CN101704887A - 基于珠母贝外套膜分泌物的珍珠质基质蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
基于珠母贝外套膜分泌物的珍珠质基质蛋白及其制备方法，该珍珠质基质蛋白有以下方法制得：将珠母贝外套膜的中心部分从贝体上分离，得到外套膜原料；将外套膜原料放入PBS溶液，低温下浸泡后，将得到的溶液离心分离，收集上清液，得到外套膜分泌液；将该外套膜分泌液超滤和透析除盐浓缩，得到浓缩液；将此浓缩液冷冻干燥，制得总的珍珠质基质蛋白，或，先制得总的珍珠质基质蛋白，然后，对其进行离子交换柱层析，收集280nm下有吸收峰的蛋白组分，再将该蛋白组分进行高效液相分离，收集280nm下有吸收峰的单一蛋白组分，将该单一蛋白组分干燥，制得单一珍珠质基质蛋白。本发明珍珠质基质蛋白无需经过脱钙处理，具有很高的生物活性。
Description
技术领域
本发明属于医学组织工程技术领域，涉及利用动物器官的生理功能获取的活性功能物质及其制备方法，具体涉及一种基于珠母贝外套膜分泌物的珍珠质基质蛋白，本发明还涉及该珍珠质基质蛋白的制备方法。
背景技术
合浦珠母贝(Pinctada fucata Martenssi)，又称马氏珠母贝，属于软体动物门(Mollusca)，瓣鳃纲(Bivalvia)，珍珠贝目(Pterioida)，珍珠贝科(Pteriidae)，珠母贝属(Pinctada)，主要分布在我国沿海，是目前世界上用于海水珍珠生产的主要贝类。珠母贝的珍珠层的珍珠质由其外套膜分泌，主要由95％以上的文石晶体(碳酸钙)和不到5％的有机基质组成，该有机基质-珍珠质基质主要由基质蛋白和多糖组成。珍珠质因为其致密的纳米结构和极高的强度成为可供移植的骨骼替代材料，研究者发现珍珠质与其他高分子材料相比，具有极高的生物兼容性，几乎不发生免疫反应。近期国内外的研究表明，珍珠质中具有诱导成骨作用的物质存在于其水溶性基质中，具有广泛的医学应用前景。但现有提取珍珠质的方法，主要以贝壳为原料，从贝壳中提取，由于贝壳中珍珠质的含量极低，限制了其大规模制备。同时，传统的提取方法中必不可少的脱钙处理损害了珍珠质中基质蛋白的生物活性，降低了其在医学上的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于珠母贝外套膜分泌物的珍珠质基质蛋白，具有诱导成骨的作用，并不发生免疫反应。
本发明的另一目的是提供一种上述珍珠质基质蛋白的制备方法，无需进行脱钙处理，避免了对珍珠质基质蛋白生物活性的损害，提高其在医学上的应用价值。
本发明所采用的技术方案是，一种基于珠母贝外套膜分泌物的珍珠质基质蛋白，该珍珠质基质蛋白采用以下步骤制备得到：
步骤1：将珠母贝外套膜的边缘深色带与中心部分分离，然后，将外套膜的中心部分从珠母贝的贝体上分离，得到外套膜原料；
步骤2：将步骤1中得到的外套膜原料放入PBS溶液中浸泡，在0℃～4℃的低温下，浸泡3小时～6小时，将得到的溶液以15000转每分钟的转速进行离心分离，收集离心分离的上清液，得到外套膜分泌液；
步骤3：将步骤2得到的外套膜分泌液进行超滤和透析除盐浓缩，得到浓缩液；
步骤4：将步骤3得到的浓缩液进行冷冻干燥，制得总的珍珠质基质蛋白，
或，先将步骤3得到的浓缩液进行冷冻干燥，制得总的珍珠质基质蛋白，然后，对该总的珍珠质基质蛋白进行离子交换柱层析，收集280nm下有吸收峰的蛋白组分，采用十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳分析收集的蛋白组分，再将该蛋白组分进行高效液相分离，并收集280nm下有吸收峰的单一蛋白组分，之后，将该单一蛋白组分进行冷冻干燥，制得单一珍珠质基质蛋白.
所述步骤2中PBS溶液的体积为外套膜原料体积的500倍～1000倍。
所述步骤3中浓缩液的截留分子量为3KD。
所述步骤4中进行离子交换柱层析时采用的填料为Sephadex G-75葡聚糖凝胶，流动相为Tris-HCl溶液。
所述步骤4中进行液相分离时采用的填料为C18颗粒，流动相为0％～100％之间梯度递增的乙腈水溶液。
本发明所采用的另一技术方案是，一种权利要求1所述珍珠质基质蛋白的制备方法，该方法具体按以下步骤进行：
步骤1：将珠母贝外套膜的边缘深色带与中心部分分离，然后，将外套膜的中心部分从珠母贝的贝体上分离，得到外套膜原料；
步骤2：将步骤1中得到的外套膜原料放入PBS溶液中浸泡，在0℃～4℃的低温下，浸泡3小时～6小时，将得到的溶液每分钟15000转的转速进行离心分离，收集离心分离的上清液，得到外套膜分泌液；
步骤3：将步骤2得到的外套膜分泌液进行超滤和透析除盐浓缩，得到浓缩液；
步骤4：将步骤3得到的浓缩液进行冷冻干燥，制得总的珍珠质基质蛋白，
或，先将步骤3得到的浓缩液进行冷冻干燥，制得总的珍珠质基质蛋白，然后，对该总的珍珠质基质蛋白进行离子交换柱层析，收集280nm下有吸收峰的蛋白组分，采用十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳分析收集的蛋白组分，再将该蛋白组分进行高效液相分离，并收集280nm下有吸收峰的单一蛋白组分，之后，将该单一蛋白组分进行冷冻干燥，制得单一珍珠质基质蛋白。
本发明方法具有如下优点：
1.直接从珠母贝外套膜的分泌液中富集珍珠质基质蛋白，程序简单，操作方便，生产成本很低。
2.能够得到大量的珍珠质基质蛋白，适合规模化生产。
3.制得的蛋白纯度高，为特异地参与珍珠层形成的蛋白，传统的提取方法混有棱柱层和角质层的杂质蛋白。
4.制得的珍珠质基质蛋白为刚分泌的未执行生物矿化功能的纯天然蛋白，且在制备过程中没有酸碱及EDTA的脱钙处理。
5.得到的蛋白生物活性很高，利于其在医学上直接或进一步的应用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明的珍珠质基质蛋白是通过一定的方法直接从珠母贝外套膜的分泌液中制得，富集珍珠质基质蛋白，蛋白纯度高，能够规模化生产，该珍珠质通过以下步骤制得：
步骤1：用剪刀将合浦珠母贝外套膜的边缘深色带与中心部分分离，丢弃该边缘深色带，然后，将外套膜的中心部分从珠母贝的贝体上分离，得到外套膜原料；
步骤2：将步骤1中得到的外套膜原料放入PBS溶液中浸泡，控制该PBS溶液的体积为外套膜原料体积的500～1000倍，在0～4℃的低温下，浸泡3～6小时，在浸泡过程中，用玻棒搅拌两次，将外套膜原料取出，将得到的溶液以每分钟15000转的转速进行离心分离，收集离心分离的上清液，得到外套膜分泌液；
步骤3：将步骤2得到的外套膜分泌液进行超滤和透析除盐浓缩，得到截留分子量为3KD的浓缩液；
步骤4：将步骤3得到的浓缩液采用常规方法进行冷冻干燥，制得总的珍珠质基质蛋白，
或，先将步骤3得到的浓缩液采用常规方法进行冷冻干燥，制得总的珍珠质基质蛋白，然后，采用Sephadex G-75葡聚糖凝胶为填料，Tris-HCl溶液为流动相，对该总的珍珠质基质蛋白进行离子交换柱层析，收集280nm下有吸收峰的蛋白组分，采用十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析收集的蛋白组分，采用C18颗粒为填料，0％～100％之间梯度递增的乙腈水溶液为流动相，将该蛋白组分进行高效液分离，并收集280nm下有吸收峰的单一蛋白组分，之后，将该单一蛋白组分进行冷冻干燥，制得单一珍珠质基质蛋白。
采用十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析上述制得的珍珠质基质蛋白，分析结果表明所得珍珠质基质蛋白的分子量为40KD。该珍珠质基质蛋白无需经过脱钙处理，因此，具有很高的生物活性，可广泛应用于制备预防和治疗骨质疏松的药物，制备医用生物新材料，并可用于珍珠和类珍珠材料的体外培养及提高珍珠产量与质量等领域。
本发明的珍珠质基质蛋白是利用外套膜的中心部分参与贝壳珍珠层形成的生物功能制备的天然蛋白。
本发明还提供了一种上述珍珠质基质蛋白的制备方法，具体按以下步骤进行：
步骤1：用剪刀将合浦珠母贝外套膜的边缘深色带与中心部分分离，丢弃该边缘深色带，然后，将外套膜的中心部分从珠母贝的贝体上分离，得到外套膜原料；
步骤2：将步骤1中得到的外套膜原料放入PBS溶液中浸泡，控制该PBS溶液的体积为外套膜原料体积的500～1000倍，在0～4℃的低温下，浸泡3～6小时，在浸泡过程中，用玻棒搅拌两次，将外套膜原料取出，将得到的溶液以每分钟15000转的转速进行离心分离，收集离心分离的上清液，得到外套膜分泌液；
步骤3：将步骤2得到的外套膜分泌液进行超滤和透析除盐浓缩，得到截留分子量为3KD的浓缩液；
步骤4：将步骤3得到的浓缩液采用常规方法进行冷冻干燥，制得总的珍珠质基质蛋白，
或，先将步骤3得到的浓缩液采用常规方法进行冷冻干燥，制得总的珍珠质基质蛋白，然后，采用Sephadex G-75葡聚糖凝胶为填料，Tris-HCl溶液为流动相，对该总的珍珠质基质蛋白进行离子交换柱层析，收集280nm下有吸收峰的蛋白组分，采用十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析收集的蛋白组分，再采用C18颗粒为填料，0％～100％之间梯度递增的乙腈水溶液为流动相，将该蛋白组分进行高效相分离，并收集280nm下有吸收峰的单一蛋白组分，之后，将该单一蛋白组分进行冷冻干燥，制得单一珍珠质基质蛋白。
实施例1
用剪刀将合浦珠母贝外套膜的边缘深色带与中心部分分离，丢弃该边缘深色带，然后，将外套膜的中心部分从珠母贝的贝体上分离，得到外套膜原料；将得到的外套膜原料放入PBS溶液中，控制该PBS溶液的体积为外套膜中心部分体积的500倍，在0℃的低温下，浸泡6小时，在浸泡过程中，用玻棒搅拌两次，每次两分钟。之后，将外套膜原料取出，将浸泡得到的溶液进行离心分离，收集离心分离的上清液，得到外套膜分泌液；将该外套膜分泌液进行超滤和透析除盐浓缩，得到截留分子量为3KD的浓缩液；将得到的浓缩液冷冻干燥，制得总的珍珠质基质蛋白。
实施例2
用剪刀将合浦珠母贝外套膜的边缘深色带与中心部分分离，丢弃该边缘深色带，然后，将外套膜的中心部分从珠母贝的贝体上分离，得到外套膜原料；将得到的外套膜原料放入PBS溶液中，控制该PBS溶液的体积为外套膜中心部分体积的1000倍，在4℃的低温下，浸泡3小时，在浸泡过程中，用玻棒搅拌两次，每次两分钟，每次将外套膜原料取出，将得到的溶液进行离心分离，收集离心分离的上清液，得到外套膜分泌液；将该外套膜分泌液进行超滤和透析除盐浓缩，得到截留分子量为3KD的浓缩液；将该浓缩液进行冷冻干燥，制得总的珍珠质基质蛋白，然后，采用Sephadex G-75葡聚糖凝胶为填料，Tris-HCl溶液为流动相，对该总的珍珠质基质蛋白进行离子交换柱层析，收集280nm下有吸收峰的蛋白组分，采用十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析收集的蛋白组分，再采用C18颗粒为填料，0％～100％之间梯度递增的乙腈水溶液为流动相，将该蛋白组分进行高效液相分离，并收集280nm下有吸收峰的单一蛋白组分，之后，将该单一蛋白组分进行冷冻干燥，制得单一珍珠质基质蛋白。
实施例3
用剪刀将合浦珠母贝外套膜的边缘深色带与中心部分分离，丢弃该边缘深色带，然后，将外套膜的中心部分从珠母贝的贝体上分离，得到外套膜原料；将得到的外套膜原料放入PBS溶液中，控制该PBS溶液的体积为外套膜中心部分体积的750倍，在2℃的低温下，浸泡4.5小时，在浸泡过程中，用玻棒搅拌两次，每次两分钟，将外套膜原料取出，将得到的溶液进行离心分离，收集离心分离的上清液，得到外套膜分泌液；将该外套膜分泌液进行超滤和透析除盐浓缩，得到截留分子量为3KD的浓缩液；将该浓缩液进行冷冻干燥，制得总的珍珠质基质蛋白，然后，采用Sephadex G-75葡聚糖凝胶为填料，Tris-HCl溶液为流动相，对该总的珍珠质基质蛋白进行离子交换柱层析，收集280nm下有吸收峰的蛋白组分，采用十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析收集的蛋白组分，再采用C18颗粒为填料，0％～100％之间梯度递增的乙腈水溶液为流动相，将该蛋白组分进行高效液相分离，并收集280nm下有吸收峰的单一蛋白组分，之后，将该单一蛋白组分进行冷冻干燥，制得单一珍珠质基质蛋白。
Claims (10)
1.一种基于珠母贝外套膜分泌物的珍珠质基质蛋白，其特征在于，该珍珠质基质蛋白采用以下步骤制备得到：
步骤1：将珠母贝外套膜的边缘深色带与中心部分分离，然后，将外套膜的中心部分从珠母贝的贝体上分离，得到外套膜原料；
步骤2：将步骤1中得到的外套膜原料放入PBS溶液中浸泡，在0℃～4℃的低温下，浸泡3小时～6小时，将得到的溶液以15000转每分钟的转速进行离心分离，收集离心分离的上清液，得到外套膜分泌液；
步骤3：将步骤2得到的外套膜分泌液进行超滤和透析除盐浓缩，得到浓缩液；
步骤4：将步骤3得到的浓缩液进行冷冻干燥，制得总的珍珠质基质蛋白，
或，先将步骤3得到的浓缩液进行冷冻干燥，制得总的珍珠质基质蛋白，然后，对该总的珍珠质基质蛋白进行离子交换柱层析，收集280nm下有吸收峰的蛋白组分，采用十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳分析收集的蛋白组分，再将该蛋白组分进行高效液相分离，并收集280nm下有吸收峰的单一蛋白组分，之后，将该单一蛋白组分进行冷冻干燥，制得单一珍珠质基质蛋白。
2.按照权利要求1所述的珍珠质基质蛋白，其特征在于，所述步骤2中PBS溶液的体积为外套膜原料体积的500倍～1000倍。
3.按照权利要求1所述的珍珠质基质蛋白，其特征在于，所述步骤3中浓缩液的截留分子量为3KD。
4.按照权利要求1所述的珍珠质基质蛋白，其特征在于，所述步骤4中进行离子交换柱层析时采用的填料为Sephadex G-75葡聚糖凝胶，流动相为Tris-HCl溶液。
5.按照权利要求1所述的珍珠质基质蛋白，其特征在于，所述步骤4中进行液相分离时采用的填料为C18颗粒，流动相为0％～100％之间梯度递增的乙腈水溶液。
6.一种权利要求1所述珍珠质基质蛋白的制备方法，其特征在于，该方法具体按以下步骤进行：
步骤1：将珠母贝外套膜的边缘深色带与中心部分分离，然后，将外套膜的中心部分从珠母贝的贝体上分离，得到外套膜原料；
步骤2：将步骤1中得到的外套膜原料放入PBS溶液中浸泡，在0℃～4℃的低温下，浸泡3小时～6小时，将得到的溶液每分钟15000转的转速进行离心分离，收集离心分离的上清液，得到外套膜分泌液；
步骤3：将步骤2得到的外套膜分泌液进行超滤和透析除盐浓缩，得到浓缩液；
步骤4：将步骤3得到的浓缩液进行冷冻干燥，制得总的珍珠质基质蛋白，
或，先将步骤3得到的浓缩液进行冷冻干燥，制得总的珍珠质基质蛋白，然后，对该总的珍珠质基质蛋白进行离子交换柱层析，收集280nm下有吸收峰的蛋白组分，采用十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳分析收集的蛋白组分，再将该蛋白组分进行高效液相分离，并收集280nm下有吸收峰的单一蛋白组分，之后，将该单一蛋白组分进行冷冻干燥，制得单一珍珠质基质蛋白。
7.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中PBS溶液的体积为外套膜原料体积的500倍～1000倍。
8.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中浓缩液的截留分子量为3KD.
9.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4中进行离子交换柱层析时采用的填料为Sephadex G-75葡聚糖凝胶，流动相为Tris-HCl溶液。
10.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4中进行液相分离时采用的填料为C18颗粒，流动相为0％～100％之间梯度递增的乙腈水溶液。
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