CN108403719A - 一种孕马尿天然结合雌激素的快速提纯和产业化生产方法 - Google Patents

一种孕马尿天然结合雌激素的快速提纯和产业化生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种孕马尿天然结合雌激素的快速提纯和产业化生产方法。提存方法包括步骤：将孕马尿经静置沉降处理和离心沉降处理，过滤并收集滤液，得到处理液，之后将处理液进行富集；将富集后的产物进行吸附处理，之后在室温下先水洗，后甲醇洗脱，收集洗脱液；将洗脱液采用旋转蒸发仪进行减压真空浓缩，之后经真空干燥箱干燥，得到结合雌激素。本发明采用MCI GEL CSP50/P10大孔树脂法进行孕马尿中天然结合雌激素的提取分离，不仅能够有效克服传统方法中吸附容量低、产品纯度低、回收率低等不足，而且该法工艺简单、成本低廉、易于工业化生产；且提取得到的结合雌激素有效成分保留多，具有优异的治疗和预防骨质疏松症等功效。

Description

一种孕马尿天然结合雌激素的快速提纯和产业化生产方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种孕马尿天然结合雌激素的快速提纯和产业化生产方法。
背景技术
众所周知，结合雌激素是治疗更年期综合症的有效药物，尤其是天然的结合雌激素混合物具有确切的功效和可靠的安全性，在临床上不仅可以用于治疗和预防女性生理或人工绝经期后出现的更年期综合症，而且能够预防和治疗骨质疏松症，得到人们长期的应用和认可。因此，自发现孕马尿液(PMU)的天然结合雌激素对治疗更年期综合症特别有效以来，从怀孕母马的尿液中提取结合雌激素混合物的方法已进行了数十年研究。
早期报道的结合雌激素混合物提取方法的专利有美国专利：US2429398、US2519516、US2696265、US2711988、US2834712等，其多为采用有机溶剂萃取的方法。上世纪60年代开始出现采用活性炭、离子交换树脂、反向硅胶等方法从孕马尿中提取结合雌激素混合物的方法。目前的提取方法主要是利用结合雌激素为甾体结构物质的疏水性来分离制备；其中，国内外陆续有多个结合雌激素分离制备相关的发明专利被公开，包括反相硅胶、含有各种功能团的大孔树脂、苯乙烯-二乙烯聚合物非极性树脂、聚丙烯酸酯树脂、含季铵官能团的强碱性阴离子交换树脂等吸附树脂等。然而，上述方法存在诸多缺点，如大孔树脂机械强度低、容易破碎、回收次数少、容易增加成本；吸附剂比表面积小、吸附剂的吸附容量小、产品纯度低、回收率差、成分保留少、不适合大规模生产的需要等。
基于此，提供一种新型的一种孕马尿天然结合雌激素的快速提纯和产业化生产方法具有至关重要的意义。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明旨在提供一种孕马尿天然结合雌激素的快速提纯和产业化生产方法。本发明采用MCI GEL CSP50/P10大孔树脂法进行孕马尿中天然结合雌激素的提取分离，不仅能够有效克服传统方法中吸附剂吸附容量低、产品纯度低、回收率低等不足，而且该法工艺简单、成本低廉、易于工业化生产；且提取得到的结合雌激素有效成分保留多，具有优异的治疗和预防骨质疏松症等功效。
为此，本发明提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种孕马尿天然结合雌激素的提存方法，包括以下步骤：S1：将孕马尿进行预处理，之后将处理液进行富集；S2：将富集后的产物进行吸附处理，之后洗涤并收集洗脱液；S3：将洗脱液经浓缩和干燥处理，得到结合雌激素。
优选地，S1中：预处理包括降粘度和悬浮物处理；具体地，将孕马尿经过自然静置沉降处理和/或离心沉降处理，之后过滤并收集滤液，得到处理液。
优选地，S2中：吸附处理中，吸附剂的原料组分包括大孔树脂，且大孔树脂选用聚苯乙烯型离子交换树脂。
优选地，聚苯乙烯型离子交换树脂选用三菱化学精细分离填料吸附树脂，且型号为CSP50/P10。
优选地，S2中：吸附剂的原料组分还包括山梨醇和氧化钇，且聚苯乙烯型离子交换树脂、山梨醇和氧化钇的质量比依次为100：(2～5)：(3～10)。
优选地，吸附剂的制备方法包括：将吸附剂的各原料组分采用球磨的方式混合均匀；其中，球磨的转速为150～300r/min，时间为200～500min。
优选地，球磨过程中还包括：加入质量百分浓度为0.1％～2％的碳酸钠水溶液，且碳酸钠水溶液的加入质量与聚苯乙烯型离子交换树脂的质量之比为(0.05～0.2)：100。
优选地，S2中：洗涤操作具体包括：在室温条件下，首先采用水溶液洗涤，之后采用甲醇进行洗脱。
优选地，S3中：采用旋转蒸发仪进行减压真空浓缩，且真空浓缩的真空度为0.08～0.09MPa，温度为50℃～65℃。
第二方面，采用本发明提供的方法制备得到的结合雌激素。
本发明提供的上述技术方案具有以下优点：
(1)申请人经过大量研究发现：本发明采用MCI GEL CSP50/P10大孔树脂法进行孕马尿中天然结合雌激素的提取分离，不仅能够有效克服传统方法中吸附剂吸附容量低、产品纯度低、回收率低等不足，而且该法工艺简单、成本低廉、易于工业化生产。
(2)本发明选用MCI GEL CSP50/P10大孔树脂作为吸附剂的活性成分，其作为一种新型非极性精细分离树脂，颗粒特别小，比表面积大，吸附容量大，可以吸附疏水性的甾体结构的结合雌激素，此外通过控制洗脱剂的极性，先水洗后醇洗来达到良好的解吸附，从而实现孕马尿中天然结合雌激素的快速提存。
(3)本发明提供的吸附剂对孕马结合雌激素粗提物具有良好的静态及动态吸附性能，对结合雌激素吸附及解吸附性能良好，条件简单易行，纯化工艺稳定，可靠，回收率在90％以上；且提取得到的结合雌激素有效成分保留多，纯度高，色泽淡，无异味，具有优异的治疗和预防骨质疏松症等功效。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明孕马尿天然结合雌激素提存方法的工艺流程示意图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚的说明本发明的技术方案，因此只作为实例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
本发明提供一种孕马尿天然结合雌激素的提存方法，如图1所示，包括以下步骤：
S1：将孕马尿在前处理缸中进行降粘度和悬浮物处理，具体地，将孕马尿经过自然静置沉降处理和/或离心沉降处理，之后采用过滤器进行过滤并收集滤液，得到处理液，之后经旋转蒸发仪和真空干燥箱将处理液进行富集。
S2：将富集后的产物经层析柱进行吸附处理，之后洗涤并收集洗脱液。其中，吸附剂的原料组分包括大孔树脂，大孔树脂选用聚苯乙烯型离子交换树脂；且吸附剂的原料组分优选还包括山梨醇和氧化钇，且聚苯乙烯型离子交换树脂、山梨醇和氧化钇的质量比依次为100：(2～5)：(3～10)。吸附剂的制备方法包括：将吸附剂的各原料组分在转速为150～300r/min的条件下球磨200～500min。此外，洗涤操作具体包括：在室温条件下，首先采用水溶液洗涤，之后采用甲醇进行洗脱。
S3：将洗脱液采用旋转蒸发仪进行减压真空浓缩，且真空浓缩的真空度为0.08～0.09MPa，温度为50℃～65℃，之后经真空干燥箱干燥，得到结合雌激素。
在本发明的进一步实施方式中，球磨过程中还包括：加入质量百分浓度为0.1％～2％的碳酸钠水溶液，且碳酸钠水溶液的加入质量与聚苯乙烯型离子交换树脂的质量之比为(0.05～0.2)：100。
下面结合具体实施方式进行说明：
实施例一
本实施例提供一种孕马尿天然结合雌激素的提存方法，包括以下步骤：
S1：将孕马尿经自然静置沉降处理和离心沉降处理，之后过滤并收集滤液，得到处理液，之后将处理液进行富集。
S2：将富集后的产物进行吸附处理，之后在室温下先水洗，后甲醇洗脱，收集洗脱液。其中，吸附剂的原料组分包括质量比依次为100：2：10的MCI GEL CSP50/P10、山梨醇和氧化钇；且吸附剂的制备方法包括：将吸附剂的各原料组分在转速为150r/min的条件下球磨500min。
S3：将洗脱液采用旋转蒸发仪在真空度为0.08MPa，温度为65℃的条件下进行真空浓缩，之后干燥，得到结合雌激素。
实施例二
本实施例提供一种孕马尿天然结合雌激素的提存方法，包括以下步骤：
S1：将孕马尿经自然静置沉降处理和离心沉降处理，之后过滤并收集滤液，得到处理液，之后将处理液进行富集。
S2：将富集后的产物进行吸附处理，之后在室温下先水洗，后甲醇洗脱，收集洗脱液。其中，吸附剂的原料组分包括质量比依次为100：5：3的MCI GEL CSP50/P10、山梨醇和氧化钇；且吸附剂的制备方法包括：将吸附剂的各原料组分在转速为300r/min的条件下球磨200min。
S3：将洗脱液采用旋转蒸发仪在真空度为0.09MPa，温度为50℃的条件下进行真空浓缩，之后干燥，得到结合雌激素。
实施例三
本实施例提供一种孕马尿天然结合雌激素的提存方法，包括以下步骤：
S1：将孕马尿经自然静置沉降处理和离心沉降处理，之后过滤并收集滤液，得到处理液，之后将处理液进行富集。
S2：将富集后的产物进行吸附处理，之后在室温下先水洗，后甲醇洗脱，收集洗脱液。其中，吸附剂的原料组分包括质量比依次为100：3：5的MCI GEL CSP50/P10、山梨醇和氧化钇；且吸附剂的制备方法包括：将吸附剂的各原料组分在转速为200r/min的条件下球磨350min。
S3：将洗脱液采用旋转蒸发仪在真空度为0.08MPa，温度为60℃的条件下进行真空浓缩，之后干燥，得到结合雌激素。
实施例四
本实施例提供一种孕马尿天然结合雌激素的提存方法，包括以下步骤：
S1：将孕马尿经自然静置沉降处理和离心沉降处理，之后过滤并收集滤液，得到处理液，之后将处理液进行富集。
S2：将富集后的产物进行吸附处理，之后在室温下先水洗，后甲醇洗脱，收集洗脱液。其中，吸附剂的原料组分包括质量比依次为100：3：5的MCI GEL CSP50/P10、山梨醇和氧化钇；且吸附剂的制备方法包括：将吸附剂的各原料组分混合，之后加入质量百分浓度为1％的碳酸钠水溶液，且碳酸钠水溶液的加入质量与聚苯乙烯型离子交换树脂的质量之比为0.1：100，然后在转速为200r/min的条件下球磨350min。
S3：将洗脱液采用旋转蒸发仪在真空度为0.08MPa，温度为60℃的条件下进行真空浓缩，之后干燥，得到结合雌激素。
另外，为了进一步说明本发明提存方法的优势，设置如下对比例。需要说明的是，下述对比例均在实施例四的基础上改变相关参数设置而成。
对比例一
本对比例提供一种孕马尿天然结合雌激素的提存方法，包括以下步骤：
S1：将孕马尿经自然静置沉降处理和离心沉降处理，之后过滤并收集滤液，得到处理液，之后将处理液进行富集。
S2：将富集后的产物进行吸附处理，之后在室温下先水洗，后甲醇洗脱，收集洗脱液。其中，吸附剂选用MCI GEL CSP50/P10。
S3：将洗脱液采用旋转蒸发仪在真空度为0.08MPa，温度为60℃的条件下进行真空浓缩，之后干燥，得到结合雌激素。
对比例二
本对比例提供一种孕马尿天然结合雌激素的提存方法，包括以下步骤：
S1：将孕马尿经自然静置沉降处理和离心沉降处理，之后过滤并收集滤液，得到处理液，之后将处理液进行富集。
S2：将富集后的产物进行吸附处理，之后在室温下先水洗，后甲醇洗脱，收集洗脱液。其中，吸附剂的原料组分包括质量比依次为100：3：5的MCI GEL CSP50/P10、山梨醇和氧化钇；且吸附剂的制备方法包括：将吸附剂的各原料组分混合，之后加入质量百分浓度为1％的碳酸氢钠水溶液，且碳酸氢钠水溶液的加入质量与聚苯乙烯型离子交换树脂的质量之比为0.1：100，然后在转速为200r/min的条件下球磨350min。
S3：将洗脱液采用旋转蒸发仪在真空度为0.08MPa，温度为60℃的条件下进行真空浓缩，之后干燥，得到结合雌激素。
对比例三
本对比例提供一种孕马尿天然结合雌激素的提存方法，包括以下步骤：
S1：将孕马尿经自然静置沉降处理和离心沉降处理，之后过滤并收集滤液，得到处理液，之后将处理液进行富集。
S2：将富集后的产物进行吸附处理，之后在室温下先水洗，后甲醇洗脱，收集洗脱液。其中，吸附剂的原料组分包括质量比依次为100：3：5的MCI GEL CSP50/P10、山梨醇和氧化钇；且吸附剂的制备方法包括：将吸附剂的各原料组分混合，之后加入质量百分浓度为1％的盐酸水溶液，且盐酸水溶液的加入质量与聚苯乙烯型离子交换树脂的质量之比为0.1：100，然后在转速为200r/min的条件下球磨350min。
S3：将洗脱液采用旋转蒸发仪在真空度为0.08MPa，温度为60℃的条件下进行真空浓缩，之后干燥，得到结合雌激素。
对比例四
本对比例提供一种孕马尿天然结合雌激素的提存方法，包括以下步骤：
S1：将孕马尿经自然静置沉降处理和离心沉降处理，之后过滤并收集滤液，得到处理液，之后将处理液进行富集。
S2：将富集后的产物进行吸附处理，之后在室温下先水洗，后甲醇洗脱，收集洗脱液。其中，吸附剂的原料组分包括质量比依次为100：3：5的MCI GEL CSP50/P10、山梨醇和氧化钇；且吸附剂的制备方法包括：将吸附剂的各原料组分混合，之后加入质量百分浓度为3％的碳酸钠水溶液，且碳酸钠水溶液的加入质量与聚苯乙烯型离子交换树脂的质量之比为0.1：100，然后在转速为200r/min的条件下球磨350min。
S3：将洗脱液采用旋转蒸发仪在真空度为0.08MPa，温度为60℃的条件下进行真空浓缩，之后干燥，得到结合雌激素。
对比例五
本对比例提供一种孕马尿天然结合雌激素的提存方法，包括以下步骤：
S1：将孕马尿经自然静置沉降处理和离心沉降处理，之后过滤并收集滤液，得到处理液，之后将处理液进行富集。
S2：将富集后的产物进行吸附处理，之后在室温下先水洗，后甲醇洗脱，收集洗脱液。其中，吸附剂的原料组分包括质量比依次为100：3：5的MCI GEL CHP50/P20、山梨醇和氧化钇；且吸附剂的制备方法包括：将吸附剂的各原料组分混合，之后加入质量百分浓度为1％的碳酸钠水溶液，且碳酸钠水溶液的加入质量与聚苯乙烯型离子交换树脂的质量之比为0.1：100，然后在转速为200r/min的条件下球磨350min。
S3：将洗脱液采用旋转蒸发仪在真空度为0.08MPa，温度为60℃的条件下进行真空浓缩，之后干燥，得到结合雌激素。
另外，为了更好的评价各实施例提存方法的功效，进行以下实验：
一、各实施例和对比例吸附剂性能及结合雌激素回收率测定
具体地，对于各实施例和对比例的提存方法，分别测定吸附剂用量及结合雌激素的回收率，具体数据如表1所示：
表1各实施例和对比例实验条件及产物回收率列表
孕马尿与吸附剂的体积比吸附比率 结合雌激素回收率/％
实施例一 200:1 94.6
实施例二 190:1 93.9
实施例三 198:1 95.1
实施例四 220:1 98.0
对比例一 130:1 89.6
对比例二 150:1 80.5
对比例三 90:1 86.3
对比例四 160:1 90.1
对比例五 100:1 82.7
二、各实施例和对比例结合雌激素性能测定
将十周龄健康SD雌鼠110只，随机分成11组，每组10只，第一组为假手术组(Sham)、第二组为卵巢切除模型组(OVX)、第三组至第十一组为实验组，分别试用实施例一至实施例四、对比例至对比例五制备得到的结合雌激素；其中，具体试验方法参照专利CN201210417435.7。
饲养条件：温度为(23±2)℃，光照：黑暗为12h：12h。让各组大鼠适应环境2周后开始骨质疏松造模手术：各组大鼠均经腹腔注射20％乌拉坦麻醉(6mL/kg体重)，Sham组开腹后关腹，其余两组行双侧卵巢切除术。术后第4周起，Sham组和OVX组每天进食标准饲料和去离子水，实验组每天进食标准饲料和去离子水，同时灌胃给与结合雌激素5mg/kg，连续3个月，每周称一次体重。实验结束后，用乌拉坦麻醉，摘取眼球采血，2000r/min离心，吸取上清(即血清)。摘除大鼠子宫，取出大鼠双侧股骨和双侧胫骨，剔除软组织。两胫骨经800℃高温炉中灰化8h，冷却后称灰重。用研钵碾碎成灰状，取0.1g骨灰溶于1mL 6mol/L盐酸中，测骨钙和骨磷时取0.2mL用超纯水稀释至1mL，用全自动生化分析仪检测骨钙和骨磷含量。左股骨用骨密度仪测量骨密度(BMD)。血清生化指标测定：取血清0.5mL，用全自动生化分析仪检测血清碱性磷酸酶(ALP)、钙(Ca)和磷(P)。各实施例和对比例结合雌激素对双侧卵巢切除大鼠血清ALP、血清Ca和血清P的影响数据如表2所示，且实验结果用x±S表示。
表2结合雌激素对大鼠血清ALP、血清Ca和血清P的影响数据列表
血清ALP(U/L) 血清Ca(mmol/L) 血清P(mmol/L)
Sham 28.95±8.56 2.53±0.15 1.98±0.20
OVX 223.05±20.06 2.01±0.06 1.45±0.25
实施例一 78.55±11.51 2.47±0.13 2.03±0.18
实施例二 80.23±10.06 2.55±0.15 2.00±0.15
实施例三 74.85±9.35 2.51±0.09 1.96±0.15
实施例四 69.80±11.51 2.53±0.13 1.95±0.09
对比例一 153.05±10.59 2.50±0.15 1.63±0.12
对比例二 98.56±9.59 2.27±0.18 1.58±0.13
对比例三 198.25±12.06 2.08±0.16 2.01±0.11
对比例四 96.37±10.16 2.31±0.10 1.50±0.15
对比例五 136.85±10.97 2.11±0.15 1.63±0.12
从表2数据可以看出：去卵巢后，模型组大鼠血清碱性磷酸酶活性显著增加；去卵巢后，体内雌激素缺乏，导致骨转化率增加，与绝经后妇女的高转化型骨质疏松症一致。而从实验组数据可以看出，给予本发明各实施例制备得到的结合雌激素后，碱性磷酸酶活性显著下降，即各实施例结合雌激素可以抑制去卵巢引起的骨转化率的增加，减少骨质的破坏；此外，本发明结合雌激素还可以显著提升血清钙浓度，有效逆转由于卵巢切除导致的血清钙的降低，进而有利于骨的形成。
需要说明的是，除了上述实施例一至实施例四列举的情况，选用其他原料组分配比及提存方法中的参数也是可行的。
本发明采用MCI GEL CSP50/P10大孔树脂法进行孕马尿中天然结合雌激素的提取分离，不仅有效克服了传统方法中吸附容量低、产品纯度低、回收率的不足，而且该法工艺简单、成本低廉、收率高、易于工业化生产；选用MCI GEL CSP50/P10大孔树脂作为吸附剂的活性成分，其作为一种新型非极性精细分离树脂，颗粒特别小，比表面积大，吸附容量大，可以吸附疏水性的甾体结构的结合雌激素，此外通过控制洗脱剂的极性，先水洗后醇洗来达到良好的解吸附，从而实现孕马尿中天然结合雌激素的快速提存；且提取得到的结合雌激素有效成分保留多、纯度高、色泽淡、无异味，具有优异的治疗和预防骨质疏松症等功效。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种孕马尿天然结合雌激素的提存方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将孕马尿进行预处理，之后将处理液进行富集；
S2：将所述富集后的产物进行吸附处理，之后洗涤并收集洗脱液；
S3：将所述洗脱液经浓缩和干燥处理，得到所述结合雌激素。
2.根据权利要求1所述的孕马尿天然结合雌激素的提存方法，其特征在于：
所述S1中：
所述预处理包括降粘度和悬浮物处理；具体地，将孕马尿经过自然静置沉降处理和/或离心沉降处理，之后过滤并收集滤液，得到处理液。
3.根据权利要求1所述的孕马尿天然结合雌激素的提存方法，其特征在于：
所述S2中：
所述吸附处理中，吸附剂的原料组分包括大孔树脂，且所述大孔树脂选用聚苯乙烯型离子交换树脂。
4.根据权利要求3所述的孕马尿天然结合雌激素的提存方法，其特征在于：
所述聚苯乙烯型离子交换树脂选用三菱化学精细分离填料吸附树脂，且型号为CSP50/P10。
5.根据权利要求3所述的孕马尿天然结合雌激素的提存方法，其特征在于：
所述S2中：
所述吸附剂的原料组分还包括山梨醇和氧化钇，且所述聚苯乙烯型离子交换树脂、所述山梨醇和所述氧化钇的质量比依次为100：(2～5)：(3～10)。
6.根据权利要求5所述的孕马尿天然结合雌激素的提存方法，其特征在于：
所述吸附剂的制备方法包括：
将所述吸附剂的各原料组分采用球磨的方式混合均匀；其中，球磨的转速为150～300r/min，时间为200～500min。
7.根据权利要求6所述的孕马尿天然结合雌激素的提存方法，其特征在于：
所述球磨过程中还包括：
加入质量百分浓度为0.1％～2％的碳酸钠水溶液，且所述碳酸钠水溶液的加入质量与所述聚苯乙烯型离子交换树脂的质量之比为(0.05～0.2)：100。
8.根据权利要求1所述的孕马尿天然结合雌激素的提存方法，其特征在于：
所述S2中：
所述洗涤操作具体包括：在室温条件下，首先采用水溶液洗涤，之后采用甲醇进行洗脱。
9.根据权利要求1所述的孕马尿天然结合雌激素的提存方法，其特征在于：
所述S3中：
采用旋转蒸发仪进行减压真空浓缩，且所述真空浓缩的真空度为0.08～0.09MPa，温度为50℃～65℃。
10.根据权利要求1～9任一项所述方法制备得到的结合雌激素。
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