CN106038738B - 一种栘*属植物多酚提取物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
背景技术
栘是蔷薇科栘属植物的通称,有三个种:云南栘Docynia delavayi(Franch.)Schneid、栘Docynia indica(Wall.)Dcne.和长爪栘Docynia longiunguisQ.Luo et J.L.Liu,主要分布于云贵川等地,其中云南栘是当地有名的野生水果。
目前,对于栘属植物的研究开发还处于初级阶段,关于栘属植物的基础性研究还很不足,对其有效成分的研究很少,造成了较大的资源浪费。刘海霞等对传统的Folin-Ciocalteu比色法进行改良,建立了一种专属性强的栘多酚的测定方法,为栘属植物资源的综合利用和开发提供理论支持(栘属植物多酚的含量测定与比较[J].食品科学.2014,35(24):295~300)。刘刚等(云南栘叶提取物片段抗氧化活性及成分分析[J].西南师范大学学报.2014,39(9):73~81)研究发现云南栘叶中含有较高活性的抗氧化成分,其中有四种化合物是典型的黄酮类化合物,为云南栘抗氧化功能的开发提供了理论依据。
发明内容
进一步的,所述提取物中根皮苷含量为87.49%~88.26%w/w。
优选的,所述提取物中多酚含量为91.34%w/w,根皮苷含量为87.49%w/w。
b、对D-101型大孔吸附树脂进行预处理;
进一步的,
a步骤超声提取条件为:超声功率800W,超声频率40KHz,用63%v/v乙醇水溶液按液料比20∶1,于65℃提取41min,提取2次;
b步骤预处理方法为:将大孔树脂D-101用体积分数为95%的乙醇水溶液密封浸泡24h后,用超纯水冲洗至无醇味;再用5%HCl溶液密封浸泡2~4h,用超纯水冲洗至中性;最后用2%NaOH溶液密封浸泡2~4h,用超纯水冲洗至中性,备用;
c步骤上样溶液质量浓度为25mg/mL,洗脱剂为50%v/v乙醇水溶液,洗脱体积为1~8BV,洗脱流速为3mL/min。
更进一步的,c步骤洗脱体积为4BV。
本发明还提供了所述提取物的制备方法。采用本发明提取条件能最大限度从栘属植物中提取得到多酚类物质,提取率高达18.54%;进一步采用本发明纯化方法对上述粗提物进行纯化后,多酚的含量由原来的(39.7±0.25)%提高到(92.33±0.99)%,提高了近2.3倍,多酚回收率高达92%,纯化效果明显。
因此,利用该工艺经一次纯化可得到高纯度的多酚和根皮苷。
药效实验表明,本发明栘多酚提取物可显著降低小鼠血清中的胆固醇TC、甘油三脂TG、高密度脂蛋白HDL-C、低密度脂蛋白LDL-C水平,表明其可有效防治机体中的血脂含量异常引起的肥胖、高脂血症、动脉粥样硬化和冠心病等脂质代谢异常疾病。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图8为不同体积洗脱液洗脱后所得纯化物中多酚与根皮苷含量图;
图9为不同浓度DT溶液对胰脂肪酶活力的影响图;
图10为不同浓度的DC溶液对胰脂肪酶活力的影响图;
图11为不同浓度DT溶液对胰蛋白酶活力的影响图;
图12为不同浓度的DC溶液对胰蛋白酶活力的影响图;
图13为不同浓度DT溶液对胰淀粉酶活力的影响图;
图14为不同浓度的DC溶液对胰淀粉酶活力的影响图。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品,通过购买市售产品获得。
准确称取研磨后的栘Docynia indica(Wall.)Dcne.叶1kg,超声功率800W,超声频率40KHz,用63%乙醇按液料比20∶1(mL/g),在65℃下提取41min,提取2次,合并提取液,浓缩,得粗提物;
对D-101型大孔吸附树脂进行预处理:将大孔树脂D-101用体积分数为95%的乙醇水溶液密封浸泡24h后,用超纯水冲洗至无醇味;再用5%HCl溶液密封浸泡2~4h,用超纯水冲洗至中性;最后用2%NaOH溶液密封浸泡2~4h,用超纯水冲洗至中性,备用;
取粗提物,上样于经过预处理的D-101型大孔吸附树脂,上样溶液质量浓度为25mg/mL,上样体积为10BV,上样流速为1mL/min。上样完成后,用50%v/v乙醇水溶液洗脱,洗脱体积为4BV(BV即树脂床体积),洗脱流速为3mL/min,收集洗脱液,浓缩冻干,即得栘属植物多酚纯化物4.3g,测定其中多酚含量为91.34%,根皮苷含量为87.49%。按所使用样品上样两种多酚含量计算,上样多酚质量为5.0g,所得纯化物中多酚为3.9g,多酚回收率为78%。
准确称取研磨后的栘Docynia indica(Wall.)Dcne.叶1kg,超声功率800W,超声频率40KHz,用63%乙醇按液料比20∶1(mL/g),在65℃下提取41min,提取2次,合并提取液,浓缩,得粗提物;
对D-101型大孔吸附树脂进行预处理:将大孔树脂D-101用体积分数为95%的乙醇水溶液密封浸泡24h后,用超纯水冲洗至无醇味;再用5%HCl溶液密封浸泡2~4h,用超纯水冲洗至中性;最后用2%NaOH溶液密封浸泡2~4h,用超纯水冲洗至中性,备用;
取粗提物,上样于经过预处理的D-101型大孔吸附树脂,上样溶液质量浓度为25mg/mL,上样体积为10BV,上样流速为1mL/min。上样完成后,用50%v/v乙醇水溶液洗脱,洗脱体积为8BV(BV即树脂床体积),洗脱流速为3mL/min,收集洗脱液,浓缩冻干,即得栘属植物多酚纯化物4.8g,其中,多酚含量为91.24%,根皮苷含量为88.26%。按所使用样品上样两种多酚含量计算,上样多酚质量为5.0g,所得纯化物中多酚为4.38g,多酚回收率为87.6%。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
1、材料、试剂与仪器
材料与试剂
根皮苷对照品(HPLC>98%,购于四川省成都市植标化纯有限公司);Folin-Ciocaileus试剂(FC试剂,购于上海如吉生物科技有限公司);乙醇(分析纯)、无水碳酸钠(分析纯)(购于成都科龙有限公司)。
仪器
仪器名称 | 型号或规格 | 生产厂家 |
紫外分光光度计 | UV-1700 | 日本岛津 |
真空冷冻干燥箱 | wizard 2.0 | 美国VirTis公司 |
恒温水浴锅 | B-260 | 上海亚荣生化仪器厂 |
超声波清洗仪 | KQ5200DE | 昆山超声仪器 |
电子天平 | BP211D | 德国赛多利斯 |
超声循环提取机 | CTXNW-5B | 北京弘祥隆生物技术股份有限公司 |
电热鼓风干燥箱 | DB-210SGB | 成都天宇试验设备有限责任公司 |
旋转蒸发仪 | Buchi R-3 | 上海岛通应用科技有限公司 |
循环水真空泵 | SHB-III | 郑州长城科工贸有限公司 |
2、检测方法
2.1样品处理
样品中多酚含量的测定:将提取液浓缩定容至50mL,稀释至一定浓度后取0.5mL,加入质量分数为10%的Na2CO3溶液2.5mL,再加FC显色剂0.5mL,在55℃条件下反应7min,在760nm测定吸光度,计算多酚含量。
根据下式计算多酚提取率:
栘依多酚提取率(%)=C×N×V×100/M
式中:C-样液中多酚含量(μg/mL);
V-样液的体积(mL);
N-稀释倍数;
3、实验方法
准确称取研磨后的栘叶5份,每份10.0g,按1∶20(g/mL)料液比分别加入蒸馏水、30%、50%、70%、95%乙醇,常温、800W、40KHz、超声提取30min,抽滤,收集滤液,浓缩蒸干得浸膏,再用70%乙醇稀释定容至50mL,放置备用。精密移取0.5mL样品溶液,测定溶液多酚含量,计算出多酚的提取率,每个处理重复三次,结果见图1。
准确称取研磨后的栘叶5份,每份10.0000g,按1∶20(g/mL)料液比加入70%乙醇,常温、800W、40KHz,分别超声提取15min、30min、45min、60min、75min,抽滤,收集滤液浓缩蒸干得浸膏,再用70%乙醇稀释定容至50mL,放置备用。精密移取0.5mL样品溶液,测定溶液多酚含量,计算出多酚的提取率,每个处理重复三次,结果见图2。
实验结果:在75min内,随着提取时间的增加,提取率先增加后趋于平缓。但35min后再延长时间则对多酚的提取率影响不大。
准确称取研磨后的栘叶6份,每份10.0000g,按1∶20(g/mL)料液比加入70%乙醇,分别在常温、35、45、55、65、75℃下,800W、40KHz,超声提取30min,抽滤,收集滤液浓缩蒸干得浸膏,再用70%乙醇稀释定容至50mL,放置备用。精密移取0.5mL样品溶液,测定溶液多酚含量,计算出多酚的提取率,每个处理重复三次,结果见图3。
实验结果:随着温度的增加,提取率总体呈现上升趋势,当温度达到65℃时,提取率达到最大,温度再上升,提取率有微弱的降低。
共设计16个试验组,分别采用本发明最佳超声提取条件(试验组16)及其他提取条件对栘叶进行提取,并对比其所得栘多酚提取率,检测方法同实验例1,结果见表1。本实验主要对比了乙醇浓度、提取时间、液料比三种因素对提取率的影响,其他提取条件参数为:各组均在800W,40KHz,65℃下超声提取2次。
实验结果:试验组16多酚提取率最高,达18.54%,其他试验组即使对乙醇浓度、提取时间或液料比作略微的调整都会导致多酚提取率降低。
以上实验表明,仅有在本发明最佳提取条件下,即:用63%乙醇水溶液按液料比20∶1,在65℃下提取41min,提取2次,才能得到最高的多酚提取率。
1、材料、试剂与仪器
D-101、AB-8、NKA-9型大孔吸附树脂成都市苌钲化玻有限公司(树脂基本理化性质见下表);Folin-Ciocaileus试剂(FC试剂)上海如吉生物科技有限公司;根皮苷标准品(HPLC>98%)四川省成都市植标化纯有限公司,批号:141027;其他试剂均为国产分析纯。
三种树脂理化性质对比
2、实验准备
2.2多酚含量的测定
2.3根皮苷含量的测定
HPLC法色谱条件:色谱柱为Agilent ZORBAX Extend-C18柱(4.6×250mm,5μm);流动相为A:C=乙腈:超纯水,线性梯度洗脱:0-10min,15%-50%A:85%-50%C;流速为1mL/min,柱温为25℃,进样量为6μL,检测波长为285nm。
以根皮苷为标准品,测定不同浓度根皮苷溶液的峰面积,并以根皮苷质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标进行线性拟合,得线性回归方程y=0.2147x+1.0425,R2=0.9999,用于检测洗脱液中根皮苷的质量浓度。
2.4大孔树脂预处理
分别将三种极性不同的大孔树脂D-101、AB-8、NKA-9用体积分数为95%的乙醇溶液密封浸泡24h后,用超纯水冲洗至无醇味;再用5%HC1溶液密封浸泡2~4h,用超纯水冲洗至中性;最后用2%NaOH溶液密封浸泡2~4h,用超纯水冲洗至中性,备用。
3、实验方法
3.1、静态吸附与解吸附
分别准确称取3种经预处理后的树脂3g,用滤纸吸干表面水分,放入100mL具塞磨口锥形瓶中,加入DT溶液5mL,常温下140r/min震荡24h进行静态吸附后,取上清液于760nm波长处测吸光度,计算其中多酚的质量浓度,按式(1)、(2)计算吸附量和吸附率;将充分吸附的树脂过滤,用蒸馏水冲洗后滤干,置于100mL具塞三角瓶中,加入30mL 70%乙醇,室温下在120r/min条件下振荡24h解析后,取上清液于760nm波长处测吸光度,计算其中多酚的质量浓度,按式(3)、(4)计算其解析率和多酚回收率,结果见表2。
式中:C0-DT溶液中多酚的质量浓度(mg/mL);
C1-吸附后上清液中多酚的质量浓度(mg/mL);
C2-解析后上清液中多酚的质量浓度(mg/mL);
V0-DT溶液的上样体积(mL);
V1-洗脱液的体积(mL);
M-树脂的质量(g)。
实验结果:三种树脂的吸附率相差不大,均在95%以上。D-101树脂的吸附率、吸附量与AB-8和NKA-9树脂的吸附率、吸附量差异极显著(P<0.01),AB-8树脂与NKA-9树脂的吸附率、吸附量差异不显著(P>0.05);而D-101树脂与AB-8树脂的解析率无显著差异(P>0.05),与NKA-9树脂的解析率差异显著(P<0.05)。其中,D-101树脂的吸附率、吸附量和解吸率分别为(96.60±0.29)%、(6.28±0.02)mg/g和(89.21±2.33)%,均大于AB-8和NKA-9树脂的吸附率、吸附量和解吸率。同时,经过D-101树脂纯化后的多酚回收率为(86.17±2.38)%,也大于AB-8和NKA-9树脂对多酚的回收率。
称取适量DT粉末,用超纯水溶解、配置成质量浓度不同的DT溶液(5、10、15、20、25、30mg/mL),冷藏备用。称取经过预处理的D-101型大孔吸附树脂湿法装柱(φ1.5cm×40cm),以一定的流速上样DT溶液至整个层析柱(上样量为10mL),然后静态吸附1h,使吸附平衡后,用蒸馏水洗至流出液为无色,再用50%乙醇溶液匀速进行洗脱,洗脱流速为2mL/min,并分别收集洗脱液200mL,浓缩后定容至50mL,测定浓缩液中多酚的质量浓度,按式(4)计算多酚的回收率,以回收率对上样溶液中多酚的质量浓度作图,绘制洗脱曲线,结果见图4。
实验结果:当上样溶液的质量浓度在5~25mg/mL之间时,多酚回收率总体呈现增长的趋势,但增长幅度不大,仅从(82.34±1.61)%增加到(93.14±1.05)%,当上样溶液质量浓度达到25mg/mL时,多酚回收率出现最大值,为(93.14±1.05)%。但随着上样溶液质量浓度的进一步增加,多酚回收率却随之下降,当上样溶液质量浓度为30mg/mL时,多酚回收率降至(79.36±1.27)%。
以上实验结果表明,上样溶液的最佳质量浓度为25mg/mL。
按上述最佳上样条件上样并吸附平衡后,通过动态实验,分别考察不同乙醇体积分数的洗脱剂、洗脱体积和洗脱流速对多酚纯化的影响。
3.3.1、乙醇体积分数的考察
质量浓度为25mg/mL的DT溶液上样10mL并吸附平衡后,以不同体积分数(0%、10%、30%、50%、70%、90%)的乙醇溶液进行洗脱,分别收集200mL洗脱液,计算多酚的回收率,并以多酚回收率对乙醇的体积分数作图,结果见图5。
实验结果:在洗脱剂中乙醇的体积分数为0~30%之间时,多酚回收率增加幅度很小,仅从(5.08±0.94)%增加到(10.04±1.33)%。随着乙醇体积分数的继续增加,多酚回收率迅速增加,在乙醇体积分数为50%时达到最大值,为(74.72±1.41)%。但随着乙醇体积分数的进一步增加,多酚回收率未见明显提升。
以上实验表明,洗脱剂乙醇溶液的最佳体积分数为50%。
3.3.2、洗脱流速对解析的影响
质量浓度为25mg/mL上样溶液上样10mL并吸附平衡后,体积分数为50%的乙醇溶液以不同洗脱流速(1mL/min、2mL/min、3mL/min、4mL/min)进行洗脱,分别收集200mL洗脱液,浓缩后定容至50mL,计算多酚回收率,并以多酚回收率对乙醇的洗脱流速作图,结果见图6。
实验结果:实验所选各洗脱流速下,多酚的回收率均差距不大,均在90%左右。但随着洗脱流速的增加,多酚回收率却呈现下降的趋势;若洗脱流速太慢,又会延长洗脱时间。
因此,综合考虑时间与成本等因素,选择3mL/min的洗脱流速作为最佳洗脱流速,此时多酚回收率为(89.92±1.92)%。
3.3.3、洗脱体积对解析的影响
质量浓度为25mg/mL上样溶液上样10mL并吸附平衡后,体积分数为50%的乙醇溶液以3mL/min的洗脱流速进行洗脱,分段(0.5BV)收集洗脱液,浓缩后定容至50mL,计算多酚的回收率,并以多酚回收率对洗脱体积作图,结果见图7。
实验结果:当洗脱体积由0.5BV增加到第1.5BV之间时,多酚回收率迅速从(3.13±1.25)%增加到(34.49±2.1)%。但随着洗脱体积的不断增加,多酚回收率却越来越小;当洗脱体积达到4BV时,多酚回收率为(0.98±0.96)%;洗脱体积继续增加到5BV,多酚回收率基本为0。
因此,综合考虑成本及洗脱效果等因素,确定其最佳洗脱体积为4BV,此时多酚总回收率为(94.15±1.35)%。
称取适量DT粉末,用蒸馏水溶解、配制成质量浓度为25mg/mL的DT溶液,上样10ml并吸附平衡后,体积分数为50%的乙醇溶液以3mL/min的洗脱流速进行洗脱,分别收集不同体积(1BV、2BV、3BV、4BV,BV即树脂床体积)洗脱液,浓缩冻干,得不同的纯化物,测定其多酚和根皮苷含量,结果见表3,图8。
表3不同体积洗脱液洗脱后所得纯化物中多酚与根皮苷含量
对洗脱第1到第4个BV的洗脱液进行浓缩冻干,测定其中多酚含量为91.34%,根皮苷含量为87.49%;合并第5到第8个BV的洗脱液,浓缩冻干测定其中多酚含量为91.24%,根皮苷含量为88.26%;合并第11到第14个BV的洗脱液,进行浓缩冻干,测定其中多酚含量为92.12%,根皮苷含量为89.21%。
经该工艺方法一次纯化后,多酚的含量由原来的(39.7±0.25)%提高到(92.33±0.99)%,提高了近2.3倍,多酚回收率高达92%,纯化效果明显。
因此,利用该工艺经一次纯化可得到高纯度的多酚和根皮苷。
1、材料与试剂
胰酶(USP级,上海晶纯生化科技股份有限公司生产)、大黄提取物(由实验室严伟老师提供)、盐酸、氢氧化钠、三羟甲基甲烷、橄榄油、阿拉伯胶、牛胆盐、茚三酮、甘氨酸、酪蛋白、乙酸钠、乙酸、氯化钙、硼砂、硼酸、氯化钠、三氯乙酸、95%乙醇、无水碳酸钠(均为分析纯,购于成都科龙有限公司)。
三羟甲基甲烷缓冲溶液:准确称取三羟甲基甲烷606.02mg,用45.7mL的0.1mol/L的HCl溶液溶解,用蒸馏水定容至100mL容量瓶中,摇匀,调节pH值至7.1,置于4℃冰箱中保存,备用。
橄榄油乳液:称取阿拉伯胶7.50001g,加入4mL橄榄油,缓慢加蒸馏水研磨,使溶液中90%的乳粒直径小于3μm,且其中最大乳粒直径不得超过10μm,转移并用蒸馏水定容至100mL容量瓶中。现配现用。
8%牛胆盐溶液:准确称取8.00004g牛胆盐,用温水溶解并定容于100mL容量瓶中,备用。
0.1mol/L氢氧化钠溶液:准确称取0.40009g氢氧化钠于50mL烧杯中,加入30mL蒸馏水溶解,待溶液冷却后,转移至100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度。
0.1mol/L HC1溶液:准确吸取4.15mL浓盐酸溶液至500mL容量瓶中,加入蒸馏水定容至刻度。
胰酶溶液:精密称定0.10006g胰酶放置于乳钵中,加入少量冷至5℃以下的三羟甲基甲烷缓冲溶液,研磨均匀,转移至50mL容量瓶中,用缓冲液定容,得2.012mg/mL的胰酶溶液,备用。
大黄溶液:准确称取5.00003g大黄提取物,加入蒸馏水溶解并定容于50mL容量瓶中,备用。
2、实验方法
3、实验结果
3.1不同浓度DT溶液对胰脂肪酶的抑制作用,结果见表4、图9。
表4不同浓度DT溶液对胰脂肪酶活力的影响
实验结果:胰酶中原脂肪酶活力为(1932.17±208.04)/g;当加入不同浓度的DT溶液时,胰脂肪酶的活力均有所下降,说明DT对脂肪酶具有抑制作用。当DT溶液浓度在2.5~20mg/mL时,随着溶液浓度的增大,其抑制率明显呈增加趋势,抑制率从(31.50±1.19)%增加至(52.08±6.25)%,当DT溶液浓度为20mg/mL时,抑制率达到最大值,为(52.08±6.25)%,之后随DT溶液浓度的增加,抑制率反而开始下降,最终趋于稳定,抑制率值为30%左右。
3.2不同浓度DC溶液对胰脂肪酶的抑制作用,结果见表5、图10。
表5不同浓度的DC溶液对胰脂肪酶活力的影响
实验结果:胰酶中脂肪酶活力为(1932.17±208.04)/g;当加入不同浓度的DC溶液时,胰脂肪酶的活力均有所下降,说明DC对脂肪酶具有抑制作用。当DC溶液浓度在1.25~40μg/mL时,随着溶液浓度的增大,抑制率可从(36.92±3.95)%增加至(89.66±2.59)%,当DC溶液浓度在20μg/mL时,抑制率达到最大值,之后随浓度的增大开始下降,说明DC浓度对脂肪酶的抑制并无明显的量效关系。
100mg/mL的大黄溶液与5mg/mL的DT溶液对脂肪酶的抑制作用相当,抑制率为大约为37%;1.25μg/mL的DC溶液对脂肪酶的抑制率为(69.83±2.99)%,明显优于大黄溶液。这表明栘多酚对胰脂肪酶具有很好的抑制作用。
3.3不同浓度DT溶液对胰蛋白酶的抑制,结果见表6、图11。
表6不同浓度DT溶液对胰蛋白酶活力的影响
实验结果:胰酶中蛋白酶活力为(0.224±0.001)mg/min.g;不同浓度的DT溶液对胰蛋白酶均有抑制作用,当DT溶液浓度在2.5~5mg/mL时,抑制率有明显的增加,抑制率从(31.22±1.21)%增加至(40.00±1.52)%,当DT溶液浓度继续增加时,抑制率有缓慢下降的趋势,当DT溶液浓度增加至10mg/mL,抑制率为(35.00±0.91)%,后随着溶液浓度的增加,抑制率基本保持不变。
3.4不同浓度DC溶液对胰蛋白酶的抑制,结果见表7、图12。
表7不同浓度的DC溶液对胰蛋白酶活力的影响
实验结果:胰酶中蛋白酶活力为(0.224±0.001)mg/min.g;不同浓度的DC溶液对胰蛋白酶的抑制率不同,当DC溶液浓度在1.25~20μg/mL时,随着溶液浓度的增大,抑制率从(46.22±1.87)%增加至(82.54±0.16)%,当DC溶液浓度在20μg/mL时,抑制率达到最大值,为(82.54±0.16)%,之后随浓度的增大对胰蛋白酶的抑制反而开始下降,当其浓度为160μg/mL时,抑制率为(56.85±3.97)%。
通过对DT溶液与DC溶液对胰蛋白酶的抑制作用比较可知(见3.3、3.4实验结果),DT溶液对胰蛋白酶活力的影响明显优于DC溶液,说明随着栘多酚纯度的增加,对胰蛋白酶的抑制作用逐渐增强,但其抑制率并不与栘多酚浓度呈正向相关。
与阳性对照组大黄溶液(100mg/mL)相比,DT溶液对胰蛋白酶的抑制作用较差,20μg/mL的DC溶液对胰蛋白酶的抑制作用较高,但其浓度远远低于大黄溶液,即DC溶液对胰蛋白酶的抑制作用更佳。
3.5不同浓度DT溶液对胰淀粉酶的抑制,结果见表8、图13。
表8不同浓度DT溶液对胰淀粉酶活力的影响
实验结果:胰酶中原淀粉酶活力为(42.57±0.18)mg/min.g;当加入不同浓度的DT溶液时,胰淀粉酶的活力均有所下降,说明DT对淀粉酶具有抑制作用。当DT溶液浓度在2.5~10mg/mL时,随着溶液浓度的增大,抑制率从(31.50±1.19)%增加至(42.33±1.45)%,之后随浓度增加抑制率开始下降,最后趋于稳定。
3.6不同浓度DC溶液对胰淀粉酶的抑制,结果见表9、图14。
表9不同浓度的DC溶液对胰淀粉酶活力的影响
实验结果:胰酶中淀粉酶活力为(0.224±0.001)mg/min·g;不同浓度的DT溶液对胰淀粉酶的抑制率不同,当DC溶液浓度在1.25~40μg/mL时,随着溶液浓度的增大,抑制率明显呈增加趋势,其抑制率可从(31.48±0.42)%增加至(56.35±1.27)%,当DC溶液浓度在40μg/mL时,抑制率达到最大值,为(56.35±1.27)%,之后随溶液浓度的增大抑制率开始下降,最后趋于稳定。
与阳性对照大黄溶液(100mg/mL)相比,DT溶液对淀粉酶的抑制作用相当,DC溶液对淀粉酶有较强的抑制作用。
以上实验结果表明:栘多酚对胰脂肪酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶都具有良好的抑制作用,尤其是纯化后的栘多酚在低剂量情况下(微克级)也具有很好的抑制胰酶活性的作用,说明栘多酚可以通过对减少人体食物中的脂肪、蛋白质、糖类的消化吸收,达到降低血糖、血脂和防治肥胖等的作用。
1、材料、试剂与仪器
1.1材料
实验动物:SPF级昆明系小鼠,体重:18~22g,购于四川省成都市成都达硕生物科技有限公司,动物合格证号:SCXK(川)2013-24。
小鼠基础饲料:购于四川省成都市成都达硕生物科技有限公司。
小鼠高脂饲料:80%小鼠基础饲料、10%猪油、10%蛋黄。
1.2药物与试剂配制
0.5%(CMC-Na)的配制:称取5.00018g羧甲基纤维素钠(成都市科龙化工试剂厂生产)至烧杯中,加蒸馏水加热使溶解,冷却至室温后,转移于1000mL容量瓶中,加入蒸馏水定容至刻度。
阳性对照药物混悬液的配制:称取胶囊(批号:国药准字20103180,重庆华森制药有限公司生产)中的粉末0.60023g,用0.5%的羧甲基纤维素钠配制成浓度6mg/mL的奥利司他混悬液,灌胃剂量为60mg/kg·bw。
2、实验方法
2.1造模及分组
实验将48只昆明系小鼠(雌雄各半,体重为18~22g)每只一笼饲养于湿度为64%RH,温度为27℃的适宜的动物观察室内,给小鼠投食基础饲料,使其适应环境,3d后,随机分为6组:空白对照组、阳性对照组、模型对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组8只小鼠。其中空白对照组喂食小鼠普通饲料,其余5组喂食高脂饲料,按每只每天10g的进食量投食,自由饮水。每隔三天称重一次,并对数据进行分析,直至实验组和空白对照组体重有显著差异,造模成功。
2.2给药方法
小鼠喂食2周(14d)高脂饲料后,体重明显增加,与空白组有显著性差异,说明造模成功。从第15d开始灌胃实验药物和阳性药物进行抗肥胖实验。
称量每只小鼠体重,确定已建立小鼠单纯性肥胖模型。每只小鼠仍按造模期一样喂食,每天定量投食饲料。空白对照组每天投食之前先灌胃0.2mL的0.5%羧甲基纤维素钠溶液;阳性对照组小鼠灌胃人日服剂量10倍的奥利司他60mg/kg.bw(即每千克体重给药60mg);低、中、高剂量组分别按300、500、750mg/kg·bw的量灌胃DC混悬液。
2.3实验小鼠的指标测定
20天后,禁食12h,称量各组小鼠体重,断尾采血。将所取的各小组小鼠血液,3000r/min离心9min,取出血清,用全自动生化分析仪检测各血清中的甘油三酯(TG)、胆固醇(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)浓度。
2.4统计与分析
实验数据用spss17.0软件处理,组间比较用方差分析,多重比较用最小显著差数(least significant difference,LSD)法。
3、实验结果
注:与空白组比较,#p≤0.05差异显著;##p<0.01;差异极显著。
与模型组比较,*p≤0.05,差异显著;**p<0.01,差异极显著。
与阳性对照组比较,Δp≤0.05,差异显著;ΔΔp<0.01,差异极显著。
实验结果:小鼠给药20天后,与模型组小鼠比较其余各组小鼠的各项指标均有降低。其中低剂量组的胆固醇与模型组表现出显著差异(p≤0.05),中、高剂量组、阳性对照组的胆固醇较模型组有极显著差异(p<0.01);高剂量组和阳性对照组的甘油三酯较模型组有极显著差异(p<0.01),中剂量组的与模型组有显著差异(p≤0.05);低、中、高剂量组和阳性对照组的高密度脂蛋白与模型组的有极显著差异(p<0.01)。高剂量组与阳性对照组的各项生化指标差异不大。
Claims (7)
2.如权利要求1所述的应用,其特征是:所述多酚提取物中多酚含量为91.24%~91.34%w/w。
3.如权利要求1所述的应用,其特征是:所述提取物中多酚含量为91.34%w/w,根皮苷含量为87.49%w/w。
6.如权利要求1所述的应用,其特征是:
a步骤超声提取条件为:超声功率800W,超声频率40KHz,用63%v/v乙醇水溶液按液料比20:1,料液比的单位为mL/g,于65℃提取41min,提取2次;
b步骤预处理方法为:将大孔树脂D-101用体积分数为95%的乙醇水溶液密封浸泡24h后,用超纯水冲洗至无醇味;再用5%HCl溶液密封浸泡2~4h,用超纯水冲洗至中性;最后用2%NaOH溶液密封浸泡2~4h,用超纯水冲洗至中性,备用;
c步骤上样溶液质量浓度为25mg/mL,洗脱剂为50%v/v乙醇水溶液,洗脱体积为1~8BV,洗脱流速为3mL/min。
7.如权利要求6所述的应用,其特征是:c步骤洗脱体积为4BV。
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