CN113176355B - 一种用于水产品中土臭味物质检测的前处理方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于水产品中土臭味物质检测的前处理方法，步骤如下：取水产品可食组织，剪碎，放入具塞离心管中，然后加入木瓜蛋白酶、双蒸馏水，涡旋，混匀，置于水浴中静置；然后加入正己烷，涡旋，混匀，置于超声浴，离心取上清，重复依次，合并两次上清液转移至新的具塞离心管中；向具塞离心管中加入净化萃取包；将离心管涡旋，离心，取上清液并转至新离心管后，封盖，备用；采用固相萃取柱，用正己烷淋洗，乙酸乙酯洗脱，洗脱液过有机相滤膜后，待GC‑MS自动进样，检测。本发明大大节约了前处理时间和耗材使用成本，可以使水产品中土臭味物质检测的回收率提高至80%左右，处理方法简单且可批量操作，在质量控制方面也增强了方法的适用能力。

Description

一种用于水产品中土臭味物质检测的前处理方法
技术领域
本发明涉及水产养殖技术领域，具体涉及一种用于水产品中土臭味物质检测的前处理方法。
背景技术
水产养殖提供的水产品极大地满足了我国人民对蛋白质的需求，是维护国家粮食安全不可动摇的根基。然而，一些残留在水产品中的异味物质极大地影响了食用口感。这些异味物质主要以土臭味物质为主，主要包括土臭素、2-甲基异莰醇、2-异丁基-甲氧基吡嗪、2-异丙基-甲氧基吡嗪和2，3，6-三氯代茴香醚，其中对水产品土臭味贡献最大的，也是目前相关研究最多的就是土臭素和2-甲基异莰醇。
在我国已有研究报道中，鳙鱼、罗非鱼、草鱼和虹鳟等众多淡水养殖品种都检测到了土臭素和2-甲基异莰醇，其中鳙鱼和罗非鱼土腥味物质含量为5.4 µg/kg和0.87 µg/kg。国外研究亦是如此，欧洲主要的淡水品种欧鳊、白斑狗鱼和虹鳟商品鱼的土臭素和2-甲基异莰醇含量分别达到了0.9 µg/kg和0.095 µg/kg、0.59 µg/kg和0.085 µg/kg、6.5 µg/kg和0.85 µg/kg。
在土臭味物质检测方面，已有研究均是采用微波萃取捕集结合固相微萃取的前处理手段，而后通过手动进样的方式与气相色谱串联质谱（GC-MS）进行联机检测。具体操作是，将待测水产品样品匀浆后置于圆底蒸馏烧瓶中，加入少量纯水并混匀，随后将圆底蒸馏烧瓶放入微波萃取装置中。同时，馏分收集瓶中加入足量的纯水，并置于馏分收集装置中。然后，微波萃取仪开始工作，通过一定功率的微波进行加热，约进行10分钟左右的蒸馏时间，将蒸馏物通过氮气吹扫转至馏分收集瓶中。蒸馏结束后，馏分收集瓶中的水体溶有的土臭味物质再随后通过固相微萃取的方式吸附萃取至固相纤维中，而后固相纤维已手动进样方式插入GC-MS进样口，进行检测。
以上方法局限性在前处理上，一是步骤繁琐，耗时而且费钱。先进行微波萃取的蒸馏方式，后通过固相微萃取的吸附萃取方式，都极其费时费力，过程时间长，更无法批量进行，尤其是固相纤维的使用寿命仅能进行约30个样品。二是操作不稳定，得到的检测效果并不好。在微波蒸馏方面，容易散失目标分析物，另外在转移至固相微萃取采样台的时候，也容易进一步散失目标物。一般通过这些步骤得到的水产品中土臭味物质的回收率不到50%。
发明内容
解决的技术问题：为了克服上述现有技术前处理方法的缺陷，本发明提出一种用于水产品中土臭味物质检测的前处理方法，基于水产品基质的特有性质，开发了一套简单并可批量操作的前处理方法，大大节约了前处理时间和耗材使用成本，通过本发明的前处理方法，水产品中土臭味物质检测的回收率也提高至80%左右，在质量控制方面也增强了方法的适用能力。
技术方案：一种用于水产品中土臭味物质检测的前处理方法，步骤如下：
步骤一.取水产品可食组织，剪碎，放入具塞离心管中，然后加入木瓜蛋白酶、双蒸馏水，涡旋，混匀，将离心管置于水浴中，静置；
步骤二.然后向步骤一处理后的具塞离心管中加入正己烷，涡旋，混匀，置于超声浴，然后离心取上清，该步骤重复一次，合并两次上清液转移至新的具塞离心管中；
步骤三.向具塞离心管中加入净化萃取包，该净化萃取包的原料按质量份配比如下：丙基乙二胺1.5-2 份、十八烷基硅烷1.5-2份、石墨化碳黑2-3份、硅藻土1-1.5份和无水硫酸镁3-5份；
步骤四.将离心管涡旋，然后离心，取上清液并转至新离心管后，封盖，备用；
步骤五. 采用硅胶固相萃取柱，先用正己烷活化柱子；上样备用的上清液；再用正己烷淋洗，氮气吹扫；用乙酸乙酯洗脱，洗脱液过有机相0.22 µm滤膜后，待GC-MS自动进样，检测。
作为优选，所述步骤一中水产品可食组织、木瓜蛋白酶、双蒸馏水的比值为(5-10g):(0.5-1 g):(2-4 mL)，涡旋1-2分钟，混匀，将离心管置于37℃水浴中，静置30-50分钟。
作为优选，所述步骤二中向步骤一处理后的具塞离心管中加入正己烷，涡旋1分钟，混匀，正己烷与水产品可食组织的比值为(15-20 mL)：(5-7.5 g)，置于超声浴中15-20分钟，在10619 g下离心8分钟，该步骤重复一次，合并两次上清液转移至新的具塞离心管中。
作为优选，所述步骤三中净化萃取包与水产品可食组织的质量比为(9-12):(5-7)。
作为优选，所述步骤三净化萃取包中丙基乙二胺的粒径为40-70 µm，十八烷基硅烷的粒径为40-70 µm，石墨化碳黑的粒径为120-150目，硅藻土的粒径40-70 µm，无水硫酸镁为农残级。
作为优选，所述步骤四中将离心管涡旋10-15分钟，然后在10619 g下离心5-10分钟，取上清液并转至新离心管后，封盖，备用。
作为优选，所述步骤五中硅胶固相萃取柱中硅胶与柱子的比值为6 g：5 mL，硅胶为超纯，粒径为60-200 µm，先用5-7 mL正己烷活化柱子，速度是2-2.5 mL/min；上样备用的上清液，速度是1-1.5 mL/min；再用3-5 mL正己烷淋洗，速度是2-2.5 mL/min；氮气吹扫1-1.5分钟；以2-3 mL乙酸乙酯洗脱，速度是1-1.5 mL/min，洗脱液过有机相0.22 µm滤膜后，待GC-MS自动进样，检测。
有益效果：1.本发明基于水产品基质的特有性质，开发了一套简单并可批量操作的前处理方法，通过本发明的前处理方法，水产品中土臭味物质检测的回收率也提高至80%左右，在质量控制方面也增强了方法的适用能力；
2.本发明通过酶解使水产品的块状结构变成乳浊液状，便于目标分析物从组织中分离和下一步的提取，然后采用正己烷作为提取剂，能够和木瓜蛋白酶水解起到联合增效的作用，再加上净化萃取包的配合使用，使最终水产品中土臭味物质检测的回收率提高至80%以上，大大节约了前处理时间和耗材使用成本。
附图说明
图1 为本发明实施例1获得的特征图谱；
图2为本发明对比例3获得的特征图谱；
图3为本发明对比例4获得的特征图谱。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。本说明书实施例中水产品为淡水水产品，如鲢鱼等。
实施例1
（1）取5 g左右的水产品可食组织，剪碎。置于50 mL具塞离心管中。随后加入0.5 g木瓜蛋白酶、2 mL双蒸馏水。涡旋1分钟，混匀。将离心管至于37℃水浴中，静置30分钟。该步骤利用酶水解的作用将水产品的块状结构变成乳浊液状，便于目标分析物从组织中分离和下一步的提取。
（2）加入15 mL正己烷，涡旋1分钟，混匀。至于超声浴中15 分钟。在10619 g下离心8分钟。该步骤重复一次。合并两次上清液转移至新的50 mL具塞离心管中。
（3）加入净化萃取包。该净化萃取包的材料和用量配方如下：丙基乙二胺（粒径为40-70 µm）1.5 g、十八烷基硅烷（粒径为40-70 µm）1.5 g、石墨化碳黑（粒径为120-150目）2g、硅藻土（粒径40-70 µm）1g和无水硫酸镁（农残级）3 g。使用净化萃取包的用途是吸附待测样品中的蛋白、脂肪酸，以及其它碳水化合物类生物大分子等，使样品纯净，保证后续GC-MS谱图无过多杂峰干扰目标物质。
（4）涡旋10 分钟。随后在10619 g下离心5分钟。取上清液并转至新离心管后。封盖，备用。
（5）以硅胶（超纯，60-200 µm）6 g填充5 mL柱子，或购置等同类型的固相萃取柱。先用5 mL正己烷活化柱子，速度是2.5 mL/min；上样备用的上清液，速度是1 mL/min；再用3mL正己烷淋洗，速度是2.5 mL/min；氮气吹扫1分钟；以2 mL乙酸乙酯洗脱，速度是1 mL/min。洗脱液过有机相0.22 µm滤膜后。待GC-MS自动进样，检测。
通过上述步骤，获得土臭素和2-甲基异莰醇的检测定量限分别是0.025 µg/kg和0.25µg/kg，土臭素和2-甲基异莰醇的回收率分别为86.12±2.11%和83.23±1.21%。与传统的微波蒸馏-固相微萃取前处理方法（回收率不到50%）比较，显著提高了回收率，获得的特征图谱如图1所示。
对比例1
同实施例1，区别在于缺少木瓜蛋白酶水解一步。
检测发现土臭素和2-甲基异莰醇的回收率分别是23.18±1.01%和30.53±0.26%，结果表明，该步骤对正己烷的提取效率影响显著。
对比例2
同实施例1，区别在于，将步骤二中的正己烷替换为乙酸乙酯，其它步骤相同。
检测发现土臭素和2-甲基异莰醇的回收率分别是均低于10%，结果表明，在乙酸乙酯状态下，净化萃取包发生吸附基质内杂质作用的同时，也吸附了目标分析物。并且在后续固相萃取浓缩步骤时没有有效接纳全部目标分析物。以上因素造成回收率低下。
本对比例，以乙酸乙酯举例，发现利用乙酸乙酯等有机溶剂，结合使用硅胶材质的固相萃取柱子，目标物质的回收率不到50%。
对比例3
同实施例1，区别在于，净化萃取包中不采用石墨化碳黑部分。图谱特征见图2，图中显示杂峰较多，干扰目标峰定量，提高了方法定量限，影响方法灵敏度。本对比例中的图谱还是可以看出目标峰。
对比例4
同实施例1，区别在于不使用净化萃取包，其它步骤相同。
图谱特征见图3。图谱显示杂峰较对比例3更多，严重干扰了目标峰，找不到目标峰。
实施例2
一种用于水产品中土臭味物质检测的前处理方法，步骤如下：
步骤一.取水产品可食组织，剪碎，放入具塞离心管中，然后加入木瓜蛋白酶、双蒸馏水，涡旋，混匀，将离心管置于水浴中，静置，其中水产品可食组织、木瓜蛋白酶、双蒸馏水的比值为10 g: 1 g: 4 mL，涡旋2分钟，混匀，将离心管置于37℃水浴中，静置50分钟；
步骤二.然后向步骤一处理后的具塞离心管中加入正己烷，涡旋1分钟，混匀，正己烷与水产品可食组织的比值为20 mL：7.5 g，置于超声浴中20 分钟，然后在10619 g下离心8分钟，取上清，该步骤重复一次，合并两次上清液转移至新的具塞离心管中；
步骤三.向具塞离心管中加入净化萃取包，该净化萃取包的原料按质量份配比如下：丙基乙二胺2 份、十八烷基硅烷2份、石墨化碳黑3份、硅藻土1.5份和无水硫酸镁5份，净化萃取包与水产品可食组织的质量比为12: 7，丙基乙二胺的粒径为40-70 µm，十八烷基硅烷的粒径为40-70 µm，石墨化碳黑的粒径为120-150目，硅藻土的粒径40-70 µm，无水硫酸镁为农残级；
步骤四.将离心管涡旋15分钟，然后在10619 g下离心10分钟，取上清液并转至新离心管后，封盖，备用；
步骤五. 采用硅胶固相萃取柱，先用正己烷活化柱子；上样备用的上清液；再用正己烷淋洗，氮气吹扫；用乙酸乙酯洗脱，洗脱液过有机相0.22 µm滤膜后，待GC-MS自动进样，检测，所述硅胶固相萃取柱中硅胶与柱子的比值为6 g：5 mL，硅胶为超纯，粒径为60-200 µm，先用7 mL正己烷活化柱子，速度是2 mL/min；上样备用的上清液，速度是1.5 mL/min；再用5 mL正己烷淋洗，速度是2 mL/min；氮气吹扫1.5分钟；以3 mL乙酸乙酯洗脱，速度是1.5mL/min，洗脱液过有机相0.22 µm滤膜后，待GC-MS自动进样，检测。

Claims (5)

1.一种用于水产品中土臭味物质检测的前处理方法，其特征在于，步骤如下：
步骤一.取水产品可食组织，剪碎，放入具塞离心管中，然后加入木瓜蛋白酶、双蒸馏水，涡旋，混匀，将离心管置于水浴中，静置，所述水产品可食组织、木瓜蛋白酶、双蒸馏水的比值为(5-10 g):(0.5-1 g):(2-4 mL)，涡旋1-2分钟，混匀，将离心管置于37℃水浴中，静置30-50分钟；
步骤二.然后向步骤一处理后的具塞离心管中加入正己烷，涡旋，混匀，置于超声浴，然后离心取上清，该步骤重复一次，合并两次上清液转移至新的具塞离心管中，所述正己烷与水产品可食组织的比值为(15-20 mL)：(5-7.5 g)；
步骤三.向具塞离心管中加入净化萃取包，该净化萃取包的原料按质量份配比如下：丙基乙二胺1.5-2 份、十八烷基硅烷1.5-2份、石墨化碳黑2-3份、硅藻土1-1.5份和无水硫酸镁3-5份，所述净化萃取包与水产品可食组织的质量比为(9-12):(5-7)；
步骤四.将离心管涡旋，然后离心，取上清液并转至新离心管后，封盖，备用；
步骤五. 采用硅胶固相萃取柱，先用正己烷活化柱子；上样备用的上清液；再用正己烷淋洗；氮气吹扫；用乙酸乙酯洗脱，洗脱液过有机相0.22 µm滤膜后，待GC-MS自动进样，检测，所述硅胶固相萃取柱中硅胶与柱子的比值为6 g：5 mL，硅胶为超纯，粒径为60-200 µm。
2.根据权利要求1所述的一种用于水产品中土臭味物质检测的前处理方法，其特征在于，所述步骤二中向步骤一处理后的具塞离心管中加入正己烷，涡旋1分钟，混匀，置于超声浴中15-20 分钟，在10619 g下离心8分钟，该步骤重复一次，合并两次上清液转移至新的具塞离心管中。
3.根据权利要求1所述的一种用于水产品中土臭味物质检测的前处理方法，其特征在于，所述步骤三净化萃取包中丙基乙二胺的粒径为40-70 µm，十八烷基硅烷的粒径为40-70µm，石墨化碳黑的粒径为120-150目，硅藻土的粒径40-70 µm，无水硫酸镁为农残级。
4.根据权利要求1所述的一种用于水产品中土臭味物质检测的前处理方法，其特征在于，所述步骤四中将离心管涡旋10-15分钟，然后在10619 g下离心5-10分钟，取上清液并转至新离心管后，封盖，备用。
5.根据权利要求1所述的一种用于水产品中土臭味物质检测的前处理方法，其特征在于，所述步骤五中先用5-7 mL正己烷活化柱子，速度是2-2.5 mL/min；上样备用的上清液，速度是1-1.5 mL/min；再用3-5 mL正己烷淋洗，速度是2-2.5 mL/min；氮气吹扫1-1.5分钟；以2-3 mL乙酸乙酯洗脱，速度是1-1.5 mL/min，洗脱液过有机相0.22 µm滤膜后，待GC-MS自动进样，检测。
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