WO2001004155A2 - Interleukin-12 der katze als immunstimulans - Google Patents
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Classifications
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Definitions
- the invention relates to the long cytokine Interleuk ⁇ n-12 (IL-12) and its use as an immunostimulant in fids
- Interleukin 12 belongs to the class of cytokines, a group of
- IL-12 Proteins which mediate signals between different cells involved in the coordination and execution of the immune response.
- IL-12 was published as a "Natural Killer Cell Stimulatory Factor" (Trinchien et al in EP 0 441 900, US 5,571, 515).
- Interleukin 12 is a heterodimeric protein , consisting of the subunits p35 and p40 IL-12 belongs to a class of cytokines which are at the beginning of the formation of an immune response, close to the systems of innate immunity (macrophages, complement) and have a decisive influence on the development of the type of forming adaptive immune response have IL-12 in the series of so-called "type 1" cytokines, which favor the formation of a cytotoxic, T-cell-based response favor IL-12 stimulates, inter alia, the secretion of interferon gamma in CD4 -pos ⁇ t ⁇ ven T helper cell population Because of these properties, IL-12 was allowed to be used as an adjuvant or as an immunostimulant to cure pre-existing diseases are
- the natural protection against infectious diseases is based on the recognition of structures of successfully controlled pathogens by the immune system. Two main activities can be distinguished. On the one hand, this is the activity of the humoral immune system, which is based on the synthesis of antibodies by the plasma cells from B-lymphocytes, but also humoral components of non-adaptive, innate immunity such as the complement system.
- Antibodies are soluble protein molecules that are able to specifically attach to an antigen that is accessible to these antibodies either in soluble form or on the surface of cells, bacteria and viruses. By complexing with antibodies, the pathogens or toxins are either inactivated or identified for components of the non-adaptive immune system, which then eliminate them.
- the cellular immune system is also known, which is based on the activity of T-lymphocytes in particular, but also "natural killer cells” (NK cells) and antigen-presenting cells of the innate immune system.
- T-lymphocytes are able to recognize body cells infected with viruses as "foreign” if the infected cells present suitable structures recognizable for the T cells.
- NK cells natural killer cells
- T-lymphocytes are able to recognize body cells infected with viruses as "foreign” if the infected cells present suitable structures recognizable for the T cells.
- T helper cells so-called CD4 + cells
- CD8 + cells directly initiates the lysis of the cell recognized as foreign or infected
- the cellular arm of the immune system is induced by activation of so-called type 1 helper cells and the humoral arm by activation of so-called type 2 helper cells (Mosmann et al., 1986).
- the cellular arm is also referred to as the ' TH1 pathway ' and the humoral arm as the ' TH2 pathway ' of the immune system.
- Bacteria are usually controlled by the TH2 arm by covering antigenic binding sites on the surface of the bacteria with antibodies. Bacteria covered in this way can then be eliminated by phagocytes.
- the TH2 arm of the immune system is also important for neutralizing bacterial toxins and for fighting various parasites that are located in the extracellular space in the patient's body.
- Infection pathogens which are primarily intracellular, as is known for individual types of bacteria and all viruses, are primarily combated by the TH1 arm of the immune system, i.e. by cytotoxic T cells.
- Different pathogens stimulate only one arm of the immune system, and certain infectious diseases, as a result of which only the TH2 arm is activated, cannot be controlled by the immune system, or cannot be controlled efficiently. In such cases, stimulation of a TH2 response by vaccination is also ineffective. Induction of the TH1 immune response after vaccination is only possible if it is the vaccine antigen is a reproductive agent. Vaccines that are unable to reproduce in the animal can only induce a humoral, but not a cellular, immune response.
- Invention to provide a functional feline IL-12 and / or a necessary nucleic acid-based sequence, and thereby in the fleins to induce a TH1 immune response in the target cells via synthesis of interferon gamma or other biologically active molecules.
- this object is achieved by expressing the two polypeptide chains of the subunits p35 and p40 of feline interleukin 12 in eukaryotic or prokaryotic cells by means of recombinant gene expression and to provide the proteins formed in such a way that they are present in equimolar concentrations in the presence of an immunization agent suitable antigen can be used. It is irrelevant whether the antigen is administered together with the IL-12 by co-injection or other forms of external delivery, or whether the antigen is already in the course of an existing infection or allergy to be treated (not -human) animal, e.g. Cat, is present and contributes locally to the development of the desired answer.
- the immunostimulant of the present invention can also be achieved by the control of cat-operable promoter and terminator or polyadenylation sequences of one or more DNA constructs consisting of genes encoding the p35 and p40 subunits of feline IL-12 , are placed directly in the cells of the cat, where they bring about the synthesis of functioning IL-12 and thus induce the desired cascade of immunostimulatory signals, primarily primarily the induction of the synthesis of interferon gamma.
- Another aspect of the invention is an immunostimulant for the therapy of certain diseases or. Adjuvant for co-injection with antigen.
- Immunostimulant can also be used for
- TH1 response is helpful. This has already been postulated for various animal species and for humans (Gately and Mulqueen, 1996), but has so far not been demonstrated.
- diseases in which the feline IL-12 adjuvant of the present invention can be used are infection with the feline coronavirus, which leads to the widespread and feared feline infectious peritonitis (FIP).
- feline infectious peritonitis FIP
- this disease results in a massive excess weight of a TH2 response, which leads to vasculitis, peritonitis and death. This early assumption was confirmed by measuring the cytokine activity in cats with FIP.
- cytokines specific for TH2 could be detected in abundance, but IL-12 and interferon gamma could hardly be detected or not at all. Further examples result from infection with the FIV or the feline leukemia virus (FeLV). These two retrovirus infections are characterized by the intracellular presence of the virus, which eludes a humoral immune response. By stimulating the TH1 response by administering IL-12 it is possible to make the amount of virus in infected cats disappear or at least to reduce it significantly. These are just a few application examples; the list is not exhaustive.
- the present invention generally also encompasses polypeptides with at least 95% sequence similarity to that of the polypeptide encoded by the nucleotide sequence flL12p40 (p40 subunit of feline IL-12: SEQ ID NO 1) and flL12p35 (IL-12SEQ ID NO 2) as Immune stimulant, especially for prevention and therapy in carnivores, especially in the domestic cat.
- flL12p40 p40 subunit of feline IL-12: SEQ ID NO 1
- IL-12SEQ ID NO 2 flL12p35
- nucleic acid constructs that contain sequences with at least 95% sequence similarity to the sequences of flL12p40 (p40 subunit of the feline IL-12: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO:
- Contain NO 1) and flL12p35 (p35 subunit of the feline: SEQ ID NO 2), and in which the sequences are under the control of an operable promoter and terminator sequence in higher animals, such as carnivores, in particular furds, especially domestic cats, operable promoter and terminator sequence, are suitable immunostimulants , for immunization against infectious diseases and for the therapy of infectious and
- Corresponding nucleic acid constructs are preferably those in which the construct consists of a linear, double-stranded DNA double strand which contains only one promoter and the coding sequence per strand.
- a polypeptide according to the invention is suitable as a therapeutic agent for tumor diseases and autoimmune diseases, or for diseases in which a TH1- There is a deficit, especially in the case of pre-existing FIV, FeLV and coronavirus infections.
- a nucleic acid construct according to the invention is suitable as an adjuvant for the prophylactic immunization against viral diseases of carnivores, in particular baits, especially domestic cats, especially for immunization against the FIV
- nucleic acid construct according to the invention is also suitable as a therapeutic agent for diseases in which there is a TH1 deficit, in particular in the case of pre-existing FlV infection, FeLV infection or FCoV infection.
- FIG. 1 shows the cloning strategy of the p35 construct, showing how the feline p35 gene was stably supplemented by sequences from the human 11-12 p35.
- Figure 2 is a sequence comparison of human and feline p35.
- 1st line human sequence pG-hLL12p;
- 2nd line feline sequence according to Fehr et al .; fil12p35a;
- 3rd line recombinant sequence pMOL-flL12 p35;
- FIG. 3 shows an IRES construct, the construct being preceded by a CMV and a T7 promoter and important restriction sites being shown.
- FIG. 4 shows the expression of interferon (IFN) -
- FIG. 5 shows the RNA virus load in animals of the third
- the core of the invention is the provision of both subunits of the IL-12, in a form which enables their expression, preferably in feline cells or tissues.
- the basis for this is the successful cloning of the coding sequences of both subunits in recombinant expression constructs
- Periodic blood tests can then be used to determine how the immunization behaves Four cats each showed that the animals in group 1 (vaccinated with FIV-DNA and IL-12) performed better in all relevant parameters with which the infection can be characterized than animals in group 2, which only with the FIV- DNA had been vaccinated (see Example 4) embodiments
- Example 1a Recombinant feline IL-12, p40
- the confirmed sequence was again PCR-amplified using the primers 5'-GTAGCGGATA AGGTACCATG CATCCTCAGC AGTTGGT (SEQ ID NO 4) and 5'-GAGAGTTCTC AGAGCTCATC CTGGGGGTGG AACCTAA (SEQ ID NO 5) according to standard conditions and the isolated amplification and restriction enzyme was then cloned and cloned using the restriction enzyme digested and used between the Kpnl and Sstl interfaces of the vector pMol using known methods. The result was the plasmid pMol-flL12p40.
- Example 1b Recombinant feline IL-12, p35
- a human p35-encoding plasmid pMOL-hlL12p35 was used as a template for the amplification with the primers f12p35-l-long (71 mer) 5 ' - TGCTGACAGC TATTGATGAG CTGTTACAGG CCCTGAATGT CAACAGTGTG ACTGTGCCAC AGAACTCCTC p (SEQL ID12TC) C (SEQ -) - r (76mer)
- the amplificate was digested using the residual functional endonucleases SstI and Kpnl and used between the Kpnl and Sstl interfaces of the vector pMol using known methods.
- the result was the plasmid pMol-flL12p35.
- the resulting reaction mixture was concentrated and after buffering with 100 U restriction endonuclease HindIII and 100 U T7 DNA polymerase in the absence of deoxyribonucleotides above sea level. digested.
- the resulting product was purified by anion exchange chromatography and, after control by gel electrophoresis and PCR control, was free of residues of the undesired fragment.
- Example 2a In vitro transcription / translation of the two IL-12 p35 and p40 chains
- Construct 1 was based on the p40 sequence produced by PCR, which was incorporated into the pCIneo Vector (Promega).
- the plasmid contained the CMV and the T7 promoter and was named pCI-p40.
- Construct 2 was based on the p35 sequence produced by PCR, which was incorporated into the vector pCITE4a (+) (Novagen)
- the plasmid contained the IRES (infernal nbosomal entry site), which preceded the p35 sequence. This plasmid was called pCITE-p35.
- Construct 3 corresponded to the construct shown in FIG. 3, it was called pCI-flL-12. In vitro translation was carried out with the three constructs mentioned above to check the correct translation of the two subunits p35 and p40
- the plasmids pCI-p40, pCITE-p35 and pCI-flL-12 were heaned and transcribed in vitro using the T7 Cab Scribe Kit (Boehnnger Mannheim).
- the RNA was purified and translated in vitro using the Flexi TM Rabbit Reticulocyte Lysate Systems (Promega) was used.
- the translation products were labeled with 35 S methionones.
- the newly synthesized proteins were separated on an SDS gel according to their molecular weight. The gel was dried under vacuum and exposed to a film which was then attached The bands found on the film corresponded in molecular weight to that expected for p35 and p40 (Table 1)
- Example 2b In vitro induction of IFN gamma in cat cells by incubation with cell culture supernatant containing IL-12
- the experiment mentioned below was carried out.
- the plasmid pCI-flL-12 was hernized.
- the DNA was transcribed on the one hand in vitro using the T7 Cab Scribe Kit (Boehnnger Mannheim) and on the other hand used directly for transfection.
- the resulting RNA was used for short-term transfection of BHK-21 cells.
- RNA transfection was carried out under routine conditions.
- BHK-21 cells were treated with water under the same conditions for negative control transfected.
- SP2 / 0 cells were used and grown on G418 medium 24 hours after transfection.
- cells were transfected with water for control purposes.
- Untransfected cells died within 7 days because, due to the lack of the neomycin resistance gene, they were unable to protect themselves from the toxic effects of the neomycin.
- the supernatants of the cells transfected with RNA or DNA, in which the IL-12 was suspected were used for the culture of lymphocytes freshly obtained from specified pathogen-free (SPF) cats. Prior to their use, these lymphocytes were incubated with the cell culture supernatant containing IL-12 for 72 hours at 37 ° C.
- Example 2c In vivo induction of IFN gamma in cats by injection of IL-12 protein
- Example 2d Checking the functionality of the complete IL-12 or the individual chains p35 and p40 after ballistic transfer into the feline cell line 3201
- 3201 cells were bombarded with gold beads (diameter 1 micron). The gold beads had previously been coated with the gene coding for p35 and p40 or with the gene coding for the green fluorescing protein (GFP). In parallel, 3201 cells were also transfected electrically with that for p35 alone, that for p40 alone, that for p35 and p40, and with the gene coding for GFP. Aliquots of the 3201 cells were then cocultured with SPF lymphocytes for 24 hours.
- GFP green fluorescing protein
- the lymphocytes were harvested periodically and examined for the expression of IFN gamma as described in Example 2c. The results are shown in Figure 4. It becomes clear that the transfection by means of gold beads and by means of electric current leads to the production of IFN gamma 16 to 24 hours after cocultivation of the transfected cells with the lymphocytes. Ballistic or electrical transfection with GFP or the p35 or p40 genes alone does not lead to IFN gamma synthesis.
- Example 3 Immunization of the cat against FIV using IL-12 as an adjuvant.
- IL-12 as an adjuvant can improve the effectiveness of a vaccine
- a vaccination test was carried out in which 3 groups of 4 cats were used.
- the basic antigen in all groups (with the exception of the control group) was the gene which codes for the gp140-SU antigen.
- the gene construct mentioned here should generally be referred to as gp140-DNA.
- Vaccination by direct injection of naked DNA is disclosed in US 5,580,859, US 5,589,466 and US 5,593,972.
- the DNA constructs were according to Wittig et al. (WO 98/21322); they contained minimalistic expression constructs consisting only of the coding sequence, in front of which the sequence of the cytomegalo virus promoter (CMV) had been placed.
- CMV cytomegalo virus promoter
- the coding sequence and the CMV promoter were used as linear double-stranded molecules which were covalently terminated on both sides in order to prevent extracellular or intracellular degradation by exonucleases.
- the DNA constructs were adsorbed onto small gold particles, which were shot directly into the skin of the test animals. The animals were bombarded three times three weeks apart with the appropriate constructs, the DNA being raised to 1 mg gold per shot.
- a helios gene gun Biorad, Kunststoff, Germany
- a pressure of 500 psi were used for the immunization.
- the entire DNA Dose was approx. 2 ⁇ g per animal per vaccination.
- Vaccine contained: Research question no. Negative controls, none of these cats
- the protective effect of the different vaccine preparations was determined by measuring the following parameters at weekly intervals (exception: measurement of the RNA load, only in week 5)
- the amount of FIV-RNA in the plasma of these cats was determined using a TaqMan ® -PCR method
- FIV-RNA virus load in plasma The results of the FIV-RNA quantification in the plasma of the cats are shown in FIG. 5. The results can be commented as follows:
- Group 1 The RNA virus load was highest here.
- Group 2 The cats vaccinated with the gp140 DNA showed a significantly lower RNA virus load than the animals of the controls; From this it can be deduced that the gp140 construct alone can induce partial protection. These results are in agreement with the serology.
- Amount of proviral DNA The results of the quantification of the proviral amount of DNA of all cats are summarized in Table 6. The results can be commented as follows:
- Group 1 As with serology and RNA measurement, the animals in Group 1 also proved to be fully susceptible to the test infection.
- Group 2 The animals in group 2 were also provirus positive without exception, but the mean amount of FIV provirus was only marginally lower than that of the control group.
- IL-12 DNA together with gp140-DNA can induce a high protective effect.
- the protective effect manifests itself on the one hand in less virus replication, which leads to little or no absence of seroconversion and / or to less integration of the viral DNA into the host cell DNA.
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Abstract
Es wird felines Interleukin-12 (IL-12) als Adjuvans resp. Immunstimulans, sowohl bei der Vakzinierung als auch bei der Therapie von Infektionskrankheiten von Feliden beschrieben. Ferner werden Verfahren offenbart, die es gestatten, beide Untereinheiten des IL-12 in den erforderlichen Mengenverhältnissen zu exprimieren.
Description
lnterleukin-12 der Katze als Immunstimulans
Beschreibung Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft das fehne Zytokin lnterleukιn-12 (IL-12) und seine Anwendung als Immunstimulans bei Fehden
Stand der Technik
Das Interleukin 12 (IL-12) gehört zu der Stoffklasse der Zytokine, einer Gruppe von
Proteinen, welche Signale zwischen verschiedenen an der Koordination und Exekution der Immunantwort beteiligten Zellen vermitteln IL-12 wurde als "Natural Killer Cell Stimulatory Factor" veröffentlicht (Trinchien et al in EP 0 441 900, US 5,571 ,515) Interleukin 12 ist ein heterodimeres Protein, bestehend aus den Unter- einheiten p35 und p40 IL-12 gehört zu einer Klasse von Zytokinen, welche am Anfang der Bildung einer Immunantwort, nahe den Systemen der angeborenen Immunitat (Makrophagen, Komplement) stehen und entscheidenden Einfluss auf die Entwicklung des Typs der sich bildenden adaptiven Immunantwort haben IL-12 gehört dabei in die Reihe der sog „Typ-1 "-Zytokine, welche die Ausbildung einer zytotoxi- sehen, auf T-Zellen basierenden Antwort favorisieren IL-12 stimuliert u a die Sekretion von Interferon gamma in der CD4-posιtιven T-Helferzellpopulation Auf Grund dieser Eigenschaften durfte sich IL-12 als Adjuvans oder als Immunstimulans zur Heilung vorbestehender Krankheiten eignen
Der natürliche Schutz vor Infektionskrankheiten beruht auf der Wiedererkennung von Strukturen erfolgreich bekämpfter Erreger durch das Immunsystem Dabei können zwei Hauptaktivitaten unterschieden werden Auf der einen Seite ist dies die Aktivität des humoralen Immunsystems, welches auf der Synthese von Antikörpern durch die von B-Lymphozyten stammenden Plasmazellen, aber auch humoralen Komponenten der nicht-adaptiven, angeborenen Immunitat wie dem Komplement- System beruht Antikörper sind lösliche Proteinmolekule, welche in der Lage sind,
sich spezifisch an ein Antigen anzuheften, das entweder in löslicher Form oder auf der Oberfläche von Zellen, Bakterien und Viren für diese Antikörper zugänglich ist. Durch die Komplexierung mit Antikörpern werden die Erreger oder Toxine entweder inaktiviert oder für Komponenten des nicht-adaptiven Immunsystems kenntlich ge- macht, die es dann beseitigen. Neben dem humoralen Immunsystem kennt man auf der anderen Seite das zelluläre Immunsystem, welches auf der Aktivität vor allem von T-Lymphozyten, aber auch „natürlichen Killerzellen" (NK-Zellen) und Antigen- präsentierenden Zellen des angeborenen Immunsystems, beruht. T-Lymphozyten sind in der Lage, mit Viren infizierte Körperzellen als „fremd" zu erkennen, wenn die infizierten Zellen geeignete Strukturen für die T-Zellen erkennbar präsentieren. Je nach spezieller Funktion der T-Zelle amplifiziert und modifiziert diese dann das Signal der Fremderkennung (T-Helferzellen, sog. CD4+ Zellen), oder leitet direkt die Lyse der als fremd oder infiziert erkannten Zelle ein (zytotoxische T-Zellen, sog. CD8+Zellen). Für das Funktionieren der Immunantwort ist die korrekte Kooperation des humoralen mit dem zellulären Immunsystem entscheidend. In den letzten zehn
Jahren wurde klar, dass der zelluläre Arm des Immunsystems durch Aktivierung von sog. Typ-1 -Helferzellen und der humorale Arm durch Aktivierung von sogenannten Typ-2- Helferzellen induziert wird (Mosmann et al., 1986). Entsprechend dieser Bezeichnung der Helferzellen wird der zelluläre Arm auch als 'TH1 pathway' und der humorale Arm als 'TH2 pathway' des Immunsystems bezeichnet. Bakterien werden meistens durch den TH2-Arm bekämpft, indem antigene Bindungsstellen, welche sich an der Oberfläche des Bakteriums befinden, mit Antikörpern bedeckt werden. Solchermaßen bedeckte Bakterien können in der Folge von Fresszellen eliminiert werden. Der TH2-Arm des Immunsystems ist ferner wichtig für die Neutralisierung von Bakteriengiften und für die Bekämpfung verschiedener Parasiten, die sich im extrazellulären Raum im Körper des Patienten befinden. Infektionserreger, die sich vor allem intrazellulär aufhalten, wie dies für einzelne Bakterienarten und sämtliche Viren bekannt ist, werden dagegen hauptsächlich durch den TH1-Arm des Immunsystems, also durch zytotoxische T-Zellen bekämpft. Verschiedene Erreger führen zu einer Stimulierung nur eines Armes des Immunsystems, und bestimmte Infektionskrankheiten, in deren Folge nur der TH2-Arm aktiviert wird, können in der Regel vom Immunsystem nicht oder nicht effizient kontrolliert werden. In solchen Fällen ist die Stimulierung einer TH2-Antwort durch Impfung ebenfalls unwirksam. Die Induktion der TH1 -Immunantwort nach Vakzinierung ist nur dann möglich, wenn es sich
beim Vakzine-Antigen um ein vermehrungsfähiges Agens handelt. Vakzine, welche zur Vermehrung im Tier nicht in der Lage sind, vermögen nur eine humorale, nicht aber eine zelluläre Immunantwort zu induzieren.
Vor einigen Jahren konnte gezeigt werden, dass die Induktion einer TH1-Antwort unter anderem von der Synthese von IL-12 abhängt. Als diese Zusammenhänge bei der Maus bekannt geworden waren, begannen mehrere Gruppen nach dem IL-12 der Katze zu suchen, da Katzen von verschiedenen Infektionskrankheiten heimgesucht werden, zu deren Überwindung ein funktionierendes TH1 Immunsystem Vorbedingung ist. Als Beispiele sind hier zu nennen die Infektion mit dem felinen Im- munschwächevirus (FIV), dem felinen Leukämievirus (FeLV) und dem felinen Co- ronavirus (FcoV).
Eine Sequenz der p35-Untereinheit des felinen IL-12 wurde 1994 veröffentlicht (Bush K, et al. 1994). Die vollständige Sequenz, welche 1996 bestimmt wurde, wurde 1997 veröffentlicht (Fehr et al., 1997; Schijns et al., 1997). Nach diesen Veröf- fentlichungen lag es nahe, die Funktion des IL-12 in-vivo zu untersuchen, insbesondere die Frage, ob die Funktion des IL-12 die gleichen immunologischen Wirkungen hinsichtlich der Steuerung der sich entwickelnden Immunantwort habe. Trotz großer Anstrengungen mehrerer mit dieser Aufgabe befasster Gruppen erwies sich der Nachweis der Funktionalität der veröffentlichten Sequenz sowie der Nachweis der Funktion als Immunstimulans bisher als unmöglich. Es ist aus anderen Tieren bekannt, dass für die Funktionalität des gebildeten IL-12 beide Untereinheiten im richtigen Verhältnis zeitgleich in der selben Zelle gebildet werden müssen (Picotti et al. 1997). Bei bisherigen Versuchen mit felinem IL-12 misslang dies. Eine noch fundamentalere Hürde lag in den, bis heute nicht vollkommen geklärten, Schwierigkeiten, eine funktionelle rekombinante Sequenz des felinen p35 in E.Coli zu klonieren. Zwar war die Sequenz aus Teilbereichen der Gesamtsequenz repräsentierenden Rekom- binanten bereits Jahre bekannt, doch trotz der hohen Ähnlichkeit des felinen IL-12 zu den menschlichen und bovinen Sequenzen gelang es bisher nicht, einen durchgängigen Klon der p35-Sequenz zu isolieren.
Ausgehend vom dargelegten Stand der Technik ist es Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, ein funktionsfähiges felines IL-12 und/oder eine dazu notwendige Sequenz auf Nukleinsäurebasis zur Verfügung zu stellen, und dadurch bei der Fehden
via Synthese von Interferon Gamma oder anderen biologisch aktiven Molekülen in den Zielzellen eine TH1-lmmunantwort zu induzieren.
Darstellung der Erfindung
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, durch Methoden der rekom- binanten Genexpression die beiden Polypeptidketten der Untereinheiten p35 und p40 des felinen Interleukin 12 in eukaryoten oder prokaryoten Zellen zu exprimieren und die gebildeten Proteine derart bereitzustellen, dass sie in äquimolaren Konzentrationen in Anwesenheit eines zur Immunisierung geeigneten Antigens zur Anwendung gebracht werden können. Dabei ist es unerheblich, ob das Antigen durch Koin- jektion oder andere Formen der externen Beibringung zusammen mit dem IL-12 verabreicht wird, oder ob das Antigen im Verlaufe einer bestehenden, zu therapie- renden Infektion oder Allergie bereits in dem zu behandelnden (nicht-menschlichen) Tier, z.B. Katze, vorhanden ist und dort lokal zur Entwicklung der gewünschten Antwort beiträgt.
Alternativ kann eine Vakzinierung unter Verwendung des Adjuvans resp. Immunstimulans der vorliegenden Erfindung auch dadurch erreicht werden, dass ein oder mehrere DNA-Konstrukte, bestehend aus Genen, die für die p35 und die p40 Untereinheiten des felinen IL-12 kodieren, unter Kontrolle von in der Katze operablen Promotor- und Terminator- oder Polyadenylierungssequenzen, direkt in Zellen der Katze verbracht werden, wo sie die Synthese von funktionierendem IL-12 herbeiführen und damit die erwünschte Kaskade von immunstimulatorischen Signalen, primär vor allem die Induktion der Synthese von Interferon gamma, induzieren. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Immunstimulans zur Therapie bestimmter Krankheiten resp. Adjuvans zur Koinjektion mit Antigen.
Das erfindungsgemäße IL-12-Adjuvans resp. Immunstimulans kann auch für die
Therapie jener Krankheiten verwendet werden, bei denen eine TH1 -Antwort hilfreich ist. Dies ist z.T. schon für verschiedene Tierarten und für den Menschen postuliert worden (Gately and Mulqueen, 1996), konnte bisher aber nicht nachgewiesen werden. Beispiele für Krankheiten, bei denen das feline IL-12-Adjuvans der vorliegen- den Erfindung einsetzbar ist, sind die Infektion mit dem felinen Coronavirus, welche zu der weitverbreiteten und gefürchteten felinen infektiösen Peritonitis (FIP) führt.
Bei dieser Krankheit kommt es aus Gründen, die zur Zeit nicht bekannt sind, zu einem massiven Übergewicht einer TH2-Antwort, in deren Folge es zu Vaskulitis, Pe- ritonitis und zum Tod kommt. Diese schon früh geäußerte Vermutung wurde durch Messung der Zytokin-Aktivität bei an FIP erkrankten Katzen bestätigt. Alle für TH2 spezifischen Zytokine konnten im Überfluss, IL-12 und Interferon Gamma jedoch kaum oder überhaupt nicht nachgewiesen werden. Weitere Beispiele ergeben sich aus der Infektion mit dem FIV oder dem felinen Leukämievirus (FeLV). Diese beiden Retrovirus-Infektionen sind charakterisiert durch intrazelluläres Vorhandensein des Virus, wodurch diese sich einer humoralen Immunantwort entziehen. Durch Stimula- tion der TH1 -Antwort durch Verabreichung von IL-12 ist es möglich, die Virusmenge in infizierten Katzen zum Verschwinden zu bringen oder mindestens wesentlich zu reduzieren. Dies sind nur einige Anwendungsbeispiele; die Liste ist nicht abschließend.
Die vorliegende Erfindung umfasst generell auch Polypeptide mit mindestens 95 % Sequenzähnlichkeit zu jener des Polypeptides, das von der Nukleotidsequenz flL12p40 (p40 Untereinheit des felinen IL-12: SEQ ID NO 1) und flL12p35 (IL- 12SEQ ID NO 2) kodiert wird, als Immunstimulans, insbesondere zur Prävention und Therapie bei Fleischfressern, im speziellen bei der Hauskatze.
Auch Nukleinsäure-Konstrukte, die Sequenzen mit mindestens 95 % Sequenzähn- lichkeit zu den Sequenzen von flL12p40 (p40 Untereinheit des felinen IL-12: SEQ ID
NO 1) und flL12p35 (p35 Untereinheit des felinen: SEQ ID NO 2) enthalten, und bei welchen die Sequenzen unter Kontrolle einer in höheren Tieren, wie Fleischfressern, insbesondere Fehden, speziell Hauskatzen, operablen Promotor- und Terminatorsequenz stehen, sind erfindungsgemäß geeignete Immunstimulantien, zur Im- munisierung gegen Infektionskrankheiten sowie zur Therapie von Infektions- und
Tumorerkrankungen von Fleischfressern, insbesondere von Fehden, speziell von Hauskatzen. Entsprechende Nukleinsäure-Konstrukte sind vorzugsweise solche, bei denen das Konstrukt aus einem linearen, an beiden Enden kovalent verbundenen DNA-Doppelstrang besteht, der lediglich pro Strang eine Promotor- und die kodie- rende Sequenz enthält.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid eignet sich als Therapeutikum bei Tumorerkrankungen sowie Autoimmunkrankheiten, oder bei Erkrankungen, bei denen ein TH1-
Defizit vorliegt, wie insbesondere bei vorbestehender FIV-, FeLV- und Coronavirus- Infektion.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäure-Konstrukt eignet sich als Adjuvans zur prophylaktischen Immunisierung gegen virale Erkrankungen von Fleischfressern, ins- besondere Fehden, speziell Hauskatzen, speziell zur Immunisierung gegen die FIV-
Infektion und/oder zur Immunisierung gegen die FeLV-Infektion. Ferner ist ein erfindungsgemäßes Nukleinsäure-Konstrukt auch als Therapeutikum bei Erkrankungen, bei denen ein TH1 Defizit vorliegt, insbesondere bei vorbestehender FlV-Infektion, FeLV-Infektion oder FCoV-Infektion, geeignet.
Weitere vorteilhafte Maßnahmen sind in den übrigen Unteransprüchen enthalten.
Die Erfindung wird nun in der Folge anhand von einigen durchgeführten Beispielen, sowie in den Figuren näher erläutert, die jedoch lediglich zum besseren Verständnis der Erfindung beitragen sollen, ohne sie in irgendeiner Weise zu beschränken. Es zeigt:
Figur 1 zeigt die Klonierungsstrategie des p35 Kon- struktes, wobei dargestellt ist, wie das feline p35 Gen durch Sequenzen des humanen 11-12 p35 stabil ergänzt wurde.
Figur 2 ist ein Sequenzvergleich des menschlichen und felinen p35. Legende:
1. Zeile: menschliche Sequenz pG-hlL12p;
2. Zeile: feline Sequenz nach Fehr et al.; fil12p35a;
3. Zeile: rekombinante Sequenz pMOL-flL12 p35;
4. Zeile: linker primer des 3'-Fragmentes; 5. Zeile: rechter primer des 3'-Fragmentes
Figur 3 zeigt ein IRES Konstrukt, wobei dem Konstrukt ein CMV und ein T7 Promotor vorangestellt ist und wichtige Restriktionsstellen eingezeichnet sind.
Figur 4 zeigt die Expression von Interferon (IFN)-
Gamma in Lymphozyten, die mit Ueberstanden von 3201 Zellen inkubiert wurden, die vorgangig mit verschiedenen Polynukleotiden transfiziert worden wa- ren p35E elektroporiert.es p35, IL12p35p40E e- lektroponertes komplettes IL-12, IL12p40E elektro- poπertes p40, GFP BT ballistisch transfiziertes GFP Gen, IL12p35p40 BT ballistisch transfiziertes komplettes IL-12, GFP-E elektroponertes GFP Gen
Figur 5 zeigt den RNA Virus Load bei Tieren der 3
Gruppen in Woche 5
Wege zur Ausführung der Erfindung
Kern der Erfindung ist die Bereitstellung beider Untereinheiten des IL-12, in einer Form, die deren Expression, bevorzugt in felinen Zellen bzw Geweben, ermöglicht Grundlage dessen ist die erfolgreiche Klonierung der kodierenden Sequenzen beider Untereinheiten in rekombinanten Expressionskonstrukten
Die Klonierung der p40-Untereιnheιt kann mit für den Fachmann gangigen Verfahren erfolgen Die genaue Beschreibung eines möglichen Vorgehens, namhch der Rekombination in das Expressionspiasmid pMol (pMol-flL12p40), welches eine Möglichkeit zur Herstellung der minimahstischen Expressionskonstrukte darstellt, findet sich unten in Beispiel 1
Die Klonierung des Expressionskonstruktes von p35 erwies sich hingegen als äußerst schwierig Die früher publizierte Sequenz war aus zwei überlappenden Klonen gewonnen worden Trotz mehrfacher Versuche erfahrener Experimentatoren war es bisher nicht möglich, aus RNA stimulierter Lymphozyten amphfizierte cDNA der vollen Sequenzlange des kodierenden Bereiches des p35 zu klonieren Die gewonnenen rekombinanten Sequenzen wiesen jeweils Deletionen im 3 '-Bereich des kodierenden Bereiches auf Letztlich wurde dann auf eine semisynthetische Strategie zurückgegriffen, welche die relativ große Ähnlichkeit des humanen p35 und des felinen IL-12 im 3'-Bereιch ausnutzt Dabei wurde der 5'- Bereich der p35-Sequenz
aus feliner cDNA amplifiziert. Der 3'-Bereich des späteren Konstrukts wurde aus einer menschlichen Sequenz amplifiziert, wobei in den dazu verwendeten Primern einige Basen so gewählt worden waren, dass sie Unterschiede zwischen der menschlichen und der felinen Sequenz zugunsten der felinen Sequenz korrigierten. Das gewonnene 3'-Konstrukt wies eine Überlappung zum amplifizierten, aus felinen
Sequenzen gewonnenen 5'-Konstrukt auf. Die beiden Konstrukte wurden dann zur Strangtrennung erhitzt und in einer PCR-Reaktion mit Primern umgesetzt, die auf den Enden des Gesamtfragmentes lagen. Erstaunlicherweise konnten keine Rekombinanten gefunden werden, die die erwarteten, in der PCR-Reaktion verwende- ten Primersequenzen in vollem Umfang enthielten. Stattdessen fanden sich immer wieder in den humanen Sequenzen vorkommende Basen innerhalb der verwendeten Primersequenzen. Diese Punktmutationen führten zu einer Reihe von Substitutionen in der Aminosäuresequenz des p35 Proteins. Die Ursache des Phänomens ist nicht klar. Eine Skizze der Klonierungsstrategie findet sich in Figur 1. Eine mögliche vollständige Methode zur Klonierung findet sich in Beispiel 1. Der Sequenzvergleich zur veröffentlichten Sequenz findet sich in Figur 2.
Die vorstehend skizzierte Amplifikation von IL12-p35 führte zu dem überraschenden Ergebnis der Insertion einer exprimierbaren, funktionellen p35-Sequenz im Expres- sionsplasmid pMol (pMol-flL12p35).
Aus den Rekombinanten pMol-flL12p35 sowie pMol-flL12p40 wurden lineare dop- pelsträngige, kovalent geschlossene Expressionskonstrukte durch Restriktion, Liga- tion und Verdau gewonnen (siehe Beispiel 1 c). Alle weiteren Versuche wurden, wo nicht anders geschildert, mit diesen Konstrukten durchgeführt.
Neben den Untereinheiten des felinen IL-12, die in SEQ ID NO 1 und SEQ ID NO 2 dargestellt sind, können auch andere Sequenzen (sowohl Polypeptid- als auch Po- lynukleotid-Sequenzen) eingesetzt werden, sofern sie mit den obengenannten Sequenzen mind. etwa 95% Homologie(Sequenzähnlichkeit) aufweisen. Die Homologie wurde im Rahmen dieser Erfindung nach dem Programm Complign des Pakets Mac Molly Tetra (www.moloqen.com) mit den Parametern gap penalty = 3; mis- match penalty = 1 bestimmt.
Zur Synthese von aktivem IL-12 können beispielsweise SP 2/0-Zellen mit einem DNA-Expressionskonstrukt transfiziert werden, welches IL-12 unter Kontrolle nur eines Promotors enthalt Diese Strategie dient dazu, die zeitliche und räumliche Gemeinsamkeit der Expression beider Untereinheiten sicherzustellen Dazu wird z B hinter der die kleinere Untereinheit kodierenden Sequenz eine sogenannte „m- ternal nbosomal entry Site" (IRES-Sequenz) eingeführt (vergleiche Figur 3) Als Beweis der Funktionalität kann der Nachweis der Induktion der Interferon (IFN)- gamma-Expression in-vitro und in-vivo durch Injektion des Uberstandes der transfi- zierten Zellen in Katzen dienen Kontrolltransfizierte Zellen zeigten dieses Phano- men nicht (Einzelheiten siehe Beispiele 2a-2c)
In einem weiteren Experiment wurde gezeigt, dass durch Transfektion von Katzenzellen mit den beiden für p35 und p40 kodierenden Genen diese in-vitro in Kokultur gehaltene Lymphozyten der Katze zur IFN-gamma-Produktion anregen können Ziel dieses Experimentes war es festzustellen, ob auch die separat verabreichten Gene korrekt abgelesen und in ein funktionierendes IL-12 zusammengebaut werden Um abzuklären, ob dieses IL-12 den beabsichtigten biologischen Effekt (Induktion von Interferon Gamma) zu erreichen in der Lage ist, wurden die transfizierten Lymphozyten mit Lymphozyten von spezifiziert pathogenfreien (SPF)-Katzen kokultiviert Von den Kokulturen wurden in periodischen Abstanden Ahquots entnommen, aus denen die Interferon-Gamma-mRNA bestimmt wurde (siehe
Beispiel 3)
Im Rahmen weiterer Untersuchungen wurden Katzen mit einer für FIV spezifischen DNA- Vakzine immunisiert, wobei IL-12-DNA als Adjuvans eingesetzt wurde Parallel dazu wurden Katzen nur mit der FIV-DNA immunisiert Als gut geeignet erwies sich eine dreimalige Immunisierung im Abstand von drei Wochen Der Grad der Immuni- sierung kann ermittelt werden, indem z B drei Wochen nach der dritten Immunisierung die geimpften Tiere zusammen mit nicht geimpften Tieren einer FIV- Testinfektion unterzogen werden Durch periodische Blutuntersuchungen kann dann festgestellt werden, wie sich die Immunisierung verhalt In einem Experiment mit je vier Katzen zeigte sich, dass die Tiere der Gruppe 1 (vakziniert mit FIV-DNA und IL- 12) in allen relevanten Parametern, mit denen die Infektion charakterisiert werden kann, besser abschnitten als Tiere der Gruppe 2, welche nur mit der FIV-DNA vakziniert worden waren (siehe Beispiel 4)
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1a: Rekombinantes felines IL-12, p40
Aus felinen periphären Blutlymphozyten wurde nach Stimulation derselben mit Staphylococcus Protein A RNA isoliert, cDNA gewonnen und mittels der Primerpaa- re 5"-GAGAGTTCTC AGAGCTCCTA ACTGCAGGAC ACGGATG (SEQ ID NO 3) sowie 5 -GTAGCGGATA AGGTACCATG CATCCTCAGC AGTTGGT (SEQ ID NO 4) unter Standardreaktionsbedingungen der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert. Das Amplifikat wurde in den Vektor „Topo" (Invitrogen) eingesetzt und in Bakterien vermehrt. Nach Isolation von Klonen und Kontrolle der Sequenz wurde eine Re- kombinante gewählt, durch Restriktion mit den Enzymen Kpnl sowie Sst1 das eingesetzte Amplifikat der p40-kodierenden Sequenz ausgeschnitten und in den Vektor pG (Mologen, Berlin) eingesetzt. Die bestätigte Sequenz wurde mittels der Primer 5'-GTAGCGGATA AGGTACCATG CATCCTCAGC AGTTGGT (SEQ ID NO 4) sowie 5'-GAGAGTTCTC AGAGCTCATC CTGGGGGTGG AACCTAA (SEQ ID NO 5) wiederum nach Standardbedingungen PCR-amplifiziert und das isolierte Amplifikat mittels der Restriktionsendonukleasen Sstl und Kpnl verdaut und mittels bekannter Methoden zwischen die Kpnl und Sstl-Schnittstellen des Vektors pMol eingesetzt. Ergebnis war das Plasmid pMol-flL12p40.
Beispiel 1b: Rekombinantes felines IL-12, p35
Aus felinen periphären Blutlymphozyten wurde nach Stimulation derselben mit
Staphylococcus Protein A RNA isoliert, cDNA gewonnen und mittels der Primerpaare flL12-p35(eco-)-r (76mer) δ'-GAGAGTTCTC AGAGCTCCTA GGAAGCATTC AGATAGCTCA TCATTCTATT GATGGTCACT GCACGGATTC TGAAAG (SEQ ID NO 6) sowie fil12-p35-l (37mer) 5" -GTAGCGGATA AGGTACCATG TGCCCGCCGC GTGGCCT (SEQ ID NO 7) unter Standardreaktionsbedingungen der Polymerase-
Kettenreaktion amplifiziert. Das Amplifikat zeigte eine im Vergleich zur erwarteten Länge verkürzte Sequenz. Es wurde humanes p35-kodierendes Plasmid pMOL- hlL12p35 als Templat für die Amplifikation mit den Primern f12p35-l-lang (71 mer) 5'- TGCTGACAGC TATTGATGAG CTGTTACAGG CCCTGAATGT CAACAGTGTG ACTGTGCCAC AGAACTCCTC C (SEQ ID NO 8) sowie flL12-p35(eco-)-r (76mer)
5'-GAGAGTTCTC AGAGCTCCTA GGAAGCATTC AGATAGCTCA TCATTCTATT
GATGGTCACT GCACGGATTC TGAAAG (SEQ ID NO 9) eingesetzt und unter Standardreaktionsbedingungen der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert. Das entstandene Amplifikat wurde isoliert und mit dem Amplifikat aus Schritt 1., sowie den Primern fil12-p35-l (37mer) sowie flL12-p35(eco-)-r (76mer) unter Standardre- aktionsbedingungen der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert. Das entstandene
Amplifikat wurde mittels der Restnktionsendonukleasen SstI und Kpnl verdaut und mittels bekannter Methoden zwischen die Kpnl und Sstl-Schnittstellen des Vektors pMol eingesetzt. Ergebnis war das Plasmid pMol-flL12p35.
Beispiel 1c: minimalistische lineare kovalent geschlossene Expressionskonstrukte
1 mg des Plasmids pMol-fil12p40 (Sequenz siehe SEQ ID NO 10 in der Zusammenstellung der Sequenzen, Sequenzprotokoll) wurde mit der Restriktionsendonuklease Eco31 l vollständig verdaut. Die entstandenen Fragmente wurden mit 50 μg des 5'- phosphorylierten Desoxyoligoribonukleotids mit der Sequenz AGGGGTCCAG TTTTCTGGAC (SEQ ID NO 11 ) (TIB Molbiol, Berlin) in Anwesenheit von 20 U T4 DNA-Ligase (MBI-Fermentas, Vilnius, Litauen) sowie 10 U Eco31 l in 5 ml Reaktionspuffer bei 37°C über Nacht umgesetzt. Die Reaktion wurde durch Erhitzen auf 60°C gestoppt.
Das entstandene Reaktionsgemisch wurde konzentriert und nach Umpuffern mit 100 U Restriktionsendonuklease Hindill sowie 100 U T7-DNA-Polymerase in Abwe- senheit von Desoxyribonukleotiden ü.N. verdaut. Das entstandene Produkt wurde per Anionen-Austausch-Chromatographie gereinigt und war nach Kontrolle durch Gelelektrophorese sowie PCR-Kontrolle frei von Resten des unerwünschten Fragmentes.
Beispiel 2a: In vitro Transkription/Translation der beiden IL-12 p35 und p40 Ketten
Um die Funktionsfähigkeit des IRES-IL-12 Konstruktes zu überprüfen, wurde folgendes Experiment durchgeführt: Zunächst wurden 3 Konstrukte hergestellt. Konstrukt 1 basierte auf der durch PCR hergestellten p40 Sequenz, welche in den pCI- neo Vector (Promega) eingebaut wurde. Das Plasmid enthielt den CMV und den T7 Promotor und wurde pCI-p40 genannt. Konstrukt 2 basierte auf der durch PCR her- gestellten p35 Sequenz, welche in den Vektor pCITE4a(+) (Novagen) eingebaut
wurde Das Plasmid enthielt die IRES (infernal nbosomal entry Site), welche der p35 Sequenz vorangestellt wurde Dieses Plasmid wurde pCITE-p35 genannt Konstrukt 3 entsprach dem in Figur 3 dargestellten Konstrukt, er wurde pCI-flL-12 genannt Eine in vitro Translation wurde mit den 3 oben erwähnten Konstrukten durchgeführt, um die korrekte Translation der beiden Untereinheiten p35 und p40 zu überprüfen
Zu diesem Zweck wurden die Plasmide pCI-p40, pCITE-p35 und pCI-flL-12 hneaπ- siert und in vitro transkribiert mittels des T7 Cab Scribe Kits (Boehnnger Mannheim) Die RNA wurde gereinigt und zur in vitro Translation unter Verwendung des Flexi™ Rabbit Reticulocyte Lysate Systems (Promega) eingesetzt Die Translationsproduk- te wurden mit 35S-Methιonιn markiert Nach der Translation wurden die neu synthetisierten Proteine auf einem SDS-Gel entsprechend ihrem Molekulargewicht aufgetrennt Das Gel wurde unter Vakuum getrocknet und gegen einen Film exponiert, der anschhessend entwickelt wurde Die auf dem Film entdeckten Banden entsprachen in ihrem Molekulargewicht jenem der erwarteten für p35 und p40 (Tabelle 1)
Tabelle 1 Resultate der in vitro Translation unter Verwendung der 3 Konstrukte
Aus diesen Resultaten folgt, dass der Konstrukt pCI-flL-12 die beiden Ketten p35 und p40 korrekt zu synthetisieren vermag
Beispiel 2b In vitro-lnduktion von IFN gamma in Katzenzellen durch Inkubation mit Zellkulturuberstand, der IL-12 enthielt
Zur Prüfung der Funktionalität des IL-12 Konstruktes (gem Figur 3) wurde das nachstehend erwähnte Experiment durchgeführt Zunächst wurde das Plasmid pCI- flL-12 hnearisiert Die DNA wurde einerseits in vitro transkribiert unter Verwendung des T7 Cab Scribe Kits (Boehnnger Mannheim) und andererseits direkt zur Trans- fektion eingesetzt Die entstandene RNA wurde zur Kurzzeittransfektion von BHK- 21 Zellen verwendet Die RNA-Transfektion wurde unter Routinebedingungen durchgeführt Parallel zur Transfektion mit der vom Plasmid abgeleiteten RNA wurden zur negativen Kontrolle BHK-21 Zellen unter gleichen Bedingungen mit Wasser
transfiziert. Zur Transfektion mit der DNA und anschließenden Selektion der transfi- zierten Zellen wurden SP2/0 Zellen eingesetzt und 24 Stunden nach Transfektion auf G418 Medium gezüchtet. Auch hier wurden Zellen zur Kontrolle mit Wasser transfiziert. Nicht transfizierte Zellen starben innerhalb von 7 Tagen ab, da sie we- gen Fehlen des Neomycin-Resistenzgens nicht in der Lage waren, sich vor der toxischen Wirkung des Neomyzins zu schützen. Die Überstände der mit RNA oder DNA transfizierten Zellen, in denen das IL-12 vermutet wurde, wurden zur Kultur von frisch von spezifiziert pathogenfreien (SPF) Katzen gewonnenen Lymphozyten verwendet. Diese Lymphozyten wurden vorgängig ihrer Verwendung mit dem IL-12- haltigen Zellkulturüberstand währen 72 Stunden bei 37°C mit 0.1 % Phytohämagglu- tinin inkubiert, damit sie Gelegenheit hatten, den IL-12 Rezeptor zu produzieren. Danach wurden die Lymphozyten 2 mal mit sterilem Medium gewaschen und anschließend mit dem IL-12-haltigen Zellkulturüberstand während 48 Stunden inkubiert. Im Anschluss an diese Kultur wurden die Zellen gewaschen und daraus mittels Trizol Reagent (Gibco) die RNA extrahiert. Die RNA wurde unter Verwendung von random Hexamers als Primer einer reversen Transkription unterzogen. Gleiche Mengen der entstandenen cDNA wurden eingesetzt zur PCR-Amplifikation bezüglich IFN-Gamma und dem Housekeeping Gen GAPDH. PCR Produkte wurden auf einem 2% Agarose Gel elektrophoretisch aufgetrennt, mit Ethidiumbromid angefärbt und bezüglich der Fluoreszenzintensität photographiert und densitometrisch ausgewertet. Beurteilt wurde das Verhältnis von Färbeintensität des IFN-Gammas in Bezug auf jenes des GAPDH. Da das GAPDH-Gen immer gleichmäßig exprimiert wird, lässt es sich zur internen Standardisierung benützen. In Tabelle 2 sind die Resultate, die mit Lymphozyten von 2 Katzen durchgeführt wurden, zusammengestellt.
Tabelle 2 Induktion von IFN-Gamma in Lymphozyten von 2 SPF Katzen.
Überstand verwendet von. Verhältnis von IFN-Gamma mRNA zu GAPDH- RNA negative Kontrolle IL-12 transf. Zellen mit RNA transfizierten BHK-21 Zellen 0.0 0.310 mit DNA transfizierten SP2/0 Zellen 0.06 0.250
Es wird deutlich, dass der Überstand jener Zellen, die mit dem IL-12 Konstrukt transfiziert wurden, zur Induktion von IFN Gamma führt, während die als negative Kontrolle transfizierten Zellen kein IFN-Gamma induzieren können.
Beispiel 2c: In vivo-lnduktion von IFN gamma in Katzen durch Injektion von IL-12 Protein
Um abzuklären, ob das in Zellkultur durch Transfektion von SP2/0 Zellen mit IL-12 DNA (pCI-flL-12) entstandene IL-12 in der Katze wirksam war, wurden 2 Katzen intramuskulär mit Ahquots des IL-12— haltigen Zellkulturuberstandes resp des als negative Kontrolle angelegten Kulturuberstandes injiziert Periodisch wurde den Katzen Blut abgenommen, aus dem die Lymphozyten gereinigt wurden Aus den Lymphozyten wurde die RNA extrahiert, revers transkribiert und die entstandene cDNA zur Amphfizierung und Quantifizierung der IFN-Gamma sowie der GAPDH Sequenzen mittels der TaqMan Methode (Europaische Patentanmeldung Nr 98 124 317 3)verwendet Die Resultate sind in Tabelle 3 zusammengestellt
Tabelle 3 Verhältnis von IFN-Gamma mRNA zur GAPDH mRNA in Lymphozyten von Katzen, denen vorgangig Zellkulturüberstand inijziert worden war
Verhältnis der IFN-Gamma mRNA zur GAPDH-mRNA
Katze injiziert mit:
10 16 24 36 48
Stunden nach Injekt on des Uberstandes
IL-12-haltιgem Überstand 0 0 0 2 0 2 0 1 0 3 6 5 1 2 0 3
Kontrolluberstand ohne IL-12 2 1 0 1 0 7 0 3 0 1 1 7 0 0 0 1
Aus diesem Experiment folgt, dass das IL-12 Protein in der Katze 16 bis 24 Stunden nach Injektion in Zellen des lymphatischen Systems zur Synthese von IFN-Gamma fuhrt
Beispiel 2d Überprüfung der Funktionalität des kompletten IL-12 respektive der einzelnen Ketten p35 und p40 nach ballistischem Transfer in die feline Zellhnie 3201
Die Methode der ballistischen Transfektion von Zielzellen ist in den Schriften WO91/00539 EP 500799 beschrieben Ein Apparat hierzu ist in WO95/19799 offen-
bart. 3201 Zellen wurden mit Goldkügelchen (Durchmesser 1 Micrometer) beschossen. Die Goldkügelchen waren vorgängig beschichtet worden mit dem für p35 und p40 oder mit dem für das green fluorescing protein (GFP) kodierenden Gen. Parallel dazu wurden 3201 Zellen elektrisch auch mit dem für p35 allein, dem für p40 allein, dem für p35 und p40 sowie mit dem für GFP kodierenden Gen transfiziert. Aliquots der 3201 Zellen wurden anschließend während 24 Stunden mit SPF Lymphozyten kokultiviert. Die Lymphozyten wurden periodisch geerntet und wie im Beispiel 2c beschrieben bezüglich der Expression von IFN Gamma untersucht. Die Resultate sind in Figur 4 dargestellt. Es wird deutlich, dass die Transfektion mittels Goldkügel- chen und mittels elektrischem Strom 16 bis 24 Stunden nach Kokultivierung der transfizierten Zellen mit den Lymphozyten zur Produktion von IFN Gamma führt. Ballistische oder elektrische Transfektion mit GFP oder den p35 oder p40 Genen aliein führt nicht zur IFN Gamma Synthese.
Beispiel 3: Immunisierung der Katze gegen FIV unter Verwendung von IL-12 als Adjuvans.
Um abzuklären, ob IL-12 als Adjuvans eine Vakzine in ihrer Wirkung zu verbessern vermag, wurde ein Impfversuch durchgeführt, in welchem 3 Gruppen zu je 4 Katzen eingesetzt wurden. Grundantigen in allen Gruppen (mit Ausnahme der Kontrollgruppe) war das Gen, welches für das gp140-SU-Antigen kodiert. Das hier erwähnte Genkonstrukt soll generell als gp140-DNA bezeichnet werden. Die Impfung durch direkte Injektion nackter DNA ist in US 5,580,859, US 5,589,466 sowie US 5,593,972 offenbart. Die DNA-Konstrukte waren entsprechend Wittig et al. (WO 98/21322) hergestellt worden; sie enthielten minimalistische Expressionskonstrukte, bestehend lediglich aus der kodierenden Sequenz, vor welche noch die Sequenz des Zytomegalo-Virus-Promotors (CMV) gestellt worden war. Die kodierende Sequenz und der CMV-Promotor wurden als lineare Doppelstrangmoleküle verwendet, die beidseitig kovalent abgeschlossen wurden, um einer extra- oder intrazellulären Degradation durch Exonukleasen vorzubeugen. Die DNA-Konstrukte wurden auf kleine Goldpartikel adsorbiert, welche direkt in die Haut der Versuchstiere einge- schössen wurden. Die Tiere wurden dreimal im Abstand von drei Wochen mit den entsprechenden Konstrukten beschossen, wobei die DNA pro Schuss auf 1 mg Gold aufgezogen wurde. Zur Immunisierung wurde eine Helios gene-gun (Biorad, München, Deutschland) und ein Druck von 500 psi verwendet. Die gesamte DNA-
Dosis betrug ca 2 μg pro Tier pro Impfung Vier Wochen nach der dritten Immunisierung wurden die Tiere einer Testinfektion mit dem für die Gewinnung des Vakzi- neantigens verwendeten FlV-Stamm (Stamm Zürich 2, (Monkawa et al , 1991)) infiziert Als Infektionsdosis für die Testinfektion wurde die 25fache Menge jener Konzentration verwendet, welche bei 50 % der Katzen zur Infektion fuhren wurde (cat infective dose 50 = CID50) Bei den verschiedenen Gruppen handelte es sich um die folgenden
Tabelle 4 Zusammensetzung der Vakzinegruppen
Gruppe
Vakzine enthielt: Fragestellung Nr. negative Kontrollen, bei diesen Katzen wurde kein
1 nur Goldpartikel Schutz erwartet
2 gp140-DNA Wirksamkeit des gp140-DNA-Konstrukts allem gp140-DNA + IL-12- Abklärung der Wirkung von IL-12 im Vergleich zur
3 DNA Gruppe 2
Der Schutzeffekt der verschiedenen Vakzine-Praparationen wurde durch Messung der folgenden Parameter jeweils in wöchentlichen Abstanden (Ausnahme Messung des RNA Loads, nur in Woche 5) bestimmt
1 Antikörper gegen das Transmembran-Protein (TM) wurden mittels eines
ELISA-Verfahrens bestimmt (Calzolan et al 1995)
Die Menge der FIV-RNA im Plasma dieser Katzen wurde mittels eines TaqMan®-PCR-Verfahrens bestimmt
Die Menge der in die DNA der Lymphozyten eingebauten FIV-DNA, die sogenannte Provirus-DNA, wurde mittels eines TaqMan®-Verfahrens bestimmt (Beschreibung des TaqMan Verfahrens siehe Leutenegger et al 1999)
Die Resultate können wie folgt zusammengefasst werden
1 Serokonversion gegen TM Der Verlauf der Serokonversion ist in Tabelle 5 zusammengefasst
Daraus geht hervor, dass die Tiere der Kontrollgruppe 1 außerordentlich stark serokonvertierten, was auf eine hohe Virusreplikationsrate schließen lässt. Ab der fünften Woche waren hier vier von vier Tieren seropositiv.
In der Gruppe 2 kam es nur allmählich zur Serokonversion, und der Grad der Serokonversion war wesentlich geringer als in der Gruppe 1. In der Gruppe 2 waren auch noch in der neunten Woche nicht alle Tiere seropositiv. Dies lässt auf eine verringerte Virusvermehrung schliessen, was mit einem Schutz vereinbar ist.
In der Gruppe 3 serokonvertierte bis in die siebte Woche lediglich ein Tier, die anderen blieben völlig negativ. Dies deutet darauf hin, dass bei drei von vier Tieren ein kompletter Schutz erzielt worden ist. Beim einen positiven Tier kam es aufgrund der im Vergleich zu den Tieren der Gruppe 1 verringerten Serokonversion nur zu einer mäßigen Virusvermehrung.
Tabelle 5 IL-12 als Adjuvans, FIV Vakzine Experiment, TM-ELISA Resultate
Wochen nach Testinfektion
Gruppe Katze
-7 -5 -3 0 1 2 3 4 5 6 7 8 10
2916 0,7 0 0 0 0,3 0,1 0 1 ,6 70,9 92,2 86,2 85,9 85,9
1 2932 1 ,2 0,3 0,2 0 0,8 0,4 0 1 ,6 59,8 78,6 96,2 65,6 65,6
381 0,6 1.3 0,1 0 0,4 0,2 0 5,3 78 95,3 72,6 89,3 89,3
384 0 1 0,1 0 0,4 OJ 0 10,7 83,8 90,7 78,7 79,4 79,4
2924 0 0,3 0 0 0,04 0,8 0,4 1 ,9 76,4 94,3 88,7 88,3 88,3
2947 0 1 0,5 0 0,4 0,6 0 0 0,4 1 ,3 0 60,4 60,4
2
379 0,6 0,9 0,1 0 0 0,4 0 0,4 0,8 16,7 31 ,6 82,4 82,4
393 0 0,3 0 0 0 0 0 0,8 66,7 85,7 63,6 90 90
2917 0 1 ,2 0,2 0 0 0,2 0 0 0,1 1 ,1 0 0,9 0,9
2943 0 0,8 0 0 0 0,8 0 0 0 0,9 0 0,8 0,8
3
377 1 2,4 2,3 0 2,6 0,4 0 1 ,6 0 2,1 0 0,5 0,5
388 0 0,2 0 0 0,4 0,1 0 0 54,6 86,6 68,8 80,1 80,1
2. FIV-RNA-Virusload im Plasma: Die Resultate der FIV-RNA-Quantifizierung im Plasma der Katzen sind in Figur 5 zusammengestellt. Die Resultate können wie folgt kommentiert werden:
Gruppe 1 : Hier war der RNA-Virusload am höchsten.
Gruppe 2: Die mit der gp140-DNA vakzinierten Katzen zeigten einen signifikant geringeren RNA-Virusload als die Tiere der Kontrollen; daraus kann abgeleitet werden, dass allein der gp140-Konstrukt schon einen Teilschutz zu induzieren vermag. Diese Resultate sind in Übereinstimmung mit der Serologie.
Gruppe 3: Zufügung von IL-12 zur gp140-DNA zeigte einen vollständigen
Schutz gegen Virus im Blut. Auch diese Resultate stimmen mit den Beobachtungen der Serologie überein.
3. Menge der proviralen DNA: Die Resultate der Quantifizierung der proviralen DNA-Menge aller Katzen ist in Tabelle 6 zusammengestellt. Die Resultate lassen sich wie folgt kommentieren:
Gruppe 1 : Wie bei der Serologie und der RNA-Messung erwiesen sich auch hier die Tiere der Gruppe 1 als voll empfänglich für die Testinfektion.
Gruppe 2: Auch die Tiere der Gruppe 2 wurden ausnahmslos Proviruspositiv, die mittlere FIV-Provirus-Menge war jedoch nur unwesentlich gerin- ger als jene der Kontrollgruppe.
Gruppe 3: Wie zuvor für die Serologie und die RNA-Menge beobachtet, erwiesen sich hier 3 von 4 Katzen als vollständig geschützt.
Tabelle 6 Provirus-Load bei den einzelnen Katzen
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die Verwendung von IL-12 DNA zusammen mit gp140-DNA einen hohen Schutzeffekt zu induzieren vermag. Der Schutzeffekt äussert sich einerseits in einer geringeren Virusreplikation, was zu geringem oder vollständigem Fehlen der Serokonversion führt und/oder zu geringerer Integration der viralen DNA in die Wirtszell-DNA.
Literaturverzeichnis
Bush K. Day NK. Kraus LA. Good RA. Bradley WG. (1994) Molecular cloning of feline interleukin 12 p35 reveals the conservation of leucine-zipper motifs present in human and murine IL-12 p35. Molecular Immunology. 31 (17): 1373-4.
Calzolari M., Young E., Cox D., Davis D., Lutz H. Serological diagnosis of feline im- munodeficiency virus infection using recombinant transmembrane glycoprotein,
Vet.lmmunol.lmmunopathol. 46, 83-92 (1995)
Fehr, D., Dean, G.A., Huder, J., Fan, Z., Huettner, S., Higgins, J.W., Pedersen, N.C. and Lutz, H. (1997) Nucleotide and predicted peptide sequence of feline interleukin- 12 (IL-12). DNA Sequence 8(1-2), 77-82.
Gately, M.K. and Mulqueen, M.J. (1996) lnterleukin-12: potential chnical applications in the treatment and prevention of infectious diseases. [Review] [49 refs]. Drugs 52(Suppl 2), 18-25; discussion 25-6.
Leutenegger C, Klein D., Hofmann-Lehmann R., Mislin C, Hummel U., Böni J., Boretti F., Guenzburg W., Lutz H; Rapid feline immunodeficiency virus provirus quantitation by polymerase chain reaction using the TaqMan® fluorogenic real-time detection System; Journal of Virological Methods 78, 105-116 (1999)
Mosmann, T.R., Cherwinski, H., Bond, M.W., Giedlin, M.A. and Coffman, R.L. (1986) Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. Journal of Immunology 136(7), 2348- 57.
Morikawa, S., Lutz, H., Aubert, A. and Bishop, D.H. (1991) Identification of con- served and variable regions in the envelope glycoprotein sequences of two feline immunodeficiency viruses isolated in Zürich, Switzerland. Virus Research 21(1), 53- 63.
Piccotti JR. Chan SY. Li K. Eichwald EJ. Bishop DK. (1997) Differential effects of IL-
12 receptor blockade with IL-12 p40 homodimer on the induction of CD4+ and CD8+ IFN-gamma-producing cells. Journal of Immunology. 158(2):643-8,
Schijns, V.E., Wierda, C.M., Vahlenkamp, T.W. and Horzinek, M.C. (1997) Molecular cloning of cat interleukin-12. Immunogenetics 45(6), 462-3.
Claims
1. Felines lnterleukin-12 (flL-12) Polypeptid, welches durch Methoden der rekombinanten Genexpression in Form der beiden Polypeptidketten der Untereinheiten p35 und p40 des felinen Interleukin 12 in eukaryoten oder prokary- oten Zellen exprimiert wird, und wobei die korrespondierenden Proteine der- art bereitgestellt werden, dass sie in äquimoiaren Konzentrationen in Anwesenheit eines zur Immunisierung geeigneten Antigens bei Fleischfressern, im speziellen bei der Hauskatze, zur Anwendung gebracht werden können.
2. Polypeptid nach Anspruch 1 , wobei die p35-Untereinheit des felinen IL12 mit einem als Templat dienenden, für humanes IL12-p35 kodierendem Plasmid amplifiziert wurde.
3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 mit mindestens 95 % Sequenzähnlichkeit zu jener des Polypeptides, das von der Nukleotidsequenz flL12p40 (SEQ ID NO 1) und flL12p35 (SEQ ID NO 2) kodiert wird, als Immunstimulans, insbesondere Prävention und Therapie bei Fleischfressern, im speziellen bei der Hauskatze.
4. Nukleinsäure-Konstrukt kodierend für felines lnterleukin-12 (flL-12), das Sequenzen mit mindestens 95 % Sequenzähnlichkeit zu den Sequenzen von flL12p40 (SEQ ID NO 1 ) und flL12p35 (SEQ ID NO 2) enthält als Immunstimulans, zur Immunisierung gegen Infektionskrankheiten und/oder zur The- rapie von Infektions- und Tumorerkrankungen von Fehden, insbesondere von Hauskatzen.
5. Nukleinsäure-Konstrukt nach Anspruch 4, wobei die Sequenzen unter Kontrolle einer in höheren Tieren, wie Fleischfressern, insbesondere Fehden, speziell Hauskatzen, operablen Promotor- und Terminatorsequenz stehen.
6. Nukleinsäure-Konstrukt gemäss Anspruch 4 oder 5, wobei das Konstrukt aus einem linearen, an beiden Enden kovalent verbundenen DNA-Doppelstrang besteht, der lediglich pro Strang eine Promotor- und die kodierende Sequenz enthält.
7. Verwendung des Nukleinsäure-Konstrukts nach Anspruch 4 bis 6 als Adjuvans zur prophylaktischen Immunisierung gegen virale Erkrankungen von Fleischfressern, insbesondere Fehden, speziell Hauskatzen.
8. Verwendung des Nukleinsäure-Konstrukts nach Anspruch 4 bis 6 als Therapeutikum bei Erkrankungen, bei denen ein TH1 Defizit vorliegt, insbesondere bei vorbestehender FIV- oder FeLV- oder FCoV-Infektion, und/oder zur Immunisierung gegen die FIV- oder FeLV- oder FCoV-Infektion.
9. Verwendung des Polypeptides nach Anspruch 1 bis 3 als Therapeutikum bei Tumorerkrankungen sowie Autoimmunkrankheiten von Fleischfressern, im speziellen von der Hauskatze.
10. Verwendung des Polypeptides nach Anspruch 1 bis 3 als Therapeutikum bei denen ein TH1 -Defizit vorliegt, insbesondere bei vorbestehender FIV-, FeLV- und Coronavirus-Infektion von Fleischfressern, im speziellen von der Hauskatze.
11. Vakzine oder Therapeutikum, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Polypep- tid gemäß Anspruch 1 bis 3 und mindestens einen geeigneten Träger enthält.
12. Vakzine oder Therapeutikum, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Nukleinsäure-Konstrukt gemäß Anspruch 4 bis 6 und mindestens einen geeigneten Träger enthält.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5571515A (en) * | 1994-04-18 | 1996-11-05 | The Wistar Institute Of Anatomy & Biology | Compositions and methods for use of IL-12 as an adjuvant |
| EP0919241A1 (de) * | 1997-05-16 | 1999-06-02 | Toray Industries, Inc. | Medikament, behandlungsmethode, prophylaktikum und prophylaxe gegen immunologische erkrankungen von hunden und katzen |
Non-Patent Citations (2)
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| FEHR D ET AL: "NUCLEOTIDE AND PREDICTED PEPTIDE SEQUENCE OF FELINE INTERLEUKIN-12 (IL-12)" DNA SEQUENCE,NEW YORK, NY,US, Bd. 8, Nr. 1/02, 1997, Seiten 77-82, XP000944982 ISSN: 1042-5179 in der Anmeldung erw{hnt * |
| SCHIJNS V E C J ET AL: "MOLECULAR CLONING OF CAT INTERLEUKIN-12" IMMUNOGENETICS,DE,SPRINGER VERLAG, BERLIN, Bd. 45, 1997, Seiten 462-463, XP002913121 ISSN: 0093-7711 in der Anmeldung erw{hnt * |
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