CN111642701B - 一种能够抑制烤羊肉中杂环胺生成的杭白菊提取物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种能够抑制烤羊肉中杂环胺生成的杭白菊提取物及其应用，通过正交试验优化水浸提取工艺，及AB‑8大孔吸附树脂吸附纯化的优化试验，得到提取杭白菊提取物的最佳提取工艺，并将其作为易于储存再加工的添加剂加入到烤羊肉中，研究该杭白菊提取物对烤羊肉中常见的两种较多量的杂环胺的抑制效果。本发明所得杭白菊提取物具有和维生素C、维生素E同效力的抗氧化性能，其中对游离态与结合态的Harman、Norharman均具有抑制效果，对游离态与结合态的总杂环胺均具有抑制效果，试验表明，杭白菊提取物在1mg/g的添加量时抑制杂环胺效果最佳。

Description

一种能够抑制烤羊肉中杂环胺生成的杭白菊提取物及其应用
技术领域
本发明涉及一种能够抑制烤羊肉中杂环胺生成的杭白菊提取物及其应用，属于食品加工技术领域。
背景技术
热加工肉制品是人类饮食不可或缺的优质蛋白质来源，但蛋白质、氨基酸热解会产生有毒有害化合物杂环胺，杂环胺类化合物从化学结构上可以分为极性的氨基咪唑氮杂芳烃和非极性的氨基咔琳两大类，其中Harman(1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚)、Norharman(9H-吡啶并[3,4-b]吲哚)属于非极性杂环胺。目前对于肉制品中杂环胺的研究，是以烧烤油炸为主，根据以往研究观察，Harman与Norharman在牛、鸡、猪、羊中生成具有很大的产量优势，其生成机理与氨基酸、蛋白质、糖和肌酸有着直接关系，这也就是诸多种类杂环胺为肉制品中热加工的一大重要热产物，而在其他蛋白比较低的高温制品中产生比较罕见，加工工艺中的温度与时间是影响肉制品杂环胺的重要因素，Arvidsson等人利用含有与牛肉中类似前提物肌酸、肌肽、氨基酸与葡萄糖为模拟体系，推测了杂环胺生成与加热时间呈指数关系。
根据杂环胺在肉中的存在状态，分为游离态杂环胺和结合态杂环胺，其中蛋白质结合态杂环胺占很大比例，目前对于杂环胺的抑制剂的研究有很多，主要包括抗氧化物，而在抑制剂的筛选过程中，通常是以游离的杂环胺为考虑对象，往往忽视了结合态杂环胺，可结合态杂环胺在代谢中被人体消化代谢吸收时可以产生细胞或者器官毒性，虽然说Harman与Norharman本身无环外氨基，因此无致癌性，但它可以促进其他有毒有害的杂环胺发挥致癌性以及毒性。就目前研究成果来看，对于肉制品中这两种具有绝对优势产量的杂环胺，通常使用含硫化合物、黄酮多酚、维生素来抑制这两种杂环胺，也就意味着含有抗氧化供能物质的植物的利用与开发是一大研究趋势，一些已经证明含有抑制杂环胺作用的香辛料，如大蒜、洋葱、辣椒和花椒等，还有一些水果副产物如葡萄籽提取物与苹果皮等。
肉加工产品讲究风味性、食用性，那么对于抗氧化物质的研究和筛选，就一定要考虑它的可食用性以及风味性，杭白菊茶是中国的传统文化茶，饮用杭白菊茶中不仅蕴含着中国的传统文化，杭白菊茶中富含大量的功能性物质，比如酚酸黄酮，可进一步加入保健品，在中国具有非常大的市场。通过将杭白菊热浸提与进一步的精制使黄酮物质得到富集，得到一种具有杭白菊香味的抗氧化成分，并使之成为良好的食品添加剂应用到肉产品中去，在高温加工过程中产生，不仅可以产生风味物质，而且促使肉产品更大的保健功能，例如降低杂环胺生成的效果，同微波加速提取与利用碱溶酸沉法将蛋白沉降提取，非蛋白成分得到分离，于是游离态杂环胺和蛋白结合态杂环胺可以同步进行提取液的净化，具有非常高的时效性，这种提取方法特别适用于富含蛋白质的食物中杂环胺的提取。
发明内容
本发明的目的是一种能够抑制烤羊肉中杂环胺生成的杭白菊提取物及其应用，通过正交及优化试验得到提取杭白菊提取物的最佳提取工艺，并将其作为易于储存再加工的添加剂加入到烤羊肉中，研究该杭白菊提取物对烤羊肉中常见的两种杂环胺的抑制效果。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种杭白菊提取物的提取方法，包括以下步骤：
(1)水浸提取：
称取杭白菊粉末，加入超纯水中，在80℃下浸提13min，过滤浓缩后，得到杭白菊提取液，对提取液进行黄酮含量的测定；
(2)树脂吸附：
将所得的杭白菊提取液通过AB-8大孔吸附树脂进行吸附后，选用乙醇作为洗脱剂进行洗脱，得到含醇黄酮液；
(3)干燥：
将所得的含醇黄酮液通过旋转蒸发除醇后，冷冻干燥，得到杭白菊提取物。
所述步骤(1)中杭白菊粉末的质量g/超纯水的体积mL＝1:70。
所述步骤(2)中AB-8大孔吸附树脂吸附杭白菊提取液的具体工艺条件为：杭白菊提取液的上样量为：杭白菊提取液中黄酮量mg/树脂量g＝3.97，吸附时间为3.5h，洗脱剂乙醇的体积分数为60％，洗脱剂乙醇的洗脱体积为2.5个柱体积。
所述的杭白菊提取物在抑制烤羊肉中杂环胺生成的应用。
所述的应用，包括以下步骤：
(1)添加杭白菊提取物的羊肉制作：将羊腿肉剔除可见脂肪与筋膜，机械破碎后，与杭白菊提取物混合腌制成肉泥；将肉泥装入直径6.5cm×厚1cm的饼状肉制品模型，4℃下腌渍5h后脱模，脱模后的肉制品置于温度为230℃的烤箱，烤制时间为15min，烤制后取出放置至室温，粉碎，制成烤肉粉末；
(2)羊肉制品中杂环胺的提取：称取烤肉粉末，加入氢氧化钠甲醇溶液，均质后微波加速提取，室温放凉后以4500r/min的速度离心10min，得上清液1，向上清液1中加入3M盐酸至pH为3±0.02，以4500r/min的速度离心10min，得上清液2与蛋白沉淀，上清液2进行游离态杂环胺的提取；向蛋白沉淀中加入盐酸进行酸解，冷却过滤后得上清液3，进行结合态杂环胺的提取；
(3)提取液的净化：取上清液2与上清液3，分别通过固相萃取法进行净化，其中净化包括活化、洗杂、洗脱三个步骤；
(4)杂环胺的测定：采用超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法进行测定。
所述步骤(2)烤肉粉末g/氢氧化钠甲醇溶液mL＝1:10；氢氧化钠甲醇溶液的浓度为1M。
所述步骤(2)均质的时间为1min，转速为13000rpm；微波加速提取的频率为2450MHz，提取时间为20s；离心的速度为4500r/min，时间为10min。
所述步骤(2)加入盐酸进行酸解时，盐酸的浓度为4M，体积为10mL，酸解的温度为110℃，时间为22h。
所述步骤(3)固相萃取法的具体步骤为：取上清液2与上清液3，分别上样于经6mL甲醇、6mL超纯水、6mL 0.1M盐酸活化好的固相萃取柱，然后用6mL 0.1M盐酸淋洗除去非极性杂质后抽真空1min、用6mL甲醇淋洗除去极性杂质后抽真空1min，用6mL氨水甲醇溶液洗脱得杂环胺最终提取液，置于氮吹装置于45℃条件下吹近干，用0.22μm有机滤膜过滤后，用于杂环胺的测定；其中氨水甲醇溶液中氨水与甲醇的体积比为1:19。
本发明的有益效果：
(1)本发明所述杭白菊水浸提取工艺属于快速提取，尽可能的保留提取物中黄酮的多元性，使简便的步骤具有更大应用空间以及生产潜能，且经过正交实验优化的工艺，使杭白菊黄酮提取物的得率提高。还采用大孔树脂对提取液进行纯化处理，其中大孔吸附树脂的上样量、洗脱剂的体积分数等条件优化可作为工业生产的参考，可用于大量制备杭白菊黄酮提取物，其中本发明杭白菊提取方法得到的杭白菊提取物中，总黄酮含量可达到68.6％。
(2)本发明在制备杭白菊黄酮提取物的过程中，所用溶剂为水或乙醇，溶剂利于回收利用，最终所得提取物的水溶性高，也易于溶解于乙醇水溶液中，整个提取净化过程高效无污染。
(3)本发明所得杭白菊黄酮提取物具有优良的性状，提取物为粉质状易于储藏，具有杭白菊的香味，具有和维生素C、维生素E同效力的抗氧化性，可以作为功能性食品添加剂，具有添加方便、无有机溶剂残留、无须加入化学辅佐试剂的特点。
(4)复杂体系(肉)的杂环胺提取是采用提取溶剂与考察基质的充分浸取萃取，通常采用均质、超声的方法促进萃取，但该方法耗时耗力。本发明采用微波加速提取，更加快捷高效，在均质化肉粉与提取溶剂利用微波条件下，提取剂中的极性甲醇吸收微波加速肉中的杂环胺与提取溶剂均一化，且提取液透明均一，离心后无残渣；使用碱溶酸沉法制取的蛋白，易于酸解释放蛋白结合态杂环胺，可以与游离的杂环胺同步于PCX固相萃取柱净化，具有时效性。
(5)本发明所述杭白菊提取物具有抑制烤羊肉中游离态杂环胺的效果，对于微量游离总杂环胺，其中最佳抑制的添加量在1mg/g。对于含量在100-300ng/g的结合态的两种杂环胺，随着杭白菊提取物的添加，抑制效果有逐渐增大趋势，综合微量游离态杂环胺与生成优势性结合态杂环胺的生成情况，认为0.2-1mg/g内添加杭白菊提取物对杂环胺有显著抑制效果，其中1mg/g对杂环胺抑制能力最强。
附图说明
图1为浸提时间对杭白菊黄酮提取率的影响曲线；
图2为浸提温度对杭白菊黄酮提取率的影响曲线；
图3为不同的料液比对杭白菊黄酮提取率的影响曲线；
图4为不同树脂量对杭白菊黄酮的吸附能力的影响曲线；
图5为树脂的吸附时间对黄酮吸附效果的影响曲线；
图6为不同浓度乙醇的洗脱液对树脂吸附黄酮的洗脱效果分析；
图7为洗脱液的加入量对树脂吸附黄酮的洗脱程度分析；
图8为杭白菊提取物的高效液相色谱图；
图9为杭白菊提取物与维生素C清除ABTS+自由基的能力分析；
图10为杭白菊提取物与维生素E清除DPPH*自由基的能力分析。
具体实施方式
实施例一、杭白菊黄酮的水浸提取工艺
(1)芦丁标准曲线的制作：取干燥至恒重的芦丁，用60％乙醇配制成浓度为0.2mg/mL的溶液，分别取0mL、2mL、4mL、6mL、8mL于50mL容量瓶中，然后分别加水定容至10mL，分别加入1.4mL亚硝酸钠(m/v，5％)及1.4mL硝酸铝(m/v，10％)，静置反应6min，再加入10mL氢氧化钠溶液(m/v，4％)，以蒸馏水定容至50mL，静置反应12min后，在510nm处测吸光度，得到标准曲线：y＝11.208x+0.0509，R2＝0.999，取样品溶液1mL进行测定，试剂空白为对照。标准曲线用以测定杭白菊提取物的黄酮含量。
(2)纯水浸提单因素试验以及正交分析：
在考察时间对黄酮提取的影响时，称取2.000g杭白菊粉末，加入120mL超纯水，80℃下分别浸提1min、5min、9min、13min、17min，由图1得出9min以后可以浸提充分；
在考察温度对黄酮提取的影响时，称取2.000g杭白菊粉末，加入120mL超纯水，选择13min浸提时间，分别在60℃、70℃、80℃、90℃、100℃下浸提，由图2得出80℃对总黄酮提取有最佳效果。
在考察料液比对黄酮提取的影响时，称取2.000g杭白菊粉末，选择13min浸提时间、80℃下，分别在料液比1:40、1:55、1:70、1:85、1:100(g/mL)下加水浸提，由图3得到1：70的料液比对总黄酮提取更佳。根据单因素实验结果设计正交试验如表1，最优参数组合为浸提时间为13min、浸提温度为80℃、浸提料液比为1:70时获得最大的黄酮得率，并在此工艺下获得提取率为9.93±0.03％。
实施例二、AB-8大孔吸附树脂吸附黄酮的条件优化
因未拆封的AB-8大孔吸附树脂中含有较多的防腐剂，所以在使用前需进行预处理，先在水中浸泡24h除去气泡，然后再用体积分数为95％的无水乙醇溶液冲洗除去醇溶杂质，再用蒸馏水洗至没有醇味。之后用5％的盐酸浸泡3小时后用蒸馏水冲至中性，再用5％的氢氧化钠溶液浸泡3小时后，用蒸馏水冲至中性，去除非极性杂质，将树脂浸泡在50％的乙醇溶液中备用。
(1)静态吸附试验确定实验条件
a.样品上样量的确定
将准确称取的1～10g(取整)AB-8大孔吸附树脂与10mL浓缩后的杭白菊提取液(3.43mg/mL)，于锥形瓶中进行室温吸附，振荡24h(震荡频率为220转/分钟)，静置后吸取上层液体进行黄酮含量测定，由表1可知随着树脂量的增加，吸附率得到提高，且在8g以后吸附率达到了90％以上，经过计算得到实际杭白菊黄酮与树脂的比例，可以作为上样量的依据，由图4可知上样一定量的提取液，8g树脂可以接近完全吸附，达到最佳吸附参数：黄酮量(mg)/树脂量(g)＝3.97。
表1不同树脂量对杭白菊提取液中黄酮吸附效果
Figure BDA0002591709620000051
b.大孔吸附树脂吸附时间的确定
准确称取8gAB-8大孔吸附树脂，按照最佳吸附参数(黄酮量mg：树脂量g为3.97)加入2mL 1.2mg/mL的杭白菊提取液，在室温静置，每30min吸取上层液体进行黄酮含量测定，由图5可知在吸附时间为3.5h时可以使树脂达到最佳吸附量，且多于此时间容易造成死吸附。
c.洗脱剂乙醇的体积分数的选择
准确称取10份AB-8型大孔吸附树脂各2g，按照最佳吸附时间与最佳上样量进行提取液的上样，充分吸附之后，将余液与树脂分离，将树脂晾干。量取10mL乙醇(体积分数分别为10％、20％、40％、50％、60％、70％、80％、90％)与上述晾干后的树脂分别混合后，在振荡器的作用下，每10分钟振摇20s(220r/min)，2h后分别吸取上层液体进行黄酮含量测定，由图6得知，用60％的乙醇洗脱可以将黄酮达到最佳洗脱效果。
(2)动态吸附试验
为确定乙醇的洗脱量，将大孔吸附树脂进行湿法装柱，柱直径2.5cm，柱高30cm，湿法装柱使树脂达到柱体积一半，按照静态吸附实验的最佳吸附比上样杭白菊提取液，吸附后再用60％的乙醇进行洗脱，每洗脱0.5BV(树脂体积)留样1mL，进行黄酮含量测定，图7显示随着洗脱的进行，洗脱液加入至2.5BV，可以将吸附的黄酮物质洗脱完全。
实施例三、杭白菊提取物的提取方法
结合实施例一与实施例二，得到杭白菊提取物的提取方法为：
(1)水浸提取：
称取2.000g杭白菊粉末，加入140mL超纯水中，在80℃下浸提13min，用中速滤纸过滤掉杭白菊粉渣，经真空浓缩后，得到杭白菊提取液，对提取液进行黄酮含量的测定。
(2)树脂吸附：
将所得的杭白菊提取液通过AB-8大孔吸附树脂进行吸附后，选用乙醇作为洗脱剂进行洗脱，得到含醇黄酮液；其中杭白菊提取液的上样量为：杭白菊提取液中黄酮量mg/树脂量g＝3.97，吸附时间为3.5h，洗脱剂乙醇的体积分数为60％，洗脱剂乙醇的洗脱体积为2.5个柱体积。
(3)干燥：
将所得的含醇黄酮液通过旋转蒸发除醇后冷冻干燥，得到杭白菊提取物。
实施例四、杭白菊提取物的黄酮含量与成分鉴定
(1)经本发明提取工艺处理后杭白菊提取物中黄酮含量的变化
称取经实施例三步骤(1)水浸提取后的提取液冷冻干燥成粉末，称取10mg，加入10mL超纯水溶解，进行黄酮含量的测定，测得黄酮含量为：1.678mg/mL；称取经实施例三步骤(2)树脂吸附后的提取液(含醇黄酮液)冷冻干燥成粉末，称取10mg，加入10mL超纯水溶解，进行黄酮含量的测定，测得黄酮含量为：3.552mg/mL，由此可知，本发明提取工艺对杭白菊中黄酮含量的富集具有较好的效果，其中大孔树脂处理后的黄酮富集量为水浸提取的2.12倍。(2)杭白菊提取物中黄酮种类与含量
将经本发明提取工艺处理后的杭白菊提取物用水溶解至0.4mg/mL，使用高效液相色谱仪配备二极管阵列检测器串联离子阱质谱仪对其进行定性。液相条件：色谱柱为Aglient Zorbax SB C18(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：乙腈(A)与0.1％甲酸水(B)；柱温：30℃；进样量10uL；流速0.4mL/min；梯度洗脱(A％)：0-10min：20-25％，10-20min：25％，20-40min：25-50％，40-47min：50-20％，47-55min：20％；DAD二极管阵列器检测波长：350nm，270nm。质谱条件：ESI+，全扫描范围为100～1000m/z；雾化气体为N2，喷雾压力为50psi；N2流速为10.0L/min；脱溶剂气N2温度为350℃。得到杭白菊提取物的高效液相色谱图，见图8，根据质谱仪所得到的一级质谱与定性离子碎片，对于出峰化合物，进行了定性与定量，见表2，计算得杭白菊提取物中黄酮含量为68.6％。
表2杭白菊提取物中黄酮种类与含量分析
Figure BDA0002591709620000071
实施例五、杭白菊提取物的抗氧化性鉴定
(1)杭白菊提取黄酮产物的抗氧化活性测定
将大孔吸附树脂洗脱得到的含醇黄酮液，经旋转蒸发除醇后冷冻干燥，进行抗氧化鉴定。包括以下步骤：
a.清除ABTS+自由基的能力：总抗氧化能力(T-AOC)测定
制作标准曲线：按照总抗氧化能力(T-AOC)测试盒*操作说明(测剂盒*为南京建成生物工程研究所)，吸取10mM的Trolox的标准液，用超纯水稀释成0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.8mM、1.0mM，制作标准曲线。以标准品Trolox清除ABTS+能力所对应的吸光度(OD)值为横坐标，以标准品浓度为纵坐标，绘制得标准曲线：y＝-3.3855x+3.265，R2＝0.994。经冷冻干燥样品复溶，分别稀释到4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL，测定其对ABTS+的清除效果，根据测定孔在405nm处的OD值，代入标准曲线计算Trolox当量(mmol/g)。
以同样的方法进行维生素C清除ABTS+的能力的测定。
由图9可知，提取物具有和维生素C相当的清除ABTS+的能力。
b.清除DPPH*自由基的能力：DPPH法
称取含醇黄酮液的冷冻干燥提取物，用95％乙醇配制成0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL、0.10mg/mL、0.50mg/mL的待测溶液。
准确吸取待测溶液0.5mL于试管中，分别向每管依次加入0.5mL的0.2mmol/L的DPPH溶液、3mL无水乙醇，在黑暗处反应30min后于517nm处测定吸光值(A1)；
准确吸取待测溶液0.5mL于试管中，分别向每管中加入3.5mL无水乙醇，在黑暗处反应30min后于517nm处测定吸光值(A2)；
向试管中加入0.5mL的0.2mmol/L的DPPH溶液、3.5mL无水乙醇，在黑暗处反应30min后于517nm处测定吸光值(A0)。
DPPH清除率计算公式：
Figure BDA0002591709620000081
A1：黄酮液与DPPH反应后的吸光；A2：黄酮液样品吸光，用乙醇代替DPPH；A0：DPPH吸光值，用乙醇代替样品。
以同样的方法进行维生素E清除DPPH*自由基的能力的测定。
由图10可知提取物具有和维生素E相当的清除DPPH*自由基的能力。
实施例六、杭白菊提取物对杂环胺的抑制
(1)添加杭白菊提取物的羊肉饼制作：将羊腿肉剔除可见脂肪与筋膜，机械破碎后，与杭白菊提取物在温度为4℃下，混合腌制5h；制成直径6.5cm×厚1cm的饼状肉制品模型，脱模后放置于温度为230℃的烤箱，烤制时间为15min，烤制后取出放置室温粉碎，制成烤肉粉末，待分析；其中杭白菊提取物的加入量分别为：0mg/g、0.2mg/g、0.4mg/g、0.6mg/g、0.8mg/g、1mg/g。
(2)羊肉制品中杂环胺的提取：称取1g烤肉粉末，加入10mL 1M氢氧化钠甲醇溶液，均质(转速为1.3万rpm，均质时间为1min)后，微波加速提取(微波频率为2450MHz，微波提取时间为20s)，室温放凉后离心(4500r/min，10min)，得上清液1，向上清液1中加入3M盐酸溶液至pH为3±0.02，沉淀蛋白质，离心(4500r/min，10min)得上清液2与蛋白沉淀，上清液2进行游离杂环胺的提取；向蛋白沉淀中加入10mL4M HCl，于110℃条件下酸解22h，冷却过滤后得上清液3，进行结合态杂环胺的提取。
(3)提取液的净化：取上清液2与上清液3，分别通过固相萃取法进行净化。净化包括活化、洗杂、洗脱三个步骤，其中活化步骤为：依次加入6mL甲醇、6mL超纯水、6mL 0.1M盐酸；洗杂步骤为：6mL 0.1M盐酸淋洗除去非极性杂质后抽真空1min、6mL甲醇淋洗除去极性杂质后抽真空1min，洗脱步骤为：6mL甲醇氨水溶液(其中氨水与甲醇的体积比为19：1)洗脱得杂环胺最终提取液，并置于电热氮吹装置于45℃条件下吹近干，用0.22μm有机滤膜过滤后，用于杂环胺的测定。
(4)杂环胺的测定：采用超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法(UPLC-MS/MS)测定。UPLC串联三重四极杆设备，液相部分由仪器自带的ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1μm×50mm，1.7μm颗粒大小)，本实验选取流动相为：乙腈(A)与10mM甲酸铵(B)，采取梯度洗脱，0-0.2min,10％B；0.2-1.0min,10-30％B；1.0-3.0min,30-60％B；3.0-3.5min,60-90％B；3.5-5min,90％B；进样量为1μL。质谱条件：采用电喷雾电离源(ESI)，ESI+模式；离子源温度为110℃；毛细管电压为0.5kV；脱溶剂温度为650℃；脱溶剂气流速为1000L/h，锥孔气，流速为50L/h，两种气体为纯度99.9％的氮气；碰撞气为纯度99.9％的氩气。定量采取外标法，数据获取来自Waters MassLynx software 4.1。
(5)杭白菊提取物对杂环胺的抑制率分析
杭白菊提取物对游离态杂环胺的抑制率分析如表3，添加杭白菊提取物在0.2mg/g有显著促进效果，0.4mg/g、0.6mg/g、0.8mg/g、1mg/g水平对Harman有抑制效果，其抑制率分别为：25.00％、72.22％、38.89％、83.33％，1mg/g添加量的抑制效果最好。对于Norharman，除0.6mg/g的添加量有轻微促进其生成，其余添加量均有抑制效果，0.2mg/g、0.4mg/g、0.8mg/g、1mg/g的添加水平对应的抑制率分别为：27.04％、54.72％、3.14％、47.80％，其中0.4mg/g的抑制效果最佳，1mg/g添加水平次之。对于总杂环胺的抑制效果：0.2-1mg/g添加量对于总杂环胺均有抑制效果，1mg/g达到最佳抑制效果54.36％。采用添加平均抑制率考察杭白菊提取物对Harman的抑制效果，0.2-1mg/g范围内添加对Harman平均抑制率为30.56％，对Norharman平均抑制率为25.79％，杭白菊提取物对Harman与Norharman的平均抑制率相当，总杂环胺的平均抑制率为26.67％。
杭白菊提取物对结合态杂环胺的抑制率分析如表4，添加杭白菊提取物在0.2mg/g，0.4mg/g、0.6mg/g、0.8mg/g、1mg/g水平对Harman有着显著抑制效果，其抑制率分别为：17.59％、12.15％、18.19％、33.13％、37.87％，对于Norharman，添加杭白菊提取物在0.2mg/g，0.4mg/g、0.6mg/g、0.8mg/g、1mg/g水平对其有显著抑制效果，其抑制率分别为：41.06％、36.21％、40.09％、53.18％、58.20％，随着杭白菊提取物添加，对两种杂环胺抑制效果均有增加的趋势，1mg/g添加量对Harman与Norharman抑制效果达到最好。对于总杂环胺的抑制效果：0.2-1mg/g添加量对于总杂环胺均有抑制效果，在1mg/g添加量达到最佳抑制效果47.88％。采用添加平均抑制率考察杭白菊提取物对Harman的抑制效果，0.2-1mg/g范围内添加对Harman平均抑制率为23.79％，对Norharman平均抑制率为45.75％，Norharman的平均抑制率明显高于Harman，总杂环胺的平均抑制率为34.60％。
综合分析，对于游离总杂环胺，其中最佳抑制的添加量在1mg/g。对于含量在100-300ng/g的结合态的两种杂环胺，随着杭白菊提取物的添加，抑制效果有逐渐增大趋势，最佳抑制的添加量在1mg/g，综合微量游离态杂环胺与生成优势性结合态杂环胺的生成情况，认为0.2-1mg/g内添加杭白菊提取物对杂环胺有显著抑制效果，其中1mg/g对杂环胺抑制能力最强。
表3：添加杭白菊提取物对游离态杂环胺的抑制分析表
Figure BDA0002591709620000101
注：抑制率＝(1-杂环胺生成量/零添加时杂环胺生成量)×100％；添加平均为相应杂环胺在0.2-1mg/g添加范围内生成量的算术平均值；生成量中标有不同字母的视为显著差别(P<0.05)。生成量单位为ng/g，数值以均值±SD(标准差)表示。
表4：添加杭白菊提取物对结合态杂环胺的抑制分析表
Figure BDA0002591709620000102
注：抑制率＝(1-杂环胺生成量/零添加时杂环胺生成量)×100％；添加平均为相应杂环胺在0.2-1mg/g添加范围内生成量的算术平均值；生成量中标有不同字母的视为显著差别(P<0.05)。生成量单位为ng/g，数值以均值±SD(标准差)表示。

Claims (5)

1.一种杭白菊提取物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）水浸提取：
称取杭白菊粉末，加入超纯水中，在80℃下浸提13min，过滤浓缩后，得到杭白菊提取液，对提取液进行黄酮含量的测定；所述杭白菊粉末的质量g/超纯水的体积mL=1:70；
（2）树脂吸附：
将所得的杭白菊提取液通过AB-8大孔吸附树脂进行吸附后，选用乙醇作为洗脱剂进行洗脱，得到含醇黄酮液；
所述AB-8大孔吸附树脂吸附杭白菊提取液的具体工艺条件为：杭白菊提取液的上样量为：杭白菊提取液中黄酮量mg/树脂量g=3.97，吸附时间为3.5h，洗脱剂乙醇的体积分数为60%，洗脱剂乙醇的洗脱体积为2.5个柱体积；
（3）干燥：
将所得的含醇黄酮液通过旋转蒸发除醇后，冷冻干燥，得到杭白菊提取物。
2.如权利要求1所述的提取方法制备得到的杭白菊提取物在抑制烤羊肉中杂环胺生成的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：
（1）添加杭白菊提取物的羊肉制作：将羊腿肉剔除可见脂肪与筋膜，机械破碎后，与杭白菊提取物混合腌制成肉泥；将肉泥装入直径6.5cm×厚1cm的饼状肉制品模型，4℃下腌渍5 h后脱模，脱模后的肉制品置于温度为230℃的烤箱，烤制时间为15min，烤制后取出放置至室温，粉碎，制成烤肉粉末；
（2）羊肉制品中杂环胺的提取：称取烤肉粉末，加入氢氧化钠甲醇溶液，均质后微波加速提取，室温放凉后以4500r/min的速度离心10min，得上清液1，向上清液1中加入3M盐酸至pH为3±0.02，以4500r/min的速度离心10min，得上清液2与蛋白沉淀，上清液2进行游离态杂环胺的提取；向蛋白沉淀中加入盐酸进行酸解，冷却过滤后得上清液3，进行结合态杂环胺的提取；
所述烤肉粉末g/氢氧化钠甲醇溶液mL=1:10；氢氧化钠甲醇溶液的浓度为1M；所述均质的时间为1min，转速为13000 rpm；微波加速提取的频率为2450MHz，提取时间为20s；
（3）提取液的净化：取上清液2与上清液3，分别通过固相萃取法进行净化，其中净化包括活化、洗杂、洗脱三个步骤；
（4）杂环胺的测定：采用超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法进行测定。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）加入盐酸进行酸解时，盐酸的浓度为4M，体积为10mL，酸解的温度为110℃，时间为22h。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）固相萃取法的具体步骤为：取上清液2与上清液3，分别上样于经6mL甲醇、6mL超纯水、6mL 0.1M盐酸活化好的固相萃取柱，然后用6mL 0.1M盐酸淋洗除去非极性杂质后抽真空1min、用6mL甲醇淋洗除去极性杂质后抽真空1min，用6mL氨水甲醇溶液洗脱得杂环胺最终提取液，置于氮吹装置于45℃条件下吹近干，用0.22μm有机滤膜过滤后，用于杂环胺的测定；其中氨水甲醇溶液中氨水与甲醇的体积比为1:19。
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