CN101538304A - 一种真菌的混合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种牛樟菇化合物成份、一种牛樟菇组合物成份，另提供一种真菌的混合物及其制备方法。具体而言，本发明是以胶体培养基大量生产真菌。
Description
技术领域
本发明提供一种牛樟菇化合物成份、一种牛樟菇组合物成份，另提供一种真菌的混合物及其制备方法。具体而言，本发明是以胶体培养基大量生产真菌。
背景技术
樟菇又称牛樟芝或牛樟菇，属于非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌属多年生蕈菌类，学名为Antrodia cinnamomea，其是台湾特有的一种真菌，仅生长于台湾特有的牛樟树。樟菇是独特且珍贵的药用真菌，也是目前台湾最昂贵的野生真菌。樟菇的第一次新种发表是在1990年，当年臧穆、苏庆华以污染灵芝孢子的牛樟菇子实体，将牛樟菇归属于灵芝属下的新种Ganoderma comphoratum(Zang&Su)。到了1995年有第二次的新种发表，张东柱、周文能根据牛樟菇的型态及培养特性，尤其发现牛樟菇是木材褐腐菌，而将它命名在薄孔菌属的新种Antrodia cinnamomea(Chang TT&W N Chou)。1997年有了第三次的新种发表，吴声华将樟菇重新命名为Antrodia camphorata。2004年，张东柱、周文能根据国际植物命名法规ICBNArticle 9.12(Greuter et al.2000)将Ganoderma comphoratum与Antrodiacamphorata认定为混淆学名，且不再被使用，并恢复使用Antrodiacinnamomea的学名。
已经有研究显示，樟菇子实体的提取物中含有三种三萜类化合物，其分别是胺蕈A(antcin A)、胺蕈B(antcin B)以及胺蕈C(antcin C)。之后，又有研究报告指出，从子实体的提取物中又发现了三种新的三萜类化合物，其分别是胺卓蕈(antrocin)、4，7-双甲氧基-5-甲基-1，3-苯并间二氧杂环戊烯(4，7-dimethoxy-5-methyl-1，3-benzodioxole)、2，2’，5，5’-四甲氧基-3，4，3’，4’-双甲基-内双氧-6，6’-双甲基联苯(2，2’，5，5’-tetramethoxy-3，4，3’，4’-bimethyl-enedioxy-6，6’-dimethylbiphenyl)。到了1996年，又有研究显示另外四种新的三萜类化合物，其分别是胺蕈E(antcin E)、胺蕈F(antcin F)、甲基胺蕈酯G(methylantcinate G)、甲基胺蕈酯H(methylantcinate H)。在1996，另外又从子实体的提取物中发现了两种以麦角甾烷(ergostane)为骨架的新化合物，其分别是樟菇酸D(zhankuic acidD)与樟菇酸E(zhankuic acid E)；以及三种以羊毛甾烷(lanostane)为骨架的新化合物，其分别是15α-乙酰-去氢硫色多孔菌酸(15α-acetyl-dehydro-sulphurenic acid)、去氢齿孔酸(dehydroeburicoic acid)、去氢硫色多孔菌酸(dehydro-sulphurenic acid)。
由以上可知，樟菇成分非常复杂，其除了三萜类化合物，另还含有很多生理活性物质，例如多糖、超氧化物歧化酶(SOD)、腺苷、小分子蛋白质、维生素、微量元素、核酸、固醇类、血压稳定物质等。从先前的研究结果得知，樟菇含有独特的三萜类化合物，而这些化合物的抗癌细胞生长能力、活化神经细胞生长能力等生理活性机制仍待理清。
由于野生樟萜的生长环境均属于幽暗、潮湿且温度稍低的中海拔地区，且生长缓慢(生长期为1年以上)，因此要产生子实体的时间相当长。牛樟树及野生樟菇为保育类植物，目前人工培养的技术仍无法兼具大量栽培与生物活性，且樟菇盗采情形严重，有濒临灭种的危机。目前樟菇人工培养方式主要有三种：液体发酵、固体培养及椴木栽培。液体发酵：早先时期，产学界多数以液体发酵为主，发酵槽能大量生产，培养时间短、产量大，普遍上可以获得较高的多糖含量，但一直无法令其产生有效成分三萜类化合物，以致于研发内容受限，大都以多糖的功能性为主，发展潜力有限。固体培养：以太空包或器皿装入五谷杂粮为培养基的方式生产，产量更大，可产出部分三萜类，性能也比液态完整，但是生产稳定性不佳，且此法不易将菌丝与五谷杂粮的培养基分离，所以常将五谷杂粮的培养基一并收起，樟菇达不到实质的5％，导致整体的活性下降，且培养时间较长，一般需耗时3～4个月。椴木栽培：以牛樟椴木来培育樟菇，据说可以解决牛樟树及牛樟菇滥伐盗采的问题，但实则不是好方法，除生长期长需1～2年、椴木来源受限之外，批次间的质量差异极大，造成质量上稳定性的不佳。有鉴于目前樟菇培养方式的缺点及限制，本发明以胶体生成培育法培养牛樟菇，配合筛检平台，通过培养基的调整，以得到具抑制癌细胞生长、保肝及其他功效性的樟菇，其优点除了不受培养基影响功效性的判断、菌丝纯度更高外，培养时间缩短为1～1.5个月，可减少长时间培养造成杂菌污染的机会，同时增加空间产能的循环性，提升单位产能，降低成本。
发明内容
现行樟菇培养方式主要有三种：液体发酵、固体培养及椴木栽培。液体发酵：早先时期，产学界多数以液体发酵为主，发酵槽能大量生产，培养时间短、产量大，普遍上可以获得较高的多糖含量，但一直无法令其产生有效成分三萜类化合物，以致于研发内容受限，大都以多糖的功能性为主，发展潜力有限。固体培养：以太空包或器皿装入五谷杂粮为培养基的方式生产，产量更大，可产出部分三萜类，性能也比液态完整，但是生产稳定性不佳，且此法不易将菌丝与五谷杂粮的培养基分离，所以常将五谷杂粮的培养基一并收起，樟菇达不到实质的5％，导致整体的活性下降，且培养时间较长，一般需耗时3～4个月。椴木栽培：以牛樟椴木来培育樟菇，据说可以解决牛樟树及牛樟菇滥伐盗采的问题，但实则不是好方法，除生长期长需1～2年、椴木来源受限之外，批次间的质量差异极大，造成质量上稳定性的不佳。
为改善以上现象，使樟菇量产化，其药理特性又得以维持相当活性，因而产生本发明。
因此，本发明是关于一种来自胶体培养的牛樟菇菌丝体萃取物，其具有如图七(c)的用PLC的特性。
本发明另外是关于一种组合物，其包括本发明的萃取物。
在一组合物的优选具体实施例中，该萃取物包括下式I的化合物：
其中R1是α-OH或＝O；R2是β-OH或H；R3是β-OH或＝O；R4是α-OH或H；且R5是H。
本发明的组合物可抑制癌细胞(例如人类肝癌细胞)生长或具有护肝功能(例如抑制细胞释放门冬氨酸氨基转移酶(GOT)、丙氨酸氨基转移酶(GPT)、减少肝纤维化或降低肝细胞病变发生)。
该组合物中优选化合物分别是(a)胺蕈(Antcin)K，其中所述R1是α-OH；R2是β-OH；R3是β-OH；R4是H；且R5是H；(b)樟菇酸A，其中R1是O；R2是H；R3是＝O；R4是H；且R5是H；(c)樟菇酸B，其中所述R1是α-OH；R2是H；R3是＝O；R4是H；且R5是H或(d)樟菇酸C，其中所述R1是α-OH；R2是H；R3是＝O；R4是α-OH；且R5是H。
本发明另外是关于一种培养真菌的方法，其包含：
(a)于培养基中对真菌进行小量培养，以进行真菌繁殖；
(b)将含真菌的培养基块接种至可容纳至少两个真菌培养基块的胶体培养基；
(c)静置胶体培养基至真菌成熟；及
(d)由成熟真菌培养基中收集真菌。
本发明方法中所用真菌是取自野生或人工培养的樟菇(Antrodiacinnamomea)。
本发明方法中胶体培养基包含基材(如洋菜胶)、碳源(如葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、淀粉、纤维素、蔗糖或上述糖类的任一种组合)、氮源(如蛋白胨、三蛋白胨、牛肉提取物、麦芽提取物、酵母提取物或上述物质的任一种组合)、增量剂(如葵花油、橄榄油、维生素B6或上述物质的任一种组合)及无机酸盐(如磷酸盐、氯化钠、硫酸镁、氯化钾或上述物质的任一种组合)。磷酸盐可选自包括但不限于K2HPO3、K3PO3、KH2PO3、NaH2PO3、Na2HPO3或上述化合物的任一种组合。
本发明方法中胶体培养基各成份重量百分比如下：
基材重量百分比是0.5％～3％；
碳源重量百分比是0.5％～30％；
氮源重量百分比是0.05％～5％；
增量剂重量百分比是0.005％～0.05％；
无机酸盐重量百分比是0.01％～2.5％。
本发明方法中胶体培养基是于16℃～32℃培养20～45天。
本发明是经过抗癌细胞生长测试、抗自由基测试、抑制细胞释放门冬氨酸氨基转移酶(GOT)、丙氨酸氨基转移酶(GPT)测试、活体模式护肝活性测试，均显示卓越的樟菇药性。
附图说明
图1：樟菇培养方法的流程图。
图2：不同培养方式的樟菇提取物对人类癌细胞抑制效果。
图3：不同培养方式的樟菇提取物清除二苯代苦味肼基自由基的效果。
图4樟菇提取物及四氯化碳对细胞释放GOT的影响。
图5樟菇对四氯化碳诱导肝损伤的治疗效果。
图6樟菇对四氯化碳诱导肝损伤的大鼠肝脏病理组织切片照片。
图7三种樟菇培养方式的HPLC图。(A-樟菇酸(Zhankuic acid)A；B-樟菇酸B；C-樟菇酸C；K-胺蕈(Antcin)K)。
具体实施方式
培养方法
图1是依照本发明一优选实施例的樟菇培养方法的流程图。参照图1，首先对樟菇进行预培养步骤，其例如是在一斜面培养基上预培养樟菇。在此，樟菇例如是取自野生樟菇或是人工培养的樟菇。而预培养的目的是为了保留樟菇菌种，以作为日后需再进行人工培养樟菇时的菌种来源。在此，预培养的条件与方式可以采用已知的任何一种方法。
之后，将樟菇接种于一胶体培养基中。换言之，取出一部分由预培养出的樟菇，并将其接种于一胶体培养基中进行培养。本发明的胶体培养基包括基材、碳源、氮源、增量剂以及无机盐。上述基材例如洋菜胶。洋菜胶的重量百分比例如是介于0.5％至3％之间，其是以胶体培养基总重量为100％而言。
此外，胶体培养基中的碳源例如选自葡萄糖(glucose或Dextrose)、果糖、半乳糖、乳糖、淀粉(starch)、纤维素、蔗糖及其组合其中之一。碳源的重量百分比是0.5％至30％，其是以胶体培养基的总重量为100％而言。
另外，胶体培养基中的氮源例如是选自蛋白胨(peptone)、三蛋白胨(tripeptone)、牛肉提取物、麦芽提取物、酵母提取物及其组合其中之一。氮源的重量百分比是0.05％至5％，其是以胶体培养基的总重量为100％而言。
另外，胶体培养基中的增量剂例如是选自葵花油、橄榄油、维生素B6及其组合其中之一。增量剂的重量百分比是0.005％至0.05％，其是以胶体培养基的总重量为100％而言。
另外，胶体培养基中的无机酸盐例如是选自磷酸盐、氯化钠、硫酸镁、氯化钾及其组合其中之一。其中，磷酸盐例如是选自K2HPO3、K3PO3、KH2PO3、NaH2PO3、Na2HPO3及其组合其中之一。无机酸盐的重量百分比例如是介于0.01％至2.5％之间，其是以胶体培养基的总重量为100％而言。
在胶体培养基中培养樟菇的温度例如是介于16至32℃之间。于胶体培养基上进行培养时的培养震荡条件为静止。而于胶体培养基上进行培养的时间例如是介于20至45天。
以本发明的方法所培养出的樟菇具有与野生樟菇子实体相同的生理活性，因而能用于抑制人类癌细胞生长，亦可以降低肝损伤的GOT、GPT上升。
以下将举出一些测试结果，以证明利用本发明的方法所培养出的樟菇具有抑制人类癌细胞生长以及降低肝损伤的GOT、GPT上升的能力。
抗人类癌细胞生长测试
此测试方法是根据美国国家癌症研究所(National Cancer Institution，NCI)所订定的抗肿瘤药物筛检模式进行的测试。此测试方法是以人类肝癌细胞株(Hep 3B)进行离体测试。人类肝癌细胞株(Hep 3B)是于含有胎牛血清的培养基中培养24小时之后再更换新的培养基，然后加入待测试样品后培养72小时。之后再以MTT呈色分析法评估细胞的存活率。测试以本发明的方法所培养出的樟菇对人类肝癌细胞的生长抑制作用时，是以计算96孔微量盘各孔中的细胞存活率，以MTT呈色分析法评估癌细胞的存活率。
MTT(3-〔4，5-Dimenthylthialzol-2-yl〕2，5-diphenyltetrazolium bromide)是一种四唑蓝，为黄色染剂，可被活细胞吸收并在线粒体中被琥珀酸脱氢酶(succinate-tetrazolium reductase)还原成蓝色的甲臜(formazan)，常用于筛检物质对细胞的生长及增殖的影响。
由图2的结果显示，胶体培养出的樟菇抑制人类肝癌细胞生长的能力比液态或固体培养出的樟菇要好，与野生樟菇的活性最相近。
抗自由基测试
此测试方法是以清除二苯代苦味肼基自由基(DPPH)以进行离体测试。取DPPH溶液加入不同浓度的樟菇酒精提取物，经均匀混和后室温避光反应30分钟，以分光光度计测其517nm的吸光值，吸光值越低表示清除能力越强。
由图3的结果显示，胶体培养出的樟菇清除二苯代苦味肼基自由基的能力比液态或固体培养出的樟菇及野生樟菇强。
抑制细胞释放GOT测试
此测试方法是以人类肝癌细胞株(Hep G2)进行离体测试。人类肝癌细胞株(Hep G2)是于含有胎牛血清的培养基中培养24小时之后再更换新的培养基，然后加入待测试样品及四氯化碳(CCl4)后培养1小时。之后取上清液加入4％MTS的无血清培养基，40分钟之后以ELISA reader读取其490nm吸光值。测试以本发明的方法所培养出的樟菇对细胞释放GOT的抑制作用时，是以计算24孔微量盘各孔中吸光值，吸光值越低表示抑制效果越好。
由图4的结果显示，胶体培养出的樟菇(CAC101)抑制细胞释放GOT的能力比其他方式培养出的樟菇(CJ50005、CJ50013)及野生樟菇(AC)强。
活体模式护肝活性测试
以四氯化碳诱发大鼠慢性肝损伤为动物模式。
采用的动物为12周龄，体重约250～300g的雄性WISTAR为实验动物模式。动物经驯养后，分成6组，经口服投与四氯化碳诱导肝疾病，再以管喂投予樟菇来测试樟菇对四氯化碳诱导肝损伤的治疗效果，如表1所示。
表1：各组处理方式
| 编组 | 诱导慢性肝损伤(1) | 口服 |
| 实验1(对照组) | 橄榄油 | 水 |
| 实验2(阴性对照组) | 6％四氯化碳/橄榄油 | 水 |
| 实验3(阳性对照组) | 6％四氯化碳/橄榄油 | 水飞蓟素(2)/2％CMC |
| 实验4 | 6％四氯化碳/橄榄油 | 低剂量(3) |
| 实验5 | 6％四氯化碳/橄榄油 | 中剂量(4) |
| 实验6 | 6％四氯化碳/橄榄油 | 高剂量(5) |
(1)每周两次，一次2.5毫升/千克
(2)每天200毫克/千克
(3)每天0.15克/千克
(4)每天0.45克/千克
(5)每天1.35克/千克
实验第8星期，将全部大鼠牺牲，从下腔静脉抽血测GOT、GPT。将血液放干后，取肝脏右大叶，固定一地方切取长宽各1厘米的肝组织放入10％中性福尔马林内作病理切片。
图5绘示出樟菇对四氯化碳诱导肝损伤的治疗效果，由图5的结果显示，胶体培养出的樟菇可有效抑制四氯化碳诱导肝损伤GOT、GPT的上升。实验动物牺牲后，肝脏进行切片，如图6所示，第一组-正常组，可见肝组织正常。第二组-阴性对照组，可见大量肝细胞发生变性及大量纤维结缔组织切入肝小叶区。第三组-阳性对照组，可见少量肝细胞发生变性及少量纤维结缔组织切入肝小叶区。第四组-低剂量组，可见极少量肝细胞发生变性。第五组-中剂量组，可见大量肝细胞发生变性及少量纤维结缔组织切入肝小叶区。第六组-高剂量组，可见大量肝细胞发生变性。显示本发明的胶体培养出的樟菇具有降低GOT、GPT上升、减少肝纤维化及肝细胞病变的发生的能力。
樟菇萃取物的制备
樟菇萃取物，可通过将樟菇干燥粉末100克压碎，加入2升乙醇，搅拌萃取1-4小时，将过滤后的萃取液浓缩干燥，而得到15％的樟菇萃取物，其高效液相层析图如图7所示，高效液相层析仪的管柱为Cosmosil PakedColumn 5C18-AR，4.6×250mm；高效液相层析仪的流动相如下表所示；高效液相层析仪的流速为每分钟一毫升(1毫升/分)；其检测仪为DAD，波长设定于210，243，254，280nm。
| 时间(分) | 0.01％磷酸(H3PO4)(％) | 乙腈(CH3CN)(％) |
| 0 | 70 | 30 |
| 65 | 53 | 47 |
| 110 | 53 | 47 |
| 140 | 0 | 100 |
| 170 | 0 | 100 |
| 175 | 70 | 30 |
| 200 | 70 | 30 |
Claims (26)
1.一种来自胶体培养的牛樟菇菌丝体萃取物，其具有如图七(c)的HPLC特性。
2.一种组合物，其包括如权利要求1的萃取物。
3.根据权利要求2的组合物，其中所述萃取物包括下式I的化合物：
其中R1是α-OH或＝O；R2是β-OH或H；R3是β-OH或＝O；R4是α-OH或H；且R5是H。
4.根据权利要求3的组合物，其中所述R1是α-OH；R2是β-OH；R3是β-OH；R4是H；且R5是H。
5.根据权利要求3的组合物，其中所述R1是O；R2是H；R3是＝O；R4是H；且R5是H。
6.根据权利要求3的组合物，其中所述R1是α-OH；R2是H；R3是＝O；R4是H；且R5是H。
7.根据权利要求3的组合物，其中所述R1是α-OH；R2是H；R3是＝O；R4是α-OH；且R5是H。
8.根据权利要求2的组合物，其可抑制癌细胞生长。
9.根据权利要求8的组合物，其中癌细胞是人类肝癌细胞。
10.根据权利要求2的组合物，其具有护肝功能。
11.根据权利要求10的组合物，其中该护肝功能是指可抑制细胞释放门冬氨酸氨基转移酶(GOT)、丙氨酸氨基转移酶(GPT)、减少肝纤维化或降低肝细胞病变发生。
12.一种培养真菌的方法，其包含：
(a)于培养基中对真菌进行小量培养，以进行真菌繁殖；
(b)将含真菌的培养基块接种至可容纳至少两个真菌培养基块的胶体培养基；
(c)静置胶体培养基至真菌成熟；及
(d)由成熟真菌培养基中收集真菌。
13.根据权利要求12的方法，其中所述真菌是取自野生或人工培养的樟菇(Antrodia cinnamomea)。
14.根据权利要求12的方法，其中所述胶体培养基包含基材、碳源、氮源、增量剂及无机酸盐。
15.根据权利要求14的方法，其中所述基材是洋菜胶。
16.根据权利要求14的方法，其中所述碳源是葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、淀粉、纤维素、蔗糖或上述糖类的任一种组合。
17.根据权利要求14的方法，其中所述氮源是蛋白胨、三蛋白胨、牛肉提取物、麦芽提取物、酵母提取物或上述物质的任一种组合。
18.根据权利要求14的方法，其中所述增量剂是葵花油、橄榄油、维生素B6或上述物质的任一种组合。
19.根据权利要求14的方法，其中所述无机酸盐是磷酸盐、氯化钠、硫酸镁、氯化钾或上述物质的任一种组合。
20.根据权利要求19的方法，其中所述磷酸盐选自K2HPO3、K3PO3、KH2PO3、NaH2PO3、Na2HPO3或上述化合物的任一种组合。
21.根据权利要求14的方法，其中所述基材重量百分比是0.5％～3％。
22.根据权利要求14的方法，其中所述碳源重量百分比是0.5％～30％。
23.根据权利要求14的方法，其中所述氮源重量百分比是0.05％～5％。
24.根据权利要求14项的方法，其中所述增量剂重量百分比是0.005％～0.05％。
25.根据权利要求14项的方法，其中所述无机酸盐重量百分比是0.01％～2.5％。
26.根据权利要求14的方法，其中所述培养基是于16℃～32℃培养20～45天。
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