CN107383222A - 用于提高免疫力的球藻提取物的制备方法 - Google Patents

用于提高免疫力的球藻提取物的制备方法 Download PDF

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    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
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Abstract

本发明公开了一种用于提高免疫力的球藻提取物的制备方法，包括冻融‑超声处理、去蛋白、透析并醇沉和分离纯化。有益效果为：本发明方法操作简单，生产周期短，所需的设备少，原料来源广，生产成本低；制备得到的多糖纯度高，可提高白细胞的变形运动速度，缩短白细胞从血液中到达病原体所在组织的时间；同时可提高白细胞的吞噬能力和分泌白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子等多种细胞因子的能力。长期服用上述多糖后，感冒频率下降，人体免疫力得到明显的提高。

Description

用于提高免疫力的球藻提取物的制备方法
技术领域
本发明涉及多糖提取技术领域，具体是一种用于提高免疫力的球藻提取物的制备方法。
背景技术
多糖是一类广泛存在于动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中的生物大分子，是构成生命的四大基本物质之一。近几十年来研究发现多糖具有复杂的生物和生理活性，特别是近十几年来随着世界各国科学家对植物多糖分离纯化、结构分析、免疫学及药理学等方面研究的不断深入，寻找一种资源相对丰富、成本低廉的植物多糖源已成为食品界、医学界关注的热点。海洋面积辽阔、海藻类植物来源丰富，其中除富含优质蛋白质、氨基酸、纤维素及矿物元素外，还含有多种生物活性多糖，并且海藻生存环境特异，海藻多糖具有独特的生理活性。作为医疗、保健用品已越来越引起世界各国的重视，海藻多糖正逐步成为生物多糖的主要来源之一。
小球藻(ChlorellapyrenoidosaFACHB5)是一类普生性单细胞藻类。小球藻具有生态分布广、可快速生长和繁殖、易于培养等优点，是地球上动植物中唯一能在20h增长4倍的生物，具有很高的应用价值。目前小球藻已经广泛地应用在动物饲料、食品添加剂、医药制剂、美容产品等方面。
现有技术如授权公告号为CN104311685B的中国发明专利，公开了一种螺旋藻多糖及其提取方法，包括以下步骤：将螺旋藻粉悬浊液反复冻融破壁后，离心获得细胞破碎液1和细胞碎片；在细胞破碎液1中加入硫酸铵至其饱和度为50％，盐析沉淀后，离心去除藻胆蛋白，获得上清液，将上清液与细胞碎片混匀，获得细胞破碎液2；采用热水浸提法获取螺旋藻多糖粗提物；将粗提物加入到乙醇/硫酸铵双水相体系中萃取，获得具有较高纯度的螺旋藻多糖的下相溶液；下相溶液经透析除盐后，用SephadexG-150层析柱和DEAESephadexA-50阴离子交换柱洗脱，获得纯螺旋藻多糖溶液；冷冻干燥后，制备成纯螺旋藻多糖成品。上述方法制备步骤繁琐，且提取过程中多糖活性容易被破坏，得到的产品质量不高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备步骤简单，原料来源广，价格低廉，提取率高的用于提高免疫力的球藻提取物的制备方法，得到的球藻提取物中球藻多糖纯度高，活性强。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：用于提高免疫力的球藻提取物的制备方法，包括冻融-超声处理、去蛋白、透析并醇沉和分离纯化。上述制备球藻提取物的方法操作简单，生产周期短，所需的设备少，原料来源广，生产成本低。制备得到的多糖纯度高，可提高白细胞的变形运动速度，缩短白细胞从血液中到达病原体所在组织的时间；同时可提高白细胞的吞噬能力和分泌白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子等多种细胞因子的能力。长期服用上述多糖后，感冒频率下降，人体免疫力得到明显的提高。分离纯化步骤为采用凝胶层析的方法对粗多糖进行分离纯化，洗脱液为溶有活性多肽的水溶液。上述凝胶层析洗脱所用的洗脱液量少，有提高免疫力作用的功能多糖损失量少，洗脱的分离效果好。
活性多肽的含量为1~3g/L，活性多肽的氨基酸序列为SCASRCKSRCRACRRCKGYAAVSFGRCRCICKCFRC。上述活性多肽能明显提高功能多糖的K值，对其他多糖的K值影响不大，从而有效的将功能多糖分离纯化。功能多糖性质不稳定，容易受外界因素影响而失活，上述活性多肽可较好保护功能多糖的活性。
凝胶层析洗脱流速为0.2~0.7mL/min，收集在620nm处有吸收的洗脱液，浓缩并冷冻干燥得到球藻提取物。功能多糖在620nm处有较强吸收，且其他多糖在此处无吸收，根据这一特性对功能多糖进行富集。
冻融-超声处理步骤为取小球藻藻泥，加入磷酸缓冲液，反复超声冻融1~4次，离心取上清液，超声功率为400~700W，每次超声作用时间为4~7min。利用超声波产生的空化作用、机械作用加速小球藻细胞壁的破碎，促进胞内物质的溶出，提高多糖的提取率。
磷酸缓冲液与藻泥质量比为12~18，缓冲液浓度为0.04~0.08mol/L，pH为7.0~8.5。功能多糖在上述磷酸缓冲液中的溶解度高，且能较好的保持功能多糖的活性。
去蛋白步骤为在上清液中加入2~5%的三氯乙酸溶液，直至不再出现白色沉淀，离心取上清液。三氯乙酸是一种有机酸，可以使溶液中的蛋白质变性沉淀。上述方法操作简单、结果稳定、反应温和，在除蛋白时能很好的保证多糖的活性。
透析并醇沉步骤为将上清液置于规格为200~400Da的透析袋中透析40~60h，加入2~5倍体积的乙醇，静置2~4h，离心取沉淀，低温干燥得到粗多糖。多糖溶液中加入乙醇，乙醇破坏多糖表面的水化层，大大降低多糖在水中的溶解度，起到分离提纯的效果，同时，多糖的活性未被破坏。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明方法操作简单，生产周期短，所需的设备少，原料来源广，生产成本低；2）制备得到的多糖纯度高，可提高白细胞的变形运动速度，缩短白细胞从血液中到达病原体所在组织的时间；同时可提高白细胞的吞噬能力和分泌白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子等多种细胞因子的能力。长期服用上述多糖后，感冒频率下降，人体免疫力得到明显的提高；3）洗脱液中加入了氨基酸序列为SCASRCKSRCRACRRCKGYAAVSFGRCRCICKCFRC的活性多肽。上述活性多肽能明显提高功能多糖的K值，对其他多糖的K值影响不大，从而有效的将功能多糖分离纯化。功能多糖性质不稳定，容易受外界因素影响而失活，上述活性多肽可较好保护功能多糖的活性。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
用于提高免疫力的球藻提取物的制备方法，包括冻融-超声处理、去蛋白、透析并醇沉和分离纯化。上述制备球藻提取物的方法操作简单，生产周期短，所需的设备少，原料来源广，生产成本低。制备得到的多糖纯度高，可提高白细胞的变形运动速度，缩短白细胞从血液中到达病原体所在组织的时间；同时可提高白细胞的吞噬能力和分泌白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子等多种细胞因子的能力。长期服用上述多糖后，感冒频率下降，人体免疫力得到明显的提高。分离纯化步骤为采用凝胶层析的方法对粗多糖进行分离纯化，洗脱液为溶有活性多肽的水溶液。上述凝胶层析洗脱所用的洗脱液量少，有提高免疫力作用的功能多糖损失量少，洗脱的分离效果好。
活性多肽的含量为3g/L，活性多肽的氨基酸序列为SCASRCKSRCRACRRCKGYAAVSFGRCRCICKCFRC。上述活性多肽能明显提高功能多糖的K值，对其他多糖的K值影响不大，从而有效的将功能多糖分离纯化。功能多糖性质不稳定，容易受外界因素影响而失活，上述活性多肽可较好保护功能多糖的活性。
凝胶层析洗脱流速为0.6mL/min，收集在620nm处有吸收的洗脱液，浓缩并冷冻干燥得到球藻提取物。功能多糖在620nm处有较强吸收，且其他多糖在此处无吸收，根据这一特性对功能多糖进行富集。
冻融-超声处理步骤为取小球藻藻泥，加入磷酸缓冲液，反复超声冻融1~4次，离心取上清液，超声功率为500W，每次超声作用时间为7min。利用超声波产生的空化作用、机械作用加速小球藻细胞壁的破碎，促进胞内物质的溶出，提高多糖的提取率。
磷酸缓冲液与藻泥质量比为16，缓冲液浓度为0.06mol/L，pH为7.5。功能多糖在上述磷酸缓冲液中的溶解度高，且能较好的保持功能多糖的活性。
去蛋白步骤为在上清液中加入3%的三氯乙酸溶液，直至不再出现白色沉淀，离心取上清液。三氯乙酸是一种有机酸，可以使溶液中的蛋白质变性沉淀。上述方法操作简单、结果稳定、反应温和，在除蛋白时能很好的保证多糖的活性。
透析并醇沉步骤为将上清液置于规格为400Da的透析袋中透析50h，加入4倍体积的乙醇，静置2h，离心取沉淀，低温干燥得到粗多糖。多糖溶液中加入乙醇，乙醇破坏多糖表面的水化层，大大降低多糖在水中的溶解度，起到分离提纯的效果，同时，多糖的活性未被破坏。
实施例2：
用于提高免疫力的球藻提取物的制备方法，包括以下步骤：
1）冻融-超声处理：取4g小球藻藻泥，加入60g磷酸缓冲液，反复超声冻融2次，在转速6000r/min条件下离心30min取上清液。超声功率为600W，每次超声作用时间为6min。磷酸缓冲液浓度为0.06mol/L，pH为7.5；
2）去蛋白：在上清液中加入3%的三氯乙酸溶液，直至不再出现白色沉淀，离心取上清液；
3）透析并醇沉：将上清液置于规格为300Da的透析袋中透析48h，加入3倍体积的乙醇，静置3h，离心取沉淀，在25℃，100KPa条件下干燥1h得到粗多糖粉末；
4）分离纯化：采用凝胶层析的方法对粗多糖进行分离纯化，洗脱液为溶有活性多肽的水溶液。活性多肽的含量为2g/L，活性多肽的氨基酸序列为SCASRCKSRCRACRRCKGYAAVSFGRCRCICKCFRC。凝胶层析洗脱流速为0.5mL/min，收集在620nm处有吸收的洗脱液，浓缩并冷冻干燥得到球藻提取物。小球藻提取物得率为6.718%，制备得到的多糖纯度高，可提高白细胞的变形运动速度，缩短白细胞从血液中到达病原体所在组织的时间；同时可提高白细胞的吞噬能力和分泌白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子等多种细胞因子的能力。长期服用上述多糖后，感冒频率下降，人体免疫力得到明显的提高，可用于保健品或药品。
实施例3：
用于提高免疫力的球藻提取物的制备方法，包括以下步骤：
1）冻融-超声处理：取6g小球藻藻泥，加入35g磷酸缓冲液，反复超声冻融2次，在转速6000r/min条件下离心30min取上清液。超声功率为800W，每次超声作用时间为4min。磷酸缓冲液浓度为0.06mol/L，pH为7.5；
2）去蛋白：在上清液中加入4%的三氯乙酸溶液，直至不再出现白色沉淀，离心取上清液；
3）透析并醇沉：将上清液置于规格为300Da的透析袋中透析48h，加入3倍体积的乙醇，静置3h，离心取沉淀，在30℃，200KPa条件下干燥1.5h得到粗多糖粉末；
4）分离纯化：采用凝胶层析的方法对粗多糖进行分离纯化，洗脱液为溶有活性多肽的水溶液。活性多肽的含量为2g/L，活性多肽的氨基酸序列为SCASRCKSRCRACRRCKGYAAVSFGRCRCICKCFRC。凝胶层析洗脱流速为0.5mL/min，收集在620nm处有吸收的洗脱液，浓缩并冷冻干燥得到球藻提取物。小球藻提取物得率为6.314%，制备得到的多糖纯度高，可提高白细胞的变形运动速度，缩短白细胞从血液中到达病原体所在组织的时间；同时可提高白细胞的吞噬能力和分泌白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子等多种细胞因子的能力。长期服用上述多糖后，感冒频率下降，人体免疫力得到明显的提高，可用于保健品或药品。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 磐安县派普特生物科技有限公司
<120> 用于提高免疫力的球藻提取物的制备方法
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Ser Cys Ala Ser Arg Cys Lys Ser Arg Cys Arg Ala Cys Arg Arg Cys
1 5 10 15
Lys Gly Tyr Ala Ala Val Ser Phe Gly Arg Cys Arg Cys Ile Cys Lys
20 25 30
Cys Phe Arg Cys
35

Claims (7)

1.用于提高免疫力的球藻提取物的制备方法，包括冻融-超声处理、去蛋白、透析并醇沉和分离纯化，其特征在于：所述的分离纯化步骤为采用凝胶层析的方法对粗多糖进行分离纯化，洗脱液为溶有活性多肽的水溶液。
2.根据权利要求1所述的用于提高免疫力的球藻提取物的制备方法，其特征在于：所述的活性多肽的含量为1~3g/L，活性多肽的氨基酸序列为SCASRCKSRCRACRRCKGYAAVSFGRCRCICKCFRC。
3.根据权利要求1所述的用于提高免疫力的球藻提取物的制备方法，其特征在于：所述的凝胶层析洗脱流速为0.2~0.7mL/min，收集在620nm处有吸收的洗脱液，浓缩并冷冻干燥得到球藻提取物。
4.根据权利要求1所述的用于提高免疫力的球藻提取物的制备方法，其特征在于：所述的冻融-超声处理步骤为取小球藻藻泥，加入磷酸缓冲液，反复超声冻融1~4次，离心取上清液，超声功率为400~700W，每次超声作用时间为4~7min。
5.根据权利要求4所述的用于提高免疫力的球藻提取物的制备方法，其特征在于：所述的磷酸缓冲液与藻泥质量比为12~18，缓冲液浓度为0.04~0.08mol/L，pH为7.0~8.5。
6.根据权利要求1所述的用于提高免疫力的球藻提取物的制备方法，其特征在于：所述的去蛋白步骤为在上清液中加入2~5%的三氯乙酸溶液，直至不再出现白色沉淀，离心取上清液。
7.根据权利要求1所述的用于提高免疫力的球藻提取物的制备方法，其特征在于：所述的透析并醇沉步骤为将上清液置于规格为200~400Da的透析袋中透析40~60h，加入2~5倍体积的乙醇，静置2~4h，离心取沉淀，低温干燥得到粗多糖。
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