DE10201732A1

DE10201732A1 - Präperation von Immunogenen und Impfstoffen auf der Grundlage von RNA

Info

Publication number: DE10201732A1
Application number: DE10201732A
Authority: DE
Inventors: Steve Cyril Pascolo; Ingmar Hoerr; Hans-Georg Rammensee; Florian Von Der Muelbe; Marie-Louise Michel; Hueseyin Firat; Francois Albert Lemonnier
Original assignee: Curevac AG
Current assignee: Curevac SE; Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Genethon
Priority date: 2002-01-18
Filing date: 2002-01-18
Publication date: 2003-07-31

Abstract

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Impfung oder das der Immunstimulierung durch Verwendung von Nukleinsäuren, speziell von RNA, die für ein oder mehrere Antigene pathogener Mikroorganismen codieren.

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Impfung oder das der Immunstimulierung durch Verwendung von Nucleinsäuren, speziell von RNA, die für ein oder mehrere Antigene pathogener Mikroorganismen codieren.
Nucleinsäuren sind neue Werkzeuge und von wachsender Bedeutung für die prophylaktische Impfung und für die Therapie gegen Infektionskrankheiten oder bösartige Krankheiten im Zusammenhang mit Krebs.

Typischerweise sind Impfstoffe auf DNA-Basis Bakterienplasmide, welche die Gene für Tumor-Antigene oder Pathogene tragen, welche nach der Injektion in den Wirtsorganismus transkribiert werden. Diese Transkription wird im allgemeinen durch Verwendung starker Promotoren ausgeführt, besonders durch virale Promotoren (Liu, Fu et al. 1998). Dieser Impftyp bietet eine Alternative gegenüber den traditionellen Immunisierungsmethoden in vivo durch die Verringerung der Menge an lebenden Viren und der damit verbundenen Risiken (Mandl, Aberle et al. 1998), ebenso wie gegenüber der Immunisierung mit Peptiden, deren Wirksamkeit durch die genetische Vielfalt der Populationen begrenzt sein kann (Deres, Schild et al. 1989).

Da die RNA für die Hydrolyse durch ubiquitäre Ribonucleasen sehr anfällig ist, haben sich die bisherigen Impfversuche auf der Basis von Nucleinsäuren auf die Verwendung von DNA konzentriert. Der Einsatz von RNA bietet auf jeden Fall Vorteile gegenüber der Verwendung von DNA, insbesondere auf dem Gebiet der Sicherheit. Der Einsatz von RNA erfordert in vivo keine Promotoren, die von Viren abstammen, und es stellt kein Risiko der Integration in das Genom dar. Im Gegensatz dazu steht die DNA deren Einsatz eine Integration in das Genom nach sich ziehen kann. Das kann zufällig oder auch als Folgeereignis einer homologen Rekombination auftreten. Dies wiederum kann zur Inaktivierung von zellulären Genen führen, aber auch zu einer Deregulierung auf dem Niveau ihrer Expression. Schlimmstenfalls kann diese Integration der Ursprung eines Tumors sein. Eine weitere Risikoquelle bei der Impfung unter Verwendung von DNA ist die Induktion von anti-DNA-Antikörpern, die als mögliche Pathogene wirken können, vor allem im Fall von Autoimmunkrankheiten wie beispielsweise bei Lupus erythematodes. Die Verabreichung von BNA, insbesondere von messenger RNA (mRNA), zur Immunisierung ist also im Vergleich zu DNA a priori ein viel sicherer Ansatz (Lu, Benjamin et al. 1994).

Vorläufige Ergebnisse unter Verwendung von β-Galaktosidase als Modellantigen zum Zweck der Untersuchung des Nutzens von RNA bei der anti-tumoralen Impfung haben gezeigt, daß die Injektion von RNA zu einer spezifischen Immunantwort führt (Hoerr, Obst et al. 2000).

Die Erfinder haben nunmehr die Hypothese aufgestellt, dass die Injektion von RNA Molekülen sehr wirksam zu einer spezifischen Immunantwort auf diese Antigene führen kann. Diese Hypothese wird von Experimenten gestützt, die mit RNA Molekülen durchgeführt wurden, die für die zu Impf und therapeutischen Zwecken passenden Antigene codieren. Diese Ergebnisse, die im nachfolgenden experimentellen Teil dargestellt sind, öffnen folglich den Weg zu neuen Perspektiven für eine sicherere Impfung, deren Wirksamkeit unabhängig vom genetischen Material ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft zum einen eine immunogene Zusammensetzung bzw. Präparation, die reife messenger RNA enthält, die für mindestens ein Antigen eines pathogenen Agens codiert.

Vorzugsweise ist die reife messenger RNA nicht replikativ.

Unter "reife messenger RNA" versteht man hier jedes RNA-Molekül, das eine codierende Sequenz enthält, welche gecapped ist und über einen poly A-Schwanz verfügt. Die codierende Sequenz kann sowohl für ein Antigen, welches ein Protein oder ein natürliches Peptid enthält wie gleichermaßen für ein Molekül codieren, welches mindestens ein Antigen enthält, das nicht natürlicherweise vorkommt, wie beispielsweise ein Polyepitop, das aus einer Aufeinanderfolge von Peptiden besteht, die im natürlichen Zustand auf ein oder mehrere Proteine verteilt sind.

Im Rahmen dieser Definition können die Ribonucleotide, die die reife messenger RNA bilden, natürliche oder modifizierte Ribonucleotide sein, insbesondere, um erhöhte Resistenz gegenüber RNasen einzuführen. Verschiedene Beispiele für Modifikationen sind im folgenden dargestellt. Als Beispiele für Ribonucleosid- Analoga, welche zum Synthetisieren der in den Zusammensetzungen dieser Erfindung enthaltenen RNA-Moleküle verwendet werden können, kann man die Diastereoisomere Sp der Ribonucleosid-5'-O-(1-thiotriphosphate) anführen (Tohda, Chikazumi et al. 1994).

Die reife messenger RNA der Erfindung liegt wenn es sich um ein sogenanntes natürliches Molekül handelt in isolierter oder gereinigter Form im Vergleich zu seinem natürlichen Zellumfeld oder zu den ihn produzierenden Organismus vor. Unter einem natürlichen Molekül versteht man bei einer reifen messenger RNA, dass sie in ihrer Struktur identisch ist in Bezug auf eine in einer Zelle oder von einem Organismus, insbesondere einem pathogenen Organismus, produzierten Sequenz. Wie weiter oben und wie in den folgenden Beispielen in Betracht gezogen, kann die reife messenger RNA gemäß der Erfindung auch eine modifizierte Sequenz, verglichen mit einer Zelle natürlich produzierten Sequenz, aufweisen. Es kann sich auch um eine rekombinante Sequenz handeln.

Daher können die Sequenzen und insbesondere die funktionellen Domänen (hauptsächlich die codierenden Regionen, das Cap und der Poly A-Schwanz) von verschiedenen Abschnitten der reifen messenger RNA stammen. Sie können jedoch insbesondere auch aus verschiedenen DNA-Sequenzen hervorgehen und/oder von verschiedenen Organismen stammen. In dieser Ausführungsform werden sie als "heterolog" bezeichnet.

Die reifen messenger RNAs in den Zusammensetzungen der Erfindung können durch in vivo Transkription oder in vitro Transkription, ausgehend von einem DNA Molekül erhalten werden, wie es nachfolgend beispielsweise im Protokoll des experimentellen Teils beschrieben wird.

Sie können jedoch auch durch jede andere geeignete Methode hergestellt werden.

In der Gesamtheit dieses Textes bezeichnet der Ausdruck "pathogenes Agens" die pathogenen Mikroorganismen oder ihre Bestandteile wie ihre Toxine, von denen man weiß oder vermutet, dass sie in die Krankheitsentwicklung bei Mensch und Tier eingreifen; einschließlich der Viren wie auch die Retroviren, beispielsweise die HIV-Retroviren oder die Viren für Hepatitis A,B oder C, das Ebola Virus, das Westnile-Virus; die Bakterien und Parasiten wie Plasmodium, aber auch die unkonventionellen Agentien wie beispielsweise die Prionen.

In einer besonderen Ausführungsform besteht die reife messenger RNA aus einer codierenden Sequenz, die gecapped ist und über einen Poly A-Schwanz verfügt.

Die Erfindung betrifft insbesondere eine immunogene Zusammensetzung, welche die oben genannte RNA in einer Form umfasst, die kompatibel zu einem Wirt ist, insbesondere einem Patienten, bei dem ein Schutz gegen ein pathogenes Agens ermittelt wurde, wobei dieser Schutz zum Beispiel eine Prävention in Form einer Impfung oder eine prophylaktische oder kurative Behandlung nach einer Kontamination durch das pathogene Agens einschließen kann. Diese Kontamination erlaubt es, die BNA zu bestimmen, die in der immunogenen Zusammensetzung verwendet werden soll.

Unter dem Ausdruck "Schutz gegen ein pathogenes Agens" versteht man gleichermaßen den Schutz gegenüber einem Pathogen wie auch seinen direkten oder indirekten Auswirkungen bei dem durch das Agens infizierten Wirt.

Der Begriff "Prophylaxe" bezeichnet hier die vorbeugende Impfung bzw. Vakzinierung, während sich die Begriffe "Behandlung" und "Verbesserung" auf einen Eingriff nach einer Infektion beziehen. Man spricht von "Behandlung", wenn der Einsatz eines Präparats der Erfindung die Auslöschung (clearance) des infektiösen Agens im Patienten und dessen Heilung bewirkt. Im anderen Fall, wenn die Stimulierung der Immunantwort durch ein immunogenes Präparat gemäß der Erfindung nicht die vollständige Heilung des Patienten erlaubt, spricht man nur von einer Verbesserung seines klinischen Zustands.

Der Ausdruck immunogene Zusammensetzung schließt notwendigerweise implizit charakteristische Techniken ein. Andernfalls würde dieser Ausdruck nicht die Abgrenzung zum Stand der Technik, der durch eine mRNA dargestellt wird, erlauben. Die in Rede stehenden charakteristischen Techniken sollten im Text angegeben werden, andernfalls riskieren wir außerdem ein Problem der ausreichenden Beschreibung oder der mangelnden Charakterisierung. Unter diesem Gesichtspunkt werden die Erfinder dankend darum gebeten, die technischen Einzelheiten anzugeben, welche es erlauben, die reife mRNA einem Menschen zu verabreichen.

Das immunogene Präparat gemäß der Erfindung ist vorteilhafterweise ein rezeptiertes Präparat um eine therapeutischen Anwendung zu schaffen. Dieser Ausdruck umfasst die Behandlung sofort nach der Infektion durch ein pathogenes Agens oder die Prävention einer Krankheit.

In einer bevorzugten Ausführungsform der immunogenen Zusammensetzung der Erfindung enthält die Sequenz der messenge RNA unter anderem stabilisierende Sequenzen, die fähig sind, die Halbwertszeit der RNA im Cytosol zu erhöhen.

Diese "stabilisierenden Sequenzen" können aus irgendeiner RNA stammen, die für ihre Stabilität bekannt ist. Sie können auch teilweise oder ganz synthetischer Art sein. Als Beispiel für stabilisierende Sequenzen, die in der Erfindung verwendbar sind, kann man die transkribierten aber nicht translatierten Sequenzen (UTR) des Gens für β-Globin (human oder andere) nennen; oder die Consensussequenz der allgemeinen Formel (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC, die in der 3'UTR der sehr stabilen RNA enthalten ist, die für das α-Globin, das α-(I)-Kollagen, die 15-Lipoxygenase oder für die Tyrosin-Hydroxylase codiert (Holcik und Liebhaber 1997). N bezeichnet dabei ein beliebiges Nucleotid, Py steht für ein Pyrimidin (T, U oder C) und x zeigt an, dass ein Nucleotid ein oder mehrere Male wiederholt vorkommt (Nx bedeutet dass ein beliebiges Nucleotid N x-mal auftritt) (Holcik und Liebhaber 1997). Eine Kombination dieser Sequenzen oder ihre Assoziation mit anderen Sequenzen wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.

Das immunogene Präparat wie weiter oben definiert, und das wenigstens eine Sequenz zur Stabilisierung enthält, die unter den transkribierten und nicht translatierten Sequenzen (UTR) des Gens für β-Globin und der Consensus- Sequenz (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC, enthalten in der 3'UTR der für α-Globin, α-(I)-Kollagen, 15-Lipoxygenase und die Tyrosin-Hydroxylase codierenden RNA ausgewählt wird, ist gleichermaßen Bestandteil der Erfindung.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des immunogenen Präparats gemäß der Erfindung besitzt die messenger RNA an ihrem 3'-Ende einen Poly A- Schwanz mit mehr als 30 Adeninresten in der 3'-Position. Vorzugsweise besitzt die messenger RNA unterhalb (d. h. in 3') der genannten 30 Adeninreste keinen Cytosinrest.

Die immunogenen Präparate, wie sie weiter oben beschrieben sind, und deren messenger RNA in Anwesenheit von modifizierten Ribonucleosiden synthetisiert wurde, um die Resistenz gegenüber BNasen zu verbessern, sind integrierter Bestandteil der Erfindung. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Präparate besitzt die messenger RNA Phosphorthioate.

Im Gegensatz zu den weiter oben genannten Stabilisierungssequenzen gibt es in einigen Genen Sequenzen, die die RNA allgemein destabilisieren. Das ist beispielsweise der Fall bei AU-reichen Sequenzen, die AURES genannt werden und die man in den 3'UTR Abschnitten zahlreiche instabiler mRNA findet (Caput, Beutler et al, 1986). Die zur Herstellung der in den Präparaten der Erfindung vorkommenden RNA-Moleküle verwendeten Sequenzen müssen also, wenn sie hinsichtlich ihrer Wirksamkeit vorteilhaft sein sollen, derart verändert sein, dass sie keine dieser destabilisierenden Sequenzen mehr enthalten. Gleiches gilt für die Stellen, die von möglichen Endonucleasen erkannt werden, wie beispielsweise die Sequenz GAACAAG, die im 3'UTR Segment des Gens enthalten ist, das für den Transferin-Rezeptor codiert (Binder, Horowitz et al, 1994). Diese Stellen können aus der RNA, wie sie in der Erfindung verwendet wird, eliminiert werden.

Ein immunogenes Präparat, wie oben beschrieben, und dessen mRNA im wesentlichen frei von destabilisierenden Sequenzen vom AURES-Typ ist, gehört gleichermaßen zum Umfang der vorliegenden Erfindung. Eine solche bevorzugte messenger RNA ist auch frei von Sequenzen vom Typ GAACAAG, die von Endonucleasen erkannt werden.

Außerdem ist es möglich, ausgehend von der RNA, wie sie in den Präparaten der Erfindung vorkommt, die Initiation und die Elongation der Translation zu verbessern, beispielsweise durch Mutation von Codons, die seltenen tRNAs entsprechen, indem sie durch solche Codons, die bei Säugern häufig vorkommenden tRNAs entsprechen, ersetzt werden. Möglich ist dies auch durch Hinzufligen von Sequenzen wie beispielsweise der 5'UTR-Sequenz des Gens, das für HSP 60 codiert, welchelches die Tration der RNA erhöht (Vivinus, Baulande et al. 2001). Ziel dieser Modifikationen ist es, eine mit interessierenden Proteinen angereicherte Produktion bereitzustellen, was die Wirksamkeit der Immunisierung erhöhen würde.

Die Erfindung erstreckt sich also auch auf ein wie oben beschriebenes immunogenes Präparat, dessen messenger RNA unter anderem eine Sequenz enthält, die der Erhöhung der Translationsrate dient.

Ein anderer Gegenstand der vorgestellten Erfindung ist ein wie oben beschriebenes immunogenes Präparat, das unter anderem wenigstens einen RNA- stabilisierenden Faktor enthält, insbesondere einen RNase-Inhibitor. Ein solcher Inhibitor kann beispielsweise unter den natürlich vorkommenden RNase- Inhibitoren ausgewählt werden, beispielsweise Rnasin® (Promega), das ein ubiquitäres Protein mit 460 Aminosäureresten ist und von dem es eine für Tiere injizierbare Form gibt (Animal Injectable grade Recombinant Rnasin®, Promega).

Es ist außerdem möglich, die RNA der immunogenen Präparate der Erfindung zu schützen, indem man sie mit kationischen Verbindungen, vorzugsweise polykationischen Verbindungen komplexiert, beispielsweise durch ein Peptid oder ein kationisches oder polykationisches Protein.

In einer bevorzugten Ausführungsform der immunogenen Präparate, wie sie im vorhergehenden Absatz beschrieben wurden, ist das die RNA komplexierende Peptid oder Protein ein Protamin, ein Poly-L-Lysin, ein Poly-L-Arginin oder ein Histon.

Des Weiteren ist es möglich, die Immunogenizität der Präparate der Erfindung zu erhöhen, indem man ein Adjuvans oder mehrere Adjuvantien hinzufügt.

Man bezeichnet hier mit Adjuvans jede chemische oder biologische Verbindung, die eine spezifische Immunantwort begünstigt. Diese Immunantwort ist gegen ein oder mehrere der von den RNA-Molekülen der Präparate der Erfindung codierten Antigene gerichtet. In Abhängigkeit der verschiedenen Typen an Adjuvantien können verschiedene Mechanismen in Betracht gezogen werden. Beispielsweise bilden die Verbindungen, die eine Endocytose der RNA durch Dendritische Zellen favorisieren, eine erste Klasse an möglichen Adjuvantien. Andere Verbindungen, die die Reifung der Dendritischen Zellen erlauben, beispielsweise Lipopolysaccharide, TNF-α oder der CD40-Ligand, bilden eine weitere Klasse möglicher Adjuvantien. Allgemeiner ausgedrückt kann jedes immunmodulierende Mittel wie die "Gefahrsignale" (LPS, GP96, Oligonucleotide mit dem CpG- Motiv) oder Cytokine wie der GM-CSF, die es erlauben, eine Immunantwort gegen ein Antigen, das durch die injizierte RNA codiert wird, zu erhöhen und/oder gerichtet zu beeinflussen, als mögliches Adjuvans in Betracht gezogen werden.

Insbesondere ist ein immunogenes Präparat, wie weiter oben beschrieben, welches wenigstens ein immunsystemmodulierendes Mittel enthält, das unter den Lipopolysacchariden (LPS), dem Glykoprotein 96, Oligonucleotiden mit dem CpG-Motiv oder den Gytokinen ausgewählt wird, Bestandteil der vorliegenden Erfindung.

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, immunogene und/oder Impfpräparate zu formulieren, deren Zusammensetzung exakt definiert ist, um jedes Risiko eines Nebeneffekts infolge eines unzureichend identifizierten Bestandteils zu vermeiden. Das ist vor allem besonders wichtig um heftige allergische Reaktionen nach der Injektion der Vakzine zu vermeiden, wie sie manchmal aufgrund von Spuren an Bestandteilen auftreten, die im Kulturmedium während der Vakzineproduktion eingesetzt wurden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es möglich, immunogene Präparate anzugeben, die eine hoch gereinigte reife messenger RNA und ein oder mehrere ebenfalls gereinigte Adjuvantien enthalten. Hoch gereinigte messenger RNA bezeichnet hier eine RNA, die dergestalt behandelt ist, dass Proteine, Lipide und DNA-Fragmente vollständig eliminiert sind. Das kann durch die Durchführung mehrer Extraktionsschritte mit Phenol/Chloroform und mehrere Präzipitationen mit Natriumacetat und Ethanol und durch Lithiumchlorid erreicht werden. Es ist aber auch möglich, in nur einem Schritt die Eliminierung der oben genannten Bestandteile zu erreichen, indem man physikalische Verfahren spezifisch anwendet: Trennsäulen zur spezifischen Fixierung von Nucleinsäuren und ihre Trennung unter definierten ionischen Bedingungen oder pH-Werte, aber auch durch Trennsäulen vom HPLC-Typ unter Ionenaustausch, Affinitätsbindung, Größenausschluß, Hydrophobizität, die es erlauben, die RNA von den anderen Molekülen zu trennen, die zur Produktion der RNA erforderlich sind.

Die Erfindung beinhaltet also auch ein immunogenes Präparat, das, wie oben beschrieben, eine messenger RNA enthält, die hochgereinigt wurde, bevor ein Adjuvans oder mehrere Adjuvantien hinzugefügt wird/werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der immunogenen Präparate der Erfindung ist ihre Zusammensetzung zur kutanen oder intradermalen Verabreichung formuliert.

Die Präparate der Erfindung sind nicht begrenzt, was Natur und Anzahl der Antigene der pathogenen Agentien betrifft die durch die RNA-Moleküle codiert werden. Unter dem Begriff "Antigen" versteht man im Rahmen der Erfindung jedes Molekül, das wenigstens ein Epitop enthält. Ein Antigen gemäß der Erfindung ist vorteilhafterweise ein Molekül, das eine Immunantwort auslösen kann, insbesondere die Bildung von Antikörpern. Ein Präparat gemäß der Erfindung kann nur eine einzelne Art messenger RNA mit genau bestimmter Sequenz enthalten, aber auch mehrere verschiedene RNAs mit verschiedenen Sequenzen. Im Extremfall kann ein Präparat der Erfindung einen ganzen Pool an RNA-Molekülen umfassen, der aus einer RNA- oder DNA-Bibliothek gewonnen wurde zum Beispiel aus einer Bibliothek aus einer Zellkultur mit von einem pathogenen Agens infizierten Zellen. Wenn ein Präparat der Erfindung messenger RNA mit mehreren Sequenzen enthält, können die codierenden Sequenzen dieser RNA sowohl von mehreren verschiedenen Antigenen, unabhängig, ob sie vom gleichen Pathogen herrühren oder nicht wie gleichermaßen einem oder mehren Antigenen einerseits und immunsystemmodulierenden Mitteln, wie beispielsweise den Cytokinen, andererseits abstammen.

Die Erfindung bezieht sich also gleichermaßen auf ein immunogenes Präparat, wie es oben beschrieben wurde, in welchem die RNA eine Bibliothek von messenger RNAs darstellt.

Außerdem können die Präparate der Erfindung vorteilhafterweise multicistronische RNA aufweisen, die IRES-Sequenzen enthält (IRES = Internal Ribosome Entry site), die es erlauben, ausgehend von einem RNA-Molekül mehrere immunogene Proteinen von Interesse und außerdem ein oder mehrere immunologisch wirksame Molekülen, wie Cytokine, die die Immunantwort stimulieren oder polarisieren (Th1 oder Th2) können, herzustellen.

Die immunogenen Präparate, wie sie oben beschrieben werden, und von deren RNA wenigstens ein Teil bzw. Abschnitt eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) aufweist, bilden also einen anderen Aspekt der Erfindung.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Präparate der Erfindung, die einen RNA-Pool bzw. ein RNA-Gemisch umfassen und/oder von denen wenigstens ein Teil bzw. Abschnitt der RNA-Moleküle eine IRES besitzt, codiert wenigstens ein Teil bzw Abschnitt der RNA-Moleküle für Cytokine, die die Immunantwort stimulieren oder polarisieren können.

Bei den Präparaten der Erfindung kann die Sequenz der RNA, die für wenigstens ein Antigen eines pathogenen Agens codiert, für sowohl ein Polyepitop als auch für ein virales oder bakterielles Protein, vollständig oder verkürzt, codieren.

Ein bevorzugtes Angriffsziel der Präparate gemäß der Erfindung ist Hepatitis B. Tatsächlich reagieren 5 bis 15% der Erwachsenen auf keinen der gegenwärtig verwendeten Impfstoffe. Dieses Ausbleiben der Immunantwort, die auf den HLA- Typ zurückgeführt wird, könnte durch die Impfung auf RNA-Grundlage überwunden werden. Außerdem könnte man eine Immuntherapie mit RNA- Impfung bei den 350 Million chronischen HBV-Virus-Patienten ins Auge fassen. Die Erfinder haben gezeigt, dass das Oberflächenantigen des für Hepatitis B verantwortlichen Virus (HBsAg) ein gut geeigneter Kandidat wäre, um eine Antwort gegen dieses Virus auszulösen (Loirat, Lemonnier et al. 2000).

Ein immunogenes Präparat gemäß der Erfindung, bei dem wenigstens ein Teil der RNA-Moleküle für ein Oberflächenprotein des Hepatitis-B-Virus codiert, ist also eine der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung kann jeweils ein Teil bzw. Abschnitt der BNA- Moleküle für die kleinen und mittleren Hüllproteine des Hepatitis-B-Virus codieren.

In der bevorzugten Ausführungsform der immunogenen Präparat, wie sie im vorhergehenden Absatz beschrieben wurden, weist wenigstens ein Teil bzw. Abschnitt der RNA die Sequenz βg-HBs-βgαn auf die in Abb. 1 dargestellt ist.

Ein anderes Angriffsziel der immunogenen Präparate der Erfindung ist das humane Immunschwächevirus (HIV). Folglich codiert von den RNA Molekülen wenigstens ein Teil bzw. Abschnitt für ein HIV Antigen und in einer bevorzugten Ausführungsform für ein HIV Polyepitop. Insbesondere weist ein Teil bzw. Abschnitt der RNA-Moleküle bei dieser Ausführungsform die Sequenz βg-HIV- HBS-βgαn, die in Abb. 2 gezeigt ist, auf. Bei diesem Beispiel umfasst das Polyepitop, welches mit HBS verbunden ist, 13 HLA-A2-Epitope, die von verschiedenen Proteinen des HIV-1-Virus abstammen. Gleichermaßen kann in Betracht gezogen werden, dass mit HBS eine Anzahl wichtigerer Epitope verbunden werden, die durch MHC-Klasse I Proteine präsentiert werden können und die von zahlreichen Proteinen des HIV-Virus abstammen.

Das Hepatitis-C-Virus ist ein weiteres Pathogen, gegen das es wünschenswert wäre, einen Impfstoff oder wenigstens einen Impfstoß, der im Wirt eine Immunantwort stimulieren kann, zu entwickeln. Hierfür scheint die Verwendung von RNA, welche für das CORE-Protein des Hepatitis C-Virus (HCV) codiert, interessant zu sein. Tatsächlich handelt es sich bei diesem Virus um das am stärksten konservierte unter den Genotypen von HCV. Außerdem existiert eine Zellantwort gegen das CORE-Protein bei Patienten, die mit dem HCV infiziert sind, und die mit einer günstigen Antwort auf eine Interferon-Therapie verbunden ist. Die Verwendung von RNA, die für nicht-strukturelle und Strukturprotein des Virus codiert, könnte sich als wirksam erweisen, wie die Ausführungsform der RNA, die einerseits für das CORE-Protein und andererseits für andere Proteine codiert.

Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der immunogenen Präparate der Erfindung codiert daher ein Teil bzw. Abschnitt der RNA-Moleküle für das CORE-Protein des Hepatitis C-Virus.

Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines der immunogenen Präparate, wie sie oben im gesamten bisherigen Text beschrieben sind, als pharmazeutisches Präparat das zur Prophylaxe, zur Behandlung oder zur Verbesserung nach einer Infektion mit einem pathogenen Agens bestimmt ist, insbesondere nach einer Infektion mit HIV, dem Hepatitis B-Virus, dem Hepatitis C-Virus, dem Rous-Sarcomvirus, aber auch mit den für Malaria verantwortlichen Parasiten oder den für Pneumonie verantwortlichen Bakterien, und gegebenenfalls mit der Beschleunigung oder dem Ausbruch einer Krankheit verbunden ist, die mit einer erhöhten Anfälligkeit von cardio-vaskulären Erkrankungen assoziiert ist, wie dies beispielsweise der Fall bei Chlamydia pneumoniae ist.

Ein anderer besonders wichtiger Aspekt der Erfindung ist ein Impfstoff, der durch beliebige Bestandteile charakterisiert ist, die in den immunogenen Präparaten enthalten sind, wie sie im gesamten bisherigen Text beschrieben sind, und der es im Wirtsorganismus (Mensch oder Tier) erlaubt, einen Schutz gegenüber einem pathogenen Agens zu bilden.

Insbesondere ist der Impfstoff dadurch charakterisiert, dass der Schutz erhalten wird durch eine Aktivierung der cytotoxischen CD8⁺ T-Lymphocyten und/oder der CD4-spezifischen T-Helferzellen durch mindestens einen Teil der RNA- Moleküle des verabreichten Präparats und/oder durch eine Aktivierung der B- Lymphocyten als Antikörperproduzenten. Die Anti-HBs-Antikörper bilden die Grundlage einer Vorbeugung gegen eine Infektion mit HBV. Die T-Zell-Antwort (Helfer- und cytotoxische T-Zellen) ist erforderlich, um eine erfolgte Infektion bekämpfen zu können.

Die nachstehenden Beispiele und Abbildungen, die nicht einschränkend sind, erlauben es, bestimmte Vorteile und Charakteristiken der vorgestellten Erfindung zu belegen.

Legenden zu den Abbildungen Abb. 1 Sequenz von injizierter RNA βg-HBS-βgαn

(Die Uracilbasen sind durch den Buchstaben T dargestellt)

- Die Sequenz in Großbuchstaben codiert für das Antigen HBS (S2.S).
- Die Start- und Terminationscodons für die Translation sind in einem Kästchen dargestellt.
- Die transkribierten und nicht translatierten Regionen (5' und 3' UTR des β-Globins) sind fett gedruckt.
- Die Sequenzen in Kleinbuchstaben und normaler Darstellung haben keine besondere Bedeutung für die Vakzinierung mit RNA und stammen von Plasmiden ab.
- Der Poly A-Poly-C-Schwanz ist kursiv dargestellt.
- Der Abschnitt mit der Restriktionsstelle, die zur Linearisierung des Plasmids vor der Transcription verwendet wird, ist unterstrichen.

Abb. 2 Sequenz von injizierter BNA βg-HIV HBS-βgαn

(Die Uracilbasen sind durch den Buchstaben T dargestellt)

- Die Squenz in Großbuchstaben codiert für das Polyepitop HLA- A*0201 HIV-HBS (die Großbuchstaben in Fettdruck entsprechen der HIV Region des Polyepitops HLA-A*0201).
- Die Start und Terminationscodons für die Translation sind in einem Kästchen dargestellt.
- Die transkribierten und nicht translatierten Regionen (5' und 3' UTR des β-Globins) sind als Kleinbuchstaben und fett gedruckt.
- Die Sequenzen in Kleinbuchstaben und normaler Darstellung haben keine besondere Bedeutung für die Vakzinierung mit RNA und stammen von Plasmiden ab.
- Der Poly A-Poly-C-Schwanz ist kursiv dargestellt.
- Der Abschnitt mit der Restriktionsstelle die zur Linearisierung des Plasmids vor der Transcription verwendet wird, ist unterstrichen.

Abb. 3 Experiment zur Restimulierung von CTL in vitro

8 Wochen nach Injektion von 20 µg DNA oder RNA in beide Ohren oder von 50 µg in beide Hinterpfoten nach Behandlung mit Cardiotoxinen wurde die BalB/o-Mäuse exekutiert, die Milzzellen in vitro mit einem Epitop BBS H-2d restimuliert und in einer Cytotoxizitätsuntersuchung gegen transfizierte Zielzellen getestet, die ein Oberflächen Antigen BBs (P815/S) exprimieren, und gegen markierte P815-Zellen als Negativkontrolle getestet.

Die spezifische cytotoxische Aktivität wurde durch Messung der Kurzzeit-Freisetzung von ⁵¹Cr getestet. Nach Inkubation für 4 h bei 37°C wurden die Überstände gesammelt und mit einem Beta-Zähler gemessen. Die Ordinate repräsentiert für jede Kurve den Prozentsatz der Zielzellenlyse (oder auch Prozentsatz der Cytotoxizität) in Bezug auf eine Kontrollyse zu 0% und zu 100%. Der Prozentanteil der Cytotoxizität = 100.(cpm [Zielzelle + CTL] - cpm [Zielzelle allein])/(cpm [Zielzelle allein + Detergens] - cpm [Zielzelle allein]) und die Abszisse zeigt das verwendete Verhältnis von Effektor- /Zielzelle. Jede Kurve entspricht den Milzzellen eines Tieres.

Abb. 4 IFN-γ (Abb. 4A) und IL-4 (Abb. 4B) ELISPOT

Ausgeführt mit Milzzellen, die, wie im Experiment zur Restimulation von CTL in vitro beschrieben, entnommen wurden.

Die Ordinate gibt die Zahl der IFN-γ produzierenden (Abb. 4A) bzw. die der L4 produzierenden Zellen, jeweils pro 10⁶ Zellen, an.

Auf der Abszisse sind die unterschiedlichen Bedingungen der Immunisierung der Mäuse dargestellt. Das zur Stimulierung verwendete Antigen ist durch die Ausfüllung der entsprechenden Säule dargestellt.

Abb. 5 Spezifischer ELISA zur Untersuchung der humoralen anti- Hepatitis B-Antwort

(Die Milzzellen wurden im gleichen Zeitpunkt entnommen, wie im Experiment zu Abb. 3 beschrieben, jedoch ohne in vitro Restimulierung mit T-Zellen).

Zwei Monate nach der Injektion von DNA oder RNA wurde das Blut der Mäuse durch Punktierung im Augenhintergrund aufgenommen, wofür Heparin-Glaspipetten benutzt wurden. Nach Gewinnung der Seren durch Zentrifugation wurden sie mit einem spezifischen ELISA Test auf das Vorhandensein von anti-Hbs-Antikörpern bzw. anti preS2-Antlkörpren geprüft. Die gereinigten rekombinanten Partikel, die das kleine Protein S des HBV-Virus (1 µg/ml) oder das synthetische Peptid preS2 (120-145) (1 µg/ml) enthalten, wurden als Festphase verwendet. Nach Blockierung mit PBST, dem 10% fötales Kälberserum zugefügt wurde, wurden die Verdünnungsreihen des Serums zugegeben. Nach gründlichem Waschen wurden die gebundenen Antikörper mit anti-Maus-Immunoglobulinen (Gesamt- IgG) detektiert. Die anti-Maus-Immunoglobuline waren mit Meerrettich-Peroxidase markiert (Amersham, GB). Der Antikörpertiter wurde nach der Methode der begrenzten Verdünnung bestimmt. Die Mäuseseren wurden einzeln bestimmt und die Titerzahlen sind der Durchschnitt von wenigstens drei Bestimmungen. Verdünnungen unterhalb von 1/100 werden als negativ betrachtet. Die anti-HBs-Titer sind als geometrisches Gruppenmittel ± Standardabweichung (GMT ± SEM) der Werte jedes einzelnen Tiers angegeben, die Ihrerseits der Durchschnitt von zwei- oder dreifach wiederholten Experimenten sind.

Abb. 6

ELISPOT mit frischen Milzzellen

HHD-Mäuse wurden mit 20 µg DNA, RNA oder RNA in Verbindung mit Protamin in jedes Ohr, oder mit 50 µg DNA in jede Hinterpfote nach Behandlung mit Cardiotoxinen geimpft Drei Wochen später wurden die Milzzellen in vitro mit Peptiden restimuliert, die den einzelnen Epitopen entsprachen. Die Immunantwort wurde durch Messung des freigesetzten IFN-γ mittels ELISPOT bestimmt.

Die Abbildung zeigt die durchschnittliche Anzahl an Spots, die für jedes Peptid bei 5 Mäusen erhalten wurden.

Dieses Experiment wurde durchgeführt, indem die Mäuse mit der in Abb. 2 gezeigten Sequenz immunisiert wurden.

Die DNA bzw. RNA-Konstrukte, die den Mäusen injiziert wurden und die zur Immunisierung dienten, codieren für die HIV-1-Epitope A9M-Y/I9V-Y/K9L8S-Y/T9V-Y/V9L-Y/P10L-V11V-Y/P9L-S9L- Y/E9V-L10V-L9V-Y/K9L-HBS Protein.

Beispiele

1 - Struktur der zur Vakzinierung geeigneten RNA

Die RNA, die in den nachfolgenden Beispielen verwendet wird, enthält die transkribierten und nicht translatierten 5'- und 3'-Sequenzen (5' oder 3' UTR) der RNA, die für das β-Globin von Xenopus codiert. Diese Sequenzen bilden vermutlich Sekundärstrukturen, die von cytosolischen Proteinen erkannt werden. Sie erlauben die Erhöhung der Halbwertszeit der RNA im Cytosol.
Es ist jedoch möglich, dass die zur Impfung wirksame RNA keine dieser stabilisierenden Sequenzen enthält.
Außerdem können die stabilisierenden Sequenzen des β-Globins durch stabilisierende Sequenzen ersetzt sein, die von einer anderen RNA mit langer Lebenszeit im Cytosol abstammen. Beispielsweise könnte die Consensus-Sequenz (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC, wie sie im 3'UTR-Abschnitt der sehr stabilen RNA vorkommt, die für das α-Globin, das α-(I)-Kollagen, die 15- Lipoxygenase und die Tyrosin-Hydroxylase (Holcik and Liebhaber 1997) codiert, eingefügt oder durch die 3'UTR-Sequenz des β-Globin ergänzt sein, wie sie in der nachfolgend beschriebenen RNA enthalten ist.
Der 3'-Poly A-Schwanz, der die Stabilität und die Translation der RNA verbessert, kann außerdem verlängert und frei von Cytosinbasen sein. RNA, die mehr als 100 Adenosinbasen am 3'-Ende und kein Cytosin stromabwärts enthält, ist vorzugsweise zu verwenden. Allgemeiner ausgedrückt ist die Erhöhung der Anzahl an Cytosin oder Guanosinbasen in der gesamten RNA (ohne zu Modifikationen in der Aminosäuresequenz der durch die RNA codierten Proteine zu führen) auch eine Methode zur Stabilisierung des Messengers und ist damit gleichermaßen in Betracht zu ziehen, um die Wirksamkeit der Immunisierung mit RNA zu verbessern.
Eine weitere Art und Weise, die BNA gegenüber RNasen zu stabilisieren, besteht darin, sie in Gegenwart von modifizierten Ribonucleotiden, beispielsweise den Sp Diastereoisomeren der Ribonucleosid-5'-O-(1-thiotriphosphate) zu synthetisieren. RNA, die Phosphorthioate enthält, widersteht dem Abbau durch RNasen besser als natürliche RNA und wird besser in Proteine translatiert (Tohda, Chikazumi et al. 1994). Ihre Verwendung für die Entwicklung eines Impfstoffes wird in Betracht gezogen.
Im Gegensatz dazu existieren in bestimmten Genen Sequenzen, die RNA allgemein destabilisieren. Dies ist bspw. bei AU-reichen Sequenzen der Fall, die mit AURES bezeichnet werden und die sich im 3'UTR zahlreicher instabiler mRNAs befinden (Caput Beutler et al. 1986). Die zur Impfung hergestellten viralen Sequenzen sollten daher gegebenenfalls derart mutiert sein, daß sie keine destabilisierenden Sequenzen mehr enthalten. Ebenfalls können Erkennungsstellen potentieller Endonukleasen, wie die im 3'UTR der für den Transferin-Rezeptor codierenden Gens enthaltenen GAACAAG Sequenzen (Binder, Horowitz et al. 1994), aus den zur Impfung verwendeten RNAs entfernt werden.
Ebenfalls ist es möglich, zusätzlich zu den Modifikationen oder über die zur Stabilisierung der interessierenden RNA vorgesehenen Sequenzen hinaus, die Initiation oder die Elongation bei der Translation, ausgehend von der Vakzin- RNA, zu verbessern. Es wird bspw. in Betracht gezogen, diejenigen Codons, welche seltenen tRNA-Spezies entsprechen, zu mutieren, um sie durch Codons zu ersetzen, die bei Säugern häufig vorkommenden tRNAs entsprechen, oder Sequenzen, wie der Sequenz im 5'UTR des für HSP60 codierenden Gens, hinzuzufügen, welche die Translation der RNA erhöhen (Vivinus, Baulande et al. 2001). Diese Modifikationen erlauben eine gesteigerte Produktion interessierender Proteine, ausgehend von der RNA, und verbessern auch die Vakzinierungseffizienz.
Schließlich ist die Verwendung von multicistronischer RNA in Betracht zu ziehen, die IRES-Sequenzen (IRES = Internal Ribosome Entry Site) enthält, welche, ausgehend von einem RNA-Molekül, die Herstellung von verschiedenen interessierenden Proteinen, zusätzlich zu einem oder mehreren immunogenen. Molekül(en), von Cytokinen, die die Immunantwort stimulieren oder polarisieren (Th1 oder Th2) können, erlaubt.

Mögliche Adjuvantien und Zusätze

Die Erfinder haben festgestellt, dass eine sehr sorgfältige Reinigung der RNA (durch Hinzufügen von Fällungsschritten mit Lithiumchlorid), die zur Immunisierung von Mäusen verwendet wird, zu einer geringeren Wirksamkeit der Immunisierung führen kann.
Aus diesem Grund ist die Co-Injektion der Vakzin-RNA mit immunsystemmodulierenden Agentien, wie den "Gefahrsignalen" (beispielsweise LPS, GP96, Oligonuecleotide mit dem CpG-Motiv) oder mit Cytokinen (beispielsweise GM-CSF) gleichermaßen in Betracht zu ziehen, um die Immunantwort gegen die durch die injizierte RNA codierten Antigene zu erhöhen und/oder zu kontrollieren.
Die Verwendung kationischer Verbindungen (Proteine oder andere), wie Protamine, um die RNA zu kondeniseren und vor dem Abbau durch RNasen zu schützen, ist von Vorteil, jedoch anhand der weiter unten stehenden Ergebnisse nicht notwendig.

Einige Beispiele von bei der Vakzinierung mit RNA geeigneten Antigenen

Die weiter unten beschriebenen Experimente illustrieren zwei Arten einer möglichen Realisation der Erfindung, was die in die Konstrukte eingeführte Nucleotidsequenz betrifft die für ein Antigen codiert. Diese zwei Modi sind zum einen eine Sequenz, die für ein Polyepitop codiert (im vorliegenden Fall für ein HIV-Polyepitop) und zum anderen eine Sequenz, die für ein vollständiges Protein codiert (ein HBV Hüllprotein).
Die möglichen Ziele der Vakzinierung durch Injektion von RNA sind a priori nicht begrenzt. Als ausgewählte Beispiele für Antigen, die bei diesem Typ der Vakzinierung verwendbar sind, kann man die Antigene der Hepatitis A-, Hepatitis B- und Hepatitis C-Viren, des Retrovirus HIV, von Chlamidia Pneumoniae, des Rous-Sarkomvirus oder der für Malaria verantwortlichen Parasiten (Falsiparum sp.) nennen.
Für die Entwicklung einer RNA Vakzine gegen das Hepatitis C-Virus scheint die Verwendung einer RNA interessant, die für das CORE-Protein des HCV-Virus codiert. In der Tat ist das CORE-Protein dieses Virus das am stärksten konservierte unter den Genotypen von HCV. Außerdem gibt es bei Patienten, die mit HCV infiziert sind, eine zelluläre Antwort gegen das CORE-Protein, die mit einer günstigen Antwort auf eine Interferon Therapie assoziiert ist. Jedoch könnte sich die Verwendung einer RNA, die für Struktur- und andere Proteine codiert, auch als wirksam erweisen.

Herstellung von RNA

Die Sequenz der RNA βg-HBS-βgαn ist in Abb. 1 dargestellt.
Die Sequenz der RNA βg-HIV-HBS-βgαn ist in Abb. 2 dargestellt.
Die Sequenzen in fettgedruckten Kleinbuchstaben sind die 5'- und 3'-Sequenzen, die transkribiert und nicht translatiert sind (5' oder 3 UTR), der RNA, die für das β-Globin bei Xenopus codieren.
Die Sequenzen, die für die Moleküle HBS S2.S und HIV Polyepitop-HBS codieren, wurden aus dem Plasmid pCMVHB-S2.S-d1, wie von Marie-Louise MICHEL (Michel, Davis et al. 1995) beschrieben, bzw. aus dem PlasmidpCMV- B10, wie von Husseyin FIRAT (FIRAT, Garcia-Pons et al. 1999) beschrieben, gewonnen. Diese zwei Fragmente besitzen stromaufwärts eine HindIII-Stelle und stromabwärts eine NsiI-Stelle (enzymatisch freigesetzt). Sie wurden in ein Plasmid ligiert, das die Produktion von RNA erlaubt (dieses Plasmid enthält sowohl einen Promotor, der von der RNA-Polymerase SP6 erkannt wird, als auch die 5'- und 3' nichttranslatierten RNA-Sequenzen, die für das β-Globin von Xenopus codieren, und die durch eine Multiple-Cloning-Site getrennt sind) und welches mit den Enzymen HindIII und BglII (enzymatisch freigesetzt) verdaut wurde. Das resultierende Plasmidkonstrukt wird mit PstI linearisiert, anschließend durch Extraktionen mit Phenolchloroform und durch Fällungen mit Ethanol und Ammoniumacetat von jeglichen Proteinen befreit und anschließend in RNase- freiem Wasser resuspendiert. Diese DNA wird durch Verwendung eines SP6 mMessagemMachine™-Kits Firma Ambion transkribiert. Dieses Kit dient der Produktion von RNA Molekülen, deren Mehrheit (80%) eine CAP- (m₇G(5')ppp(5')G) Struktur in der 5'-Position besitzen. Nach Behandlung der Transkriptionsreaktion mit DNase werden die RNAs mit Lithiumchlorid gefallt, in Wasser resuspendiert und mittels Messung der optischen Dichte bei 260 nm quantifiziert. Anschließend wird die Präparation durch Extraktion mit Lithiumchorid und dann durch Fällung mit Ethanol und Ammoniumacetat von Spuren an Proteinen gereinigt, bevor sie bei 10 Milligramm pro Milliliter in RNase-freiem Wasser resuspendiert wird. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C wird die RNA unter Verwendung von RNase-freiem Hepes-Puffer (150 mM NaCl; 10 mM Hepes pH 7,5) auf 1 Milligramm pro Milliliter verdünnt.

HbsAg Expressionsvektor, RBs-RNA und Immunisierung

Das Plasmid pCMV-S2.S enthält einen Abschnitt des für die Hülle codierenden Bereichs des Genoms von HBV. Die preS2- und S-Bereiche stehen in diesem Plasmid (Michel, Davis et al. 1995) unter der Transkriptionskontrolle des Immediate-Early Promotors des humanen Cytomegalovirus (CMV-i.e.), was die Expression kleinerer und mittlerer Hüllproteine von HBV erlaubt, die alle beide das Oberflächenantigen HBs (HBsAg) aufweisen.
Die Plasmid-DNA, die für die Immunisierung in vivo verwendet wird, wurde unter Verwendung von DNA-Reinigungssäulen von Qiagen (Endofree Plasmid Kit, Qiagen, Hilden, Deutschland) gereinigt.
Für die Immunisierung auf Basis von DNA wurde der Expressionsvektor für HBsAg, pCMV-S2.S. wahrend der Auffrischung, wie zuvor beschrieben, direkt in die Muskulatur des vorderen Schienbeins injiziert, oder direkt in den äußersten Teil des Ohrs (Ohrmuschel, ear pinna). Fünfzig Mikroliter DNA wurden bei 1 mg/ml in jedes Schienbein für eine Gesamtmenge von 100 Mikrogramm DNA pro Maus injiziert. Zwanzig Mikroliter DNA wurden bei 1 mg/ml in beide Ohren für eine Gesamtmenge von 40 Mikrogramm DNA pro Maus injiziert.
Was die Immunisierung auf Basis von RNA betrifft, so wurde die RNA, die für HBsAg codiert, durch Verwendung eines Vektors, der ein subkloniertes Fragment des Plasmids pCMV S2.S enthält, und der SP6-Polymerase gewonnen. Die RNA wurde nach einer Methode hergestellt, die in der Patentanmeldung EP 1083 232 beschrieben ist. In einigen Fällen wurde die RNA dadurch stabilisiert, dass Protamin im Verhältnis von 1/1 Gramm verwendet wurde. Zwanzig Mikroliter RNA wurden hinter jedes Ohr von BALB/C-Mäusen für eine Gesamtmenge von 40 Mikrogramm pro Maus injiziert.
Für die Immunisierung wurden Gruppen von 4 bis 6 weiblichen BALB/c-Mäusen im Alter von 6 bis 8 Wochen verwendet.

Induktion von CTL

Die Milzen wurden 52 Tage nach der Immunisierung entnommen und die Milzzellen wurden gezählt und analysiert, um das relative Verhältnis von T- and B-Zellen zu bestimmen. Der Prozentsatz von CD8⁺- und CD4⁺-Zellen wurde durch FACS-Analyse frischer Milzzellen bestimmt, wobei eine direkte Färbung mit anti-Maus CD8⁺ FITC- und CD4⁺ PE-Antikörpern (Pharmingen, San Diego, CA) angewendet wurde.

Messung der CTL-Aktivität

Die Milz der Mäuse wurde 8 Wochen nach der Immunisierung mit RNA oder DNA entnommen. Die Milzzellen wurden in alpha-MEM-Medium (Gibco) kultiviert (10 × 10⁶ Zellen pro Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen), dem 10 nM Hepes, nicht-essentielle Aminosäuren, Natriumpyruvat (1 mM), Betamercaptoethanol (50 nM) und 10% fötales Kälberserum zugefügt waren. Diese Zellen wurden für fünf Stunden mit 1 Mikrogramm des von S abstammenden Peptids (AS 28-39 ab dem ersten Methionin des kleinen Hüllproteins) entsprechend dem Epitop, das auf H-2L^d begrenzt ist, stimuliert. Die Effektorzellen wurden in einem Cytotoxizitätsexperiment nach sieben Tagen in der Kultur verwendet. Die cytolytische Aktivität der Zellen wurde in einem Kurzzeit-⁵¹-Cr-Freisetzungsexperiment gegen transfizierte Zielzellen, die HbsAg (P815/S) exprimieren, und gegen P815-Zellen als Negativkontrolle gemessen. Nach vier Stunden Inkubation bei 37°C wurden die Überstände gesammelt und unter Verwendung eines Beta-Zählers gezählt. Die spontane und die maximale Freisetzung wurden mit Vertiefungen bestimmt, die das Kulturmedium allein oder mit Lysemittel (5% Triton, 1% SDS) enthielten. Die spezifische Lyserate wurde folgendermaßen berechnet:
(experimentelle Freisetzung - spontane Freisetzung)/(maximale Freisetzung - spontane Freisetzung) × 100 für jedes Experiment. Die spezifische Lyse wurde für jeden Punkt in dreifacher Wiederholung bestimmt. Die CTL-Aktivität wurde für jede Maus mit verschiedenen Verhältnissen an Effektor-/Zielzellen bestimmt (E/T).
Das Verhältnis der CD8⁺ T-Zellen und der CD4⁺ T-Zellen war in den Gruppen vergleichbar, jedoch scheint die Injektion ins Ohr zu einer höheren Anzahl an B- Zellen zu führen (siehe folgende Tabelle).
Analyse der Lymphozyten Populationen in der Milz nach der Vakzinierung.

Untersuchung zytotoxischer T-Lymphocyten nach der Impfung (Abb. 3)

Um die CTL zu detektieren, wurden die Milzzellen für sieben Tage mit dem Ld- restringierten Peptid S-28-39 aktiviert und anschließend ihre lytische Aktivität bezüglich mit HBs transfizierten p815/S-Zellen getestet Nichttransfizierte p815- Zellen dienten zur Kontrolle. Die Ergebnisse sind in Abb. 3 dargestellt. Die cytotoxischen Antworten wurden für jede Gruppe immunisierter Mäuse detektiert. Die intramuskuläre DNA-Injektion in den vorbehandelten Muskel erbrachte die höchste Lyserate der Zielzellen. Cytotoxische T-Zellen wurden in 4 von 6 Mäusen nach Injektion von RNA mit Protamin gefunden, während bei 5 von 5 und 6 von 6 Mäusen cytotoxische T-Zellen in der Milz nach Injektion von DNA oder nackter RNA gefunden wurden.
Dies deutet darauf hin, dass die Injektion von nackter RNA oder von RNA in Assoziation mit Protamin geeignet ist, in vivo cytotoxische T-Zellen zu aktivieren, die ein auf endogene Weise vorbereitetes HBs-Antigen erkennen.

Quantifizierung von HBs-spezifischen T-Zellen, die IFN-γ produzieren

Die Zellen, die Interferon-γ (IFN-γ) freisetzen, wurden durch einen für ein gegebenes Cytokin spezifischen Immunospot-Test durch ein Enzym-gekoppeltes Cytokin-spezifisches Immunospot-Experiment (enzyme-linked immunospot oder ELISPOT) nach Stimulation durch ein Peptid oder ein HBs-Antigen quantifiziert. ELISA-Platten mit einem ebenen Nitrozellulose-beschichteten Boden wurden mit 50 Mikroliter Ratten Antikörper anti-murin IFN-γ (5 µg/ml, Pharmingen, San Diego, CA) über Nacht bei 4°C bedeckt, und dann für zwei Stunden bei 37°C mit RPMI 1640 gesättigt, das 10% Totales Kälberserum enthielte Milzzellen (1 × 10⁶ /Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen), die wie oben für die CTL- Experimente beschrieben gewonnen wurden, wurden 40 Stunden in α-MEM- Komplettmedium bei 37°C in Gegenwart von 5% CO₂ inkubiert, wobei verschiedene Antigene zur Stimulation dienten. Die Zellen wurden mit den Peptiden HBV-S (3 µg/ml) oder mit HBsAg-Partlkeln (1 µg/ml) inkubiert. Zwei Peptide, die auf MHC Klasse I beschränkt sind und die vom S-Segment abstammen (28-39 = I-12-L und das Peptid 15 = S362-372 W-1-L) und ein Peptid, das auf MHC-Klasse 2 beschränkt ist und vom preS2-Segment herrührt (preS 138-165), wurden für die Aktivierung benutzt. Der Hintergrund wurde mit Zellen in Medium bestimmt. Die Zellen wurden aufgenommen, indem die Platten gepuffert wurden. Anschließend wurden sie mit Wasser lysiert. Nach Reinigung mit PBS (0,05% Tween 20) wurde ein biotinylierter anti-murin IFN-γ-Antikörper der Ratte (1 µg/ml, Phatmingen, San Diego, CA) für eine 90 minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzugegeben.
Die Vertiefungen wurden wie vor der Inkubation gewaschen, wonach eine Verdünnung von alkalischer Phosphatase-Streptavidin von 1 : 1000 (Boehringer- Mannheim, Deutschland) für 1 h 30 min benutzt wurde. Anschließend wurde eine Lösung von 2,3 nM 5-Bromo-4-chlor-3-indolyl-phosphat (BCIP) und Nitroblue- Tetrazollum (NBT) (Promega, Madison, WI) zugefügt, die in einer alkalischen Pufferlösung verdünnt war. Wenn die Spots sichtbar wurden, wurde die Reaktion durch Zugabe von Wasser gestoppt und die Platte an der Luft getrocknet. Die Anzahl der Spots, die IFN-γ sekretierten, wurde unter Verwendung eines ELISPOT-Lesegeräts (Zeiss) gezählt. Die Ergebnisse sind als Durchschnittswert für jede Gruppe als IFN-γ-sekretierende Zellen pro 10⁶ Milzzellen angegeben.
Zwei Monate nach der Immunisierung wurden die HBs-spezifischen T-Zellen in der Milz der immunisierten Mäuse detektiert, denen DNA nur intramuskulär injiziert wurde (Abb. 4A). Diese T-Zellen produzierten IFN-γ nach Aktivierung mit auf MHC-Klasse-I restringierten Peptid, das vom S-Segment abstammte oder mit dem auf MHC-Klasse-II restringierten Peptid, das vom pre- S2-Segment abstammt. Im Gegensatz dazu konnte kein Spot nach Aktivierung der Milzen der Mäuse, denen entweder DNA oder RNA ins Ohr injiziert wurde, detektiert werden. Das legt den Schluss nahe, dass die aktivierten T-Zellen den Milzzellen der Mäuse, denen man DNA oder RNA über das Ohr verabreichte, nicht präsentiert wurden. Jedoch deutet die Detektion cytotoxischer T-Zellen nach der Restimulierung in vitro mit einem Peptid (Abb. 3) an, dass die T- Gedächtnis-Zellen auf beiden Immunisierungswegen, sowohl bei Verwendung von DNA als auch von RNA, induziert wurden.
Vergleichbare Ergebnisse wurden mit einem IL-4-ELISPOT-Experiment gewonnen (Abb. 4B). Wenige Spots entsprachen aktivierten T-Zellen, welche IL-4 nach der Immunisierung mit DNA (intramuskulär) freisetzten und sowohl das vom S-Segment abstammende MHC-Klasse-1-Peptid als auch das vom pre-S2-Segment abstammenden MHC-Klasse-II-Peptid erkannten. Der größere Anteil der T-Zellen setzt IFN-γ frei, was anzeigt, dass die T-Helfer- Antwort auf ein Th-1 Profil gerichtet war.

Humorale Anti-Hepatitis-B-Antwort

Zwei Monate nach der DNA- oder RNA-Injektion wurde das Blut der Mäuse durch Punktion im Augenhintergrund gewonnen, wofür Heparin-Glaspipetten benutzt wurden, und die durch Zentrifugation gewonnenen Seren wurden auf die Anwesenheit von anti-HBs- und anti-preS2-Antikörpern mit einem spezifischen ELISA Test untersucht Gereinigte rekombinante Partikel, die das kleine Protein S des HBV Virus (1 µg/ml) oder das synthetische Peptid preS2 (120-145) (1 µg/ml) enthalten, wurden als Festphase verwendet. Nach Blockierung mit PBST (phosphatgepufferte Salzlösung, die 0,1% Tween 20 enthält), enthaltend 10% totales Kälberserum, wurden Verdünnungsreihen des Serums hinzugefügt. Nach gründlichem Waschen wurden die gebundenen Antikörper detektiert wofür anti- Maus-Immunglobuline (Gesamt-IgG) verwendet wurden, die mit Meerrettich- Peroxidase (Amersham, GB) markiert waren. Der Antikörpertiter wurde nach der Methode der begrenzten Verdünnung bestimmt. Die Mäuseseren wurde einzeln getestet und die Titer sind der Durchschnitt von 3 Bestimmungen. Die Verdünnungen unterhalb 1 : 100 wurden als negativ angesehen. Die anti-HBs-Titer werden als geometrisches Gruppenmittel ± Standardabweichung (GMT ± SEM) der Werte der einzelnen Tiere ausgedrückt, die ihrerseits selbst der Durchschnitt von doppelt oder dreifach ausgeführten Experimenten sind.
Die für HBsAg oder für die preS2 Domäne des mittleren HBV Proteins spezifischen Antikörper wurden bei 4 von 4 Mäusen 8 Wochen nach der intramuskulären Injektion von pCMV S2.2 mit einem ELISA-Test im Serum detektiert (Abb. 5). Weder nackte RNA noch mit Protamin kombinierte RNA führte zu einer signifikanten Antikörperbildung für anti-HBs und anti-preS2 bei den Mäusen, die über das Ohr geimpft wurden. Im Gegensatz hierzu wurden schwache anti-HBs-Antikörpertiter im Serum bei 2 von 4 Mäusen gefunden, denen DNA ins Ohr injiziert wurde. Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass DNA wahrscheinlich länger als RNA überlebt was zu einer konstanten Produktion des HBs-Antigens fuhrt.

HIV-Polyepitope-HBS Expressionsvektor, HIV Polyepitope-HBS- RNA und Immunisierung

Das pCMV B10-Plamid enthält ein Polyepitop, das 13 HLA-A2-Epitope von HIV-1 aufweist. In diesem Plasmid (Firat Garcia-Pons et al. 1999) wurde die Epitop-Sequenz unter die transkriptionellen Kontrolle des Immediate-Early- Promotors des humanen Cytomegalovirus (CMV-i.e.) gestellt.
Die zur Immunisierung in vivo verwendete Plasmid-DNA wurde mit Qiagen- DNA-Reinigungssäulen (Endofree Plasmid Kit, Qiagen, Hilden, Deutschland) gereinigt.
Zur Immunisierung auf Basis von DNA wurde der Expressionsvektor pCMV-B10 für das Polyepitop im Verlauf der Auffrischung, wie zuvor beschrieben, direkt in die Muskulatur des vorderen Schienbeins injiziert, oder direkt in den äußersten Teil des Ohrs (Ohrmuschel). Fünfzig Mikroliter DNA wurden bei 1 mg/ml in jedes Schienbein für eine Gesamtmenge von 100 Mikrogramm DNA pro Maus injiziert Zwanzig Mikroliter DNA wurden bei 1 mg/ml für eine Gesamtmenge von 40 Mikrogramm DNA pro Maus injiziert.
Was die Immunisierung auf Basis von RNA betrifft, so wurde die RNA, die für das Polyepitop codiert, dadurch gewonnen, dass ein Vektor, der ein subkloniertes Fragment des Plasmids pCMV-B10 enthält und die SP6-Polymerase verwendet wurden. Die RNA wurde nach der Methode hergestellt, die in der Patentanmeldung EP 1 083 232 beschrieben ist. In einigen Fällen wurde die RNA dadurch stabilisiert, dass Protamin im Verhältnis von 1/1 Gramm benutzt wurde. Zwanzig Mikroliter RNA wurden hinter jedes Ohr von BALB/c-Mäusen für eine Gesamtmenge von 40 Mikrogramm pro Maus injiziert.
Zur Immunisierung wurden Gruppen von 4 bis 6 weiblichen BALB/c-Mäusen im Alter von 6 bis 8 Wochen verwendet.

Quantifizierung von T-Zellen, die für ein HIV-Epitop spezifisch sind und IFN-γ herstellen

Zellen, die Interferon-Gamma (IFN-γ) freisetzen, wurden mit einem ELISPOT quantifiziert wie es weiter oben nach Stimulation durch die 13 HLA-A2-Epitope beschrieben ist die durch das Plasmid pCMV-B10 codiert werden. ELISA Platten mit einem ebenen Nitrozellulose-beschichteten Boden werden mit 50 Mikroliter anti-murin IFN-γ-Antikörper der Ratte (5 µg/ml, Pharmingen, San Diego, CA) über Nacht bei 4°C bedeckt, und dann für zwei Stunden bei 37°C mit RPMI 1640 gesättigt, das 10% fötales Kälberserum enthielt. Milzzellen (1 × 10⁶/Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen), die, wie oben für die CTL-Experimente beschrieben, gewonnen wurden, wurden 40 Stunden in α-MEM-Komplettmedium bei 37°C in Gegenwart von 5% CO₂ inkubiert, wobei verschiedene Antigene zur Stimulation dienten. Die Zellen wurden separat mit den HIV Epitopen inkubiert. (Bitte die Konzentration präzisieren, und ob die Inkubationen jeweils mit einem einzelnen Peptid oder mit Peptidgemischen durchgeführt wurden.) Der Hintergrund wurde mit Zellen in Medium ermittelt. Die Zellen wurden aufgenommen, indem die Platten gepuffert wurden. Anschließend wurden sie mit Wasser lysiert. Nach Reinigung mit PBS (0,05% Tween 20) wurde ein biotinylierter anti-murin IFN-γ-Antikörper der Ratte (1 µg/ml, Pharmingen, San Diego, CA) für eine 90minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzugegeben. Die Vertiefungen wurden wie vor der Inkubation gewaschen, wonach eine Verdünnung von alkalischer Phosphatase-Streptavidin von 1 : 1000 in PBS (Boehringer-Mannheim, Deutschland) 1 h 30 min benutzt wurde. Schließlich wurde eine 2,3 nM Lösung von 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (BCIP) und von Nitroblue-Tetrazolium (NBT) hinzugefügt, die in einer alkalischen Pufferlösung verdünnt war. Wenn die Spots sichtbar wurden, wurde die Reaktion mit Wasser gestoppt und luftgetrocknet. Die Zahl der Spots, die IFN-γ freisetzten, wurde mit Hilfe eines ELISPOT Lesegeräts (Zeiss) ermittelt, und die Ergebnisse sind als Mittelwert für jede Gruppe als IFN-γ sekretierende Zellen pro 10⁶ Zellen dargestellt.
Die Ergebnisse sind in Abb. 6 wiedergegeben.
Bitte bestätigen, daß die zwei vorstehenden Paragraphen tatsächlich dem entsprechen, was die Erfinder auf der Seite 27 angemerkt haben. LITERATUR Binder, R. J. A. Horowitz, et al (1994). "Evidence that the pathway of transferin receptor mRNA degradation involves an endonucleolytic cleavage within the 3' UTR and does not involve poly(A) tail shortening." EMBO J 13(8): 1969-80.
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Claims

1. Immunogene Präparation, enthaltend eine Messenger RNA, die für wenigstens ein Antigen eines pathogenen Agens codiert.

2. Immunogene Präparation nach Anspruch 1, wobei die RNA eine nicht-replikative reife Messenger RNA ist.

3. Immunogene Präparation nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Sequenz der RNA zusätzlich Stabilisierungssequenzen enthält die der Erhöhung der Halbwertszeit der RNA im Cytosol dienen.

4. Immunogene Präparation nach Anspruch 3, wobei mindestens ein Teil bzw. Abschnitt der Stabilisierungssequenzen ausgewählt ist aus den transkribierten und nicht nicht-translatierten (UTR- Sequenzen des β-Globingens und der Konsensussequenz (C/U)CCANxCCC(U/A)PyXUC(C/U)CC, die im 3'UTR der für α-Globin, α(I)-Collagen, 15-Lipoxygenase und Tyrosinhydroxylase codierenden RNAs enthalten ist.

5. Immunogene Präparation nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die RNA am 3'-Ende einen Poly A-Schwanz aus mehr als 30 A-Resten in 3-Position aufweist.

6. Immunogene Präparation nach einem der Ansprüche 1-5, wobei die RNA in Gegenwart von modifizierten Ribunucleosiden synthetisiert wird, um ihr eine Resistenz gegenüber dem Abbau durch RNasen zu verleihen.

7. Immunogene Präparation nach Anspruch 6, wobei die RNA Phosphorthioate enthält.

8. Immunogene Präparation nach einem der Ansprüche 1-7, wobei die RNA im wesentlichen frei von AURES- Destabilisierungssequenzen und von Endonuklease- Erkennungssequenzen ist.

9. Immunogene Präparation nach einem der Ansprüche 1-8, wobei die RNA zusätzlich eine Sequenz enthält, welche ihre Translation erhöht.

10. Immunogene Präparation nach einem der Ansprüche 1-9, zusätzlich enthaltend mindestens einen RNA-Stabilisierungsfaktor, insbesondere einen RNase-Inhibitor.

11. Immunogene Präparation nach einem der Ansprüche 1-10, wobei die RNA mit mindestens einem kationischen, vorzugsweise polykationischen, Peptid oder Protein komplexiert ist.

12. Immunogene Präparation nach Anspruch 11, wobei das Peptid oder Protein ein Protamin, Poly-L-Lysin, Poly-L-Arginin oder Histon ist.

13. Immunogene Präparation nach einem der Ansprüche 1-12, zusätzlich enthaltend ein Adjuvans oder mehrere Adjuvanzien.

14. Immunogene Präparation nach Anspruch 13, enthaltend mindestens ein immunmodulierendes Mittel, das aus Lipopolysacchariden (LPS), dem Glycoprotein 96, CpG-enthaltenden Oligonukleotiden und Cytokinen ausgewählt ist.

15. Immunogene Präparation nach den Ansprüchen 13 und 14, wobei die RNA vor der Zugabe des Adjuvans oder der Adjuvanzien hoch gereinigt wird.

16. Immunogene Präparation nach einem der Ansprüche 1-15, wobei die Zusammensetzung zur kutanen oder intradermalen Verabreichung formuliert ist.

17. Immunogene Präparation nach einem der Ansprüche 1-16, wobei die RNA ein Gemisch von Messenger RNAs ist.

18. Immunogene Präparation nach einem der Ansprüche 1-17, wobei mindestens ein Teil bzw. Abschnitt der RNA-Moleküle eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) enthält.

19. Immunogene Präparation nach Anspruch 17 oder 18, wobei mindestens ein Teil bzw. Abschnitt der RNA-Moleküle für Cytokine codiert, die zur Stimulierung oder zur Polarisierung der Immunantwort befähigt sind.

20. Immunogene Präparation nach einem Ansprüche 1-19, wobei die für mindestens ein Antigen eines pathogenen Agens codierende Sequenz für ein Polyepitop codiert.

21. Immunogene Präparation nach einem der Ansprüche 1-19, wobei die Sequenz der für mindestens ein Antigen eines pathogenen Agens codierenden RNA für mindestens ein vollständiges oder verkürztes virales oder bakterielles Protein codiert.

22. Immunogene Präparation nach Anspruch 21, wobei mindestens ein Teil bzw. Abschnitt der RNA-Moleküle für ein Oberflächenantigen des Hepatitis-B-Virus codiert.

23. Immunogene Präparation nach Anspruch 22, wobei mindestens ein Teil bzw. Abschnitt der RNA Moleküle für die kleinen und mittleren Hüllproteine des Hepatits-B-Virus codiert.

24. Immunogene Präparation nach Anspruch 23, wobei mindestens ein Teil bzw. Abschnitt der RNA Moleküle die in der Abb. 1 dargestellten Sequenz aufweist.

25. Immunogene Präparation nach Anspruch 20, wobei mindestens ein Teil bzw. Abschnitt der RNA-Moleküle für ein Polyepitop von HIV codiert.

26. Immunogene Präparation nach Anspruch 25, wobei mindestens ein Teil bzw. Abschnitt der RNA-Moleküle die in der Abb. 2 dargestellte Sequenz aufweist.

27. Immunogene Präparation nach Anspruch 21, wobei mindestens ein Teil bzw. Abschnitt er RNA-Moleküle für das CORE-Protein des Hepatitis-C-Virus codiert.

28. Verwendung eines immunogenen Präparats nach einem der Ansprüche 1-27 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Prophylaxe oder Behandlung oder Verbesserung des Zustands eines Patienten infolge einer Infektion durch HIV, Hepatitis-B-Virus, Hepatitis-C-Virus, Rous-Sarkom- Virus, die für Malaria verantwortlichen Parasiten oder Chlamydia Pneumoniae.

29. Vakzin, dadurch gekennzeichnet, daß es eine immunogene Präparation nach einem der Ansprüche 1-27 enthält, welche es erlaubt, in einem menschlichen oder tierischen Wirt einen Schutz gegenüber einem pathogenen Agens hervorzurufen.

30. Vakzine nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß der Schutz durch eine Aktivierung cytotoxischer T-Lymphozyten und/oder T-Helfer-Lymphozyten und B-Lymphozyten bewirkt wird, die mindestens für ein Antigen spezifisch sind, das von mindestens einem Teil bzw. Abschnitt der RNA-Moleküle der Präparation codiert wird.