MX2008008579A - Un procedimiento para el aislamiento de principios farmacologicamente activos de origen vegetal y animal. - Google Patents
Un procedimiento para el aislamiento de principios farmacologicamente activos de origen vegetal y animal.Info
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Abstract
Un procedimiento para la recuperación y purificación de productos solubles en agua hidrófilos naturales en forma conjugada de extractos acuosos vegetales o fluidos fisiológicos, mediante adsorción de dichos extractos o fluidos en una resina lipófila, seguido por la desorción y recuperación del eluato, cuyo procedimiento se determina porque la resina es un polímero de estireno-divinil benceno poroso bromado en la porción de estireno y/o divinil benceno, con un área de 600 m2/g, volumen de 1.3 ml/g (peso seco), y un tamaño de poro de aproximadamente 200 Angstrom.
Description
UN PROCEDIMIENTO PARA EL AISLAMIENTO DE PRINCIPIOS
FARMACOLOGICAMENTE ACTIVOS DE ORIGEN VEGETAL Y ANIMAL
MEMORIA DESCRIPTIVA
La invención se refiere a un procedimiento para el aislamiento y purificación de compuestos naturales farmacológicamente interesantes de fuentes animales o vegetales. Más particularmente, la invención se refiere a la extracción de compuestos hidrófilos y solubles es agua presentes en dichas fuentes en una forma conjugada para ácidos inorgánicos, por ejemplo, la forma de sulfatos, o en forma glucosilada. El procedimiento comprende la adsorción de las fuentes que contienen dichos compuestos en una resina altamente lipófila, seguido por la desorción y recuperación del eluato. Ejemplos preferidos de compuestos que se obtienen mediante procedimientos de la invención comprenden fitoestrógenos (isoflavonas), estrógenos completamente conjugados a estructuras polifenólicas esferoidales de origen animal o vegetal que tienen varias actividades farmacológicas terapéuticas o preventivas, tal como actividad antioxidante y antitumor. Los compuestos que se obtienen mediante el procedimiento de la invención en alta pureza y reproducibilidad son útiles para la preparación de
medicamentos o suplementos alimenticios, para el tratamiento de patologías tales como tumores en el útero y próstata, e inflamaciones agudas o crónicas, y patologías que derivan de condiciones parafisiológicas tales como síndrome premenstrual y tensión, osteoporosis y ateroesclerosis relacionada con envejecimiento y/o alteraciones hormonales. Existe un número de suplementos alimenticios basados en extractos fitoterapéuticos, cuya composición y reproducibilidad cambian notablemente, dependiendo de las técnicas de extracción utilizadas. Los cambios tienen que ver principalmente con la presencia de productos diferentes a los deseados. Como consecuencia, dichos extractos no pueden utilizarse como medicamentos, ya que no satisfacen los requerimientos obligatorios de composiciones uniformes y ausencia de otros componentes WO 93/23069, WO 99/43335 y EP 1 174144 describe extractos de soya o trébol que contienen mezclas de genisteína, daidzeína, formononetina y biocanina A. EP 74144 reclama un procedimiento para la extracción de isoflavona agliconas, en particular de Trifolium pratensis, mediante maceración del material vegetal en agua finamente en polvo seco, seguido por extracción mediante adición de un solvente miscible en agua (generalmente etanol); separación del residuo vegetal; tratamiento de la solución acuosa con un hidrocarburo alifático para remover ceras y grasas; separación de las fases y remoción del hidrocarburo; destilación del solvente orgánico miscible en agua in vacuo, para dar un sólido (isoflavona agliconas solubles en agua) que
se filtra y seca. El contenido de agliconas probado por HPLC oscila de 19.5% a 38% p/p, mientras los rendimientos oscilan de 0.6% a 2.2% con base en el material de partida. WO 93/23069 describe composiciones enriquecidas en fitoestrógenos de isoflavona obtenidos al extraer el material vegetal seco con agua: mezcla de solvente orgánico soluble en agua (por ejemplo, etanol), separando el extracto orgánico en agua, separando por destilación el solvente orgánico y concentrando la fase acuosa. WO 99/43335 describe la preparación de extractos de trébol que contienen isoflavonas caracterizado por la presencia de "cromóforos aromáticos" (genisteína, daidzeína, formononetina y biocanina-A). El procedimiento de extracción es sustancialmente el mismo como el que se describe en WO 93/23069, aunque contiene un paso de purificación/aislamiento adicional de isoflavonas por medio de HPLC. En caso de fluidos fisiológicos de animal tal como orina de animales preñados, se describen los procedimientos para la preparación de mezclas de estrogenos conjugados mediante el uso de diferentes resinas adsorbentes no iónicas semipolares, pero notablemente hidrófilas, tal como Amberlites®, Diaion Sepabeads® o HPD-500®. Por ejemplo, US 5723454 describe un método para la extracción de estrogenos conjugados de orina de yegua preñada en donde la orina previamente clarificada mediante filtración a través de un lecho de arena, mediante centrifugado o por ultrafiltración, se expone (mediante contacto en suspensión o mediante percolación en una
columna) a resinas no iónicas Amberlite® (ésteres poliacrílicos entrelazados, por ejemplo XAD-7 por Rohm & Haas), con una polaridad media (momento dipolar que oscila de 1.5 a 2.0 Debye) y áreas específicas de 400 a 500 m2/g. La resina se somete a lavados repetidos con agua alcalina, posteriormente la mezcla de estrógeno se recupera medíante elución con agua alcalina: mezcla de solventes orgánicos miscibles y obtenidos en forma sólida mediante concentración in vacuo y secado. US 2005/0014738, US 2003/0105344 y US 2004/0072812 describe el mismo procedimiento de adsorción/desorción de estrógenos conjugados, de nueva cuenta utilizando polaridad media, principalmente resinas hidrófilas tales como Dowex ® XAD2, Dowex®, Optípore. US 2002/0 56303 describe el uso de resinas Diaion ® HP-20 y Sepabeads ® SP-700 (Mitsubishi), también con polaridad media. CN 1308038 hace uso de la resina semi-polar HPD-500 fabricada por Hebej Cangzhou Chemical Factory que tiene características similares. Los pasos de contacto y extracción del material absorbido también son similares. Todos los métodos mencionados se basan en el uso de resinas principalmente hidrófilas, de polaridad media, no iónicas, que tienen una selectividad de adsorción deficiente, produciendo así mezclas de estrógenos conjugados y no conjugados, como también cantidades notables de derivados de cresol. Esto implica una serie de pasos de purificación seguido de la adsorción y algunas veces incluso la eliminación del lote trabajado debido al
contenido inaceptable en estrógenos no conjugados u otras impurezas polifenólicas. Por lo tanto es evidente la necesidad de procedimientos reproducibles que superen los problemas mencionados anteriormente, haciendo a la composición de los conjugados de origen animal y vegetal constante y libre de productos no conjugados u otras impurezas. Se ha encontrado sorprendentemente que el uso de un polímero de estireno-divinil benceno altamente poroso, con un área de 600 m2/g, volumen de 1.3 ml/g (peso seco), tamaño de poros de aproximadamente 200 Angstrom, caracterizado por la bromuración de uno de los dos componentes poliméricos, proporciona la purificación de los compuestos mencionados anteriormente en rendimientos elevados y el uso de los mismos en el campo farmacéutico. El procedimiento de la invención puede aplicarse a "extractos primarios", definidos como líquido de partida crudo o extractos sólidos, obtenidos de fuentes vegetales o animales con métodos conocidos, y a fluidos fisiológicos. Ejemplos de productos de origen vegetal incluyen isoflavonas o ligandos, tal como genisteína, daídzeína, formononetina, biocanina A, cumestrol y ácidos ferúiico e isoferúlíco, presentes en varias fuentes vegetales en forma soluble en agua conjugada con monosacáridos. Ejemplos de productos que se extraen de fluidos fisiológicos incluyen estrógenos esteroidales tal como estrona y estradiol presente en la orina de la hembra preñada, en donde se conjugan con ácidos inorgánicos. En
particular, la orina de yegua preñada proporciona una mezcla de sales de estrógeno conjugadas que comprenden estrona, equilina, ?8,9 -dehidroesterona, 17a-estradiol; 1 7a-dihidoequilina, 17 -dihidroequilina, 17ß-estradiol, equilenina, 17a-dihidroequilenina; 17 -dihidroequilenina y también opcionalmente una o más sales conjugadas del grupo de 17ß -?8'9 -dehidroestradiol; 17 a- ?8,9 -dehidroestradiol; 6-OH 1 7a-dihidroequilenina; 6-OH equilenina; 6-OH 17(_>-dihidroequilen¡na y/u otros metabolitos esteroidales sulfatados. La sales son preferiblemente sales de sodio, aunque los conjugados son principalmente sulfatos. La bromuración de resina implica un incremento en el peso específico de las partículas (que permite, Ínter alia, trabajar en columna a través de percolación directa y lecho expandido) e induce una hidratacion polimérica menor, en consecuencia una carga polar inferior y lipofilia mucho mayor a los polímeros de estireno-divinil benceno no bromados se utilizan hasta la fecha. Las resinas bromadas que tienen dichas características se fabrican por Mitsubishi Chem. Co, por ejemplo: Diaion SP 207®, Diaion SP 205®, Diaion SP 206®. Los resultados obtenidos de conformidad con la invención son inesperados en vista de las características notablemente hidrófilas y de lipofilia reducida de los productos para purificar. El comportamiento de estos productos con respecto a la adsorción en resinas principalmente lipófilas, tal como las resinas anteriores, que son más específicas para moléculas lipófilas, por lo tanto es sorprendente e inesperado.
El procedimiento de la invención comprende los siguientes pasos: adsorción, a granel o en una columna, de dichos extractos primarios o fluidos, opcionalmente clarificados por pre-filtración, centrifugado o ultrafiltración, mediante percolación directa o lecho expandido (es decir, desde la parte inferior de la columna) en dichos polímeros de estireno-divinil benceno bromados, con adsorción consecuente de los principios activos o mezclas de los mismos y cualquier impureza; en caso de procesamiento a granel, la separación y o prensado (mediante filtración in vacuo o centrifugado) de la fase sólida de adsorción del líquido, que se desecha; desorción selectiva de los productos adsorbidos, principios activos e impurezas en columna, por medio de gradientes (ya sea cóncavos o convexos) de agua: solventes miscibles en agua y opcionalmente de pH; recuperación de los eluatos y secado in vacuo; pasos de purificación y/o cristalización adicionales opcionales de los residuos sólidos. El contacto entre la resina y fluido o extracto primario puede llevarse a cabo ya sea a granel, manteniendo la masa heterogénea bajo agitación lenta (para evitar la pulverización de la resina) o en columna cromatográfica, mediante percolación o técnicas de lecho expandido. La selección del procedimiento depende del tipo y cantidad del producto trabajado. En el caso de una técnica a granel, el agitador preferido
es un agitador con aspas. La resina se utilizará en cantidades que dependen de la naturaleza del fluido o extracto primario para procesar y el contenido en principios activos, como se prueba por los análisis convencionales (HPLC, GC) pero, como una regla, el rendimiento de la producción siendo el mismo, esta cantidad es de aproximadamente 60-75% de las resinas semi-polares anteriores. En el caso de procesamiento a granel, se utilizan tres a cuatro veces las cantidades de las columnas. La solución para adsorber puede clarificarse con técnicas conocidas, por ejemplo mediante filtración en un lecho de arena o centrifugado en un aparato adecuado para la recuperación del fluido mediante ultrafiltración. En caso de procesamiento a granel, la resina adsorbida se recupera, se prensa del fluido en exceso mediante filtración in vacuo y se coloca en una columna adaptada con un septo poroso y una camisa de enfriamiento. El adsorbato se eluye con agua: mezcla de solventes miscibles (por ejemplo 70-30 v/v agua-etanol), y se ajusta con hidróxido de sodio a un pH alcalino de 1 1 a 13, preferiblemente de 1 1 a 12.5. El eluato crudo opcionalmente concentrado entonces se purifica mediante cromatografía en la misma resina bromada como se utiliza para la extracción primaria, o en otras resinas bromadas, siguiendo el procedimiento descrito para el procesamiento directo cromatográfico. El procedimiento a granel es particularmente útil para la preparación de derivados de origen vegetal. En caso de trabajar con técnicas cromatográficas, lo cual se prefiere para fluidos de fuentes animales, la solución primaria opcionalmente concentrada se pasa en un lecho de resina, mediante percolación o lecho
expandido. La última técnica se favorece por el peso específico elevado de las partículas de las resinas bromadas y se expone de manera útil la solución a una superficie de adsorción mayor, a medida que la sobrepresión ligera separa las microesferas porosas entre sí, que por el contrario forma un lecho más compacto cuando se utiliza percolación directa. La aplicación de una sobrepresión ligera a la solución suministrada incrementa el rendimiento de adsorción y reduce los tiempos operativos. Las resinas que puedan utilizarse en el procedimiento de adsorción son polímeros de estireno-divinil benceno bromados altamente porosos, tal como Diaion SP 207®, Diaion SP 205® y Diaion SP 206® fabricados por Mitsubishi Chemical Co., Diaion SP 207® se prefiere. La relación de la resina a solución para tratamiento puede oscilar de 1 parte por volumen de resina por 25 partes de solución a 1 parte de resina por 200 partes de solución, dependiendo del tipo de SP utilizado y la naturaleza del principio o principios activos para extraer. Más particularmente, en el caso de Diaion SP 207, dicha relación puede oscilar de 25 a 150. La elución se monitorea con detección de UV entre 270 y 280 nm. El volumen de líquidos de lavado para remover la solución adsorbida aún en el espacio vacío de la columna generalmente es de 1 .8 a 2 veces el lecho de la columna. Los líquidos de lavado tienen una composición que varía de conformidad con la naturaleza y la cantidad de las impurezas y el tipo de producto adsorbido. Las temperaturas oscilan de 0°C a 35°C, preferiblemente de 0°C a 5°C. El líquido de lavado preferido es agua, pero pequeñas cantidades (1 -5%) de solventes
miscibles en agua (por ejemplo, acetona o etanol) también pueden estar presentes. El producto adsorbido se eluye con agua.solventes miscibles en agua (por ejemplo, cetonas, alcoholes con bajo peso molecular, éteres solubles en agua o ésteres) mezclas cuya composición puede oscilar de 100% a 0.10% agua/solvente, dependiendo de la naturaleza de las impurezas y el origen del material. Las mezclas se ajustan al pH 1 1 -13, preferiblemente 1 1 -12.5, con hidróxido de sodio. La elución se monitorea a través de la absorción de UV entre 270 y 280 nm. Las fracciones se analizan y aquellas que contienen los compuestos deseados, se combinan y concentran in vacuo. Los siguientes ejemplos ilustran a detalle la invención
EJEMPLO 1 Preparación de isoflavonas conjugadas por extracción directa de Trifolium pratensis
500 g de Trifolium pratensis finamente triturados, secos se trataron con 2000 mi de agua destilada bajo agitación a temperatura ambiente durante 10 horas. El sólido entonces se filtra y la solución se analiza por HPLC para el contenido en isoflavonas conjugadas y no conjugadas. El contenido total de isoflavonas conjugadas es de aproximadamente 500 mg, las agliconas libres están sustancialmente ausentes. La solución se concentra in vacuo a 250 mi, se filtra adicionalmente, se percola en una columna de 1 -
1 .5 cm de diámetro empacado con 10 g de Sepabeads 270® Mitsubishi, recolectando las fracciones y monitoreando la elución mediante UV a 270 nm. Después de terminar la percolación, la columna se lava con aproximadamente dos veces el espacio vacío con agua destilada, posteriormente agua que contiene etanol al 5% (200 mi). Las fracciones que contienen las isoflavonas conjugadas (análisis de HPLC) se combinan. La solución se filtra, el residuo se seca in vacuo (aproximadamente 420 mg) posteriormente se absorbe con acetona seca para dar un residuo sólido, en un rendimiento de aproximadamente 84% en el extracto acuoso de partida. El residuo consiste en glicosidas de biocanina A, formononetina, daidzeína y genisteína con pureza al 98%.
EJEMPLO 2 Preparación de isoflavonas por extracción de los extractos acuosos de Trifolium pratensis
20 g del extracto seco obtenido de conformidad con EP 174144 (ejemplo 1 ) con contenido en isoflavonas libres de aproximadamente 20% y en isoflavonas conjugadas de aproximadamente 30% (HPLC) se dispersan en 500 mi de agua; la suspensión se filtra in vacuo. El análisis de HPLC muestra el contenido en agliconas conjugadas que es de alrededor de 28% y en agliconas no conjugadas que es de alrededor de 1 % en el peso seco de partida (las agliconas no conjugadas se remueven, junto con otros
componentes, debido a su insolubilidad en agua). La solución se concentra a 200 mi mediante destilación in vacuo y se trata con 80 g de Sepabeads® SP 207 (Mitsubishi) absorbentes. La agitación continúa durante 2 horas. La resina adsorbida entonces se filtra in vacuo, se prensa y se coloca en una columna adaptada con un septo poroso. 1 .8 volúmenes del lecho de la columna entonces se agregan con agua destilada enfriada previamente a 0-5°C. Después de eso, 2.5 veces el volumen del lecho se agrega con una mezcla de agua:etanol 95/5, recolectando el eluato que se somete a destilación in vacuo a una temperatura que no excede 40°C hasta secar. El residuo sólido se absorbe con acetona, posteriormente con acetona/etil éter y se tritura, los solventes se separan por filtración in vacuo y el sólido se recupera. Los análisis de HPLC muestran que el producto consiste en genisteína, daidzeína, formonetina y biocanina A y se encuentra sustancialmente libre de impurezas (el contenido en isoflavonas conjugadas: 90-95%). Los rendimientos oscilan de 80 a 85% en el extracto de partida.
EJEMPLO 3 Extracción de estrógenos conjugados de orina de yegua preñada
20 litros de orina de yegua preñada se filtran primero en un lecho de arena de aproximadamente 10 cm, posteriormente a través de una membrana de 0.2 µ. El contenido en estrógenos conjugados se determina mediante HPLC o GC. El pH se ajusta a aproximadamente 12.5-13.5 mediante adición de hidróxido de sodio concentrado. Todo se mantiene bajo agitación mecánica durante aproximadamente 1 -2 h, bajo nitrógeno. El pH entonces se ajusta a neutralidad (pH 7.5-8.5, preferiblemente 8) con un ácido mineral, preferiblemente HCI o ácido trifluoroacético. La solución además se filtra in vacuo en arena, posteriormente sobre una membrana. El filtrado claro se pasa, mediante percolación o lecho expandido, con sobrepresión ligera para no incrementar el lecho de resina por más de 3-5% en altura en caso del lecho expandido y no inducir el empacado de la resina cuando se utiliza percolación directa, en una columna con un diámetro de 7.5 y 10 cm empacado con 150-180 g de Sepabeads 207® Diaion (Mitsubishi). En el caso del lecho expandido, el lecho de columna debe ser de al menos 30-50 cm. Después de terminar la elución, la resina se enfría mediante la circulación del enfriador líquido a 0°-5°C, posteriormente el adsorbato se lava con al menos 1.8-2/5 volúmenes de espacio vacío con agua destilada a 0°-5°C. El lecho entonces se percola (o expande) con agua a pH 1 1 .5-13.0 mediante la adición de NaOH concentrado, a una temperatura de 5°-10°C (2 y 4 volúmenes de la
resina). El complejo de estrogenos conjugado entonces se eluye con una mezcla de agua: solventes miscibles en agua (acetona, etanol, THF) en una relación mínima 30:70, posteriormente se ajusta a pH 10-13, preferiblemente 12.5-13, mediante la adición de hidróxido de sodio. El eluato se recupera, se neutraliza y se seca in vacuo para proporcionar el ingrediente activo.
Claims (10)
1.- Un procedimiento para la recuperación y purificación de productos solubles en agua hidrófilos naturales en forma conjugada de extractos acuosos vegetales o fluidos fisiológicos, mediante adsorción de dichos extractos o fluidos en una resina lipófila, seguido por desorción y recuperación del eluato, cuyo procedimiento se caracteriza porque la resina es un polímero de estireno-divinil benceno poroso bromado en la porción de estireno y/o divinil benceno, con un área de 600 m2/g, un volumen de 1.3 ml/g (peso seco) y un tamaño de poro de aproximadamente 200 Angstrom.
2. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque los productos naturales comprenden isoflavonas, antioxidantes o estrógenos conjugados o mezclas de los mismos.
3. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque las isoflavonas se extraen de soya o Trifolium pratensis.
4. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque las isoflavonas comprenden genisteína, daidzeina, formononetina, biocanina A.
5. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, para la purificación y recuperación de estrógenos conjugados de fluidos de mamífero preñado.
6. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque una mezcla de sales de fluido fisiológico es orina de yegua preñada.
7. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 6 para la preparación de sales de mezcla de estrógenos que comprenden estrona, equilina, A8,9-dehidroestrona, 1 7a-estradiol; 7a-dihidroequilina, 1 7ß-dihidroequilina, 1 7p-estradiol, equilenina, 1 7a-dihidroequilenina; 1 7p-dihidroequilenina.
8. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 7 para la preparación de una mezcla que contiene además una o más sales conjugadas del grupo de 7p-A8,9-dehidroestradiol; 17 a-A8,9-dehidroestradiol; 6-OH 17a-dihidroequilenina; 6-OH equilenina; 6-OH 17 -dihidroequilenina y/u otros metabolitos esferoidales sulfatados.
9. - El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 - 7, caracterizado además porque los conjugados son sulfatos y las sales son sales de sodio.
10.- El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8, caracterizado además porque las resinas se seleccionan de aquellas que están comercialmente disponibles bajo los nombres comerciales Diaion SP 207®, Diaion SP 205® y Diaion SP 206®.
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