mRNA-Gemisch zur Vakzinierung gegen Tumorerkrankungen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gemisch, welches mRNA zur Vakzinierung enthält, wobei mindestens eine mRNA einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodieren- den Bereich enthält und mindestens eine weitere mRNA einen für mindestens ein immuno- genes Protein kodierenden Bereich enthält. Weiterhin betrifft die Erfindung eine pharmazeu¬ tische Zusammensetzung, welche ein erfindungsgemäßes mRNA-Gemisch enthält, sowie die Verwendung zur Behandlung von Tumorerkrankungen.
In der Therapie und Prävention zahlreicher Erkrankungen spielen molekularmedizinische Verfahren, wie die Gentherapie und die genetische Vakzinierung, eine große Rolle. Basis die¬ ser Verfahren ist die Einbringung von Nukleinsäuren in Zellen bzw. Gewebe des Patienten, gefolgt von der Verarbeitung der durch die eingebrachten Nukleinsäuren kodierten Informa¬ tionen, d.h. der Expression der erwünschten Polypeptide bzw. Proteine. Als einzubringende Nukleinsäuren kommt hierbei sowohl DNA als auch RNA in Betracht.
Die bisher üblichen Verfahren der Gentherapie und der genetischen Vakzinierung basieren auf der Verwendung von DNA, um die benötigte genetische Information in die Zelle einzu¬ schleusen. In diesem Zusammenhang sind verschiedene Verfahren zur Einbringung von DNA in Zellen, wie bspw. Caldumphosphat-Transfektion, Polypren-Transfektion, Protoplas¬ ten-Fusion, Elektroporation, Mikroinjektion und lipofektion, entwickelt worden, wobei sich insbesondere die lipofektion als geeignetes Verfahren herausgestellt hat. Ebenfalls kommt die Verwendung von DNA-Viren als DNA-Vehikel. Derartige Viren erzielen aufgrund ihrer infektiösen Eigenschaften eine sehr hohe Transfektionsrate. Die verwendeten Viren werden bei diesem Verfahren genetisch verändert, damit in der transfizierten Zelle keine funktionsfä-
higeα infektiösen Partikel gebildet werden. Trotz dieser Vorsichtsmaßnahme kann jedoch, z.B. aufgrund möglicher Rekombinationsereignisse, ein Risiko der unkontrollierten Ausbrei¬ tung der eingebrachten gentherapeutisch wirksamen sowie viralen Gene nicht ausgeschlossen werden.
Wie erwähnt, kommt in der Gentherapie neben DNA auch RNA als verwendbare Nuklein¬ säure in Betracht. Und obwohl im Stand det Technik bekannt ist, dass die Instabilität von mRNA bzw. von RNA im allgemeinen ein Problem in der Anwendung von medizinischen Verfahren, die auf RNA-Expressionssystemen beruhen, darstellen kann, stellen RNA- Expressionssysteme gegenüber DNA-Expressionssystemen in der Gentherapie und in der genetischen Vakzinierung erhebliche Vorteile dar. Hierzu gehört u.a., dass eine in eine Zelle eingebrachte RNA nicht in das Genom integriert, während bei Verwendung von DNA (z.B. als DNA-Vehikel, die von DNA-Viren abgeleitet werden), die in eine Zelle eingebracht wird, diese DNA in gewissem Ausmaß in das Genom integriert. Dies birgt die Gefahr, dass die DNA in ein intaktes Gen des Genoms der Wirtszelle inseriert, mit der Folge, das dieses Gen mutiert und damit vollständig oder teilweise inaktiviert werden kann oder zu einer Fehlinfor¬ mation führt. D.h., die Synthese eines für die Zelle lebenswichtigen Genprodukts kann voll¬ ständig ausgeschaltet werden oder aber ein verändertes oder falsches Genprodukt wird exprimiert. Eine besondere Gefahr besteht dann, wenn die Integration der DNA in ein Gen erfolgt, das in die Regulation des Zellwachstums involviert ist. In diesem Fall kann die Wirts¬ zelle in einen entarteten Zustand gelangen und zur Krebs- bzw. Tumorbildung führen. Dar¬ über hinaus ist für die Expression einer in die Zelle eingebrachten DNA erforderlich, dass die entsprechenden DNA-Vehikel einen starken Promotor, wie den vitalen CMV-Promotor, ent¬ halten. Die Integration derartiger Promotoren in das Genom der behandelten Zelle kann zu unerwünschten Veränderungen der Regulierung der Genexpression in der Zelle führen. Im Gegensatz dazu sind bei der Verwendung von RNA als Vakzine keine vitalen Sequenzen, wie Promotoren etc., zur wirksamen Transkription, erforderlich.
Eine weitere Gefahr bei der Verwendung von DNA als Vakzine (oder Gentherapeutikum) ist die Induktion pathogener Anti-DNA-Antikörper in dem Patienten, in den die Fremd-DNA eingebracht wird, unter Hervorrufung einer - möglicherweise tödlichen - Immunantwort. Im
Gegensatz dazu sind bisher keine anti-RNA-Antikörper nachgewiesen worden. Ursächlich
hierfür wird die Tatsache sein, dass RNA wesentlich einfacher in vivo, also in dem Organismus des Patienten, abgebaut wkd. RNA besitzt gegenüber DNA relativ kurze Halbwertszeiten im Blutkreislauf.
Trotz der erwähnten mannigfaltigen Vorteile der Verwendung von RNA gegenüber DNA in molekulargenetischen Verfahren, stellt die bereits erwähnte Instabilität der RNA ein Problem dar. Verantwortlich für die Instabilität der RNA sind insbesondere RNA-abbauende Enzyme, sog. RNAasen (Ribonucleasen), wobei selbst die kleinsten Verunreinigungen mit Ribonuclea- sen reichen ausreichen, um RNA in Lösung vollständig abzubauen. Daneben gibt es zahlrei- che weitere Prozesse, welche die RNA destabilisieren. Viele diese Prozesse sind noch unbe¬ kannt, oftmals scheint jedoch eine Wechselwirkung zwischen der RNA und Proteinen dafür maßgeblich zu sein. Auf der anderen Seite sind auch zahlreiche Phänomene bekannt, die eine RNA stabilisieren.
In diesem Zusammenhang sind im Stand der Technik einige Maßnahmen vorgeschlagen worden, die Stabilität von RNA zu erhöhen und dadurch ihren Einsatz als Gentherapeutikum bzw. RNA-Vakzine zu ermöglichen.
In EP-A-1083232 wird zur Lösung des Problems der Instabilität von RNA ex vivo ein Verfah- ren zur Einbringung von RNA, insbesondere mRNA, in Zellen und Organismen vorgeschla¬ gen, bei welchem die RNA in Form eines Komplexes mit einem kationischen Peptid oder Protein vorliegt.
WO 99/14346 beschreibt weitere Verfahren zur Stabilisierung von mRNA. Insbesondere werden Modifizierungen der mRNA vorgeschlagen, welche die mRNA-Spezies gegenüber dem Abbau von RNasen stabilisieren. Derartige Modifikationen betreffen einerseits die Stabi¬ lisierung durch. Sequenzmodifikationen, insbesondere die Verminderung des C- und/oder U- Gehalts durch Baseneliminierung oder Basensubstitution. Andererseits werden chemische Modifikationen, insbesondere die Verwendung von Nukleotidanaloga, sowie 5'- und 3'- BIo- ckierungsgruppen, eine erhöhte Länge des Poly-A-Schwanzes sowie die Komplexierung der mRNA mit stabilisierenden Mitteln und Kombinationen der genannten Maßnahmen vorge¬ schlagen.
In den US-Patenten US 5,580,859 und US 6,214,804 werden unter anderem im Rahmen der "transienten Gentherapie" (TGT) mRNA-Vakzine und -Therapeutika offenbart. Es werden verschiedene Maßnahmen zur Erhöhung der Translationseffizienz und der nαRNA-Stabüität beschrieben, die sich vor allem auf die nicht-translatierten Sequenzbereiche beziehen.
Bieler und Wagner (in: Schleef (Hrsg.), Plasmids for Therapy and Vaccination, Kapitel 9, Sei¬ ten 147 bis 168, Wiley-VCH, Weinheim, 2001) berichten von der Verwendung synthetischer Gene im Zusammenhang mit gentherapeutischen Methoden unter Verwendung von DNA- Vakzinen und lentiveralen Vektoren. Es wird die Konstruktion eines synthetischen, von HIV- 1 abgeleiteten
beschrieben, bei welchem die Codons gegenüber der Wildtyp- Sequenz derart modifiziert wurden (alternative Codonverwendung, engl, "codon usage"), dass sie der Verwendung von Codons entsprach, die in hoch exprimierten Säugergenen zu finden ist. Dadurch wurde insbesondere der A/T-Gehalt gegenüber der Wildtyp-Sequenz vermiti- dert. Die Autoren stellen insbesondere eine erhöhte Expressionsrate des synthetischen gag- Gens in ttansfizietten Zellen fest. Des weiteren wurde in Mäusen eine erhöhte AntLkörperbil- dung gegen das gag-Viotάn bei mit dem synthetischen DNA-Konstrukt immunisierten Mäu¬ sen und auch eine verstärkte Cytokinfreisetzung in vitro bei ttansfizierten Milzzellen von Mäu¬ sen beobachtet. Schließlich konnte eine Induzierung einer cytotoxischen Immunantwort in mit dem
immunisierten Mäusen festgestellt werden. Die Autoren dieses Artikels führen die verbesserten Eigenschaften ihrer DNA-Vakzine im wesentlichen auf einen durch die optimierte Codonverwendung hervorgerufene Veränderung des Nukleo- cytoplasmatischen Transports der vom DNA-Vakzin exprimierten mRNA zurück. Im Ge¬ gensatz dazu halten die Autoren die Auswirkung der veränderten Codonverwendung auf die Translationseffizienz für gering.
Zwischenzeitlich werden im Stand der Technik auch Verfahren beschrieben, die auf einer mRNA-Vakzinierung basieren sowie hierfür verwendbare Zusammensetzungen, bei denen mRNA vorzugsweise stabilisiert wird.
So beschreibt WO 02/098443 eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine stabilisierte mRNA enthält und als Vakzine zur Behandlung von Krebs- und Infektionserkrankungen
sowie zur Geweberegeneration verwendet wird. Die mRNA kodiert für ein biologisch wirk¬ sames oder antigenes Peptid und wird insbesondere durch Erhöhung des C/G-Gehalts in der kodierenden Region stabilisiert.
Die WO 03/051401 beschreibt eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine mRNA enthält, die ein Tumorantigen kodiert, und ggf. ein Cytokin enthält zur Behandlung und Pro¬ phylaxe von Krebserkrankungen. Auch hier werden verschiedene Varianten zur Stabilisierung der mRNA in dieser Zusammensetzung beschrieben.
Im Stand der Technik werden jedoch keine mRNA-Vakzine beschrieben, die auch die Auslö¬ sung einer Immunantwort in dem Organismus, dem sie appliziert werden, sicherstellen bzw. erhöhen bzw. erleichtern. Dies wäre jedoch von erheblichem Vorteil, da der Organismus (Pa¬ tient) einer erhöhten Belastung, durch beispielsweise mehrfache Applikationen, erhöhte Do¬ sierungen etc., ausgesetzt werden könnte oder müßte, wenn die mRNA-Vakzinierung nicht oder nicht in dem gewünschten Ausmaß erfolgreich verläuft. Hierdurch wird auch das Risiko auftretender Nebenwirkungen gegen die Vakzine erhöht.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein neues System zur Genthe¬ rapie oder genetischen Vakzinierung bereitzustellen, das zum einen die Nachteile der Ver- wendung von DNA-Therapeutika und DNA-Vakzinierung beseitigt und zum anderen eine effektivere Wirkung von auf mRNA basierenden Therapeutika und Vakzinen erzielt.
Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.
Ein Gegenstand der Erfindung betrifft demnach ein Gemisch, das mRNA zur Vakzinierung enthält, wobei mindestens eine mRNA einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält und mindestens eine weitere mRNA einen für mindestens ein immunogenes Protein kodierenden Bereich enthält.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass nahezu jeder Organismus sogenannte „Gedächtnis-Immunantworten" gegen gewisse Fremd-Moleküle, z.B. Proteine, insbesondere
virale Proteine, Antigene, besitzt. Das bedeutet, dass ein Organismus bereits zu einem frühe¬ ren Zeitpunkt mit einem solchen Fremd-Molekül infiziert worden ist, und dass durch diese Infektion bereits eine Immunantwort gegen dieses Fremd-Molekül, z.B. ein vitales Protein, ausgelöst wurde, die dem Immunsystem im „Gedächtnis" bleibt, d.h. die es speichert. Bei einer erneuten Infektion mit dem gleichen Fremd-Molekül wird diese Immunantwort reakti¬ viert. Erfindungsgemäß kann eine solche Reaktivierung der Immunantwort durch die Vakzi¬ nierung mit dem erfindungsgemäßen Gemisch erfolgen, und zwar durch die in dem Gemisch enthaltene mRNA, die einen für mindestens ein immunogenes Protein kodierenden Bereich enthält. Diese Reaktivierung kann erfindungsgemäß sogar ortsspezifisch, nämlich am Ort der Applikation des Gemisches, z.B. Applikation in ein Tumorgewebe, erfolgen. Hierdurch kann die Auslösung einer (neuen) Immunantwort gegen das oben beschriebene Fremd-Molekül (gegen das eine Gedächtnis-Immunantwort vorliegt) unterstützt/erleichtert werden.
„Vakzinierung" bzw. „Impfung" bedeutet im allgemeinen die Einbringung eines oder mehre- v rer Antigene eines Tumors oder im Sinne der Erfindung die Einbringung der genetischen Information für ein oder mehrere Antigen(e) eines Tumors in Form der für das/die Anti¬ gen^) eines Tumors kodierenden mRNA in einen Organismus, insbesondere in ei¬ ne/mehrere ZeEe/Zellen bzw. Gewebe dieses Organismus. Die so verabreichte mRNA wird in dem Organismus bzw. in dessen Zellen in das (Tumor-)Antigen translatiert, d.h. das von der mRNA kodierte Antigen (auch: antigenes Polypeptid oder antigenes Peptid) wird expri- miert, wodurch eine gegen dieses Antigen gerichtete Immunantwort stimuliert wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung bedeutet ein „Antigen aus einem Tumor" oder auch „Tumorantigen", dass das entsprechende Antigen in Zellen exprimiert wird, die mit einem Tumor assoziert sind. Insbesondere handelt es sich hierbei um Antigene, die in den entarteten Zellen (Tumorzellen) selbst produziert werden. Vorzugsweise handelt es sich hierbei um An¬ tigene, die auf der Oberfläche der Zellen lokalisiert sind. Weiterhin sind erfindungsgemäß auch solche Antigene aus Tumoren umfasst, die in Zellen exprimiert werden, die nicht selbst entartet sind oder ursprünglich nicht selbst entartet waren, jedoch mit dem vorstehend er- wähnten Tumor assoziiert sind. Dazu gehören zum Beispiel auch Antigene, die mit Tumor¬ versorgenden Gefäßen bzw. deren Bildung oder Neubildung zusammenhängen, insbesondere solche Antigene, die mit der Neovaskularisierung oder Angiogenese assoziiert sind, z.B.
Wachstumsfaktot en wie VEGF, bFGF, usw. Weiterhin umfassen derartige mit einem Tumor zusammenhängende Antigene auch Antigene, die aus Zellen des Gewebes stammen, die den Tumor einbetten. Hierbei kann es sich beispielsweise um Antigene von Bindegewebszellen, z.B. Antigene der extrazellulären Matrix, handeln. Das erfindungsgemäße Gemisch kann (mindestens eine) mRNA enthalten, die von 1 bis 50, vorzugsweise 1 bis 10 solcher Antigene aus einem Tumor kodiert/kodieren.
Beispiele für derartige Tumorantigene sind 707-AP, AFP, ART-4 (Adenocarcinoma recogni- zed Antigen; AB026125), BAGE, ß-Catenin/m, Bcr-abl, CAMEL (AJ012835), CAP-1, CASP- 8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, z.B. GAGE-4, GnT-V, GP 100HAGE, HAGE, HAST-2, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, hTERT (oder hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, z.B. LAGE-I, LDLR/FUT, MAGE, z.B. MAGE-A, MAGE-B, MAGE-C, MAGEAl, MAGEA2 (L18920), MAGE-A3, MAGE-A4 (U10687), MAGE-A6, MAGE-AlO; MClR (Melanocyte Stimulating Hormone Receptor; X65634), Myosin/m, Melan-A, Melan-A/MART-1, Mucl, Mucin-1, MUM-I, -2, - 3, NA88-A, NY-ESO-I, NY-ESO-I /LAGE-2, pl90 minor bcr-abl, Pml/RARα, PRAME (U65011), Proteinase 3, PSA, PSM, RAGE, z.B. RAGE-3 (Ü46193), RUl oder RU2, SAGE, SART-I (AB006198), SART-2 (AF098066) oder SART-3 (AB020880), SCPl, SSX, z.B. SSX2 (X86175), Survivin, TEL/ AMLl, TPI/m, TRP-I, TRP-2, TRP-2/INT2, Tyrosinase und WTl (BC046461), VEGF (M32977), VEGFR-2 (AF063658), VEGFR-I (XM_497921), PDGF-R (BC032224), Her3 (M34309), Ep-CAM (KSA bzw. GA733-2; M32325 bzw. M33011), PSMA (AF007544), PSA (M26663), PSCA (AF043498), Vimentin (Z19554), Adi- pose Differentiation Antigen (X97324), ß-Actin (Ml 0277), Met-Protoonkogen 002958), Iso¬ form G250 der Carbonanhydrase (X66839), Cytochrom P450 (AF450132), Cyclin Dl (X59798), Cyclin (M15796), DAM (X82539), HCV-Polyprotein (L20498), p53 (M14695), MDM2 (X58876), Sperm-Protein (AF015527), Adenovirus-Protein E3, α-Actinin 4, CD4- Cyclin-abhängige Proteinkinase, KIAA 0020 (D13645), Malic Enzyme (L34035), MYO IG, Pmell7 (M77348), Wegner's Autoantigen (X56132), Silencing Information Regulator 2-like Protein (AF095714), Ribosomal Protein S2 (BC001795), Multidrug Resistance Protein-3 (Y17151), Adenovirus-Protein EIa, Adenovirus EIb, Bcr-AbL PR33 E/L-Selectin, Recoverin, hTERT, und CMV pp65.
Besonders bevorzugte Tumorantigene sind MAGE, insbesondere MAGE-Al und MAGE- A6, Melan-A, GP100, Tyrosinase, Survivin, CEA (Carcino Embryonic Antigen), Her-2/neu und Mucin-1. Weiterhin bevorzugt ist es, wenn ein erfindungsgemäßes RNA-Gemisch min¬ destens ein vitales Tumorantigen (bspw. HPV-E7 oder HCV-Polyprotein oder Adenovkus- Protein E3, EIa oder EIb) enthält, ggf. in Kombination mit mindestens einem originär hu¬ manen, vorzugsweise autologen Tumorantigen des zu behandelnden Patienten. Bevorzugt handelt es sich bei dem autologen Tumorantigen um eines der vorgenannten Antigene, insbe¬ sondere MAGE, hierbei insbesondere MAGE-Al und MAGE-A6, Melan-A, GP100, Tyrosi¬ nase, Survivin, CEA (Carcino Embryonic Antigen), Her-2/neu, Mucin-1, PSA, p53, Bcr-Abl, PDGFR, Her3 oder Cyclin. Ganz besonders bevorzugt liegt in einem erfindungsgemäßen RNA-Gemisch ein oder zwei verschiedene vitale Tumorantigene in Kombination mit 2 bis 6 verschiedenen autologen Tumorantigenen des Patienten vor. Im Falle eines RNA-Gemisches ohne vitale Tumorantigene ist es ebenfalls bevorzugt, dass dieses 2 bis 6 verschiedene Tu¬ morantigene, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe der vorgenannten Tumorantigene, enthält.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung kodiert die mindestens eine mRNA des Gemisches, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodie¬ renden Bereich enthält, für ein Antigen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MAGE, insbesondere MAGE-Al und MAGE-A6, Melan-A, GP100, Tyrosinase und Survivin.
Eine ebenfalls bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Ge¬ misch, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für ein Antigen kodiert, das aus der Gruppe bestehend aus MAGE, insbesondere MAGE-Al, CEA (Carcino Embryonic Antigen), Her-2/neu, Mu- cin-1 und Survivin ausgewählt ist.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Gemisch, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für ein Antigen kodiert, das aus der Gruppe bestehend aus Te- lomerase TERT, PR3, WTl, PRAME, Mucin-1 und Survivin.
In einer weiteten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kodiert die mindestens eine mRNA des Gemisches, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tu¬ mor kodierenden Bereich enthält, für ein Antigen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TNC (Tenascin C), EGFRI, SOX9, SEC61G und PTPRZl.
Eine weitere bevorzugte Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Gemisch, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für ein Antigen kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acession number M77481, Accession number NM_005363, Accession number NM_005511, Accession number M77348, Accession number NM_000372 und Accession number AF077350.
Eine ebenfalls bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Ge¬ misch, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für ein Antigen kodiert, ausgewählt aus der Gruppe be¬ stehend aus Acession number M77481, Accession number NM_004363, Accession num¬ ber Ml 1730, Accession number NM_002456 und Accession number AF077350.
Eine weitere bevorzugte Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Gemisch, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für ein Antigen kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Accession number NM_003219, Accession number NM_002777, Accession number NM_000378, Accession number NM_006115, Accession number NM_002456]und Accessi¬ on number AF077350.
Eine weiterhin bevorzugte Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Ge¬ misch, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für ein Antigen kodiert, ausgewählt aus der Gruppe be¬ stehend aus Accession number X78565, Accession number AF288738, Accession number Z46629, Accession number NM_014302 und Accession number NM_002851.
Sämtliche in der vorliegenden Erfindung aufgeführten Accession numbers (Zugriffsnum¬ mern) beziehen sich auf die jeweiligen Proteinsequenzen, erhalten aus der ncbi (PubMed)- Datenbank, im Internet unter http://www.ncbi.nlm.nui.gov/entrez/query.fcgi (bzw. http://www.ncbi.nkn.nih.gov/ entrez/que:ty.fcgi?db=Protein&itool=toolbar).
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das oder sind die Antigen(e) aus einem Tumor ein Polyepitop des/der Antigens/Antigene aus einem Tumor. Ein „Polyepi- top" eines Antigens bzw. mehrerer Antigene ist eine Aminosäuresequenz, in der mehrere oder viele Regionen des/der Antigens/Antigene repräsentiert werden, die mit dem Antigen- bindenden Teil eines Antikörpers oder mit einem T-Zell-Rezeptor in Wechselwirkung treten. Das Polyepitop kann dabei vollständig und unmodifiziert vorliegen. Es kann jedoch gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere zur Optimierung der Antikörper/ Antigen- bzw. T- Zell-Rezeptor/Antigen-Wechselwirkung, auch modifiziert vorliegen. Eine Modifikation ge¬ genüber dem Wildtyp-Polyepitop kann bspw. eine Deletion, Addition und/ oder Substitution eines oder mehrerer Aminosäurereste umfassen. Dementsprechend wird/werden in der für das modifizierte Polyepitop kodierenden mRNA der vorliegenden Erfindung gegenüber der für das Wildtyp-Polyepitop kodierenden mRNA ein oder mehrere Nukleotide entfernt, hin¬ zugefügt und/ oder ersetzt.
„Immunogenes Protein" im Sinne der Erfindung betrifft ein „Fremdprotein", insbesondere ein „Protein eines Pathogens", das eine Immunantwort auslöst, sofern es in einen fremden Organismus gelangt. Die Begriffe „immunogenes Protein", „Fremdprotein" und „Protein eines Pathogens" sind synonym zu verwenden. Weiterhin steht der Begriff „Protein" syn¬ onym auch für „Polypeptid" und „Peptid". Bei einem solchen immunogenen Protein handelt es sich insbesondere um ein virales oder bakterielles Protein oder ein Pilz-Protein. Erfin¬ dungsgemäß sind jedoch auch Proteine jedes beliebigen anderen Pathogens umfasst. Das Auslösen der Immunantwort erfolgt in der Regel durch die Infektion des fremden Organis¬ mus (z.B. einem Säugetier, insbesondere einem Mensch) mit einem pathogenen Organismus, z.B. einem Virus, der dieses immunogene Protein enthält oder auf der Oberfläche trägt und durch den Infektionsvorgang mit in den fremden Organismus einbringt. Es ist bevorzugt, dass in dem Organismus, der einmal mit einem solchen immunogenen Protein infiziert wird, die dadurch ausgelöste Immunantwort gespeichert wird, und dass bei einer erneuten Infekti-
on mit diesem Protein diese Immunantwort reaktiviert wird. Es liegt demnach eine sog. Ge- dächtois-Immunantwort gegen das immunogene Protein vor. Ein Beispiel für einen solchen Vorgang gibt ein weit verbreitetes Virus, mit dem sich beispielsweise nahezu jedes erwachse¬ ne Individuum, insbesondere der Mensch, in seinem Leben bereits infiziert hat, und zwar das Influenza A oder B Virus. Bei dieser Infektion wird eine Immunantwort gegen die Influenza- Virusproteine, einschließlich der Influenza-Matrixproteine, gebildet. Gelangt ein solches In¬ fluenza-Virusprotein, insbesondere ein Influenza-Matrixprotein, erneut in den bereits früher infizierten Organismus, reaktivert dieser die Immunantwort gegen das/die Protein(e).
Immunogene Proteine im Sinne der Erfindung sind vorzugsweise Strukturproteine von Viren, insbesondere Matrixproteine, Capsidproteine und Oberflächenproteine der Iipidmembran. Weitere Beispiele für solche vitalen Proteine sind Proteine von Adenovken, Rhinoviren, Co- rona-Viren. Besonders bevorzugt ist hierbei das Hepatitis B Oberflächen-Antigen („Hepatitis B Surface Antigen", nachfolgend als „HBS-Antigen" bezeichnet). Das HBS-Antigen [Acces- sion number E00121] ist ein fremdes Antigen, das für die meisten Organismen, insbesondere Säugetiere, vor den allem Mensch, die weder mit dem Hepatits B Virus (HBV) infiziert sind oder waren oder gegen HBV vakziniert wurden, ein neues Antigen darstellt. Der Nachweis einer Immunreaktion auf fremde Antigenen erfolgt in der Regel effizienter als auf eigene An¬ tigene, wie Tumorantigene, da Zellen, die diese eigenen Antigene tragen, meistens durch das Immunsystem inaktiviert oder zerstört werden, um eine Autoimmunität zu vermeiden. Eine Immunreaktion auf das HBS-Antigen, kann daher einen Surrogat-Marker für die Effizienz des verabreichten erfindungsgemäßen Gemisches dienen. Weiterhin kann das HBS-Antigen im Zusammenwirken mit einem weiteren immunogenen Protein der Erfindung die Immun¬ antwort des Organismus, dem das erfindungsgemäße Gemisch verabreicht wird, erheblich verstärken. Ein weiteres bevorzugtes immunogenes Protein ist das CMV pp65 [Accession number Ml 5120].
Ein ganz besonders bevorzugtes immunogenes Protein ist das Influenza-Matixprotein, ge¬ nauer das Influenza Matrix-Ml -Protein. Es sind zwei Typen des Influenzavirus bekannt, das Influenza A Virus und das Influenza B Virus. Für beide Typen sind verschiedene Sero-Typen bekannt, die jeweils leichte Sequenzunterschiede zueinander aufweisen. Eine bevorzugte Aus¬ führungsform der Erfindung betrifft daher ein Gemisch, in welchem die mindestens eine
rrϊRNA, die einen für mindestens ein immunogenes Protein odet Polypeptid kodierenden Bereich enthält, für ein Matrixprotein, bevorzugt ein Influenza-Matrixprotein, besonders be¬ vorzugt das Influenza A-Matrix-Ml -Protein oder das Influenza B-Matrix-Ml -Protein kodiert.
Konsequenterweise betrifft eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Gemisch, in welchem die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein immuno- genes Protein kodierenden Bereich enthält, für ein Matrixprotein, bevorzugt ein Influenza- Matrixprotein, besonders bevorzugt das Influenza A-Matrix-Ml -Protein oder das Influenza B-Matrix-Ml-Protein, oder für HBS oder für CMV pp65 kodiert.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Gemisch, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein immunogenes Protein kodie¬ renden Bereich enthält, für ein immunogenes Protein kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Accession number AF348197, Accession number VOl 099, Accession number E00121 und Accession number M15120.
Beispiele für bevorzugte erfindungsgemäße immungenetische Proteine sind Proteine weit verbreiteter Pathogene, d.h. Pathogene, mit denen mit großer Wahrscheinlichkeit jeder Orga¬ nismus, insbesondere Säugetiere, bevorzugt der Mensch, mindestens einmal in seinem Leben infiziert wird. Hierzu zählen beispielsweise jedes Struktur- oder Nicht-Strukturprotein von:
- Influenzavirus Typ A oder B oder jedes anderen Orthomyxoviren (Influenza Typ C),
- Picornaviren, wie Rhinovirus oder Hepatitis A Virus,
- Togaviren, wie Alphavirus oder Rubivirus, z.B. Sindbis, Semliki-Forest oder Rubeo- lavirus (Masernvirus), Rubellavirus (Röteinvirus),
- Coronaviren, insbesondere die Subtypen HCV-229E oder HCV-OC43,
- Rhabdovken, wie Rabiesvirus,
- Paramyxoviren, wie Mumpsvirus,
- Reoviren, wie Rotavirus der Gruppe A, B oder C, - Hepadnaviren, wie Hepatitis B Virus,
- Papoviren, wie humane Papillomaviten (HPV) jedes Serotyps (von 1 bis 75),
- Adenoviren von Typ 1 bis 47,
- Herpesviren, wie Herpes Simplexvirus 1, 2 oder 3, Cytomegalievirus (CMV), insbe¬ sondere bevorzugt CMVpp65, oder Epstein-Barr-Virus (EBV),
- Vacciniaviren und
- dem Bakterium Chlamydophila pneumoniae (Chlamydia pneumoniae).
Beispiele für ebenfalls bevorzugte erfindungsgemäße immungenetische Proteine sind Proteine von Pathogenen, die einen Organismus, insbesondere ein Säugetier, vorzugsweise einen Men¬ schen, selten infizieren. Hierzu gehören zum Beispiel jedes Struktur- oder Nicht- Strukturprotein von:
Flaviviren, wie Denguevirus Typ 1 bis 4, Gelbfiebervirus, West-Nile-Virus, Japa- nisches-Encephalitis-Virus oder Hepatitis C Virus Caliciviren,
Filoviren, wie Ebokvirus, - Bornaviren,
Bunyaviren, wie Rift-Valley-Fieber Virus,
Arenavken, wie LCMV (Virus der lymphocytären Choriomeningitis) oder Viren des Hämorrhagischen Fiebers, Retrovirus, wie HIV und - Parvoviren.
Erfindungsgemäß sind ebenfalls funktionelle Fragmente und/oder funktionelle Varianten eines immunogenen Proteins bzw. eines Antigens aus einem Tumor der Erfindung sowie der erfindungsgemäßen mRNA uthfasst. „Funktionell" im Sinne der Erfindung bedeutet, dass das immunogene Protein bzw. das Antigen aus einem Tumor bzw. die mRNA immunologische bzw, immunogene Aktivität aufweist, insbesondere eine Immunantwort in einem Organis¬ mus, in dem es fremd ist, auslöst. Die erfindungsgemäße mRNA ist funktionell, wenn sie in ein funktionelles immunogenes Protein bzw. Tumorantigen (oder Fragment hiervon) transla- tiert werden kann.
Unter einem „Fragment" im Sinne der Erfindung ist ein verkürztes immunogenes Protein bzw. Tumorantigen bzw. eine verkürzte mRNA der vorliegenden Erfindung zu verstehen. Es
kann sich hierbei um N-terminal, C-terminal oder intrasequentiell verkürzte Aminosäure¬ bzw. Nukleinsäuresequenzen handeln.
Die Herstellung erfindungsgemäßer Fragmente ist im Stand der Technik gut bekannt und kann von einem Fachmann unter Anwendung von Standardverfahren durchgeführt werden (siehe z.B. Maniatis et al. (2001), Molecular Cloning: Laboratory Manual, CoId Spring Har- bour Laboratory Press). Im allgemeinen kann die Herstellung der Fragmente des immunoge- nen Proteins bzw. des Antigens durch Modifizieren der DNA-Sequenz, die das Wildtyp- Molekül kodiert, gefolgt von einer Transformation dieser DNA-Sequenz in einen geeigneten Wirt und Expression dieser modifizierten DNA-Sequenz, unter der Voraussetzung, dass die Modifikation der DNA die beschriebenen funktionellen Aktivitäten nicht zerstört, durchge¬ führt werden. Im Falle der erfindungsgemäßen mRNA kann die Herstellung des Fragements ebenfalls durch Modifizieren der Wildtyp-DNA-Sequenz gefolgt von einer in vitro Transkrip¬ tion und Isolierung der mRNA erfolgen, ebenfalls unter der Voraussetzung, dass die Modifi- kation der DNA die funktionelle Aktivität der mRNA nicht zerstört. Die Identifizierung eines erfindungsgemäßen Fragments kann beispielsweise über eine Sequenzierung des Fragments und einem nachfolgenden Vergleich der erhaltenen Sequenz mit der Wildtyp-Sequenz erfol¬ gen. Die Sequenzierung kann anhand von Standardverfahren, die im Stand der Technik zahl¬ reich und gut bekannt sind, erfolgen.
Als „Varianten" im Sinne der Erfindung werden insbesondere solche immunogenen Proteine, Antigene bzw. mRNA bezeichnet, die Sequenzunterschiede zu den entsprechenden Wildtyp- Sequenzen aufweisen. Bei diesen Sequenzabweichungen kann es sich um eine oder mehrere Insertionen), Deletion(en) und/oder Substitutionen) von Aminosäuren bzw. Nukleinsäuren handeln, wobei eine Sequenzhomologie von mindestens 60%, bevorzugt 70%, stärker bevor¬ zugt 80%, ebenfalls stärker bevorzugt 85%, noch stärker bevorzugt 90% und am meisten bevorzugt 97% vorliegt.
Um die prozentuale Identität zweier Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen zu bestim- men, können die Sequenzen abgeglichen werden, um nachfolgend miteinander verglichen zu werden. Hierfür können z.B. Lücken in die Sequenz der ersten Aminosäure- bzw. Nuklein- säuresequenz eingeführt werden und die Aminosäuren bzw. Nukleinsäuren an der entspre-
chenden Position der zweiten Aminosäure- bzw. Nukleinsäuresequenz verglichen werden. Wenn eine Position in der ersten Aminosäuresequenz mit der gleichen Aminosäure bzw. der gleichen Nukleinsäure besetzt ist, wie es an einer Position in der zweiten Sequenz der Fall ist, dann sind beide Sequenzen an dieser Position identisch. Die prozentuale Identität zwischen zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl identischer Positionen geteilt durch die Se¬ quenzen.
Die Bestimmung der prozentualen Identität zweier Sequenzen kann anhand eines mathemati¬ schen Algorithmus durchgeführt werden. Ein bevorzugtes, jedoch nicht beschränkendes, Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich zweier Sequenzen heran¬ gezogen werden kann, ist der Algorithmus von Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873- 5877. Ein solcher Algorithmus ist in dem NBLAST-Programm integriert, mit dem Sequenzen identifiziert werden können, die eine gewünschte Identität zu den Sequenzen der vorliegen¬ den Erfindung besitzen. Um einen Lücken-Abgleich (auch "gapped alignment"), wie oben beschrieben, zu erhalten, kann das "Gapped BLAST" -Programm verwendet werden, wie in Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402 beschrieben.
Funktionelle Varianten im Sinne der Erfindung, können vorzugsweise mRNA-Moleküle sein, die eine erhöhte Stabilität und/oder Translationsrate gegenüber ihren Wildtyp-Molekülen aufweisen. Ebenfalls kann ein besserer Transport in die Zelle des (Wirts-) Organismus vorlie¬ gen. Varianten können insbesondere auch immunogenen Proteine sein, die stabilisiert sind, um einer physiologischen Degradation zu entgehen, bspw. durch Stabilisierung des Protein¬ rückgrats durch Substitution der amidartigen Bindung, bspw. auch durch den Einsatz von ß- Aminosäuren.
Unter den Begriff Varianten fallen insbesondere solche Aminosäuresequenzen, die gegenüber den physiologischen Sequenzen konservative Substitution aufweisen. Als konservative Substi¬ tutionen werden solche Substitutionen bezeichnet, bei denen Aminosäuren gegeneinander ausgetauscht werden, die aus der gleichen Klasse stammen. Insbesondere gibt es Aminosäu- ren mit aliphatischen Seitenketten, positiv oder negativ geladenen Seitenketten, aromatischen Gruppen in der Seitenketten oder Aminosäuren, deren Seitenketten Wasserstoffbrücken ein¬ gehen können, bspw. Seitenketten, die eine Hydroxyfunktion besitzen. Das bedeutet, dass
bspw. eine Aminosäure mit einer polaren Seitenkette durch eine andere Aminosäure mit einer gleichfalls polaren Seitenkette ersetzt wird oder beispielsweise eine durch eine hydrophobe Seitenkette gekennzeichnete Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit gleichfalls hyd¬ rophober Seitenkette substituiert wird (z.B. Serin (Threonin) durch Threonin (Serin) bzw. Leucin (Isoleucin) durch Isoleucin (Leucin)). Insertionen und Substitutionen sind insbesonde¬ re an solchen Sequenzpositionen möglich, die keine Veränderung der dreidimensionalen Struktur hervorrufen oder den Bindungsbereich betreffen. Eine Veränderung einer dreidi¬ mensionalen Struktur durch Insertionen) oder Deletion(en) ist bspw. mit Hilfe von CD- Spektren (Zirkulardichroismus-Spektren) leicht überprüfbar (Urrv, 1985, Absorption, circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modern Physical Methods in Biochemistry, Neu- berger et al. (Hrgb.), Elsevier, Amsterdam).
Ebenfalls umfasst sind Varianten, bei denen ein „codon usage" erfolgt. Jede Animosäure wird durch ein Codon, das durch jeweils drei Nukelotide (Triplet) definiert wird, kodiert. Es ist möglich, ein Codon, das eine bestimmte Aminosäure kodiert, gegen ein anderes Codon, das dieselbe Aminosäure kodiert, auszutauschen. Durch die Wahl geeigneter alternativer Codons kann beispielsweise die Stabilität der erfindungsgemäßen mRNA erhöht werden. Hierauf wird nachstehend noch näher eingeganten.
Geeignete Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen Varianten mit Aminosäurese¬ quenzen, die gegenüber den Wildtyp-Sequenzen Substitutionen aufweisen, werden bspw. in den Druckschriften US 4,737,462, US 4,588,585, US 4,959,314, US 5,116,943, US 4,879,111 und US 5,017,691 offenbart. Die Herstellung von Varianten im allgemeinen wird insbesonde¬ re auch von Maniatis et al, (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben. Es können hierbei Codons weggelassen, ergänzt oder ausgetauscht werden. Varianten im Sinne der Erfindung können ebenfalls hergestellt werden, indem in die Nukleinsäuren, welche für die Varianten kodieren, Veränderungen eingeführt werden, wie bspw. Insertionen, Delitionen und/oder Substitutionen einer oder mehrerer Nukleotide. Im Stand der Technik sind zahlreiche Verfahren für derartige Veränderungen von Nukleinsäuresequenzen bekannt. Eine der meist verwendeten Technik ist die Oligo- nukleotid-gerichtete Orts-spezifische Mutagenese (siehe Comack B., Current Protocols in Molecular Biology, 8.01-8.5.9, Ausubel F. et al., Aufl. 1991). Bei dieser Technik wird ein Oli-
gonukleotid synthetisiert, dessen Sequenz eine bestimmte Mutation aufweist. Dieses Oligo- nukleotid wird dann mit einem Template hybridisiert, das die Wildtyp-Nukleinsäuresequenz enthält. Bevorzugt wird bei dieser Technik ein einzelsträngiges Template verwendet. Nach dem Annealing von Oligonukleotid und Template, wird eine DNA-abhängige DNA- Polymerase eingesetzt, um den zweiten Strang des Oligonukleotids, der komplementär zu dem Template-DNA-Strang ist, zu synthetisieren. Als Ergebnis wkd ein Heteroduplex- Molekül erhalten, welches eine Fehlpaarung enthält, die durch die oben erwähnte Mutation in dem Oligonukleotid entsteht. Die Oligonukleotidsequenz wird in ein geeignetes Plasmid ein¬ geführt, dieses wird in eine Wirtszelle eingeführt und in dieser Wirtszelle wird die Oligo- nukleotid-DNA repliziert. Mit dieser Technik erhält man Nukleinsäuresequenzen mit geziel¬ ten Veränderungen (Mutationen), welche für die Herstellung von Varianten gemäß der Erfin¬ dung verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung kann vorteilhafterweise in der in der Behandlung und/ oder Pro- phylaxe von Tumorerkrankung und insbesondere bevorzugt in der Behandlung und/oder Prophylaxe von Melanomen, Carzinomen, AML (akute myeloische Leukämie) und Gliom (Glioma) zur Anwendung kommen. Hierfür kann eine Vakzinierung mit dem erfindungsge¬ mäßen Gemisch vorgenommen werden, wobei die für ein Antigen kodierende mRNA für mehrere verschiedene Antigene kodiert, die spezifisch für Melanome sind (z.B. MAGE-Al, MAGE-A6, Melan-A, GP100, Tyrosinase und Survivin) bzw. spezifisch für Carzinome sind (z.B. MAGE-Al, CEA, Her-2/neu, Mucin-1 und Survivin) bzw. spezifisch für AML sind (z.B. Telomerase TERT, PR3, WTl, PRAME, Mucin-1 und Survivin) bzw. spezifisch für Gliom sind (z.B. TNC (Tenascin C), EGFRI (Epidermal Growth Factor Receptor 1), SOX9, SEC61G und PTPRZl (Protein Tyrosine Phosphatase, Rezeptor-Typ, Z-Polypeptid 1). Da- durch wird erfindungsgemäß erreicht, dass ein Melanom bzw. Carzinom bzw. AML bzw. Gliom effektiver bekämpft werden kann, da die Kombination aus verschiedenen für den je¬ weiligen Tumor spezifischen Antigene ein extrem breites Wirkspektrum aufweisen. Wie be¬ reits beschrieben, enthält das jeweilige Gemisch weiterhin eine für ein immunogenes Protein kodierende mRNA, welche vorzugsweise die Reaktivierung einer Immunantwort vermittelt. Hierbei wird erfindungsgemäß besonders ein Influenza-Matrix-Protein, speziell ein Influenza A oder B Matrix-Ml -Protein, bevorzugt. Zusätzlich kann das jeweilige Gemisch das itnmu- nogene Protein HBS enthalten.
Demgemäss betrifft eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Gemisch., in welchem die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für die Antigene MAGE-Al [Acession number (Zugriffsnummer) M77481], MAGE-A6 [Accession number NM_005363], Melan-A [Acces¬ sion number NM_005511], GP100 [Accession number M77348], Tyrosinase [Accession number NM_000372] und Survivin [Accession number AF077350] kodiert und die mindes¬ tens eine mRNA, die einen für mindestens ein immunogenes Protein oder Polypeptid kodie¬ renden Bereich enthält, für ein Influenza-Matrixprotein [Accession number AF348197 oder Accession number VOl 099] kodiert. Bevorzugt enthält das Gemisch funktionelle Fragmente und/oder funktionelle Varianten der vorgenannten mRNAs
Konsequenterweise betrifft eine ebenfalls besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfin¬ dung ein Gemisch, in welchem die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein An- tigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für die Antigene MAGE-Al [Acession number M77481], CEA [Accession number NM_004363], Her-2/neu [Accession number Ml 1730], Mucin-1 [Accession number NM_002456] und Survivin [Accession number AF077350] kodiert, und die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein immuno¬ genes Protein oder Polypeptid kodierenden Bereich enthält, für ein Influenza-Matrixprotein [Accession number AF348197 oder Accession number V01099] kodiert. Bevorzugt enthält das Gemisch funktionelle Fragmente und/oder funktionelle Varianten der vorgenannten mRNAs.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Gemisch, in welchem die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für die Antigene Telomerase TERT [Accession number
NM_003219], PR3 [Accession number NM_002777], WTl [Accession number NM_000378],
PRAME [Accession number NM_006115], Mucin-1 [Accession number NM_002456] und
Survivin [Accession number AF077350] kodiert und die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein immunogenes Protein oder Polypeptid kodierenden Bereich enthält, für ein Influenza-Matrixprotein [Accession number AF348197 oder Accession number V01099]
kodiert. Bevorzugt enthält das Gemisch funktionelle Fragmente und/oder funktionelle Vari¬ anten der vorgenannten rnRNAs.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausfuhrungsform der Erfindung betrifft ein Gemisch, in welchem die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für die Antigene TNC (Tenascin C) [Accession number X78565], EGFRI („Epidermal Growth Factor Receptor 1") [Accession number AF288738], SOX9 [Accession number Z46629], SEC61G [Accession number NM_014302] und PTPRZl (Protein Tyrosine Phosphatase, Rezeptor-Typ, Z-Polypeptid 1) [Accession number NM_002851] kodiert und die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein immu- nogenes Protein oder Polypeptid kodierenden Bereich enthält, für ein Influenza- Matrixproterα [Accession number AF348197 oder Accession number VOl 099] kodiert. Be¬ vorzugt enthält das Gemisch funktionelle Fragmente und/oder funktionelle Varianten der vorgenannten mRNAs.
Eine bevorzugte Ausfuhrungsform betrifft ein Gemisch, in welchem die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein immunogenes Protein oder Polypeptid kodierenden Bereich enthält, für ein Matrixprotein, bevorzugt ein Influenza-Matrixproteinf Accession number AF348197 oder Accession number VOl 099], besonders bevorzugt das Influenza A- Matrix-Mi -Protein oder das Influenza B-Matrix-Ml -Protein, und für ein HBS-Antigen [Ac¬ cession number E00121] kodiert. Das Hepatitis B Oberflächen-Antigen ist, wie oben be¬ schrieben, zur Anwendung bei anti-viraler Vakzinierung besonders geeignet.
Die mRNA des Gemisches gemäß der Erfindung kann als nackte mRNA und/oder als modi- fizierte mRNA, insbesondere stabilisierte mRNA, vorliegen. Modifikationen der erfindungs¬ gemäßen mRNA dienen vor allem der Erhöhung der Stabilität der mRNA aber auch einer Verbesserung des Transfers der mRNA in eine Zelle bzw. ein Gewebe eines Organismus. Vorzugsweise weist die mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches eine oder mehrere Modi¬ fikationen, insbesondere chemische Modifikationen, auf, die zur Erhöhung der Halbwertszeit der mRNA im Organismus beitragen bzw. den Transfer der mRNA in die Zelle bzw. ein Gewebe verbessern.
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform, der vorliegenden Erfindung ist der G/C- Gehalt des kodierenden Bereichs der modifizierten rnRNA des erfindungsgemäßen Gemi¬ sches gegenüber dem G/C-Gehalt des kodierenden Bereichs der Wildtyp-RNA erhöht, wobei die kodierte Aminosäuresequenz der modifizierten mRNA gegenüber der kodierten Amino- säuresequenz der Wildtyp-mRNA vorzugsweise nicht verändert ist.
Diese Modifikation beruht auf der Tatsache, dass für die effiziente Translation einer rnRNA die Sequenzabfolge des zu translatierenden Bereichs der rnRNA wesentlich ist. Bedeutungs¬ voll ist hier die Zusammensetzung und die Abfolge der verschiedenen Nukleotide. Insbeson- dere sind Sequenzen mit erhöhtem G (Guanosin) / C (Cytosin) -Gehalt stabiler als Sequen¬ zen mit einem erhöhten A (Adenosin) / U (Uracil) -Gehalt. Daher werden erfindungsgemäß unter Beibehaltung der translatierten Aminosäureabfolge die Codons gegenüber der Wildtyp- mRNA derart variiert, dass sie vermehrt G/C-Nukleotide beinhalten. Aufgrund der Tatsache, dass mehrere Codons für ein und dieselbe Aminosäure kodieren (sog. „Degeneration des genetischen Codes"), können die für die Stabilität günstigsten Codons ermittelt werden (sog. „alternative Codonverwendung" oder englisch: „codon usage").
In Abhängigkeit von der durch die modifizierte rnRNA zu kodierenden Aminosäure sind unterschiedliche Möglichkeiten zur Modifikation der mRNA-Sequenz gegenüber der Wildtyp- Sequenz möglich. Im Fall von Aminosäuren, die durch Codons kodiert werden, die aus¬ schließlich G- oder C- Nukleotide enthalten, ist keine Modifikation des Codons erforderlich. So erfordern die Codons für Pro (CCC oder CCG), Arg (CGC oder CGG), AIa (GCC oder GCG) und GIy (GGC oder GGG) keine Veränderung, da kein A oder U vorhanden ist.
Demgegenüber können Codons, welche A- und/oder U-Nukleotide enthalten durch Substi¬ tution anderer Codons, welche die gleichen Aminosäuren kodieren, jedoch kein A und/oder U enthalten, verändert werden. Beispiele hierfür sind:
die Codons für Pro können von CCU oder CCA zu CCC oder CCG verändert werden; - die Codons für Arg können von CGU oder CGA oder AGA oder AGG zu CGC oder CGG verändert werden; die Codons für AIa können von GCU oder GCA zu GCC oder GCG verändert werden;
die Codons für GIy können von GGU oder GGA zu GGC oder GGG verändert werden.
In anderen Fällen können A- bzw. U-Nukleotide zwar nicht aus den Codons eliminiert wer¬ den, jedoch ist es möglich, den A- und U-Gehalt zu verringern, indem Codons verwendet werden, die einen geringeren Anteil A- und/oder U-Nukleotide enthalten. Beispiele hierfür sind:
die Codons für Phe können von UUU zu UUC verändert werden;
- die Codons für Leu können von UUA, UUG, CUU oder CUA zu CUC oder CUG ver- ändert werden; die Codons für Ser können von UCU oder UCA oder AGU zu UCC, UCG oder AGC verändert werden; das Codon für Tyr kann von UAU zu UAC verändert werden; das Codon für Cys kann von UGU zu UGC verändert werden; - das Codon His kann von CAU zu CAC verändert werden; das Codon für GIn kann von CAA zu CAG verändert werden; die Codons für He können von AUU oder AUA zu AUC verändert werden; die Codons für Thr können von ACU oder ACA zu ACC oder ACG verändert werden; das Codon für Asn kann von AAU zu AAC verändert werden; - das Codon für Lys kann von AAA zu AAG verändert werden; die Codons für VaI können von GUU oder GUA zu GUC oder GUG verändert werden; das Codon für Asp kann von GAU zu GAC verändert werden; das Codon für GIu kann von GAA zu GAG verändert werden, das Stop-Codon UAA kann zu UAG oder UGA verändert werden.
Im Falle der Codons für Met (AUG) und Trp (UGG) besteht hingegen keine Möglichkeit der Sequenzmodifikation.
Die vorstehend aufgeführten Substitutionen können sowohl einzeln aber auch in allen mögli- chen Kombinationen zur Erhöhung des G/C-Gehalts der modifizierten mRNA gegenüber der Wildtyp-mRNA (der ursprünglichen Sequenz) verwendet werden. So können beispiels¬ weise alle in der Wildtyp-Sequenz auftretenden Codons für Thr zu ACC (oder ACG) verän-
dert werden. Bevorzugt werden jedoch beispielsweise Kombinationen der vorstehenden Sub¬ stitutionsmöglichkeiten verwendet:
Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz (Wildtyp-mRNA) für Thr kodierenden Codons zu ACC (oder ACG) und Substitution aller ursprünglich für Ser kodierenden Co- dons zu UCC ( oder UCG oder AGC);
Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz für He kodierenden Codons zu AUC und Substitution aller ursprünglich für Lys kodierenden Codons zu AAG und Substituti- on aller ursprünglich für Tyr kodierenden Codons zu UAC;
Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz für VaI kodierenden Codons zu GUC (oder GUG) und Substitution aller ursprünglich für GIu kodierenden Codons zu GAG und Substitution aller ursprünglich für AIa kodierenden Codons zu GCC (oder GCG) und Substitution aller ursprünglich für Arg kodierenden Codons zu CGC (oder CGG);
Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz für VaI kodierenden Codons zu GUC (oder GUG) und Substitution aller ursprünglich für GIu kodierenden Codons zu GAG und Substitution aller ursprünglich für AIa kodierenden Codons zu GCC (oder GCG) und Substitution aller ursprünglich für GIy kodierenden Codons zu GGC (oder GGG) und Substituion aller ursprünglich für Asn kodierenden Codons zu AAC;
Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz für VaI kodierenden Codons zu GUC (oder GUG) und Substitution aller usprünglich für Phe kodierenden Codons zu UUC und Substitution aller ursprünglich für Cys kodierenden Codons zu UGC und Substitution al¬ ler ursprünglich für Leu kodierenden Codons zu CUG (oder CUC) und Substitution aller ursprünglich für GIn kodierenden Codons zu CAG und Substitution aller ursprünglich für Pro kodierenden Codons zu CCC (oder CCG);
usw.
Vorzugsweise -wird der G/C-Gehalt des für das Protein kodierenden Bereichs der modifizier¬ ten mRNA um mindestens 7%-Punkte, mehr bevorzugt um mindestens 15%-Punkte, beson¬ ders bevorzugt um mindestens 20%-Punkte gegenüber dem G/C-Gehalt des kodierten Be¬ reichs der für das Protein kodierenden Wildtvp-mRNA erhöht.
Besonders bevorzugt ist es in diesem Zusammenhang, den G/C-Gehalt der modifizierten mRNA, insbesondere in dem für das Protein kodierenden Bereich, im Vergleich zur Wildtyp- Sequenz maximal zu erhöhen. G/C-maximierte Sequenzen für die codierenden Bereiche einer bevorzugten Auswahl von vitalen oder Tumorantigenen, die in einem erfindungsgemäßen RNA-Gemisch eingesetzt werden können, sind in den Figuren 19 bis 81 dargestellt.
Eine weitere bevorzugte Modifikation der mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches basiert auf der Erkenntnis, dass die Translationseffizienz ebenfalls durch eine unterschiedliche Häu¬ figkeit im Auftreten von tRNAs in Zellen bestimmt wird. Sind daher in einer RNA-Sequenz vermehrt sogenannte "seltene" Codons vorhanden, so wird die entsprechende mRNA deut¬ lich schlechter translatiert als in dem Fall, dass für relativ "häufige" tRNAs kodierende Co¬ dons vorhanden sind.
Somit wird erfindungsgemäß in der modifizierten mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches, der für das Protein, Peptid bzw. Polypeptid kodierende Bereich gegenüber dem entsprechen¬ den Bereich der Wildtvp-mRNA derart verändert, dass mindestens ein Codon der Wildtyp- Sequenz, das für eine in der Zelle relativ seltene tRNA kodiert, gegen ein Codon ausge¬ tauscht, das für eine in der Zelle relativ häufige tRNA kodiert, welche die gleiche Aminosäure trägt wie die relativ seltene tRNA. Durch diese Modifikation werden die RNA-Sequenzen derart modifiziert, dass Codons eingefügt werden, für die häufig vorkommende tRNAs zur Verfügung stehen. Anders ausgedrückt, können durch diese Modifikation erfindungsgemäß alle Codons der Wildtyp-Sequenz, die für eine in der Zelle relativ seltene tRNA kodieren, jeweils gegen ein Codon ausgetauscht werden, das für eine in der Zelle relativ häufige tRNA kodiert, welche jeweils die gleiche Aminosäure trägt wie die relativ seltene tRNA.
Welche tRNAs telativ häufig in der Zelle auftreten und welche demgegenüber relativ selten auftreten, ist einem Fachmann bekannt; vgl. bspw. Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11(6): 660-666.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist es, den erfindungsgemäß in der modifizierten mRNA erhöhten, insbesondere maximalen, sequenziellen G/C-Anteil mit den "häufigen" Codons zu verknüpfen, ohne die Aminosäuresequenz des durch den kodierenden Bereich der mRNA kodierten Proteins, Peptids bzw. Polypeptids zu verändern. Diese bevorzugte Aus¬ führungsform stellt eine besonders effizient translatierte und stabilisierte mRNA bspw. für das erfindungsgemäße Gemisch bereit.
Die Ermittlung einer wie vorstehend beschrieben modifizierten mRNA (Erhöhung des G/C- Gehalts; Austausch von tRNAs) kann anhand des in der WO 02/098443 - deren Offenba¬ rungsgehalt vollinhaltlich in die vorliegende Erfindung einbezogen wird — erläuterten Compu- terprogramms ermittelt werden. Mit diesem Computerprogramm kann anhand des geneti¬ schen Codes bzw. dessen degenerativer Natur die Nucleotid-Sequenz einer beliebigen mRNA derart modifiziert werden, dass sich ein maximaler G/C-Gehalt in Verbindung mit der Ver¬ wendung von Codons, die für möglichst häufig in der Zelle vorkommende tRNAs kodieren, ergibt, wobei die durch die modifizierte mRNA kodierte Aminosäure-Sequenz gegenüber der nicht-modifizierten Sequenz vorzugsweise nicht verändert ist. Alternativ kann auch nur der G/C-Gehalt oder nur die Codonverwendung gegenüber der ursprünglichen Sequenz modifi¬ ziert werden. Der Quellcode in Visual Basic 6.0 (eingesetzte Entwicklungsumgebung: Micro¬ soft Visual Studio Enterprise 6.0 mit Servicepack 3) ist ebenfalls in der WO 02/098443 ange¬ geben.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der A/U- Gehalt in der Umgebung der Ribosomen-Bindungsstelle der modifizierten mRNA des erfin¬ dungsgemäßen Gemisches gegenüber dem A/U-Gehalt in der Umgebung der Ribosomen- Bindungsstelle der Wildtyp-mRNA erhöht. Diese Modifikation (ein erhöhter A/U-Gehalt um die Ribosomen-Bindungsstelle) erhöht die Effizienz der Ribosomen-Bindung an die mRNA. Eine wirksame Bindung der Ribosomen an die Ribosomen-Bindungsstelle (Kozak-Sequenz:
GCCGCCACCAUGG, das AUG bildet das Startcodon) bewirkt wiederum eine effiziente Translation der mRNA.
Eine ebenfalls bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein erfin- dungsgernäßes Gemisch, wobei der kodierende Bereich und/oder der 5'- und/oder 3'-nicht- translatierte Bereich der modifizierten mRNA gegenüber der WMdtyp-mRNA derart verän¬ dert ist, dass er keine destabilisierenden Sequenzelemente enthält, wobei die kodierte Amino¬ säuresequenz der modifizierten mRNA gegenüber der Wildtyp-mRNA vorzugsweise nicht verändert ist. Es ist bekannt, dass beispielsweise in den Sequenzen eukaryotischer mRNAs destabilisierende Sequenzelemente (DSE) auftreten, an welche Signalproteine binden und den enzymatischen Abbau der mRNA in ήvo regulieren. Daher können zur weiteren Stabilisierung der erfindungsgemäßen modifizierten mRNA gegebenenfalls im für das Protein kodierenden Bereich ein oder mehrere derartige Veränderungen gegenüber dem entsprechenden Bereich der Wildtyp-mRNA vorgenommen werden, so dass dort keine bzw. im wesentlichen keine destabilisierenden Sequenzelemente enthalten sind. Durch derartige Veränderungen können erfindungsgemäß ebenfalls in den nicht-translatierten Bereichen (3'- und/ oder 5'-UTR) vor¬ handene DSE aus der mRNA eliminiert werden.
Derartige destabilisierende Sequenzen sind bspw. AU-reiche Sequenzen ("AURES"), die in 3'- UTR-Abschnitten zahlreicher instabiler mRNA vorkommen (Caput et al., Proc. Natl. Acad.
Sei. USA 1986, 83: 1670 bis 1674). Die in dem erfindungsgemäßen Gemisch enthaltenen mRNA-Moleküle sind daher vorzugsweise derart gegenüber der Wildtyp-mRNA verändert, dass sie keine derartigen destabilisierenden Sequenzen aufweisen. Dies gilt auch für solche
Sequenzmotive, die von möglichen Endonucleasen erkannt werden, bspw. die Sequenz GAACAAG, die im 3' UTR-Segment des für den Transferin-Rezeptor kodierenden Gens enthalten ist (Binder et al., EMBO J. 1994, 13: 1969 bis 1980). Auch diese Sequenzmotive werden bevorzugt in der modifizierten mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches entfernt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die modi- fizierte mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches eine 5'-Cap-Struktur auf. Beispiele von Cap-Strukturen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A und G(5')ppp(5')G.
Ferner ist es bevorzugt, dass die modifizierte mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches ei¬ nen Poly(A)-Schwanz, vorzugsweise von mindestens 25 Nukleotiden, stärker bevorzugt von mindestens 50 Nukleotiden, noch stärker bevorzugt von mindestens 70 Nukleotiden, eben- falls stärker bevorzugt von mindestens 100 Nukleotiden, am stärksten bevorzugt von mindes¬ tens 200 Nukleotiden aufweist.
Ebenfalls bevorzugt weist die modifizierte mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches min¬ destens eine IRES und/ oder mindestens eine 5'- und/ oder 33-Stabilisierungssequenz auf. Erfindungsgemäß können demnach in die modifizierte mRNA eine oder mehrere sog. IRES (engl, „internal ribosomal entry side") eingefügt werden. Eine IRES kann so als alleinige Ri- bosomen-Bindungsstelle fungieren, sie kann jedoch auch zur Bereitstellung einer mRNA die¬ nen, die mehrere Proteine, Peptide bzw. Polypeptide kodiert, die unabhängig voneinander durch die Ribosomen translatiert werden sollen ("multicistconische mRNA"). Beispiele erfin- dungsgemäß verwendbarer IRES-Sequenzen sind diejenigen aus Picornaviren (z.B. FMDV), Pestviren (CFFV), Polioviren (PV), Enzephalo-Myocarditis-Viren (ECMV), Maul-und- Klauenseuche-Viren (FMDV), Hepatitis-C-Viren (HCV), Klassisches-Schweinefieber-Viren (CSFV), Murines-Leukoma-Virus (MLV), Simean-Immundefizienz-Viren (SIV) oder Gricket- Paralysis-Viren (CrPV).
Weiterhin bevorzugt weist die modifizierte mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches min¬ destens eine 5'- und/ oder 3'-Stabilisierungssequenz auf. Diese Stabilisierungssequenzen in den 51- und/oder 3'- nicht-translatierten Bereichen bewirken eine Erhöhung der Halbwerts¬ zeit der mRNA im Cytosol. Diese Stabilisierungssequenzen können eine 100%ige Sequenz- homologie zu natürlich vorkommenden Sequenzen, die in Viren, Bakterien und Eukaryoten auftreten, aufweisen, können aber auch teilweise oder vollständig synthetischer Natur sein. Als Beispiel für stabilisierende Sequenzen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, können die nicht-translatierten Sequenzen (UTR) des ß-Globingens, bspw. von Homo sapiens oder Xenopus laevis, genannt werden. Ein anderes Beispiel einer Stabilisierungssequenz weist die allgemeine Formel (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC auf, die im 31UTR der sehr stabilen mRNA enthalten ist, die für α-Globin, α-(T)-Collagen, 15-Iipoxygenase oder für Tyrosin-Hydroxylase kodiert (vgl. Holcik et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1997, 94: 2410 bis
2414). Selbstverständlich können derartige Stabilisierungssequenzen einzeln oder in Kombi¬ nation miteinander als auch in Kombination mit anderen, einem Fachmann bekannten Stabi¬ lisierungssequenzen verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung weist die modifizierte mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches mindestens ein Analoges natürlich vorkommen¬ der Nukleotide auf. Dieses/diese Analoges /Analoga dient/dienen der weiteren Stabilisierung der modifizierten mRNA, wobei dies auf der Tatsache beruht, dass die in den Zellen vor¬ kommenden RNA-abbauenden Enzyme als Substrat vorzugsweise natürlich vorkommende Nukleotide erkennen. Durch Einfügen von Nukleotid-Analoga in die RNA kann daher der RNA-Abbau erschwert werden, wobei die Auswirkung auf die Translationseffizienz bei Ein¬ fügen dieser Analoga, insbesondere in den kodierenden Bereich der mRNA, einen positiven oder negativen Effekt auf die Translationseffizienz haben kann. In einer keineswegs abschlie¬ ßenden Aufzählung können als Beispiele erfindungsgemäß verwendbarer Nukleotidanaloga Phosphoramidate, Phosphorthioate, Peptidnukleotide, Methylphosphonate, 7- Deazaguaonsin, 5-Methylcytosin und Inosin genannt werden. Die Herstellung derartiger Ana¬ loga sind einem Fachmann bspw. aus den US-Patenten 4,373,071, US 4,401,796, US 4,415,732, US 4,458,066, US 4,500,707, US 4,668,777, US 4,973,679, US 5,047,524, US 5,132,418, US 5,153,319, US 5,262,530 und 5,700,642 bekannt. Erfindungsgemäß können derartige Analoga in nicht-translatierten und translatierten Bereichen der modifizierten mRNA vorkommen.
Vorzugsweise kann die modifizierte mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, zusätzlich einen wei- teren funktionellen Abschnitt enthalten, der bspw. für ein die Immunantwort förderndes Cy- tokin (Monokin, Lymphokin, Interleukin oder Chemokin, wie IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL- 6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, INF-α, INF-γ, GM-CFS, LT-α oder Wachstumsfaktoren, wie hGH, kodiert.
Einem Fachmann sind verschiedene Verfahren geläufig, die beschriebenen Modifikationen vorzunehmen. Einige dieser Verfahren wurden bereits in dem obigen Abschnitt zu den Vari¬ anten der Erfindung beschrieben. Beispielsweise kann zur Substitution von Codons in der
erfindungsgemäßen modifizierten tαRNA im Falle kürzerer kodierende* Bereiche (die für biologisch wirksame oder antigene Proteine oder Peptide kodieren) die gesamte mRNA che¬ misch unter Verwendung von Standardtechniken synthetisiert werden.
Bevorzugt werden allerdings Substitutionen, Additionen oder Eliminierungen von Basen un¬ ter Verwendung einer DNA-Matrize zur Herstellung der modifizierten mRNA mit Hilfe von Techniken der gängigen zielgerichteten Mutagenese eingeführt (siehe z.B. Maniatis et al., Mo- lecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, 3. Aufl., CoId Spring Harbor, NY, 2001). Bei einem solchen Verfahren wird zur Herstellung der mRNA ein entsprechendes DNA-Molekül in vitro transkribiert. Diese DNA-Matrize besitzt einen geeig¬ neten Promotor, bspw. einen T7 -oder SP6-Promotor, für die in vitro Transkription, dem die gewünschte Nukleotidsequenz für die herzustellende mRNA und ein Termisationssignal für die in in vitro Transkribtion folgen. Erfindungsgemäß wird das DNA-Molekül, das die Matrize des herzustellenden RNA-Konstrukts bildet, durch fermentative Vermehrung und anschlie- ßende Isolierung als Teil eines in Bakterien replizierbaren Plasmids hergestellt. Als für die vorliegende Erfindung geeignete Plasmide können bspw. die Plasmide pT7Ts (GenBank- Zugriffsnummer U26404; Lai et al., Development 1995, 121: 2349 bis 2360), pGEM®-Reihe, bspw. pGEM®-l (GenBank-Zugriffsnummer X65300; von Promega) und pSP64 (GenBank- Zugriffsnummer X65327) genannt werden; vgl. auch Mezei und Storts, Purification of PCR Products, in: Griffin und Griffin (Hrsg.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001.
Es kann so unter Verwendung kurzer synthetischer DNA-Oligonukleotide, die an den ent¬ stehenden Schnittstellen kurze einzelsträngige Übergänge aufweisen, oder durch chemische Synthese hergestellte Gene die gewünschte Nukleotidsequenz nach einem Fachmann geläufi¬ gen molekularbiologischen Methoden in ein geeignetes Plasmid cloniert werden (vgl. Maniatis et al., supra). Das DNA-Molekül wird dann aus dem Plasmid, in welchem es in einfacher oder mehrfacher Kopie vorliegen kann, durch Verdauung mit Restriktionsendonukleasen ausge¬ schnitten.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die modifizierte mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches mit mindestens einem kationischen oder polykationischen
Agens komplexiert oder kondensiert ist. Bevorzugt handelt es sich bei einem solchen kationi¬ schen oder poykationischen Agens um ein Agens, das aus der Gruppe bestehend aus Prota¬ min, Poly-L-Lysin, Poly-L-Arginin und Histonen ausgewählt ist.
Durch diese Modifikation der erfindungsgemäßen mRNA kann der wirksame Transfer der modifizierten mRNA in die zu behandelnden Zellen, bzw. das zu behandelndes Gewebe bzw. den zu behandelnden Organismus dadurch verbessert werden, dass die modifizierte mRNA mit einem kationischen Peptid oder Protein assoziiert oder daran gebunden ist. Insbesondere ist dabei die Verwendung von Protamin als polykationisches, Nukleinsäure-bindendes Protein besonders wirksam. Die Verwendung anderer kationischer Peptide oder Proteine, wie Poly-L- Lysin oder Histonen, ist selbstverständlich ebenfalls möglich. Diese Vorgehensweise zur Sta¬ bilisierung der modifizierten mRNA wird beispielsweise in EP-A-1083232 beschrieben, deren diesbezüglicher Offenbarungsgehalt in die vorliegende Erfindung vollumfänglich eingeschlos¬ sen ist.
Die vorstehend beschriebenen, sämtlichen Modifikationen der mRNA des erfindungsgemä¬ ßen Gemisches können im Sinne der Erfindung einzeln oder in Kombinationen miteinander auftreten.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein erfindungsgemäßes Ge¬ misch zur Verwendung als pharmazeutische Zusammensetzung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusam¬ mensetzung, die ein erfindungsgemmäßes Gemisch enthält sowie pharmazeutisch geeignete Hilfs- und/oder Trägerstoffe. Damit wird erfindungsgemäß auch eine Kombination der er¬ findungsgemäßen mRNAs mit pharmazeutisch akzeptablen Träger-, Hilfs- und/oder Zusatz¬ stoffen offenbart. Entsprechende Herstellungswege sind bei „Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980) offenbart, das Bestandteil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung ist. Vorzugsweise enthält die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zusätzlich mindestens einen RNase-Inhibitor, vorzugsweise RNasin.
Für die parenterale Verabreichung kommen als Trägerstoffe bspw. steriles Wasser, sterile Kochsalzlösungen, Polyalkylenglykole, hydrogenierte Naphthalen und insbesondere biokom¬ patible Lactidpolymere, Lactid/Glycolidcopolymer oder Polyoxyethylen- /Polyoxypropylencopolymere in Betracht. Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammen- Setzungen können Füllsubstanzen oder Substanzen, wie Lactose, Mannitol, Substanzen zur kovalenten Anknüpfung von Polymeren, wie z.B. Polyethylenglykol, an erfindungsgemäße Inhibitoren, Komplexierung mit Metallionen oder Einschluß von Materialien in oder auf be¬ sondere Präparationen von Polymerverbindung, wie z.B. Polylactat, Polyglykolsäure, Hydro- gel oder auf Liposomen, Mikroemulsion, Micellen, unilamellare oder multilamellare Vesikel, Erythrozyten-Fragmente oder Sphäroplasten, enthalten. Die jeweiligen Ausführungsformen der pharmazeutischen Zusammensetzung werden abhängig vom physikalische Verhalten, beispielsweise in Hinblick auf die Löslichkeit, die Stabilität, Bioverfügbarkeit oder Abbaubar- keit gewählt. Kontrollierte oder konstante Freisetzung der erfindungsgemäßen Wkkstoff- komponente in der Zusammensetzung schließt Formulierungen auf der Basis lipophiler De- pots ein (z.B. Fettsäuren, Wachse oder Öle). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden auch Beschichtungen erfindungsgemäßer Substanzen oder Zusammensetzungen, enthaltend solche Substanzen, nämlich Beschichtungen mit Polymeren offenbart (z.B. Poloxamere oder Poloxamine). Weiterhin können erfindungsgemäßen Substanzen bzw. Zusammensetzungen protektive Beschichtungen, z.B. Proteaseinhibitoren oder Permeabilitätsverstärker, aufweisen. Bevorzugte Träger sind typischerweise wässrige Trägermaterialien, wobei Wasser zur Injekti¬ on (WFI) oder Wasser, gepuffert mit Phosphat, Citrat oder Acetat usw. verwendet wird, und der pH typischerweise auf 5,0 bis 8,0, vorzugsweise 6,0 bis 7,0, eingestellt wird. Der Träger bzw. das Vehikel wird zusätzlich vorzugsweise Salzbestandteile enthalten, z.B. Natriumchlo¬ rid, Kaliumchlorid oder andere Komponenten, welche die Lösung bspw. isotonisch machen. Weiterhin kann der Träger neben den vorstehend genannten Bestandteilen zusätzliche Kom¬ ponenten, wie humanes Serumalbumin (HSA), Polysorbat 80, Zucker oder Aminosäuren, enthalten.
Die Art und Weise der Verabreichung und die Dosierung der erfindungsgemäßen pharmazeu- tischen Zusammensetzung hängen von der zu behandelnden Erkrankung und deren Fort¬ schrittsstadium, wie auch dem Körpergewicht, dem Alter und dem Geschlecht des Patienten ab. Die Konzentration der modifizierten rnRNA in derartigen Formulierungen kann daher
innerhalb eines weiten Bereichs von 1 μg bis 100 mg/ml variieren. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung wird vorzugsweise parenteral, bspw. intravenös, intraar¬ teriell, subkutan, intramuskulär, dem Patienten verabreicht. Ebenso ist es möglich, die phar¬ mazeutische Zusammensetzung topisch oder oral zu verabreichen.
Konsequenterweise ist von der vorliegenden Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur Behand¬ lung von Erkrankungen, insbesondere Krebs- bzw. Tumorerkrankungen bzw. eine Vakzinie¬ rung zur Prävention der vorstehend genannten Erkrankungen bereitgestellt, welches das Ve¬ rabreichen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Patienten, insbesondere einen Menschen, umfasst.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass die pharmazeutische Zusammensetzung der vorlie¬ genden Erfindung weiterhin ein oder mehrere Adjuvanz/Adjuvanzien enthält. Hierdurch kann eine Erhöhung der Immunogenizität der pharmazeutische Zusammensetzung bewirkt erden. Unter "Adjuvans" ist erfindungsgemäß jede chemische oder biologische Verbindung zu verstehen, die eine spezifische Immunantwort begünstigt. In Abhängigkeit der verschiede¬ nen Arten von Adjuvanzien können diesbezüglich verschiedene Mechanismen in Betracht kommen. Bspw. bilden Verbindungen, die eine Endocytose der in der pharmazeutischen Zu¬ sammensetzung enthaltenen modifizierten mRNA durch dendritische Zellen (DC) fördern, eine erste Klasse von verwendbaren Adjuvanzien. Andere Verbindungen, welche die Reifung der DC erlauben, bspw. Iipopolysaccharide, TNF-α oder CD40-Iigand, sind eine weitere Klasse geeigneter Adjuvanzien. Allgemein kann jedes das Immunsystem beeinflussende A- gens von der Art eines "Gefahrsignals" (LPS, GP96, Oligonucleoti.de mit dem CpG-Motiv) oder Cytokine, wie GM-CFS, als Adjuvans verwendet werden, welche es erlauben, eine Im- munantwort gegen ein Antigen, das durch die modifizierte mRNA kodiert wird, zu erhöhen und/oder gerichtet zu beeinflussen. Insbesondere sind dabei die vorstehend genannten Cyto¬ kine bevorzugt. Weitere bekannte Adjuvanzien sind Aluminiumhydroxid, das Freud'sche Ad¬ juvans sowie die vorstehend genannten stabilisierenden kationischen Peptide bzw. Polypepti¬ de, wie Protamin. Des weiteren sind Iipopeptide, wie Pam3Cys, ebenfalls besonders geeignet, um als Adjuvanzien in der pharmazeutischen Zusammmensetzung der vorliegenden Erfin¬ dung eingesetzt zu werden; vgl. Deres et al, Nature 1989, 342: 561-564.
Ein weitetet Gegenstand det votliegenden Etfindung betrifft ein Vetfahten zut Hetstellung eines eifindungsgemäßen Gemisches, das die folgenden Schritte umfaßt: a. in vitro Transkription mindestens einet Template-DNA, kodietend füt mindestens ein
Antigen aus einem Tumot, b. in vitro Ttanskription mindestens einet Template-DNA, kodietend füt mindestens ein immunogenes Ptotein, c. Degtadation det Template-DNA mit geeigneten Mitteln, d. Isolietung det in den Schritten a. und b. ethaltenen mRNA mit geeigneten Mitteln, e. Mischen det in Schritt d. isolierten mRNAs.
Votgehensweisen zut in vitro Ttanskription wurden bereits votstehend beschrieben und sind im Stand der Technik bekannt (siehe z.B. Maniatis et al., supra). Etfindungsgemäß verwend¬ bare Antigene aus einem Tumor sowie immunogene Proteine wurden ebenfalls vorstehend beschrieben. Die Degradation der Template-DNA in Schritt c. kann vorzugsweise durch eine (im Stand der Technik wohlbekannte) DNAse- Behandlung erfolgen. Die Isolierung der mRMA kann durch vorzugsweise mehrete aufeinanderfolgende Präzipitations- und/oder Ex¬ traktionsprozesse erfolgen. Hierbei kommt beispielsweise eine IiCl-Präzipitation, eine Etha- nol/NaCl-Präzipitation und eine Phenol/Chloroform-Exttaktion in Betracht. Weitere Ver¬ fahren sind dem Fachmann gut bekannt. Ferner kann sich eine weitergehende Aufreinigung mittels Chromatographie anschliessen. Die isolierten mRNAs können zum Mischen vor¬ zugsweise in Wasser, ebenfalls bevorzugt bei gleichen Konzentrationen, vorliegen. Es können jedoch auch unterschiedliche Konzentrationen gewählt werden. Geeignete Bedinungen und Konzentrationen untet denen die mRNAs vorteilhaft gemischt werden können sind dem Fachmann ebenfalls gut bekannt.
Es ist weiterhin bevorzugt, dass die isolierte und/oder gemischte mRNA in wässrigen Lö¬ sungsmittel vorliegt. Hierbei kann es sich beispielsweise um PBS handeln. PBS kann hierbei je nach Geeignetheit in verschiedenen Konzentrationen vorliegen, z.B. 1 x PBS oder 10 x PBS. Weiterhin kann es sich um isotonische Kochsalzlösung handeln, die auch mit HEPES gepuf- fert sein kann. Besonders bevorzugt ist alletdings die Verwendung von Riαger-Lactat-Lösung (Fa. Fresenius). Bei Verwendung von Riαger-Lactat-Lösung als Puffer wurde von den Erfin¬ dern erstmals eine gegenübet dem Stand det Technik 5-fach höhete Effektivität erzielt.
Ein weitetet Gegenstand det Etfindung betrifft die Vetwendung eines erfindungsgemäßen
Gemisches und/ oder einet etfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung zut
Behandlung von Ktebs- bzw. Tumotetktankungen, beispielsweise Melanom, wie malignem Melanom, Hautmelanom, Catzinom, wie Coloncatzinom, Lungencatcinom, wie kleinzelligem
Lungencarzinom, Adenocarcinom, Ptostatacatcinom, Speisetöhtencatcinom, Btustcatcinom,
Nietencatcinom, Sactom, Myelom, Leukämie, insbesondete akutet myeloischer Leukämie,
Gliom, Lymphomen, und Blastomen. Bei Tumotetktankungen kodiett die etfindungsgemäße füt ein Tumotantigen kodietende mRNA votzugsweise füt ein tumotspezifisches Oberflä- chenantigen (TSSA).
Ein ebenfalls weitetet Gegenstand der Etfindung betrifft die Verwendung eines etfindungs¬ gemäßen Gemisches zut Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs- bzw. Tumorerkrankungen, beispielsweise Melanom, wie malignem Melanom, Hautmelanom, Car- zinom, wie Coloncarzinom, Lungencarcinom, wie kleinzelligem Lungencarziαom, Adenocar¬ cinom, Prostatacarcinom, Speiseröhrencarcinom, Brustcarcinom, Nierencatcinom, Sacrom, Myelom, Leukämie, insbesondere akuter myeloischer Leukämie, Gliom, Lymphomen, und Blastomen. Bei Tumorerkrankungen kodiett die erfindungsgemäße für ein Tumorantigen kodierende mRNA vorzugsweise für ein tumorspezifisches Oberflächenantigen (TSSA). Der Begriff „Arzneimittel" und der Begriff „pharmazeutische Zusammensetzung" sind erfin¬ dungsgemäß synonym zu verstehen.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Figuren und Beispielen weiter il¬ lustriert, ohne dass diese dazu gedacht sind, die Gegenstände der vorliegenden Erfindung hierauf zu beschränken.
Figuren:
In den nachfolgenden Figuren 1 bis 13, die RNA-Nukleinsäuresequenzen darstellen, ist das Start-Codon und gegebenenfalls auch das Stop-Codon jeweils in Fettdruck-Buchstaben ange¬ geben. Grau unterlegt sind die Sequenzabschnitte, die die nicht translatierte Region (unttans-
lated region, UTR) des humanen alpha-globin Gens betreffen, welches die mRNA stabilisiert und ferner die Translation der mRNA erhöht.
Figur 1 zeigt die Melan A-αg- A70RNA-Nukleinsäuresequenz
Figur 2 zeigt die Tyrosinase-αgA70 RNA-Nukleinsäuresequenz
Figur 3 zeigt die MAGE Al -αgA70 RNA-Nukleinsäuresequenz
Figur 4 zeigt die MAGE A6-αGA70 RNA-Nukleinsäuresequenz
Figur 5 zeigt die Survivin-αgA70 RNA-Nukleinsäuresequenz
Figur 6 zeigt die HER-2/neu-αgA70 RNA-Nukleinsäuresequenz
Figur 7 zeigt die CEA -OCgA70 RNA-Nukleinsäuresequenz
Figur 8 zeigt die Mucinl -OCgA70 RNA-Nukleinsäuresequenz
Figur 9 zeigt die GPlOO-CCgA70 RNA-Nukleinsäuresequenz
Figur 10 zeigt die ßg -FLUWT-OCgA70 RNA-Nukleinsäuresequenz. Es handelt sich um die Nukleinsäuresequenz einer Varianten — eine Punktmutation enthaltend - des Influenza A/Hong Kong/1/68 Mattixprotein. Accession number AF348197
Figur 11 zeigt die ßg-FLUGC rich-αgA70 RNA-Nukleinsäuresequenz. Es handelt sich um die GC-angereichterte Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein kodiert, das identisch zu dem Influenza A/PR/8/34 Matrixprotein, Accession number V01099, ist.
Figur 12 zeigt die HBS-OCgA70 RNA-Nukleinsäuresequenz
Die vorgenannten in den Figuren dargestellten RNA-Sequenzen enthalten sowohl den codie¬ renden Bereich als auch weitere Sequenzen am 5'- und am 3'-Terminus. Am 3'-Terminus können bspw., wie in den Figuren dargestellt, Kozak-Sequenzen bzw. Ribosomen- Bindungssequenzen vorliegen. Am 5'-Terminus kann eine Poly-A-Sequenz, bspw. aus einem Globin-Gen (α oder ß), vorliegen. Bei den vorgenannten Sequenzen wurde jeweils die nicht translatierte α-Globin-Sequenz flankierend am 5'- und am 3'-Ende die codierenden Bereiche der bezeichneten Gene angefügt.
Figur 13 zeigt die Auswirkung der Verwendung verschiedenen Puffer auf die Expressi¬ on von mRNA. Hierzu wurden verschiedenen Mäusen verschiedene Injekti- onsansäzte (enthaltend mRNA, kodierend für Luziferase, und jeweils unter¬ schiedliche Puffer) ins Ohr injiziert und die Expressionsrate durch Messung der Luziferaseaktivität mittels Iichtemission bestimmt. Die genaue Versuchs¬ durchführung wird im nachfolgenden Beispiel 2 erläutert. Die Messungen wurden alle 15 Sekunden für 45 Sekunden vorgenommen. Entsprechend sind die Werte in Fig. 13 auf der x-Achse in jeweils drei Säulen für jeden der Puffer dargestellt. Auf der Y-Achse ist die Expressionsrate in NLU/sec. Maus wie- dergegeben. Wie zu erkennen ist, liegt die Expressionsrate des Injektionsan¬ satzes, der Ringer-Lactat-Lösung als Puffer enthält, extrem höher als bei den anderen verwendeten Puffersystemen.
Figur 14: In Figur 14 ist der Verlauf des klinischen Versuchs dargestellt. Hierbei sind zwei verschiedene Versuchsanordnungen gezeigt (I (obere Tabelle), II (untere
Tabelle)). W (= Wochen). Nach der ersten Versuchsanordnung wurde zu¬ nächst alle zwei Wochen injiziert, später im Abstand von 4 Wochen (X indi¬ ziert Verabreichung). Nach der zweiten Versuchsanordnung wurde 2x in den ersten beiden Wochen injiziert, dann alle 4 Wochen. Die Injektionen (jeweils identisch in den beiden Versuchsanordnungen) wurden den Patienten der bei¬ den Versuchsanordnungen jeweils parallel intradermal in das linke und rechte Bein verabreicht. Die injizierten Lösungen enthielten bei beiden Versuchsan-
Ordnungen ein erfindungsgemäßes RNA-Gemisch, das sich aus Tumoranti- gen-RNA (Survivin, CEA, Mucin-1, Her-2/neu, MAGE-Al) und viraler Anti- gen-RNA (Influenza matrix GC rieh, HBS) in gleichen absoluten Mengen zu¬ sammensetzt. Die verabreichten Tumorantigen-RNAs entsprachen den iα den Figuren 3 (MAGE-Al), 5 (Survivin), 6 (HER2 neu) und 7 (CEA) bzw. 8 (Mu- cinl) dargestellten Sequenzen. Das verabreichte vitale Antigen HBS entsprach der Sequenz in Figur 12 und das weitere vitale Antigen der in Figur 11 darge¬ stellten FLU-GC rieh Sequenz. Bei letzterer handelt es sich um die einzige im verabreichten Gemisch enthaltene G/C optimierte Sequenz. Insgesamt wur- den 200 μg RNA der vorbezeichneten Antigene in 300 μl Ringer-Laktatlösung aufgelöst. Den Patienten wurden hiervon ca. 100 μl der Lösung (pro Injekti¬ on) in das linke bzw. rechte Bein verabreicht. Die restliche Lösung verblieb in der Injektionsspritze. Jeweils einen Tag nach der Verabreichung des RNA- Gemisches "wurde den Patienten GM-CSF, ebenfalls intradermal in das Bein, verabreicht.
Die Darstellung des Agarose-Gels zeigt die Banden der acht verschiedenen RNA-Antigene im erfindungsgemäßen Gemisch.
Figur 15 : Figur 15 zeigt die Versuchsanordnung 1 (Arm 1) mit insgesamt 16 behandel- ten Patienten, die an malignen Erkrankungen leiden (RCC: Nierenzellcarci- nom, Ovarialkarzinom oder Brustkrebs) bzw. (Arm 2) 11 Patienten mit RCC oder colorektalem Carcinom. Es handelt sich jeweils um die Angabe der Pri- märtumore. Die Patienten zeigen allerdings auch metastasierende Sekundär- tumore. Die Patienten wurden einer Computertomographie unterzogen (CT- Scan). Auf diese Weise wurde der Status der Patienten (S: stabil, P: progressiv oder R: regressiv) ermittelt.
Figur 16 : Figur 16 zeigt die intrazelluläre Cytokin-Anfärbung. Es wurde die zelluläre Immunantwort über FACS Analyse ausgewertet. Nach verschiedenen Zeit- punkten (T) wurden die Blutzellen geerntet und eingefroren. Nach T 8 wer¬ den alle Proben ausgewertet, indem die IFN-gamma-Sekretion analysiert und als Aktivierungsmarker für eine CD4-T-Zell-Antwort oder CD8-T-Zell-
Antwort angesehen wurde. Der verabreichte erfindungsgemäße RNA-Cocktail ■wurde hierbei getrennt nach Stimulatoren (Flu und HBS) oder Tumorantige¬ nen (der Rest) untersucht.
Figur 17 : In den Auftragungen von Figur 17 wird der Verlauf der gemessenen Zellzah¬ len für CD4- bzw. CD8-Zellen bei drei verschiedenen Patienten dargestellt. Die Auftragungen zeigen die Korrelation der biochemischen Befunde (siehe Beispiel 4) und der klinischen Ergebnisse beim Patienten. Beim Patienten 1 zeigte sich klinische Stabilität zu allen Zeitpunkten, zu denen CT-Scans (vor Behandlung und jeweils vierteljährlich danach) aufgenommen wurden (SSSS).
Patient 2 (Pat2) hingegen wies zum Zeitpunkt des letzten CT-Scans einen progressiven Krankheitsverlauf auf (SSSP). Progressiver Krankheitsverlauf korreliert mit geringeren CD4- bzw. CD8-Zelltitern. Aufgetragen sind % der Interferon-gamma-positiven Zeilen pro Patient.
Figur 18 : Figur 18 zeigt Darstellungen aus CT-Scans, wobei die Lunge des Patienten vor (links) bzw. nach (rechts) Vakzinierung mit dem erfindungsgemäßen RNA- Gemisch dargestellt ist. Wie durch die Tumorgröße (siehe Pfeile) dieses Se¬ kundärtumors in der Lunge dargestellt, hat sich diese bei den Patienten nach 6-monatiger behandlung signifikant verkleinert.
Die Figuren 19 bis 81 stellen RNA-Sequenzen von verschiedenen, jeweils bezeichneten Ge¬ nen dar, die in Hinblick auf deren jeweiligen G/C-Gehalt sequenzoptimiert wurden. Die Se¬ quenzoptimierung erfolgte nach dem in der veröffentlichten Patentanmeldung WO 2002/098443 beschriebenen Verfahren, d.h. die Sequenzen weisen — ohne zu einer Verände¬ rung des hierdurch jeweils codierten Proteins zu führen — einen maximalen G/C-Gehalt auf, wodurch eine Stabilisierung der RNA erreicht wird. Alle Sequenzen der Figuren 19 bis 81 (welche nur den codierenden Bereich darstellen) können in einem erfindungsgemäßen RNA- Gemisch, bevorzugt unter Modifizierung am 3'- und oder 5'-Terminus (bspw. unter Hinzufü- gung einer Kozak-Sequenz oder eines Poly-Schwanzes oder einer Ribosomen-Bindungsstelle), enthalten sein.
Beispiele:
Beispiel 1: Herstellung des erfindungsgemäßen Gemisches
Die tnRNA wurde durch in vitro Transkription geeigneter Template-DNA und anschliessen- der Extraktion und Aufreinigung der mRNA erhalten. Hierzu können Standardverfahren verwendet, die im Stand der Technik zahlreich beschrieben werden und dem Fachmann ge¬ läufig sind. Beispielsweise Maniatis et al. (2001), Molecular Cloning: Laboratory Manual, CoId Spring Harbour Laboratory Press. Gleiches gilt auch für die Sequenzierung der mRNA, die sich der (nachfolgend beschriebenen) Aufreinigung der mRNA anschloss. Hier wurde insbe¬ sondere das NBLAST-Programm verwendet, wie bereits oben beschrieben.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Gemische erfolgte generell gemäß nachfolgender Vorgehensweise:
1. Vektor
Die Gene, welche für die in den jeweiligen Gemischen eingesetzten mRNAs kodieren, wur¬ den in den PlasmiάVektor pT7TS eingeführt. pT7TS enthält nicht translatierte Regionen des alpha- oder des beta-Globingens sowie einen polyA-Schwanz von 70 Nukleotiden:
T7 promoter Xbal
Xenopus ß-globin 5'Untranslated region: GCTTGTTCTTTTTGCAGAAGCTCAGAATAAACGCTCAACTTTGGC
Xenopus ß-Globin 3' nicht translatierte Region ("Untranslated region"):
GACTGACTAGGATCTGGTTACCACTAAACCAGCCTCAAGAACACCC- GAATGGAGTCTCTAAGCTACATAATACCAACTTACACTTACAA- AATGTTGTCCCCCAAAATGTAGCCATTCGTATCTGCTCCTAATAAA- AAGAAAGTT TCTTCACATTCTA oder human α-Globin nicht translatierte Region: CT AGTGACTGA- o TAGCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACC
Abbildung: Graphik des Plasmidvektors pT7TS
Es wutden Plasmide hoher Reinheit mit dem. Qiagen Endo-free Maxipreparation Kit oder mit dem Machery-Nagel GigaPrep Kit erhalten. Die Sequenz des Vektors wurde über eine 5 Doppelstrang-Sequenzierung vom T7 Promotor bis zur Pstl- oder Xbal-Stelle kontrolliert und dokumentiert. Plasmide, deren eiαklonierte Gensequenz korrekt und ohne Mutationen ist, wurden für die in vitro Transkription benutzt.
2. Gene
0 Die Gene, welche für erfindungsgemäßen Gemische eingesetzten mRNAs kodieren, wurden mittels PCR amplifiziert oder aus den (oben beschriebenen) Plasmiden extrahiert. Für die erfindungsgemäßen „Carcinoma"- bzw. „meloma"- bzw. „AML"-Gemische wurden folgende Konstrukte eingesetzt:
5 HBS (Accession number E00121):
Plasmid-Fragment Hindlll/ Nsil blunt (= mit stumpfem Ende) in T7TS HinDIII/Spel blunt
FLUWT (Accession number AF348197): Plasmid-Fragment Spei blunt in T7TS BgIII blunt/ Spei blunt 0
FLUGC-reich kodiert für ein Matrix Ml Protein, das 60%, vorzugsweise 65%, stärker bebor- zugt 70%, ebenfalls stärker bevorzugt 80%, ebenfalls stärker bevorzugt 85%, am. stärksten bevorzugt 90% Sequenzhomologie zu dem Protein mit der Accession number V01099: Plas- mid-Fragment Bglll/Spel in T7TS Blgll/Spel
GP100 (Accession number M77348): PCR-Fragment Spei in T7TS HinDIII blunt/Spel
MAGE-Al (Accession number M77481): Plasmid-Fragment HinDIII/Spel in T7TS HinDIII/Spel
MAGE-A6 (Accession number: NM_005363): PCR-Fragment Spei in T7TS HinDIIIblunt/Spel
Her2/neu (Accession number: M11730):
PCR-Fragment HinDIII/Spel in T7TS HinDIII/Spel
Tyrosinase (Accession number: NM_000372): Plasmid-Fragment EcoRI blunt in T7TS HinDIII blunt/Spel blunt
Melan-A (Accession number: NM_005511):
Plasmid-Fragment NotI blunt in T7TS Hindill blunt/Spel blunt
CEA (Accession number: NM_004363): PCR-Fragment HinDIII/Spel in T7TS HinDIII/Spel
CMV pp65 (Accession number: M15120): PCR-Fragment BamHI/Spel in T7TS Bglll/Spel
Tert (Accession number: NM_003219) :
PCR fragment HindHI/Spel in T7TS HinDIII/Spel
WTl (Accession number: NM_000378):
Plasmid fragment EcoRV/Kpnl blunt in T7TS HinDIII blunt/Spel blunt
PR3 (Accession number: NM_002777): Plasmid fragment EcoRl blunt/Xbal in T7TS HinDIII blunt/Spel
PRAME (Accession number: NM_006115):
Plasmid fragment BamHl blunt/Xbal in T7TS HinDIII blunt/Spel
Survivin (Accession number AF077350):
PCR-Fragment HinDIII/Spel in T7TS HinDIII/Spel
Mucinl (Accession number NM_002456):
Plasmid-Fragment: SacI blunt/BamHI in T7TS HinDIII blunt/Bglll
Tenascin (Accession number X78565):
PCR fragment BgIII blunt/Spel in T7TS HinDIII blunt/Spel
EGFRl (Accession number AF288738): PCR fragment HinDIII/Spel in T7TS HinDIII/Spe I
Sox9 (Accession number Z46629):
PCR fragment HinDIII/Spel in T7TS HinDIII/Spel
SecόlG (Accession number NM_014302):
PCR fragment HinDIII/Spel in T7TS HinDIII/Spel
PTRZl (Accession number NM_002851):
PCR fragment EcoRV/Spel in T7TS HinDIII blunt/Spel
3. in vitro Transkription
3.1. Herstellung Protein-freier DNA
500 μg von jedem der vorbeschriebenen Plasmide wurden in einem Volumen von 2,5 ml durch einen Verdau mit dem Restriktionsenzym PstI oder Xbal in einem 15 ml Falcon Röhr- chen linearisiert. Dieses geschnittene DNA-Konstrukt wurde in die RNA Produktionseinheit überfuhrt. 2,5 ml einer Mischung aus Phenol/ Chloroform/Isoamylalkohol wurde zu der line- arisierten DNA zugegeben. Das Reaktionsgefäß wurde für 2 Minuten gevortext und für 5 Minuten bei 4.000 rpm zentrifuguiert Die wässάg Phase wurde abgehoben und mit 1,75 ml 2-Propanol in einem 15 ml Falcon Röhrchen vermischt. Dieses Gefäß wurde 30 Minuten bei 4.000 rpm zentrifugiert, der Überstand verworfen und 5 ml von 75% Ethanol zugegeben. Das Reaktionsgefäß wurde für 10 Minuten bei 4.000 rpm zenrifugiert und der Ethanol wurde ent¬ fernt. Das Gefäß wurde nochmals für 2 Minuten zentrifugiert und die Reste des Ethanols wurden mit einer Mikroliter-Pipettenspitze entfernt. Das DNA Pellet wurd dann in 500 μl RNase-freien Wasser aufgelöst (1 μg/μl).
3.2. enzymatische mRNA-Synthese Materialien:
• T7 Polymerase: aufgereinigt aus einem E.co/Ϊ-Stamm, der ein Plasmid mit dem Gen für die Polymerase enthält. Diese RNA-Polymerase verwendet als Substrat nur T7 Phagen-Promotor-Sequenzen (Fa. Fermentas),
• NTPs: chemisch synthetisiert und über HPLC aufgereinigt. Reinheit über 96% (Fa. Fermentas),
• CAP Analogon: chemisch synthetisiert und über HPLC aufgereinigt. Reinheit über 90% (Fa. Trilink),
• RNase Inhibitor: Rnasin, Injectable grade, rekombinant hergestellt (E.coli) (Fa. Fer¬ mentas),
• DNase: Vertrieb als Medikament über Apotheken als Pulmozym® (dornase alfa) (Fa. Roche).
In ein 15 ml Falcon Röhrchen witd folgendes Reaktionsmix pipettiert: 100 μg linearisierte proteinfreie DNA,
400 μl 5x Puffer (Tris-HCl pH 7.5, MgCl2, Spermidin, DTT, Inorganische Pyrophosphotase
25 U),
20 μl Ribonuclease Inhibitor (rekombinant, 40 U/μl); 80 μl rNTP-Mk (ATP5 CTP, UTP 10OmM) , 29μl GTP (100 mM); 116 μl Cap Analog (100 mM);
50 μl T7 RNA Polymerase (200 U/μl) ; 1045 μl RNase-freies Wasser.
Das Gesamtvolumen betrug 2 ml und wurde für 2 Stunden bei 37 °C im Heizblock inkubiert. Danach wurden 300 μl DNAse: Pulmozyme ™(1 U/μl) zugegeben und die Mischung wurde für weitere 30 Minuten bei 37 0C inkubiert. Hierbei wurde das DNA-Template enzymatisch abgebaut.
5. Aufreinigung der mRNAs
5.1. LiCl-Präzipitation (Lithium-Chlorid/Ethanolfallung)
Bezogen auf 20-40 ug RNA wurde diese folgendermaßen durchgeführt:
LiCl-Fällung 25 μl liCl-Lösung [8M]
30 μl WFI („water for injection", Wasser zur Injektion) wurden zu dem Transkriptionsansatz (20 μl) gegeben und vorsichtig gemischt. In das Reaktionsgefäß wurden 25 μl IiCl-Lösung zugegeben und die Lösungen mindestens 10 Sekunden gevortext. Der Ansatz wurde bei — 20°C für mindestens 1 Stunde inkubiert. Das verschlossene Gefäß wurde anschließend bei 40C mit 4.000 rpm für 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Waschen Es wurden 5 μl 75%iger Ethanol zu jedem Pellet zugegeben (unter der Sicherheitswerkbank). Die verschlossenen Gefäße wurden 20 Minuten bei 40C mit 4.000 rpm zentrifugiert. Der Ü-
berstand wurde verworfen (unter der Sicherheitswerkbank) und es wurde nochmals 2 Minu¬ ten bei 40C mit 4.000 rpm zentάfugiert. Der Überstand wurde vorsichtig mit einer Pipette entfernt (unter der Sicherheitswerkbank). Danach wurde das Pellet ca. 1 Stunde getrocknet (unter der Sicherheitswerkbank). Resuspension
Zu den gut getrockneten Pellets wurden je 10 μl WFI gegeben (unter der Sicherheitswerk¬ bank). Das jeweilige Pellet wurde sodann in einem Schüttelgerät über Nacht bei 4°C gelöst.
5.2. Endreinigung Die Endreinigung erfolgte durch Phenol-Chloroform-Extraktion. Sie kann ebenfalls mit¬ tels Anionenaustauschchromatographie erfolgen (z.B. MEGAclear ™ von Fa. Ambion oder Rneasy von Fa. Qiagen). Nach dieser Aufreinigung der mRNA, wurde die RNA ge¬ gen Isopropanol und NaCl präzipitiert (1 M NaCl 1:10, Isopropanol 1:1, gevortext, 30' bei , 4.000 rpm und 4 °C zentrifugiert und das Pellet wurde mit 75% Ethanol gewaschen). Die mittels Phenol-Chloroform-Extraktion aufgereinigte RNA wurde in RNase freiem Wasser gelöst und mindestens 12 Stunden bei 4 °C inkubiert. Die Konzentration jeder mRNA wurde bei OD260 Absorption gemessen. (Die Chlorophorm-Phenol-Extraktion erfolgte nach Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1,2,3 (1989)).
6. Mischen der mRNAs
Die aufgereinigten mRNAs wurden in der für das jeweilige erfindungsgemäße mRNA Gemisch gewünschten Zusammensetzung gemischt.
Es wurden gleiche Mengen von jeder in dem jeweiligen erfindungsgemäßen Gemisch enthal- tenen mRNA gemischt und die Lösung wurde durch Gefriertrocknen oder durch Alkohol- Präzipitation (Isopropanol oder Ethanol mit NaCl) lyophilisiert. Das Pellet wurde in RNAse- freiem Wasser mit einer Konzentration von 5 mg/ml resuspendiert.
Nachfolgend wurde diese Lösung je nach Bedarf mit einem Puffer verdünnt. Bevorzugt ver- wendete Puffer hierfür waren:
Ringer-Lactat-Lösung (Fresenius) oder PBS (Phosphat gepufferte Saline) oder isotonischer Kochsalzlösung, welche auch durch HEPES gepuffert werden kann.
Hierbei ist besonders hervorzuheben, dass den Erfindern mit der Ringer-Lactat-Lösung als verwendetem Puffer eine 5-fach höhere Effektivität erzielt wurde, als mit allen anderen ver¬ wendeten Puffern. Solche Werte sind im Stand der Technik bislang nicht bekannt. Nähere Daten hierzu ergeben sich aus Beispiel 2 (s. unten)
Die Verdünnungen wurden bis zu einer finalen Konzentration für die Injektion (ca. 0,6 μg/μl RNA, es wurde eine Variationsbreite von 0,1 μg/μl bis zu 10 μg/μl verwendet, bevorzugt wurde die Konzentration auf 0,6 oder 0,8 oder 1 μg/μl eingestellt) vorgenommen. Das Ge¬ misch wurde je nach Bedarf mit stabilisierenden kationischen Agenzien, wie z. B. Protamin, versetzt (ca. 0,12 μg/μl, es wurde eine Variationsbreite von 0,01 μg/μl bis zu 10 μg/μl ver¬ wendet, bevorzugt wurde die Konzentration auf 0,12 oder 0,16 oder 0,2 μg/μl eingestellt). Das Gemisch wurde bei -20 bis -80 °C stabil aufbewahrt, ggf. wurde es vor einer Injektion für kürzere Zeit auch bei Raumtemperatur 40C bis vor Injektion aufbewahrt.
Beispiel 2: Auswirkung verschiedener Puffer auf die Expressionsrate
Um die Effektivität verschiedener Puffer zu testen, wurde folgendes Experiment durchge¬ führt: Es wurden mehreren Mäusen jeweils gleiche Mengen an mRNA, die für Luziferase aus Photi- nuspjralis kodiert, ins Ohr injiziert, wobei die mRNA in getrennten Versuchsansätzen in ver¬ schiedenen Puffern (s. Beispiel 1) aufgenommen war. Die Injektionsansätze pro Ohr enthiel¬ ten die folgenden Zusammensetzungen:
Injektionsansatz mit Ringer-Lactat-Lösung 20μl lmg/mlmRNA 80μl 1 x Ringer Lactat (#2620521, Fa. Fresensius-Kabi)
In)ektionsansat2 mit PBS 20μl lmg/ml mRNA 50μl 2 x PBS (Standard-Lösung) 30μl Wasser (H2O)
Injektionsansatz mit HEPES /NaCl 20μl lmg/ml mRNA
50μl 2 x Puffer (2OmM Hepes, pH 7,4, 300 mM NaCl) 30μl Wasser (H2O)
Die Mäuse wurden 15 Stunden nach der Injektion durch cervicale Dislokation getötet. Die Ohren wurden entfernt, rasiert, unter Stickstoff zerkleinert und anschliessend in Lysepuffer (25 mM TrisHCl pH 7,5, 2 mM EDTA, 10% Glycerol, 1% Triton X-IOO; frische Zugabe von DTT auf 2 mM und PMSF auf 1 mM) homogenisiert. Die Homogenisierung erfolgte auf Eis. Nachfolgend wurde das Homogenisat bei 4 °C für 10 Min bei maximaler Umdrehung in einer Mikrozentrifuge (Microfuge) zentrifugiert. Der Überstand wurde danach abgenommen, das Lysat aliquotiert und bei — 80°C gelagert.
Der Nachweis der Luziferaseaktivität wurde anhand eines Standardverfahren durchgeführt („Luciferase Reporter Gene Assay, constant light signal Chemilumineszenz-Assay zur quanti¬ tativen Bestimmung der Luciferase-Aktivität in transfizierten Zellen", optimiert für den Gebrauch mit Luminometern, Fa. Roche, Best. Nr. 1 897 667). Zusammengefasst, erfolgte die — jeweils doppelt durchgeführte - Bestimmung der Luziferaseaktivität durch die Messung der Lichtemission von 50 μl Lysat nach Zugabe von 300 μl Messpuffer (25 mM Glycylglycin pH 7,8, 15 mM Magnesiumsulfat, 5 mM ATP (frisch zugegeben)) und 100 μl Luciferin (250 μM in Wasser) als Substrat. Die Messungen erfolgten gegen eine leere Platte (LP) und gegen mRNA, kodierend für lacZ in PBS („lacZ mRNA") als Negativkontrollen. Im Ergebnis (s. Figur 13) ergibt sich eine bei weitem höhere Expression von Luziferase, wenn die Luziferase mRNA in der Ringer-Lactat-Lösung aufgenommen wurde, im Vergleich zu den Injektionsan¬ sätzen, in denen die Luziferase mRNA in PBS oder in HEPES /NaCl-Puffer aufgenommen wurde.
Beispiel 3: Stabilisierung det mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches
Als eine beispielhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Gemisches wurde die Nuk- leinsäuresequenz des codierenden Bereichs der in dem Gemisch enthaltenen mRNAs bezüg¬ lich ihres G/C-Gehalts optimiert. Zur Ermittlung der Sequenz einer erfindungsgemäß modi¬ fizierten mRNA wurde das bereits oben erwähnte, und in der WO 02/098443 beschriebene, Computerprogramm verwendet, das mit Hilfe des genetischen Codes bzw. dessen degenerati- ver Natur die Nucleotid-Sequenz einer beliebigen mRNA derart modifiziert, dass sich ein maximaler G/C-Gehalt in Verbindung mit der Verwendung von Codons, die für möglichst häufig in der Zelle vorkommende tRNAs codieren, ergibt, wobei die durch die modifizierte mRNA codierte Aminosäure-Sequenz gegenüber der nicht-modifizierten Sequenz vorzugs¬ weise identisch ist. Alternativ kann auch nur der G/C-Gehalt oder nur die Codonverwendung gegenüber der ursprünglichen Sequenz modifiziert werden. Der Quellcode in Visual Basic 6.0 (eingesetzte Entwicklungsumgebung: Microsoft Visual Studio Enterprise 6.0 mit Servicepack 3) ist ebenfalls in der WO 02/098443 offenbart.
Beispiel 4: Klinische Versuche
Die Durchführung der klinischen Versuche bei den mit erfindungsgemäßen RNA-Gemischen behandelten Patienten findet sich in Figur 14 beschrieben. Zur Überprüfung der klinischen Ergebnisse wurden parallel Untersuchungen von Blutproben vorgenommen, die den Patien- ten vor und während der Behandlung entnommen wurden. Die Blutproben wurden dann auf Ifn-γ positive Zellen (CD4- und CD8-Zellen) hin untersucht und deren Anteil an der Ge¬ samtzahl der Zellen bei jedem einzelnen behandelten Patienten bestimmt. Die Zu- oder Ab¬ nahme dieser Zellzahlen korreliert mit dem klinischen Phänotyp der Patienten und erweist sich somit als Marker für den Therapieerfolg.
Im einzelnen wurden periphere Blutmonozyten (PBMCs) den Patienten am Tag der ersten Vakzinierung, am Tag der vierten Vakzinierung (T4) etc. entnommen und durch Ficoll-
Gradienten gereinigt und in flüssigem Stickstoff gefroren. Am Ende der Vakzinierungsperio- de wurde ein Röhrchen (VM) aufgetaut, mit 10 μg eines erfindungsgemäßen rnRNA- Gemisches, enthaltend gleiche Mengen an Tumorantigenen (Survivin + Mage- Al+Her2neu+Mucinl+CEA) oder gleichen Mengen von viralen Antigenen (Influenza GC rieh + HBS), transfiziert. Die Transfektion wurde durch Elektroporation durchgeführt. Die Zellen wurden in Kultur gegeben und nach einer Woche durch neu transfizierte, aufgetaute autologe periphere Blutmonozyten re-stitnuliert. Nach einer weiteren Woche der Kultivierung wurden wiederum einige neu transfizierte, autologe, aufgetaute periphere Blutmonozyten zur Kultur hinzugefügt. 6 Stunden später wurden die Zellen gesammelt, fixiert und permeabili- siert, und zwar unter Verwendung des Cytoficx-Cytoperm Kits von BD-Pharmingen. Ein Cocktail von Antikörpern wurde verwendet, um die Zellen anzufärben: CD4-FITC, Antife- ron-γ PE und CD8 PercP. Nach dem Waschen wurden die Zellen durch FACS analysiert.
Die Auftragungen gemäß Figuren 16 und 17 zeigen die Anzahl von CD4 oder CD8 T- Lymphocyten, die gegenüber den Antigen-Cocktails reaktiv sind (Interferon-γ positive Zel¬ len). Es gibt unter den am Ende der Behandlung gesammelten Zellen mehr reaktive Zellen als unter den im Blut zur Beginn der Behandlung gesammelten Zellen. Dies lässt darauf schlie¬ ßen, dass die Injektionen des aktiven RNA-Gemisches eine antivirale (Flu- und/oder Hbs) und eine Antitumor- (Her2neu und/oder Suvivin und/oder Mucin-1 und/oder Her2 und/oder CEA) Zellantwort ausgelöst hat. In einigen Patienten (im wesentlichen vier und zehn) wurden mehr reaktive Zellen im Blut am Ende der Behandlung gesammelt als zu Be¬ ginn der Behandlung. In Figur 17 stellt SSS eine stabilisierte Erkrankung nach drei konsekuti¬ ven CT-Scans dar. P bedeutet Progression.