ES2930034T3 - Regulación por norrin de proteínas de unión y el uso de las mismas para tratar edema inducido por fuga de la membrana epitelial o endotelial - Google Patents

Abstract

Un método para estrechar las uniones intercelulares en células endoteliales o epiteliales incluye exponer las células endoteliales o epiteliales a norrina. Tras un tiempo de contacto suficiente, para que la norrina regule selectivamente la expresión génica de cadherina o claudina-5 en las células endoteliales o epiteliales, las uniones intercelulares se estrechan. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Regulación por norrin de proteínas de unión y el uso de las mismas para tratar edema inducido por fuga de la membrana epitelial o endotelial

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere, en general, a una sustancia para su uso en métodos de regulación de la expresión génica de cadherina y claudina en un tejido del cuerpo aplicando a dicho tejido la proteína norrin; y en particular, a producir la producción celular adicional de cadherina y claudina-5 para limitar el edema asociado a zonas de oclusión comprometidas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Diversas enfermedades inflamatorias se caracterizan por edema inducido por fuga. A nivel celular, este edema está asociado con las uniones entre las células epiteliales o endoteliales que se comprometen. Dicho mecanismo relacionado con este tipo de inflamación es el tejido isquémico que compensa una falta de oxígeno y nutrientes regulando excesivamente por incremento las citocinas implicadas en la permeabilidad. La expresión en exceso del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) provoca un aumento en la permeabilidad de los vasos debido a la reducción de las moléculas de adhesión célula a célula, tales como VE-cadherina y claudina-5. Se ha mostrado que la enfermedad de Crohn y la enfermedad inflamatoria del intestino evolucionan a través de un mecanismo fallido de la zona de oclusión (JD Schulzke et al. Ann N Y Acad Sci. 2009 May; 1165:294-300. doi: 10.1111).

Las zonas de oclusión endoteliales se encuentran en una variedad de tejidos que incluyen vasos sanguíneos y el cerebro, el revestimiento endotelial de la pared del vaso forma un barrera permeable controlada, que está localizada en la interfase entre los compartimentos vasculares y perivasculares. Aunque el endotelio actúa de barrera eficiente que separa estrictamente los dos compartimentos, también puede actuar de filtro permeable que permite el intercambio selectivo de solutos y agua entre los lados luminal y abluminal de la barrera. Una alteración de la función del equilibrio debida al fallo de la zona de oclusión conduce a una variedad de afecciones inflamatorias de la vasculatura, sistema linfático y cerebro. Mientras que dichas afecciones se tratan rutinariamente con antiinflamatorios esteroideos o no esteroideos, dichas terapias existentes tienen limitaciones en términos de eficacia, así como efectos secundarios.

Además, muchos cánceres evolucionan solo mediante angiogénesis, que es promovida por el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y la metástasis de tumores requiere necesariamente el aflojamiento de las uniones entre las células cancerosas para permitir que las células sean circulatorias. Aunque no es causante del cáncer, este mecanismo parece ser importante en la proliferación.

Las capas epiteliales y endoteliales son sitios de intercambio, así como barreras, para el tránsito de iones y moléculas entre tejidos y el aparato circulatorio del organismo. Los complejos entre células epiteliales y endoteliales adyacentes incluyen las zonas de oclusión y las zonas adherentes. Las células epiteliales y endoteliales de los vertebrados presentan zonas de oclusión que se encuentran apicales a las zonas adherentes. Las zonas de oclusión tienen una función de organización en la polarización epitelial y endotelial y establecen una barrera apico-lateral a la difusión de solutos a través del espacio intracelular (función de puerta). Las zonas de oclusión también restringen el movimiento de lípidos y proteínas de la membrana entre la membrana apical y basolateral (función de valla). Las zonas de oclusión son sitios de contacto de la membrana altamente ordenados, que comprenden una red de fibrillas intramembranarias. Las zonas de oclusión incluyen proteínas transmembranarias, que incluyen ocludina, claudina-5 y moléculas de adhesión de la zona de oclusión (JAM) y varias proteínas periféricas citoplásmicas. Estas se muestran esquemáticamente en el estado de la técnica FIG. 1. Aunque las proteínas transmembranarias median en la adherencia célula-célula, la placa de la zona de oclusión citosólica contiene diversos tipos de proteínas (por ejemplo, proteínas PDZ, tales como la familia ZO (zona de oclusión)) que une proteínas transmembranarias de la zona de oclusión al esqueleto subyacente. Estos adaptadores también reclutan proteínas reguladoras, tales como proteínas cinasas, fosfatasas, GTPasas pequeñas y factores de transcripción, hacia las zonas de oclusión. Como resultado, las proteínas estructurales (actina y espectrina) y reguladoras (proteínas de unión a actina, GTPasas y cinasas) se yuxtaponen con proteínas transmembranarias. Este armazón de proteína facilita el ensamblaje de estructuras altamente ordenadas, tales como complejos de la zona de oclusión o parches de señalización que regulan la polaridad, la proliferación y la diferenciación de las células epiteliales.

Las zonas de oclusión se localizan en la porción más alta de la membrana plasmática lateral, donde las proteínas integrales de la membrana, como las claudinas, parecen participar en las interacciones homófilas y/o heterófilas implicadas en las adhesiones firmes. Las claudinas tienen cuatro dominios transmembranarios hidrófobos y dos bucles extracelulares. Los bucles extracelulares, cuyas secuencias son distintas en diferentes claudinas, contribuyen a la formación no solo de las cadenas de la zona de oclusión, sino también de canales selectivos de iones. La claudina-5 es importante en las uniones de células endoteliales y epiteliales. En general, las cadenas de la zona de oclusión son copolímeros lineales de ocludina, claudina-5 y las j Am que atraen proteínas citoplásmicas que contienen dominios PDZ (OZ) tienen alta afinidad por las secuencias carboxiterminales de estas proteínas.

Las zonas de oclusión y las zonas adherentes están asociadas funcional y estructuralmente, la VE-cadherina endotelial asociada a las zonas adherentes regula por incremento el gen que codifica la proteína adhesiva de la zona de oclusión claudina-5 y una estructura similar se encuentra en células epiteliales con E-cadherina en lugar de VE-cadherina. Este efecto requiere la liberación de la actividad inhibitoria del factor de caja forkhead FoxO1 para suprimir la actividad del proteasoma. La cadherina vascular endotelial (VE)-cadherina actúa induciendo la fosforilación de FoxO1 mediante la activación de Akt y limitando la translocación de beta-catenina al núcleo (Taddei et al. Nat Cell Biol. 2008 Aug;10(8):923-34. doi: 10.1038/ncb1752. Epub 6 de julio de 2008). La policistina-1 (PDK-1) es una proteína de la membrana localizada en zonas adherentes en un complejo que contiene beta-cateninas, que está mediada por P13K.

El VEGF induce la permeabilidad vascular mediante la inducción de la rápida endocitosis de una molécula de adhesión de células endoteliales y epiteliales clave, la cadherina, rompiéndose así la función de barrera. Este proceso se inicia por la activación de la GTPasa pequeña, Rac por VEGFR a través de la fosforilación dependiente de Src de Vav2 (no mostrada), un factor de intercambio de nucleótidos de guanina. La activación de Rac promueve, a su vez, la fosforilación mediada por cinasa activada por p21 (PAK) de un motivo altamente conservado dentro de la cola intracelular de cadherina. Esto da como resultado el desmontaje de las uniones intercelulares (Gavard et al., Nat Célula Biol. 2006 Nov; 8(11):1223-34. Epub 22 de octubre de 2006).

En una célula epitelial a modo de ejemplo normalmente funcionante mostrada en el panel izquierdo de la FIG. 1 con una zona de oclusión intacta, VEGf no se une al receptor VEGFR correspondiente, y la claudina-5 se expresa normalmente en el núcleo del gen de claudina-5 codificante y se procesa por el retículo endoplásmico. La ocludina, claudina-5 y JAM forman juntos una zona de oclusión funcionante, y la cadherina forma una zona adherente organizada.

A diferencia, con la unión de VEGF a VEGFR, como se muestra en el panel derecho de la FIG. 1, el complejo Src/Rac/Pak actúa sobre las beta-cateninas para desestabilizar la zona adherente. Se cree que la cascada resultante altera la expresión y el ensamblaje de claudina-5 dando como resultado una pérdida de estructura de la zona de oclusión.

Norrin es un ligando para el subtipo 4 de receptor Frizzled (Fz4). Norrin se une Fz4 con afinidad nanomolar (Xu, et al, Cell, 2004; 116:883-895; Clevers, Curr Biol, 2004; 14:R436-437; Nichrs, Dev Cell, 2004; 6:453-454). La interacción de norrin con Fz4 depende del receptor de la superficie celular LRP5 (Xu, 2004). Los receptores Frizzled se acoplan a la vía de señalización canónica de p-catenina. La inactivación de la glucógeno sintasa cinasa (GSK) 3p y axina a través de la unión del receptor frizzled estabiliza la p-catenina, que posteriormente se acumula en el núcleo de la célula y activa la transducción de genes diana que son cruciales en la transición de fase Gl-S, tal como ciclina D1 o c-Myc (Willert et al., Curr Opin Genet Dev, 1998; 8:95-102). Se ha mostrado que la supresión de la actividad de norrin excluye la angiogénesis asociada con la enfermedad ocular (documento de patente US 2010/0129375).

Por lo tanto, existe una necesidad de un método de tratamiento de edema asociado a la fuga de membrana endotelial y epitelial. Hay una necesidad adicional de un método de tratamiento de trastornos clínicos asociados a edema por fallo de la membrana de células endoteliales y epiteliales. También existe la necesidad de un método de producción de cadherina y claudina-5. La presente invención se refiere a estas necesidades, así como a otras, importantes en la técnica.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La reivindicación independiente adjunta define la presente invención. Las reivindicaciones dependientes definen realizaciones preferidas. En particular, la presente invención se refiere a una sustancia basada en norrin para su uso en un método de tratamiento de edema retiniano, en particular edema de la membrana inducido por fuga en un sujeto reforzando uniones intercelular en células endoteliales o epiteliales in vivo en un sujeto humano o animal, por ejemplo, para tratar edema de la vasculatura retiniana. La sustancia basada en norrin comprende una cantidad eficaz de un truncado de norrin de extremo N que retiene un motivo de nudo de cisteína de norrin nativa, o de un mutante de norrin, cada uno capaz de unirse al receptor frizzled-4 de una célula endotelial o epitelial, mutante de norrin que contiene restos químicos adicionales que no son normalmente parte de la molécula de norrin que mejora la semivida biológica de la misma.

Las células endoteliales o epiteliales se seleccionan preferentemente entre:

• células endoteliales que definen una membrana vascular;

• células endoteliales que definen un capilar linfático; o

• células epiteliales que definen una membrana de la barrera hematoencefálica; o

• células epiteliales que definen una membrana hematointestinal, o

• células endoteliales microvasculares retinianas humanas (HRMEC).

La sustancia basada en norrin se basa preferentemente en un polipéptido de SEQ ID NO. 1 o 2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Estos y otros aspectos de la presente invención serán explicados en los dibujos adjuntos y la siguiente descripción detallada de la invención.

La FIG. 1 son esquemas del estado de la técnica de una célula que tiene uniones de células intactas (panel izquierdo) y uniones de células debilitadas o alteradas (panel derecho), que muestran la función de VEGF en cambiar la vía de ciertas vías celulares destacadas;

la FIG. 2 es un esquema de una posible vía para la eficacia de la presente invención para inducir la expresión celular de VE-cadherina y claudina-5;

la FIG. 3 son micrografías de fluorescencia de 20X aumentos de células endoteliales microvasculares retinianas humanas (HRMEC) inmunoteñidas (verde en límites alrededor de las células) para VE-cadherina después de 24 horas en medio solo (panel superior izquierdo), después de la exposición a: VEGF (100 ng/ml de medio) (panel superior derecho), norrin (250 ng/ml de medio) (panel inferior izquierdo), y tanto VEGF (100 ng/ml de medios) como norrin (250 ng/ml de medio) (panel inferior derecho);

la FIG. 4 son micrografías de fluorescencia de 40X aumentos de HRMEC inmunoteñidas (verde en límites alrededor de las células) para claudina-5 después de 24 horas en medio solo (panel superior izquierdo), después de la exposición a: VEGF (100 ng/ml de medio) (panel superior derecho), norrin (250 ng/ml de medio) (panel inferior izquierdo), y tanto VEGF (100 ng/ml de medio) como norrin (250 ng/ml de medio) (panel inferior derecho);

la FIG. 5 es un gráfico de barras normalizado de la expresión de ARNm de claudina-5 en una monocapa de HRMEC 24 horas después sin adición, VEGF, norrin, o la combinación de VEGF y norrin, que muestra que norrin restaura la expresión de claudina-5;

la FIG. 6 son micrografías retinianas que representan la fuga de azul de Evans en los ojos de un modelo de retinopatía inducida por oxígeno (OIR) de un ratón, con un ojo no inyectado (panel izquierdo) y un ojo inyectado con norrin (panel derecho), las imágenes se tomaron 3 días después de la inyección de norrin, donde brillante (blanco) es indicativo de fuga vascular y el ojo inyectado muestra conservación de la red de capilares.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención tiene utilidad como un método de limitar la fuga intercelular entre células endoteliales y epiteliales en un sujeto. Como resultado, se trata fácilmente un trastorno clínico en el que el edema ocurre basándose en la fuga de las zonas adherentes o las zonas de oclusión en células endoteliales y epiteliales. La presente invención es particularmente muy apta para su uso en respuesta al compromiso de la barrera hematoencefálica (BBB), o la barrera hematointestinal (BIB). También se proporciona un método de producción de cadherina y claudina-5. En una aplicación particular, la inflamación asociada a enfermedad de Crohn es reducida; una afección actualmente con tratamientos clínicos limitados. La invención se describirá con detalle a continuación. Los expertos en la técnica apreciarán que la descripción dada en el presente documento es para fines a modo de ejemplo solo y no pretende de ningún modo limitar el alcance de la invención.

Sin pretender quedar ligado a teoría de operación alguna, la unión de la proteína norrin a un receptor frizzled-4 de una célula endotelial o epitelial limita la degradación de beta-catetina, que entonces se acumula y localiza en el núcleo celular y posteriormente inducen una respuesta celular por transducción génica junto con TCF/LEF (factor de linfocitos T / factor potenciador linfoide). Los genes de claudina-5 y cadherina se transcriben entonces y las proteínas correspondientes son fabricadas por el retículo endoplásmico. Las proteínas resultantes reparan una unión de célula comprometida. Esto se muestra esquemáticamente en la FIG. 2. Las proteínas claudina-5 y cadherina también se someten a recogida o uso en estudios experimentales en ciertas realizaciones de la invención.

Las siguientes definiciones se usan en el presente documento con respecto al entendimiento de la presente invención.

"Administrar" se define en el presente documento como un medio de proporcionar proteína norrin o una composición que contiene norrin a las células endoteliales o epiteliales objeto con uniones comprometidas. Dicha administración puede ser por cualquier vía que incluye, sin limitación, oral, transdérmica (por ejemplo, mucosa oral), por inyección (por ejemplo, subcutánea, intravenosa, por vía parenteral, por vía intraperitoneal), por inhalación (por ejemplo, oral o nasal) o tópica (por ejemplo, colirios, crema, etc.). Las preparaciones farmacéuticas se administran, por supuesto, por formas adecuadas para cada vía de administración.

Por "alteración" se indica un cambio (aumento o disminución) en los niveles de expresión o actividad de un gen o polipéptido como se detecta por métodos habituales conocidos en la técnica, tales como los descritos en el presente documento. Como se usa en el presente documento, una alteración incluye al menos un cambio del 10 % en niveles de expresión, preferentemente un cambio del 25 %, más preferentemente un cambio del 40 % y lo más preferentemente un cambio del 50 % o mayor en los niveles de expresión.

Por "análogo" se indica una molécula que no es idéntica, pero tiene características funcionales o estructurales análogas a la proteína norrin. Por ejemplo, un análogo de polipéptido retiene la actividad biológica de norrin que existe de forma natural correspondiente, mientras que tiene ciertas modificaciones bioquímicas que potencian la función del análogo con respecto a un polipéptido que existe de forma natural. Dichas modificaciones bioquímicas podrían aumentar la resistencia a las proteasas del análogo, solubilidad, permeabilidad de la membrana o semivida, sin alterar, por ejemplo, la unión al ligando. Un análogo puede incluir un aminoácido no natural.

En la presente divulgación, "comprende", "que comprende", "que contiene" y "que tiene" y similares pueden tener el significado atribuido a ellos en la ley de patentes de EE. UU. y pueden significar "incluye", "que incluye" y similares; "que consiste esencialmente en" o "consiste esencialmente" tiene asimismo el significado atribuido en la ley de patentes de EE. UU. y el término es de extremos abiertos, lo que permite la presencia de más de lo que se cita mientras que las características básicas o novedosas de lo que se cita no cambie por la presencia de más de lo que se cita, pero excluye las realizaciones del estado de la técnica.

Por "control" se indica un patrón o estado de referencia.

"Cadherina" pretende referirse a cadherina endotelial vascular con referencia a células endoteliales (VE-cadherina) y cadherina epitelial (E-cadherina) con referencia a células epiteliales.

"Detectar" se refiere a identificar la presencia, ausencia o cantidad de analito que va a detectarse.

Por "marca detectable" se indica una composición que cuando se asocia a una molécula de interés hace que esta última sea detectable, por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, marcas útiles incluyen isótopos radiactivos, perlas magnéticas, perlas metálicas, partículas coloidales, colorantes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas (por ejemplo, como se usa comúnmente en un ELISA), biotina, digoxigenina o haptenos.

Por "fragmento" se indica una porción de norrin. Esta porción contiene, preferentemente, al menos 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de la longitud entera de los 133 restos de aminoácidos del polipéptido norrin humano nativo. Un fragmento puede contener 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100,110, 120, 130 o incluso los 133 aminoácidos completos.

"Truncado" pretende incluir un fragmento de norrin que tiene una escisión del extremo de polipéptido de la proteína norrin de hasta 40 restos de aminoácidos.

Por un "polipéptido aislado" se indica un análogo de polipéptido de norrin que se ha separado de componentes que lo acompañan naturalmente. Normalmente, el polipéptido se aísla cuando está al menos el 60 %, en peso, libre de las proteínas y moléculas orgánicas que existen de forma natural con las que se asocia naturalmente. Preferentemente, la preparación es al menos el 75 %, más preferentemente al menos el 90 % y lo más preferentemente al menos el 99 %, en peso, de un polipéptido de la invención. Un polipéptido aislado de la invención se puede obtener, por ejemplo, por extracción de una fuente natural, por expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica dicho polipéptido; o sintetizando químicamente la proteína. La pureza se pueden medir por cualquier método apropiado, por ejemplo, cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida, o por análisis de HPLC.

Norrin pretende definir un polipéptido o fragmento del mismo que tiene al menos aproximadamente 85 % de identidad de aminoácidos con el N.° de acceso de NCBI NP_000257.1, como se muestra a continuación, y que tiene la capacidad de unir el receptor frizzled-4 de células epiteliales retinianas. gil4557789lreflNP_000257.11 precursor de norrin [Homo sapiens]

MR.KHVLAASFSMLSLLVIMGDTDSKTDSSFIMDSDPRRCMR.HHYYDSISHPLYK.es

SKMVLLARCEGHCSQASRSEPLVSFSTVLKQPFRSSCHCCRPQTSKLKALRLRCSGG

MRLTATYRYILSCHCEECNS (SEQ ID NO. 1)

Como se usa en el presente documento, "obtener", como en "obtener un agente", incluye sintetizar, comprar o adquirir de otro modo el agente.

El término "paciente" o "sujeto" se refiere a un animal que es el objeto de tratamiento, observación o experimento. A modo de ejemplo solo, un sujeto incluye, pero no se limita a, un mamífero, que incluye, pero no se limita a, un mamífero humano o no humano, tal como un primate no humano, bovino, equino, canino, ovino o felino.

"Farmacéuticamente aceptable" se refiere a autorizado o autorizable por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o listado en la Farmacopea de los EE. UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, que incluye a seres humanos.

"Excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente, vehículo o diluyente que se puede administrar a un sujeto, junto con un agente, y que no destruye la actividad farmacológica del mismo y es no tóxico cuando se administra en dosis suficientes para administrar una cantidad terapéutica del agente.

Se entiende que los intervalos proporcionados en el presente documento son una abreviatura de todos los valores dentro del intervalo. Por ejemplo, un intervalo de 1 a 50 se entiende que incluye cualquier número, combinación de números o subintervalo del grupo que consiste en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50, así como todos los valores decimales intermedios entre los números enteros anteriormente mencionados, tales como, por ejemplo, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 y 1,9. Con respecto a subintervalos, "subintervalos anidados" que se extienden desde cualquier punto terminal del intervalo se contemplan específicamente. Por ejemplo, un subintervalo anidado de un intervalo a modo de ejemplo de 1 a 50 puede comprender 1 a 10, 1 a 20, 1 a 30, y 1 a 40 en una dirección, o 50 a 40, 50 a 30, 50 a 20 y 50 a 10 en la otra dirección.

Por "reducir" se indica una alteración negativa de al menos 10 %, 25 %, 50 %, 75 % o 100 %.

La identidad de secuencia se mide normalmente usando software de análisis de secuencias (por ejemplo, el paquete de software de análisis de secuencias del Genetics Computer Group, Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, programas BLAST, BESTFIT, GAP o PILEUP/PRETTYBOX). Dicho software hace corresponder secuencias idénticas o similares asignando grados de homología a diversas sustituciones, deleciones y/u otras modificaciones. Las sustituciones conservativas normalmente incluyen sustituciones dentro los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. En un enfoque a modo de ejemplo para determinar el grado de identidad, se puede usar el programa BLAST, con una puntuación de probabilidad entre e"3 y e"100 que indica una secuencia estrechamente relacionada.

Como se usa en el presente documento, los términos "tratan", "tratado", "tratar", "tratamiento" y similares se refieren a reducir o mejorar un trastorno y/o síntomas asociados con el mismo que comprometen a BRB.

Normalmente, una dosis terapéuticamente eficaz debe producir una concentración en suero del compuesto de desde aproximadamente 0,1 ng/ml hasta aproximadamente 50-100 gg/ml.

A menos que se establezca específicamente o sea obvio del contexto, como se usa en el presente documento, se entiende que el término "o" es inclusivo. A menos que se establezca específicamente o sea obvio del contexto, como se usa en el presente documento, se entiende que los términos "un", "una", "el" y "la" son singular o plural.

A menos que se establezca específicamente o sea obvio del contexto, como se usa en el presente documento, se entiende que el término "aproximadamente" está dentro un intervalo de tolerancia normal en la técnica, por ejemplo dentro de 2 desviaciones estándar de la media. Se puede entender que aproximadamente está dentro del 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 % o del 0,01 % del valor establecido. A menos que sea de otro modo evidente del contexto, todos los valores numéricos en el presente documento se proporcionan modificados por el término aproximadamente.

Norrin es una proteína de 133 aminoácidos de longitud que es secretada en el espacio extracelular. Dos dominios primarios definen la estructura de la proteína norrin general: un péptido señal dirige la localización de la molécula; y un motivo de nudo de cisteína proporciona la confirmación terciaria requerida para la unión del receptor frizzled-4 (Meitinger, T, et al., Nat Genet, 1993; 5:376-380; Berger, W, et al, Hum Mol Genet, 1996; 5:51-59). Los truncados y fragmentos de norrin que retienen la capacidad de unirse al receptor frizzled-4 están operativos en el presente documento. En algunas realizaciones inventivas, un truncado o fragmento de norrin retiene el motivo de nudo de cisteína.

La importancia del motivo de nudo de cisteína se resalta por un modelado informático que demuestra el requisito de enlaces disulfuro entre los restos de cisteína en la formación de la confirmación estructural de norrin. Sin embargo, las mutaciones en regiones distintas del motivo de nudo de cisteína producen plegamiento incompleto de las proteínas y dan como resultado la vitreorretinopatía exudativa familiar (FEVR) y vitreorretinopatías relacionadas.

En ciertas realizaciones inventivas, un truncado de extremo N de -24 restos de norrin, con la siguiente secuencia de aminoácidos:

KTD SSF1MDSDPRRCMRHHYVD SISHPL YKC S SKMVLL ARCEGHC SQ

ASRSEPLVSFSTVLKQPFRSSCHCCRPQTSKLKALRLRCSGGMRLTATYRYILSCH

CEECNS (SEQ ID NO. 2) (Acceso N.° Q00604)

Se ha descubierto que algunos fragmentos y truncaciones, tales como SEQ ID NO: 2, tienen solubilidad mejorada en comparación con norrin.

La invención engloba además variantes y equivalentes que son sustancialmente homólogos a norrin y aún retienen la capacidad de unirse selectivamente al receptor frizzled-4. Estos puede contener, por ejemplo, mutaciones de sustitución conservativa, es decir, la sustitución de uno o más aminoácidos por aminoácidos similares. Por ejemplo, sustitución conservativa se refiere a la sustitución de un aminoácido con otro dentro de la misma clase general tal como, por ejemplo, un aminoácido ácido con otro aminoácido ácido, un aminoácido básico con otro aminoácido básico, o un aminoácido neutro por otro aminoácido neutro.

Norrin de la presente invención puede ser norrin recombinante, norrin natural o norrin sintético que retiene propiedades de unión a frizzled-4. Se reconocerá en la técnica que algunas secuencias de aminoácidos de la invención se pueden variar sin efecto significativo de la estructura o función de la proteína. Por lo tanto, la invención incluye además variaciones de norrin que muestran actividad sustancial; dichos mutantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones tipo. Los mutantes norrin operativos en el presente documento incluyen ilustrativamente sustituciones de aminoácidos con respecto a SEQ ID NO: 1 de R64E. El péptido biológicamente activo es un mutante múltiple con respecto a SEQ ID NO: 1: T26A, S28A, S29A; P36A, R37A, R38A; Y120A, R121A, Y122A; o H127A, E129A, E130A; o combinaciones de los mismos. Cualquier aminoácido mutado en una mutación múltiple es operable como una única mutación. Otras mutaciones de secuencia operativas en el presente documento se ilustran en la FIG. 6A de Smallwood, P M, et al, J Biol Chem, 2007: 282:4057-4068 o Ke, J et al. Genes & Dev. 2013: 27: 2305­ 2319. Se aprecia que otras mutaciones en diferentes sitios de aminoácido son similarmente operables. Se aprecia además que la mutación del aminoácido conservado en cualquier sitio particular muta preferentemente a glicina o alanina. Se aprecia además que la mutación a cualquier aminoácido neutramente cargado, cargado, hidrófobo, hidrófilo, sintético, no natural, no humano, u otro aminoácido es similarmente operable.

Las modificaciones y cambios se hacen opcionalmente en la estructura (primaria, secundaria o terciaria) de la proteína Norrin que están englobadas dentro del compuesto inventivo que pueden o pueden no dar como resultado una molécula que tiene características similares a las de los polipéptidos a modo de ejemplo desvelados en el presente documento. Se aprecia que es más probable que los cambios en las bases de aminoácidos conservados afecten la actividad de la proteína resultante. Sin embargo, se aprecia además que cambios en los aminoácidos operables para la interacción de receptores, resistencia o promoción de la degradación de proteínas, tráfico intracelular o extracelular, secreción, interacción proteína-proteína, modificación postraduccional, tal como glucosilación, fosforilación, sulfatación y similares, pueden dar como resultado actividad elevada o reducida de un compuesto inventivo, mientras que se retiene cierta capacidad para alterar o mantener una actividad fisiológica. Se sabe que ciertas sustituciones de aminoácidos por otros aminoácidos en una secuencia ocurren sin pérdida de actividad apreciable.

Al hacer dichos cambios, se considera el índice hidropático de los aminoácidos. Según la presente invención, ciertos aminoácidos se pueden sustituir con otros aminoácidos que tienen un índice hidropático similar y todavía dan como resultado un polipéptido con actividad biológica similar. Cada aminoácido se asigna a un índice hidropático basándose en sus características de hidrofobia y carga. Los índices son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cisteína (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (­ 0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

Sin pretender limitarse a una teoría particular, se cree que el carácter hidropático relativo del aminoácido determina la estructura secundaria del polipéptido resultante, que a su vez define la interacción del polipéptido con otras moléculas. Se conoce en la técnica que un aminoácido se puede sustituir con otro aminoácido que tiene un índice hidropático similar y todavía obtener un polipéptido funcionalmente equivalente. En dichos cambios, la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±,2 se prefiere, aquellos dentro de . ±,1 son particularmente preferidos, y aquellos dentro de . ±,0,5 son incluso más particularmente preferidos.

Como se explica resumidamente anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan, en general, en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácido, por ejemplo, su hidrofobia, hidrofilia, carga, tamaño y similares. Las sustituciones a modo de ejemplo que tienen en consideración diversas de las características anteriores se conocen bien por los expertos en la técnica e incluyen (resto original: sustitución a modo de ejemplo): (Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Gln, His), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gln: Asn), (Glu: Asp), (Gly: Ala), (His: Asn, Gln), (Ile: Leu, Val), (Leu: Ile, Val), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Tip: Tyr), (Tyr: Trp, Phe) y (Val: Ile, Leu).

Norrin y análogos pueden ser modificados adicionalmente para contener restos químicos adicionales que no son normalmente parte de la proteína. Los restos derivatizados pueden mejorar la solubilidad, la semivida biológica, la absorción de la proteína o la afinidad de unión. Los restos también pueden reducir o eliminar efectos secundarios deseables de las proteínas y similares. Una visión general de los restos se puede encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000).

Norrin aislado descrito en el presente documento se puede producir por cualquier método adecuado conocido en la técnica. Dichos métodos varían de métodos de síntesis de proteína directos a construir una secuencia de ADN que codifica secuencias de polipéptidos aisladas y que expresan las secuencias en un hospedador transformado adecuado. En algunas realizaciones, se construye una secuencia de ADN usando tecnología recombinante aislando o sintetizando una secuencia de ADN que codifica una proteína natural de interés. Opcionalmente, la secuencia puede ser mutagenizada por mutagénesis específica de sitio para proporcionar análogos funcionales de los mismos (Zoeller et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81 :5662-5066 (1984) y la patente de EE. UU. N.° 4.588.585).

Según la presente invención, las zonas de oclusión y las zonas adherentes de célula endotelial o epitelial con uniones comprometidas se exponen a una dosis de norrin, un truncado o fragmento del mismo. Después de la exposición a norrin, las células resultantes tienen niveles demostrablemente más altos de claudina-5 y cadherinas de la unión celular. Por lo tanto, la presente invención invierte los efectos de las citocinas que incluyen VEGF sobre las células endoteliales o epiteliales. Por lo tanto, se reduce el edema con uniones de barrera endoteliales o epiteliales retinianas o coroideas comprometidas.

Se observa que el truncado de norrin de SEQ ID NO: 2 es eficaz en aumentar los niveles de unión celular de claudina-5 y cadherinas a concentraciones de 10 a 1000 ng/ml.

La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de norrin sola o en combinación con un vehículo, excipiente o aditivo farmacéuticamente aceptable. Los derivados particularmente favorecidos son aquellos que aumentan la biodisponibilidad de norrin administrado a un mamífero (por ejemplo, permitiendo que norrin sea más fácilmente absorbido en la sangre) o que potencian la administración de norrin a un compartimento biológico (por ejemplo, la retina) con respecto a la proteína nativa.

Para preparar las composiciones farmacéuticas según la presente invención, una cantidad terapéuticamente eficaz de norrin se mezcla íntimamente preferentemente con un vehículo farmacéuticamente aceptable según técnicas farmacéuticas convencionales de incorporación mediante mezclado para producir una dosis. Un vehículo puede adoptar una amplia variedad de formas dependiendo de la forma de la preparación deseada para administración, por ejemplo, oral, tópica o parenteral, que incluye geles, cremas pomadas, lociones y preparaciones implantables de liberación con el tiempo, entre numerosas otras.

Norrin también se administra con un terapéutico auxiliar, tal como un agente anti-VEGF. Un agente anti-VEGF operativo en el presente documento incluye ilustrativamente bevacizumab, moléculas pequeñas de ranibizumab que inhiben las tirosina cinasas estimuladas por VEGF, tales como lapatinib, sunitinib, sorafenib, axitinib, pazopanib, o una combinación de los mismos. También se proporciona un medicamento de un agente anti-VEGF y norrin en un vehículo adecuado. Se encuentra que la terapia de combinación es más eficaz que un agente anti-VEGF convencional. Las inyecciones intraoculares anti-VEGF a modo de ejemplo son eficaces en aproximadamente el 78 % de los sujetos con edema retiniano secundario a diabetes; mientras que una terapia de combinación con norrin aumenta esta eficacia hasta más del 85 %. Sin pretender quedar ligado a teoría particular alguna, la unión anti-VEGF a un receptor de VEGF es inferior a completa debido a factores tales como la cinética, y variación de receptores entre sujetos y como resultado todavía se puede iniciar una cascada inflamatoria con agentes anti-VEGF. Norrin al mejorar las uniones intercelulares compensa dicha actividad de VEGF que ocurre en presencia de agentes anti-VEGF.

Un vehículo en disolución adecuado para inyección es particularmente ventajoso para tratar edema retiniano y degeneración macular húmeda.

Las disoluciones o suspensiones usadas para administración parenteral, intradérmica, subcutánea o tópica pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril, tal como agua para inyectables, solución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminatetraacético; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro sódico o dextrosa.

La administración en forma de una preparación oral líquida usa un vehículo en una forma tal como suspensiones, elixires y disoluciones, se pueden usar vehículos adecuados y aditivos que incluyen agua, glicoles, aceites, alcoholes, aromatizantes, conservantes, agentes colorantes y similares. Para administración por vía oral sólida, se proporcionan preparaciones en una forma tal como polvos, comprimidos, cápsulas, y para preparaciones sólidas tales como supositorios, vehículos adecuados y aditivos que incluyen almidones, vehículos de azúcar, tales como dextrosa, manitol, lactosa y vehículos relacionados, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes o disgregantes. Si se desea, los comprimidos o cápsulas pueden tener un recubrimiento entérico o ser de liberación sostenida por técnicas convencionales. Norrin se proporciona en una dosis sólida, en forma liofilizada o en gotitas de disolución peletizadas.

En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán al compuesto de la rápida eliminación del cuerpo, tales como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulada. Se pueden usar polímeros biocompatibles biodegradables, tales como etilenoacetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Métodos para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica.

Las suspensiones liposómicas también pueden ser vehículos farmacéuticamente aceptables. Éstos se pueden preparar según métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las formulaciones liposómicas se pueden preparar disolviendo lípido(s) apropiado(s) en un disolvente inorgánico que entonces se evapora, dejando atrás una fina película de lípido secado sobre la superficie del recipiente. Entonces se introduce en el recipiente una disolución acuosa del compuesto activo. El recipiente se agita a mano para liberar el material lipídico de las paredes del recipiente y para dispersar los agregados de lípido, formándose así la suspensión liposómica. Otros métodos de preparación bien conocidos por aquellos expertos habituales también se pueden usar en este aspecto de la presente invención.

Las formulaciones adecuadas para administración tópica a la piel se pueden presentar como pomadas, cremas, geles y pastas, que incluyen el componente a administrar en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un sistema de administración tópica preferido es un parche transdérmico que contiene el componente a administrar.

Las formulaciones para administración rectal se pueden presentar como un supositorio con una base adecuada que comprende, por ejemplo, manteca de cacao o un salicilato.

La preparación parenteral se puede encerrar en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiple fabricados de vidrio o plástico. Si se administra por vía intravenosa, los vehículos preferidos incluyen, por ejemplo, solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Para formulaciones parenterales, el vehículo comprenderá normalmente agua estéril o disolución acuosa de cloruro sódico, aunque se pueden incluir otros componentes que incluyen aquellos que ayudan en la dispersión. Por supuesto, donde se va a usar agua estéril y se mantiene como estéril, norrin y los vehículos también se deben esterilizar. También se pueden preparar suspensiones inyectables, en cuyo caso se pueden emplear vehículos líquidos apropiados, agentes de suspensión y similares.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen disoluciones para inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que convierten la formulación en isotónica con la sangre del receptor previsto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y espesantes. Las formulaciones se pueden presentar en dosis unitaria o recipientes multidosis, por ejemplo, ampollas y viales cerrados, y se pueden almacenar en una condición secada por congelación (liofilizada) que solo requiere la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyectables, inmediatamente antes de uso. Las disoluciones o suspensiones para inyección extemporánea se pueden preparar a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos del tipo previamente descrito.

La administración del compuesto activo puede variar de continua (goteo intravenoso) a varias administraciones por vía por día (por ejemplo, Q.I.D.) y puede incluir tópica, parenteral, intramuscular, intravenosa, subcutánea, intracoroidea o transdérmica (que puede incluir un agente de potenciamiento de la penetración).

La aplicación de los terapéuticos objeto puede ser local, de manera que se administren en el sitio de interés. Se pueden usar diversas técnicas para proporcionar la norrin objeto en el sitio de interés, tales como inyección, uso de catéteres, trócares, proyectiles, gel pluronic, prótesis endovasculares, polímeros de liberación sostenida de fármaco u otro dispositivo que proporcione acceso interno. Donde un órgano o tejido sea accesible debido a la extracción del paciente, dicho órgano o tejido puede ser bañado en un medio que contiene norrin objeto, norrin objeto pueden ser pintado sobre el órgano, o se puede aplicar de cualquier forma conveniente.

Norrin se puede administrar a través de un dispositivo adecuado para la liberación controlada y sostenida de una composición eficaz en la obtención de un efecto fisiológico o farmacológico local o sistémico deseado. El método incluye situar el sistema de administración de fármacos de liberación sostenida en un área donde se desee la liberación del agente y permitir que el agente pase a través del dispositivo al área de tratamiento deseada. Más específicamente, norrin se administra a través de un dispositivo intralinfático o intratecal adecuado para implantación directa en un vaso linfático o el cerebro, respectivamente. Se encuentra sorprendentemente que dichos dispositivos de la presente invención proporcionan la liberación controlada sostenida de variado norrin para tratar el ojo sin riesgo de efectos secundarios locales y sistémicos perjudiciales. Véase, por ejemplo, las patentes de EE. UU. 5.378.475; 5.773.019; 6.001.386; 6.217.895; 6.375.972 y 6.756.058.

Otros métodos de administración de norrin incluyen: inyectar el sistema o implantar quirúrgicamente el sistema, un sistema de administración de fármacos de liberación sostenida y un método para proporcionar la administración controlada y sostenida de norrin en un sistémico local o fisiológico deseado o efecto farmacológico que comprende implantar quirúrgicamente un sistema de administración de fármacos de liberación sostenida en una localización deseada.

Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: un sistema de administración de fármacos de liberación sostenida que comprende un depósito interno que contiene norrin, un tubo interno impermeable al paso del agente, teniendo el tubo interno el primer y segundo extremos y cubriendo al menos una porción del depósito interno, siendo el tubo interno de un tamaño y estando formado de un material de manera que el tubo interno sea capaz de soportar su propio peso, un miembro impermeable situado en el primer extremo del tubo interno, previniendo el miembro impermeable el paso del agente del depósito a través del primer extremo del tubo interno, y un miembro permeable situado en el segundo extremo del tubo interno, permitiendo el miembro permeable la difusión del agente del depósito a través del segundo extremo del tubo interno. Un método de administración de norrin a un segmento de porción del cerebro incluye implantar un dispositivo de liberación sostenida para administrar norrin a la región del cerebro, o un dispositivo implantable de liberación sostenida para administrar un compuesto de la invención a una porción del cerebro; un dispositivo de administración de fármaco de liberación sostenida incluye a) un núcleo de fármaco que contiene norrin; b) al menos una copa unitaria esencialmente impermeable al paso del agente que rodea y define un compartimento interno para aceptar el núcleo del fármaco, incluyendo la copa unitaria un extremo superior abierto con al menos una acanaladura empotrada alrededor de al menos alguna porción del extremo superior abierto de la copa unitaria; c) un tapón permeable que es permeable al paso de norrin, el tapón permeable está situado en la parte superior abierta de la copa unitaria en donde la acanaladura interactúa con el tapón permeable que lo contiene en posición y que cierra el extremo superior abierto, permitiendo el tapón permeable el paso del agente fuera del núcleo del fármaco, a través del tapón permeable y fuera del extremo superior abierto de la copa unitaria. Un dispositivo de administración de norrin de liberación sostenida incluye un núcleo interno de norrin que tiene una solubilidad deseada y una capa de recubrimiento de polímero, siendo la capa de polímero permeable a norrin, en donde la capa de recubrimiento de polímero cubre completamente el núcleo interno. Se aprecia que la liberación sostenida es muy apta para retardar la metástasis en una variedad de cánceres que incluyen colorrectal y linfático.

Norrin se puede administrar como microesferas. Por ejemplo, norrin se puede comprar de R&D Systems, Minneapolis, Minn., o clonado, expresado y purificado se carga en microesferas biodegradables sustancialmente como se describe por Jiang, C, et al, Mol. Vis., 2007; 13:1783-92 usando la técnica de emulsificación espontánea de Fu, K, et al, J. Pharm. Sci., 2003; 92:1582-91. Las microesferas se sintetizan y se cargan disolviendo 200 mg de 50:50 de poli(lactidaco-ácido glicólico) (PLGA) en 5 ml de una relación en volumen 4:1 de trifluoroetanol:diclorometano complementado con 8 mg de hidróxido de magnesio para minimizar la agregación de proteínas durante la encapsulación. Se pueden reconstituir 10 pg de norrin en 300 pl de 7 mg de albúmina de suero bovino (BSA) y 100 mg de docusato sódico (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.) disuelto en 3 ml de PBS. La disolución se puede mezclar en vórtex y verter en 200 ml de 1 % (p/v) de poli(alcohol vinílico) (PVA, 88 % hidrolizado) con agitación suave. Las microesferas pueden ser endurecidas agitando durante tres horas, se recogen por centrifugación y se lavan tres veces para retirar el PVA residual. Si las microesferas no deben ser inmediatamente inyectadas, se congelan rápidamente en nitrógeno líquido, se liofilizan durante 72 h y se almacenan en un desecador a -20 °C. Las microesferas que contienen norrin presentan diámetros promedio de 8 pm como se ha determinado por un tamaño de partículas. Norrin también se puede administrar por inyección intravítrea. Por ejemplo, norrin en disolución, se puede envasar en microesferas como se ha descrito anteriormente, o expresar en células, o en forma purificada en disolución se puede exponer al cerebro o sistema linfático por inyección intratecal o intralinfática. Dicha inyección se puede realizar bajo anestesia general usando un microscopio quirúrgico (Moller-Wedel GmbH, Wedel, Alemania) usando microagujas de vidrio biseladas con un diámetro externo de aproximadamente 100 pm. Las suspensiones de microesferas se preparan en PBS a 2 y 10 % (p/v) y se mezclan en vórtex brevemente inmediatamente antes de la inyección para garantizar una dispersión uniforme. Se puede usar una aguja hipodérmica de 30 de calibre para perforar los tejidos intermedios. Se inyectan opcionalmente cinco microlitros de muestra de prueba por este conducto en el espacio luminal usando una jeringa de Hamilton de 50 pl (Hamilton Co, Reno, Nev.). Para garantizar la administración adecuada y prevenir el choque, la aguja se mantiene en su lugar durante un minuto después de que se complete la inyección y posteriormente se saca lentamente. Además, se puede realizar simultáneamente paracentesis para aliviar la presión y así prevenir el reflujo.

También se puede administrar norrin por administración por un sistema de administración de liberación controlada. Un sistema de administración de liberación controlada implantable se describe en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. 2005/0281861 y se envasa en dicho sistema a 100 pg por cápsula formulada final. Por ejemplo, se puede implantar un sistema de administración de fármacos que contiene norrin usando pinzas o un trocar después de hacer una incisión de 2-3 mm en la esclerótica. La retirada del dispositivo después de la colocación del sistema puede dar como resultado una abertura autosellante. Un ejemplo de un dispositivo que se usa para insertar los implantes se desvela en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° 2004/0054374. La localización del sistema puede influir en los gradientes de concentración del componente terapéutico o fármaco que rodea al elemento, y así influye en las tasas de liberación (por ejemplo, un elemento situado más cerca del borde del vítreo puede dar como resultado una tasa de liberación más lenta).

Las formulaciones de dosis unitaria preferidas son las que contienen una dosis o unidad diaria, subdosis diaria, como se ha citado antes en este documento, o una fracción apropiada de las mismas, del componente administrado.

La pauta posológica para norrin de la invención se basa en una variedad de factores, que incluyen el grado de fuga en el BBB, o BIB, la vía de administración, el volumen de inflamación abluminal y el norrin particular empleado. Por lo tanto, la pauta posológica puede variar ampliamente, pero se puede determinar rutinariamente usando métodos convencionales.

En ciertas realizaciones, norrin se administra una vez al día; en otras realizaciones, norrin se administra dos veces al día; en aún otras realizaciones, norrin se administra una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez cada cuatro días, una vez cada cinco días, una vez cada seis días, una vez cada siete días, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada dos meses, una vez cada seis meses, o una vez al año. El intervalo de dosis se puede ajustar según las necesidades de pacientes individuales. Para intervalos de administración más largos, se pueden usar formulaciones de liberación prolongada o de liberación lenta.

Los vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen ilustrativamente solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, tampón acuoso isotónico estéril y combinaciones de los mismos.

Las composiciones parentales de liberación controlada pueden estar en forma de suspensiones acuosas, microesferas, microcápsulas, microesferas magnéticas, disoluciones de aceite, suspensiones de aceite, emulsiones, o el principio activo se puede incorporar en vehículo(s) biocompatible(s), liposomas, nanopartículas, implantes o dispositivos de infusión.

Los materiales para su uso en la preparación de microesferas y/o microcápsulas incluyen polímeros biodegradables/bioerosionables, tales como PLGA, poliglactina, poli-(cianoacrilato de isobutilo), poli(2-hidroxietil-L-glutamina) y poli(ácido láctico).

Los vehículos biocompatibles que se pueden usar cuando se formula una formulación parenteral de liberación controlada incluyen hidratos de carbono, tales como dextranos, proteínas tales como albúmina, lipoproteínas o anticuerpos.

Los materiales para su uso en implantes pueden ser no biodegradables, por ejemplo, polidimetilsiloxano, o biodegradables, tales como, por ejemplo, poli(caprolactona), poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) o poli(ortoésteres).

Los ejemplos de conservantes incluyen, pero no se limitan a, parabenos, tales como p-hidroxibenzoato de metilo o propilo y cloruro de benzalconio.

Las formas de liberación prolongada inyectables se preparan formando matrices microencapsuladas de compuesto(s) de la invención en polímeros biodegradables, tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la relación entre el compuesto y el polímero, y la naturaleza del polímero particular empleado, la tasa de liberación del compuesto se puede controlar. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de liberación prolongada también se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido del cuerpo.

Cualquiera de las composiciones de liberación controlada, liberación prolongada y de liberación sostenida anteriormente descritas se puede formular para liberar el principio activo en aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 1 semana, en aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 72 horas, en aproximadamente 30 minutos a 24 horas, en aproximadamente 30 minutos a 12 horas, en aproximadamente 30 minutos a 6 horas, en aproximadamente 30 minutos a 4 horas, y en aproximadamente 3 horas a 10 horas. En realizaciones, una concentración eficaz del (de los) principio(s) activo(s) se mantiene en un sujeto durante 4 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, o más después de la administración de las composiciones farmacéuticas al sujeto.

Cuando norrin se administra como un fármaco a seres humanos o animales, norrin puede ser administrado en sí mismo o como una composición farmacéutica que contiene principio activo en combinación con un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Los actuales niveles de dosis y evolución temporal de la administración de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden variar para obtener una cantidad de principio activo que es eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, composición y modo de administración, sin ser tóxico para el paciente. En general, norrin se administra en una cantidad suficiente para reducir o eliminar los síntomas asociados a edema o para inhibir la metástasis en cánceres.

Los intervalos de dosis a modo de ejemplo incluyen 0,00001 mg a 250 mg por día, 0,0001 mg a 100 mg por día, 1 mg a 100 mg por día, 10 mg a 100 mg por día, 1 mg a 10 mg por día y 0,01 mg a 10 mg por día. Una dosis preferida de un agente es la máxima que un paciente puede tolerar y no desarrollar efectos secundarios graves o inaceptables. En ciertas realizaciones inventivas, la dosis terapéuticamente eficaz produce una concentración de norrin de desde aproximadamente 0,1 ng/ml hasta aproximadamente 50-100 pg/ml.

La determinación de una cantidad eficaz está perfectamente dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente en vista de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento. En general, una cantidad eficaz o efectiva de norrin se determina administrando primero una baja dosis del (de los) agente(s) y luego aumentando gradualmente la dosis administrada o dosificaciones hasta que se observa un efecto deseado (por ejemplo, reducir o eliminar síntomas asociados a edema retiniano) en el sujeto tratado, con efectos secundarios tóxicos mínimos o aceptables. Los métodos aplicables de determinación de una dosis apropiada y programa de administración para la administración de una composición farmacéutica de la presente invención se describen, por ejemplo, en Goodman y Oilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman et al., eds., 11a edición, McGraw-Hill 2005, y Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a y 21 a ediciones, Gennaro y Universidad de Ciencias en Filadelfia, Eds., Lippencott Williams & Wilkins (2003 y 2005).

Lo siguiente son ejemplos in vitro e in vivo de cómo norrin puede vencer la reducción de células endoteliales de moléculas de adhesión célula a célula y volver a estabilizar los vasos que son para fines de ilustración, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención. Ensayos in vitro

Ejemplo 1: Inmunotinción de VE-cadherina en células - exposición a VEGF

Se cultivaron células endoteliales microvasculares retinianas humanas (HRMEC) en DMEM complementado con 10 % (v/v) de FBS inactivado por calor (Nichirei Biosciences Inc., Tokyo, Japón), 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina (Life Technologies Gibco, Francia). Los cultivos celulares se incubaron sobre placas de cultivo de tejido recubiertas con colágeno Transwell® (Corning, New York, NY) en una atmósfera humidificada de 5 % de CO2 a 37 °C.

Se cultivaron HRMEC durante 14 a 21 d en una placa para cámaras Lab-Tek (Corning). Se administró H2O2 (500 pmol/l) al lado basolateral de Transwell®. A algunas placas no se añadió nada (control), o se añadió VEGF (100 ng/ml) o truncado de norrin (SEQ ID NO: 2) (250 ng/ml) o tanto VEGF como norrin (100 ng/ml y 250 ng/ml, respectivamente) al medio apical 30 min antes del tratamiento con H2O2. Después de 6 h de incubación, las células se lavaron dos veces con PBS frío y se fijaron con acetona fría (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japón) durante 10 min. Entonces se retiraron las células del Transwell® y se montaron sobre portaobjetos. A continuación, las células se incubaron con anti-VE-cadherina humana de ratón a 4 °C durante la noche. Después de lavar con PBS, las células se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con colorante específico para anticuerpo anti-VE-cadherina humana, luego se lavaron posteriormente en PBS. Se examinó la inmunofluorescencia y se obtuvieron imágenes usando microscopía de fluorescencia.

En condiciones de control, la claudina-5 se localiza en límites célula-célula de estas células como se muestra en el panel superior izquierdo de la FIG. 3. Después de la adición de VEGF (panel superior derecho, FIG. 3) se puede observar una reducción en las moléculas de adhesión célula-célula, así como una pérdida en la morfología de adoquín. Sin embargo, con la combinación de VEGF y norrin (panel inferior derecho, FIG. 3), se restauraron las proteínas de unión y la morfología. Se observa el efecto de norrin solo (panel inferior izquierdo, FIG. 3).

Ejemplo 2: Inmunotinción de claudina-5 en células - exposición a VEGF

Se repitió el proceso del Ejemplo 1 con anticuerpo anti-claudina-5 humana de ratón a 4 °C durante la noche en lugar de anti-VE-cadherina humana. Después de lavar con PBS, las células se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con colorante específico para el anticuerpo anti-claudina 5 humana, luego se lavaron posteriormente en PBS antes de obtenerse imágenes usando microscopía de fluorescencia.

En condiciones de control, la claudina-5 se localiza en límites célula-célula de estas células como se muestra en el panel superior izquierdo de la FIG. 4. Después de la adición de VEGF (panel superior derecho, FIG. 4) se puede observar una reducción en las moléculas de adhesión célula-célula, así como una pérdida en la morfología de adoquín. Sin embargo, con la combinación de VEGF y norrin (panel inferior derecho, FIG. 4), se restauraron las proteínas de unión y la morfología. Se observa el efecto de norrin solo (panel inferior izquierdo, FIG. 4).

Ejemplo 3: Expresión de ARNm de claudina-5 en células - exposición a VEGF

El proceso del Ejemplo 4 se repite con la sustitución de TGF-beta con VEGF como agente de exposición. La cantidad de ARNm de claudina-5 detectada se muestra en la FIG. 5 normalizada al control de solo medio. Se observa que norrin aumenta los niveles de expresión de claudina-5 más allá de los del control de medio.

Ejemplo 4: Ensayos in vivo de fuga de vasos y tinción de claudina-5 en ratones OIR

El modelo de ratón de retinopatía inducida por oxígeno (OIR) se usa para crear retina isquémica, por lo que se pueden evaluar los cambios en la morfología y función vascular. La cría de ratones en un alto entorno de oxígeno crea áreas de retina avascular. Una vez se devolvieron a un entorno de oxígeno normal, los vasos se volvieron permeables y crecieron en un modo sin regular. La cantidad de fuga se puede visualizar inyectando por vía sistémica un colorante fluorescente (azul de Evans o fluoresceína) y luego viendo la retina bajo un microscopio. En ratones OIR, el colorante azul de Evans se puede observar fugando de los vasos retinianos y la claudina-5 se altera (panel izquierdo de la FIG.

6). Sin embargo, en ojos de OIR inyectados con norrin después de la inducción de OIR de retina avascular, el colorante azul de Evans está confinado a los vasos (panel derecho de la FIG. 6). Las imágenes se tomaron 4 días después de la inyección de norrin en el ojo derecho.

Ejemplo 5: Inmunotinción de VE-cadherina en células vasculares - exposición a VEGF

El procedimiento del Ejemplo 1 se repite con un cultivo de células endoteliales microvasculares humanas, dermis adulta (HMVECad) en lugar de HRMEC. Se obtienen resultados similares a los del Ejemplo 1, lo que demuestra la eficacia de norrin para restaurar proteínas de unión y morfología normal.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Sustancia basada en norrin para su uso en un método de tratamiento de edema retiniano en una retina de un sujeto humano o animal reforzando las uniones intercelulares en células endoteliales o epiteliales in vivo por medio de administración de una cantidad eficaz de la sustancia basada en norrin por inyección o colirios o gotitas de disolución peletizada a un ojo que contiene las células endoteliales o epiteliales, para regular por incremento selectivamente una expresión génica de cadherina y claudina-5 en las células endoteliales o epiteliales y para reforzar las uniones intercelulares del tejido para la prevención de la fuga vascular o para la reparación de la fuga vascular para tratar el edema en la retina, en donde la sustancia basada en norrin comprende una cantidad eficaz de

• un truncado de norrin del extremo N que tiene una escisión de extremo N del polipéptido con respecto a una proteína norrin nativa de hasta 40 restos de aminoácidos que retiene un motivo de nudo de cisteína de norrin nativa, en donde el polipéptido consiste en SEQ ID NO. 2, o de

• un mutante de norrin que tiene al menos aproximadamente 85 % de identidad de aminoácidos con SEQ ID NO.

1 y que incluye sustituciones de aminoácidos con respecto a SEQ ID NO: 1 de R64E, T26A, S28A, S29A; P36A, R37A, R38A; o H127A, E129A, E130A; o combinaciones de los mismos,

cada uno capaz de unirse a receptor frizzled-4 de una célula endotelial o epitelial, conteniendo dicho truncado de norrin de extremo N o mutante de norrin restos químicos adicionales que no son normalmente parte de la molécula de norrin.

2. La sustancia basada en norrin para su uso según la reivindicación 1, en donde las células endoteliales o epiteliales se seleccionan de entre:

• células endoteliales que definen una membrana vascular;

• células endoteliales microvasculares retinianas humanas (HRMEC).

3. La sustancia basada en norrin para su uso según la reivindicación 1 o 2, en donde el método de tratamiento de edema de fuga de membrana comprende tratar edema de la vasculatura retiniana.

4. La sustancia basada en norrin para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el método de tratamiento de edema de fuga de membrana comprende exponer las células endoteliales o epiteliales a la sustancia basada con norrin por administración por inyección.

5. La sustancia basada en norrin para su uso según la reivindicación 4, en donde el método de tratamiento de edema de fuga de membrana comprende diagnosticar edema asociado a la fuga de líquidos de una unión celular comprometida en las células endoteliales o epiteliales antes de la etapa de exposición.

6. La sustancia basada en norrin para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el sujeto es humano o es un animal seleccionado de uno de: vaca, caballo, oveja, cerdo, cabra, pollo, gato, perro, ratón, cobaya, hámster, conejo, rata, o una célula derivada de uno de los anteriormente mencionados.

7. La sustancia basada en norrin para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 6, en donde el truncado de norrin de extremo N incluye un fragmento de SEQ ID NO. 1 que se une al receptor frizzled-4 de las células de vasos retinianos.

8. La sustancia basada en norrin para su uso según la reivindicación precedente 1 a 7, en donde el truncado de norrin o mutante es recombinante.