CN103214530B

CN103214530B - 一种苹果渣中根皮苷的分离纯化方法

Info

Publication number: CN103214530B
Application number: CN201310109318.9A
Authority: CN
Inventors: 尚华; 刘迪
Original assignee: Shaanxi Polytechnic Institute
Current assignee: Shaanxi Polytechnic Institute
Priority date: 2013-03-29
Filing date: 2013-03-29
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2033-03-29
Also published as: CN103214530A

Abstract

本发明涉及多酚类物质提纯技术，公开了一种苹果渣中根皮苷的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）粗提：将重量比为1：8-1:12的苹果渣和浸提乙醇溶液混合，浸提乙醇溶液体积比为50-70%，再在60-80℃恒温水浴锅中重复浸提、过滤，合并滤液，离心分离，得上清液为苹果渣的粗提溶液；（2）吸附：将苹果渣的粗提溶液作为吸附液，调节苹果渣的粗提溶液pH值为3.5-4.0后，采用D-101大孔吸附树脂对苹果渣的粗提溶液中的根皮苷进行树脂吸附；（3）洗脱：采用pH值为7.0、体积浓度75%-90%的乙醇洗脱液进行洗脱、浓缩、干燥，得纯化根皮苷粉。

Description

一种苹果渣中根皮苷的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及多酚类物质提纯技术，特别涉及一种苹果渣中根皮苷的分离纯化方法。

背景技术

多酚类物质具有很多独特的作用，目前多酚物质的应用越来越广泛。多酚是多羟基酚类化合物的总称，在植物体中广泛存在，又称为单宁。多酚的独特结构赋予了它很多独特的功能，如多酚具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗动脉硬化等多种功效。目前，国内外研究的多酚制备方法有化学合成法和提取分离法，前者虽然可以得到纯度较高的多酚产品但是产品的安全性较差，并需要消耗大量的合成原料和合成能量；后者由于其具有制得的产品安全性高、原料来源广泛、操作简便等优点而受到了广泛的关注。另外，采用提取分离法可以从很多工业化生产的废料中制备多酚，对工业废料可以实现综合再利用，因此，目前多酚制备的研究聚焦在了提取分离方法上。

根皮苷属于多酚类物质，分子式为C₂₁H₂₄O₁₀,为多酚物质中植物黄酮类中的二氢查尔酮苷。根皮苷主要存在于苹果树的根皮、茎、嫩叶以及苹果果实中，具有多种生物活性，如调节血压、血糖，保护心脏、清除体内自由基及美白等，并且还具有低毒的特点。目前，从植物中提取根皮苷的主要原料为苹果植物，近年来在多穗柯植物中也发现了含量比较丰富的根皮苷。但是，其提取分离方法仅限于粗提。

发明内容

本发明的目的在于一种苹果渣中根皮苷的分离纯化方法，为苹果渣深度加工和综合利用以及根皮苷的制备开辟一条新的途径。在苹果榨汁过程中，大部分多酚物质随果皮和果芯而转移到果渣中，因此，苹果渣中含有较多的多酚物质，其中含量较多的为根皮苷。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。

一种苹果渣中根皮苷的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）粗提：将重量比为1：8-1:12的苹果渣和浸提乙醇溶液混合，浸提乙醇溶液体积比为50-70%，再在60-80℃恒温水浴锅中重复浸提、过滤，合并滤液，离心分离，得上清液为苹果渣的粗提溶液；

（2）吸附：将苹果渣的粗提溶液作为吸附液，调节苹果渣的粗提溶液pH值为3.5-4.0后，采用D-101大孔吸附树脂对苹果渣的粗提溶液中的根皮苷进行树脂吸附；

（3）洗脱：采用pH值为7.0、体积浓度75%-90%的乙醇洗脱液进行洗脱、浓缩、干燥，得纯化根皮苷粉。

上述技术方案的步骤（2）中，吸附工艺参数影响吸附率的权重关系是：吸附液流速>吸附液pH>吸附液浓度。

优选地，在步骤（2）进行树脂吸附前，先对苹果渣的粗提溶液进行取样，对样品浓缩、烘干、称重，计算粗提溶液浓度，通过浓缩或加水调节粗提溶液浓度为0.4-0.5mg/mL；更优选地，在进行树脂吸附前，粗提溶液浓度为0.45mg/mL。

优选地，步骤（2）中调节苹果渣的粗提溶液pH值时采用柠檬酸或醋酸。

上述技术方案的步骤（3）中，洗脱工艺参数影响洗脱率的权重关系是：乙醇洗脱液pH>乙醇洗脱液浓度>洗脱温度。

优选地，在步骤（3）进行洗脱时，洗脱温度为65-75℃；更优选地，在步骤（3）进行洗脱时，洗脱温度为70℃。

本发明以苹果渣为原料，以根皮苷为分离纯化对象，采用有机溶剂提取法制备粗提物，研究最佳的分离纯化条件，使得根皮苷在苹果渣粗提物干粉的浓度为0.78%（质量分数）经本发明的分离纯化产物干粉中浓度为17.23%（质量分数），其提纯效果得到质的提高，苹果渣深度加工和综合利用提供参考，同时为寻找高纯度根皮苷的制备原料开辟一条新的途径。

附图说明

图1为不同型号的树脂对苹果渣根皮苷粗提溶液的吸附率和洗脱率柱状图；

图2为不同的上样浓度影响D-101树脂吸附率的曲线图；

图3为不同的吸附流速影响D-101树脂吸附率的曲线图；

图4为不同的洗脱液pH影响树脂洗脱率的曲线图；

图5为不同浓度的乙醇洗脱液影响树脂洗脱率的曲线图；

图6为不同流速的乙醇洗脱液影响树脂洗脱率的曲线图。

发明内容

下面结合附图和具体验证实验对本发明作进一步详细说明。

一、实验方案

（1）苹果渣中根皮苷粗提溶液的制备

将体积比60%的乙醇溶液按照1:10的料液比与杜仲叶粉混合，70℃恒温水浴锅中浸提5h，浸提2次，过滤，合并滤液，离心分离，上清液为苹果渣中根皮苷粗提溶液。将粗提溶液减压浓缩至干，真空冷冻干燥成粉。使用时，用水溶解，重新得粗提溶液，其pH值时采用柠檬酸或醋酸。

工业生产中，具体是：将重量比为1：8-1:12的苹果渣和浸提乙醇溶液混合，浸提乙醇溶液体积比为50-70%，再在60-80℃恒温水浴锅中重复浸提、过滤，合并滤液，离心分离，得上清液为苹果渣的粗提溶液，调节其浓度和PH值后直接使用。

（2）根皮苷的测定

采用高效液相色谱法检测各样品中的根皮苷。将一定浓度的苹果渣根皮苷样品溶液浓缩，浓缩液经过孔径0.45μm滤膜过滤，进样测定根皮苷含量。

（3）树脂预处理

按照LS-6、HPD-600、XDA-8、D-101和D4020这5种大孔吸附树脂说明书所述方法，对这5种树脂进行预处理及再生处理，待用。

(a)树脂的优选效果对比

准确称取用滤纸吸干表面水分的经过预处理的树脂1g(精确到0.0001g)，置于250mL三角瓶中，加入已知浓度的苹果根皮苷粗提溶液100mL，避光密封，置于恒温水浴振荡器中，25℃，120r/min振荡24h。滤出树脂，用蒸馏水洗去表面残留多酚溶液后用滤纸吸干表面水分备用，测定容液中剩余根皮苷浓度，根据以下公式计算树脂吸附率:

吸附率A(%)=［(C₀－C_e)/C₀］×100%

式中:C₀为粗提溶液中根皮苷的起始浓度，mg/mL；C_e为吸附平衡时溶液中的总多酚浓度mg/mL；A为吸附率，%。

量取体积比90%的乙醇溶液100mL，于25℃下振荡洗脱吸附了苹果根皮苷的树脂2h，测定解吸液中总多酚浓度，计算洗脱率，公式如下:

洗脱率D(%)=C_DV_D/［(C₀－C_e)×V_A］×100%

式中:D为洗脱率，%；C_D为洗脱液中总多酚浓度，mg/mL；V_A为吸附液体积，mL；V_D为洗脱液体积，mL。

以吸附率、洗脱率两个指标说明树脂的优选效果，并进行后续的静态和动态实验研究。

（b）上样浓度(苹果渣中根皮苷粗提溶液浓度)对根皮苷吸附率影响

取5份样品浓度分别为0.15、0.30、0.45、0.60、0.75mg/mL的溶液，体积相同并在相同的吸附柱上吸附，收集洗脱液，用HPLC法测定其洗脱液中根皮苷的含量，从而计算大孔树脂的吸附率。

(c)吸附流速对吸附率的影响

对6份相同的样品溶液在相同的吸附柱上进行吸附，并且分别在流速为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL/min条件下进行吸附实验。用HPLC测定其洗脱液中根皮苷的含量，从而计算大孔树脂的吸附率。

(d)洗脱液pH对洗脱率的影响

调节洗脱剂的pH值，用3、4、5、6、7、8、9、10、11等9种不同pH值的乙醇溶液在相同的流速和相同的乙醇浓度下进行洗脱，收集洗脱液，用HPLC法测定其洗脱液中根皮苷的含量，从而计算大孔树脂的洗脱率。

(e)乙醇洗脱液浓度对洗脱效果的影响

对6份相同的样品溶液在相同流速和相同的吸附柱上进行吸附，然后分别用相同体积的20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇进行洗脱，减压浓缩回收乙醇后，用HPLC测定其洗脱液中根皮苷的含量，从而计算大孔树脂的洗脱率。

(f)洗脱剂流速对洗脱效果的影响

对5份相同的样品溶液，在相同的条件进行吸附，然后在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL/min的条件下进行洗脱，收集洗脱液，用HPLC法测定根皮苷浓度，计算出不同流速下的解吸率。

二、效果对比

（1）树脂优选效果对比

5种不同型号的树脂对苹果渣根皮苷粗提溶液的吸附率和洗脱率如图1所示。从表1可以看出，吸附率最高的树脂是XDA-8树脂，其次是D-101和D4020；洗脱率最高的是D-101，其次是D4020。D-101树脂具有较高的吸附率和最高的洗脱率，符合发明人综合优选D-101树脂作为分离苹果渣中根皮苷的树脂。

（2）上样浓度对根皮苷吸附率的影响效果对比

不同的上样浓度对D-101树脂吸附率的影响如图2所示。由图可以看出，上样液浓度（即吸附液浓度）由0.15mg/mL上升到0.45mg/mL，树脂的吸附率随之上升；而上样液浓度由0.45mg/mL上升到0.75mg/mL时，树脂的吸附率却随之下降。吸附过程中，上样浓度过小，吸附效率低；上样浓度过大，会发生多层吸附，也会使吸附率降低。结果显示，发明人选用0.45mg/mL这个浓度比较适合，且吸附率较高，选用0.45mg/mL作为后续试验上样浓度。

（3）吸附流速对根皮苷吸附率的影响效果对比

不同的吸附流速对树脂吸附率的影响如图3所示。由图3可以看出，吸附流速从1.0mL/min增大到6.0mL/min，吸附率不断下降。上样吸附的流速大，样品溶液与树脂床接触的时间就被缩短，因此树脂吸附根皮苷的量就变少，从而导致树脂吸附率下降。吸附流速在1mL/min时，根皮苷的吸附率达到最高；在6mL/min根皮苷的吸附率达到最低。后续实验，选择1mL/min的吸附速率进行吸附。

（4）乙醇洗脱液pH对根皮苷洗脱率的影响效果对比

不同的洗脱液pH对树脂洗脱率的影响如图4所示。由图4可以看出，pH值由3上升到7时，洗脱率随之上升；pH值由7上升到11时，洗脱率随之下降，即在pH为7时洗脱率最高。根皮苷属于中性极的物质，可以被偏中性的洗脱液很好地洗脱。发明人优选乙醇洗脱液，pH为7。

（5）乙醇洗脱液浓度对洗脱效果的影响

不同浓度的乙醇洗脱液对树脂洗脱率的影响如图5所示。由图5可以看出，随着乙醇浓度的增大，洗脱率也随之增大。这可能是因为随乙醇浓度增加，洗脱剂的极性降低，对树脂的洗脱能力就越强，根皮苷在洗脱液中的溶解性越好。发明人选用高浓度的乙醇溶液，即体积浓度75%-90%乙醇溶液，作为洗脱剂。

（6）洗脱剂流速对洗脱效果的影响

不同流速的乙醇洗脱液对树脂洗脱率的影响如图6所示。由图6可以看出，随着洗脱剂流速的不断增加，解吸率不断减小。流速增大，导致洗脱液与树脂接触的时间短，树脂床中吸附的根皮苷还没有被充分洗脱，洗脱液就已经流过树脂床了。因此，洗脱流速不宜过大，实验室选择0.5mL/min的流速进行洗脱。

三、进一步研究和结论

（1）发明人进一步研究D-101树脂对苹果渣中根皮苷的吸附率，其中，吸附工艺参数影响吸附率的权重关系是：吸附液流速>吸附液pH>吸附液浓度。换言之，吸附工艺参数影响吸附率的权重关系由大到小依次是：吸附液流速、吸附液pH、吸附液浓度。

最优吸附条件：吸附液浓度0.5mg/mL、吸附液pH值4、吸附流速（实验室1.0mL/min，）在此条件下吸附率可达到69.87%；工业生产中，选用可容忍的最低吸附流速即可。

将吸附液浓度、吸附液pH和吸附流速作为动态吸附的3个考察因素，每个因素为3个水平，按照Box-Behnken中心组合设计试验以吸附率为响应值。按照三因素三水平设计试验，验证各影响因素对吸附率影响的结果如表1所示，试验结果的方差分析如表2所示。

由表2结果可验证，该回归模型F检验极显著（P<0.001），失拟检验不显著（P>0.05），其决定系数R2=0.9514，调整决定系数R2Adj=0.8889，表明此二次回归模型拟合性较好，响应值的变化95.14%与所选变量有关，回归方程能较好地描述各影响因素与响应值之间的关系。各影响因素中，吸附液pH和吸附流速的二次方对吸附率的影响极显著（P<0.01）。由F值大小可以看出，各影响因素对吸附率的影响顺序为：吸附流速>吸附pH>吸附液浓度。

数据分析与处理采用Design-Expert7.0软件处理和分析试验结果，根据回归分析，得出该模型因素实际值的二次回归方程为：

R1=-11.17-129.95A+29.5275B+98.34C+4.5AB-26.0AC-0.3BC+163.0A2-3.9925B2-41.07C2；对试验结果进行分析处理，验证最优吸附条件：吸附液浓度0.5mg/mL、吸附液pH值4、吸附流速（实验室1.0mL/min）；同时，工业生产中采用吸附液浓度0.5mg/mL、吸附液pH值4、可容忍的最低吸附流速，结论一致。

此外，工业生产中，对苹果渣的粗提溶液（即吸附液）进行取样，对样品浓缩、烘干、称重，计算粗提溶液浓度，通过浓缩或加水调节粗提溶液浓度0.4-0.5mg/mL；调节苹果渣的粗提溶液pH值（吸附液pH值）时采用食品级的柠檬酸或醋酸来实现。

表1D-101树脂吸附试验优化结果

表2D-101树脂吸附试验结果方差分析表

注：**表示极显著水平（P<0.01）

（2）发明人进一步研究乙醇洗脱液对根皮苷洗脱率，其中，洗脱工艺参数影响洗脱率的权重关系是：乙醇洗脱液pH>乙醇洗脱液浓度>洗脱温度。换言之，洗脱工艺参数影响洗脱率的权重关系由大到小依次是：乙醇洗脱液pH、乙醇洗脱液浓度、洗脱温度。

最优洗脱条件为：乙醇洗脱液浓度80%、洗脱液pH值7、洗脱温度70℃，洗脱率可达89.92%，适用于工业和实验室。

将乙醇洗脱液浓度、洗脱液pH值和洗脱温度作为动态吸附的3个考察因素，每个因素为3个水平，按照Box-Behnken中心组合设计试验以吸附率为响应值。按照三因素三水平设计试验，按照三因素三水平的试验设计，验证各影响因素对洗脱率影响的结果如表3所示，试验结果的方差分析如表4所示。

表3树脂洗脱试验优化结果

表4树脂洗脱试验结果方差分析表

注：*表示显著水平（P<0.05）；**表示极显著水平（P<0.01）

由表3结果可，该回归模型F检验极显著（P<0.001），失拟检验不显著（P>0.05），其决定系数R²=0.9968，调整决定系数R² _Adj=0.9874，表明此二次回归模型拟合性较好，响应值的变化99.68%与所选变量有关，回归方程能较好地描述各影响因素与响应值之间的关系。各影响因素中，洗脱液pH一次方和洗脱液pH二次方对洗脱率的影响显著（P<0.01）；洗脱液浓度二次方和洗脱液pH二次方对洗脱率影响极显著（P<0.01）。由F值大小可以看出，各影响因素对吸附率的影响顺序为：洗脱液pH>洗脱液浓度>洗脱温度。

R2=857.88750+20.83250A+45.93750B-1.80125C+0.0325AB-0.00375AC-0.01BC-0.13275A²-3.4B²+0.012C²；对试验结果进行分析处理，得出树脂洗脱的最佳操作条件为：乙醇浓度为79.05%，洗脱液pH为7.5，洗脱温度69.92℃，最大洗脱率可以达到90.63%。工业实际中，最优洗脱条件为：乙醇洗脱液浓度80%、洗脱液pH值7、洗脱温度70℃，洗脱率可达89.92%，与试验结论基本一致。此外，工业实际中，结合前述吸附工艺，洗脱采用pH值为7.0、体积浓度75%-90%的乙醇洗脱液在60-80℃进行洗脱、浓缩、干燥，就可得到纯度提高一个数量级的根皮苷粉。

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现,或不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。特别需要指出的是，上述所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明保护范围内。

Claims

1.一种苹果渣中根皮苷的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)粗提：将重量比为1：8-1:12的苹果渣和浸提乙醇溶液混合，浸提乙醇溶液体积比为50-70％，再在60-80℃恒温水浴锅中重复浸提、过滤，合并滤液，离心分离，得上清液为苹果渣的粗提溶液；

(2)吸附：对苹果渣的粗提溶液进行取样，对样品浓缩、烘干、称重，通过浓缩或加水调节粗提溶液浓度为0.4-0.5mg/mL，将苹果渣的粗提溶液作为吸附液，调节苹果渣的粗提溶液pH值为3.5-4.0后，采用D-101大孔吸附树脂对苹果渣的粗提溶液中的根皮苷进行树脂吸附；调节苹果渣的粗提溶液pH值时采用柠檬酸或醋酸；

(3)洗脱：采用pH值为7.0、体积浓度75％-90％的乙醇洗脱液进行洗脱，洗脱温度为65-75℃，最后浓缩、干燥，得纯化根皮苷粉。

2.根据权利要求1所述的苹果渣中根皮苷的分离纯化方法，其特征在于，在步骤(2)中，吸附工艺参数影响吸附率的权重关系是：吸附液流速>吸附液pH>吸附液浓度。

3.根据权利要求1所述的苹果渣中根皮苷的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)所述调节粗提溶液浓度为0.45mg/mL。

4.根据权利要求1所述的苹果渣中根皮苷的分离纯化方法，其特征在于，在步骤(3)中，洗脱工艺参数影响洗脱率的权重关系是：乙醇洗脱液pH>乙醇洗脱液浓度>洗脱温度。

5.根据权利要求1所述的苹果渣中根皮苷的分离纯化方法，其特征在于，在步骤(3)进行洗脱时，洗脱温度为70℃。