CN105311036B - 樟芝酸h在防治药物性肝损伤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了樟芝酸H在防治药物性肝损伤中的应用。所述樟芝酸H为式Ⅰ所示化合物。樟芝酸H具有防治药物性肝损伤的作用，樟芝酸H属于纯天然制剂，安全无毒性，对APAP诱导的急性肝损伤具有良好的防治作用，本发明为研制以樟芝酸H组分为基础的保肝药物以及保健品提供了科学依据，具有重大的应用价值。

Description

樟芝酸H在防治药物性肝损伤中的应用

技术领域

本发明涉及一种樟芝酸H的新用途，具体涉及樟芝酸H在防治药物性肝损伤中的应用。

背景技术

药物性肝损伤(DILI，Drug induced liver injury)是指在药物使用过程中，因药物本身或代谢产物或由于特殊体质对药物的超敏感性或耐受性降低所导致的肝脏损伤。临床上表现为急性和慢性肝病，轻者停药后可自行恢复，重者可能危及生命、需积极治疗、抢救。DILI可以发生在以往没有肝病史的健康者或原来就有严重疾病的患者身上；可发生在用药超量时，也可发生在正常用量的情况下。目前我们日常生活中接触的药物及保健品已超过30000种，明确可以引起DILI的药物超过1000种，因此，DILI已成为一个不容忽视的严重公共卫生问题。

对乙酰氨基酚(Acetaminophen，APAP)(扑热息痛)是临床最常用的解热镇痛抗炎药，也是临床引起肝毒性的最常见的药物，长期或过量使用APAP易导致急性肝功能衰竭。FDA于2014年2月发布公告，建议医生和医疗人员用含APAP不超过325mg的药品，并表示，限制此类药品能降低患者因过量服用而导致的严重肝脏损害风险。但是，APAP为日常生活中常用的一类药物，它所引起的急性肝损伤是较严重的，重者会引起死亡。据报道，在美国大约40％的急性肝衰竭与该药物有关。研究开发能够有效防治药物性肝损伤，特别是治疗APAP肝损伤的药物具有重要的实际应用价值。

牛樟芝又称牛樟菇，属担子菌纲、多孔菌目、多孔菌科、薄孔菌属。牛樟芝是我国台湾特有的稀世珍宝，一直被誉为治疗肝病的神奇药王。近年的研究证实其确实具有解毒保肝、消除肿瘤、补肾强心、益胃整肠、强化免疫、镇痛抗菌等作用。有关牛樟芝生物学功能的化学(组分)基础和生物学机理尚未完全阐明。

发明内容

本发明的目的是提供牛樟芝组成成分—樟芝酸H(Antcin H)基于防治药物诱导肝损伤的新用途，通过本发明，可以制备含有樟芝酸H的具有保肝功效的药物或保健食品。

本发明中的樟芝酸H为式Ⅰ所示化合物；

本发明首先提供了樟芝酸H在制备预防药物性肝损伤的药物和/或保健品中的应用。

所述药物性肝损伤具体为对乙酰氨基酚致急性肝损伤。

所述应用具体可表现为下述1)或2)：

1)所述樟芝酸H抑制血清中谷丙转氨酶水平升高；

2)所述樟芝酸H抑制肝组织中肝细胞坏死。

本发明还提供了樟芝酸H在下述1)或2)中的应用：

1)制备抑制血清中谷丙转氨酶水平升高的产品；

2)制备抑制肝组织中肝细胞坏死的产品。

本发明进一步提供了樟芝酸H在制备治疗药物性肝损伤的药物和/或保健品中的应用。

所述药物性肝损伤具体为对乙酰氨基酚致急性肝损伤。

所述应用具体可表现为下述1)或2)：

1)所述樟芝酸H抑制肝细胞系凋亡；

2)所述樟芝酸H抑制原代肝细胞坏死。

所述肝细胞系为小鼠AML-12细胞；

所述原代肝细胞为小鼠原代肝细胞。

本发明还进一步提供了樟芝酸H在下述1)或2)中的应用：

1)制备抑制肝细胞系凋亡的产品；

2)制备抑制原代肝细胞坏死的产品。

使用所述樟芝酸H预防对乙酰氨基酚致急性肝损伤时，使用低剂量25mg/kg体重时，由H&E染色结果可知：肝小叶结构存在。偶见点灶状肝细胞坏死和少量单核淋巴细胞灶状浸润，坏死灶数目1个/10个10倍视野；肝细胞界板完整；汇管区未见炎细胞浸润。使用高剂量50mg/kg体重时，由H&E染色结果可知：肝小叶结构存在；肝小叶内无肝细胞坏死；肝细胞界板完整；汇管区未见炎细胞浸润。

使用所述樟芝酸H治疗对乙酰氨基酚致急性肝损伤时，使用高剂量50mg/kg体重时，由H&E染色结果可知：肝小叶结构存在，可见肝细胞坏死灶，相比于模型对照组，坏死灶区域及数目明显降低。

本发明还提供了一种具有保肝作用的药物或保健品，其活性成分为所述樟芝酸H，具体可以有效量的所述樟芝酸H为活性成分，加入适宜辅料制备得到。

本发明公开了牛樟芝中的一种活性成分—樟芝酸H具有防治药物性肝损伤的作用，樟芝酸H属于纯天然制剂，安全无毒性，对APAP诱导的急性肝损伤具有良好的防治作用，本发明为研制以樟芝酸H组分为基础的保肝药物以及保健品提供了科学依据，具有重大的应用价值。

附图说明

图1为实施例1中H&E染色的结果，其中图1(A)为空白对照组，图1(B)为肝损伤模型对照组，图1(C)为低剂量樟芝酸H肝损伤保护组，图1(D)为高剂量樟芝酸H肝损伤保护组。

图2为实施例1中血清中谷丙转氨酶数值的变化。

图3为实施例2中H&E染色的结果，其中图3(A)为空白对照组，图3(B)为肝损伤模型对照组，图3(C)为低剂量樟芝酸H肝损伤保护组，图3(D)为高剂量樟芝酸H肝损伤保护组。

图4为实施例2中血清中谷丙转氨酶数值的变化。

图5为实施例3中H&E染色的结果，其中其中图5(A)为空白对照组，图5(B)为肝损伤模型对照组，图5(C)为高剂量樟芝酸H肝损伤保护组。

图6为实施例3中血清中谷丙转氨酶数值的变化。

图7为实施例4中小鼠原代肝细胞死亡率的变化。

图8为实施例5中肝细胞系AML-2凋亡的变化。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

雄性C57BL/6小鼠：北京维通利华公司。

全自动生化分析仪：日立，7020型。

5％吐温-80溶液即含5％(体积比)吐温-80的PBS溶液。

樟芝酸H溶液是将樟芝酸H溶于5％吐温-80溶液得到的。

樟芝酸H玉米油溶液是将樟芝酸H溶解于玉米油中得到的。

APAP溶液即用加热55℃的PBS溶解所得。

AML-12(alpha mouse liver 12)：正常小鼠肝细胞系，购于ATCC。

SYTOX-green和Hoechst33258试剂：Invitrogen公司。

AnnexinⅤ/PI凋亡试剂盒：MBL公司。

ALT检测试剂盒：Teco Diagnostics公司。

下述实施例中所用的樟芝酸H是式Ⅰ所示化合物，按照文献(Chen CH,Yang SW,Shen YC.New steroid acids from Antrodia cinnamomea,a fungal parasite ofCinnamomum micranthum.J Nat Prod 1995；58:1655–61.)(即文献中Antcin H)中公开的方法制备，

实施例1、樟芝酸H对APAP致急性肝损伤的预防保护作用

雄性C57BL/6小鼠40只，适应性饲养一周，自由采水、饮食。一周后随机分为4组，即空白对照组、模型对照组、低剂量樟芝酸H组和高剂量樟芝酸H组，每组10只。具体处理如下：

实验第1、2、3和4天，空白对照组和模型对照组，每天灌胃一次5％吐温-80溶液，每次体积为10μL/g体重；低剂量樟芝酸H组，每天灌胃5％吐温-80溶解的樟芝酸H，剂量为25mg/kg体重，每次体积为10μL/g体重；高剂量樟芝酸H组，每天灌胃5％吐温-80溶解的樟芝酸H，剂量为50mg/kg体重，每次体积为10μL/g体重。

实验第4天晚上禁食10小时，实验第5天，空白对照组和模型对照组灌胃5％吐温-80溶液；低剂量樟芝酸H组灌胃剂量为25mg/kg的5％吐温-80溶解的樟芝酸H；高剂量樟芝酸H组灌胃剂量为50mg/kg的5％吐温-80溶解的樟芝酸H。1小时之后，空白对照组腹腔注射PBS溶液，注射体积为12μL/g体重；模型对照组、低剂量樟芝酸H组和高剂量樟芝酸组均注射剂量为300mg/kg的APAP溶液，注射体积为12μL/g体重。10小时后，取血(采用全自动生化分析仪测定血清中谷丙转氨酶)。取肝脏，福尔马林浸泡固定后用于制片H&E染色。

结果如图1和图2。

图1为H&E染色的结果(A为空白对照组，B为模型对照组，C为低剂量樟芝酸H组，D为高剂量樟芝酸H组)。

图2为血清中谷丙转氨酶数值的结果。

空白对照组(图1(A))：肝小叶结构存在。肝小叶内未见肝细胞坏死。肝细胞界板完整。汇管区未见炎细胞浸润。

肝损伤模型对照组(图1(B))：肝小叶结构存在。肝小叶内亚大片肝细胞坏死，以肝小叶中央区为著，坏死灶数目150个/10个10倍视野。肝细胞界板完整。汇管区未见炎细胞浸润。

低剂量樟芝酸H组(图1(C))：肝小叶结构存在。偶见点灶状肝细胞坏死和少量单核淋巴细胞灶状浸润，坏死灶数目1个/10个10倍视野。肝细胞界板完整。汇管区未见炎细胞浸润。

高剂量樟芝酸H组(图1(D))：肝小叶结构存在。肝小叶内无肝细胞坏死。肝细胞界板完整。汇管区未见炎细胞浸润。

由图1所示的病理切片结果可知，口服樟芝酸H具有显著地预防APAP致急性肝损伤的作用。

谷丙转氨酶(又名谷氨酸转氨酶，简称GPT或ALT)，主要分布在肝细胞浆内，如果肝细胞坏死，血清中谷丙转氨酶水平就会升高，升高程度与肝细胞受损程度一致，因此是目前最常用的肝功能指标之一。图2的结果显示，腹腔注射APAP给小鼠可使小鼠血清中的ALT水平显著增加，表明小鼠急性肝损伤造模成功。灌胃樟芝酸H可使APAP肝损伤小鼠血清中的ALT水平显著降低。

实施例2、樟芝酸H对APAP致急性肝损伤的预防作用

雄性C57BL/6小鼠20只，适应性饲养一周，自由采水、饮食。一周后随机分为4组，即空白对照组、模型对照组、低剂量樟芝酸H组和高剂量樟芝酸H组，每组5只。具体处理如下：

空白对照组和模型对照组，腹腔注射玉米油，注射体积为8μL/g体重；低剂量组，腹腔注射玉米油溶解的樟芝酸H，剂量为25mg/kg，注射体积为8μL/g体重；高剂量组，腹腔注射玉米油溶解的樟芝酸H，剂量为50mg/kg，注射体积为8μL/g体重。

1小时之后，空白对照组腹腔注射PBS溶液，注射体积为12μL/g体重；模型对照组、低剂量樟芝酸H组和高剂量樟芝酸组均注射剂量为300mg/kg的APAP溶液，注射体积为12μL/g体重。24小时之后，取血(采用Teco Diagnostics公司的试剂盒检测谷丙转氨酶数值)。取肝脏，福尔马林浸泡固定后用于制片H&E染色。

结果如图3和图4所示。

图3为H&E染色结果(A为空白对照组，B为模型对照组，C为低剂量樟芝酸H组，D为高剂量樟芝酸H组)。

图4为血清中谷丙转氨酶数值的结果。

空白对照组(图3(A))：肝小叶内未见肝细胞坏死。肝细胞界板完整。

模型对照组(图3(B))：肝小叶内大片肝细胞坏死，以肝小叶中央区为著。

低剂量樟芝酸H组(图3(C))：肝小叶内见少量肝细胞坏死。

高剂量樟芝酸H组(图3(D))：肝小叶结构存在。肝小叶内无肝细胞坏死。

由图3所示的病理切片结果可知，樟芝酸H预先注射1h，可以显著的预防APAP所致急性药物性肝损伤的作用。

图4的结果显示，小鼠腹腔注射APAP，血清中ALT水平显著增加，表明肝损伤模型成功。樟芝酸H预处理1h则可以很明显的降低ALT水平；另外，樟芝酸H进行预处理也均可使APAP肝损伤小鼠血清中的ALT水平显著降低。

实施例3、樟芝酸H对APAP致急性肝损伤的治疗作用

雄性C57BL/6小鼠18只，适应性饲养一周，自由采水、饮食。一周后随机分为3组，即空白对照组、模型对照组和高剂量樟芝酸H组，每组6只。具体处理如下：

空白对照组腹腔注射PBS溶液，注射体积为12μL/g体重；模型对照组和高剂量樟芝酸H组均腹腔注射APAP溶液，剂量为300mg/kg，注射体积为12μL/g体重。

1小时之后，空白对照组和模型对照组，腹腔注射玉米油，注射体积为8μL/g体重；高剂量组，腹腔注射玉米油溶解的樟芝酸H，剂量为50mg/kg，注射体积为8μL/g体重。

结果如图5和图6所示。

图5为H&E染色结果(A为空白对照组、B为模型对照组，C为高剂量樟芝酸H组(1：1))。

图6为血清中谷丙转氨酶数值的结果。

空白对照组(图5(A))：肝小叶内未见肝细胞坏死。肝细胞界板完整。

模型对照组(图5(B))：肝小叶内大片肝细胞坏死，以肝小叶中央区为著。

高剂量樟芝酸H组(图5(C))：肝小叶结构存在，可见肝细胞坏死灶，相比于模型对照组，坏死灶区域及数目明显降低。

由图5所示的病理切片结果可知，在APAP注射1h之后，腹腔注射樟芝酸H可以显著的治疗APAP所致的急性药物性肝损伤。

图6的结果显示，小鼠腹腔注射APAP，血清中ALT水平显著增加，急性肝损伤模型造模成功。APAP注射1h之后，注射樟芝酸H可以明显降低ALT水平。

实施例4、体外细胞实验，樟芝酸H对APAP致急性肝损伤的防治作用

通过二次灌注法，分离C57BL/6小鼠原代肝细胞，细胞贴壁2h之后，换用无血清、无酚红指示剂的DMEM/F12培养基培养细胞，对细胞做以下处理：

空白对照组：含有与样品处理组相等体积DMSO的基础培养基；

模型对照组：将10mM APAP溶解于基础培养基中，处理2h之后，移除APAP，只保留基础培养基，加入与处理组相等体积的DMSO；

阴性对照组：基础培养基中加入75μM樟芝酸H；

樟芝酸H处理组：将10mM APAP溶解于基础培养基中，处理2h之后，去除APAP，加入75μM樟芝酸H。

处理24h之后，通过SYTOX-green和Hoechst3325染色，荧光显微镜下观察，计算细胞坏死率。

结果如图7所示。原代细胞经APAP诱导，细胞坏死程度明显上升，说明肝损伤细胞模型成功，加入樟芝酸H处理组，细胞坏死率下降明显，加入樟芝酸H处理组的结果与樟芝酸H处理组的结果类似。

实施例5、体外细胞实验，樟芝酸H对APAP致急性肝损伤的防治作用

准备小鼠肝细胞AML-12，DMEM基础培养基+10％胎牛血清组成的完全培养基培养细胞，37℃，5％CO₂培养。药物处理之前24h，分细胞于六孔板中，等到细胞融合度达到50～60％加药处理。处理分别如下：

空白对照组：完全培养基中加入与处理组相等量的溶剂DMSO；

肝损伤模型对照组：完全培养基中加入30mM APAP溶液；

阴性对照组：完全培养基中加入50μM樟芝酸H；

樟芝酸H肝损伤保护组：培养基中加入30mM APAP，50μM樟芝酸H。

36h之后，胰酶收集细胞于离心管中，依据AnnexinⅤ/PI凋亡试剂盒操作步骤，加入85μL Binding Buffer，10μL AnnexinⅤ试剂，5μL试剂，样品前处理完成后，通过流式细胞仪检测细胞凋亡。

结果如图8所示。体外肝细胞损伤的表现形式最常见的为细胞凋亡，APAP加入之后，能明显诱导细胞的凋亡，阴性对照与空白对照组均没有表现出明显的细胞凋亡，樟芝酸H处理组和APAP实验组，细胞凋亡程度明显下降。

由上述各实施例可知，樟芝酸H具有显著的保护肝脏、防治药物性肝损伤的作用，具有良好的开发应用前景。

Claims (2)

1.樟芝酸H在制备预防药物性肝损伤的药物和/或保健品中的应用；所述樟芝酸H为式Ⅰ所示化合物；

所述药物性肝损伤为对乙酰氨基酚致急性肝损伤；

所述应用表现为下述1)或2)：

1)所述樟芝酸H抑制血清中谷丙转氨酶水平升高；

2)所述樟芝酸H抑制肝组织中肝细胞坏死。

2.樟芝酸H在制备治疗药物性肝损伤的药物和/或保健品中的应用；所述樟芝酸H为式Ⅰ所示化合物；

所述药物性肝损伤为对乙酰氨基酚致急性肝损伤；

所述应用表现为下述1)或2)：

1)所述樟芝酸H抑制肝细胞系凋亡；

2)所述樟芝酸H抑制原代肝细胞坏死。