CN103623409A

CN103623409A - 樟芝酸衍生物与抗癌药物组合用于治疗和/或预防肿瘤

Info

Publication number: CN103623409A
Application number: CN201310376713.3A
Authority: CN
Inventors: 吴宗正; 高翊恺
Original assignee: Taiwan Antitumor Biotech Co Ltd
Current assignee: Taiwan Antitumor Biotech Co Ltd
Priority date: 2012-08-24
Filing date: 2013-08-26
Publication date: 2014-03-12
Also published as: US20140057880A1; TWI494109B; TW201422227A; JP2014139153A; EP2700404A1

Abstract

本发明意外地发现，樟芝酸或其酯衍生物、盐或组合物与抗肿瘤药物组合在抑制肿瘤方面提供出乎意料的功效同时使正常细胞维持高生存力。另外，鉴于樟芝酸或其酯衍生物、盐或组合物在辅助治疗中起一定作用的事实，所述抗肿瘤药物在化学治疗中的量可通过组合地使用樟芝酸或其酯衍生物、盐或组合物而减少。

Description

樟芝酸衍生物与抗癌药物组合用于治疗和/或预防肿瘤

技术领域

本发明涉及一种抑制和／或治疗肿瘤的组合和方法。具体地说，本发明提供一种抗肿瘤药物与樟芝酸或其衍生物、盐或组合物的组合用于抑制和／或治疗肿瘤。

背景技术

尽管近来医学有进展，但癌症仍然是最常见和致命的疾病之一。癌症的发病率在生命期内随衰老而增加(“终生风险”)。咸信其它风险因素包括遗传、饮食和环境暴露(例如暴露于致突变化学物(mutagenic chemical)、辐射、转化病毒等)。癌症是用以描述各自以特定类型细胞的不受控制生长为特征的多种疾病的术语。其开始于含有此种细胞的组织，并且癌症如果在诊断时未曾蔓延到任何其它组织，那么可以通过例如手术、辐射或另一类型的局部治疗来治疗。然而，当有癌症已从其来源组织转移的迹象时，典型地使用不同治疗方法。实际上，因为不可能测定转移程度，所以当检测到任何蔓延迹象时，通常进行全身性治疗方法。这些方法涉及投与干扰快速分裂细胞(如癌细胞)生长的化学治疗药物。

例如，原发性肝细胞癌(在下文中可以称为“肝癌”)最通常在慢性肝炎向肝硬化的发展之后出现。已确诊许多病毒性肝炎和肝硬化患者，并且近年来肝癌的发病率渐增。肝癌已用例如肝切除术、经皮局部治疗(例如射频消融治疗或乙醇注射治疗)、经导管肝动脉栓塞术(transcatheter hepatic arterial embolization，TAE)、连续动脉输注化学治疗或放射治疗来治疗。另一实例是乳癌。小叶原位癌和乳腺管原位癌是分别在小叶和乳腺管中出现但未曾蔓延到乳房周围的脂肪组织或蔓延到身体的其它区域的乳癌。浸润性(或侵袭性)小叶和乳腺管癌是分别在小叶和乳腺管中出现并且已蔓延到乳房的脂肪组织和／或身体的其它部分的癌症。其它乳癌包括髓样癌、胶样癌、管状癌和发炎性乳癌。可用于乳癌患者的治疗是手术、免疫治疗、放射治疗、化学治疗、内分泌治疗或其组合。若干化学治疗剂用于治疗癌症，包括烷基化剂、抗代谢物拈抗剂、抗癌抗生素和植物衍生的抗癌剂。然而，大多数用于癌症化学治疗中的细胞毒性药物具有狭窄的化学治疗效用并且在高剂量下具有严重副作用。

植物和蘑菇是用于发现和开发新颖天然衍生的治疗癌症的药剂的有价值资源。樟芝(Taiwanofungus camphoratus，亦称为Ganoderma comphoratum、Antrodia cinnamomea或Antrodia camphorate)称为牛樟芝(niu-chang-chih)或牛樟菇(niuchang-ku)，且寄主植物牛樟(niu-chang)为牛樟树(Cinnamomum kanehirai)的中国通用名，其在台湾为濒危物种。传统上，樟芝用作食物、酒精和药物中毒、腹泻、腹痛、高血压、皮肤发痒和肝癌的中国疗法。三萜系化合物是樟芝的主要组分。三种三萜系化合物，即樟芝酸A、樟芝酸B和樟芝酸C，是麦角甾烷型类似物并且从樟芝的子实体(fruiting body)分离。樟芝酸A和樟芝酸C具有针对反应性氧物质的有效免疫调节作用。谢韵之(Yun-Chih Hsieh)等人进一步报导，樟芝酸A、樟芝酸C和樟芝酸A甲酯可以选择性抑制人类癌细胞而不是正常细胞的增殖(谢韵之等人，“来自薄孔菌属樟脑酸酯的樟芝酸A甲酯经由氧化剂介导的丝切蛋白和Bax触发的线粒体路径来诱发人类肝癌细胞的细胞凋亡(Methyl Antcinate A from Antrodia camphorate Induces Apoptosis in Human Liver Cancer Cells through Oxidant-Mediated Cofilin-and Bax-Triggered Mitochondrial Pathway)”，化学毒理学研究(Chem.Res.Toxico1.)2010，23，第1256-1267页)。

然而，需要一种相对低毒性并且有效的治疗和／或预防肿瘤和抑制肿瘤生长的方法；具体地说，需要另外改善通常与全身性化学治疗相关的毒性。

发明内容

本发明提供一种包含抗肿瘤药物以及樟芝酸或其盐或酯衍生物或组合物的组合，其中所述樟芝酸或其盐或酯衍生物或组合物的量可减少所述抗肿瘤药物的量并且对正常细胞提供低细胞毒性。

本发明还提供一种在对个体的肿瘤具选择性的情况下抑制和／或治疗肿瘤的方法，其包含向个体投与有效量的本发明的组合。

附图说明

图1展示分别用50μg／ml、100μg／ml、150μg／ml和200μg／ml的5FU处理的HepG2细胞的细胞生存力。“**”表示统计显著性检验中的p值小于0.05，并且“***”表示统计显著性检验中的p值小于0.001。

图2展示分别用200μg／ml5FU以及5μg／ml、10μg／ml、15μg／ml、20μg／ml和25μg／ml的樟芝酸A处理的HepG2细胞的细胞生存力。“**”表示统计显著性检验中的p值小于0.05，并且“***”表示统计显著性检验中的p值小于0.001。

图3展示分别用100μg／ml5FU以及5μg／ml、10μg／ml、15μg／ml、20μg／ml和25μg／ml的樟芝酸A处理的HepG2细胞和CCD-966SK细胞的细胞生存力。“***”表示统计显著性检验中的p值小于0.001。

图4展示用200μg／ml5FU、100μg／ml5FU和100μg／ml5FU以及25μg／ml樟芝酸A处理的正常细胞株CCD-966SK的细胞生存力。“**”表示统计显著性检验中的p值小于0.05，并且“***”表示统计显著性检验中的p值小于0.001。

图5展示用10μg／ml的樟芝酸A和不同浓度的5FU处理的HepG2和CCD-966SK的细胞生存力。“***”表示统计显著性检验中的p值小于0.001。

图6展示用他莫昔芬(tamoxifen)处理的HepG2细胞的细胞生存力。“*”表示统计显著性检验中的p值小于0.01；并且“***”表示统计显著性检验中的p值小于0.001。

图7展示分别用3.13μg／ml他莫昔芬以及5μg／ml、10μg／ml、15μg／ml、20μg／ml和25μg／ml的樟芝酸A处理的HepG2细胞的细胞生存力。“**”表示统计显著性检验中的p值小于0.05，并且“***”表示统计显著性检验中的p值小于0.001。

图8展示用3.13μg／ml TAM和3.13μg／ml TAM以及15μg／ml樟芝酸A处理的正常细胞株CCD-966SK的细胞生存力。“**”表示统计显著性检验中的p值小于0.05。

图9展示用10μg／ml的樟芝酸A和不同浓度的TAM处理的HepG2和CCD-966SK的细胞生存力。“***”表示统计显著性检验中的p值小于0.001。

图10展示用舒尼替尼(sunitinib)处理的HepG2细胞和CCD-966SK的细胞生存力。“*”表示统计显著性检验中的p值小于0.01，并且“**”表示统计显著性检验中的p值小于0.05。

图11展示用10μg／ml的樟芝酸A和不同浓度的舒尼替尼处理的HepG2和CCD-966SK的细胞生存力。“**”表示统计显著性检验中的p值小于0.05，并且“***”表示统计显著性检验中的p值小于0.001。

图12展示用米托葸醌(mitoxantrone)处理的HepG2和CCD-966SK细胞的细胞生存力。“*”表示统计显著性检验中的p值小于0.01；“**”表示统计显著性检验中的p值小于0.05；并且“***”表示统计显著性检验中的p值小于0.001。

图13展示用10μg／ml的樟芝酸A和不同浓度的米托葸醌处理的HepG2和CCD-966SK的细胞生存力。“**”表示统计显著性检验中的p值小于0.05，并且“***”表示统计显著性检验中的p值小于0.001。

具体实施方式

本发明意外地发现，抗肿瘤药物与樟芝酸或其酯衍生物、盐或组合物组合在抑制肿瘤细胞方面提供出乎意料的功效，同时使正常细胞维持在高生存力下。另外，鉴于樟芝酸或其酯衍生物、盐或组合物在辅助疗法中起一定作用的事实，所述抗肿瘤药物在化学疗法中的量可通过组合地使用樟芝酸或其酯衍生物、盐或组合物而减少。此外，包含樟芝酸或其酯衍生物、盐或组合物以及抗肿瘤药物的本发明的组合可选择性抑制肿瘤细胞。

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解相同的含义。尽管任何类似或等效于本文所述的方法和材料的方法和材料均可以用于实施或测试本发明，但对优选的方法和材料加以描述。出于本发明目的，下文定义下列术语。

术语“一个(种)(a／an)”指代一个(种)或一个(种)以上(即，至少一个(种))项目的语法对象。

术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”意指减少患者所经历的癌症症状的频率、程度、严重度和／或持续时间。

术语“预防(prevent)”、“预防(prevention)”、“预防(preventing)”意指抑制或避免与癌症相关的症状。

术语“减轻(alleviate)”、“减轻(alleviation)”或“减轻(alleviating)”意指减小疾病、病症或病状的一种或一种以上症状的严重度。

术语“盐”是指维持游离碱的生物有效性和性质的盐，且其通过与无机或有机酸(如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、苹果酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸等)发生反应而获得。

术语“有效量”意指在低毒性情况下有效抑制或治疗和／或预防癌症的本发明的组合的量。举例来说，本发明的组合的有效量可减少癌细胞数目；减小肿瘤尺寸；抑制(即，在一定程度上减缓且优选地中止)癌细胞浸润到外周器官中；抑制(即，至少在一定程度上减缓且优选地中止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；促进细胞凋亡；和／或在一定程度上缓解与病症相关的一种或一种以上症状。

术语“个体”应理解为指代动物，通常为哺乳动物，如灵长类动物(人类、猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猕猴)、家养动物(狗和猫)、家畜(马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。个体包括动物疾病模型(例如易患肿瘤小鼠、负载肿瘤小鼠或接受异种移植物肿瘤的小鼠)。

术语“肿瘤”在本文中用于包括(但不限于)起源于乳房、前列腺、结肠、肺、胰脏、肝脏、胃、膀胱或生殖道(子宫颈、卵巢、子宫内膜等)、脑和骨髓的肿瘤；黑色素瘤；或淋巴瘤。

术语“抑制肿瘤细胞生长”在本文中用于意指以下中的一者或一者以上：减缓肿瘤细胞生长、使肿瘤细胞生长停止、引起肿瘤细胞减少或消退、抑制肿瘤侵袭、引起肿瘤细胞死亡以及引起癌转移的减少或消退。

在一个方面中，本发明提供了一种组合，其包含抗肿瘤药物以及樟芝酸或其盐或酯衍生物或组合物，其中樟芝酸或其盐或酯衍生物或组合物的量可减少抗肿瘤药物的量且对正常细胞提供低细胞毒性。

樟芝乙醇萃取物和从其分离的樟芝酸或其衍生物可通过诱导肿瘤细胞的细胞凋亡而选择性抑制肿瘤细胞，但对正常细胞展现低毒性，由此樟芝乙醇萃取物和从其分离的樟芝酸或其衍生物可用作抵抗肿瘤的药剂或用于化学疗法。

樟芝酸是从樟芝的子实体分离的麦角甾烷型三萜系化合物，其具有下式：

其中R₁为=O或OH；R₂为H或OH；R₃为H、=O、OH或O-乙酰基；R₄为H或OH；R₅为H；R₆为H或OH；且R₇为=O或OH。

樟芝酸的实例包括樟芝酸A(4α-甲基麦角甾-8,24(28)-二烯-3，11-二酮-26-酸)、樟芝酸B(2-甲基-3-亚甲基-6-[(4S)-4，10，13-三甲基-3，7，11-三氧代-1，2,4,5，6，12，14，15，16，17-十氢环戊二烯并[a]菲-17-基]庚酸)、樟芝酸C(4a甲基麦角甾-8,24(28)-二烯-3，11-三酮-7P-26-酸)、樟芝酸D(4，14-羟基-4α-甲基-3，7，11-三氧代-麦角甾-8,24(28)-二烯-26-酸)、樟芝酸E(5，3，11-二氧代-4α-甲基麦角甾-8，14,24(28)-三烯-26-酸)、樟芝酸F(6,3，11-二氧代-7β-羟基-4α-甲基麦角甾-8，14,24(28)-三烯-26-酸)、樟芝酸H(3α，12α-二羟基-4α-甲基麦角甾-8,24(28)-二烯-7，11-二酮-26-酸)和樟芝酸K(4，7-二甲基乙氧基-5-甲基-1，3-苯并间二氧杂环戊烯)。樟芝酸A-K的化学式如下：

化合物

R₁

R₂

R₃

R₄

R₅

R₆

R₇

樟芝酸A

=O

H

=O

樟芝酸B

=O

H

=O

H

=O

樟芝酸C

=O

H

-OH

H

=O

樟芝酸D

=O

H

=O

H

=O

樟芝酸E

=O

H

--

H

=O

樟芝酸F

=O

H

-OH

--

H

=O

樟芝酸G

=O

H

-OAc

H

=O

樟芝酸H

-OH

H

=O

H

-OH

=O

樟芝酸I

-OH

H

=O

H

=O

樟芝酸J

=O

H

=O

-OH

H

-OH

樟芝酸K

-OH

H

=O

樟芝酸A(4α-甲基麦角甾-8，24(28)-二烯-3，11-二酮-26-酸)是本发明的组合中所用的一个优选实施例且具有如下结构式：

樟芝酸的盐包括碱加成盐。酸性的本发明樟芝酸可与碱(如碱金属氢氧化物，例如氢氧化钠和氢氧化钾；碱土金属氢氧化物，例如氢氧化钙、氢氧化钡和氢氧化镁)、有机碱(例如N-甲基-D-葡糖胺、胆碱三(羟甲基)胺基-甲烷、L-精氨酸、L-赖氨酸、N-乙基哌啶、二苯甲基胺等)形成盐(包括医药学上可接受的盐)。与碱形成的特定盐包括苄星(benzathine)盐、钙盐、二乙醇胺盐、葡甲胺盐、醇胺盐、钾盐、普鲁卡因(procaine)盐、钠盐、缓血酸胺(tromethamine)盐和锌盐。在一个实施例中，樟芝酸酯衍生物包括(但不限于)烷基樟芝酸、烯基樟芝酸、炔基樟芝酸。樟芝酸酯优选为樟芝酸A C_1-8烷基(如甲基、乙基、丙基和丁基等)酯、樟芝酸B C_1-8烷基(如甲基、乙基、丙基和丁基等)酯、樟芝酸C C_1-8烷基(如甲基、乙基、丙基和丁基等)酯、樟芝酸D C_1-8烷基(如甲基、乙基、丙基和丁基等)酯、樟芝酸E C_1-8烷基(如甲基、乙基、丙基和丁基等)酯、樟芝酸F C_1-8烷基(如甲基、乙基、丙基和丁基等)酯、樟芝酸H C_1-8烷基(如甲基、乙基、丙基和丁基等)酯和樟芝酸K C_1-8烷基(如甲基、乙基、丙基和丁基等)酯。樟芝酸酯优选为樟芝酸A甲酯、樟芝酸B甲酯、樟芝酸C甲酯、樟芝酸G甲酯、樟芝酸H甲酯、樟芝酸A乙酯或樟芝酸B乙酯；其化学式如下：

化合物

R₁

R₂

R₃

R₄

R₅

R₆

R₇

樟芝酸A甲酯

=O

H

CH₃

H

=O

樟芝酸B甲酯

=O

H

=O

H

CH₃

H

=O

樟芝酸C甲酯

=O

H

-OH

H

CH₃

H

=O

樟芝酸G甲酯

=O

H

-OAc

H

CH₃

H

=O

樟芝酸H甲酯

-OH

H

=O

H

CH₃

-OH

=O

樟芝酸A乙酯

=O

H

CH₂CH₃

H

=O

樟芝酸B乙酯

-OH

H

=O

H

CH₂CH₃

-OH

=O

在另一实施例中，樟芝酸的组合物是含有樟芝酸的樟芝的萃取物。樟芝酸或其衍生物包括于樟芝的萃取物中。一个优选实施例是樟芝乙醇萃取物的低极性洗脱份。根据本发明，樟芝乙醇萃取物的低极性洗脱份可通过以下方式获得：用正己烷萃取樟芝，使用呈多种比率的甲醇和乙酸乙酯的混合物作为流动相用硅胶色谱法洗脱所得乙醇萃取物，且收集低极性洗脱份。

根据本发明的一个实施例，樟芝可呈粉末或溶液形式。根据本发明，低极性洗脱份可通过高效液相色谱法(HPLC)、制备型HPLC或半制备型HPLC进一步纯化，从而获得保留时间在23分钟到35分钟的洗脱份。保留时间优选地在约24分钟到33分钟，约27到33分钟，或约28分钟到33分钟，保留时间更优选在约28分钟到29分钟。根据本发明的一个更优选实施例，进一步纯化所得洗脱份以获得樟芝酸。

根据本发明，抗肿瘤药物包括(但不限于)：a)具有抗有丝分裂作用的药物，尤其是靶向细胞骨架元件的药物，包括微管调节剂，如紫杉醇(taxo1)药物(如紫杉醇、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel))、足叶草毒素(podophylotoxin)或长春花生物碱(vinca alkaloid)(长春新碱(vincristine)或长春碱(vinblastine))；b)抗代谢药物(如5-氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷(cytarabine)、吉西他滨(gemcitabine)；嘌呤类似物，如喷司他丁(pentostatin)或甲氨蝶呤methotrexate))；c)烷基化剂或氮芥(如铂药物(顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)或帕拉尼素(paraplidineatin))、亚硝基脲(nitrosourea)、环磷酰胺(cyclophosphamide)或异环磷酰胺(ifosfamide))；d)靶向DNA的药物，如葸环霉素(antracycline)药物阿霉素(adriamycin)、小红莓(doxorubicin)、表阿霉素(pharmorubicin)或表柔比星(epirubicin)；e)靶向拓扑异构酶的药物，如喜树碱(camptothecin)、依托泊苷(etoposide)、米托葸醌、小红莓；f)激素或激素激动剂或拈抗剂，如雌激素、抗雌激素(他莫昔芬和相关化合物)和雄激素、氟他胺(flutamide)、亮丙瑞林(1euprorelin)、戈舍瑞林(goserelin)、环丙孕酮(cyproterone)或奥曲肽(octreotide)；g)靶向肿瘤细胞中信号转导的药物，包括抗体衍生物，如赫赛汀(herceptin)；h)酪氨酸激酶抑制剂，如伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)和埃罗替尼(erlotinib)和舒尼替尼；i)潜在影响肿瘤的癌转移的药物，如基质金属蛋白酶抑制剂；i)基因疗法和反义试剂；和k)抗体治疗剂。抗癌药物优选地为具有抗有丝分裂作用的药物、抗有丝分裂药物、抗代谢药物、烷基化剂或氮芥、靶向DNA的药物、靶向拓扑异构酶的药物或激素拈抗剂。更优选地，具有抗有丝分裂作用的药物是紫杉醇、太平洋紫杉醇、紫杉德(taxotere)、多烯紫杉醇、足叶草毒素、长春新碱或长春碱；抗代谢药物为5-氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷、吉西他滨、喷司他丁或甲氨蝶呤；烷基化剂或氮芥为顺铂、卡铂、奥沙利铂、帕拉尼素、亚硝基脲、环磷酰胺或异环磷酰胺；靶向DNA的药物为阿霉素、小红莓、表阿霉素或表柔比星；靶向拓扑异构酶的药物为喜树碱、依托泊苷、米托葸醌或小红莓；激素或激素激动剂或拈抗剂为雌激素、他莫昔芬、雄激素、氟他胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林、环丙孕酮或奥曲肽；靶向肿瘤细胞中信号转导的药物是赫赛汀；且酪氨酸激酶抑制剂是伊马替尼、吉非替尼和埃罗替尼或舒尼替尼。更优选地，具有抗有丝分裂作用的药物是太平洋紫杉醇、紫杉德或多烯紫杉醇；抗代谢药物为5FU；烷基化剂或氮芥为顺铂、卡铂或环磷酰胺；靶向DNA的药物为小红莓；靶向拓扑异构酶的药物为喜树碱、米托葸醌或小红莓；抗雌激素为他莫昔芬；且酪氨酸激酶抑制剂是舒尼替尼。最优选地，具有抗有丝分裂作用的药物是太平洋紫杉醇或多烯紫杉醇；抗代谢药物为5FU；烷基化剂或氮芥为顺铂或卡铂；靶向DNA的药物为小红莓；靶向拓扑异构酶的药物为米托葸醌；抗雌激素为他莫昔芬；且酪氨酸激酶抑制剂是舒尼替尼。

在一个实施例中，本发明提供一种组合，其包含抗有丝分裂药物、抗代谢药物、烷基化剂、氮芥、靶向DNA的药物、拓扑异构酶抑制剂、激素拈抗剂或酪氨酸激酶抑制剂以及樟芝酸或其盐或酯衍生物或组合物。所述组合优选地包含太平洋紫杉醇、紫杉德、多烯紫杉醇、5FU、顺铂、卡铂、环磷酰胺、小红莓、喜树碱、米托葸醌、他莫昔芬或舒尼替尼以及樟芝酸或其盐或酯衍生物或组合物。在另一实施例中，本发明提供一种组合，其包含5-FU、他莫昔芬、米托葸醌或舒尼替尼以及樟芝酸或其盐或酯衍生物或组合物。

在一些实施例中，樟芝酸或其盐或酯衍生物或组合物的量可减少抗肿瘤药物的量且对正常细胞提供低细胞毒性。樟芝酸或其盐或酯衍生物或组合物以及抗肿瘤药物的量优选地在以下范围内：分别为约0.5％(w／w)到约95％(w／w)和约99.5％(w／w)到约5％(w／w)，分别为约2％(w／w)到约90％(w／w)和约98％(w／w)到约10％(w／w)，分别为约4％(w／w)到约90％(w／w)和约96％(w／w)到约10％(w／w)，分别为约2％(w／w)到约85％(w／w)和约98％(w／w)到约15％(w／w)，分别为约2％(w／w)到约25％(w／w)和约98％(w／w)到约75％(w／w)，分别为约55％(w／w)到约90％(w／w)和约45％(w／w)到约10％(w／w)，分别为约10％(w／w)到约80％(w／w)和约90％(w／w)到约20％(w／w)，分别为约15％(w／w)到约70％(w／w)和约85％(w／w)到约30％(w／w)，分别为约20％(w／w)到约80％(w／w)和约80％(w／w)到约20％(w／w)，分别为约20％(w／w)到约70％(w／w)和约80％(w／w)到约30％(w／w)，分别为约20％(w／w)到约60％(w／w)和约80％(w／w)到约40％(w／w)，分别为约20％(w／w)到约50％(w／w)和约80％(w／w)到约50％(w／w)，分别为约30％(w／w)到约80％(w／w)和约70％(w／w)到约20％(w／w)，分别为约30％(w／w)到约70％(w／w)和约70％(w／w)到约30％(w／w)，分别为约30％(w／w)到约60％(w／w)和约70％(w／w)到约40％(w／w)，分别为约 40％(w／w)到约80％(w／w)和约60％(w／w)到约20％(w／w)，分别为约40％(w／w)到约70％(w／w)和约60％(w／w)到约30％(w／w)以及分别为约50％(w／w)到约80％(w／w)和约50％(w／w)到约20％(w／w)。

包含本发明的组合的医药调配物通常将包含一种或一种以上载剂或赋形剂和任选地其它治疗成分。在与调配物的其它成分相容以及对其接受者生理学上无害的意义上，载剂一股将为“可接受的”。所述载剂或赋形剂为已知的，例如填充剂、润滑剂、粘合剂和用于液体调配物的多种液体赋形剂。适合的载剂包括本文中引用的参考文献中所公开的载剂。

本发明的组合优选地呈单位剂型形式，如片剂、丸剂、胶囊、粉末、颗粒、无菌胃肠外溶液或悬浮液、计量式气雾剂或液体喷雾剂、滴剂、安瓿、自动喷射装置或栓剂；用于口服、胃肠外、鼻内、舌下或直肠投与，或用于通过吸入或吹入的投与。或者，组合可以适于每周一次或每月一次投与的形式存在。可考虑含有活性成分的易蚀聚合物。对于制备固体组合(如片剂)来说，将主要活性成分与医药载剂(例如常规片剂成分，如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶)和其它稀释剂(例如水)混合，从而形成含有本发明的化合物或其盐、衍生物或组合物的均匀混合物的固体预调配组合。当提及这些预调配组合为均匀时，意指成分遍及组合均匀分散，以使组合可易于再分为等效的单位剂型(如片剂、丸剂和胶囊)。新颖组合的片剂或丸剂可经包衣或以其它方式混配以提供具有延长作用的优势的剂型。举例来说，片剂或丸剂可包含内部剂量和外部剂量组分，后者呈前者上的包膜的形式。两种组分可由肠衣层分隔，所述肠衣层用于防止在胃中崩解且容许内部组分完整传递到十二指肠内或延迟释放。各种材料可用于所述肠衣层或包衣，所述材料包括多种聚合酸和聚合酸与如虫胶、十六烷醇和乙酸纤维素的材料的混合物。

适合的调配物包括本发明的组合的水性或油性溶液。适于活性成分胃肠外传递的调配物包括水性和非水性组合物，其中活性成分溶解或悬浮于溶液中。适于胃肠外投与的调配物包括水性和非水性无菌注射液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑细菌剂或使得调配物与预定接受者的血液等渗的溶质。其它胃肠外调配物可包含水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和增稠剂。

适于口服投与的本发明的调配物被制备为：如胶囊、扁囊剂、胶状物或片剂的个别单元，其各自含有预定量的樟芝乙醇萃取物的低极性洗脱份或樟芝酸A或其医药学上盐；粉末或颗粒；呈水性液体或非水性液体形式的溶液或悬浮液；或水包油液体乳液或油包水液体乳液。

用于直肠投与的调配物可以具有适合基质的栓剂形式存在。

适于肺内或经鼻投与的调配物将具有例如在0.01微米到200微米范围内的粒径(包括在以0.1微米的增量介于0.01微米与500微米之间的范围内的粒径，如0.1微米、0.2微米、0.3微米、0.4微米、0.5微米、1微米、2微米、5微米、30微米、35微米等)，其通过经鼻部通道吸入或通过经口腔吸入来投与，以便到达多个支气管或肺泡囊。适于气雾剂或干粉投与的调配物可根据常规方法制备且可与其它治疗剂一起传递。

适于阴道投与的调配物可以除活性成分外含有所述如此项技术中已知为适当的载剂的子宫托、棉塞、乳膏剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂调配物形式存在。

适于经皮投与的调配物可以经皮贴片的形式存在。经皮贴片向患者提供基线或稳态尼古丁(nicotine)水平。由贴片剂在使用期间释放的樟芝乙醇萃取物的低极性洗脱份或樟芝酸A或其医药学上盐的总量将视使用者的体型大小、暴露于尼古丁的历史以及对治疗的反应而变化。贴片的尺寸将根据待传递的尼古丁的量而变化。

包含本发明的组合的调配物以单位剂量或多剂量容器(例如密封安瓿和小瓶)形式存在，且可储存在冷冻干燥(冻干)条件中，在即将使用之前，仅需加入无菌液体载剂(例如注射用水)即可。可自先前描述的种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备临时注射溶液和悬浮液。如本文所述，优选的单位剂量调配物为含有日剂量或单位日亚剂量的单位剂量调配物。

应理解，除本发明的组合以外，以上特别提及的本发明的调配物可包括此项技术中常规的与所讨论的调配物类型有关的其它药剂，例如适于口服投与的药剂可包括调味剂或着色剂。

本发明的组合可用于提供控制释放医药调配物，其中控制和调节本发明的组合的释放，从而允许较不频繁的给药或改进本发明的组合的药物动力学或毒性概况。

调配物包括适于前述投药途径中的任一者的调配物。调配物可便利地存在于单位剂型中且可通过药剂学技术中熟知的任何方法制备。所述方法包括使活性成分与构成一种或一种以上辅助成分或赋形剂的载剂结合的步骤。一股来说，通过使活性成分与液态载剂或细粉状固体载剂或两者均匀且紧密结合且接着(如果必要)使产物成形来制备调配物。举例来说，通过任选地与一种或一种以上辅助成分一起压制或模制来制造片剂。压制片剂可通过在适当机器中压制呈如粉末或颗粒的自由流动形式，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性或分散剂混合的本发明的组合来制备。模制片剂可通过在适当机器中模制用惰性液体稀释剂湿润的粉末状活性成分的混合物来制备。片剂可任选地经包衣或刻划且任选地经调配以便由其提供减缓或控制释放的活性成分。

在另一方面中，本发明提供一种在低毒性情况下抑制和／或治疗肿瘤细胞的方法，其包含投与个体有效量的本发明的组合，所述本发明的组合包含樟芝酸或其盐或酯衍生物或组合物以及有效量的抗肿瘤药物。根据本发明的一个实施例，樟芝酸或其盐或酯衍生物或组合物和抗肿瘤药物可单独、同时或依序投与。

根据本发明，樟芝酸或其盐或酯衍生物或组合物以及抗肿瘤药物适用于在低毒性和选择性情况下抑制肿瘤细胞。具体地说，本发明的组合对肿瘤细胞而非正常细胞具细胞毒性。在组合地使用樟芝酸或其盐或酯衍生物或组合物时，抗肿瘤药物的量可减少。根据本发明，肿瘤为骨髓淋巴瘤、肝细胞癌、肝母细胞瘤、横纹肌肉瘤、食道癌、甲状腺癌、恶性神经节瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤(1ymphangioendotheliosarcoma)、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肉瘤(Ewing’s tumor)、膀胱平滑肌肉瘤、横纹肌内皮肉瘤(rhabdotheliosarcoma)、结肠癌、胰脏癌、肝癌、乳房癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓性癌、支气管癌、肾细胞癌、血肿、胆管癌、黑色素瘤、绒膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、韦尔姆斯氏瘤(Wilms'tumor)、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、神经管母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病(例如急性淋巴细胞性白血病)、急性髓细胞性白血病(成髓细胞性、前髓细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金氏病(Hodgkin’s disease)和非霍奇金氏病)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、直肠癌、头颈部癌症、脑癌、原发位不明癌、外周神经系统癌、中枢神经系统癌、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、重链病、癌转移以及特征在于细胞生长不受控制或异常的任何疾病或病症。肿瘤优选地为肝脏肿瘤或乳房肿瘤。

在一个实施例中，肿瘤为肝癌。肝癌包括肝细胞癌(HCC)、血管内皮瘤、肉瘤、肝母细胞瘤或胆管癌(bile duct cancer／cholangiocarcinoma)。本发明的组合可任选地用于组合疗法以治疗这些疾病或病状中的任一者。组合疗法包括本发明的组合与手术、放射疗法、化学疗法、细胞毒性剂或细胞生长抑制剂的组合，包括本文中所公开或在本文中所引用的任何参考文献中的任何疗法或治疗。本发明的组合优选地可与化学疗法组合使用。或者，本发明的组合可用作化学治疗剂或辅助化学治疗剂。

用于治疗性应用的本发明组合的有效剂量将在一定程度上至少视以下因素而定：如所治疗的病状的状态、是否是防治性地(较低剂量)使用本发明的组合、或恶性疾病的严重度和传递的方法。这些因素将由临床医师使用常规剂量递增研究确定。

任何适合的投药途径均可用于提供患者有效剂量的本发明的组合。举例来说，视情况可使用口服、直肠、胃肠外、经皮、经粘膜、皮下、肌肉内、鞘内、肺内、经鼻或阴道等。

本发明的组合可有效抑制肿瘤细胞而非正常细胞。因此，本发明的组合可在低毒性情况下选择性抑制肿瘤细胞。此外，通过组合地使用樟芝酸或其酯衍生物、盐或组合物，可减少抗肿瘤药物的量，因此减少由抗肿瘤引起的副作用。

实例

实例1樟芝酸A与5-氟尿嘧啶(5FU)的组合的细胞生存力分析(MTT分析)

将2×10⁴个HepG2细胞接种到96孔板的每个孔中，并且用含有10％FBS和1％抗生素-抗霉菌溶液的DMEM培养基孵育。去除培养基，并且然后将6.25μg／ml5-氟尿嘧啶(5FU)作为对照物、200μg／ml5FU+25μg／ml樟芝酸A、200μg／ml5FU+20μg／ml樟芝酸A、200μg／ml5FU+15μg／ml樟芝酸A、200μg／ml5FU+10μg／ml樟芝酸A、200μg／ml5FU+5μg／ml樟芝酸A、100μg／ml5FU+25μg／ml樟芝酸A、100μg／ml5FU+20μg／ml樟芝酸A、100μg／ml5FU+15μg／ml樟芝酸A、100μg／ml5FU+10μg／ml樟芝酸A、100μg／ml5FU+5μg／ml樟芝酸A加入到孔中。24小时之后，去除试剂，并且将100μ10.5％mg／ml溴化3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑(MTT)加入到每个孔中用于MTT分析。在37℃下在暗处孵育2小时之后，去除溶液，并且将100μ1DMSO加入到每个孔中，并且将其在暗处放置10分钟。从每个孔取用溶液，并且然后使其经历ELISA读取器以检测570nm波长下的吸光度。通过使用对照物的吸光度作为100％来计算细胞生存力百分比。

如图l中所示，用5FU处理的HepG2细胞的IC₅₀是200μg／ml，并且即使高浓度5FU情况下的细胞也不能完全被杀死。然而，分别用200μg／ml5FU以及5μg／ml、10μg／ml、15μg／ml、20μg／ml和25μg／ml的樟芝酸A处理的细胞可以几乎完全被杀死(图2)。在将5FU浓度降低到100μg／ml并且分别用100μg／ml5FU以及5μg／ml、10μg／ml、15μg／ml、20μg／ml和25μg／ml的樟芝酸A处理HepG2细胞之后，细胞可以几乎完全被杀死(图3)。

此外，分别用培养基作为对照物、200μg／ml5FU、100μg／ml5FU和100μg／ml5FU以及25μg／ml樟芝酸A处理正常细胞株CCD-966SK，以测试本发明的组合对正常细胞的作用。如图4中所示，加入樟芝酸A可增强用5FU处理的细胞的细胞生存力。

另外，当分别用樟芝酸A10μg／ml以及12.5μg／ml、25μg／ml、50μg／ml、100μg／m1 和200μg／ml的5FU处理HepG2细胞和CCD-966SK细胞时，可以有效抑制癌细胞(HepG2细胞)，同时正常细胞(CCD-966SK细胞)具有高生存力(参见图5)。结果显示，樟芝酸A可以增强5FU在杀死癌细胞中的作用(即减少5FU的量)，同时使正常细胞保持在高生存力下(即减少对正常细胞的细胞毒性)。

实例2樟芝酸A与他莫昔芬的组合的细胞生存力分析(MTT分析)

除3.13μg／ml他莫昔芬+25μg／ml樟芝酸A、3.13μg／ml5FU+20μg／ml樟芝酸A、3.13μg／ml他莫昔芬+15μg／ml樟芝酸A、3.13μg／ml他莫昔芬+10μg／ml樟芝酸A、3.13μg／ml他莫昔芬+5μg／ml樟芝酸A作为测试样品以外，对照物、测试条件、材料和方法与实例l相同。如图6中所示，用他莫昔芬处理的HepG2细胞的IC₅₀是8.02μg／ml，并且用12.5μg／ml他莫昔芬处理的细胞不能完全被杀死。通过分别使用低浓度的他莫昔芬以及5μg／ml、10μg／ml、15μg／ml、20μg／ml和25μg／ml的樟芝酸A，细胞生存力可以显著减弱。如图7中所示，在分别用3.13μg／ml他莫昔芬(“TAM”)以及5μg／ml、10μg／ml、15μg／ml、20μg／ml和25μg／ml的樟芝酸A处理HepG2细胞之后，细胞生存力分别是49.92％、41.52％、30.82％、26.21％和23.18％。

此外，分别用培养基作为对照物、3.13μg／ml他莫昔芬(“TAM”)和3.13μg／ml TAM以及15μg／ml樟芝酸A处理正常细胞株CCD-966SK，以测试本发明的组合对正常细胞的作用。如图8中所示，加入樟芝酸A可增强用TAM处理的细胞的细胞生存力。

另外，当分别用10μg／ml樟芝酸A以及0.625μg／ml、1.25μg／ml、2.5μg／ml、5μg／ml和10μg／ml的TAM处理HepG2细胞和CCD-966SK细胞时，可以有效抑制癌细胞(HepG2细胞)，同时正常细胞(CCD-966SK细胞)具有高生存力(参见图9)。结果显示，樟芝酸A可以增强TAM在杀死癌细胞中的作用(即减少5FU的量)，同时使正常细胞保持在高生存力下(即减少对正常细胞的细胞毒性)。

实例3樟芝酸A与舒尼替尼和樟芝酸A与米托蒽醌的组合的细胞生存力分析(MTT分析)

对照物、测试条件、材料和方法与实例1相同。如图10中所示，用舒尼替尼处理的HepG2细胞的IC₅₀是约25μg／ml，并且正常细胞(CCD-966SK细胞)也在此浓度下被杀死。当分别用10μg／ml的樟芝酸A以及5μg／ml、10μg／ml、15μg／ml、20μg／ml和25μg／ml的舒尼替尼处理HepG2细胞和CCD-966SK细胞时，可以有效抑制癌细胞(HepG2细胞)，同时正常细胞(CCD-966SK细胞)具有高生存力(参见图11)。结果显示，樟芝酸A可以增强舒尼替尼在杀死癌细胞中的作用(即减少5FU的量)，同时使正常细胞保持在更高生存力下(即减少对正常细胞的细胞毒性)。

转向米托葸醌，如图12中所示，用米托葸醌处理的HepG2细胞的IC₅₀是约25μg／ml，并且正常细胞(CCD-966SK细胞)的生存力也在此浓度下减弱。当分别用10μg／ml的樟芝酸A以及2.5μg／ml、5μg／ml、6.25μg／ml、10μg／ml和12.5μg／ml的米托葸醌处理HepG2细胞和CCD-966SK细胞时，可以有效抑制癌细胞(HepG2细胞)，同时正常细胞(CCD-966SK细胞)具有更高生存力(参见图13)。结果显示，樟芝酸A可以增强舒尼替尼在杀死癌细胞中的作用(即减少5FU的量)，同时使正常细胞保持在更高生存力下(即减少对正常细胞的细胞毒性)。

实例3本发明的组合樟芝酸A与5FU、樟芝酸A与他莫昔芬、樟芝酸A与舒尼替尼和樟芝酸A与米托蒽醌的动物模型测试

将2×10⁶个HepG2人类肝癌细胞注入到NOD-SCID小鼠的背中以形成肿瘤。在肿瘤生长到10×10mm³之后，每天分别将本发明的组合，即分别1mg／kg量的樟芝酸A与20mg／kg、10mg／kg、5mg／kg、2.5mg／kg、1.25mg／kg量的5FU，分别1mg／kg量的樟芝酸A与1mg／kg、0.5mg／kg、0.25mg／kg、0.125mg／kg、0.0625mg／kg量的他莫昔芬，分别1mg／kg量的樟芝酸A与2.5mg／kg、2mg／kg、1.5mg／kg、1mg／kg、0.5mg／kg量的舒尼替尼，和分别1mg／kg量的樟芝酸A与1.25mg／kg、1mg／kg、0.625mg／kg、0.5mg／kg、0.25mg／kg量的米托葸醌注入到小鼠的腹腔中。将乙醇注入到小鼠中作为对照物。在每天一次注入持续14天之后，将小鼠杀死，并且测量肿瘤的尺寸。结果显示，本发明的组合显著减小肿瘤的尺寸(约20％到70％减小)。

Claims

1.一种抗肿瘤药物以及樟芝酸或其盐或酯衍生物或组合物的组合，其中所述樟芝酸或其盐或酯衍生物或组合物的量可减少所述抗肿瘤药物的量并且对正常细胞提供低细胞毒性，其中所述樟芝酸具有下式：

其中

R₁是=O或OH；R₂是H或OH；R₃是H、=O、OH或O-乙酰基；R₄是H或OH；R₅是H；R₆是H或OH；并且R₇是=O或OH。

2.根据权利要求1所述的组合，其中樟芝酸是樟芝酸A、樟芝酸B、樟芝酸C、樟芝酸D、樟芝酸E、樟芝酸F、樟芝酸H或樟芝酸K。

3.根据权利要求1所述的组合，其中樟芝酸是樟芝酸A。

4.根据权利要求1所述的组合，其中所述樟芝酸盐包括碱加成盐和酸加成盐。

5.根据权利要求1所述的组合，其中所述樟芝酸酯衍生物是烷基樟芝酸、炔基樟芝酸、烯基樟芝酸。

6.根据权利要求1所述的组合，其中所述樟芝酸酯衍生物是樟芝酸A甲酯、樟芝酸B甲酯、樟芝酸C甲酯、樟芝酸G甲酯、樟芝酸H甲酯、樟芝酸A乙酯或樟芝酸B乙酯。

7.根据权利要求1所述的组合，其中所述樟芝酸组合物是樟芝的萃取物。

8.根据权利要求7所述的组合，其中所述樟芝萃取物是樟芝乙醇萃取物的低极性洗脱份。

9.根据权利要求1所述的组合，其中所述抗肿瘤药物是抗有丝分裂药物、抗代谢药物、烷基化剂、氮芥、靶向DNA的药物、拓扑异构酶抑制剂、激素拈抗剂或酪氨酸激酶抑制剂。

10.根据权利要求9所述的组合，其中所述抗有丝分裂药物是紫杉醇、太平洋紫杉醇、多烯紫杉醇、多烯紫杉醇、足叶草毒素、长春新碱或长春碱；所述抗代谢药物是5-氟尿嘧啶5FU、阿糖胞苷、吉西他滨、喷司他丁或甲氨喋呤；所述烷基化剂是顺铂、卡铂、奥沙利铂或帕拉尼素；所述氮芥是亚硝基脲、环磷酰胺或异环磷酰胺；所述靶向DNA的药物是阿霉素、小红莓、表阿霉素或表柔比星；所述拓扑异构酶抑制剂是喜树碱、依托泊苷、米托葸醌或小红莓；所述激素拈抗剂是他莫昔芬、氟他胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林、环丙孕酮或奥曲肽；所述酪氨酸激酶抑制剂是伊马替尼、吉非替尼、埃罗替尼或舒尼替尼。

11.根据权利要求9所述的组合，其中所述抗有丝分裂药物是太平洋紫杉醇或多烯紫杉醇；所述抗代谢药物是5FU；所述烷基化剂是顺铂或卡铂；所述氮芥是环磷酰胺；所述靶向DNA的药物是小红莓；所述拓扑异构酶抑制剂是喜树碱、米托葸醌或小红莓；抗雌激素药是他莫昔芬；并且所述酪氨酸激酶抑制剂是舒尼替尼。

12.根据权利要求9所述的组合，其中所述抗肿瘤剂是5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、吉西他滨、诸如喷司他丁、甲氨喋呤的嘌呤类似物、他莫昔芬、顺铂、卡铂、奥沙利铂或帕拉尼素。

13.根据权利要求1所述的组合，其中所述樟芝酸或其盐或酯衍生物或组合物以及抗代谢药物或激素拈抗剂的量分别介于约0.5％(w／w)到约95％(w／w)和约99.5％(w／w)到约5％(w／w)范围内。

14.一种在对个体的肿瘤具选择性的情况下抑制和／或治疗肿瘤的方法，其包含向个体投与有效量的根据权利要求1所述的组合，其中所述组合包含抗肿瘤药物以及樟芝酸或其盐或酯衍生物或组合物，并且其中所述樟芝酸或其盐或酯衍生物或组合物的量可减少所述抗肿瘤药物的量并且对正常细胞提供低细胞毒性。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述抗肿瘤药物和所述樟芝酸或其盐或酯衍生物或组合物是单独、同时或连续投与的。

16.根据权利要求14所述的方法，其中樟芝酸是樟芝酸A。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述樟芝酸酯衍生物是樟芝酸A甲酯、樟芝酸B甲酯、樟芝酸C甲酯、樟芝酸G甲酯、樟芝酸H甲酯、樟芝酸A乙酯或樟芝酸B乙酯。

18.根据权利要求14所述的方法，其中所述樟芝酸组合物是含有樟芝酸的樟芝的萃取物。

19.根据权利要求14所述的方法，其中所述樟芝萃取物是樟芝乙醇萃取物的低极性洗脱份。

20.根据权利要求14所述的方法，其中所述抗肿瘤药物是抗有丝分裂药物、抗代谢药物、烷基化剂、氮芥、靶向DNA的药物、拓扑异构酶抑制剂、激素拈抗剂或酪氨酸激酶抑制剂。

21.根据权利要求13所述的方法，其中所述肿瘤选自由以下组成的群组：肝细胞癌、肝胚细胞瘤、结肠癌、胰脏癌、肝癌、乳癌、卵巢癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、直肠癌、头颈癌或脑癌。