CN109975459B - 一种同时检测卤肉中瘦肉精和罂粟壳添加物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了一种同时检测卤肉中瘦肉精和罂粟壳添加物的方法，其包括通过三氯乙酸溶液提取分离样品，获得含有待检测物的溶液，并将所述待检测物溶液经过固相萃取柱等净化后，经液相色谱质谱联用检测待检测物中添加物的种类和含量的步骤。本发明实施例一种同时检测卤肉中瘦肉精和罂粟壳添加物的方法，其通过对提取试剂、净化方式的优化，降低了基质干扰，提高了净化效率。本发明实施例采用三氯乙酸溶液提取目标物，通过固相萃取小柱等方式净化，高效液相色谱串联质谱仪检测，内标法定量，一次前处理提取两类物质，不仅有效缩短了前处理时间，而且有机试剂用量少，对环境污染小。

Description

一种同时检测卤肉中瘦肉精和罂粟壳添加物的方法

技术领域

本发明实施例涉及食品安全检测技术领域，具体涉及一种同时检测卤肉中瘦肉精和罂粟壳添加物的方法。

背景技术

瘦肉精，是一类药物的统称，通常是指克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、妥布特罗、氯丙那林、喷布特罗、西马特罗、非诺特罗等物质，它们均属于β-受体激动剂，能与肾上腺素受体结合，临床上主要用于治疗人的哮喘、支气管痉挛等。当将其以超过治疗剂量5～10倍的用量用于家畜饲养时，即有显著的营养“再分配效应”，促进动物体蛋白质沉积、促进脂肪分解抑制脂肪沉积，能显著提高胴体的瘦肉率、增重和提高饲料转化率，因此，曾被用作牛、羊、禽、猪等畜禽的促生长剂、饲料添加剂。以盐酸克仑特罗为例，其属于非蛋白质激素，耐热，使用后会在猪体组织中形成残留，尤其是在猪的肝脏等内脏器官残留较高，食用后直接危害人体健康，人类食用含“瘦肉精”的食品后，常见的会出现有恶心、头晕、四肢无力、手颤等中毒症状。因此，含“瘦肉精”的食品对心脏病、高血压、甲亢和前列腺肥大等疾病患者危害更大，严重的可导致死亡。

罂粟壳，是植物罂粟的干燥成熟果壳。秋季将已割取浆汁后的成熟果实摘下，破开，除去种子及枝梗，干燥。和鸦片、海洛因相比，罂粟壳内的“有毒物质”虽然含量不大、纯度也不高，但其成分中仍然包括吗啡、可待因、那可丁、罂粟碱等30多种生物碱，其中吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因、那可丁等比较有代表性。人食用了添加有罂粟壳的食品，会或多或少地产生轻快感，表现在生理上，有的人可能脸部微微发红，有的人可能心跳加快，有的人可能容易打瞌睡，而有的人可能不易入睡。即使是对毒品不敏感的人，如果长期食用添加了罂粟壳的食品，也会产生一定的依赖性，进而成瘾，具有潜在的吸食毒品的倾向，给社会造成极坏的影响。长期食用这种食品，会出现发冷、出虚汗、乏力、面黄肌瘦等症状；严重时，可能对神经系统、消化系统造成损害，甚至会出现内分泌失调等症状，对人体肝脏、心脏有一定的毒害。

卤肉制品作为日常消费比较受欢迎的食品，主要原料为猪肉、牛肉等，在日常抽检项目中瘦肉精及罂粟碱等项目是重点关注项目。有些食品加工者置国家法律、法规及人民身体健康于不顾，在原料采购环节把关不严，在产品加工环节中掺入罂粟壳吸引回头客，对消费者造成一定的伤害。

目前，并未有同时有效监控瘦肉精和罂粟壳生物碱等在食品中的添加的方法，食品中瘦肉精的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气质联用(GC-MS)、液质联用(HPLC-MS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)等；罂粟壳生物碱的检测主要有薄层色谱、示波极谱法、免疫层析法、液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、液相色谱质谱联用法(HPLC-MS)。针对食品中瘦肉精颁布了相关的检测标准，但是测定罂粟壳生物碱的方法尚无国家标准，且缺乏一种检测方法能够同时测定两类物质。在现有的检测方法中，食品中瘦肉精检测方法有一些步骤较为复杂，前处理需要使用酶解，耗时较长。

综上所述，传统的方法中，没有同时有效检测食品中含有瘦肉精和罂粟壳生物碱等添加物的方法，此外，单独检测瘦肉精以及罂粟壳生物碱的检测方法步骤复杂，检测效率低，耗时长。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种同时检测卤肉中瘦肉精和罂粟壳添加物的方法，以解决现有技术中只能单独检测食物中瘦肉精或罂粟壳生物碱添加物的不足，同时解决检测过程中步骤繁琐、检测效率低以及耗时长的问题。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种同时检测卤肉中瘦肉精和罂粟壳添加物的方法，其特征在于包括通过三氯乙酸溶液提取分离样品，获得含有待检测物的溶液，并将所述待检测物溶液经过固相萃取柱净化后，经液相色谱质谱联用检测待检测物中非法添加物的种类和含量的步骤。

优选的，所述提取分离样品的过程为：将所述样品均匀粉碎后，加入内标液和5％的三氯乙酸混合后，超声、振荡处理，离心后取上清液，重复上述步骤，将上清液合并，将合并后的上清液加入正己烷混合后，离心去除正己烷获得含有待检测物溶液。

优选的，所述内标液分别为克仑特罗-D9、沙丁胺醇-D3、吗啡-D3和可待因-D3溶液。

优选的，所述固相萃取步骤包括：

先用3mL甲醇，3mL水活化平衡PCX固相萃取小柱；

将所述含有待检测物的溶液过所述PCX固相萃取小柱，然后用分别用3mL水、3mL1％乙酸和1mL甲醇淋洗PCX固相萃取小柱，并减压抽干；

最后，用5mL含有体积分数为5％氨水的甲醇洗脱柱，收集洗脱液，所述洗脱液干燥后，用乙腈-0.1％乙酸溶液溶解，得到净化后的含待检测物的溶液。

优选的，所述待检测物为：溴布特罗、马布特罗、非诺特罗、莱克多巴胺、喷布特罗、克仑特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、妥布特罗、特布他林、西马特罗、氯丙那林、那可丁、罂粟碱、蒂巴因、可待因、吗啡。

优选的，本发麻实施例的方法还包括标准曲线的建立过程，其通过各个以各化合物的定量离子峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标，对应的化合物浓度作为横坐标，获得标准曲线。

优选的，所述待检测物中，沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林以沙丁胺醇-D3为内标；

溴布特罗、马布特罗、非诺特罗、喷布特罗、克仑特罗、塞布特罗、妥布特罗、西马特罗、氯丙那林以克仑特罗-D9为内标；

吗啡、罂粟碱以吗啡-D3为内标；

可待因、蒂巴因和那可丁以可待因-D3为内标。

优选的，所述液相色谱中的流动相A为0.1％乙酸水溶液，流动相B为乙腈。

本发明实施例具有如下优点：

本发明实施例一种同时检测卤肉中瘦肉精和罂粟壳添加物的方法，其通过对SPE小柱的优化，降低了基质干扰，提高了净化效率。在HPLC-MS/MS的方法确证中，采用空白基质配制系列标准溶液可以有效降低基质效应对方法的精确度和结果的准确度产生的影响，该方法不仅快速、准确，而且灵敏度高，本发明实施例采用三氯乙酸溶液提取目标物，通过固相萃取小柱等方式净化，高效液相色谱串联质谱仪检测，内标法定量，一次前处理提取两类物质，不仅有效缩短了前处理时间，而且有机试剂用量少；废弃物少，对环境污染小。

本发明实施例同时测定卤肉中12种瘦肉精及5种罂粟壳生物碱的检测方法，待测样品用质量分数为5％的三氯乙酸溶液提取，正己烷去油脂，PCX固相萃取小柱净化处理，使用Angilent Zorbax C18色谱柱分离，以0.1％乙酸水溶液和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，电喷雾正离子模式电离，多反应监测模式检测，内标法定量。在瘦肉精检测方面，无需酶解，酸解提取更加迅速，大幅缩短检测时间，检测的灵敏度高，结果可靠性，为卤肉制品非法添加物检测提供了有力的技术支撑，能够较好地满足日常实际检测工作的需要。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1本发明实施例的空白基质添加1μg/kg溴布特罗卤牛肉样品的质谱多反应监测色谱图；

图2本发明实施例的空白基质添加1μg/kg马布特罗卤牛肉样品的质谱多反应监测色谱图；

图3本发明实施例的空白基质添加1μg/kg非诺特罗卤牛肉样品的质谱多反应监测色谱图；

图4本发明实施例的空白基质添加1μg/kg莱克多巴胺卤牛肉样品的质谱多反应监测色谱图；

图5本发明实施例的空白基质添加1μg/kg喷布特罗卤牛肉样品的质谱多反应监测色谱图；

图6本发明实施例的空白基质添加1μg/kg克仑特罗卤牛肉样品的质谱多反应监测色谱图；

图7本发明实施例的空白基质添加1μg/kg沙丁胺醇卤牛肉样的质谱多反应监测色谱图；

图8本发明实施例的空白基质添加1μg/kg塞布特罗卤牛肉样品的质谱多反应监测色谱图；

图9本发明实施例的空白基质添加1μg/kg妥布特罗卤牛肉样品的质谱多反应监测色谱图；

图10本发明实施例的空白基质添加1μg/kg特布他林卤牛肉样品的质谱多反应监测色谱图；

图11本发明实施例的空白基质添加1μg/kg西马特罗卤牛肉样品的质谱多反应监测色谱图；

图12本发明实施例的空白基质添加1μg/kg氯丙那林卤牛肉样品的质谱多反应监测色谱图；

图13本发明实施例的空白基质添加5μg/kg克仑特罗-D9卤牛肉样品的质谱多反应监测色谱图；

图14本发明实施例的空白基质添加5μg/kg沙丁胺醇-D3卤牛肉样品的质谱多反应监测色谱图；

图15本发明实施例的空白基质添加10μg/kg那可丁卤牛肉样品的质谱多反应监测色谱图；

图16本发明实施例的空白基质添加10μg/kg罂粟碱卤牛肉样品的质谱多反应监测色谱图；

图17本发明实施例的空白基质添加10μg/kg蒂巴因卤牛肉样品的质谱多反应监测色谱图；

图18本发明实施例的空白基质添加50μg/kg可待因卤牛肉样品的质谱多反应监测色谱图；

图19本发明实施例的空白基质添加50μg/kg吗啡卤牛肉样品的质谱多反应监测色谱图；

图20本发明实施例的空白基质添加50μg/kg可待因-D3卤牛肉样品的质谱多反应监测色谱图；

图21本发明实施例的空白基质添加50μg/kg吗啡-D3卤牛肉样品的质谱多反应监测色谱图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1、实验部分

1.1仪器和试剂

Agilent 6460质谱仪(美国Agilent公司)；高速冷冻离心机(美国Beckman公司)MV5全自动平行氮吹浓缩仪(Labtech公司)；刀式搅拌器(德国Retsch公司)；电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；涡旋混合器(德国IKA公司)；振荡器(日本Yamato公司)；超声仪(Branson公司)；PCX固相萃取小柱(Agela公司)。

甲醇、乙酸、乙腈、正己烷(色谱纯，德国MERCK公司)；三氯乙酸(色谱纯，上海国药集团化学试剂有限公司)，氨水(分析纯)，水为超纯水。

标准品：溴布特罗(Brombuterol)、马布特罗(Mabuterol)、非诺特罗(Fenoterol)、莱克多巴胺(Ractopamine)、喷布特罗(Penbutolol)、克仑特罗(Clenbuterol)、沙丁胺醇(Salbutamol)、塞布特罗(Cimbuterol)、妥布特罗(Tulobuterol)、特布他林(Turbutaline)、西马特罗(Cimaterol)、氯丙那林(Clorprenaline)、克仑特罗-D9(Clenbuterol-D9)、沙丁胺醇-D3(Salbutamol-D3)，均购自DR公司；那可丁(Noscapine)浓度为10mg/L、罂粟碱(Paraverine)浓度为10mg/L、蒂巴因(Thebaine)浓度为10mg/L、可待因(Codeine)浓度为50mg/L、吗啡(Morphine)浓度为50mg/L，购自阿尔塔公司；可待因-D3(Codeine-D3)浓度为20mg/L、吗啡-D3(Morphine-D3)浓度为20mg/L，购自上海安谱公司。

1.2色谱条件

液相色谱条件为：Angilent Zorbax C18色谱柱为(50×2.1mm，3.5μm)；柱温箱温度：35℃；样品室温度：室温；进样量：10μL；流速为0.35mL/min；流动相A：0.1％乙酸水溶液；流动相B：乙腈，梯度洗脱程序如表1所示。

表1

1.3质谱条件

干燥气温度：325℃；干燥气流速：6L/min；鞘气温度:350℃；鞘气流速:11L/min；毛细管电压:3500V。

1.4标准溶液配制

分别称取β-受体激动剂标准品10mg于100mL容量瓶中，加入甲醇-水(1:1，v/v)溶解并定容至刻度，得到质量浓度为100mg/L的单标准储备溶液，于-18℃下冷冻保存，有效期为6个月。取上述单标准储备液，用甲醇-水(1:1，v/v)稀释成β-受体激动剂类药物与罂粟壳生物碱的混合标准工作溶液，其中：β-受体激动剂类药物浓度0.1mg/L；蒂巴因、罂粟碱、那可丁浓度为浓1mg/L；吗啡和可待因浓度为5mg/L。放入冰箱中于2～4℃下储存，有效期为1个月。

氘代标准工作液：取4种同位素内标溶液适量配制氘代标准工作液，其中：克仑特罗-D9和沙丁胺醇-D3的浓度均为0.2mg/L；吗啡-D3和可待因-D3的浓度均为2mg/L。

准确吸取标准工作液，用初始流动相配比复溶的空白基质溶液制成标准系列溶液，其中β-受体激动剂质量浓度为0.5、1、2、5、10μg/L；吗啡和可待因浓度为25、50、125、250、500μg/L，蒂巴因、罂粟碱、那可丁浓度为5、10、25、50、100μg/L。

空白基质溶液的制备：称取与试样基质相应的阴性样品2.0g，与试样同时进行提取、净化和复溶得到。

1.5样品前处理

将样品用刀式搅拌器搅碎均匀，称取2g样品，精确至0.01g，置于50mL聚四氟乙烯具塞离心管中，分别加入50μL 4种混合氘代标准工作液和10mL质量分数为5％的三氯乙酸，涡旋30s，超声处理15min，震荡15min，然后以4000r/min下离心10min，取上清液置于另一个50ml聚四氟乙烯具塞离心管中；再在样品中加入10mL质量分数为5％的三氯乙酸重复上述步骤，合并2次上清液，加入10mL正己烷，涡旋30s，然后于4 000r/min离心10min，去除正己烷，获得含有待测物的溶液。

将含有待检测物的溶液用PCX固相萃取小柱进行纯化，首先，用PCX固相萃取小柱依次用3mL甲醇，3mL水，活化平衡PCX固相萃取小柱；然后将含有待检测物的溶液过柱；分别用3mL水、3mL 1％乙酸和1mL甲醇淋洗PCX柱，弃去淋洗液，减压抽干5min；最后，用5mL含有5％(v/v)氨水的甲醇洗脱柱，收集纯化后的含有待检测物的溶液，用氮气将溶液吹干，干燥物用1mL乙腈-0.1％乙酸(1:9，v/v)溶液溶解，过0.22μm滤膜，获得纯化后的含有待检测物的溶液。

2结果与分析

2.1样品前处理条件

β-受体激动剂在动物体内经过代谢后，部分会与葡萄糖醛酸等作用，以葡萄糖醛酸轭合物或硫酸轭合物等形式存在，因此测定这类化合物时，需要将其解离转化为代谢前的化合物，常用的解离方法主要有酶水解、碱水解等，本发明实施例利用三氯乙酸的强酸强氧化特性，以质量分数5％三氯乙酸水溶液水解样品，辅以超声处理，对样品能起到较好的水解轭合物、沉淀蛋白的作用。样品中的β-受体激动剂及罂粟壳生物碱，在酸性条件下易于H+结合形成阳离子，在纯化的过程中，被PCX固相萃取小柱吸附，具有较高的选择性和灵敏度。淋洗时使用水、甲醇等去除水溶性、脂溶性等杂质，可有效去除干扰物质。

2.2质谱条件的优化

在ESI(+)模式下分别对单个标准溶液进行一级质谱全扫描分析，得到每种药物的分子离子，然后以分子离子为母离子，对其离子进行全扫描，以MRM模式检测，在此基础上对碎裂电压和碰撞能进行优化，使选定的母离子和子离子组成的特征离子的丰度和比例达到最佳。优化得到质谱条件见表2所示，12种β-受体激动剂、5种罂粟壳生物碱及同位素内标的质谱参数。

表2

其中，图1至图21为空白基质添加的质谱多反应监测色谱图。

2.3线性试验、检出限和定量限

为了减少基质效应对待测化合物的影响，本发明实施例采用基质匹配的标准溶液进行线性实验。按1.4进行操作配制基质匹配的系列标准溶液。以各化合物的定量离子峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，对应的化合物浓度作为横坐标，获得标准曲线，得出线性方程、相关系数，其中，沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林以沙丁胺醇-D3；克仑特罗等其他为β-受体激动剂以克仑特罗-D9为内标；吗啡、罂粟碱以吗啡-D3为内标，可待因、蒂巴因和那可丁以可待因-D3为内标。线性方程见表3所示，12种β-受体激动剂、5种罂粟壳生物碱线性方程及相关系数，各个组分均具有良好的线性相关，相关系数均大于0.99。

在阴性样品中添加β-受体激动剂和罂粟壳生物碱，分别以3倍信噪比(S/N≥3)和10倍信噪比(S/N≥10)，计算检出限(LOD)和定量限(LOQ)，12种β-受体激动剂的定量限为0.5μg/kg；蒂巴因、罂粟碱和那可丁的定量限5μg/kg；吗啡和可待因的定量限为25μg/kg。

表3

2.4回收率与精密度

以不同种类空白样品做加标回收试验，β-受体激动剂加标水平分别为0.5μg/kg、1μg/kg、5μg/kg，蒂巴因、罂粟碱和那可丁加标水平分别为5μg/kg、10μg/kg、50μg/kg，吗啡和可待因加标水平分别为25μg/kg、50μg/kg、250μg/kg，每个添加水平重复6次。

加标回收试验结果见表5所示，β-受体激动剂及罂粟壳生物碱在空白基质中添加回收率和相对标准偏差，结果表明，17种化合物的回收率范围为75.1％～110.4％，相对标准偏差均在10％以内。

表5

2.5实际样品测定

本发明实施例的方法对30份卤肉样品进行了检测，在所检的卤肉样品中，有2份样品莱克多巴胺阳性，含量分别为3.7μg/kg和2.3μg/kg，1份样品沙丁胺醇阳性，含量2.9μg/kg，所有样品均未检出罂粟壳生物碱，该方法简便、快捷，具有很好的适用性和操作性，谱图中干扰峰较少。

3结果

本发明实施例的实验结果表明，本发明实施例通过对样品的前处理和检测方法的优化，建立了同时测定卤肉食物中瘦肉精和罂粟壳非法添加物的检测方法。本发明实施例的方法可以通过对样品进行一次前处理，利用液相色谱质谱联用同时检测两类物质，降低了基质干扰，提高了净化效率，有效缩短了前处理时间，而且有机试剂用量少、废弃物少，对环境污染小，适合卤肉食物中中瘦肉精和罂粟壳非法添加物的同时检测。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种同时检测卤肉中瘦肉精和罂粟壳添加物的方法，其特征在于，包括通过三氯乙酸溶液提取分离样品，获得含有待检测物的溶液，并将所述待检测物溶液经过固相萃取后，经液相色谱质谱联用检测待检测物中添加物的种类和含量的步骤；

所述提取分离样品的过程为：将所述样品均匀粉碎后，加入内标液和5％的三氯乙酸混合后，超声、振荡处理，离心后取上清液，重复上述步骤，将上清液合并，将合并后的上清液加入正己烷混合后，离心去除正己烷获得含有待检测物溶液；

所述固相萃取步骤包括：

先用3mL甲醇，3mL水活化平衡PCX固相萃取小柱；

将所述含有待检测物的溶液过所述PCX固相萃取小柱，然后用分别用3mL水、3mL 1％乙酸和1mL甲醇淋洗PCX固相萃取小柱，并减压抽干；

最后，用5mL含有体积分数为5％氨水的甲醇洗脱柱，收集洗脱液，所述洗脱液干燥后，用乙腈-0.1％乙酸溶液溶解，得到纯化后的含待检测物的溶液；

所述待检测物为：溴布特罗、马布特罗、非诺特罗、莱克多巴胺、喷布特罗、克仑特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、妥布特罗、特布他林、西马特罗、氯丙那林、那可丁、罂粟碱、蒂巴因、可待因、吗啡；

液相色谱条件为：色谱柱为Angilent Zorbax C18色谱柱；所述液相色谱中的流动相A为0.1％乙酸水溶液，流动相B为乙腈，

梯度洗脱程序如下表

。

2.如权利要求1所述的同时检测卤肉中瘦肉精和罂粟壳添加物的方法，其特征在于，

所述内标液分别为克仑特罗-D9、沙丁胺醇-D3、吗啡-D3和可待因-D3溶液。

3.如权利要求1所述的同时检测卤肉中瘦肉精和罂粟壳添加物的方法，其特征在于，

还包括标准曲线的建立过程，其通过各个以各化合物的定量离子峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标，对应的化合物浓度作为横坐标，获得标准曲线。

4.如权利要求1所述的同时检测卤肉中瘦肉精和罂粟壳添加物的方法，其特征在于，

所述待检测物中，沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林以沙丁胺醇-D3为内标；

溴布特罗、马布特罗、非诺特罗、喷布特罗、克仑特罗、塞布特罗、妥布特罗、西马特罗、氯丙那林以克仑特罗-D9为内标；

吗啡、罂粟碱以吗啡-D3为内标；

可待因、蒂巴因和那可丁以可待因-D3为内标。

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