WO2013135928A1 - Uso de la obestatina para la regeneración muscular - Google Patents

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WO2013135928A1
WO2013135928A1 PCT/ES2013/070149 ES2013070149W WO2013135928A1 WO 2013135928 A1 WO2013135928 A1 WO 2013135928A1 ES 2013070149 W ES2013070149 W ES 2013070149W WO 2013135928 A1 WO2013135928 A1 WO 2013135928A1
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peptide
seq
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muscle
obestatin
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PCT/ES2013/070149
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Jesús PÉREZ CAMIÑA
Felipe Casanueva Freijo
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Universidade De Santiago De Compostela
Servizo Galego De Saúde
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    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin

Definitions

  • the present invention falls within the field of medicine, specifically within peptides with myogenic capacity useful for inducing muscle regeneration and, therefore, for the treatment and / or prevention of injuries or diseases that occur with muscle damage.
  • Myogenesis is the process of muscle tissue formation that involves the specification and differentiation of muscle precursor cells or myoblasts, their fusion for the formation of primary and secondary myotubes and the consequent maturation in myofibers (Chargé SB., Et al., 2004 , Physiol Rev. 84: 209-238). This process is required both for the development of skeletal muscle in the embryo, as well as for postnatal growth and for the maintenance and repair of myofibres of skeletal muscle after an injury (Perry RL., Et al., 2000, Front Biosci. 5 : D750-767; Sartorelli V., et al., 2005, Curr Opin Genet Dev. 15 (5): 528-533).
  • muscle fibers or myocytes are formed from the fusion of myoblasts into multinucleated fibers, called myotubes.
  • myotubes In embryonic development the process of myogenesis begins with the proliferation of myoblasts, which proliferate if there is sufficient fibroblast growth factor (FGF). On the contrary, in the absence of FGF myoblasts cease their division and secrete fibronectin to the extracellular matrix.
  • FGF fibroblast growth factor
  • the second stage involves the alignment of myoblasts to form myotubes.
  • the third stage consists of a cellular fusion, in which calcium ions are critical, which is mediated by a set of metalloproteinases called meltrins.
  • Myocyte augmentation factors (MEFs) Myocyte Enhance Factors" promote myogenesis.
  • serum response factor plays a fundamental role during myogenesis, being required for the expression of actin alpha genes in striated muscle.
  • the expression of skeletal alpha actin is also regulated by the androgen receptor.
  • spheroids can regulate myogenesis.
  • myoblasts are activated early, regenerating muscle through the generation of new fibers or fusion with preexisting fibers.
  • Myoblasts induced to proliferate in response to various growth factors express the myogenin transcription factor that promotes the expression of specific skeletal muscle proteins, such as creatine kinase and myosin.
  • Myogenic regulatory factors are vital for the determination and maintenance of skeletal muscle. In this sense, during development, the induction of MyoD and Myf-5 expression defines the origin of myogenic progenitor cells that are responsible for forming different muscle groups in the adult organism. There is a high number of signaling pathways involved in the regulation of myogenesis during development and during the regeneration of damaged muscle tissue. These pathways regulate cell cycle progression, protein-protein interactions and the transcriptional activity of myogenic factors.
  • the myogenesis process requires the coordinated actions of multiple signaling pathways that regulate cell cycle output, determining and specifying the myogenesis process based on the expression of myogenic factors, a group of transcription factors that includes Myf-5, MyoD , myogenin and MRF4.
  • obestatin a 23 amino acid gastrointestinal peptide derived from the same precursor peptide of ghrelin, pre-proghrelin, called obestatin has been identified.
  • Obestatin was originally isolated from the stomach, showing that it was a circulating peptide whose secretion is pulsatile, showing an ultradian rhythm similar to that of ghrelin and growth hormone (GH) (Zhang JV., Et al., 2005, Science 310: 996-999).
  • Mitogenic actions have been described (Cami ⁇ a JP., Et al., 2007, J Cell Physiol. 21 1: 1-9) and adipogenic (Gurriarán-Rodr ⁇ guez U., et al., 2010, J Cell Mol Med.
  • obestatin demonstrates a biological functionality for this peptide.
  • obestatin promotes cell survival in ⁇ cells and in human pancreatic islets.
  • obestatin induces the expression of genes that regulate the fate of ⁇ cells, insulin biosynthesis and glucose sensitivity (Granata R., et al., 2008, Diabetes 57: 967-979).
  • damaged muscle tissue requires a myogenic process for its maintenance and regeneration, so agents capable of promoting said myogenesis, and therefore stimulating the regeneration of muscle myofibers, are of special clinical interest because of their potential. application in the treatment and / or prevention of diseases and injuries that occur with muscle damage.
  • the present invention provides an isolated peptide called "obestatin” that promotes proliferation and differentiation in myoblasts.
  • the proliferative effect in myoblasts shows a clear dose-dependent pattern.
  • the role as myogenic factor is established through the expression in myoblasts of key factors for their differentiation, such as, but not limited to, the early differentiation marker, myogenin, and the late differentiation marker, myosin, (MHC, of its acronym in English "Myosin Skeletal Heavy Chain”), in a dose-dependent manner.
  • myosin myosin
  • MHC of its acronym in English "Myosin Skeletal Heavy Chain
  • said peptide is applicable in muscle regeneration, preferably in musculoskeletal regeneration, thus being useful in the treatment and / or prevention of diseases or injuries that occur with muscle damage.
  • obestatins in different organisms such as, but not limited to, mouse, rat, hamster, buffalo, bear, cat or human who share a high identity in the sequence and have the same ability to promote myogenesis.
  • a first aspect of the invention relates to the use of an isolated peptide comprising an amino acid sequence with at least 86% identity with SEQ ID NO: 1, or the use of the nucleotide sequence encoding it, as myogenic agent "in vitro".
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of an isolated peptide consisting of an amino acid sequence with at least 86% identity with SEQ ID NO: 1, or the use of the nucleotide sequence encoding it, as myogenic agent "in vitro".
  • "Obestatin" in the present invention is understood to mean an amino acid sequence with at least 86% identity with SEQ ID NO: 1.
  • Human obestatin is understood as a peptide of sequence SEQ ID NO: 3 which has a homology greater than 86% with SEQ ID NO: 1.
  • Mouse obestatin or rat obestatin is understood as the sequence peptide SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of mouse obestatin, and which coincides with rat obestatin, is SEQ ID NO: 1.
  • This sequence SEQ ID NO: 1 corresponds to residues 76 to 98 of the sequence with access number to the NCBI ( National Center for Biotechnology Information) NP_067463 corresponding to a pre-propeptide called sequence pre-proghrelin SEQ ID NO: 7, which when processed in the body gives rise to sequence obestatin SEQ ID NO: 1.
  • This propeptide is encoded for the ghrelin gene.
  • rat / mouse obestatin was employed, since the corresponding assays were carried out on rat myoblast cell lines as well as on the rats themselves, and therefore correspondence between the sequence was necessary problem and the respective target in the trials.
  • the most useful application of the present invention and its ultimate purpose is its therapeutic use in humans.
  • human obestatin an element homologous to that of rat / mouse obestatin with a high percentage of identity in its amino acid sequence with respect to that of rat / mouse, and with only 3 amino acids in difference (86 , 9% identity), also exerts a comparable effect as a myogenic agent, both on the corresponding human myoblast lines, and as part of a drug for muscle regeneration in a human being.
  • human obestatin corresponds to the sequence SEQ ID NO: 3.
  • This sequence is related to residues 76 to 98 of the sequence with access number to NCBI NP_057446 corresponding to the sequence pre-proghrelin SEQ ID NO: 5, which is processed in the organism giving rise to the SEQ sequence obestatin ID NO: 3.
  • the peptide of the invention can be encoded by a nucleotide sequence that directly takes place by transcription-translation to the 23 amino acid peptide.
  • An example sequence that codes directly for mouse or rat obestatin could be, but not limited to, the sequence SEQ ID NO: 2, so preferably, the nucleotide sequence to which the present invention relates and which codes for mouse obestatin is SEQ ID NO: 2.
  • an example sequence that encodes directly for human obestatin could be, for example, but not limited to, the sequence SEQ ID NO: 4. Therefore, preferably, the nucleotide sequence encoding human obestatin is SEQ ID NO: 4.
  • Obestatin in organisms is encoded by the ghrelin gene. This gene gives rise to a peptide called pre-proghrelin. In humans, this peptide has the sequence SEQ ID NO: 5, and is processed in the body giving obestatin as a product. Specifically, in humans, pre-proghrelin has 1,117 amino acids and its sequence would be SEQ ID NO: 5.
  • the intron-free coding sequence for human preproghrelin, and therefore coding for a peptide comprising the human obestatin of the invention would be the sequence SEQ ID NO: 6, which corresponds to the 354 base pair nucleotide sequence with access number CCDS33700.1, in the Consensus CDS database (CCDS). Therefore, preferably, the nucleotide sequence encoding human obestatin is SEQ ID NO: 6.
  • the intron-free coding sequence for the pre-proghrelin of 117 amino acids (SEQ ID NO: 7), and which would therefore also be coding for a peptide comprising the obestatin of the invention, would be the SEQ sequence ID NO: 8, which corresponds to the nucleotide sequence of 354 base pairs with access number CCDS20432.1 in the Consensus CDS database (CCDS). Therefore, preferably, the nucleotide sequence encoding mouse obestatin is SEQ ID NO: 8.
  • % identity with respect to a polypeptide or protein refers to the percentage of amino acids of the sequence in question that are identical to the amino acids of the sequence with which it is compared, after aligning said sequences and entering spaces, if necessary, to achieve the maximum percentage of identity without taking into account conservative substitutions.
  • the alignment can be carried out in different ways known to the person skilled in the art, such as using public tools such as the BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megalign (DNASTAR) programs. A person skilled in the art can determine the appropriate parameters to measure alignment, including the algorithms necessary to achieve maximum alignment of the sequences that are compared.
  • % identity is calculated by dividing the number of amino acids that are identical after aligning SEQ ID NO: 1 and the candidate sequence, by the total number of amino acids of SEQ ID NO: 1, and multiplying the result by 100.
  • the "% identity" is calculated in the same way although nucleotides are compared.
  • another preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of an isolated peptide comprising an amino acid sequence with at least one 86% identity with SEQ ID NO: 1, where the amino acid sequence with at least 86% identity with SEQ ID NO: 1 is SEQ ID NO: 3, or when using the nucleotide sequence encoding it, such as "in vitro" myogenic agent.
  • SEQ ID NO: 3 corresponds to human obestatin, and in the organism it is synthesized in the form of preproghrelin, which is processed giving rise to obestatin, this pre-proghrelin would present the same utility as obestatin.
  • the amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 3 is human pre-proghrelin (SEQ ID NO: 5).
  • Another preferred embodiment relates to the use of an isolated peptide consisting of an amino acid sequence with at least 86% identity with SEQ ID NO: 1, where the amino acid sequence with at least 86% identity with SEQ ID NO : 1 is SEQ ID NO: 3, or when using the nucleotide sequence that encodes it, as an "in vitro" myogenic agent.
  • a preferred embodiment of the first aspect of the invention relates to the use of an isolated peptide comprising an amino acid sequence with at least 91% identity with SEQ ID NO: 1, or the use of the nucleotide sequence encoding it, as myogenic agent "in vitro".
  • a more preferred embodiment relates to the use of an isolated peptide comprising an amino acid sequence with at least 95% identity with SEQ ID NO: 1, or to the use of the nucleotide sequence encoding it, as a "in vitro" myogenic agent.
  • An even more preferred embodiment relates to the use of an isolated peptide comprising the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, or to the use of the nucleotide sequence encoding it, as an "in vitro" myogenic agent.
  • SEQ ID NO: 1 corresponds to mouse or rat obestatin, and in the organism it is synthesized in the form of pre-proghrelin, which is processed giving rise to obestatin, this pre-proghrelin would present the same utility as obestatin .
  • the amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 1 is the mouse or rat pre-proghrelin (SEQ ID NO: 7).
  • a particular embodiment refers to the use of an isolated peptide consisting of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, or to the use of the nucleotide sequence encoding it, as an "in vitro" myogenic agent.
  • Obestatin and its variants or derivatives can be synthesized, for example, but not limited to, by chemical synthesis, recombinant DNA techniques, isolation from natural sources or by in vitro proteolysis.
  • Obestatin can be produced recombinantly, not only directly but as a fusion polypeptide together with a heterologous polypeptide, which may contain, for example, but not limited to, a signal sequence, or other polypeptide having a cleavage site for a protease, for example, but not limited to, at the N-terminal end of the mature protein or polypeptide.
  • nucleotide sequence refers to a polymeric form of nucleotides of any length that may or may not be chemical or biochemically modified. They refer, therefore, to any polyiribonucleotide or polydeoxyribonucleotide, both single-stranded and double-stranded. Any of the sequences of the present invention, and which can be encoded for example but not limited to obestatin, can be obtained artificially by conventional cloning and selection methods, or by sequencing.
  • Said nucleotide sequence in addition to the coding sequence, may carry other elements, such as, but not limited to, introns, non-coding sequences at the 5 'and / or 3' ends, ribosome binding sites, or stabilizing sequences.
  • These polynucleotides can additionally include coding sequences for additional amino acids that may be useful, for example, but not limited, to increase the stability of the peptide generated from them or to allow a better purification thereof.
  • the nucleotide sequence encoding obestatin is part of an expression vector.
  • an "expression vector” is a nucleic acid molecule used to transfer genetic material to a cell. Apart from said genetic material, a vector may also contain different functional elements that include transcription control elements, such as, but not limited to, promoters or operators, regions or enhancers of binding to transcription factors and control elements to initiate and finish the translation.
  • Vectors include, but are not limited to: plasmids, cosmids, viruses, phages, recombinant expression cassettes and transposons. Some vectors are capable of replicating or dividing autonomously once they are introduced into the host cell, such as bacterial vectors with an origin of bacterial replication or mammalian episomal vectors.
  • An expression vector is one capable of directing the expression of genes to which it has been operatively linked.
  • An expression vector is used for transcription and translation of a gene of interest, usually controlled by a promoter.
  • a "promoter” is a nucleotide sequence that controls the translation of the gene of interest.
  • the promoter is Operationally linked to the gene of interest. Operationally linked “refers to the functional relationship and the location of the promoter sequence with respect to the gene of interest.
  • Obestatin or the nucleotide sequence that encodes it, can be used as "in vitro" myogenic agents expressing in a cell culture, preferably myoblasts, to induce differentiation of cells in culture, so that myotubes (syncytial cells are formed) multinucleated, with nuclei in the central position, but without mitotic activity) and subsequently muscle fibers or myocytes that can finally be used in somatic cell therapy procedures for the regeneration of damaged muscle tissue, preferably musculoskeletal tissue.
  • the obestatin, the nucleotide sequence that encodes it and the cells in culture, preferably myoblasts, which are intended to be differentiated by this "in vitro" myogenesis procedure are, more preferably, of human origin and even more preferably of autologous origin.
  • myogenic agent refers to that agent capable of inducing proliferation, and / or differentiation of a pluri or multipotential cell, preferably from a myoblast, to a myocyte or muscle fiber, that is, to a fusiform and multinuclear cell with contractile capacity and that is part of muscle tissue.
  • myoblast is an undifferentiated cell with the ability to synthesize fine filaments shortly before its fusion process with other myoblasts and lead to the formation of myotubes.
  • Myoblasts are cells with high capacity for cell division and constitute the germ cells of the muscle.
  • the obestatin or the nucleotide sequence that encodes it can be administered to an individual suffering from an injury or disease that causes damage to the muscle tissue, preferably in the musculoskeletal tissue, to promote muscle regeneration and thus restore the condition.
  • another aspect of the invention relates to the use of an isolated peptide comprising an amino acid sequence with at least 86% identity with SEQ ID NO: 1, or the use of the nucleotide sequence encoding it, for the purpose of development of a medicine for muscle regeneration.
  • this aspect of the invention relates to an isolated peptide comprising an amino acid sequence with at least 86% identity with SEQ ID NO: 1, or to the nucleotide sequence encoding it, for use as a medicament for muscle regeneration
  • the amino acid sequence with at least 86% identity with SEQ ID NO: 1 is SEQ ID NO: 3. Since SEQ ID NO: 3 corresponds to human obestatin, and in the organism it is synthesized in the form of pre-proghrelin, which is processed giving rise to obestatin, this pre-proghrelin would present the same utility as obestatin.
  • the amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 3 is human pre-proghrelin (SEQ ID NO: 5).
  • the isolated peptide consists of an amino acid sequence with at least 86% identity with SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence with at least 86% Identity with SEQ ID NO: 1 is SEQ ID NO: 3.
  • the isolated peptide comprises an amino acid sequence with at least 91% identity with SEQ ID NO: 1. In a more preferred embodiment of this aspect of the invention, the isolated peptide comprises an amino acid sequence with at least 95% identity with SEQ ID NO: 1. In an even more preferred embodiment of this aspect of the invention, the isolated peptide comprises the sequence SEQ ID NO: 1. Since SEQ ID NO: 1 corresponds to mouse or rat obestatin, and in the organism it is synthesized in the form of pre-proghrelin, which is processed giving rise to obestatin, this pre-proghrelin would present the same utility as obestatin. Thus, preferably, the amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 1 is the mouse or rat pre-proghrelin (SEQ ID NO: 7). In an even more preferred embodiment, the isolated peptide consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1.
  • nucleotide sequence encoding the isolated peptide is SEQ ID NO: 4. In another preferred embodiment, the nucleotide sequence encoding the isolated peptide is SEQ ID NO: 2. In another preferred embodiment, the nucleotide sequence that encoding for the isolated peptide is SEQ ID NO: 6. Thus, preferably, the nucleotide sequence encoding the isolated peptide is SEQ ID NO: 8.
  • the nucleotide sequence encoding the isolated peptide is part of an expression vector.
  • Muscle regeneration refers to the formation of muscle tissue, preferably musculoskeletal tissue, in order to maintain and / or repair damaged muscle myofibers after an injury or disease that involves muscle damage, thus helping to increase, restoration or partial or total replacement of the functional activity of damaged muscle tissue, preferably of the functional activity of damaged skeletal muscle.
  • the medicament is for the treatment and / or prevention of injuries or diseases that occur with damage or destruction of the muscle.
  • diseases are, for example, but not limited to, degenerative or genetic diseases that occur with muscle damage, preferably with skeletal muscle damage as well as muscle injuries caused by direct trauma associated with physical exercise, such as, and not limited to, the trauma associated with excessive physical exercise, or resistance training.
  • muscular dystrophies such as Becker muscular dystrophy or Duchenne muscular dystrophy
  • muscle injuries such as those caused by a direct trauma associated with physical exercise, inflammatory myopathies or myositis, distal myopathies, myotonic myopathies, congenital myopathies, mitochondrial myopathies, metabolic myopathies (such as Pompe disease, Forbes disease or Tarui disease), primary periodic paralysis, neurogenic myopathies, necrosis muscle, muscle atrophy, sprains, strains, cramps, tendonitis, contractures (such as Volkmann's ischemic contracture or Dupuytren's contracture), muscle infections, myofacial pain, muscle fasciculations, hypotonia, rhabdomyolysis or compartment syndrome.
  • the medicament is for the treatment and / or prevention of the diseases or muscular lesions selected from the list comprising: neurogenic myopathies, muscular necrosis, muscular atrophy, sprains, strains, cramps, tendonitis, contractures, muscular dystrophy, myositis, muscular infections, myofacial pain, metabolic myopathies, muscular fasciculations, hypotonia, congenital myopathies, muscular paralysis, rhabdomyolysis or compartment syndrome.
  • the medicament is for the treatment and / or prevention of selected muscle diseases or injuries. from the list that includes: neurogenic myopathies, muscular necrosis, muscular atrophy or muscular dystrophy.
  • Muscle diseases present with a limited number of symptoms, including weakness, fatigue, muscle pain, cramps, contractures and gait disturbance.
  • the muscle can present a variety of involuntary motor phenomena, although most of them are a reflection of its denervation and not properly a muscular disease, so it is important to differentiate the clinical manifestations of myopathies from those of neuropathies.
  • the diagnosis is made based on a muscular examination that involves the detection of: gait disturbances, pelvic weakness, loss of muscle mass, pseudohypertrophy, fasciculations and / or myoclonus. In parallel, consistency, tone, pain, strength and muscular reflex are assessed. Complementary examinations are performed based on clinical analysis (muscle enzymes and myoglobinuria), weakness tests, imaging techniques (ultrasound, NMR, CT), electromyography and muscle biopsy.
  • the medicament comprises obestatin, or the nucleotide sequence that encodes it, in a therapeutically effective amount, "therapeutically effective amount” meaning the amount of obestatin or nucleotide sequence encoding it that produces the desired effect.
  • therapeutically effective amount meaning the amount of obestatin or nucleotide sequence encoding it that produces the desired effect.
  • the dosage to obtain a therapeutically effective amount depends on a variety of factors, such as the age, weight, sex or tolerance of the individual to whom the medication is to be administered.
  • composition of the invention which comprises:
  • the amino acid sequence with at least 86% identity with SEQ ID NO: 1 is SEQ ID NO: 3. Since SEQ ID NO: 3 corresponds to human obestatin, and in the organism it is synthesized in the form of pre-proghrelin, which is processed giving rise to obestatin, this pre Proghrelin would present the same utility as obestatin. Thus, preferably, the amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 3 is human pre-proghrelin (SEQ ID NO: 5). In another preferred embodiment of this aspect of the invention, the isolated peptide consists of an amino acid sequence with at least 86% identity with SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence with at least 86% Identity with SEQ ID NO: 1 is SEQ ID NO: 3.
  • the isolated peptide comprises an amino acid sequence with at least 91% identity with SEQ ID NO: 1.
  • the isolated peptide comprises an amino acid sequence with at least 95% identity with SEQ ID NO: 1.
  • the isolated peptide comprises the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 1 is the mouse or rat pre-proghrelin (SEQ ID NO: 7).
  • the isolated peptide consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1.
  • the nucleotide sequence encoding the isolated peptide is SEQ ID NO: 4. In another preferred embodiment, the nucleotide sequence encoding the isolated peptide is SEQ ID NO: 2. In another preferred embodiment, the nucleotide sequence coding for the isolated peptide is SEQ ID NO: 6. Thus, preferably the nucleotide sequence encoding the isolated peptide is SEQ ID NO: 8. In another preferred embodiment of this aspect of the invention, the nucleotide sequence that codes for the isolated peptide forms part of an expression vector.
  • the medicament is for the treatment and / or prevention of muscle diseases or injuries selected from the list comprising: neurogenic myopathies, muscle necrosis, muscular atrophy, sprains, strains, cramps, tendonitis, contractures, muscular dystrophy, myositis, muscle infections, Myofacial pain, metabolic myopathies, muscle fasciculations, hypotonia, congenital myopathies, muscular paralysis, rhabdomyolysis or compartment syndrome.
  • the medicament is for the treatment and / or prevention of muscular diseases or injuries selected from the list comprising: neurogenic myopathies, muscular necrosis, muscular atrophy or muscular dystrophy.
  • composition of the invention may further comprise another active ingredient (s), excipient / s and / or pharmaceutically acceptable carrier (s).
  • excipient refers to a substance that helps the absorption of the elements of the composition of the invention, stabilizes said elements, activates or aids the preparation of the composition in the sense of giving it consistency or providing flavors that make it nicer.
  • the excipients could have the function of keeping the ingredients together, such as, for example, starches, sugars or cellulose, the sweetening function, the coloring function, the protective function of the composition, for example, to isolate it from air and / or moisture, the filling function of a pill, capsule or any other form of presentation, the disintegrating function to facilitate the dissolution of the components and their absorption in the intestine, without excluding other types of excipients. mentioned in this paragraph.
  • the "pharmaceutically acceptable carrier” is a substance that is used in the composition to dilute any of the components included therein to a certain volume or weight.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is an inert substance or action analogous to obestatin and the nucleotide sequence that encodes it.
  • the function of the vehicle is to facilitate the incorporation of other elements, allow a better dosage and administration or give consistency and form to the composition.
  • the term "active ingredient”, “active substance”, “pharmaceutically active substance”, “active ingredient” or “pharmaceutically active ingredient” means any component that potentially provides a pharmacological activity or other different diagnostic effect, cure, mitigation, treatment, or prevention of a disease, or that affects the structure or function of the body of man or other animals.
  • the term includes those components that promote a chemical change in the preparation of the drug and are present therein in a modified form intended to provide the specific activity or effect.
  • the composition of the invention can be formulated for administration in a variety of ways known in the state of the art.
  • preparations include any solid composition (tablets, pills, capsules, granules, etc.) or liquid (solutions, suspensions or emulsions) for oral, topical or parenteral administration.
  • the composition of the invention can also be formulated in the form of liposomes, nanoparticles, nanospheres, microparticles, microspheres, micelles, sustained release formulations or any other conventional release system.
  • compositions and / or its formulations can be administered to an animal, including a mammal and, therefore, to man, in a variety of ways, including, but not limited to, oral, parenteral (intraperitoneal, intravenous, intradermal, intraspinal, intrastromal, intraarticular, intrathecal, intralesional, intraarterial, intramuscular, intranasal, subcutaneous, intracapsular), topical, through transdermal patches or rectal, through the administration of a suppository, percutaneous, nasal spray, surgical implant, internal surgical paint, infusion pump or route catheter.
  • parenteral intraperitoneal, intravenous, intradermal, intraspinal, intrastromal, intraarticular, intrathecal, intralesional, intraarterial, intramuscular, intranasal, subcutaneous, intracapsular
  • topical through transdermal patches or rectal, through the administration of a suppository, percutaneous, nasal spray, surgical implant, internal surgical paint, infusion pump or route catheter.
  • the “medicament” referred to in the present invention may be for human or veterinary use.
  • the "medicine for human use” is any substance or combination of substances that is presented as having properties for the treatment or prevention of diseases or injuries in humans or that can be used in humans or administered to humans in order to restore , correct or modify physiological functions by exercising a pharmacological, immunological or metabolic action, or establishing a medical diagnosis.
  • the "veterinary medicinal product” means any substance or combination of substances that is presented as having curative or preventive properties with respect to animal diseases or injuries or that can be administered to the animal in order to restore, correct or modify its physiological functions exercising a pharmacological, immunological or metabolic action, or establishing a veterinary diagnosis.
  • the medicament of the invention can be used both alone and in combination with other medications or compositions for muscle regeneration, preferably for the treatment and / or prevention of degenerative or genetic lesions or diseases that occur with muscle damage, more preferably skeletal muscle.
  • treatment refers to combating the effects caused as a result of a degenerative or genetic injury or disease that occurs with muscle damage, preferably with skeletal muscle damage, in a subject ( preferably mammal, and more preferably human) which includes:
  • prevention consists in preventing the onset of the disease, that is, preventing the disease or the pathological condition from occurring in a subject (preferably mammalian, and more preferably human), in particularly, when said subject has a predisposition for the pathological condition, but has not yet been diagnosed as having it.
  • Fig. 1 Activation of mitogen and myogenesis regulatory enzymes by obestatin in myoblasts and L6E9 myotubes. Effect of obestatin on activity of regulatory enzymes of mitogenic capacity (ERK 1/2), metabolic (Akt and AMPK) and myogenic (Akt and p38). Based on a dose-response study the saturating dose for maximum enzymatic activation is set for a 5 nM concentration. Immunoblot analysis shows an activation profile for Akt, ERK 1/2 and p38 in myoblasts and myotubes. AMPK inactivation is described in both cell models.
  • the activation profile discovers bimodal characteristics for the action of obestatin: 1.- mitogenic activation in myoblasts; and, 2.- myogenic activation. Immunoblots are representative of 6 independent trials. Fig. 2. Mitogenic effect of obestatin in myoblasts L6E9. Mitogenic effect of different doses of obestatin (0.01-100 nM) on myoblasts L6E9 after 48 hours of stimulation in the presence of growth medium [GM, English growth medium: DMEN + 10% FBS]. Co: initial number of cells. Control: number of cells after 48 hours in GM. GM + obestatin: number of cells after 48 hours of stimulation with obestatin in GM.
  • Fig. 3 Effect of obestatin on the expression of myogenic markers myogenin and MHC in myoblasts L6E9. Effect of stimulation with different doses of obestatin (0.01-100) on the expression of myogenic markers myogenin and myosin (MHC) after 6 days of induction of differentiation through the use of differentiation medium (DM) Differentiation medium: DMEN + 2% FBS). Protein expression levels are referenced to myoblast levels in growth medium (GM), undifferentiated. Data are represented as% with respect to cell expression in GM (mean ⁇ standard error of 6 independent experiments). The evaluation of the degree of expression was performed by immunoblot using the lmageJ64 program (*, p ⁇ 0.05).
  • Fig. 4 Index of differentiation associated with obestatin estimated in L6E9 myoblasts by immunofluorescence.
  • A estimation of the myogenic capacity of obestatin (5 nM) by immunofluorescence (differentiation index). The cells were differentiated in DM (control) or in DM + obestatin (5 nM) for 6 days. Once fixed, the cells were stained with the anti-MHC antibody (40x magnification).
  • B quantification of the differentiation index of differentiated cells in DM (control) or in DM + obestatin (5 nM) for 6 days. Data are represented relative to the number of MHC positive control cells (mean ⁇ standard error; *, p ⁇ 0.05).
  • Fig. 5 Melt index (number of nuclei per myotube) associated with the obestatin estimated in L6E9 by immunofluorescence.
  • A estimation of the myotube fusion capacity (fusion index) of obestatin (5 nM) by immunofluorescence. The cells were differentiated in DM (control) or in DM + obestatin (5 nM) for 6 days. Once fixed, the cells were stained with the anti-MHC antibody (40x magnification).
  • B quantification of the fusion index for differentiated cells in DM (control) or in DM + obestatin (5 nM) for 6 days. Data are represented as% of total number of MHC positive cells with ⁇ 2 nuclei (mean ⁇ standard error).
  • Fig. 7 Effect of chronic administration of obestatin on myogenic markers in gastronemia and rat soleus (animal model). Effect of administration during 72 hours of obestatin (300 nmol / kg / 24h; 72 h) by implanting minipumps on early and late markers of myogenesis in skeletal muscle tissue (gastronemium and soleo) in male rats.
  • A Western blot analysis. First column: control; Second column: treatment with obestatin.
  • B Protein levels in gastronemium.
  • White column control;
  • Fig. 9 Immunohistochemical analysis of the effect of exogenous administration of obestatin on the ability of muscle regeneration in the damaged anterior tibial of the mouse (animal model).
  • the images shown are representative of the damaged anterior tibial muscle sections (hematoxylin / eosin staining) under local exogenous administration of obestatin (300 nmol / kg / 24h) or PBS (control) at 48, 96, 168 and 240 h after induction of damage .
  • the images show the zone of damage and regeneration at the indicated times.
  • Fig. 11 Immufluorescence analysis of the effect of exogenous administration of obestatin (96 h) on the expression of eMHC in the damaged anterior tibial of the mouse (animal model). Representative images of eMHC expression by immunofluorescence of anterior tibial sections treated with obestatin (300 nmol / kg / 24h) or PBS (control) at 96 h after induction of damage. The upper panels correspond to staining with anti-eMHC antibody and the lower panels to staining with DAPI.
  • Fig. 13 Quantification of blood vessels by myofiber in the anterior tibial 10 days after induction of muscle damage and exogenous treatment of obestatin (300 nmol / kg / 24h) or vehicle (PBS). Quantification of the number of blood vessels (immunofluorescence: positivity to isolectin) by myofiber (mean ⁇ standard error; *, p ⁇ 0.005) of sections of the anterior tibial treated with obestatin (300 nmol / kg / 24h) or PBS (control) 10 days after induction of damage.
  • Fig. 14 Quantification of blood vessels by myofiber in the anterior tibial 10 days after induction of muscle damage and exogenous treatment of obestatin (300 nmol / kg / 24h) or vehicle (PBS). Quantification of the number of blood vessels (immunofluorescence: positivity to isolectin) by myofiber (mean ⁇ standard error; *, p ⁇ 0.005) of sections of
  • Rat / mouse obestatin was obtained from California Peptide Research (CA, USA).
  • Anti-pAkt HM S473
  • anti-Akt anti-pERK1 / 2 (T202 / Y204), anti-ERK 1/2, anti-AMPKa (T172), anti- ⁇ , anti-pp38 (Y182), anti -p38, anti-p21 and anti-tubulin
  • MA Cell Signaling Technology
  • Anti-myosin heavy chain antibody (MHC) and antilaminin were obtained from Abcam (Cambridge, UK).
  • Anti myogenin, anti-MyoD, anti-Myf5, anti-Pax-7, anti-Myf6 and anti-Six-1 antibodies were from Santa Cruz Biotechnology (CA, USA).
  • the anti-isolectin antibodies GS-IB4 Alexa Fluor 594 and goat anti-mouse antibody conjugated to FITC was obtained from Invitrogen (CA, USA).
  • the anti-embryonic myosin heavy chain (eMHC) antibodies were obtained from Developmental Studies Hybridoma Bank (IA, USA).
  • the secondary antibodies and the Enhanced Chemiluminescence Detection System were from Pierce (IL, USA).
  • Alzet® osmotic mini pumps (model 1003D) were purchased from Alzet Corporation (CA, USA).
  • the other reagents were from Sigma-Aldrich (Mo, USA). CULTURE AND DIFFERENTIATION OF MIOBLASTS L6E9.
  • GM culture medium
  • FBS fetal bovine serum
  • streptomycin 100 U / mL streptomycin
  • IMMUNOBLOT ANALYSIS Tissue or cell samples were directly lysed in RIPA buffer [Tris-HCI (pH 7.2), 50 mM; NaCI, 150 mM; EDTA, 1 mM; NP-40, 1% (v / v); Sodium deoxycholate, 0.25% (w / v); protease inhibitors (Sigma); phosphatase inhibitors (Sigma)].
  • the lysates were clarified by centrifugation (14,000xg for 15 min at 4 ° C) and the protein concentration was quantified using QuantiPro TM BCA assay kit (Sigma).
  • QuantiPro TM BCA assay kit QuantiPro TM BCA assay kit (Sigma).
  • Immunoreactive bands were detected by chemiluminescence Pierce ECL Western Blotting Substrate; Thermo Scientific, IL, USA).
  • IMMUNOHISTOCHEMICAL ANALYSIS Muscle samples were mounted in a cold freezing medium [Tragacanth; Santa Cruz Biotechnology (CA, USA)] and frozen in a nitrogen-isopentane mixture. Tissue sections were obtained by serial cuts with a cryostat (10 ⁇ ) and were mounted on adhesion slides for histochemistry (Marienfeld, Lauda-Kónigshofen, Germany). The fixed sections were stained with hematoxylin / eosin. The quantification of the area of regenerative myofibers was performed using the lmageJ64 analysis software. IMMUNOFLUORESCENCE MICROSCOPY ANALYSIS.
  • L6E9 cells were cultured and differentiated on confocal microscopy slides in DM medium supplemented or not with obestatin (5 nM) for 6 days.
  • the cells were fixed using a PBS-paraformaldehyde buffered solution for 15 min, washed, permeabilized and blocked with PBT [1% Triton X-100, 1% Tween-20, 5% inactivated serum, 0.2% BSA in PBS buffer ] for 30 min, and subsequently incubated with anti-MHC antibody diluted in PBT (1: 400) for 12 h at 4 ° C.
  • the cells were incubated with the secondary antibody (goat anti-mouse antibody conjugated with) in PBT (1: 1000) for 45 min at 37 ° C.
  • DAPI was used for nucleus staining.
  • the digital images of the cell cultures were acquired with a Leica TCS-SP2 confocal microscope. Five fields of three independent experiments were taken for each group. The degree of differentiation was evaluated based on the number of MHC positive cells between the total number of nuclei. The number of nuclei within the myotubes ( ⁇ 2 nuclei) was quantified for 20-50miotubes. The myotubes were grouped into two categories, those with 2-3 nuclei and with 4 or more nuclei. The percentage of myotubes in each category was calculated relative to the total number of cells.
  • tissue immunofluorescence analyzes frozen sections were obtained which were fixed using a buffered PBS-paraformaldehyde solution for 15 min, washed, permeabilized and blocked with PBT for 30 min, and subsequently incubated with the corresponding primary antibody (anti-antibody eMHC, anti-laminin) diluted in PBT (1: 50) for 12 h at 4 ° C. After three washes with PBS, the tissue sections were incubated with the secondary antibody in PBT (1: 1000) for 45 min at 37 ° C. The nuclei were visualized by staining with DAPI. The digital images of the cell cultures were acquired with a Leica TCS-SP2 confocal microscope.
  • the anterior tibial muscle (TA) was removed under anesthesia and underwent three cycles of cold contact damage by applying a metal rod cooled in liquid nitrogen along the length of the muscle.
  • the damaged muscles were treated locally with injection of obestatin (300 nmol / kg weight) or the corresponding vehicle (PBS; control) during the indicated times at 24 h intervals.
  • the mice were sacrificed by cervical dislocation under anesthetic treatment, and the tissues were removed for immunoblot and immunohistochemical analysis.
  • the sciatic denervation was used using Swiss mice.
  • the sciatic denervation was performed under anesthesia, a mid-thigh incision was made in the lateral aspect of the right hind limb, separating the muscles and lifting the sciatic nerve with surgical forceps. A portion of the nerve that was sectioned was removed by removing a fragment thereof. Finally, the incision was closed.
  • These animals were administered locally an injection of obestatin (300 nmol / kg weight) or the corresponding vehicle (PBS; control) at 24-hour intervals for 14 days.
  • EXAMPLE 1 Study dose response for the activation of mitogenic and myogenic enzymes in myoblasts and myotubes L6E9.
  • FIG. 1 shows that treatment with obestatin (5 nM) in myoblasts L6E9 produces a dose-dependent increase for pAkt (S473), pp38 (Y138) and pERK1 / 2 (T202 / Y204), which reaches maximum levels at 10 min post-stimulus
  • obestatin (5 nM) dephosphorylates AMPKa in T172 [pAMPKa (T172)], inactivating this enzyme.
  • This activation dynamic was similar in L6E9 myotubes under stimulation with obestatin (5 nM). These data indicate possible mitogenic and myogenic capacity.
  • EXAMPLE 2 Study dose response for the mitogenic capacity of obestatin in myoblasts L6E9.
  • EXAMPLE 3 Study dose response for the expression of myogenic markers performed in L6E9 cells (rat myoblasts).
  • L6E9 cells were cultured in DM supplemented with different concentrations of obestatin in a range of 0.01-100 nM for six days.
  • Figure 3 shows, the levels of myogenin protein and MHC, detected by immunoblot, showed an increase in expression for cells treated with obestatin, the maximum effect observed at a concentration of 5 nM for myogenin expression (increase in -1, 7 in relation to the control cells) and MHC (increase of -1, 6 in relation to the control cells).
  • EXAMPLE 7 Study of expression of factors typical of mitogenesis in rats under chronic administration of obestatin.
  • osmotic mini pumps were used for in vivo administration of this peptide.
  • a group of 10 male rats received continuous subcutaneous infusion of obestatin for 72h (300 nmol / kg body weight / 24h); and another group of 10 rats received the equivalent volume of PBS for 72h.
  • the animals were sacrificed, and the gastronemia and soleus muscles were extracted and processed for the analysis of the expression of key factors of muscle differentiation by immunoblot.
  • MyoD Myogenic regulatory factor D
  • Myf5 Myogenic regulatory factor 5
  • Pax-7 Paned box protein 7
  • myogenin Myf6 (of its Acronym in English Myogenic factor 6)
  • MHC myogenin, Myf6 (of its Acronym in English Myogenic factor 6) and MHC were significantly increased in gastronemia and soleus muscle of rats under treatment with obestatin in relation to the control rat group ( Figure 7).
  • Six-1 Homeobox protein SIX1
  • the increase in both types of muscle in the family of regulatory factors of different stages of myogenesis shows a clear regenerative capacity of the muscle for obestatin.
  • EXAMPLE 8 Effect of exogenous administration of obestatin on the damaged anterior tibial of the mouse (animal model) on the myogenic markers PAX-7 (A), MyoD (B), myogenin (C) and eMHC (D)
  • EXAMPLE 9 Immunohistochemical analysis of the effect of exogenous administration of obestatin on the ability of muscle regeneration in the damaged tibial anterior mouse (animal model).
  • EXAMPLE 10 Quantitative analysis of the areas of the regenerative fibers of the tibial anterior at 96 and 168 hours after induction of damage and exogenous administration of obestatin or PBS (control).
  • EXAMPLE 11 Immufluorescence analysis of the effect of exogenous administration of obestatin (96 h) on the expression of eMHC in the damaged anterior tibial of the mouse (animal model).
  • EXAMPLE 12 Analysis of serum creatine kinase levels in mice that were induced damage to the tibialis anterior muscle and were treated locally with obestatin or vehicle (PBS) for 96 h.
  • PBS obestatin or vehicle
  • Serum creatine kinase levels are associated with muscle damage.
  • EXAMPLE 13 Quantification of blood vessels by myofiber in the anterior tibial 10 days after induction of muscle damage and exogenous treatment of obestatin (300 nmol / kg / 24h) or vehicle (PBS).
  • Isolectin positive blood vessel count in the anterior tibial muscle shows a significant increase in capillary density 10 days after induction of muscle damage and treatment with obestatin (300 nmol / kg / 24h) in relation to vehicle administration ( PBS), indicating an increase in angiogenesis associated with the regenerative process ( Figure 13). This is indicative that obestatin regulates the regeneration capacity and the contribution of nutrients to the regeneration zone.
  • EXAMPLE 14 Analysis of the anterior tibial muscle weight reduction in mice that underwent sciatic denervation (muscular atrophy model) under the exogenous administration of obestatin or vehicle (PBS).

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Abstract

La presente invención se refiere al uso de la obestatina, o a la secuencia nucleotídica que la codifica, como agente miogénico "in vitro", y para la elaboración de un medicamento para la regeneración muscular, preferiblemente para la regeneración músculo-esquelética, siendo así de utilidad en el tratamiento y/o prevención de enfermedades degenerativas o genéticas o de lesiones que cursan con daño muscular.

Description

USO DE LA OBEST ATINA PARA LA REGENERACIÓN MUSCULAR
DESCRIPCIÓN La presente invención se encuadra en el campo de la medicina, específicamente dentro de los péptidos con capacidad miogénica útiles para inducir regeneración muscular y, por tanto, para el tratamiento y/o prevención de lesiones o enfermedades que cursan con daño muscular. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La miogénesis es el proceso de formación de tejido muscular que implica la especificación y diferenciación de células precursoras de músculo o mioblastos, su fusión para la formación de miotubos primarios y secundarios y la consiguiente maduración en miofibras (Chargé SB., et al., 2004, Physiol Rev. 84:209-238). Este proceso es requerido tanto para el desarrollo del músculo esquelético en el embrión, como para el crecimiento postnatal y para el mantenimiento y reparación de las miofibras del músculo esquelético tras una lesión (Perry RL., et al., 2000, Front Biosci. 5:D750-767; Sartorelli V., et al., 2005, Curr Opin Genet Dev. 15(5):528-533).
Por tanto, las fibras musculares o miocitos se forman a partir de la fusión de mioblastos en fibras multinucleadas, llamadas miotubos. En el desarrollo embrionario el proceso de miogénesis comienza con la proliferación de los mioblastos, que proliferan si hay suficiente factor de crecimiento fibroblástico (FGF). Por el contrario, en ausencia de FGF los mioblastos cesan su división y secretan fibronectina a la matriz extracelular. El segundo estadio implica el alineamiento de los mioblastos para formar miotubos. El tercer estadio consiste en una fusión celular, en la que los iones de calcio son críticos, que está mediada por un conjunto de metaloproteinasas llamadas meltrinas. Los factores de aumento de los miocitos (MEFs de sus siglas en inglés "Myocyte Enhance Factors") promueven la miogénesis. Además, el factor de respuesta al suero (SRF de sus siglas en inglés "Serum fíesponse Factor") juega un papel fundamental durante la miogénesis, siendo requerido para la expresión de genes de actina alfa en el músculo estriado. La expresión de actina alfa esquelética está también regulada por el receptor de andrógenos. Así, los esferoides pueden regular la miogénesis. En el proceso de cicatrización, los mioblastos son activados tempranamente, regenerando músculo mediante la generación de nuevas fibras o fusión con fibras preexistentes. Los mioblastos inducidos a proliferar en respuesta a varios factores de crecimiento expresan el factor de transcripción miogenina que promueve la expresión de proteínas específicas del músculo esquelético, tales como la creatina quinasa y la miosina.
Existen diferentes marcadores moleculares que permiten analizar detalladamente la determinación miogénica, la proliferación de mioblastos y la diferenciación terminal. Los factores reguladores miogénicos son vitales para la determinación y mantenimiento del músculo esquelético. En este sentido, durante el desarrollo, la inducción de la expresión de MyoD y de Myf-5 define el origen de las células progenitoras miogénicas que son responsables de formar distintos grupos musculares en el organismo adulto. Existe un elevado número de vías de señalización implicadas en la regulación de la miogénesis durante el desarrollo y durante la regeneración del tejido muscular dañado. Estas vías regulan la progresión del ciclo celular, las interacciones proteína-proteína y la actividad transcripcional de los factores miogénicos.
El proceso de miogénesis requiere las acciones coordinadas de múltiples vías de señalización que regulan la salida del ciclo celular, determinando y especificando el proceso de miogénesis en base a la expresión de factores miogénicos, un grupo de factores de transcripción que incluye Myf-5, MyoD, miogenina y MRF4.
Por otro lado, ha sido identificado un péptido gastrointestinal de 23 aminoácidos derivado del mismo péptido precursor de la ghrelina, pre-proghrelina, denominado obestatina. La obestatina se aisló originalmente del estómago, demostrándose que era un péptido circulante cuya secreción es pulsátil, mostrando un ritmo ultradiano similar al de la ghrelina y la hormona del crecimiento (GH) (Zhang JV., et al., 2005, Science 310:996-999). Se han descrito acciones mitogénicas (Camiña JP., et al., 2007, J Cell Physiol. 21 1 : 1-9) y adipogénicas (Gurriarán-Rodríguez U., et al., 2010, J Cell Mol Med. 15(9): 1927-40) para la obestatina, lo que evidencia una funcionalidad biológica para este péptido. Recientemente, se ha descrito que la obestatina promueve la supervivencia celular en células β y en islotes pancreáticos humanos. Asimismo, la obestatina induce la expresión de genes que regulan el destino de las células β, la biosíntesis de insulina y la sensibilidad a la glucosa (Granata R., et al., 2008, Diabetes 57:967-979). En resumen, el tejido muscular dañado requiere de un proceso miogénico para su mantenimiento y regeneración, por lo que los agentes capaces de promover dicha miogénesis, y por tanto de estimular la regeneración de las miofibras musculares, son de especial interés en clínica por su potencial aplicación en el tratamiento y/o prevención de enfermedades y lesiones que cursan con daño muscular.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un péptido aislado llamado "obestatina" que promueve la proliferación y diferenciación en mioblastos. El efecto proliferativo en mioblastos muestra un claro patrón dosis dependiente. El papel como factor miogénico se establece a través de la expresión en mioblastos de factores clave para su diferenciación, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, del marcador de diferenciación temprano, miogenina, y del marcador de diferenciación tardío, la miosina, (MHC, de sus siglas en inglés "Myosin Skeletal Heavy Chain"), de forma dosis dependiente. Así, este péptido ejerce un papel como factor de supervivencia de mioblastos prolongando el potencial regenerativo del sistema muscular a través del aumento de la actividad proliferativa de los mioblastos. Por otra parte, promueve la miogénesis a través de la salida del ciclo celular facilitando la migración, la diferenciación y la fusión de los mioblastos para la determinación de los miotubos. Por tanto, dicho péptido es de aplicación en la regeneración muscular, preferiblemente en la regeneración músculo- esquelética, siendo así de utilidad en el tratamiento y/o prevención de enfermedades o lesiones que cursan con daño muscular. Existen obestatinas en diferentes organismos como por ejemplo, aunque sin limitarse, ratón, rata, hámster, búfalo, oso, gato o humano que comparten una alta identidad en la secuencia y que presentan la misma capacidad de promover la miogénesis.
Por todo ello, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de un péptido aislado que comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1 , o al uso de la secuencia nucleotídica que lo codifica, como agente miogénico "in vitro". Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de un péptido aislado que consiste en una secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1 , o al uso de la secuencia nucleotídica que lo codifica, como agente miogénico "in vitro". Se entiende por "obestatina" en la presente invención una secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1. Se entiende por obestatina humana un péptido de secuencia SEQ ID NO:3 el cual presenta una homología superior al 86% con SEQ ID NO: 1. Se entiende por obestatina de ratón o obestatina de rata el péptido de secuencia SEQ I D NO: 1.
La secuencia aminoacídica de la obestatina de ratón, y que coincide con la obestatina de rata, es SEQ ID NO: 1. Esta secuencia SEQ ID NO:1 se corresponde con los residuos 76 a 98 de la secuencia con número de acceso al NCBI (National Center for Biotechnology Information) NP_067463 correspondiente a un pre-propéptido denominado pre-proghrelina de secuencia SEQ ID NO:7, el cual cuando es procesado en el organismo da lugar a la obestatina de secuencia SEQ ID NO: 1. Este propéptido es codificado por el gen de la ghrelina. En los ejemplos de la presente invención, se empleó la obestatina de rata/ratón, ya que los ensayos correspondientes se llevaron a cabo sobre líneas celulares de mioblastos de rata así como sobre las propias ratas, y por tanto era necesario la correspondencia entre la secuencia problema y la diana respectiva en los ensayos. Sin embargo, debe entenderse que la aplicación de mayor utilidad de la presente invención y su fin último es su uso terapéutico en humanos. En este sentido, es esperable que la obestatina humana, elemento homólogo al de la obestatina de rata/ratón con un elevado porcentaje de identidad en su secuencia aminoacídica con respecto a la de rata/ratón, y con tan sólo 3 aminoácidos de diferencia (86,9% de identidad), también ejerza un efecto comparable como agente miogénico, tanto sobre las correspondientes líneas de mioblastos de humano, como formando parte de un medicamento para la regeneración muscular en un ser humano. En la presente invención, la obestatina humana se corresponde con la secuencia SEQ ID NO:3. Esta secuencia es la relativa a los residuos 76 a 98 de la secuencia con número de acceso al NCBI NP_057446 correspondiente a la pre-proghrelina de secuencia SEQ ID NO:5, la cual se procesa en el organismo dando lugar a la obestatina de secuencia SEQ ID NO:3.
El péptido de la invención puede estar codificado por una secuencia nucleotídica que de lugar directamente mediante su transcripción-traducción al péptido de 23 aminoácidos. Un ejemplo de secuencia que codifica directamente para la obestatina de ratón o rata (SEQ ID NO: 1) podría ser, aunque sin limitarse, la secuencia SEQ ID NO: 2, por lo que preferiblemente, la secuencia nucleotídica a la que se refiere la presente invención y que codifica para la obestatina de ratón es la SEQ ID NO: 2.
Por otro lado, un ejemplo de secuencia que codifica directamente para la obestatina humana (SEQ ID NO:3), podría ser, por ejemplo, aunque sin limitarse, la secuencia SEQ ID NO:4. Por esto, de forma preferida, la secuencia nucleotídica que codifica para la obestatina humana es la SEQ ID NO: 4.
La obestatina en los organismos se encuentra codificada por el gen de la ghrelina. Este gen da lugar a un péptido denominado pre-proghrelina. En humanos este péptido tiene como secuencia SEQ ID NO: 5, y es procesado en el organismo dando como producto la obestatina. Concretamente, en humanos, la pre-proghrelina tiene 1 17 aminoácidos y su secuencia sería SEQ ID NO:5. La secuencia codificante sin intrones para la pre- proghrelina humana, y que por tanto codifica para un péptido que comprende la obestatina humana de la invención sería la secuencia SEQ ID NO:6, la cual se corresponde con la secuencia nucleotídica de 354 pares de bases con número de acceso CCDS33700.1 , en la base de datos Consensus CDS (CCDS). Por ello, de forma preferida, la secuencia nucleotídica que codifica para la obestatina humana es SEQ ID NO: 6.
Por otro lado, en ratón, la secuencia codificante sin intrones para la pre-proghrelina de 117 aminoácidos (SEQ ID NO:7), y que por tanto también sería codificante para un péptido que comprende la obestatina de la invención, sería la secuencia SEQ ID NO:8, la cual se corresponde con la secuencia nucleotídica de 354 pares de bases con número de acceso CCDS20432.1 en la base de datos Consensus CDS (CCDS) . Por ello, de forma preferida, la secuencia nucleotídica que codifica para la obestatina de ratón es SEQ ID NO: 8.
El término "% de identidad" con respecto a un polipéptido o proteína se refiere al porcentaje de aminoácidos de la secuencia en cuestión que son idénticos a los aminoácidos de la secuencia con la que se compara, después de alinear dichas secuencias y de introducir espacios, si fuera necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad sin tener en cuenta las sustituciones conservadoras. El alineamiento puede llevarse a cabo de distintas formas conocidas por el experto en la materia, como por ejemplo, usando herramientas públicas como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Un experto en la materia puede determinar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo los algoritmos necesarios para alcanzar el máximo alineamiento de las secuencias que se comparan. En la presente invención, el % de identidad se calcula dividiendo el número de aminoácidos que son idénticos después de alinear SEQ ID NO: 1 y la secuencia candidata, entre el número total de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , y multiplicando el resultado por 100. En el caso de una secuencia nucleotídica, el "% de identidad" se calcula de igual manera aunque se comparan nucleótidos.
Tabla 1. Porcentajes de identidad entre las secuencias aminoacídicas de la obestatina de ratón y rata en comparación con la secuencia de humano y otros animales.
Figure imgf000008_0001
Por todo ello, otra realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de un péptido aislado que comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1 , donde la secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1 es SEQ ID NO:3, o al uso de la secuencia nucleotídica que lo codifica, como agente miogénico "in vitro". Dado que SEQ ID NO:3 corresponde a la obestatina humana, y en el organismo es sintetizada en forma de pre- proghrelina, la cual se procesa dando lugar a la obestatina, esta pre-proghrelina presentaría la misma utilidad que la obestatina. Por tanto, de forma preferida, la secuencia aminoacídica que comprende SEQ ID NO:3 es la pre-proghrelina humana (SEQ ID NO:5). Otra realización preferida se refiere al uso de un péptido aislado que consiste en una secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1 , donde la secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1 es SEQ ID NO:3, o al uso de la secuencia nucleotídica que lo codifica, como agente miogénico "in vitro".
Una realización preferida del primer aspecto de la invención, se refiere al uso de un péptido aislado que comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 91 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 , o al uso de la secuencia nucleotídica que lo codifica, como agente miogénico "in vitro". Una realización más preferida se refiere al uso de un péptido aislado que comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 95% de identidad con la SEQ ID NO: 1 , o al uso de la secuencia nucleotídica que lo codifica, como agente miogénico "in vitro". Una realización aun más preferida se refiere al uso de un péptido aislado que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 , o al uso de la secuencia nucleotídica que lo codifica, como agente miogénico "in vitro". Dado que SEQ ID NO:1 corresponde a la obestatina de ratón o rata, y en el organismo es sintetizada en forma de pre-proghrelina, la cual se procesa dando lugar a la obestatina, esta pre-proghrelina presentaría la misma utilidad que la obestatina. Por tanto, de forma preferida la secuencia aminoacídica que comprende SEQ ID NO:1 es la pre-proghrelina de ratón o rata (SEQ ID NO:7). Una realización particular, se refiere al uso de un péptido aislado que consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 , o al uso de la secuencia nucleotídica que lo codifica, como agente miogénico "in vitro".
La obestatina y sus variantes o derivados pueden ser sintetizados, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante síntesis química, técnicas de ADN recombinante, aislamiento de fuentes naturales o por proteólisis in vitro. La obestatina puede producirse recombinantemente, no sólo directamente sino como un polipéptido de fusión junto con un polipéptido heterólogo, el cual puede contener, por ejemplo aunque sin limitarnos, una secuencia señal, u otro polipéptido que tenga un sitio de corte para una proteasa, por ejemplo, aunque sin limitarnos, en el extremo N-terminal de la proteína madura o del polipéptido.
Los términos "secuencia nucleotídica", "secuencia de nucleótidos", "ácido nucleico", "oligonucleótido" y "polinucleótido" se usan aquí de manera intercambiable y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud que pueden estar o no química o bioquímicamente modificados. Se refieren, por tanto, a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, tanto de cadena sencilla como de doble hebra. Cualquiera de las secuencias de la presente invención, y que pueden codificar por ejemplo aunque sin limitarse para obestatina, puede obtenerse de manera artificial mediante métodos de clonación y selección convencionales, o bien mediante secuenciación. Dicha secuencia nucleotídica, adicionalmente a la secuencia codificante, puede llevar otros elementos, como por ejemplo aunque sin limitarnos, intrones, secuencias no codificantes en los extremos 5' y/o 3', sitios de unión a ribosomas, o secuencias estabilizadoras. Estos polinucleótidos adicionalmente pueden incluir secuencias codificantes para aminoácidos adicionales que puedan ser útiles, por ejemplo, aunque sin limitarse, para aumentar la estabilidad del péptido generado a partir de ellos o para permitir una mejor purificación del mismo. En otra realización preferida, la secuencia nucleotídica que codifica para la obestatina forma parte de un vector de expresión.
Un "vector de expresión" es una molécula de ácido nucleico usada para transferir material genético a una célula. Aparte de dicho material genético, un vector también puede contener diferentes elementos funcionales que incluyen elementos de control de la transcripción, como por ejemplo aunque sin limitarnos, promotores u operadores, regiones o potenciadores de la unión a factores de transcripción y elementos de control para iniciar y terminar la traducción. Los vectores incluyen, aunque sin limitarse: plásmidos, cósmidos, virus, fagos, casetes de expresión recombinantes y transposones. Algunos vectores son capaces de replicarse o dividirse autónomamente una vez que son introducidos en la célula huésped, como los vectores bacterianos con un origen de replicación bacteriano o los vectores episomales de mamíferos. Un vector de expresión es aquel capaz de dirigir la expresión de genes a los que se ha ligado de manera operativa. Un vector de expresión se usa para la transcripción y la traducción de un gen de interés, normalmente controlado por un promotor. Un "promotor" es una secuencia de nucleótidos que controla la traducción del gen de interés. El promotor está operativamente unido al gen de interés. Operativamente unido" se refiere a la relación funcional y a la localización de la secuencia del promotor con respecto al gen de interés.
La obestatina, o la secuencia nucleotídica que la codifica, pueden utilizarse como agentes miogénicos "¡n vitro" expresándose en un cultivo celular, preferiblemente de mioblastos, para inducir la diferenciación de las células en cultivo, de manera que se formen miotubos (células sincitiales multinucleadas, con núcleos en posición central, pero sin actividad mitótica) y posteriormente fibras musculares o miocitos que puedan ser utilizados finalmente en procedimientos de terapia celular somática para la regeneración del tejido muscular dañado, preferiblemente del tejido músculo- esquelético. Por ello, la obestatina, la secuencia nucleotídica que la codifica y las células en cultivo, preferiblemente mioblastos, que pretenden diferenciarse mediante este procedimiento de miogénesis "¡n vitro" son, más preferiblemente, de origen humano y aun más preferiblemente de origen autólogo.
Tal y como aquí se utiliza, el término "agente miogénico" se refiere a aquel agente capaz de inducir la proliferación, y/o diferenciación de una célula pluri o multipotencial, preferiblemente de un mioblasto, a un miocito o fibra muscular, es decir, a una célula fusiforme y multinuclear con capacidad contráctil y que forma parte del tejido muscular.
Un "mioblasto" es una célula indiferenciada con capacidad para sintetizar filamentos finos poco antes de su proceso de fusión con otros mioblastos y dar lugar a la formación de miotubos. Los mioblastos son células con alta capacidad de división celular y constituyen las células germinales del músculo.
Asimismo, la obestatina o la secuencia nucleotídica que la codifica pueden ser administradas a un individuo que padezca una lesión o enfermedad que cursa con daño en el tejido muscular, preferiblemente en el tejido músculo-esquelético, para promover la regeneración muscular y reestablecer así la condición patológica. Por ello, otro aspecto de la invención se refiere al uso de un péptido aislado que comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1 , o al uso de la secuencia nucleotídica que lo codifica, para la elaboración de un medicamento para la regeneración muscular. O alternativamente, este aspecto de la invención se refiere a un péptido aislado que comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1 , o a la secuencia nucleotídica que lo codifica, para su uso como medicamento para la regeneración muscular. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1 , es SEQ ID NO:3. Dado que SEQ ID NO:3 corresponde a la obestatina humana, y en el organismo es sintetizada en forma de pre-proghrelina, la cual se procesa dando lugar a la obestatina, esta pre-proghrelina presentaría la misma utilidad que la obestatina. Por tanto, de forma preferida, la secuencia aminoacídica que comprende SEQ ID NO:3 es la pre-proghrelina humana (SEQ ID NO:5).
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el péptido aislado consiste en una secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1. En una realización mas preferida, la secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1 , es la SEQ ID NO:3.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el péptido aislado comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 91 % de identidad con la SEQ ID NO: 1. En una realización más preferida de este aspecto de la invención, el péptido aislado comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 95% de identidad con la SEQ ID NO: 1. En una realización aun más preferida de este aspecto de la invención, el péptido aislado comprende la secuencia SEQ ID NO: 1. Dado que SEQ ID NO: 1 corresponde a la obestatina de ratón o rata, y en el organismo es sintetizada en forma de pre-proghrelina, la cual se procesa dando lugar a la obestatina, esta pre-proghrelina presentaría la misma utilidad que la obestatina. Por tanto, de forma preferida, la secuencia aminoacídica que comprende SEQ ID NO: 1 es la pre-proghrelina de ratón o rata (SEQ ID NO:7). En una realización aun más preferida, el péptido aislado consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.
En una realización preferida, la secuencia nucleotídica que codifica el péptido aislado es SEQ ID NO: 4. En otra realización preferida, la secuencia nucleotídica que codifica para el péptido aislado es SEQ ID NO: 2. En otra realización preferida, la secuencia nucleotídica que codifica para el péptido aislado es SEQ ID NO: 6. Por esto, de forma preferida, la secuencia nucleotídica que codifica para el péptido aislado es SEQ ID NO: 8.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la secuencia nucleotídica que codifica para el péptido aislado forma parte de un vector de expresión. La "regeneración muscular" se refiere a la formación de tejido muscular, preferiblemente de tejido músculo-esquelético, con el fin de mantener y/o reparar las miofibras musculares dañadas tras una lesión o enfermedad que cursa con daño muscular, ayudando así al incremento, restauración o sustitución parcial o total de la actividad funcional del tejido muscular dañado, preferiblemente de la actividad funcional del músculo esquelético dañado.
En otra realización preferida, el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de lesiones o enfermedades que cursan con daño o destrucción del músculo. Estas enfermedades son, por ejemplo aunque sin limitarse, enfermedades degenerativas o genéticas que cursan con daño muscular, preferiblemente con daño del músculo esquelético así como las lesiones musculares producidas por un trauma directo asociado al ejercicio físico, como por ejemplo, y sin limitarse, el trauma asociado al ejercicio físico excesivo, o a entrenamientos de resistencia. Existen diversas enfermedades y lesiones que cursan con daño muscular y que por tanto requieren una regeneración de dicho tejido, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, distrofias musculares (como distrofia muscular de Becker o distrofia muscular de Duchenne), lesiones musculares como las producidas por un trauma directo asociado a ejercicio físico, miopatías inflamatorias o miositis, miopatías distales, miopatías miotónicas, miopatías congénitas, miopatías mitocondriales, miopatías metabólicas (como enfermedad de Pompe, enfermedad de Forbes o enfermedad de Tarui), parálisis periódicas primarias, miopatías neurogénicas, necrosis muscular, atrofia muscular, torceduras, distensiones, calambres, tendinitis, contracturas (como contractura isquémica de Volkmann o contractura de Dupuytren), infecciones musculares, dolor miofacial, fasciculaciones musculares, hipotonía, rabdomiólisis o síndrome compartimental.
Así, en una realización más preferida, el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades o lesiones musculares seleccionadas de la lista que comprende: miopatías neurogénicas, necrosis muscular, atrofia muscular, torceduras, distensiones, calambres, tendinitis, contracturas, distrofia muscular, miositis, infecciones musculares, dolor miofacial, miopatías metabólicas, fasciculaciones musculares, hipotonía, miopatías congénitas, parálisis muscular, rabdomiólisis o síndrome compartimental. En una realización aun más preferida, el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades o lesiones musculares seleccionadas de la lista que comprende: miopatías neurogénicas, necrosis muscular, atrofia muscular o distrofia muscular.
Las enfermedades musculares cursan con un limitado número de síntomas, entre los que destacan la debilidad, fatigabilidad, el dolor muscular, los calambres, las contracturas y la alteración de la marcha. Además, el músculo puede presentar una variedad de fenómenos motores involuntarios, aunque la mayor parte de ellos son un reflejo de su denervación y no propiamente de una enfermedad muscular, por lo que es importante diferenciar las manifestaciones clínicas de las miopatías de las de las neuropatías. En términos generales, el diagnóstico se realiza en base a una exploración muscular que implica la detección de: alteraciones de la marcha, debilidad pelviana, pérdida de masa muscular, seudohipertrofia, fasciculaciones y/o mioclonías. Paralelamente se valora la consistencia, tono, dolorimiento, fuerza y reflejo muscular. Las exploraciones complementarias se realizan en base a análisis clínicos (enzimas musculares y mioglobinuria), pruebas de debilidad, técnicas de imagen (ecografía, RMN, TAC), electromiografía y biopsia muscular.
Preferiblemente, el medicamento comprende obestatina, o la secuencia nucleotídica que la codifica, en una cantidad terapéuticamente efectiva, entendiéndose por "cantidad terapéuticamente efectiva" la cantidad de obestatina o de secuencia nucleotídica que la codifica que produzca el efecto deseado. La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo o tolerancia del individuo al que le va a ser administrado el medicamento.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una composición farmacéutica, "composición de la invención", que comprende:
(i) un péptido aislado que comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1 , , o
(ii) la secuencia nucleotídica que codifica para el péptido de (i),
para la elaboración de un medicamento para la regeneración muscular.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1 , es SEQ ID NO:3. Dado que SEQ ID NO:3 corresponde a la obestatina humana, y en el organismo es sintetizada en forma de pre-proghrelina, la cual se procesa dando lugar a la obestatina, esta pre- proghrelina presentaría la misma utilidad que la obestatina. Por tanto, de forma preferida, la secuencia aminoacídica que comprende SEQ ID NO:3 es la pre-proghrelina humana (SEQ ID NO:5). En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el péptido aislado consiste en una secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1. En una realización más preferida, la secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1 , es SEQ ID NO:3. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el péptido aislado comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 91 % de identidad con la SEQ ID NO: 1. En una realización más preferida de este aspecto de la invención, el péptido aislado comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 95% de identidad con la SEQ ID NO: 1. En una realización aun más preferida de este aspecto de la invención, el péptido aislado comprende la secuencia SEQ ID NO: 1. Dado que SEQ ID NO: 1 corresponde a la obestatina de ratón o rata, y en el organismo es sintetizada en forma de pre-proghrelina, la cual se procesa dando lugar a la obestatina, esta pre-proghrelina presentaría la misma utilidad que la obestatina. Por tanto, de forma preferida, la secuencia aminoacídica que comprende SEQ ID NO: 1 es la pre-proghrelina de ratón o rata (SEQ ID NO:7). En una realización aun más preferida, el péptido aislado consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.
En una realización preferida, la secuencia nucleotídica que codifica para el péptido aislado es SEQ ID NO: 4. En otra realización preferida, la secuencia nucleotídica que codifica para el péptido aislado es SEQ ID NO: 2. En otra realización preferida, la secuencia nucleotídica que codifica para el péptido aislado es SEQ ID NO: 6. Por esto, de forma preferida la secuencia nucleotídica que codifica para el péptido aislado es SEQ ID NO: 8. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la secuencia nucleotídica que codifica para el péptido aislado forma parte de un vector de expresión.
En otra realización preferida, el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades o lesiones musculares seleccionadas de la lista que comprende: miopatías neurogénicas, necrosis muscular, atrofia muscular, torceduras, distensiones, calambres, tendinitis, contracturas, distrofia muscular, miositis, infecciones musculares, dolor miofacial, miopatías metabólicas, fasciculaciones musculares, hipotonía, miopatías congénitas, parálisis muscular, rabdomiólisis o síndrome compartimental. En otra realización preferida, el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades o lesiones musculares seleccionadas de la lista que comprende: miopatías neurogénicas, necrosis muscular, atrofia muscular o distrofia muscular.
La composición de la invención puede comprender además otro/s principio/s activo/s, excipiente/s y/o vehículo/s farmacéuticamente aceptable/s. El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de los elementos de la composición de la invención, estabiliza dichos elementos, activa o ayuda a la preparación de la composición en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que la hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos, como por ejemplo es el caso de almidones, azúcares o celulosas, la función de endulzar, la función de colorante, la función de protección de la composición, como por ejemplo, para aislarla del aire y/o la humedad, la función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación, la función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.
El "vehículo farmacéuticamente aceptable", al igual que el excipiente, es una sustancia que se emplea en la composición para diluir cualquiera de los componentes comprendidos en ella hasta un volumen o peso determinado. El vehículo farmacéuticamente aceptable es una sustancia inerte o de acción análoga a la obestatina y a la secuencia nucleotídica que la codifica. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros elementos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición.
Como se emplea aquí, el término "principio activo", "sustancia activa", "sustancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto. La composición de la invención puede formularse para su administración en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Como ejemplos de preparaciones se incluye cualquier composición sólida (comprimidos, pildoras, cápsulas, gránulos, etc.) o líquida (soluciones, suspensiones o emulsiones) para administración oral, tópica o parenteral. La composición de la invención también puede ser formulada en forma de liposomas, nanopartículas, nanoesferas, micropartículas, microesferas, micelas, de formulaciones de liberación sostenida o de cualquier otro sistema convencional de liberación.
Tal composición y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse, oral, parenteral (intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, intraespinal, intraestromal, intraarticular, intratecal, intralesional, intraarterial, intramuscular, intranasal, subcutánea, intracapsular), tópica, mediante parches transdérmicos o vía rectal, mediante la administración de un supositorio, percutánea, espray nasal, implante quirúrgico, pintura quirúrgica interna, bomba de infusión o vía catéter.
El "medicamento" al que se refiere la presente invención puede ser de uso humano o veterinario. El "medicamento de uso humano" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades para el tratamiento o prevención de enfermedades o lesiones en seres humanos o que pueda usarse en seres humanos o administrarse a seres humanos con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico médico. El "medicamento de uso veterinario" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades curativas o preventivas con respecto a las enfermedades o lesiones animales o que pueda administrarse al animal con el fin de restablecer, corregir o modificar sus funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico veterinario.
El medicamento de la invención puede utilizarse tanto solo como en combinación con otros medicamentos o composiciones para la regeneración muscular, preferiblemente para el tratamiento y/o prevención de lesiones o enfermedades degenerativas o genéticas que cursan con daño muscular, más preferiblemente del músculo esquelético. El término "tratamiento", tal como se entiende en la presente invención, se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de una lesión o enfermedad degenerativa o genética que cursa con daño muscular, preferiblemente con daño en el músculo esquelético, en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente humano) que incluye:
(i) inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo;
(ii) aliviar la enfermedad o la condición patológica, es decir, causar la regresión de la enfermedad o la condición patológica o su sintomatología; o
(iii) estabilizar la enfermedad o la condición patológica.
El término "prevención" tal como se entiende en la presente invención, consiste en evitar la aparición de la enfermedad, es decir, evitar que se produzca la enfermedad o la condición patológica en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente humano), en particular, cuando dicho sujeto tiene predisposición por la condición patológica, pero aún no se ha diagnosticado que la tenga.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Activación de enzimas reguladoras de mitogénesis y miogénesis por la obestatina en mioblastos y miotubos L6E9. Efecto de la obestatina sobre actividad de enzimas reguladoras de la capacidad mitogénica (ERK 1/2), metabólica (Akt y AMPK) y miogénica (Akt y p38). En base a un estudio dosis-respuesta la dosis saturante para la máxima activación enzimática se establece para una concentración 5 nM. El análisis por inmunoblot muestra un perfil de activación para Akt, ERK 1/2 y p38 en mioblastos y miotubos. Se describe inactivación de AMPK en ambos modelos celulares. El perfil de activación descubre características bimodales para la acción de la obestatina: 1.- activación mitogénica en mioblastos; y, 2.- activación miogénica. Los immunoblots son representativos de 6 ensayos independientes. Fig. 2. Efecto mitogénico de la obestatina en mioblastos L6E9. Efecto mitogénico de diferentes dosis de obestatina (0,01-100 nM) en mioblastos L6E9 tras 48 horas de estimulación en presencia de medio de crecimiento [GM, del inglés growth médium: DMEN+10% FBS]. Co: número inicial de células. Control: número de células tras 48 horas en GM. GM+obestatina: número de células tras 48 horas de estimulación con obestatina en GM. Los datos están expresados como media±error estándar de 4 experimentos independientes (*, p<0,05). Fig. 3. Efecto de la obestatina sobre la expresión de los marcadores miogénicos miogenina y MHC en mioblastos L6E9. Efecto de la estimulación con diferentes dosis de obestatina (0,01-100) sobre la expresión de los marcadores miogénicos miogenina y miosina (MHC) tras 6 días de la inducción de la diferenciación mediante la utilización de medio de diferenciación (DM, del inglés Differentiation médium: DMEN+2% FBS). Los niveles de expresión de proteínas están referenciados a los niveles de mioblastos en medio de crecimiento (GM, del inglés Growth Médium: DMEN+10% FBS), no diferenciados. Los datos están representados como % respecto a la expresión de células en GM (media±error estándar de 6 experimentos independientes). La evaluación del grado de expresión se realizó por inmunoblot mediante la utilización del programa lmageJ64 (*, p<0,05).
Fig. 4. índice de diferenciación asociado a la obestatina estimado en mioblastos L6E9 por inmunofluorescencia. A: estimación de la capacidad miogénica de la obestatina (5 nM) mediante inmunofluorescencia (índice de diferenciación). Las células fueron diferenciadas en DM (control) o en DM+obestatina (5 nM) durante 6 días. Una vez fijadas, las células fueron teñidas con el anticuerpo anti-MHC (magnificación 40x). B: cuantificación del índice de diferenciación de células diferenciadas en DM (control) o en DM+obestatina (5 nM) durante 6 días. Los datos están representados relativos al número de células control positivas para MHC (media±error estándar; *, p<0,05).
Fig. 5. índice de fusión (número de núcleos por miotubo) asociado a la obestatina estimado en L6E9 por inmunofluorescencia. A: estimación de la capacidad de fusión de miotubos (índice de fusión) de la obestatina (5 nM) mediante inmunofluorescencia. Las células fueron diferenciadas en DM (control) o en DM+obestatina (5 nM) durante 6 días. Una vez fijadas, las células fueron teñidas con el anticuerpo anti-MHC (magnificación 40x). B: cuantificación del índice de fusión para las células diferenciadas en DM (control) o en DM+obestatina (5 nM) durante 6 días. Los datos están representados como % del número total células positivas para MHC con≥ 2 núcleos (media±error estándar). Fig. 6. Evaluación de la capacidad de cicatrización (migración/invasión) de la obestatina en mioblastos L6E9. A: los mioblastos L6E9 crecieron al 100% de confluencia en GM y posteriormente se indujo el daño con una pipeta estéril. Las células fueron mantenidas en GM o GM+obestatina (5 nM) durante 8 y 24 horas tras la inducción del daño celular (magnificación 40x). B: cuantificación del % de cicatrización (media±error estándar; *, p<0,05).
Fig. 7. Efecto de la administración crónica de obestatina sobre los marcadores miogénicos en el gastronemio y soleo de rata (modelo animal). Efecto de la administración durante 72 horas de obestatina (300 nmol/kg/24h; 72 h) mediante la implantación de minibombas sobre marcadores tempranos y tardíos de la miogénesis en tejido muscular esquelético (gastronemio y soleo) en ratas macho. A: análisis mediante western-blot. Primera columna: control; segunda columna: tratamiento con obestatina. B: Niveles de proteína en gastronemio. Columna blanca: control; columna gris: tratamiento con obestatina. Los niveles de proteína se expresan como % del control obtenido del grupo de animales con implantación de minibombas con salino (n=10 por grupo; media±error estándar; *, p<0,05). C: Niveles de proteína en soleo. Columna blanca: control; columna gris: tratamiento con obestatina. Los niveles de proteína se expresan como % del control obtenido del grupo de animales con implantación de minibombas con salino (n=10 por grupo; media±error estándar; *, p<0,05).
Fig. 8. Efecto de la administración exógena de obestatina en el tibial anterior dañado de ratón (modelo animal) sobre los marcadores miogénicos PAX-7 (A), MyoD (B), miogenina (C) y eMHC (D). Efecto de la administración exógena local de obestatina (300 nmol/kg/24h) sobre marcadores tempranos y tardíos de la miogénesis en tejido muscular esquelético dañado (tibial anterior) en ratones. Los niveles de proteína se expresan como % del control obtenido del grupo de animales con administración de PBS (n=10 por grupo; media ± error estándar; *, #, p<0.005).
Fig. 9. Análisis inmunohistoquímico del efecto de la administración exógena de obestatina sobre la capacidad de regeneración muscular en el tibial anterior dañado de ratón (modelo animal). Las imágenes que se muestran son representativas de las secciones del músculo tibial anterior dañado (tinción hematoxilina/eosina) bajo la administración exógena local de obestatina (300 nmol/kg/24h) o PBS (control) a las 48, 96, 168 y 240 h después de la inducción del daño. Las imágenes muestran la zona de daño y regeneración a los tiempos indicados.
Fig. 10. Análisis cuantitativo de las áreas de las fibras regenerativas del tibial anterior a las 96 y 168 horas después de la inducción del daño y administración exógena de obestatina o PBS (control). El análisis corresponde al área de miofibras de regeneración en el tibial anterior. Para ello se realizó un análisis inmunohistoquímico mediante tinción con hematoxilina/eosina y posterior cuantificación del área de la miofibra mediante la utilización del programa lmageJ64 (n=10 por grupo; media ± error estándar; *, p<0.005).
Fig. 11. Análisis por inmufluorescencia del efecto de la administración exógena de obestatina (96 h) sobre la expresión de eMHC en el tibial anterior dañado de ratón (modelo animal). Imágenes representativas de la expresión de eMHC mediante inmunofluorescencia de secciones del tibial anterior tratados con obestatina (300 nmol/kg/24h) o PBS (control) a las 96 h después de la inducción del daño. Los paneles superiores corresponden a la tinción con anticuerpo anti-eMHC y los paneles inferiores a la tinción con DAPI.
Fig. 12. Análisis de los niveles de creatina quinasa en suero de ratones a los que se le indujo daño en el músculo tibial anterior y fueron tratados localmente con obestatina o vehículo (PBS) durante 96 h. Los niveles de creatina quinasa se expresan como IU/L (International υηίίε/Ιίίθή para los tres grupos a estudios: control sin daño, control daño (PBS) y tratamiento con obestatina (n=10 por grupo; media ± error estándar; *,#, p<0.005).
Fig. 13. Cuantificación de los vasos sanguíneos por miofibra en el tibial anterior 10 días después de la inducción del daño muscular y tratamiento exógeno de obestatina (300 nmol/kg/24h) o vehículo (PBS). Cuantificación del número de vasos sanguíneos (inmunofluorescencia: positividad a isolectina) por miofibra (media ± error estándar; *, p<0.005) de secciones del tibial anterior tratados con obestatina (300 nmol/kg/24h) o PBS (control) 10 días después de la inducción del daño. Fig. 14. Análisis de la reducción de peso del músculo tibial anterior en ratones a los que se les practicó la denervación del ciático (modelo de atrofia muscular) bajo la administración exógena de obestatina o vehículo (PBS). Se utilizaron ratones Swiss a los que se les practicó la denervación del ciático en una de las extremidades, utilizando la otra como control. El efecto de la administración de obestatina (300 nmol/kg peso) o el vehículo (PBS; control) se evaluó en el músculo tibial anterior a los14 días. Los datos se expresan como % de reducción de peso respecto al control sin denervación (n=5 por grupo; media ± error estándar; *, p<0.005).
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad de la obestatina como agente miogénico y, por tanto, como regenerador muscular. Estos ejemplos específicos que se proporcionan sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención y se incluyen solamente con fines ilustrativos, por lo que no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
MÉTODOS
MATERIALES. La obestatina de rata/ratón se obtuvo de California Peptide Research (CA, USA). Anticuerpos anti-pAkt HM(S473), anti-Akt, anti-pERK1/2(T202/Y204), anti- ERK 1/2, anti-AMPKa(T172), anti-ΑΜΡΚα, anti-pp38(Y182), anti-p38, anti-p21 y anti- tubulin fueron de Cell Signaling Technology (MA, USA). Anticuerpo anti-cadena pesada de la miosina (MHC) y antilaminin se obtuvieron de Abcam (Cambridge, UK). Anticuerpo anti miogenina, anti-MyoD, anti-Myf5, anti-Pax-7, anti-Myf6 y anti-Six-1 fueron de Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Los anticuerpos anti-isolectin GS-IB4 Alexa Fluor 594 y anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con FITC se obtuvo de Invitrogen (CA, USA). Los anticuerpos anti-embrional myosin heavy chain (eMHC) se obtuvieron de Developmental Studies Hybridoma Bank (IA, USA). Los anticuerpos secundarios y el Enhanced Chemiluminescence Detection System fueron de Pierce (IL, USA). Minibombas osmóticas Alzet® (modelo 1003D) se adquirieron a Alzet Corporation (CA, USA). Los demás reactivos fueron de Sigma-Aldrich (Mo, USA). CULTIVO Y DIFERENCIACIÓN DE LOS MIOBLASTOS L6E9. Los estudios se realizaron en base a la utilización de mioblastos de rata L6E9 que fueron mantenidos en medio de cultivo (GM, del inglés growth médium) constituido por DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Médium) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS, del inglés Fetal bovine serum), 100 U/mL penicilina, y 100 U/mL estreptomicina. Para la diferenciación, las células se cultivaron al 80-100% de confluencia en GM y se sustituyó por medio de diferenciación (DM, del inglés differentiation médium) constituido por DMEM suplementado con 2% de FBS, 100 U/mL penicilina, y 100 U/mL estreptomicina durante 6 días.
ANÁLISIS POR INMUNOBLOT. Las muestras de tejido o células fueron directamente lisadas en tampón RIPA [Tris-HCI (pH 7.2), 50 mM; NaCI, 150 mM; EDTA, 1 mM; NP-40, 1 % (v/v); Deoxicolato sódico, 0,25% (p/v); inhibidores de proteasas (Sigma); inhibidores de fosfatasas (Sigma)]. Los lisados fueron clarificados por centrifugación (14,000xg durante 15 min a 4°C) y la concentración de proteínas se cuantificó utilizando QuantiPro™ BCA assay kit (Sigma). Para inmunoblot, se cargaron cantidades iguales de proteína que fueron fraccionadas en geles de SDS-PAGE y transferidas a membranas de nitrocelulosa. Las bandas inmunoreactivas fueron detectadas por quimioluminiscencia Pierce ECL Western Blotting Substrate; Thermo Scientific, IL, USA).
ANÁLISIS POR INMUNOHISTOQUÍMICA. Las muestras de músculo se montaron en un medio frío de congelación [Tragacanth; Santa Cruz Biotechnology (CA, USA)] y congeladas en una mezcla de nitrógeno-isopentano. Las secciones del tejido fueron obtenidas por cortes seriados con un criostato (10 μηι) y fueron montadas en portas de adhesión para histoquímica (Marienfeld, Lauda-Kónigshofen, Germany). Las secciones fijadas fueron teñidas con hematoxilina/eosina. La cuantificación del área de las miofibras regenerativas se realizó mediante la utilización del software de análisis lmageJ64. ANÁLISIS POR MICROSCOPÍA DE INMUNOFLUORESCENCIA. Las células L6E9 fueron cultivadas y diferenciadas sobre portas de microscopía confocal en medio DM suplementado o no con obestatina (5 nM) durante 6 días. Las células fueron fijadas utilizando una solución tamponada de PBS-paraformaldehido durante 15 min, lavadas, permeabilizadas y bloqueadas con PBT [1 % Tritón X-100, 1 % Tween-20, 5% suero inactivado, 0,2% BSA en tampón PBS] durante 30 min, y posteriormente incubadas con anticuerpo anti-MHC diluido en PBT (1 :400) durante 12 h a 4°C. Después de tres lavados con PBS, las células fueron incubadas con el anticuerpo secundario (anticuerpo cabra anti-ratón conjugado con) en PBT (1 : 1000) durante 45 min a 37°C. El DAPI fue utilizado para la tinción del núcleo. Las imágenes digitales de los cultivos celulares fueron adquiridas con un microscopio confocal Leica TCS-SP2. Se tomaron cinco campos de tres experimentos independientes para cada grupo. El grado de diferenciación se evaluó en base al número de células positivas a MHC entre el número total de núcleos. El número de núcleos dentro de los miotubos (≥ 2 núcleos) fue cuantificado para 20-50miotubos. Los miotubos fueron agrupados en dos categorías, aquellos con 2-3 núcleos y con 4 o más núcleos. El porcentaje de miotubos en cada categoría se calculó relativo al número total de células.
Para los análisis de inmunofluorescencia de tejidos, se obtuvieron secciones congeladas que fueron fijadas utilizando una solución tamponada de PBS-paraformaldehido durante 15 min, lavadas, permeabilizadas y bloqueadas con PBT durante 30 min, y posteriormente incubadas con el correspondiente anticuerpo primario (anticuerpo anti- eMHC, anti-laminin) diluido en PBT (1 :50) durante 12 h a 4°C. Después de tres lavados con PBS, las secciones de tejido fueron incubadas con el anticuerpo secundario en PBT (1 : 1000) durante 45 min a 37°C. Los núcleos fueron visualizados mediante tinción con DAPI. Las imágenes digitales de los cultivos celulares fueron adquiridas con un microscopio confocal Leica TCS-SP2.
ENSAYOS DE INVASIÓN/MIGRACIÓN. Las células L6E9 fueron cultivadas hasta alcanzar una confluencia del 100% en GM. Alcanzada dicha confluencia, el daño se produjo mediante la utilización de una punta de pipeta estéril que permitió realizar dos canales lineales y perpendiculares. Tras el daño, las células fueron lavadas y cultivadas con GM o GM+obestatina (5 nM). El progreso de la migración se fotografió inmediatamente después del daño y a las 8 y 24 horas, cerca del punto de cruce. El área "invadida" se calculó trazando el borde de "cicatrización" y utilizando el software lmageJ64. El porcentaje de cicatrización se calculó en base a la siguiente ecuación: %cicatrización=[(área 0h-area xh)/ área 0 h]x100.
MODELOS ANIMALES. Para los ensayos in vivo se utilizaron dos modelos animales: ratas Sprague-Dawley y ratones Swiss. Las ratas Sprague-Dawley (250 g; n=20) mantenidas en ciclos de luz-oscuridad de 12h con libre acceso a dieta estándar y agua. Las minibombas Alzet® (modelo 1003D) fueron implantadas a nivel subcutáneo. Los animales fueron asignados a uno de los dos grupos experimentales (n=10/grupo): 1) grupo control (minibombas con salino); y, 2) grupo obestatina (minibombas implantadas conteniendo obestatina 300 nmol/kg peso/24h). Estas minibombas permiten un flujo de difusión de 1 microL/h. Después de 72 h, las ratas fueron sacrificadas por dislocación cervical bajo tratamiento anestésico, y los tejidos soleo y gastronemio se extrajeron para análisis por inmunoblot.
Los ratones (30 g; n=50) se mantuvieron en ciclos de luz-oscuridad de 12h con libre acceso a dieta estándar y agua. Para la inducción del daño muscular, el músculo tibial anterior (TA) se extrajo bajo anestesia y se sometió a tres ciclos de daño por contacto frío aplicando a lo largo de la longitud del músculo una barra metálica enfriada en nitrógeno líquido. Los músculos dañados fueron tratados localmente con inyección de obestatina (300 nmol/kg peso) o el correspondiente vehículo (PBS; control) durante los tiempos indicados en intervalos de 24 h. Los animales fueron asignados a uno de los cinco grupos experimentales (n=10/grupo): 1) grupo control (salino); 2) grupo obestatina 48 h (obestatina 300 nmol/kg peso/24h); 3) grupo obestatina 96 h (obestatina 300 nmol/kg peso/24h); 4) grupo obestatina 168 h (obestatina 300 nmol/kg peso/24h); y, grupo obestatina 240 h (obestatina 300 nmol/kg peso/24h). Después de los tiempos indicados, los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical bajo tratamiento anestésico, y los tejidos se extrajeron para análisis por inmunoblot e inmunohistoquímica.
Para el estudio de atrofia muscular se procedió a la denervación del ciático utilizan ratones Swiss. La denervación del ciático se realizó bajo anestesia, practicado una incisión a nivel del medio muslo en la cara lateral del miembro trasero derecho, separando los músculos y levantando el nervio ciático con fórceps quirúrgicos. Se aisló una porción del nervio que se seccionó retirando un fragmento del mismo. Finalmente se procedió al cierre de la incisión. A estos animales se les administró localmente una inyección de obestatina (300 nmol/kg peso) o el correspondiente vehículo (PBS; control) en intervalos de 24 h durante 14 días.
EJEMPLO 1. Estudio dosis respuesta para la activación de enzimas mitogénicos y miogénicos en mioblastos y miotubos L6E9.
Para definir el efecto mitogénico y miogénico de la obestatina, se estudió la capacidad de activación de dianas intracelulares reguladoras de la proliferación (ERK1/2) y/o diferenciación (p38 y Akt). En mioblastos, la activación de Akt [pAkt(S473)], p38 [pp38(Y138)] y ERK 1/2 [pERK1/2(T202/Y204)] se observó a concentraciones 0,1 nM de obestatina, en los que los niveles de fosforilación alcanzaban valores saturables a una concentración de 5 nM. La Figura 1 muestra que el tratamiento con obestatina (5 nM) en mioblastos L6E9 produce un aumento dosis-dependiente para pAkt(S473), pp38(Y138) y pERK1/2(T202/Y204), que alcanza niveles máximos a los 10 min post-estímulo. Al mismo tiempo, la obestatina (5 nM) defosforila la AMPKa en T172 [pAMPKa(T172)], inactivando este enzima. Dicha dinámica de activación fue similar en miotubos L6E9 bajo la estimulación con obestatina (5 nM). Estos datos indican posible capacidad mitogénica y miogénica. EJEMPLO 2. Estudio dosis respuesta para la capacidad mitogénica de la obestatina en mioblastos L6E9.
Estudios dosis-dependientes realizados en mioblastos con diferentes concentraciones de obestatina (0,01-100 nM) en GM (condiciones proliferativas) muestran un aumento máximo del número de células a las 48 horas post estimulación a una concentración de 5,0 nM de obestatina (~2,2-incremento en relación al control; Figura 2). Ello demuestra la capacidad proliferativa de la obestatina sobre mioblastos, paso previo a la diferenciación celular.
EJEMPLO 3. Estudio dosis respuesta para la expresión de marcadores miogénicos realizado en células L6E9 (mioblastos de rata).
Las células L6E9 fueron cultivadas en DM complementado con diferentes concentraciones de obestatina en un rango de 0,01-100 nM durante seis días. Como muestra la Figura 3, los niveles de proteína de miogenina y MHC, detectados por inmunoblot, mostraron un aumento de expresión para las células tratadas con obestatina, siendo el efecto máximo observado a una concentración de 5 nM para la expresión de miogenina (aumento de -1 ,7 en relación a las células control) y MHC (aumento de -1 ,6 en relación a las células control).
EJEMPLO 4 y 5. Estudios de microscopía de fluorescencia para la estimación del índice de diferenciación y fusión para el tratamiento con obestatina en células L6E9.
Los datos muestran que el tratamiento con obestatina incrementa -150% la capacidad de diferenciación en relación a las células control (Figura 4). Además, aproximadamente el 22% de los miotubos control presentaron≥4 núcleos, frente al -67% de las células bajo tratamiento con obestatina (Figura 5). Este efecto representa un incremento de -3,4 en el índice de fusión para el tratamiento con obestatina. EJEMPLO 6. Evaluación de la capacidad de cicatrización (migración/invasión) de la obestatina en mioblastos L6E9.
Los ensayos realizados en mioblastos L6E9 para la valoración de la capacidad del índice de migración (cicatrización) de la obestatina (5 nM) muestran un aumento del 53% a las 8 horas de la inducción del daño celular en relación a células control (Figura 6). Este aumento es del 21 % a las 24 horas tras la inducción del daño celular. El trabajar con tiempos cortos permite eliminar la contribución propia de la mitogénesis en el proceso de migración.
EJEMPLO 7. Estudio de expresión de factores propios de la mitogénesis en ratas bajo la administración crónica de obestatina.
En base a la corta vida media de la obestatina en plasma, se utilizaron minibombas osmóticas para la administración in vivo de este péptido. Se trabajó con dos grupos de ratas macho: un grupo de 10 ratas macho recibieron la infusión subcutánea continuada de obestatina durante 72h (300 nmol/kg peso corporal/ 24h); y otro grupo de 10 ratas recibieron el volumen equivalente de PBS durante 72h. Los animales fueron sacrificados, y los músculos gastronemio y soleo fueron extraídos y procesados para el análisis de la expresión de factores clave de la diferenciación muscular por inmunoblot. Los niveles de MyoD (de sus siglas en inglés Myogenic regulatory factor D), Myf5 (de sus siglas en inglés Myogenic regulatory factor 5), Pax-7 (de sus siglas en inglés Paired box protein 7), miogenina, Myf6 (de sus siglas en inglés Myogenic factor 6) y MHC fueron significativamente aumentados en músculo gastronemio y soleo de las ratas bajo el tratamiento con obestatina en relación al grupo de ratas control (Figura 7). Six-1 (de sus siglas en inglés Homeobox protein SIX1) mostró un aumento significativo en las muestras de soleo, mientras que no se observó efecto alguno en las muestras de gastronemio. El aumento en ambos tipos de músculo de la familia de factores reguladores de diferentes etapas de la miogénesis muestra una clara capacidad regenerativa del músculo para la obestatina.
EJEMPLO 8. Efecto de la administración exógena de obestatina en el tibial anterior dañado de ratón (modelo animal) sobre los marcadores miogénicos PAX-7 (A), MyoD (B), miogenina (C) y eMHC (D)
La estimación del potencial terapéutico de la obestatina como agente regenerador del músculo se evaluó en ratones Swiss a los que se les indujo el daño muscular en el tibial anterior y posteriormente se administró localmente la obestatina (300 nmol/kg peso) o el correspondiente vehículo (PBS). Los músculos fueron extraídos y analizados por inmunoblot a las 48, 96, 168 y 240 h después del tratamiento (n=5 por tiempo a estudio). Los niveles de Pax-7, MyoD, myogenina y eMHC fueron significativamente más altos en los músculos tratados con obestatina en relación a los músculos control (Figura 8). Además, se observó una aceleración de los tiempos de expresión para cada uno de estos factores analizados.
EJEMPLO 9. Análisis inmunohistoquímico del efecto de la administración exógena de obestatina sobre la capacidad de regeneración muscular en el tibial anterior dañado de ratón (modelo animal).
El examen histológico de las secciones del músculo tibial anterior obtenidas durante el proceso de regeneración muscular mostró un aumento significativo del calibre de las miofibras regenerativas en aquellos animales tratados con obestatina (300 nmol/kg peso) en relación a los correspondientes controles. Además, se pudo constatar una aceleración en el proceso regenerativo a juzgar por restructuración de las miofibras en la zona de daño a los diferentes tiempos en relación a los controles (Figura 9). Estos datos son indicativos de un aumento de la capacidad regenerativa del músculo.
EJEMPLO 10. Análisis cuantitativo de las áreas de las fibras regenerativas del tibial anterior a las 96 y 168 horas después de la inducción del daño y administración exógena de obestatina o PBS (control).
Un análisis del área de las fibras regenerativas en el tibial anterior mostró un aumento significativo en aquellos animales tratados con obestatina (300 nmol/kg peso) en relación a los correspondientes controles a las 96 y 168 h después del tratamiento (Figura 10). El aumento de área de las miofibras regenerantes unido a la velocidad de regeneración son indicativos de un aumento de la regeneración muscular bajo el tratamiento con obestatina.
EJEMPLO 11. Análisis por inmufluorescencia del efecto de la administración exógena de obestatina (96 h) sobre la expresión de eMHC en el tibial anterior dañado de ratón (modelo animal).
La expresión de eMHC, la cual está ausente en el músculo no dañado, aumenta de forma gradual durante el proceso de regeneración. El análisis por inmunofluorescencia de la expresión de eMHC en tibial anterior demuestra que la administración de obestatina (300 nmol/kg peso; 96 h) aumenta de forma significativa en la etapa temprana de la regeneración en relación a los controles (Figura 1 1). Estos datos refuerzan los resultados obtenidos para los marcados de diferenciación analizados por inmunoblot.
EJEMPLO 12. Análisis de los niveles de creatina quinasa en suero de ratones a los que se le indujo daño en el músculo tibial anterior y fueron tratados localmente con obestatina o vehículo (PBS) durante 96 h.
Los niveles séricos de creatina quinasa están asociados a un daño muscular. En animales a los que se les indujo el daño en el músculo tibial anterior y fueron tratados con obestatina (300 nmol/kg peso; 96 h) localmente mostraron una reducción significativa en relación a los controles de daño muscular bajo la administración del vehículo (PBS) (Figura 12). Estos datos son indicativos de una reducción del daño muscular consecuencia del aumento de la capacidad regenerativa bajo el tratamiento con obestatina. EJEMPLO 13. Cuantificación de los vasos sanguíneos por miofibra en el tibial anterior 10 días después de la inducción del daño muscular y tratamiento exógeno de obestatina (300 nmol/kg/24h) o vehículo (PBS).
El recuento de vasos sanguíneos positivos a isolectin en el músculo tibial anterior muestra un aumento significativo de la densidad capilar 10 días después de la inducción del daño muscular y tratamiento con obestatina (300 nmol/kg/24h) en relación a la administración del vehículo (PBS), indicando un aumento de la angiogénesis asociada al proceso regenerativo (Figura 13). Esto es indicativo de que la obestatina regula la capacidad de regeneración y la aportación de nutrientes a la zona de regeneración. EJEMPLO 14. Análisis de la reducción de peso del músculo tibial anterior en ratones a los que se les practicó la denervación del ciático (modelo de atrofia muscular) bajo la administración exógena de obestatina o vehículo (PBS).
Un análisis del peso del músculo tibial anterior en el modelo animal de atrofia muscular (denervación del ciático) demuestra que la administración local de obestatina (300 nmol/kg peso; 14 días) reduce la pérdida de masa muscular en relación a los animales control bajo tratamiento con el vehículo (PBS) (Figura 14). Estos datos son indicativos de que la obestatina es capaz de contrarrestar los efectos atróficos del músculo a través del aumento de masa y, probablemente, de fuerza muscular. Ello podría explicarse en base a la capacidad regenerativa e hipertrófica demostrada para dicho péptido.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Uso de un péptido aislado que comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1 , o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, como agente miogénico "in vitro".
2. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica según la reivindicación 1 donde dicho péptido comprende la secuencia SEQ ID NO: 3.
3. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica según la reivindicación 2 donde dicho péptido consiste en SEQ ID NO: 5.
4. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica según la reivindicación 2 donde dicho péptido consiste en SEQ ID NO: 3.
5. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según la reivindicación 1 donde dicho péptido comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 91 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 .
6. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según la reivindicación 5 donde dicho péptido comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 95% de identidad con la SEQ ID NO: 1 .
7. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según la reivindicación 6 donde dicho péptido comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 .
8. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según la reivindicación 7 donde dicho péptido consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 7.
9. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según la reivindicación 7 donde dicho péptido consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 .
10. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde dicha secuencia nucleotídica forma parte de un vector de expresión.
1 1 . Uso de un péptido aislado que comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1 , o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, para la elaboración de un medicamento para la regeneración muscular.
12. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica según la reivindicación 1 1 donde dicho péptido comprende la secuencia SEQ ID NO: 3.
13. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica según la reivindicación 12 donde dicho péptido consiste en SEQ ID NO: 5.
14. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica según la reivindicación 12 donde dicho péptido consiste en SEQ ID NO: 3.
15. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según la reivindicación 1 1 donde dicho péptido comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 91 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 .
16. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según la reivindicación 15 donde dicho péptido comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 95% de identidad con la SEQ ID NO: 1 .
17. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según la reivindicación 16 donde dicho péptido comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 .
18. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según la reivindicación 17 donde dicho péptido consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 7.
19. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según la reivindicación 17 donde dicho péptido consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 .
20. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según cualquiera de las reivindicaciones 1 1 a 19 donde dicha secuencia nucleotídica forma parte de un vector de expresión.
21 . Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según cualquiera de las reivindicaciones 1 1 a 20, donde el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades o lesiones musculares seleccionadas de la lista que comprende: miopatías neurogénicas, necrosis muscular, atrofia muscular, torceduras, distensiones, calambres, tendinitis, contracturas, distrofia muscular, miositis, infecciones musculares, dolor miofacial, miopatías metabólicas, fasciculaciones musculares, hipotonía, miopatías congénitas, parálisis muscular, rabdomiólisis o síndrome compartimental.
22. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según la reivindicación 21 , donde el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades o lesiones musculares seleccionadas de la lista que comprende: miopatías neurogénicas, necrosis muscular, atrofia muscular o distrofia muscular.
23. Uso de una composición farmacéutica que comprende: a. un péptido aislado que comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1 , o b. la secuencia nucleotídica que codifica para el péptido de (i), para la elaboración de un medicamento para la regeneración muscular.
24. Uso de una composición farmacéutica según la reivindicación 23 donde el péptido aislado de (i) comprende la secuencia SEQ ID NO: 3.
25. Uso de una composición farmacéutica según la reivindicación 24 donde el péptido aislado de (i) consiste en SEQ ID NO: 5.
26. Uso de una composición farmacéutica según la reivindicación 24 donde el péptido aislado de (i) consiste en SEQ ID NO: 3.
27. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 23 donde el péptido aislado de (i) comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 91 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 .
28. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 27 donde el péptido aislado de (i) comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 95% de identidad con la SEQ ID NO: 1 .
29. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 28 donde donde el péptido aislado de (i) comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 .
30. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 29 donde el péptido aislado de (i) consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 7.
31 . Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 29 donde el péptido aislado de (i) consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 .
32. Uso de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 23 a
31 donde la secuencia nucleotídica forma parte de un vector de expresión.
33. Uso de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 23 a
32 donde el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades o lesiones musculares seleccionadas de la lista que comprende: miopatías neurogénicas, necrosis muscular, atrofia muscular, terceduras, distensiones, calambres, tendinitis, contracturas, distrofia muscular, miositis, infecciones musculares, dolor miofacial, miopatías metabólicas, fasciculaciones musculares, hipotonía, miopatías congénitas, parálisis muscular, rabdomiólisis o síndrome compartimental.
34. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 33 donde el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades o lesiones musculares seleccionadas de la lista que comprende: miopatías neurogénicas, necrosis muscular, atrofia muscular o distrofia muscular.
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