KR20230094887A - 신규 아사로이독사진 c 및 이를 포함하는 항암용 조성물 - Google Patents

신규 아사로이독사진 c 및 이를 포함하는 항암용 조성물 Download PDF

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서영혜
문병철
이아영
류승목
김효선
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Abstract

본 발명은 신규 아사로이독사진 C 화합물 및 이를 포함하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 화학식 1로 표시되는 아사로이독사진 C 화합물, 이의 이성질체 또는 약학적으로 허용 가능한 염; 이를 이용한 약학 조성물과 건강기능식품 조성물; 및 상기 화합물의 분리방법을 제공한다.

Description

신규 아사로이독사진 C 및 이를 포함하는 항암용 조성물 {Asaroidoxazine C and anticancer composition comprising the same}
본 발명은 신규 아사로이독사진 C (Asaroidoxazine C) 및 이를 포함하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 하기 화학식 1로 표시되는 아사로이독사진 C, 이의 이성질체 또는 약학적으로 허용 가능한 염; 이를 이용한 약학 조성물과 건강기능식품 조성물; 및 상기 아사로이독사진 C의 분리방법을 제공한다.
세신 (Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var. mandshuricum (Maxim.) Kitag.)은 쥐방울덩굴 (Aristolochiaceae)과에 속하며 한국, 중국, 일본 등 아시아에 주로 분포한다. 세신 (A. heterotropoides)의 뿌리와 근경은 일부 아시아 국가에서 기침, 두통, 치통, 아프타성 구내염, 염증, 국소 마취 및 류머티즘을 치료하기 위해 전통 의학에서 사용되어 왔다[R. Zhou, "Resource science of Chinese medicinal materials", China Medical and Pharmaceutical Sciences Press, Beijing (1993); J. Lee et al., "Bioactive compounds from the roots of Asiasarum heterotropoides", Molecules 19 (1) (2014) 122-138]. 이전의 약리학적 연구에서는 세신 추출물이 항통각, 항염증, 살비 (acaricidal) 및 살충 (larvicidal) 활성이 있는 것으로 보고되었다 [Y. Xu et al., "Assessment on anti-nociception and anti-inflammation pharmacodynamics of Asarum heterotropoides var. mandshuricum and Asarum sieboldii", China J. Chin. Mat. Med. 37 (5) (2012) 625-631; J.-R. Kim et al., "Acaricidal activity of Asarum heterotropoides root-derived compounds and hydrodistillate constitutes toward Dermanyssus gallinae (Mesostigmata: Dermanyssidae)", Exp. Appl. Acarol. 68 (4) (2016) 485-495; H. Perumalsamy et al., "Larvicidal activity of Asarum heterotropoides root constituents against insecticide-susceptible and-resistant Culex pipiens pallens and Aedes aegypti and Ochlerotatus togoi", J. Agric. Food Chem. 58 (18) (2010) 10001-10006.] 또한, 이 식물체의 에센셜 오일은 항균 및 탈취 활성을 나타내는 것으로 보고되었다 [J. Moon, et al., "Physicochemical characterization and deodorant activity of essential oil recovered from Asiasarum heterotropoides using supercritical carbon dioxide and organic solvents", J. Ind. Eng. Chem. 69 (2019) 217-224; Y. Dan et al., "Activities of essential oils from Asarum heterotropoides var. mandshuricum against five phytopathogens", Crop Prot. 29 (3) (2010) 295-299]. 세신에 대한 일부 식물화학적 조사는 항염증, 세포독성 및 항암과 같은 유용한 생물학적 효과를 갖는 다양한 유형의 리그난, 모노테르펜, 아미드, 플라바논, 페난트렌, 벤젠 유도체 및 휘발성 페닐프로펜의 존재를 밝혀냈다[J. Lee et al., Bioactive compounds from the roots of Asiasarum heterotropoides, Molecules 19 (1) (2014) 122-138; Y. Jing et al., Chemical constituents from the roots and rhizomes of Asarum heterotropoides var. mandshuricum and the in vitro anti-inflammatory activity, Molecules 22 (1) (2017) 125; Y. Jing et al., Phenanthrene derivatives from roots and rhizomes of Asarum heterotropoides var. mandshuricum, Fitoterapia 117 (2017) 101-108; Y. Wang et al., Toxic and Repellent Effects of Volatile Phenylpropenes from Asarum heterotropoides on Lasioderma serricorne and Liposcelis bostrychophila, Molecules 23 (9) (2018) 2131]. 그러나 전통적인 의학적 중요성과 생물학적 효과에도 불구하고 세신 및 관련 대사 산물의 항암 활성에 대한 연구는 여전히 부족한 상태이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 세신의 뿌리에서 신규한 아사로이독사진 (Asaroidoxazine) 화합물을 분리하고, 이의 인간 암 세포주에 대한 억제 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 세신 뿌리로부터 분리한 신규 화합물, 이를 이용한 항암용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 세신 뿌리 분획물을 이용한 항암용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 세신 뿌리로부터 신규 화합물을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 아사로이독사진 C (Asaroidoxazine C), 이의 이성질체 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00001
.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 이성질체는 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 거울상 이성질체의 혼합물 또는 부분입체 이성질체의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 아사로이독사진 C는 쥐방울덩굴과 (Aristolochiaceae) 족도리풀속(genus Asarum)에 속하는 동속근연종으로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 쥐방울덩굴과 (Aristolochiaceae) 족도리풀속(genus Asarum)에 속하는 동속근연종은 세신 (Asarum heterotropoides) 뿌리일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 아사로이독사진 C, 이의 이성질체 또는 약학적으로 허용 가능한 염은 암세포 억제 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 화합물, 이의 이성질체 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물; 및 전술한 화합물, 이의 이성질체 또는 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 아사로이독사진 C, 이의 이성질체, 약학적으로 허용 가능한 염 또는 식품학적으로 허용 가능한 염은 암을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 것일 수 있다.
추가로, 본 발명은 (a) 세신 뿌리를 에탄올 용매로 추출하여 세신 뿌리 에탄올 추출물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 세신 뿌리 에탄올 추출물을 헥산, 에틸아세테이트 및 물 순서로 계통 분획하여 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계를 수행하여 수득되는, 세신 (Asarum heterotropoides) 뿌리 분획물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 세신 뿌리 분획물은 하기 화학식 1로 표시되는 아사로이독사진 C (Asaroidoxazine C), 하기 화학식 2로 표시되는 아리스톨록사진 C (Aristoloxazine C) 및 하기 화학식 3으로 표시되는 아사로이독사진 B (Asaroidoxazine B)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00002
,
[화학식 2]
Figure pat00003
,
[화학식 3]
Figure pat00004
.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 쥐방울덩굴과 (Aristolochiaceae) 족도리풀속(genus Asarum)에 속하는 동속근연종으로부터 상기 화학식 1로 표시되는 아사로이독사진 C (Asaroidoxazine C)를 분리하는 방법을 제공한다:
(a) 쥐방울덩굴과 (Aristolochiaceae) 족도리풀속(genus Asarum)에 속하는 동속근연종을 에탄올 용매로 추출하여 에탄올 추출물을 수득하는 단계;
(b) 상기 에탄올 추출물을 헥산, 에틸아세테이트 및 물 순서로 계통 분획하여 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계;
(c) 상기 에틸아세테이트 분획물을 물-메탄올 혼합액을 유출 용매로 하여 플래시 크로마토그래피를 수행하여 분획물을 수득하는 단계; 및
(d) 컬럼 크로마토그래피를 수행한 후 수득된 분획물을 물-아세토니트릴 혼합액을 유출 용매로 하여 반분취 크로마토그래피를 수행하여 상기 아사로이독사진 C를 정제하는 단계.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 쥐방울덩굴과 (Aristolochiaceae) 족도리풀속(genus Asarum)에 속하는 동속근연종은 세신 (Asarum heterotropoides) 뿌리일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 (a) 단계의 에탄올 용매는 50 내지 90% 에탄올 용매일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 (c) 단계의 물-메탄올 혼합액은 6:4에서 1:9의 농도 구배로 적용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 (d) 단계의 물-아세토니트릴 혼합액은 6.5:3.5 내지 5.5:4.5의 농도 구배로 적용될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 아사로이독사진 C는 기존 항암제인 5-FU에 비해 현저히 낮은 농도에서도 우수한 항암 활성을 나타내는 바, 암의 예방, 개선 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있으며, 과량의 사용에 따른 부작용을 방지할 수 있다. 또한, 본 발명에서 제공되는 세신 뿌리 분획물은 아사로이독사진 C 뿐만 아니라, 아리스톨록사진 C 및 아사로이독사진 B를 포함하며, 아리스톨록사진 C 및 아사로이독사진 B도 기존 항암제인 5-FU에 비해 현저히 낮은 농도에서도 우수한 항암 활성을 나타내는 바, 세신 뿌리 분획물 또한 항암제로서의 활용 가치가 높다.
도 1은 세신으로부터 분리된 화합물 1-3 (화합물 1: 아리스톨록사진 C, 화합물 2: 아사로이독사진 B, 화합물 3: 아사로이독사진 C)의 화학 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 화합물 3 (아사로이독사진 C)의 주요 HMBC (→) 상관관계를 나타낸 것이다.
도 3은 화합물 2 (아사로이독사진 B)의 X선 ORTEP 도면을 나타낸 것이다.
도 4는 화합물 1-3의 계산적 및 실험적 ECD 스펙트럼을 나타낸 것으로, 순서대로 (A)는 화합물 1 (아리스톨록사진 C), (B)는 화합물 2 (아사로이독사진 B), (C)는 화합물 3 (아사로이독사진 C)을 나타낸다.
도 5는 화합물 3 (아사로이독사진 C)의 HRESIMS 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6은 화합물 3 (아사로이독사진 C)의 1H NMR 스펙트럼 (600 MHz, 메탄올-d 4)을 나타낸 것이다.
도 7은 화합물 3 (아사로이독사진 C)의 13C NMR 스펙트럼 (150 MHz, 메탄올-d 4)을 나타낸 것이다.
도 8은 화합물 3 (아사로이독사진 C)의 HSQC 스펙트럼 (600 MHz, 메탄올-d 4)을 나타낸 것이다.
도 9는 화합물 3 (아사로이독사진 C)의 HMBC 스펙트럼 (600 MHz, 메탄올-d 4)을 나타낸 것이다.
도 10a 내지 10i는 다양한 암세포주에 대한 화합물 1 내지 3 (화합물 1: 아리스톨록사진 C, 화합물 2: 아사로이독사진 B, 화합물 3: 아사로이독사진 C)의 세포 증식 억제 효과를 MTT 어세이로 측정한 결과를 나타낸 것으로, 도 10a는 인간 흑색종 세포, 도 10b는 인간 비흑색종 피부암 세포, 도 10c는 인간 전립선암 세포, 도 10d는 인간 폐암 세포, 도 10e는 인간 섬유육종 세포, 도 10f는 인간 난소암 세포, 도 10g는 인간 대장암 세포, 도 10h는 인간 위암 세포 및 도 10i는 인간 간암 세포에 대한 세포 증식 억제 효과를 보여준다.
이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
상술한 바와 같이, 본 발명자들은 세신의 뿌리에서 신규한 아사로이독사진 화합물을 분리하고, 이의 인간 암 세포주에 대한 우수한 억제 효과를 확인하였다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은 신규 아사로이독사진 화합물로서, 하기 화학식 1로 표시되는 아사로이독사진 C (Asaroidoxazine C), 이의 이성질체 또는 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다:
[화학식 1]
Figure pat00005
.
본 발명에서 정의되는 상기 세신은 족도리풀 (Asarum heterotropoides Fr. mandshuricum), 민족도리풀 (Asarum sieboldi Miq), 또는 섬족도리풀 (Asarum maculatum)일 수 있고, 바람직하게는 족도리풀 (Asarum heterotropoides Fr. mandshuricum)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 이성질체는 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 거울상 이성질체의 혼합물 또는 부분입체 이성질체의 혼합물을 포함할 수 있으나, 이로 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 아사로이독사진 C는 쥐방울덩굴과 (Aristolochiaceae) 족도리풀속(genus Asarum)에 속하는 동속근연종으로부터 분리될 수 있다. 바람직하게는 상기 아사로이독사진 C는 세신 (Asarum heterotropoides) 뿌리로부터 분리될 수 있다. 상기 쥐방울덩굴과 (Aristolochiaceae) 족도리풀속(genus Asarum)에 속하는 동속근연종은 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나, 자연에서 채취 또는 재배된 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 세신 뿌리로부터 아사로이독사진 C를 분리하여 이의 항암 활성을 확인하였다. 그 결과, 표 2, 도 10a 및 도 10h에서 확인되는 바와 같이 아사로이독사진 C는 인간 흑색종 및 위암 세포의 증식 억제 활성을 나타냈다. 특히, 나노몰 (nM) 수준에서도 세포 증식 억제 효과를 나타내어 마이크로몰 (μM) 수준에서 효과를 나타내는 양성 대조군 5-FU에 비해 현저히 우수한 항암 활성을 가지는 것으로 확인되었다.
이에 따라, 본 발명의 제2 측면은 상기 화학식 1로 표시되는 아사로이독사진 C, 이의 이성질체 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물 및 상기 화학식 1로 표시되는 아사로이독사진 C, 이의 이성질체 또는 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약학 및 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 화합물, 이의 이성질체, 약학적으로 허용 가능한 염 또는 식품학적으로 허용 가능한 염은 암을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 용도로 사용될 수 있다.
상기 암은, 예를 들어, 흑색종, 비흑색종 피부암 (예를 들어, 편평상피세포암), 유방암, 두경부암, 갑상선암, 섬유육종, 연부조직육종, 골육종, 고환암, 전립선암, 난소암, 방광암, 피부암, 뇌암, 혈관육종, 비만세포종, 백혈병, 림프종, 간암, 폐암, 췌장암, 위암, 신장암, 대장암, 조혈 종양, 신경 모세포종, 표피암종 또는 이의 전이암일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 제3 측면은 세신 (Asarum heterotropoides) 뿌리 분획물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
전술한 아사로이독사진 C는 세신 뿌리로부터 분리되므로, 이를 포함하는 세신 뿌리 추출물 또는 분획물 또한 암 예방, 개선 또는 치료에 활용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "추출물"은 상기 세신 뿌리의 추출처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. 상기 추출물은 세신의 천연, 잡종 또는 변종 식물로부터 추출될 수 있고, 식물 조직 배양물로부터도 추출이 가능하다.
상기 추출물은 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로리드, 에틸아세테이트, 아세톤, C1 내지 C4의 저급 알코올, 물 또는 이들의 혼합 용매를 추출 용매로 하여 제조될 수 있고, 바람직하게는 C1 내지 C4의 저급 알코올, 물 또는 이들의 혼합 용매를 추출 용매로 하여 제조될 수 있으나, 이로 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물에 있어서, 세신 추출물은 상기 추출 용매를 사용하여 건조된 세신 뿌리를 1회 이상 추출하여 제조될 수 있으며, 상기 용매 추출물을 감압농축한 후 동결 건조 또는 분무 건조하여 얻은 건조 추출물로 제조할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 세신 뿌리 분획물로부터 상기 화학식 1로 표시되는 아사로이독사진 C (Asaroidoxazine C) 뿐만 아니라, 상기 화학식 2로 표시되는 아리스톨록사진 C (Aristoloxazine C) 및 상기 화학식 3으로 표시되는 아사로이독사진 B (Asaroidoxazine B)를 분리하였고, 이들의 항암 활성을 확인하였다. 그 결과, 표 2, 도 10a 내지 도 10d, 도 10g 및 도 10h에서 확인되는 바와 같이, 아리스톨록사진 C는 인간 흑색종, 비흑색종 피부암, 전립선암, 폐암, 섬유육종, 난소암, 대장암, 위암 및 간암 세포의 증식 억제 활성을 나타내었다. 또한, 표 2 및 도 10a 내지 도 10i에서 확인되는 바와 같이 아사로이독사진 B는 인간 흑색종, 비흑색종 피부암, 전립선암, 폐암, 대장암 및 위암 세포의 증식 억제 활성을 나타냈다. 특히, 아리스톨록사진 C 및 아사로이독사진 B 또한 나노몰 (nM) 수준에서도 세포 증식 억제 효과를 나타내어, 마이크로몰 (μM) 수준에서 효과를 나타내는 양성 대조군 5-FU에 비해 현저히 우수한 항암 활성을 가지는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명의 조성물에 포함되는 세신 뿌리 분획물은 아사로이독사진 C, 아리스톨록사진 C 및 아사로이독사진 B를 포함하는 형태로 제조될 수 있다.
예를 들어, 상기 3종의 화합물을 포함하는 세신 뿌리 분획물은 (a) 세신 뿌리를 에탄올 용매로 추출하여 세신 뿌리 에탄올 추출물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 세신 뿌리 에탄올 추출물을 헥산, 에틸아세테이트 및 물 순서로 계통 분획하여 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계를 수행하여 수득될 수 있으나, 이로 한정되지 않는다. 상기 (a) 단계에서, 에탄올 용매는 50 내지 90% 에탄올, 바람직하게는 60 내지 80% 에탄올, 가장 바람직하게는 65 내지 75% 에탄올 용매일 수 있다. 에탄올 이외의 다른 용매를 사용하는 경우, 상기 3종의 화합물 함량이 급격하게 감소하여, 의도한 항암 활성이 나타나지 않을 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 용어 "예방"은 질병 또는 병증의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에 있어서는 암의 발병 시기를 지연시키거나, 발병을 억제하는 것을 의미한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 용어 "개선"은 질병 또는 병증 상태를 호전 또는 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미하는 것으로, 본 발명에 있어서는 암의 증상을 호전시키는 것을 의미한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 용어 "치료"는 질병 또는 병증의 진행을 지연, 중단 또는 역전시키는 모든 행위를 의미하는 것으로, 본 발명에 있어서는 암의 증상을 경감, 완화 또는 없애거나, 역전시키는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"이란, 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 화학식 1의 화합물의 이로운 효능을 떨어뜨리지 않는 화학식 1의 화합물의 어떠한 유기 또는 무기 부가염을 의미한다. 이들 염은 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 질산, 황산, 과염소산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 아스파르트산, 옥살산, (D) 또는 (L) 말산, 말레산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 4-톨루엔술폰산, 살리실산, 시트르산, 벤조산 또는 말론산 등을 사용할 수 있다. 또한, 이들 염은 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등) 및 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염 등) 등을 포함한다. 예를 들면, 산부가염으로는 아세테이트, 아스파테이트, 벤즈에이트, 베실레이트, 바이카보네이트/카보네이트, 바이설페이트/설페이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 에디실레이트, 에실레이트, 포메이트, 퓨마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루큐로네이트, 헥사플루오로포스페이트, 하이벤제이트, 하이드로클로라이드/클로라이드, 하이드로브로마이드/브로마이드, 하이드로요오디드/요오디드, 이세티오네이트, 락테이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 나프틸레이트, 2-나프실레이트, 니코티네이트, 나이트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/수소 포스페이트/이수소 포스페이트, 사카레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 토실레이트, 트리플루오로아세테이트, 알루미늄, 알기닌, 벤자틴, 칼슘, 콜린, 디에틸아민, 디올아민, 글라이신, 라이신, 마그네슘, 메글루민, 올아민, 칼륨, 나트륨, 트로메타민, 아연염 등이 포함될 수 있으며, 이들 중 하이드로클로라이드 또는 트리플루오로아세테이트일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은, 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 약학 조성물은, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있고, 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들어, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되고, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 제한되지 않으나, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분 한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 통상적인 1일 투여량은 당업자가 적절하게 선택할 수 있으며, 1회 또는 수 회로 나누어 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물을 매일 투여 또는 간헐적으로 투여해도 좋고, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 2~3회로 나누어 투여하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 다른 약물 치료와 병용하여 사용할 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란, 암이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물에 포함될 수 있는 필수 성분으로 아사로이독사진 C 및/또는 전술한 세신 뿌리 분획물을 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 특별히 제한이 없으며, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약추출물, 식품 보조 첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
또한, 상기 식품 보조 첨가제는 당업계에 통상적인 식품 보조 첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함한다.
상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외에 향미제로서 천연 향미제(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 건강보조식품은 건강기능식품 및 건강식품 등을 포함한다.
상기 건강기능(성)식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.
본 발명의 제4 측면은 다음의 단계를 포함하는, 세신 (Asarum heterotropoides) 뿌리로부터 상기 화학식 1로 표시되는 아사로이독사진 C (Asaroidoxazine C)를 분리하는 방법에 관한 것이다:
(a) 세신 뿌리를 에탄올 용매로 추출하여 세신 뿌리 에탄올 추출물을 수득하는 단계;
(b) 상기 세신 뿌리 에탄올 추출물을 헥산, 에틸아세테이트 및 물 순서로 계통 분획하여 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계;
(c) 상기 에틸아세테이트 분획물을 물-메탄올 혼합액을 유출 용매로 하여 플래시 크로마토그래피를 수행하여 분획물을 수득하는 단계; 및
(d) 플래시 크로마토그래피를 수행한 후 수득된 분획물을 물-아세토니트릴 혼합액을 유출 용매로 하여 반분취 크로마토그래피를 수행하여 상기 아사로이독사진 C (Asaroidoxazine C)를 정제하는 단계.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 세신 뿌리는 자연건조 또는 열풍건조 방법 등과 같이 통상적인 건조방법을 통해 건조한 것일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 (a) 단계에서 세신 뿌리를 추출하는데 사용되는 추출 용매의 종류는 에탄올이다. 에탄올을 이용한 추출 (즉, 주정추출)은 식품 가공상 가장 친환경적이며 경제적인 추출방법이다. 바람직하게는 50% 내지 90% 에탄올, 보다 바람직하게는 60% 내지 80% 에탄올, 가장 바람직하게는 65% 내지 75% 에탄올을 추출 용매를 사용할 수 있다.
상기 추출물을 제조하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 침지 추출법, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2 종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 (c) 단계는 물-메탄올 혼합액은 6:4에서 1:9의 농도 구배로 적용하여 플래시 크로마토그래피를 수행하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 표준적 역상 소수성 수지, 예를 들어 C18 수지 (resin)로 충진된 컬럼을 이용하여 플래쉬 크로마토그래피로 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 (d) 단계의 물-아세토니트릴 혼합액은 6.5:3.5 내지 5.5:4.5의 농도 구배로 적용하여 반분취 크로마토그래피로 수행될 수 있으며, 바람직하게는 표준적 역상 소수성 수지, 예를 들어 ODS-A 수지 (resin)로 충진된 컬럼을 이용하여 반분취 크로마토그래피로 수행될 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
세신 추출물 제조 및 아사로이독사진 C 화합물의 분리
1-1. 일반적인 절차
광학 회전 및 UV 스펙트럼은 각각 MCP-5500 디지털 편광계 (Anton Paar, Graz, Austria)와 Optizen POP 분광 광도계 (Mecasys, 대전, 대한민국)를 사용하여 결정되었다. 전자 원형 이색성 (electronic circular dichroism, ECD) 스펙트럼은 JASCO J-1100 분광편광계(Jasco, Tokyo, Japan)에서 기록되었다. NMR 스펙트럼은 AVANCE Ⅲ 600 MHz Cryo-NMR (Bruker, Billerica, MA, USA)에서 획득하였다. HRESIMS 데이터는 Bruker 컴팩트 또는 Waters Q-TOF 질량 분석기 (Waters, Milford, MA, USA)를 사용하여 획득하였다. 분취 HPLC는 YMC-Pack ODS-A 반분취 컬럼 (21.2 × 250mm, 5μm, 120Å, YMC, Kyoto, Japan)이 구비된 2545Q 구배 모듈과 2998 PDA 검출기로 구성된 Waters prep-LC 시스템을 사용하여 수행하였다. 컬럼 크로마토그래피는 Biotage SNAP Ultra 100g 및 SNAP Ultra C18 120g 사전 팩킹 카트리지와 Sephadex LH-20 겔(MilliporeSigma, St. Louis, MO, USA)로 수동 팩킹된 Biotage SNAP 건조 로드 카트리지 10g이 구비된 Selekt 플래시 크로마토그래피 시스템(Biotage, Uppsala, Sweden)을 통해 수행되었다.
1-2. 추출 및 분리
건조된 세신 뿌리는 2019년에 KMD Medicinal Herbs Co. (울산, 대한민국)에서 구입하여 한국 한의학연구원 한약자원연구센터에 기탁하였다 (바우처 번호 2-19-0399).
건조된 세신 뿌리 (1 kg)를 분쇄하고 40℃에서 침용하여 70% 에탄올 (10 L)로 추출한 다음 여과하고 진공에서 증발시켜 총 추출물 (86.3 g, 8.6%)을 수득하였다. 이 추출물 (80.0g)을 증류수 (1.5L)에 현탁하고 일련의 유기 용매로 분할하여 n-헥산-가용성 (9.3g), EtOAc-가용성 (2.7g) 및 수용성 추출물 (66.9g)을 수득하였다. 활성 EtOAc 추출물을 플래시 크로마토그래피 시스템 (Flash chromatography system, FCS)을 사용하여 2개의 SNAP Ultra C18 120g 카트리지 (물/MeOH, 6:4에서 1:9)로 분리하여 23개의 분획 (F01-F23)을 수득하였다. F14 (18.7 mg)를 YMC-Pack ODS-A 반분취 컬럼 (물/CH3CN, 6.5:3.5 내지 5.5:4.5, 50분)으로 정제하여 화합물 1 (4.9 mg), 화합물 2 (4.9 mg) 및 화합물 3 (2.5 mg)을 생성하였다.
아리스톨록사진 C (Aristoloxazine C) (화합물 1): 노란빛을 띤 결정; ECD (c 0.5 mM, CH3CN) Δε +3.97 (289), -5.44 (223); 1H (DMSO-d 6, 600 MHz) 및 13C (DMSO-d 6, 150 MHz) NMR 데이터는 표 1에 나타내었다.
아사로이독사진 B (Asaroidoxazine B) (화합물 2): 노란빛을 띤 결정; ECD (c 0.5 mM, CH3CN) Δε +1.03 (346), -0.42 (320), +3.99 (281 nm), -8.80 (223); 1H (DMSO-d 6, 600 MHz) 및 13C (DMSO-d 6, 150 MHz) NMR 데이터는 표 1에 나타내었다.
아사로이독사진 C (Asaroidoxazine C) (화합물 3): 갈색 무정형 분말; [α]20 D -12 (c 0.03, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 221 (3.42), 238 (3.41), 290 (3.45) nm; ECD (c 0.5 mM, CH3CN) Δε -2.33 (292), +1.33 (250), +0.96 (240), +5.14 (219); 1H (methanol-d 4, 600 MHz) 및 13C (methanol-d 4, 150 MHz) NMR 데이터는 표 1에 나타내었다. HRESIMS m/z 481.0682 [M + Na]+ (C21H18N2O8SNa, 481.0682에 대해 계산됨).
position 1 a 2 a 3 b
δ C, type δ H, multi.
(J in Hz)		 δ C, type δ H, multi.
(J in Hz)		 δ C, type δ H, multi.
(J in Hz)
1 118.2, C 118.1, C 120.1, C
2 105.3, CH 7.62, s 105.3, CH 7.60, s 106.3, CH 7.53, s
3 153.5, C 153.4, C 155.3, C
4 150.0, C 149.9, C 151.1, C
4a 113.0, C 112.9, C 115.3, C
4b 127.7, C 128.2, C 124.3, C
5 119.0, CH 7.92 d (8.0) 104.2, CH 7.45, s 108.0, CH 7.76, s
6 130.2, CH 7.53, t (8.1) 160.8, C 155.9, C
7 112.7, CH 7.22, d (8.3) 99.5, CH 6.78, s 144.7, C
8 156.3, C 157.5, C 152.7, C
8a 119.5, C 111.7, C 119.4, C
9 38.2, CH 5.43, s 38.2, CH 5.31, s 40.6, CH 5.39, s
10 151.8, C 151.7, C 153.8, C
10a 117.6, C 117.7, C 119.2, C
11 162.9, C 162.8, C 165.4, C
12 104.2, CH2 6.45, s, 6.55, s 104.0, CH2 6.44, s, 6.54, s 105.4, CH2 6.35, s, 6.47, s
1′ 34.4, CH2 3.20, d (15.0), 3.32, m c 34.4, CH2 3.16, d (15.3), 3.29, d (15.3) 35.3, CH2 3.19, d (15.7), 3.50, d (15.7)
2′ 169.5, C 169.5, C 174.1, C
NH2-2′ 7.14, br s, 7.35, br s 7.11, br s, 7.32, br s
OCH3-6 56.3, CH3 3.94, s 56.8, CH3 3.94, s
OCH3-7 61.5, CH3 3.93, s
OCH3-8 56.2, CH3 3.95, s 55.5, CH3 3.86, s 62.5, CH3 4.10, s
a DMSO-d 6에서 측정됨. b 메탄올-d 4에서 측정됨. c 신호가 부분적으로 겹침.
1-3. 계산 방법 (Computational methods)
형태 이성질체 (Conformer) 분포, 최적화 및 ECD 계산은 문헌 [Ryu, Seung Mok et al. "Chemical Constituents of the Egg Cases of　Tenodera angustipennis　(Mantidis ootheca) with Intracellular Reactive Oxygen Species Scavenging Activity."　Biomolecules　vol. 11,4 556. 10 Apr. 2021]에 기재된 바와 같이 수행되었다.
1-4. X선 회절 분석
CCD 데이터는 Bruker-SAINT 소프트웨어 패키지를 사용하여 통합 및 확장되었으며, SHEXL-2014를 사용하여 구조를 풀어 세밀하게 구분하였다. 화합물 2의 결정 데이터 - C20H16N2O7S(M = 428.41): 사방정계, 공간군 P212121(no. 19), a = 4.7058(6) Å, b = 19.547(3) Å, c = 19.654(3) Å, V = 1807.9(4) Å3, Z = 4, T = 100(2) K, μ(Cu-Kα) = 2.047 mm-1, Dcalc = 1.574 g/cm3, 3075 엑스선 반사 (3.189°≤ 2θ ≤ 69.920°), 3201 고유 엑스선 반사 (Rint = 0.1255)를 전체 계산에 사용하였다. 최종 R1은 0.0918 (I > 2σ(I))이었고, wR2는 0.1561 (I > 2σ(I))이었다. 화합물 2에 대한 결정학적 데이터는 캠브리지 결정학적 데이터 센터에 보충 간행물 번호 CCDC 2102594로 기탁되었다.
화합물 1 및 2는 노란색 결정으로 수득되었으며, HRESIMS에서 각각 m/z 421.0467 [M + Na]+ 및 451.0573 [M + Na]+에서 분자 이온을 관찰되었다. 화합물 1과 2의 1D NMR 스펙트럼은 각각 아리스톨록사진 C와 아사로이독사진 B의 스펙트럼과 유사하였다. 아리스톨록사진 C와 아사로이독사진 B는 옥사진고리를 포함하는 아리스토로크산 유도체로 최근 족도리풀속 (Asarum)에서 분리되는 것으로 보고되고 있다. 옥사진 고리의 존재는 NMR 데이터에서 확인하기 어렵다. 따라서, 화합물 1과 2의 구조를 명확히 규명하기 위하여 X선 결정학을 이용하여 화합물 2의 구조를 추가로 확인하였다. 도 3의 X선 구조는 옥사진 고리의 존재를 분명히 보여주었다. 화합물 1과 2의 C-9 위치에서의 절대 배열은 실험 및 계산된 ECD 스펙트럼 간의 비교를 통해 결정되었다. 도 4에서 확인되는 바와 같이, 실험적 ECD 스펙트럼은 9S 모델의 계산된 ECD 스펙트럼과 잘 일치하였다. 이러한 분광학적 증거에 기초하여, 화합물 1 및 2의 구조는 각각 아리스톨록사진 C 및 아사로이독사진 B로 밝혀졌다.
화합물 3은 갈색 무정형 분말로 분리되었으며, HRESIMS에서 m/z　481.0682 [M + Na]+ (C21H18N2O8SNa, 481.0682로 계산)로 나타나 분자식 C21H18N2O8S로 확인되었다.
3개의 1H NMR 스펙트럼은 3개의 단일선 (singlet) 메틴기 [δH 5.39(1H, s, H-9), 7.53(1H, s, H-2) 및 7.76(1H, s, H-5)], 2개의 메틸렌기 [δH 3.19(1H, d, J = 15.7Hz, H-1'a), 3.50(1H, d, J = 15.7Hz, H-1'b), 6.35(1H, s, H-12a), 및 6.47(1H, s, H-12b)] 및 3개의 메톡시기[δH 3.93(3H, s, OCH3-7), 3.94(3H, s, OCH3-6), 및 4.10(3H, s, OCH3-8)]. 또한, 2개의 카르보닐 탄소 신호 [δC 165.4(C-11) 및 174.1(C-2')] 및 11개의 양성자화되지 않은 sp2 탄소 신호 [δC 115.3 (C-4a), 119.2 (C-10a), 119.4 (C-8a), 120.1 (C-1), 124.3 (C-4b), 144.7 (C-7), 151.1 (C-4), 152.7 (C-8), 153.8 (C-10), 155.3 (C-3), 및 155.9 (C-6)]를 포함한 21개의 탄소 신호는 13C NMR 및 HSQC 스펙트럼에서 관찰되었다(표 1 및 도 5 내지 8). 도 8의 HMBC 스펙트럼에서, C-3/C-4를 갖는 H-12 (δH 6.35 및 6.47), C-3/C-4/C-10a/C-11을 갖는 H-2 (δH 7.53), C-4b/C-8a/C-8/C-10a/C-10/C-1'를 갖는 H-9 (δH 5.39) 및 C-4a/C-6/C-7/C-8a를 갖는 H-5(δH 7.76)의 교차 피크는 화합물 3이 C-9 위치에서 치환된 아리스톨로크산 (aristolochic acid) 유도체임을 나타낸다(도 2). 9 위치(δC 40.6; δH 5.39)의 화학적 이동 및 C-9/C-2'를 갖는 H-1' (δH 3.19 및 3.50)의 HMBC 교차 피크는 프로피온아마이드 부분이 C-9 위치의 황 원자에 부착되어 있음을 나타낸다. 3개의 메톡시기의 위치도 HMBC 상관관계에 의해 C-6, C-7, C-8로 확인되었다.
2개의 방향족 고리, 1개의 시클로헥사디엔 고리, 메틸렌디옥시기, 2개의 카르보닐기 및 아민기가 13개의 불포화를 설명하고, 분자식에 의해 구한 불포화도를 충족시키는 위해 1개의 고리가 더 필요하였다. 따라서, C-1의 카르복실산과 C-10의 니트로기가 연결되어 옥사진 고리를 형성하는 것으로 추정된다. 화합물 3의 구조는 화합물 3의 추가 메톡시기에 해당하는 신호를 제외하고, 아사로이독사진 B (화합물 2)의 구조와 유사하였다. 화합물 3 ([α]20D +19, MeOH)의 광학 회전은 화합물 2 ([α]20D -12, MeOH)와 비교하여 큰 차이를 보였고, 도 4에서 확인되는 바와 같이 화합물 3의 실험적 ECD 스펙트럼은 9R 모델의 계산된 ECD 스펙트럼과 일치한다. 따라서, 화합물 3의 C-9 위치에서의 절대 배열은 화합물 1 및 2의 배열과 반대 배열인 것으로 결정되었다. 모든 분광학적 증거를 고려하여, 화합물 3의 구조는 아사로이독사진 C인 것으로 밝혀졌다.
MTT 어세이를 통한 항암 활성 확인
실시예 1에서 분리된 3종의 화합물의 항암 활성을 평가하기 위해, SKMEL5 (흑색종), A431 (비흑색종 피부), PC3 (전립선), A549 (폐), HT1080 (섬유육종), OVCAR3 (난소), HCT116 (대장), AGS (위) 및 HepG2 (간)을 포함한 9개의 인간 암 세포주에 대한 세포독성 활성을 평가하였다.
세포를 96-웰 플레이트에 씨딩 (웰당 1-2.5 x 103개 세포)한 다음 밤새 안정화시켰다. 그런 다음, 세포를 37℃, CO2 인큐베이터에서 24시간, 48시간 또는 72시간 동안 각각 다른 용량의 화합물로 처리하고 20㎕의 MTT ((4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약(Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA))을 각 웰에 첨가하였다. 1-2시간 후, 배지를 버리고 100μl의 DMSO (디메틸 설폭사이드, VWR Life Science, Ohio, USA)를 첨가한 다음 Multiskan Skyhigh 마이크로플레이트 분광광도계 (Thermo Scientific, Singapore)를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 5-FU는 양성 대조군으로 사용하였다. 표 2의 추출물은 실시예 1-2의 세신 뿌리 분획물의 제조과정에서 수득된 70% 에탄올 세신 뿌리 추출물이다.
세포주 IC 50 값 (72h)
아리스톨록사진 C (nM) 아사로이독사진 B (nM) 아사로이독사진 C (nM) 추출물 (ng/ml) 5-FU
(μM)
NHDF
(정상 피부)		 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
SKMEL5
(흑색종)		 72.1±0.4 398.2±5.5 724.9±11.6 n.d. 8.4±0.7
A431
(비흑색종 피부암)		 85.7±2.5 554.7±2.6 n.d. n.d. 1.0±0.03
PC3 (전립선암) 84.3±2.0 690.9±6.3 n.d. n.d. n.d.
A549 (폐암) 25.7±0.7 192.0±5.0 n.d. n.d. 2.40±0.1
HT1080
(섬유육종)		 143.4±2.3 n.d. n.d. n.d. 4.9±0.1
OVCAR3 (난소암) 374.1±12.0 n.d. n.d. n.d. n.d.
HCT116 (대장암) 29.3±0.2 244.3±3.5 n.d. n.d. 3.5±0.1
AGS (위암) 22.1±0.8 154.4±2.2 408.0±3.9 n.d. 3.2±0.1
HepG2 (간암) 149.2±0.7 n.d. n.d. n.d. n.d.
n.d.: 검출되지 않음 (not detected)
그 결과, 표 2 및 도 10a 내지 10i에서 확인되는 바와 같이 3종의 화합물은 모두 5-FU보다 훨씬 강한 나노몰 IC50 값을 갖는 강력한 억제 활성을 나타냈다.
아리스톨록사진 C는 시험한 모든 세포에 대해 22.1 내지 374.1 nM 사이의 IC50 값으로 세포독성을 나타냈다. 특히, AGS, A549, HCT116 세포에서 IC50 값은 각각 22.1 ± 0.8, 25.7 ± 0.7, 29.3 ± 0.2 nM로 가장 강한 활성을 보였다.
아사로이독사진 B는 HT1080, OVCAR3 및 HepG2를 제외한 6개 암 세포주에 대해 154.4 내지 690.9 nM의 IC50 값으로 강력한 세포독성 활성을 나타냈다.
아사로이독사진 C는 각각 408.0 ± 3.9 nM 및 724.9 ± 11.6 nM의 IC50 값으로 인간 위선암종 AGS 및 흑색종 SKME-5 세포 증식에 대한 강력한 억제 활성을 나타냈다. 특히, 3종의 화합물 모두 양성 대조군인 5-FU보다 훨씬 강한 나노몰 수준의 IC50 값으로 강력한 억제 활성을 나타내었고, 메톡실기의 수가 적을수록 암세포에 대한 효능이 강한 것으로 나타났다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (18)

  1. 화학식 1로 표시되는 아사로이독사진 C (Asaroidoxazine C), 이의 이성질체 또는 약학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure pat00006
    .
  2. 제1항에 있어서, 상기 이성질체는 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 거울상 이성질체의 혼합물 또는 부분입체 이성질체의 혼합물을 포함하는 것인, 화합물, 이의 이성질체 또는 약학적으로 허용 가능한 염.
  3. 제1항에 있어서, 상기 아사로이독사진 C는 쥐방울덩굴과 (Aristolochiaceae) 족도리풀속(genus Asarum)에 속하는 동속근연종으로부터 분리되는 것인, 화합물, 이의 이성질체 또는 약학적으로 허용 가능한 염.
  4. 제3항에 있어서, 상기 아사로이독사진 C는 세신 (Asarum heterotropoides) 뿌리로부터 분리되는 것인, 화합물, 이의 이성질체 또는 약학적으로 허용 가능한 염.
  5. 제1항에 있어서, 상기 아사로이독사진 C, 이의 이성질체 또는 약학적으로 허용 가능한 염은 암세포 억제 활성을 나타내는 것인, 화합물, 이의 이성질체 또는 약학적으로 허용 가능한 염.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 화합물, 이의 이성질체 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 화합물, 이의 이성질체 또는 약학적으로 허용 가능한 염은 암을 예방 또는 치료하기 위한 것인, 약학 조성물.
  8. 세신 (Asarum heterotropoides) 뿌리 분획물을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 세신 뿌리 분획물은 다음의 단계를 수행하여 수득되는, 약학 조성물:
    (a) 세신 뿌리를 에탄올 용매로 추출하여 세신 뿌리 에탄올 추출물을 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 세신 뿌리 에탄올 추출물을 헥산, 에틸아세테이트 및 물 순서로 계통 분획하여 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계.
  9. 제8항에 있어서, 상기 세신 뿌리 분획물은 화학식 1로 표시되는 아사로이독사진 C (Asaroidoxazine C), 화학식 2로 표시되는 아리스톨록사진 C (Aristoloxazine C) 및 화학식 3으로 표시되는 아사로이독사진 B (Asaroidoxazine B)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00007
    ,
    [화학식 2]
    Figure pat00008
    ,
    [화학식 3]
    Figure pat00009
    .
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 화합물, 이의 이성질체 또는 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 화합물, 이의 이성질체 또는 식품학적으로 허용 가능한 염은 암을 예방 또는 개선하기 위한 것인, 건강기능식품 조성물.
  12. 세신 (Asarum heterotropoides) 뿌리 분획물을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물로서,
    상기 세신 뿌리 분획물은 다음의 단계를 수행하여 수득되는, 건강기능식품 조성물:
    (a) 세신 뿌리를 에탄올 용매로 추출하여 세신 뿌리 에탄올 추출물을 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 세신 뿌리 에탄올 추출물을 헥산, 에틸아세테이트 및 물 순서로 계통 분획하여 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세신 뿌리 분획물은 화학식 1로 표시되는 아사로이독사진 C (Asaroidoxazine C), 화학식 2로 표시되는 아리스톨록사진 C (Aristoloxazine C) 및 화학식 3으로 표시되는 아사로이독사진 B (Asaroidoxazine B)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00010
    ,
    [화학식 2]
    Figure pat00011
    ,
    [화학식 3]
    Figure pat00012
    .
  14. 다음의 단계를 포함하는, 쥐방울덩굴과 (Aristolochiaceae) 족도리풀속(genus Asarum)에 속하는 동속근연종으로부터 화학식 1로 표시되는 아사로이독사진 C (Asaroidoxazine C)를 분리하는 방법:
    [화학식 1]
    Figure pat00013

    (a) 쥐방울덩굴과 (Aristolochiaceae) 족도리풀속(genus Asarum)에 속하는 동속근연종을 에탄올 용매로 추출하여 에탄올 추출물을 수득하는 단계;
    (b) 상기 에탄올 추출물을 헥산, 에틸아세테이트 및 물 순서로 계통 분획하여 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계;
    (c) 상기 에틸아세테이트 분획물을 물-메탄올 혼합액을 유출 용매로 하여 플래시 크로마토그래피를 수행하여 분획물을 수득하는 단계; 및
    (d) 컬럼 크로마토그래피를 수행한 후 수득된 분획물을 물-아세토니트릴 혼합액을 유출 용매로 하여 반분취 크로마토그래피를 수행하여 상기 아사로이독사진 C (Asaroidoxazine C)를 정제하는 단계.
  15. 제14항에 있어서, 상기 (a) 단계의 쥐방울덩굴과 (Aristolochiaceae) 족도리풀속(genus Asarum)에 속하는 동속근연종은 세신 (Asarum heterotropoides) 뿌리인 것인, 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 (a) 단계의 에탄올 용매는 50 내지 90% 에탄올 용매인 것인, 방법.
  17. 제 14항에 있어서, 상기 (c) 단계의 물-메탄올 혼합액은 6:4에서 1:9의 농도 구배로 적용되는 것인, 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 (d) 단계의 물-아세토니트릴 혼합액은 6.5:3.5 내지 5.5:4.5의 농도 구배로 적용되는 것인, 방법.
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