CN109876022B - 黑木耳降血脂活性部位及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种黑木耳降血脂活性部位及其制备方法和应用，黑木耳通过本发明提供的制备方法得到了对脂肪酶具有体外抑制作用的活性部位，且通过动物实验表明，本发明提供的活性部位具有降血脂的作用，该活性部位经过测定三萜成分为15.6‑35.9%，多酚类成分为28.4‑53.6%，其中三萜类成分与多酚类的重量比为1:（2.2‑2.9）时活性较高。该黑木耳活性部位能用于制备降血脂药物，具有良好的开发应用前景。本发明还公开了该黑木耳降血脂活性部位的主成分范围，便于后期开发应用时，进行质量标准提升与控制。

Description

黑木耳降血脂活性部位及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种具有降血脂活性的中药提取物，具体地说涉及黑木耳中降血脂活性部位的制备方法及其应用。

背景技术

高脂血症是指血中胆固醇和/或甘油三酯过高或高密度脂蛋白胆固醇过低，现代医学常称之为血脂异常，也常称为高脂蛋白血症。高血脂及脂质代谢障碍是造成动脉粥样硬化的主要危险因素，由此引起的心脑血管疾病严重危害人类健康，有时还可导致高血压、糖尿病、冠心病等疾病，引起肾功能衰竭等。随着生活水平的不断提高,饮食结构的改变,高血脂症已呈高发病趋势，由高脂血症引发的动脉硬化、冠心病、脑梗塞等内科慢性疾病对人类健康造成很大威胁。

目前用于治疗高血脂症的化学类药物因其起效快且疗效肯定而受到大家的青睐,常用的降脂药有五类：他汀类、贝特类、烟酸类、树脂类、胆固醇吸收抑制剂，此外还有一些其他药物。其中，他汀类药物市场占有率最高。但是以上化学类药物多数存在价格较高、毒副反应明显以及停药后容易反弹的缺点；因此，寻求新的药源已经成为医学界的研究热点之一。

而天然的降血脂生物活性物质历经多年的验证，其活性、疗效正越来越多的受到人们的重视，随着国内外研究学者对这些降血脂生物活性物质研究的不断深入,明确主要成分的结构特性，阐述其主要的作用机理，对于进一步开发出一种疗效突出、特异性强、毒副作用小的新型降血脂药物有着重要的意义。

发明内容

本发明旨在对黑木耳降血脂作用进行研究，进而发现黑木耳降血脂作用的活性部位，对黑木耳降血脂活性部位的制备方法进行优化，得到具有较好降血脂活性部位，并对该降血脂活性部位的主要大类成分进行了测定。

本发明提供了一种黑木耳降血脂活性部位，其特征在于，以重量计，该活性部位总三萜含量为15.6-35.9％，总多酚含量为28.4-53.6％，三萜类成分与多酚类的重量比为1:(1.5-2.9)。

进一步的，以重量计，该活性部位总三萜含量为16.7-21.1％，总多酚含量为46.4-53.6％，三萜类成分与多酚类的重量比为1:(2.2-2.9)。

本发明还提供了一种包含该活性部位在制备降血脂药物中的应用。

本发明还提供了一种黑木耳降血脂活性部位的制备方法，包含以下步骤：

(1)酶解：取黑木耳50度烘干后粉碎，加入复合酶溶液，在40度下酶解4h，酶解结束后加热灭活复合酶；

(2)提取：将上述酶解后产物加入提取溶液回流提取3～5次，过滤，合并滤液，浓缩，得到浓缩浸膏。

(3)萃取：将上述浓缩浸膏加水混悬后，用有机溶剂采用超声波辅助萃取3～5次，超声功率：300-500W，超声温度：20-50℃，超声时间：20-30min，合并有机溶剂层，浓缩后得到萃取部位浓缩浸膏。

(4)纯化：大孔树脂柱层析，将上述萃取部位浓缩浸膏用1:1～1:2的纯水溶解后，进行大孔树脂吸附，然后先用3～5倍柱体积的纯水洗脱除去水溶性杂质；再用1～3倍柱体积的体积分数为20～30％的乙醇水溶液洗脱除杂；最后用3～5倍柱体积的体积分数为40～80％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为40～80％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得黑木耳降血脂活性部位。

具体的，酶解步骤中复合酶为蛋白酶、纤维素酶和果胶酶中任意一种或三种混合物。

具体的，加入蛋白酶用量为每克黑木耳干粉4000U，纤维素酶用量为每克黑木耳干粉900U，果胶酶用量为每克黑木耳干粉100U。

进一步的，提取步骤为将上述酶解后产物加入乙醇水溶液超声提取，超声频率为300-800KHz，,超声温度为30-90度，超声提取时间为1-4h，后分离提取液，过滤，合并滤液，浓缩，得到浓缩浸膏。

优选的，提取步骤中的提取溶液为60％～85％乙醇水溶液，用量为生药重量体积比1.5～3倍量，加热回流时间为2～4小时，浸膏浓缩至无醇味。

优选的，提取步骤中的提取溶液为70％乙醇水溶液。

优选的，萃取步骤中水的用量为浸膏的2～3倍量，萃取用有机溶剂用量与水等体积；萃取步骤中有机溶剂为乙酸乙酯或正丁醇。

具体的，纯化步骤中大孔树脂柱型号为DH-101、AB-8或DM-130。

优选的，纯化步骤中采用4倍柱体积量的体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱，收集体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得黑木耳降血脂活性部位。

进一步的，纯化步骤为聚酰胺柱层析，将上述萃取部位浓缩浸膏用1:1～1:2的纯水溶解后，进行吸附，然后用3～5倍柱体积的体积分数为60-70％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为60-70％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得黑木耳降血脂活性部位。

进一步的，在纯化步骤之后，加入进一步的纯化，将洗脱部位除醇浓缩至原体积的5-20％，得到浓缩液，加入浓缩液3-4倍体积的水搅拌均匀后静置沉淀，滤过或者离心得沉淀物，沉淀物干燥后得到黑木耳降血脂活性部位。

黑木耳具有提高免疫力、抗血栓、抗辐射、抗溃疡、清胃涤肠、延缓衰老、抗菌和降脂降压等活性，且属于药食同源，其毒性低、安全性高，资源易获取。多酚类化合物,具有预防动脉粥样硬化和改善脂质代谢的作用，其降脂机制主要包括抑制脂解酶上调低密度脂蛋白受体及增加粪便脂质排泄等。三萜类化合物不仅能靠自身免疫力降低血清中的血脂水平，还能通过提高体内抗氧化能力来降低血脂。

本发明的有益效果为：

1.本发明的制备工艺能有效地提高有效成分的含量，得到的黑木耳有效组分化学成分明确，在药理研究上更易于阐明其作用效果，在生产中更易于药物的质量控制。

2.本发明提供的黑木耳有效组分对脂肪酶具有体外抑制作用，且通过动物实验表明，本发明提供的黑木耳有效组分具有降血脂的作用。

3.本发明发现黑木耳有效部位中总三萜和总多酚在一定比例下的效果显著提高。

具体实施方式

如前所述，本发明旨在提供一种黑木耳中降血脂活性部位的制备方法、含量测定方法及其应用。以下将结合实施例的内容进行具体描述。

特别需要指出的是，针对本发明所做出的类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料药或辅料，以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：

一种黑木耳降血脂活性部位，以重量计，该活性部位总三萜含量为15.6-35.9％，总多酚含量为28.4-53.6％，三萜类成分与多酚类的重量比为1:(1.5-2.9)。

一种包含该活性部位在制备降血脂药物中的应用。

一种黑木耳降血脂活性部位的制备方法，包含以下步骤：

(1)酶解：取黑木耳50g,于50度烘干后粉碎，加入蛋白酶用量为每克黑木耳干粉4000U，纤维素酶用量为每克黑木耳干粉900U，果胶酶用量为每克黑木耳干粉100U的复合酶溶液，在40度下酶解4h，酶解结束后加热灭活复合酶；

(2)提取：将上述酶解后产物加入提取溶液为60％乙醇水溶液，用量为生药重量体积比3倍量，加热回流时间为4小时，提取溶液回流提取3次，过滤，合并滤液，浓缩，得到浓缩浸膏。

(3)萃取：将上述浓缩浸膏加水混悬后，用正丁醇采用超声波辅助萃取3次，超声功率：300W，超声温度：20℃，超声时间：20min，合并正丁醇层，浓缩后得到萃取部位浓缩浸膏。

(4)纯化：DH-101型大孔树脂柱层析，将上述萃取部位浓缩浸膏用1:2的纯水溶解后，进行大孔树脂吸附，然后先用3倍柱体积的纯水洗脱除去水溶性杂质；再用1倍柱体积的体积分数为20％的乙醇水溶液洗脱除杂；最后用3倍柱体积的体积分数为40％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为40％的乙醇水溶液洗脱部位。

得到黑木耳降血脂活性部位，其中总三萜含量为15.6％，总多酚含量为28.4％，三萜类成分与多酚类的重量比为1:1.8。

实施例2

一种黑木耳降血脂活性部位，以重量计，该活性部位总三萜含量为15.6-35.9％，总多酚含量为28.4-53.6％，三萜类成分与多酚类的重量比为1:(1.5-2.9)。

一种包含该活性部位在制备降血脂药物中的应用。

一种黑木耳降血脂活性部位的制备方法，包含以下步骤：

(1)酶解：取黑木耳50g,于50度烘干后粉碎，加入蛋白酶用量为每克黑木耳干粉4000U，纤维素酶用量为每克黑木耳干粉900U，果胶酶用量为每克黑木耳干粉100U的复合酶溶液，在40度下酶解4h，酶解结束后加热灭活复合酶；

(2)提取：上述酶解后产物加入70％乙醇水溶液超声提取，70％乙醇水溶液的用量为生药重量体积比3倍量，超声频率为300KHz，超声温度为50度，超声提取时间为4h，后分离提取液，过滤，合并滤液，浓缩，得到浓缩浸膏。

(3)萃取：将上述浓缩浸膏加水混悬后，用乙酸乙酯采用超声波辅助萃取3次，超声功率：300W，超声温度：20℃，超声时间：20min，合并乙酸乙酯层，浓缩后得到萃取部位浓缩浸膏。

(4)纯化：聚酰胺柱层析，将上述萃取部位浓缩浸膏用1:2的纯水溶解后，进行吸附，然后用5倍柱体积的体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱部位。

(5)再纯化：将70％乙醇水溶液洗脱部位除醇浓缩至原体积的5％，得到浓缩液，加入浓缩液4倍体积的水搅拌均匀后静置沉淀，沉淀物干燥后得到黑木耳降血脂活性部位。

得到的黑木耳降血脂活性部位，其中总三萜含量为35.6％，总多酚含量为53.6％，三萜类成分与多酚类的重量比为1:1.5。

实施例3

一种黑木耳降血脂活性部位，以重量计，该活性部位总三萜含量为16.7-21.1％，总多酚含量为46.4-53.6％，三萜类成分与多酚类的重量比为1:(2.2-2.9)。

一种包含该活性部位在制备降血脂药物中的应用。

一种黑木耳降血脂活性部位的制备方法，包含以下步骤：

(1)酶解：取黑木耳50g,于50度烘干后粉碎，加入蛋白酶用量为每克黑木耳干粉4000U，纤维素酶用量为每克黑木耳干粉900U，果胶酶用量为每克黑木耳干粉100U的复合酶溶液，在40度下酶解4h，酶解结束后加热灭活复合酶；

(2)提取：将上述酶解后产物加入提取溶液为70％乙醇水溶液，用量为生药重量体积比5倍量，加热回流时间为4小时，提取溶液回流提取3次，过滤，合并滤液，浓缩，得到浓缩浸膏。

(3)萃取：将上述浓缩浸膏加水混悬后，用乙酸乙酯采用超声波辅助萃取3次，超声功率：300W，超声温度：20℃，超声时间：20min，合并乙酸乙酯层，浓缩后得到萃取部位浓缩浸膏。

(4)纯化：聚酰胺柱层析，将上述萃取部位浓缩浸膏用1:1的纯水溶解后，进行吸附，然后用3倍柱体积的体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得黑木耳降血脂活性部位。

得到黑木耳降血脂活性部位，其中总三萜含量为16.7％，总多酚含量为48.3％，三萜类成分与多酚类的重量比为1:2.9。

实施例4

一种黑木耳降血脂活性部位，以重量计，该活性部位总三萜含量为16.7-21.1％，总多酚含量为46.4-53.6％，三萜类成分与多酚类的重量比为1:(2.2-2.9)。

一种包含该活性部位在制备降血脂药物中的应用。

一种黑木耳降血脂活性部位的制备方法，包含以下步骤：

(1)酶解：取黑木耳50g,于50度烘干后粉碎，加入蛋白酶用量为每克黑木耳干粉4000U，纤维素酶用量为每克黑木耳干粉900U，果胶酶用量为每克黑木耳干粉100U的复合酶溶液，在40度下酶解4h，酶解结束后加热灭活复合酶；

(2)提取：将上述酶解后产物加入提取溶液为70％乙醇水溶液，用量为生药重量体积比8倍量，加热回流时间为4小时，提取溶液回流提取3次，过滤，合并滤液，浓缩，得到浓缩浸膏。

(3)萃取：将上述浓缩浸膏加水混悬后，用乙酸乙酯采用超声波辅助萃取3次，超声功率：300W，超声温度：20℃，超声时间：20min，合并乙酸乙酯层，浓缩后得到萃取部位浓缩浸膏。

(4)纯化：DM-130大孔树脂柱层析，将上述萃取部位浓缩浸膏用1:1纯水溶解后，进行大孔树脂吸附，然后先用5倍柱体积的纯水洗脱除去水溶性杂质；再用3倍柱体积的体积分数为30％的乙醇水溶液洗脱除杂；最后用5倍柱体积的体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得黑木耳降血脂活性部位。

得到黑木耳降血脂活性部位，其中总三萜含量为21.1％，总多酚含量为46.4％，三萜类成分与多酚类的重量比为1:2.2。

实施例5：

一种黑木耳降血脂活性部位，以重量计，该活性部位总三萜含量为15.6-35.9％，总多酚含量为28.4-53.6％，三萜类成分与多酚类的重量比为1:(1.5-2.9)。

一种包含该活性部位在制备降血脂药物中的应用。

一种黑木耳降血脂活性部位的制备方法，包含以下步骤：

(1)酶解：取黑木耳50g,于50度烘干后粉碎，加入蛋白酶用量为每克黑木耳干粉4000U，纤维素酶用量为每克黑木耳干粉900U，果胶酶用量为每克黑木耳干粉100U的复合酶溶液，在40度下酶解4h，酶解结束后加热灭活复合酶；

(2)提取：将上述酶解后产物加入3倍量的85％乙醇水溶液超声提取，超声频率为800KHz，超声温度为90度，超声提取时间为4h，后分离提取液，过滤，合并滤液，浓缩，得到浓缩浸膏。

(3)萃取：将上述浓缩浸膏加水混悬后，用正丁醇采用超声波辅助萃取3次，超声功率：300W，超声温度：20℃，超声时间：20min，合并正丁醇层，浓缩后得到萃取部位浓缩浸膏。

(4)纯化：AB-8型大孔树脂柱层析，将上述萃取部位浓缩浸膏用1:2的纯水溶解后，进行大孔树脂吸附，然后先用3倍柱体积的纯水洗脱除去水溶性杂质；再用1倍柱体积的体积分数为20％的乙醇水溶液洗脱除杂；最后用3倍柱体积的体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱部位。

得到黑木耳降血脂活性部位，其中总三萜含量为20.6％，总多酚含量为40.3％，三萜类成分与多酚类的重量比为1:2.0。

可见，上述提取物的制备方法，其工艺简单，该采用水或有机溶剂充分提取或萃取后进行除杂与纯化，易于操作，质量可控，易重现，得到的黑木耳降血脂活性部位中总三萜含量为15.6-35.9％，总多酚含量为28.4-53.6％，三萜类成分与多酚类的重量比为1:1.5-2.9。

黑木耳降血脂活性部位中总三萜及总多酚的含量测定

1.仪器与试剂

UV-300型紫外可见分光光度计；恒温水浴锅，电子分析天平，无水乙醇、异丙醇、正丁醇、福林酚、高氯酸、冰醋酸、香草醛皆为分析纯试剂，没食子酸、白桦脂醇为标准品，黑木耳降血脂活性部位(实施例1-5制备)。

2.总多酚含量测定

2.1标准曲线的制备

采用福林-酚比色法，标准品选用没食子酸，通过标准曲线方程计算多酚含量。没食子酸标准液浓度0.1mg/mL。分别移取0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50mL没食子酸标准液置于25mL具塞试管中，分别加入福林酚试剂1mL，摇匀，分别加入12％碳酸钠溶液2mL，用去离子水定容至25mL，摇匀。室温下避光反应1h，于765nm波长下测定吸光度，用去离子水调节零点，以没食子酸标准溶液的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标制作标准曲线。

2.2样品吸光度的测定

分别将制备例1-5中样品用去离子水充分溶解，并定容至100mL容量瓶。量取待测样品1mL加入福林酚试剂1mL，同上方法测定吸光度，通过标准曲线计算多酚含量。

3总三萜含量测定

3.1标准曲线的制备

采用白桦脂醇为标准品，5％香草醛-冰醋酸和高氯酸为显色剂，通过紫外分光光度法测定三萜类化合物含量。

(1)白桦脂醇标准溶液制备：精确称取白桦脂醇5mg，用无水乙醇充分溶解，再用无水乙醇定容至10mL容量瓶中，制成0.5mg/mL白桦脂醇溶液待用。

(2)5％香草醛-冰醋酸的制备：精确称取10g香草醛粉末，用冰醋酸溶解并定容至200mL容量瓶中。放入冰箱待用。

分别吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL的白桦脂醇标准溶液于25mL具塞试管中，水浴蒸干后分别加入5％香草醛-冰醋酸0.5mL，然后加入高氯酸0.8mL，于60℃水浴锅中加热15min后取出冷却，加冰醋酸定容至25mL，摇匀，以冰醋酸调节零点，测定吸光度。以白桦脂醇质量为横坐标，以吸光度为纵坐标制作标准曲线。

3.2样品吸光度测定

分别将制备例1-5中样品用冰醋酸充分溶解，并定容至10mL容量瓶，放入冰箱待用。量取待测样品0.1mL水浴蒸干后，加0.5mL 5％香草醛-冰醋酸，加0.8mL高氯酸，同上方法测定吸光度，通过曲线计算样品总三萜含量。

表1为上述各制备例中总多酚及总三萜含量及比例。

表1：制备例中总三萜及总多酚含量测定

黑木耳降血脂活性部位的活性检测

下面通过药效学实验来进一步说明其降血脂活性。

黑木耳活性部位对脂肪酶的抑制作用

1.药物、材料与方法

1.1药物

黑木耳降血脂活性部位(实施例1-5制备)

1.2材料

猪胰脂肪酶、4-硝基苯棕榈酸酯、阿拉伯树胶粉、奥利司他，sigma公司；

Tris，Amersco；异丙醇，脱氧胆酸钠，DMSO，盐酸；

酶标仪，molecular devices spectraMax M2e；

天平，Mettler Toledo AL104；

离心机，Eppendorf 5424。

1.3方法：

(1)试剂配制

药品配制：称取样品溶于DMSO中配制成200mg/mL母液，-20℃保存。缓冲液配制：50mM Tris-HCl溶液，含0.1％阿拉伯树胶粉和0.2％脱氧胆酸钠，pH值为10.0。

酶溶液配制：用缓冲液配制1.2mg/mL酶，混匀，5000rpm离心5分钟，取上清，分装，-70℃保存。底物溶液配制：称取0.302g pNPP，加入32mL异丙醇，超生乳化，即为25mMpNPP，分装，4℃保存。

(2)脂肪酶抑制剂活性测定

在96孔细胞培养板中，加入198μL缓冲液，再加入9.6μL的50mg/mL样品母液，混匀，使其初浓度为2.4mg/mL。再用缓冲液进行倍比稀释使其浓度为0.15mg/mL。脂肪酶用缓冲液稀释120倍，底物用缓冲液稀释50倍。以上稀释后的试剂待用。取96孔细胞培养板，按照表1中不同的分组分别加入缓冲液、抑制剂和脂肪酶，37℃孵育10分钟。脂肪酶和抑制剂预孵育10分钟后，每孔加入100μL底物，37℃反应60分钟。在酶标仪OD405nm处测量各孔的吸光值，表1为脂肪酶抑制剂筛选反应体系(200μL)。

A：为未加抑制剂的酶活；a：为未加抑制剂的空白对照(未加酶)；

B：为加抑制剂的酶活；b：为加抑制剂的空白对照(未加酶)。

2.结果处理及分析

脂肪酶抑制率的计算公式：Inhibition rate％＝[1-(B-b)/(A-a)]×100。

表2为不同制备例中样品对脂肪酶抑制作用的测试结果，通过表2可知，不同制备例中样品均可不同程度的抑制脂肪酶活性。

表2不同制备例中样品对脂肪酶抑制作用的测试结果。

其中^**为与对照组比较，P<0.01。

通过表2可以得出，通过本发明提供的制备方法得到的黑木耳活性部位对脂肪酶具有体外抑制作用。

实施例1-5制备所得黑木耳活性部位对高脂血症大鼠的降血脂作用：

1.药物、材料与方法

1.1药物

黑木耳降血脂活性部位(实施例1-5制备)

1.2材料

辛伐他汀，Sigma；

天平，Mettler Toledo；

离心机，Eppendorf 5424；

酶标仪，molecular devices spectraMax M2e；

总胆固醇(TC)测定试剂盒、甘油三酯(TG)测定试剂盒、低密度脂蛋白(LDL-C)测定试剂盒及高密度脂蛋白(HDL-C)测定试剂盒；丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒。

动物：雄性SD大鼠，体重(50±10)g。

饲料：基础营养饲料和高脂营养饲料(含3％胆固醇、0.2％胆酸、0.5％丙硫氧嘧啶、10％猪油)。

1.3方法：

(1)造模

SD大鼠120只，随机选取15只作为空白对照组。空白对照组给予基础营养饲料，其余105只给予高脂营养饲料，第1周每日给予15g/d高脂营养饲料，自由饮水。造模期间，每周末次给予高脂营养饲料16h后取血检测TC或TG的水平。6周后大鼠的TC或TG水平超过正常组大鼠(P<0.05)为造模成功。

(2)分组与给药

造模成功的大鼠随机分为模型组、阳性对照(辛伐他汀)组、黑木耳降血脂活性部位(实施例1-5制备)，每组15只。给药组与模型组继续给食高脂饲料，空白对照组投喂基础饲料。给药剂量分别为：辛伐他汀10mg/kg、黑木耳降血脂活性部位(实施例1-5制备)65mg/kg，用纯净水配成混悬液，灌胃给药体积为10mL/kg，连续6周。给药时间为每日16:00。模型组灌胃给予等体积的纯净水，空白对照组不作任何处理。

(3)检测方法

每周用电子天平测体重(精确到0.1g)一次，每周检测TC或TG的水平以大致观察大鼠的造模及治疗情况。对给药6周的动物处死前(处死前12h空腹)，称体重，用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，取肝脏组织并称取湿重。打开胸腔，自心脏直接采血4～6mL，肝素抗凝，分离血清，按照试剂盒要求的测定条件和程序测定血清总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)含量。

2.结果处理及分析

2.1对大鼠血脂的影响

实验结果参见表3，表3为不同制备例中样品对大鼠血脂的影响的检测结果，通过表3可知，不同制备例中样品可不同程度的降低肥胖大鼠的总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白含量，具有一定的降血脂作用。

表3不同制备例中样品对大鼠血脂的影响(n＝15)

其中^**为与空白组比较，P<0.01；^#为与模型组比较，P<0.05，^##为与模型组比较P<0.01。

通过表3可以看出，与空白对照组相比，模型组大鼠的TG、TC、LDL-C的含量明显升高，HDL-C的含量明显降低(P<0.01)，说明造模成功；与模型组相比，黑木耳降血脂活性部位(实施例1-5制备)可不同程度的降低肥胖大鼠的TG、TC、LDL-C含量(P<0.05)；黑木耳降血脂活性部位(实施例3和4制备)还可升高HDL-C的含量(P<0.05)，通过表3的检测结果比较，发现实施例3和4降低肥胖大鼠的TG、TC、LDL-C含量和升高HDL-C含量的效果最好，而实施例3和4制备所得黑木耳降血脂活性部位的总三萜与总多酚的含量比例分别为2.9和2.2，表明黑木耳降血脂活性部位(实施例1-5制备)具有一定的降血脂作用，可用于高脂血症，且在总三萜与总多酚的含量比例分别为2.2-2.9的范围内，活性最强。

需要指出的是，上述包含黑木耳有效部位的药物组合物，可根据药剂学领域的常用辅料，根据剂型和实际情况进行恰当选择，例如常见的辅料有淀粉、低取代羟丙基纤维素、微粉硅胶、硬脂酸镁、淀粉浆、蔗糖、糊精、羧甲基淀粉钠、滑石粉、聚山梨酯、聚乙二醇、注射用大豆磷脂和注射用甘油等；制备所需药物的各种剂型时，可以按照药剂学领域的常规生产方法制备，如将该化合物与一种或多种载体混合，然后制成相应的剂型。作为优选，所述药物制剂的剂型包括注射剂、片剂、栓剂、软膏剂、凝胶剂、丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂与合剂等等。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种黑木耳降血脂活性部位的制备方法，其特征在于，以重量计，该活性部位总三萜含量为16.7%，总多酚含量为48.3%，三萜类成分与多酚类的重量比为1:2.9；

包含以下步骤：

（1）酶解：取黑木耳50g，于50度烘干后粉碎，加入蛋白酶用量为每克黑木耳干粉4000U，纤维素酶用量为每克黑木耳干粉900U，果胶酶用量为每克黑木耳干粉100U的复合酶溶液，在40度下酶解4h，酶解结束后加热灭活复合酶；

（2）提取：将上述酶解后产物加入提取溶液为70%乙醇水溶液，用量为生药重量体积比5倍量，加热回流时间为4小时，提取溶液回流提取3次，过滤，合并滤液，浓缩，得到浓缩浸膏；

（3）萃取：将上述浓缩浸膏加水混悬后，用乙酸乙酯采用超声波辅助萃取3次，超声功率：300W，超声温度：20℃，超声时间：20min，合并乙酸乙酯层，浓缩后得到萃取部位浓缩浸膏；

（4）纯化：聚酰胺柱层析，将上述萃取部位浓缩浸膏用1:1的纯水溶解后，进行吸附，然后用3倍柱体积的体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得黑木耳降血脂活性部位。

2.一种黑木耳降血脂活性部位的制备方法，其特征在于，以重量计，该活性部位总三萜含量为21.1%，总多酚含量为46.4%，三萜类成分与多酚类的重量比为1:2.2；

包含以下步骤：

（1）酶解：取黑木耳50g，于50度烘干后粉碎，加入蛋白酶用量为每克黑木耳干粉4000U，纤维素酶用量为每克黑木耳干粉900U，果胶酶用量为每克黑木耳干粉100U的复合酶溶液，在40度下酶解4h，酶解结束后加热灭活复合酶；

（2）提取：将上述酶解后产物加入提取溶液为70%乙醇水溶液，用量为生药重量体积比8倍量，加热回流时间为4小时，提取溶液回流提取3次，过滤，合并滤液，浓缩，得到浓缩浸膏；

（3）萃取：将上述浓缩浸膏加水混悬后，用乙酸乙酯采用超声波辅助萃取3次，超声功率：300W，超声温度：20℃，超声时间：20min，合并乙酸乙酯层，浓缩后得到萃取部位浓缩浸膏；

（4）纯化：DM-130大孔树脂柱层析，将上述萃取部位浓缩浸膏用1:1纯水溶解后，进行大孔树脂吸附，然后先用5倍柱体积的纯水洗脱除去水溶性杂质；再用3倍柱体积的体积分数为30％的乙醇水溶液洗脱除杂；最后用5倍柱体积的体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得黑木耳降血脂活性部位。