8,9-데히드로에스트라디올; 6-OH 17α-디히드로에퀼레닌; 6-OH 에퀼레닌; 6-OH 17β-디히드로에퀼레닌 및/또는 기타 술페이트화 스테로이드 대사산물(sulfated steroidal metabolite)로부터 선택된 하나 이상의 접합된 염을 포함하는 접합 에스트로겐 염의 혼합물을 제공한다. 염은 바람직하게는 소디움 염이고, 접합물(conjugated)은 주로 술페이트이다.
수지 브롬화는 입자의 비중량(specific weight)의 증가(특히, 직접적인 삼출및 팽창층(expanded bed)을 통해 컬럼에서 작용할 수 있게 함)를 수반하고 현재까지 사용된 다른 비-브롬화(non-brominated) 스티렌-디비닐벤젠 중합체보다 더 낮은 수준의 중합체 수화 및 따라서, 더 낮은 극성 전하 및 훨씬 더 높은 지방 친화성을 유도한다. 그와 같은 특성을 갖는 브롬화 수지는 Mitsubishi Chem. Co에 의해 제조되며, 예를 들면, 디아이온(Diaion) SP 207®, 디아이온 SP 205®, 디아이온 SP 206®이다.
본 발명에 따라 수득된 결과는 정제될 생성물의 현저한 친수성 및 감소된 지방 친화성을 고려할 때, 예상치 못한 것이다. 따라서, 주로 친지성인 수지, 예를 들면, 친지성 분자에 대해 더 특이적인, 전술된 수지와 같은 친지성 수지 상 흡착과 관련된 이 생성물들의 거동은 놀랍고 의외이다.
본 발명의 방법은 하기 단계들을 포함한다:
선택적으로 예비-여과(pre-filtration), 원심분리 또는 한외원심분리에 의해, 상기 브롬화 스티렌-디비닐 벤젠 중합체 상에서 직접적인 삼출 또는 팽창층(즉, 컬럼의 하단으로부터)에 의해 정화된, 상기 일차 추출물 또는 유체의 벌크 상태 또는 컬럼 상으로의 흡착 및 이에 따른 활성 성분 또는 그 혼합물 및 불순물의 결과적인 흡착;
벌크 상태의 워크 업의 경우, 액체로부터 흡착 고체상의 분리 및 (진공 상태에서의 여과 또는 원심분리에 의한) 압착, 제거;
컬럼에서 물:수-혼화성 용매 및 선택적으로 pH의 (오목 또는 볼록형) 구배에 의한, 흡착된 생성물, 활성 성분 및 불순물의 선택적인 탈착;
용출물(eluate)의 회수 및 진공상태에서의 건조; 및
선택적인, 고형 잔재물의 추가 정제 및/또는 결정화 단계.
수지와 유체 또는 일차 추출물 간의 접촉은 벌크로, (수지의 분말화(pulverization)를 방지하기 위해) 느린 교반 하에 이질적인 매스를 유지하면서 수행되거나 또는 크로마토그래피용 컬럼에서, 삼출 또는 팽창층 기법에 의해 수행될 수 있다.
방법의 선택은 대상 생성물의 종류 및 양에 의존적이다. 벌크 기법(in bulk technique)의 경우, 바람직한 교반기는 블래이드 교반기이다. 수지는 처리 대상 유체 또는 일차 추출물의 속성 및 통상적인 분석(HPLC, GC)에 의해 분석된, 활성 성분의 함량에 의존적인 양으로 이용될 것이나, 일반적으로, 생산 성능이 동일한 경우, 이 양은 전술된 반-극성 수지의 약 60-75%이다. 벌크 워크-업의 경우, 컬럼에 대한 양의 3배 내지 4배의 양이 이용된다. 흡착대상 용액은 공지된 기법, 예를 들면, 모래층에서의 여과 또는 유체의 회수를 위한 적합한 장치에서의 원심 분리 또는 한외여과에 의해 정화될 수 있다. 벌크 워크 업의 경우, 흡착된 수지는 진공 상태에서의 여과에 의해 과량의 유체로부터 압착되어 회수되고 다공성 격벽 및 냉각용 재킷(cooling jacket)을 갖춘 컬럼에 배치된다. 흡착물(adsorbate)은 물:혼화성 용매 혼합물(예를 들면, 70-30 v/v 물-에탄올)로 용리되고, 수산화나트륨에 의해 11 내지 13, 바람직하게는 11 내지 12.5의 알칼리 pH로 조정된다. 선택적으로 농축된 정제되지 않은 용출물이 크로마토그래피의 직접적인 워크 업을 위해 기재된 절차에 따라 일차 추출에서 사용된 것과 동일한 브롬화 수지 또는 다른 브롬화 수지 상에서 크로마토그래피에 의해 정제된다. 벌크로 수행되는 방법은 식물 기원 유도체의 제조를 위해 특히 유리하다.
동물 원료로부터의 유체를 위해 바람직한, 크로마토그래피 기법에 의한 워크 업의 경우, 선택적으로 농축된 일차 용액이 삼출 또는 팽창층에 의해 수지층(resin bed) 상에서 통과된다. 후자의 기법은 브롬화 수지의 입자의 높은 비중량(specific weight)에 의해 선호되고, 이는 약간의 과압력이 다공성 마이크로비드들을 상호 간에 분리시키기 때문에, 용액을 유리하게 보다 큰 흡착 표면에 노출시키며, 반대로 직접적인 삼출을 이용하는 경우에는 보다 밀집된 층(bed)을 형성한다. 공급된 용액에 대한 약간 과압력의 적용은 흡착 수율을 증가시키고 작동 시간을 단축한다. 흡착 과정에 이용될 수 있는 수지는 Mitsubishi Chemical Co에 의해 제조된 디아이온 SP 207®, 디아이온 SP 205® 및 디아이온 SP 206®과 같은 높은 다공성을 갖는 브롬화된 스티렌-디비닐 벤젠 중합체이다. 디아이온 SP 207®이 바람직하다. 수지의 처리될 용액에 대한 비는 사용되는 SP의 종류 및 추출대상 활성 성분의 속성에 따라, 25 부피부(part by volume)의 용액 당 1 부피부 내지 200 부피부의 용액 당 1 부피부의 범위일 수 있다. 보다 구체적으로, 디아이온 SP 207의 경우, 상기 비는 25 내지 150의 범위일 수 있다. 용리는 270 내지 280 nm의 UV 검출에 의해 모니터링된다. 컬럼의 빈 공간(void)에 여전히 존재하는 흡착된 용액을 제거하기 위한 세척액의 부피는 일반적으로 컬럼 층의 부피의 1.8 내지 2배이다. 세척액은 불순물의 속성 및 양과 흡착된 생성물의 종류에 따라 변하는 조성물을 갖는다. 온도는 O℃ 내지 35℃의 범위이고, 바람직하게는 O℃ 내지 5℃의 범위이다. 바람직한 세척액은 물이나, 소량(1-5%)의 수-혼화성 용매(예를 들면, 아세톤 또는 에탄올)이 또한 존재할 수 있다.
흡착된 생성물은 불순물의 속성 및 물질의 기원에 따라, 그 조성이 100% 내지 0.10% 물/용매의 범위일 수 있는 물:수-혼화성 용매(예를 들면, 케톤, 저분자량 알코올, 수용성 에테르 또는 에스테르) 혼합물에 의해 용리된다. 상기 혼합물은 수산화나트륨에 의해 pH 11-13, 바람직하게는 11-12.5로 맞춰진다. 용리는 270 내지 280 nm의 UV 흡수를 통해 모니터링된다. 분획을 분석하고, 원하는 화합물을 함유한 분획들을 통합하고 진공 상태에서 농축한다.
하기 실시예는 본 발명을 상세하게 예시한다.
실시예 1
트리폴리움 프라텐시스의 직접 추출에 의한 접합 이소플라본의 제조
500 g의 건조되어 미세하게 분쇄된 트리폴리움 프라텐시스를 실온에서 교반 하에 10시간 동안 2000 ml의 증류수로 처리하였다. 그 후, 고형물을 여과시키고 상기 용액을 대상으로 HPLC에 의해 접합 및 비접합(unconjugated) 이소플라본의 함량을 분석하였다. 접합 이소플라본의 총 함량은 약 500 mg이었고, 유리된 아글리 콘은 실질적으로 존재하지 않았다. 상기 용액을 진공 상태에서 250 ml까지 농축하고, 더 여과시키고, 10 g의 세파비드 207® Mitsubishi가 충진된 1-1.5 cm 직경의 컬럼 상으로 삼출시키고, 분획을 회수하고 270 nm에서 UV에 의해 용리를 모니터링하였다. 삼출의 완료 후에, 상기 컬럼을 컬럼 공간(void)의 약 2배량의 증류수 및 뒤이어, 5% 에탄올을 포함하는 물(200 ml)로 세척했다. 접합 이소플라본을 함유한(HPLC 분석) 분획들을 통합했다. 상기 용액을 여과시키고, 잔류물을 진공 상태에서 건조시키고(약 420 mg) 무수 아세톤(dry acetone)에 용해시켜, 출발 수성 추출물 기준으로 약 84%의 수율로 고형 잔류물을 생성하였다. 상기 잔류물은 98% 순도의 비오카닌-A, 포르모노네틴, 다이드제인 및 게니스테인의 글리코시드로 구성되었다.
실시예 2
트리폴리움 프라텐시스 수성 추출물의 추출에 의한 이소플라본의 제조
약 20%의 유리 이소플라본 및 약 30%의 접합 이소플라본 함량(HPLC)을 갖는, EP 1174144 (실시예 1)에 따라 수득된 20 g의 건조된 추출물을 500 ml의 물에 분산시키고; 그 현탁액을 진공 상태에서 여과시켰다. HPLC 분석은 접합 아글리콘의 함량이 출발 건조 중량 대비 약 28%이고, 비접합 아글리콘의 함량은 약 1%라는 것을 보여주었다(물에 대한 불용성 때문에, 다른 성분들과 함께, 비접합 아글리콘은 제거됨). 상기 용액을 진공 상태에서 증류에 의해 200 ml까지 농축시키고 80 g의 흡착성 세파비드® SP 207 (Mitsubishi)로 처리하였다. 교반을 2시간 동안 지속하였 다. 그 후, 흡착된 수지를 진공 상태에서 여과시키고, 압착시키고, 다공성 격벽을 갖춘 컬럼 상에 배치하였다. 그 후, 컬럼층(column bed)의 1.8 부피의 0-5℃로 미리 냉각시킨 증류수를 첨가하였다. 그 후, 상기 층 부피의 2.5배에 해당하는 95/5 물/에탄올 혼합물을 첨가하고, 용출물을 회수하고, 40℃를 넘지 않는 온도에서 진공 하에 건조될 때까지 증류시켰다. 고체 잔류물을 아세톤으로 및, 그 후 아세톤/에틸 에테르에 용해시켜 분쇄하고, 진공 상태에서 용매를 증류시켜 제거하고 고체를 회수하였다. HPLC 분석은 상기 생성물이 게니스테인, 다이드제인, 포르모네틴 및 비오카닌 A로 구성되고, 실질적으로 불순물을 포함하지 않는다는 것을 보여주었다(접합 이소플라본의 함량: 90-95%). 수율은 출발 추출물 기준으로 80 내지 85%였다.
실시예 3
임신한 암말 소변으로부터 접합 에스트로겐의 추출
20 l의 임신한 암말 소변을 먼저 약 10 cm의 모래층 상에서 여과시키고, 그 후, 0.2 μ 막을 통해 여과시켰다. 접합 에스트로겐의 함량은 HPLC 또는 GC에 의해 결정하였다. 농축된 수산화나트륨의 첨가에 의해 pH를 약 12.5-13.5로 조정하였다. 전체를 약 1-2 시간 동안 질소 하에서 기계적 교반 하에 유지시켰다. 그 후, 무기산, 바람직하게는 HCl, 또는 트리플루오로아세트산으로 pH를 중성(pH 7.5-8.5, 바람직하게는 8)으로 조정하였다. 상기 용액을 진공 상태에서 모래 상에서 더 여과시키고, 그 후 막에서 더 여과시켰다. 맑은 여과액을 150-180 g의 세파비 드 207® 디아이온(Mitsubishi)이 충진된 7.5 내지 10 cm 직경의 컬럼 상에서, 팽창층의 경우 수지층의 높이를 3-5% 이상 증가시키지 않고, 직접 삼출을 이용하는 경우, 수지의 패킹(packing)을 유도하지 않도록 약간의 과압력으로, 삼출 또는 팽창층에 의해 통과시켰다. 팽창층의 경우, 컬럼층은 30-50 cm 이상이어야 한다. 용리의 완료 후에, 상기 수지를 0℃-5℃에서 액체 쿨러의 순환에 의해 냉각시키고, 상기 흡착물을 0℃-5℃의 컬럼 공간의 1.8-2/5배 이상의 부피의 증류수로 세척하였다. 그 후, 상기 층(bed)을 5℃-10℃의 온도에서, 농축된 NaOH의 첨가에 의해 11.5-13.0의 pH를 갖는 물(상기 수지 부피의 2 내지 4배 부피)로 삼출(또는 팽창)시켰다. 그 후, 접합 에스트로겐 복합체를 30:70 최소비(minimum ratio)의 물:수-혼화성 용매(아세톤, 에탄올, THF)로 용리시키고, 수산화나트륨의 첨가에 의해 pH 10-13, 바람직하게는 12.5-13으로 조정하였다. 용출물을 회수하고 중화시키고 진공 상태에서 건조시켜 활성 성분을 수득하였다.

Claims (10)

  1. 식물 수성 추출물 또는 생리적 유체(physiological fluid)를 친지성 수지 상에 흡착시키는 단계, 탈착시키고 용출물을 회수하는 단계에 의해 식물 수성 추출물 또는 생리적 유체로부터 접합된 형태의 천연 친수성 수용성 생성물을 회수하고 정제하는 방법으로서, 상기 수지는 600 m2/g 면적, 1.3 ml/g 용적(건조 중량), 약 200 옹스트롬의 세공 크기를 갖는, 스티렌 및/또는 디비닐벤젠 부분에서 브롬화된 다공성 스티렌-디비닐 벤젠 중합체인 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 천연 생성물은 이소플라본, 항산화제, 또는 접합 에스트로겐(conjuated estrogen) 또는 그들의 혼합물을 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 이소플라본은 대두 또는 트리폴리움 프라텐시스(Trifolium pratensis)로부터 추출된 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 이소플라본은 게니스테인, 다이드제인, 포르모노네틴, 비오카닌 A를 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 임신한 포유동물 체액으로부터 접합 에스트로겐의 정제 및 회수를 위한 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 생리적 유체의 염의 혼합물은 임신한 암말 소변인 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 에스트론, 에퀼린, △8,9-데히드로에스트론, 17α-에스트라디올; 17α-디히드로에퀼린, 17β-디히드로에퀼린, 17β-에스트라디올, 에퀼레닌, 17α-디히드로에퀼레닌; 17β-디히드로에퀼레닌을 포함하는 접합 에스트로겐 염 혼합물의 제조를 위한 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 17β-△8,9-데히드로에스트라디올; 17α-△8,9-데히드로에스트라디올; 6-OH 17α-디히드로에퀼레닌; 6-OH 에퀼레닌; 6-OH 17β-디히드로에퀼레닌 및/또는 기타 술페이트화 스테로이드 대사산물(sulfated steroidal metabolite)로부터 선택된 하나 이상의 접합된 염을 더 포함하는 혼합물의 제조를 위한 것인 방법.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 접합물(conjuate)은 술페이트이고 상기 염은 소디움 염인 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수지는 상품명 디아이 온(Diaion) SP 207®, 디아이온 SP 205® 및 디아이온 SP 206®로 상업적으로 구입가능한 수지들로부터 선택된 것인 방법.
KR1020087015601A 2005-12-29 2006-12-19 식물 및 동물 기원의 약리 활성 성분을 분리하는 방법 KR20080097987A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ITMI2005A002516 2005-12-29
IT002516A ITMI20052516A1 (it) 2005-12-29 2005-12-29 PROCESSO PER L'ISOLAMENTO DI PèRINCIPI FARMACOLOGICAMENTE ATTIVI DI ORIGINE VEGETALE ED ANIMALE

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20080097987A true KR20080097987A (ko) 2008-11-06

Family

ID=37896166

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087015601A KR20080097987A (ko) 2005-12-29 2006-12-19 식물 및 동물 기원의 약리 활성 성분을 분리하는 방법

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20090312293A1 (ko)
EP (1) EP1965880A1 (ko)
JP (1) JP5243264B2 (ko)
KR (1) KR20080097987A (ko)
CN (1) CN101160160B (ko)
CA (1) CA2634958A1 (ko)
IT (1) ITMI20052516A1 (ko)
MX (1) MX2008008579A (ko)
WO (1) WO2007073908A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100979524B1 (ko) 2008-02-27 2010-09-06 대한민국 감귤로부터 플라보노이드 성분의 추출 및 정제방법
US20110177179A1 (en) * 2010-01-18 2011-07-21 Sinoveda Canada, Inc. Preparation of botanical extracts containing absorbable components using pharmaceutical platform technology
EP2640736B1 (en) 2010-11-19 2016-08-31 Cargill, Incorporated Method for the enrichment of rebaudioside b and/or rebaudioside d in stevia-derived glycoside compositions using adsorb-desorb chromatography with a macroporous neutral adsorbent resin
US20140371180A1 (en) 2013-06-14 2014-12-18 Dr. Reddy's Laboratories Ltd. Process for purification and isolation of estrogens
BE1022422B1 (nl) * 2014-09-23 2016-03-25 Avore Nv Methode voor het verwijderen van organische verontreinigingen uit water

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3769401A (en) * 1970-11-19 1973-10-30 Frosst & Co Chemical process
FR2427343A1 (fr) * 1978-05-31 1979-12-28 Dia Prosim Procede de bromation de resines a base de copolymeres vinylaromatiques reticules
JPS62106098A (ja) * 1985-11-01 1987-05-16 Tsumura Juntendo Inc タンニンの製造方法
JPH02167091A (ja) * 1988-12-21 1990-06-27 Kawaken Fine Chem Co Ltd 麦角アルカロイドの分離精製法
ATE145404T1 (de) * 1991-07-31 1996-12-15 Warner Lambert Co Verfahren zur reinigung von pentostatin
ATE275959T1 (de) 1992-05-19 2004-10-15 Graham Edmund Kelly Verwendung von isoflavon phyto-östrogen extrakten von soja oder klee
HU9500323D0 (en) 1994-02-08 1995-03-28 Solvay Deutschland Process for separating estrogenes from urine of mares with foal
US5679806A (en) * 1995-02-24 1997-10-21 Hauser, Inc. Process for the isolation and purification of isoflavones
US6033714A (en) * 1996-03-13 2000-03-07 Archer Daniels Midland Company Process for production of isoflavone fractions from soy
AUPP198798A0 (en) 1998-02-25 1998-03-19 Novogen Research Pty Ltd Compositions comprising extracts of isoflavone-containing plants and anti-cancer modalities involving the same
JP2000262244A (ja) * 1999-03-18 2000-09-26 Ajinomoto Co Inc 大豆イソフラボン含有組成物とその製造方法
NZ538766A (en) * 2000-01-13 2006-09-29 Purdue Research Foundation A process to purify taxanes from plant biomass
EP1174144A1 (en) 2000-07-20 2002-01-23 Linnea S.A. Dry extract rich in isoflavones and process of preparation
DE10037389A1 (de) 2000-08-01 2002-02-14 Solvay Pharm Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Anreicherung und Stabilisierung von konjugierten Oestrogenen aus Stutenharn
ES2266251T3 (es) * 2000-08-31 2007-03-01 Phenolics, Llc Metodo eficaz para producir composiciones enriquecidas con antocianinas.
CN1141273C (zh) 2001-02-16 2004-03-10 何策熙 一种生物有机复合肥及其生产方法
US20020156303A1 (en) 2001-04-19 2002-10-24 Scinopharm Taiwan, Ltd. Process for the preparation of conjugated estrogens from pregnant mare urine
DE10159161A1 (de) 2001-12-01 2003-06-18 Solvay Pharm Gmbh Verfahren zur Gewinnung von Oestrogenen aus Stutenharn
US6855704B2 (en) 2002-10-09 2005-02-15 Apr Llc Process for isolating conjugated estrogens
US8349819B2 (en) * 2002-10-09 2013-01-08 Dr. Reddy's Laboratories New York, Inc. Steroid extraction process from urine sources
JP4139969B2 (ja) * 2003-09-19 2008-08-27 三栄源エフ・エフ・アイ株式会社 退色抑制剤
WO2006117168A2 (de) * 2005-05-03 2006-11-09 Dr. Willmar Schwabe Gmbh & Co. Kg Verfahren zur herstellung von ginkgoextrakten mit vermindertem gehalt an unpolaren pflanzeninhaltsstoffen und umweltbedingten unpolaren fremdstoffen

Also Published As

Publication number Publication date
JP5243264B2 (ja) 2013-07-24
CA2634958A1 (en) 2007-07-05
ITMI20052516A1 (it) 2007-06-30
EP1965880A1 (en) 2008-09-10
US20090312293A1 (en) 2009-12-17
WO2007073908A1 (en) 2007-07-05
JP2009522216A (ja) 2009-06-11
CN101160160A (zh) 2008-04-09
CN101160160B (zh) 2011-07-27
MX2008008579A (es) 2008-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4428054B2 (ja) 大豆サポニン含有物及びその製造法
US5789581A (en) Process for obtaining malonyl isoflavone glycosides and obtaining isoflavone glycosides or isoflavone aglycons from malonyl isoflavone glycosides
JPH0714927B2 (ja) イソフラボン化合物の製造法
JP4331482B2 (ja) 亜麻種子からセコイソラリシレシノールジグリコシド（ｓｄｇ）を単離精製する方法
KR20080097987A (ko) 식물 및 동물 기원의 약리 활성 성분을 분리하는 방법
CA2288321C (en) Preparation of isoflavones from legumes
JP3078694B2 (ja) ゲニステインの製造法
US6517840B1 (en) Production of a product enriched in isoflavone values from natural sources
Hsu et al. Isolation of individual isoflavone species from soybean by solvent extraction followed by the combination of macroporous resin and aluminium oxide separation
JP4442422B2 (ja) 高濃度かつ高溶解性のイソフラボン含有組成物及びその製造法
JPH10298175A (ja) 水易溶性大豆イソフラボンの製造方法
JP2003063971A (ja) 連翹葉及びその抽出物とそれらの用途
JP2000281673A (ja) イソフラボン化合物の製造法
JP2000095792A (ja) ゲニスチンから成るイソフラボン組成物の取得方法
JP2000517309A (ja) 牝馬の尿からエストロゲンを取得する方法
JPH11263786A (ja) イソフラボン化合物の製造法
JP4691028B2 (ja) ウマ結合型エストロゲン天然混合物を得るための方法
KR20010016220A (ko) 대두 배아로부터 생리활성 물질인 이소플라본의 분리정제방법
AU731389B2 (en) Preparation of isoflavones from legumes
JPH0684385B2 (ja) サポニン類の抽出方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application