CN109553674A - 贝壳珍珠层基质蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

贝壳珍珠层基质蛋白及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及贝壳珍珠层基质蛋白及其制备方法和用途，一种珍珠层基质蛋白的制备方法，其包括如下步骤:1)取贝类珍珠层粉碎成粉末,所述粉末的直径小于100μm；2)将贝类珍珠层粉末在钙离子螯合剂溶液中溶解；3)去除钙离子螯合剂溶液未溶解的不溶物；4)将贝类珍珠层粉末溶液进行浓缩后透析去除小分子杂质,所述透析液为水；5)将透析保留液浓缩干燥后得到珍珠层基质蛋白。还公开了本发明所述的珍珠层基质蛋白在制备治疗或预防骨代谢疾病中的药物中的用途。进一步地，所述骨代谢疾病为骨质疏松症、佩吉特病(Paget)、成骨不全、骨纤维发育不良、磷酸酶过少症以及恶性肿瘤的体液性高钙血症及多发性骨髓瘤诱导的骨质溶解。

Description

贝壳珍珠层基质蛋白及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及贝壳珍珠层蛋白及其制备方法和用途。
背景技术
骨质疏松症是一种由多种因素产生的慢性病变过程，其治疗效果比较缓慢，带给患者带来极大的生活不便，以及生理与心理上的双重痛苦。我国现有骨质疏松症患者约8400万，预计到2050年患者人数将高达2亿。在治疗骨质疏松时，需要抑制骨吸收因子和促进骨形成的因子同时作用才能起到更好的治疗效果。目前治疗骨质疏松症的相关药物虽然种类繁多，但是普遍具有一定的副作用，作为预防措施使用时不能长期服用，因此寻找副作用小、可以长期服用的能够预防骨质疏松的生物活性物质已经成为重要的研究方向。
珍珠质历来被中医视为珍贵的药材，作为药用和美容已有悠久的历史。珍珠质具有安神定惊、清热益阴、明目解毒、消炎生津、止咳祛痰的功能，适用于胃及十二指肠溃疡、失眠、神经衰弱、肝炎、咽喉肿痛等症状，对高血压、癫痫、风湿性心脏病等有一定疗效，现已制成小儿回春丹、六神丸、复方哮喘散等20余种中成药，但其治疗骨质疏松的功效还没有被开发出来。贝壳珍珠层粉与珍珠质成分相同，价格低廉，应用前景广阔。贝壳珍珠层粉蕴含丰富的具有抗骨质疏松活性的功效蛋白，且是优良的天然钙源。贝壳中可能含有抑制骨吸收和促进骨形成的生物活性因子，因此从贝壳中制备成骨诱导因子，不仅可以增加贝壳的综合利用价值，还可为新型抗骨质疏松药物的开发提供科学依据，具有十分重要的现实意义。
1989年，法国学者Lopes所在的课题组用珍珠质制成的牙齿植入口腔而获得启示，开始将珍珠质用于骨修复的研究中。随后，法国、瑞典、韩国和中国的学者先后以绵羊腰椎、股骨，大鼠股骨以及人和犬的上、下颌骨等为骨缺陷模型，也开展了珍珠质用于骨的移植和修复的实验研究，并取得了卓有成效的研究结果，但是珍珠质在骨质疏松方面的研究进展缓慢。
骨组织由高度结晶的磷酸钙和有机基质构成，在骨修复过程中，需要破骨细胞与成骨细胞的协同作用。骨吸收包括矿物溶解和有机基质降解，而骨形成包括新基质的形成和矿物沉积。骨形成不足或过量的骨吸收都会诱发骨病，特别是引发骨质疏松。值得注意的是，预防骨质疏松的药物需要同时包含抑制骨吸收和诱导骨形成的因子，贝壳珍珠层中的水溶基质可能就是较好的选择。
贝壳珍珠质具有良好的生物相容性、生物可降解性和潜在的骨传导特性，能够刺激、诱导骨组织的再生和新骨的形成，促使宿主骨的矿化程度提高。从珍珠质中提取的水溶性的有机基质成分中的基质蛋白(WSM)对不同类型的骨细胞作用有所不同。体外实验研究表明，WSM能促进成骨细胞的矿化，还能通过抑制组织蛋白酶的活性来减缓破骨细胞的活性，达到抑制骨吸收的作用。通过对比，单独碳酸钙溶液对骨质疏松几乎没有治疗效果，而WSM可加速成骨细胞的钙化，对成骨细胞的分化也有促进作用。WSM抑制骨髓细胞的增殖，而对于碱性磷酸酶的活性有较大的促进作用，这与BMP、TGF-β等骨生长因子的作用类似，表明水溶性基质蛋白可能包含一种或多种信号分子，能促进骨髓细胞向成骨分化。通过信号通路的分析，WSM的成骨与熟知的生长因子如BMP-2、骨钙素等作用不同。在骨修复过程中，需要破骨细胞的吸收与成骨细胞的成骨协同作用。实验表明，WSM的信号分子可能同时具有抑制破骨细胞活性和促进成骨细胞矿化的双重作用：一方面，珍珠层中的水溶基质通过抑制破骨细胞组织蛋白酶K的活性阻止骨吸收；另一方面，水溶基质通过激活c-Jun NH2-terminal kinase(JNK)和Fos-related antigen-1(Fra-1)的信号通路刺激成骨细胞的生物矿化形成新骨。目前为止，关于贝壳珍珠质WSM的研究并不多，WSM包含最少300种小分子量的分子，珍珠层的成骨因子很可能与小分子量的分子有关，它们可能更容易从珍珠层扩散到骨组织周围，有利于成骨。虽然贝壳中基质蛋白已经显示了作为骨质疏松治疗药物的潜在应用前景，但是其含量极低且水提法让大量有效活性因子流失，限制了其应用。
因为贝壳基质蛋白被封闭在贝壳内，而且通常与碳酸钙晶体结合在一起，晶体内部的基质蛋白与晶体之间存在较强的作用，所以将有机基质全部提取出来存在一定困难。目前，根据溶解贝壳碳酸钙方法主要有2种，分别是弱酸脱钙法和超纯水溶解法。弱酸脱钙法提取条件相对剧烈，蛋白质有可能被降解，活性成分丢失严重，而超纯水溶解法萃取蛋白的效率极低，持续时间较长，蛋白活性也容易丢失。
发明内容
本发明中采用的EDTA脱钙法，可以有效的溶解贝壳碳酸钙晶体，使晶体内部的基质蛋白大量释放出来，具有提取条件温和、持续时间短、基质蛋白浓度高等优点，且保证了贝壳基质蛋白的生物活性。按照本发明提取的贝壳基质蛋白生物活性高，能高效促进成骨细胞的矿化活性，且可以有效的治疗和缓解小鼠骨质疏松症状。
本发明一个方面提供了一种珍珠层基质蛋白的制备方法，其包括如下步骤:
1)取贝类珍珠层粉碎成粉末,所述粉末的直径小于250μm；
2)将贝类珍珠层粉末在钙离子螯合剂溶液中溶解；
3)去除钙离子螯合剂溶液未溶解的不溶物；
4)将贝类珍珠层粉末溶液进行浓缩后透析去除小分子杂质,所述的透析液为水；
5)将透析保留液浓缩干燥后得到珍珠层基质蛋白。
在本发明的技术方案中，步骤1)中粉末的直径小于200μm，优选为小于100μm，更优选为小于80μm。
在本发明的技术方案中，所述的钙离子螯合剂溶液的浓度为0.1-1M，pH值为7.5-8.5(8.0)。
在本发明的技术方案中，钙离子螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)和环己二胺四乙酸(CDTA)中的一种或多种，或其的钠盐或镁盐。
在本发明的技术方案中，步骤2)中溶解的时间为10-50小时，优选为20-40小时。
在本发明的技术方案中，贝类珍珠层是通过将贝类外部的棱柱层与角质层以机械方法去除获得，在去除贝类外部的棱柱层与角质层时不使用任何化学试剂处理。
在本发明的技术方案中，贝类选自具有珍珠层的任何贝类。
在本发明的技术方案中，所述的透析液中不含盐类，且pH值呈中性，优选为约6.5-7.5；更优选地，所述的透析液选自纯水。
本发明另一个方面提供了一种由本发明的制备方法获得的珍珠层基质蛋白。
在本发明中，所述的珍珠层基质蛋白分子量为14-97kd的混合蛋白。
在本发明中，所述的珍珠层基质蛋白主要为分子量为60kd左右的混合蛋白。
在本发明的实施方案中，所述的珍珠层基质蛋白由贝壳的珍珠层中获得，在本发明的一个实施方案中，所述的贝壳为合浦珠母贝。
本发明再一个方面提供了珍珠层基质蛋白在制备治疗或预防骨代谢疾病中的药物中的用途。
本发明再一个方面提供了珍珠层基质蛋白在治疗或预防骨代谢疾病中的药物中的用途。
在本发明的技术方案中，所述骨代谢疾病为骨生长或骨质的异常减少的相关疾病。
其中，包括骨质疏松症、佩吉特病(Paget)、成骨不全、骨纤维发育不良、磷酸酶过少症以及恶性肿瘤的体液性高钙血症及多发性骨髓瘤诱导的骨质溶解。
本发明再一个方面提供了一种提高骨密度和/或骨小梁的骨体积分数和/或骨小梁的数量的方法，所述方法为给予受试者珍珠层基质蛋白。
本发明再一个方面提供了珍珠层基质蛋白在制备提高骨密度和/或骨小梁的骨体积分数和/或骨小梁的数量的药物中的用途。
本发明再一个方面提供了一种提高促进成骨细胞的矿化活性的方法，所述方法为给予受试者珍珠层基质蛋白。
本发明再一个方面提供了珍珠层基质蛋白在制备提高促进成骨细胞的矿化活性的药物中的用途。
本发明再一个方面提供了一种用于骨代谢疾病的药物组合物，其中的活性成分为珍珠层基质蛋白。
在本发明的技术方案中，所述的药物组合物中还包含一种或多种药物辅料。
在本发明的技术方案中，所述的药物组合物中还包含一种或多种其它活性组分。
在本发明的技术方案中，所述药物组合物可以配制为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、粉剂、注射剂或液体剂的形式，但本发明不限于此。
有益效果
1、本发明提供了一种高效制备贝壳珍珠层基质蛋白的方法，条件吻合，收率以及纯度高。
2、本发明证明珍珠层基质蛋白提取物可以有效的治疗骨质疏松症状，可以有效的治疗骨质疏松症以及相关疾病。
附图说明
图1是贝壳珍珠层的分离和珍珠粉的制备流程。
图2是傅里叶变换红外光谱仪FTIR鉴定珍珠层粉末晶体晶型的结果图，珍珠层粉末是典型的文石特征峰，且无杂质，文石特征峰为700cm-1,712cm-1，858cm-1和1082cm-1。
图3是从珍珠层粉末中提取的EDTA可溶性基质蛋白的SDS-PAGE结果图，基质蛋白在97-14kDa区间都有分布，其中60kDa左右有一条丰度很高的蛋白条带。
图4是基质蛋白刺激成骨细胞MC3T3-E1的结果图，其中A是不同浓度的基质蛋白对MC3T3-E1活性的影响，显示对细胞无毒性；B是基质蛋白和贝壳蛋白刺激MC3T3-E1成骨分化，茜素红染色显示基质蛋白促进MC3T3-E1钙结节的形成，而贝壳蛋白没有促进作用。
图5是micro CT扫描分析基质蛋白治疗骨质疏松小鼠股骨的结果图。比较分析对照组(Sham组)、贝壳蛋白治疗组(OVX+Shell组)、骨质疏松组(OVX组)和基质蛋白治疗组(OVX+Protein组)小鼠股骨的骨参数指标：骨密度(BMD),骨体积分数(BV/TV)和骨小梁数量(Tb.N)，*，P＜0.05，**，P＜0.01，**，P＜0.001。
具体实施方式
以下列举具体实施例及药效学试验对本发明进行说明。实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1EDTA溶解珍珠层粉末实验
将合浦珠母贝在实验室适应培养一周后处死取其贝壳。随后用剪刀剪下贝壳边缘部分，剩余贝壳利用锉子使用机械方法，刮擦除去外部的棱柱层与角质层，即得贝壳珍珠层样品。EDTA溶解珍珠层粉末具体步骤如下：
①将制备好的珍珠层样品用高速粉碎机粉碎，用不同筛网筛选不同粒径的粉末(60目＝250μm，180目＝80μm)，分别获得粒径≤80μm、80μm＜粒径＜250μm、粒径≥250μm的粉末，珍珠层粉末进行FTIR光谱晶体鉴定；
②将珍珠层粉末放入0.5M EDTA(每10g粉末溶于100ml的0.5M EDTA中，pH8.0)搅动溶解观察溶解时间。
实施例2贝壳珍珠层基质蛋白的提取
贝壳来自广东深圳大亚湾海域的合浦珠母贝，在实验室适应培养一周后处死取其贝壳。随后用剪刀剪下贝壳边缘部分，剩余贝壳利用锉子使用机械方法，刮擦除去外部的棱柱层与角质层，即得贝壳珍珠层样品。EDTA可溶贝壳基质蛋白的提取具体步骤如下：
①将制备好的珍珠层样品用高速粉碎机碎成直径小于80μm的粉末，珍珠层粉末进行FTIR光谱晶体鉴定；
②将珍珠层粉末放入0.5M EDTA(10g/100ml)搅动溶解36h；
③4℃，13000rpm离心30min，此步骤重复2次，充分除去EDTA未溶解的杂质；
④将得到的上清使用Milipore 15ml 3KD超滤管进行浓缩，将溶液体积浓缩到十分之一。
⑤所得的溶液装入规格3.5KD透析袋，用超纯水透析12h，每隔2小时换水1次，然后对透析后的溶液再次使用Milipore 15ml 3KD超滤管进行超滤浓缩，将溶液体积浓缩到十分之一，再用冻干机冷冻干燥后得到蛋白粉末保存于－80℃冰箱，即得到珍珠层基质蛋白。
实施例3SDS-PAGE蛋白大小分布鉴定
①将蛋白质粉末用超纯水配制成3mg/ml的蛋白溶液，4℃，25000rpm离心15min，取上清，抽干上清；
②将抽干后的上清和沉淀合并，加入200μl有SDS L3、终浓度为1mM的PMSF、2mM的EDTA，混匀，置于冰上5min后，加入终浓度10mM DTT(PMSF、EDTA、DTT所加体积为蛋白液体积的1％)；
③冰上超声5min(工作5s，间隔5s，功率100W),4℃，25000rpm离心20min；
将上清转入新的1.5ml离心管中，将终浓度10mM DTT(蛋白液体积的1％)，56℃水浴1h；
④冷却至室温，加终浓度55mM IAM(蛋白液体积的1％)，暗室放置45min；
⑤4℃，25000rpm离心15min，上清即为上样蛋白质溶液；
⑥按照SDS-PAGE标准步骤跑胶分析(分离胶浓度为12％)。
实施例4贝壳蛋白的提取对比实验
贝壳来自广东深圳大亚湾海域的合浦珠母贝，在实验室适应培养一周后处死取其贝壳。随后用剪刀剪下贝壳边缘部分，剩余贝壳利用锉子使用机械方法，刮擦除去外部的棱柱层与角质层，同时用NaOH处理三天的贝壳，作为对照，即得贝壳珍珠层样品。贝壳质蛋白的提取具体步骤如下：
①将制备好的珍珠层样品用研磨机碎成直径高于200μm的粉末；
②将每10g珍珠层粉末放入100ml 0.5M EDTA(pH8.0)搅动溶解36h；
③4℃，13000rpm离心30min，此步骤重复2次，充分除去EDTA未溶解的杂质；
④将得到的上清使用Milipore 15ml 3KD超滤管进行浓缩，将溶液体积浓缩到十分之一。
⑤所得的溶液装入规格3.5KD透析袋，用Tris-Cl pH8.0透析12h，每隔2小时换透析液1次，然后对透析后的溶液再次使用Milipore 15ml 3KD超滤管进行超滤浓缩，将溶液体积浓缩到十分之一，再用冻干机冷冻干燥后得到蛋白粉末保存于－80℃冰箱，即得到珍珠层贝壳蛋白(shell)。
实施例5基质蛋白细胞矿化功能分析
①成骨细胞MC3T3-E1的培养：
成骨细胞MC3T3-E1的培养基为α-MEM(10％胎牛血清、100μg/ml Penicillin、100μg/ml Streptomycin)，将成骨细胞MC3T3-E1培养于37℃的培养箱中(5％CO2)，每3天更换一次培养基，7天传代一次。在96孔板中接种MC3T3-E1细胞悬液(100μl/孔)，向培养基中加入不同浓度的基质蛋白(5、10、15、30μg/ml)，孵育72h，每隔24h测定成骨细胞的活性。
②成骨细胞的活性的测定：
按照Dojindo Cell Counting Kit(CCK-8)细胞增殖试剂盒步骤测定细胞活性，向每孔加入10μl的CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育2h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
③茜素红染色分析钙结节：
成骨细胞MC3T3-E1在成骨诱导培养基(50μM维生素C、10mMβ-甘油磷酸、100nM地塞米松、30μg/ml贝壳蛋白或者30μg/ml基质蛋白)下培养21天，弃去培养基，细胞用PBS洗3次；室温用4％多聚甲醛固定30min；弃去固定液，用超纯水洗3次；加入茜素红染色(上海源叶生物，货号R20794)，室温孵育30min；弃去染色液，超纯水洗3次，拍照。
(4)基质蛋白的抗骨质疏松功能
①对照组(Sham组)：9周龄C57BL/6J野生型雌性小鼠从背部双侧切开，取卵巢周围部分脂肪垫，确保双侧卵巢完整且无损伤。小鼠伤口恢复5天后，腹腔注射100μl生理盐水，每隔3天注射一次，造模30天；
②骨质疏松组(OVX组)：9周龄C57BL/6J野生型雌性小鼠从背部双侧进行去卵巢手术，确保双侧卵巢去除干净。小鼠伤口恢复5天后，腹腔注射100μl生理盐水，每隔3天注射一次，造模30天；
③贝壳蛋白治疗组(OVX+Shell组)：9周龄C57BL/6J野生型雌性小鼠从背部双侧进行去卵巢手术，确保双侧卵巢去除干净。小鼠伤口恢复5天后，腹腔注射100μl浓度为4mg/ml贝壳蛋白，每隔3天注射一次，造模30天。
④基质蛋白治疗组(OVX+Protein组)：9周龄C57BL/6J野生型雌性小鼠从背部双侧进行去卵巢手术，确保双侧卵巢去除干净。小鼠伤口恢复5天后，腹腔注射100μl浓度为4mg/ml基质蛋白，每隔3天注射一次，造模30天。
在实验结束时断颈处死小鼠，取小鼠骨头70％乙醇固定用于CT分析。使用BRUKER公司SkyScan1176 MicroCT对小鼠骨头进行扫描，利用泡沫板固定骨头位置进行扫描。使用电压60kV,电流425μA，分辨率9μm条件进行CT扫描。扫描重建完成后，对股骨干骺端骨小梁进行结构分析。从股骨远端干骺端生长板消失处继续往下弃去50层后，选取200层作为骨小梁重建区域进行分析，使用MicroCT自带软件进行重建，阈值为80。主要分析指标包括骨密度(BMD),骨体积分数(BV/TV),骨小梁数量(Tb.N)三项指标。
结果
①贝壳珍珠层的分离、珍珠层粉末制备及晶型鉴定
本发明采用人工机械的方法从贝壳中分离出珍珠层，该珍珠层色彩斑斓(图1)，与珍珠颜色和光泽相似，机械分离未添加任何化学处理步骤，保证了珍珠层的生物活性。
采用高速粉碎机碎成不同直径溶解速度差异较大，而蛋白提取过程中处理时间直接影响了蛋白活性。通过观察可知珍珠层粉末粒径≤80μm的，在用EDTA溶解时，溶解时间为36小时，珍珠层粉末粒径为80μm＜粒径＜250μm，在用EDTA溶解时，溶解时间为50小时，粒径≥250μm的粉末溶解时间高于90小时。由实施例1的结果可知，直径小于80μm的粉末(图1)，该尺寸增加了珍珠层粉末颗粒物的表面积，有利于EDTA的高效螯合溶解，利用该方法制备的珍珠层粉末晶型鉴定全是文石，纯度达到100％(图2)。对比试验中粒径过大导致无法迅速溶解，和EDTA螯合效率也低。
②贝壳EDTA可溶性基质蛋白的分子大小分布情况
SDS-PAGE根据蛋白质的分子量大小的不同分开蛋白质，发明人利用EDTA溶解法提取的可溶性基质蛋白经过SDS-PAGE分析，图3结果显示在14-97kD区段均有分布不同大小分子量的基质蛋白，其中在60kDa左右有一条丰度很高的蛋白条带，本发明方法可以有效的分离提取到基质蛋白。
③贝壳基质蛋白生物活性鉴定及其治疗骨质疏松小鼠效果的评价
MC3T3-E1是一种小鼠胚胎成骨细胞前体细胞，可以用来筛选刺激成骨分化的生物活性物质。图4结果显示基质蛋白对MC3T3-E1细胞没有毒性，且能促进MC3T3-E1发生矿化，证明基质蛋白是一种有效的促进成骨因子。我们将基质蛋白腹腔注射到骨质疏松小鼠中，与骨质疏松小鼠相比，基质蛋白治疗组可以有效缓解小鼠骨质疏松症状，图5结果显示小鼠骨密度BMD、骨小梁的骨体积分数(BV/TV)和骨小梁的数量(Tb.N)均发生显著的升高。贝壳蛋白治疗组并没有有效缓解小鼠骨质疏松症状，结果显示小鼠骨密度BMD、骨小梁的骨体积分数(BV/TV)和骨小梁的数量(Tb.N)均没有变化。

Claims (10)

1.一种珍珠层基质蛋白的制备方法，其包括如下步骤:
1)取贝类珍珠层粉碎成粉末,所述粉末的直径小于250μm；
2)将贝类珍珠层粉末在钙离子螯合剂溶液中溶解；
3)去除钙离子螯合剂溶液未溶解的不溶物；
4)将贝类珍珠层粉末溶液进行浓缩后透析去除小分子杂质,所述透析液为水；
5)将透析保留液浓缩干燥后得到珍珠层基质蛋白；
优选地，所述钙离子螯合剂选自乙二胺四乙酸、乙二醇四乙酸、环己二胺四乙酸或其的钠盐或镁盐中的一种或多种的组合。
2.根据权利要求1所述的制备方法，步骤1)中粉末的直径小于200μm，优选为小于100μm，更优选为小于80μm。
3.根据权利要求1所述的制备方法，贝类珍珠层通过将贝类外部的棱柱层与角质层以机械方法去除获得。
4.由权利要求1-3任一项所述的的制备方法获得的珍珠层基质蛋白。
5.根据权利要求4所述的珍珠层基质蛋白为分子量为14-97kd的混合蛋白。
6.如权利要求4或5所述的珍珠层基质蛋白在制备治疗或预防骨代谢疾病中的药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其中骨代谢疾病为骨生长或骨质的异常减少的相关疾病；优选地，所述骨代谢疾病为骨质疏松症、佩吉特病(Paget)、成骨不全、骨纤维发育不良、磷酸酶过少症以及恶性肿瘤的体液性高钙血症及多发性骨髓瘤诱导的骨质溶解。
8.如权利要求4或5所述的珍珠层基质蛋白在制备提高骨密度和/或骨小梁的骨体积分数和/或骨小梁的数量的药物中的用途。
9.如权利要求4或5所述的珍珠层基质蛋白在制备提高促进成骨细胞的矿化活性的药物中的用途。
10.一种用于骨代谢疾病的药物组合物，其中的活性成分为权利要求1-3所述的珍珠层基质蛋白。
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