CN102138945B

CN102138945B - 一种自银杏叶中提取高黄酮含量活性物质的方法

Info

Publication number: CN102138945B
Application number: CN 201110081794
Authority: CN
Inventors: 叶明�; 倪林
Original assignee: Hefei University of Technology
Current assignee: Hefei University of Technology
Priority date: 2011-04-01
Filing date: 2011-04-01
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2031-04-01
Also published as: CN102138945A

Abstract

一种自银杏叶中提取高黄酮含量活性物质的方法，将银杏叶粉末置于pH值8-10的氢氧化钙溶液中微波处理1-3min，银杏叶粉末质量与氢氧化钙溶液体积的料液比为1∶3-5；微波处理后加入等体积的65-95vt％乙醇溶液，软包装密封后于200-300MPa下处理15-25min得到预处理液；预处理液用浓度65-95vt％乙醇溶液于pH8-11条件下加热回流至少两次，合并滤液并调滤液pH至7，再离心分离得到上清液；向上清液中加入0.3-0.5wt％维生素E搅拌均匀得到上液样；上液样用AB-8型大孔吸附树脂吸附-解析，分离得到解析液，解析液经浓缩和真空冷冻干燥得到银杏叶活性物质。活性物质得率高达25％，其中黄酮含量高达22％。

Description

一种自银杏叶中提取高黄酮含量活性物质的方法

一、技术领域

本发明型涉及从银杏叶中提取高黄酮含量活性物质的的方法。

二、背景技术

银杏(Ginkgo bilobal)又名白果树，属裸子植物，树龄可达千年以上，是古代二叠纪孑遗植物，有植物界中“活化石”之称，是现存种子植物中最古老的孑遗植物。银杏树具有适应性强、繁殖能力强等多方面的特点。

银杏果的医疗及营养保健作用早已被人们所知，而对银杏叶的开发利用要晚得多。德国和法国是世界上最早从事银杏叶产品开发的国家，他们在七十年代中期，首先开发了治疗心血管病的银杏叶片，此后，其他国家相继致力于银杏制品的开发。

近代科学表明，银杏叶的化学成分十分复杂，迄今为止已发现170多种化合物。其中最重要的活性成分为黄酮类化合物和萜内酯类，其他的还包括有机酸类、氨基酸、糖类、醇类、微量元素及维生素、叶绿素、生物碱类等。现代研究表明银杏叶活性物质中黄酮类含量最高，为2.5％～5.91％。银杏叶提取物有清除氧自由基、拮抗血小板活化因子引起的血小板聚集和血栓形成作用，具有降血脂、增强中枢神经系统功能、调节神经递质和激素水平、改善血液流变状态、抗炎、抗过敏作用。具有促进视网膜神经细胞增生，显著升高视网膜神经细胞的膜电位，对培养的视网膜神经细胞有良好的保护作用。随着对银杏叶提取物的深入研究，其各种制剂已广泛应用于心、脑血管疾病。

活性物质中总黄酮的含量直接决定着银杏叶的药用价值，要想获得较多黄酮，关键是改进银杏叶的提取工艺。只有提高活性物质的得率，才能为下一步获取精制银杏黄酮铺平道路。传统的提取方法主要有水浸提法，醇提取法等，采用传统的生产工艺很难获得较高质量的银杏叶提取物。

三、发明内容

本发明针对现有银杏叶提取工艺得率不高、杂质较多等方面的缺陷，旨在提供一种新的提取方法，所要解决的技术问题是提高黄酮在活性物质中的含量。

本发明的技术方案以银杏叶为原料，包括粉碎、预处理、提取、分离和纯化，与现有技术的区别是粉碎后的银杏叶经预处理后再进行提取，所述的预处理是银杏叶粉末置于pH值8-10的氢氧化钙溶液中微波处理1-3min，银杏叶粉末(质量)与碱液(体积)的料液比为1∶3-5，微波处理结束后加入等体积浓度65-95vt％(体积百分比，下同)乙醇溶液，软包装并密封后于200-300MPa下处理15-25min得到预处理液；卸压、拆封后对预处理液用浓度65-95vt％乙醇溶液于pH8-11条件下加热回流提取至少两次，过滤分离后合并滤液，调滤液pH值至7，再离心分离，得到上清液，向上清液中加入0.3-0.5wt％(质量百分比，下同)抗氧化剂维生素E，搅拌均匀后得到上液样；所述的纯化就是对上液样用AB-8型大孔吸附树脂振荡吸附分离纯化，即将AB-8型大孔吸附树脂浸泡于上液样中振荡吸附不少于12h，吸附后分离，将树脂浸入60-70vt％乙醇溶液中振荡解析不少于1d，分离得到解析液。

解析液减压脱溶回收乙醇，进一步浓缩成稠膏，真空冷冻干燥得到银杏叶高黄酮含量的活性物质。

具体操作步骤如下：

(1)银杏叶粉末制备：

将干银杏叶粉碎，过60目筛得到银杏叶粉末。

(2)银杏叶的预处理：

取粉碎好的银杏叶粉末，加入一定量的pH为8-10的氢氧化钙溶液，置于微波功率800W下处理1.0-3.0min。将微波处理后的银杏叶悬浮液置于聚乙烯袋中并加入等体积65-95vt％乙醇溶液，密封。将密封好的聚乙烯袋子置于200-300Mpa高压下处理15-25min得到预处理液后取出，静置，备用。

(3)银杏叶活性物质的提取：

向银杏叶预处理液加入65-95vt％乙醇溶液，液料比(乙醇溶液体积mL：银杏叶粉末质量g)为20∶1，调pH为8-11，回流60min，静置，过滤，残渣加入65-95vt％乙醇溶液，调pH值8-11，加热回流提取60min，静置，过滤，合并滤液，滤液即为粗提液。

(4)离心处理：

调节粗提液的pH至7，10000r/min离心10-20min得到上清液；

(5)上清液处理：

上清液中添加0.3-0.5wt％(以上清液质量计)抗氧化剂维生素E，得上液样。

(6)AB-8型大孔吸附树脂吸附：

1)AB-8型大孔吸附树脂预处理：称取10-20g AB-8型大孔吸附树脂用4-5倍75vt％的乙醇溶液浸泡树脂30min，倒出乙醇，水洗至无味，再用4-5倍4-8wt％碱和酸分别处理30min。碱洗后水洗至pH 8-9；酸洗后水洗至pH 5-6。最后，将处理好的树脂装入容器，用蒸馏水浸泡，得到预处理AB-8型大孔吸附树脂。

2)振荡吸附：

移取银杏叶上液样置于装有AB-8型大孔树脂的锥形瓶中，盖上瓶塞，室温下不时振荡吸附12h。

3)振荡解吸：

已吸附树脂用50mL65vt％的乙醇溶液浸泡震荡1d，分离收集解吸液。

(7)浓缩并干燥：

解吸液减压浓缩成稠膏，回收乙醇，真空冷冻干燥得银杏叶活性物质成品。

(8)黄酮含量的测定：

采用芦丁络合物分光光度法测定提取液中总黄酮含量。精确称取干燥至恒重的芦丁(标准对照品)40mg置于100mL容量瓶中，加入75vt％乙醇溶液定容至100mL，即得芦丁标准溶液。分别取5、10、15、20、25mL芦丁标准溶液用蒸馏水稀释至50mL，准确吸取5mL于10mL试管中，各加入10wt％亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6min；加10wt％硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，放置6min；加4wt％氢氧化钠溶液4mL，再用蒸馏水定容至刻度，摇匀，放置15min。用蒸馏水作空白，在510nm处测定吸光度。

准确称取干燥的活性物质100mg置于100mL容量瓶中，在最优条件下测定银杏叶提取物吸光度，代入标准曲线方程中求出滤液中黄酮的浓度，然后计算出活性物质中总黄酮的含量。

以银杏叶计，活性物质提取率可达25％，活性物质中黄酮含量达22％。

本发明运用碱性条件下微波-高压联合辅助提取并结合非极性AB-8型大孔树脂静态饱和吸附-解析法从银杏叶中提取活性物质的方法，微波促进了银杏叶有效活性物质从细胞中溶出，高压促使细胞壁破裂，细胞内的提取物(活性物质)可以迅速溢出，与提取剂本体(氢氧化钙溶液)混合，从而大大提高提取率。提取的银杏叶活性物质中黄酮含量较高，本发明银杏叶中总活性物质提取率高达25％，活性物质中黄酮含量高达22％；AB-8型大孔吸附树脂对黄酮有良好的吸附-解析效果，吸附率可达80％以上，且成本较低，易再生。

四、附图说明

图1是芦丁标准曲线图。

五、具体实施方式

实施例1：

(1)银杏叶粉末制备：

将干银杏叶粉碎，过60目筛得到银杏叶粉末。

(2)银杏叶的预处理：

取粉碎的银杏叶粉末5g，加入20mL pH为8的氢氧化钙溶液，置于微波功率800W下处理3.0min。将微波处理后的银杏叶悬浮液置于聚乙烯袋中并加入等体积90vt％乙醇溶液，密封。将密封好的聚乙烯袋子置于300Mpa高压下处理15min得到预处理液后取出，静置，备用。

(3)银杏叶活性物质的提取：

向银杏叶预处理液中加入75vt％乙醇溶液，液料比(体积mL∶质量g)为20∶1，调pH为8，加热回流60min，静置，过滤，残渣在上述条件下回流提取60min，静置，过滤，合并滤液，滤液即为粗提液。

(4)离心处理：

调节粗提液的pH值至7，10000r/min离心15min得到上清液。

(5)上清液处理：

上层清液中添加0.3wt％抗氧化剂维生素E，得上液样。

(6)AB-8型大孔吸附树脂吸附：

1)AB-8型大孔吸附树脂预处理：称取10.000gAB-8型大孔吸附树脂用4倍75vt％的乙醇溶液浸泡树脂30min，倒出乙醇，水洗至无味，再用4倍6wt％碱和酸分别处理30min。碱洗后水洗至pH 8；酸洗后水洗至pH 5。最后，将处理好的树脂装入容器，用蒸馏水浸泡，得到预处理AB-8型大孔吸附树脂。

2)振荡吸附：

移取上液样置于装有AB-8型大孔树脂的锥形瓶中，盖上瓶塞，室温下不时振荡吸附12h；

3)振荡解吸：

已吸附树脂用50mL65vt％的乙醇溶液浸泡静置振荡1d，收集解吸液。

(7)、黄酮含量的测定：

采用芦丁络合物分光光度法测定提取液中总黄酮含量。

(8)、浓缩并干燥：

解吸液减压浓缩成稠膏，回收乙醇，真空冷冻干燥得银杏叶活性物质1.1991g。活性物质中黄酮含量19.5％。

实施例2：

(1)银杏叶粉末制备：

将干银杏叶粉碎，过60目筛得到银杏叶粉末。

(2)银杏叶的预处理：

取粉碎的银杏叶粉末5g，加入20mL pH为9的氢氧化钙溶液，置于微波功率800W下处理3.0min。将微波处理后的银杏叶悬浮液置于聚乙烯袋中并加入等体积90vt％乙醇溶液，密封。将密封好的聚乙烯袋子置于300Mpa高压下处理15min得到预处理液后取出，静置，备用。

(3)银杏叶活性物质的提取：

(4)离心处理：

调节粗提液的pH值至7，10000r/min离心15min得到上清液。

(5)上清液处理：

上层清液中添加0.3wt％抗氧化剂维生素E，得上液样。

(6)AB-8型大孔吸附树脂吸附：

2)振荡吸附：

3)振荡解吸：

(7)、黄酮含量的测定：

采用芦丁络合物分光光度法测定提取液中总黄酮含量。

(8)、浓缩并干燥：

解吸液减压浓缩成稠膏，回收乙醇，真空冷冻干燥得银杏叶活性物质1.2506g。活性物质中黄酮含量22.1％。

实施例3：

(1)银杏叶粉末制备：

将干银杏叶粉碎，过60目筛得到银杏叶粉末。

(2)银杏叶的预处理：

取粉碎的银杏叶粉末5g，加入20mL pH为10的氢氧化钙溶液，置于微波功率800W下处理3.0min。将微波处理后的银杏叶悬浮液置于聚乙烯袋中并加入等体积90vt％乙醇溶液，密封。将密封好的聚乙烯袋子置于300Mpa高压下处理15min得到预处理液后取出，静置，备用。

(3)银杏叶活性物质的提取：

(4)离心处理：

调节粗提液的pH值至7，10000r/min离心15min得到上清液。

(5)上清液处理：

上层清液中添加0.3wt％抗氧化剂维生素E，得上液样。

(6)AB-8型大孔吸附树脂吸附：

2)振荡吸附：

3)振荡解吸：

(7)、黄酮含量的测定：

采用芦丁络合物分光光度法测定提取液中总黄酮含量。

(8)、浓缩并干燥：

解吸液减压浓缩成稠膏，回收乙醇，真空冷冻干燥得银杏叶活性物质1.2101g。活性物质中黄酮含量20.1％。

实施案例4：

(1)银杏叶粉末制备：

将干银杏叶粉碎，过60目筛得到银杏叶粉末。

(2)银杏叶的预处理：

(3)银杏叶活性物质的提取：

(4)离心处理：

调节粗提液的pH值至7，10000r/min离心15min得到上清液。

(5)上清液处理：

上层清液中添加0.3wt％抗氧化剂维生素E，得上液样。

(6)AB-8型大孔吸附树脂吸附：

2)振荡吸附：

3)振荡解吸：

(7)、黄酮含量的测定：

采用芦丁络合物分光光度法测定提取液中总黄酮含量。

(8)、浓缩并干燥：

解吸液减压浓缩成稠膏，回收乙醇，真空冷冻干燥得银杏叶活性物质1.1241g。活性物质中黄酮含量18.7％。

Claims

1.一种自银杏叶中提取高黄酮含量活性物质的方法，以银杏叶为原料，包括粉碎、预处理、提取、分离和纯化，其特征在于：将银杏叶粉末置于pH值8-10的氢氧化钙溶液中微波处理1-3min，银杏叶粉末质量与氢氧化钙溶液体积的料液比按g：mL计为1:3-5；微波处理后加入等体积的体积百分比65-95%乙醇溶液，软包装密封后于200-300MPa下处理15-25min得到预处理液；预处理液用体积百分比65-95%乙醇溶液于pH8-11条件下加热回流至少两次，合并滤液并调滤液pH至7，再离心分离得到上清液；向上清液中加入重量百分比0.3-0.5%维生素E搅拌均匀得到上液样；上液样用AB-8型大孔吸附树脂振荡吸附不少于12小时，吸附后分离，将树脂置于体积百分比60-70%乙醇溶液中振荡解析不少于1天，分离得到解析液，解析液减压浓缩成稠膏，将稠膏真空冷冻干燥。