DE69735643T2

DE69735643T2 - IL12 zur Gentherapie der Tumoren

Info

Publication number: DE69735643T2
Application number: DE69735643T
Authority: DE
Inventors: L. Alexander Delafield RAKHMILEVICH; Ning-Sun Verona YANG
Original assignee: Powderject Vaccines Inc
Current assignee: Powderject Vaccines Inc
Priority date: 1996-06-05
Filing date: 1997-06-04
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2017-06-05
Also published as: JP2000512980A; EP0963207A1; WO1997046263A1; US5922685A; EP0963207B1; DE69735643D1; EP0963207A4; HK1024622A1; ES2262180T3

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein genetische Konstrukte zur Behandlung von Tumoren und betrifft insbesondere ein genetisches Konstrukt, welches das IL-12-Gen für einen direkten Transport in Hautzellen enthält.
Hintergrund der Erfindung
Interleukin-(IL)-12, das früher als natürlicher Killerzellen-stimulierender Faktor oder als cytotoxischer Lymphozyten-Reifungsfaktor bezeichnet wurde, ist ein über Disulfidbrücken verknüpftes heterodimeres Zytokin, das aus einer 35 kDa und 40 kDa Untereinheit zusammengesetzt ist; die Untereinheiten werden üblicherweise als „p35" und „p40" bezeichnet. Die komplementären cDNAs, die die p35- und p40-Untereinheit sowohl von der Maus als auch vom Menschen codieren, sind sequenziert und kloniert worden, und es ist sowohl vom humanen als auch vom murinen IL-12 gezeigt worden, dass es als Wachstumsfaktor für natürliche Killer-(„NK")-Zellen und T-Zellen in vitro und in vivo wirkt. Außerdem hat IL-12 sich bei Regression und vollständigem Verschwinden muriner Tumoren als wirksam erwiesen. Tahara et al., Cancer Research 54 (1): 182-9, 1994; Brunda et al., J. EXP. MED. 178 (4): 123-30, 1993.
Da IL-12 eine kurze Halbwertzeit in vivo besitzt, sind allerdings häufige Zytokin-Injektionen erforderlich, um therapeutische Wirkungen zu erzielen. Darüber hinaus sind typischerweise relativ große Mengen an IL-12 (im Bereich von 1 – 10 μg/Tag) erforderlich. Deshalb führt die Verabreichung von rekombinantem IL-12 häufig zu Vergiftungserscheinungen.
Die IL-12-Gentherapie unter Verwendung retroviraler Vektoren wird in verschiedenen Laboratorien untersucht, und ihre Antitumor-Wirkung ist gezeigt worden. Lotze, M.T., et al., J. Cell. Biochem., Seite 184, 1993; Robinson et al., Cancer Gene Therapy 1(2): 147, 1994. In der Untersuchung von Lotze et al. waren die Gene für die p35 und p40-Untereinheit in NIH 3T3-Fibroblasten inseriert. Die Fibroblasten waren zum Transport von IL-12 an die Tumorstellen eingesetzt, was das Wachstum einer Reihe an murinen Tumoren verzögerte. In der Untersuchung von Robins et al. führte der direkte Transport von IL-12 zu mehreren verschiedenen Maus-Tumorlinien mit Hilfe der retroviral-vermittelten Transduktion vor der Inokulation, oder zu Fibroblasten, die dann mit Tumorzellen gemeinsam verabreicht wurden, zu einer Hemmung des Tumorwachstums wie auch zu einer Induktion einer Antitumor-Immunität.
Ein Partikel-vermittelter Transport eines IL-12-Gens in die Haut und dessen Wirkungen auf eine Tumorregression sind in Proc. Am. Assoc. Can. Res. Ann. Meet., Vol. 37, 1996, 347, offen gelegt.
Allerdings war es bis jetzt nicht möglich, eine verlässliche Regression etablierter Tumoren und ihrer Spontanmetastasen unter Anwendung einer direkten IL-12-Gentherapie hervorzurufen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung lässt sich dahingehend zusammenfassen, dass eine Antitumor-Antwort nach einer Übertragung eines das Zytokin IL-12 codierenden DNA-Moleküls auf eine Säugerzelle bewirkt werden kann.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, die Behandlung von Tumoren mit der Verwendung eines IL-12 genetischen Konstrukts zu ermöglichen.
Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Anpassung entweder an den epidermalen oder mukosalen Transport des Plasmidkonstrukts.
Gemäß der Erfindung wird folglich die Verwendung eines Plasmidkonstrukts bereitgestellt, umfassend
eine DNA-Sequenz, welche eine p35-Untereinheit von Zytokin IL-12 codiert und welche unter der Kontrolle eines Promotors ist, der in den Zielzellen, in die das Konstrukt transportiert werden soll, operativ ist, und
eine DNA-Sequenz, welche eine p40-Untereinheit von Zytokin IL-12 codiert und welche unter der Kontrolle eines separaten Promotors ist, der ebenfalls in den Zielzellen, in die das Konstrukt transportiert werden soll, operativ ist,
in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumoren in einem Säuger durch Transportieren von Kopien des Konstrukts in epidermale oder mukosale Zielzellen des Säugers in vivo.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Plasmidkonstrukt bereit, das für eine Verwendung bei der Behandlung von Tumoren in einem Säuger geeignet ist, durch Transport von Kopien des Konstrukts in epidermale oder mukosale Zielzellen des Säugers in vivo, wobei das Konstrukt umfasst:
eine DNA-Sequenz, welche eine p35-Untereinheit von Zytokin IL-12 codiert und welche unter der Kontrolle eines Promotors ist, der in den Zielzellen, in die das Konstrukt transportiert werden soll, operativ ist, und
eine DNA-Sequenz, welche eine p40-Untereinheit von Zytokin IL-12 codiert und welche unter der Kontrolle eines separaten Promotors ist, der in den Zielzellen, in die das Konstrukt transportiert werden soll, operativ ist.
Ein Vorteil der genetischen Behandlung der vorliegenden Erfindung ist, dass sie inhärent sicher ist, bei Verabreichung nicht schmerzhaft ist und bei den behandelten Individuen zu keinen nachteiligen Folgen führen sollte.
Ein weiterer Vorteil der genetischen Behandlung der vorliegenden Erfindung ist, dass die genetische Behandlung selbst dann wirksam ist, wenn der Transport zu einer vom Tumor entfernt liegenden Stelle erfolgt und im immunologischen Gedächtnis nach Beendigung einer genetischen Behandlung behalten bleibt.
Weitere Gegenstände, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ersichtlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Karte des IL-12-Plasmids pWRG3169.
2 ist eine Karte des IL-12-Plasmids pWRG3196.
3 ist ein Diagramm, das die Muster des Tumorwachstums in IL-12-Genbehandelten Mäusen und Kontrollmäusen zeigt.
4A-4F sind Diagramme, welche die Änderung des Durchmessers verschiedener induzierter fester Tumoren nach einer Behandlung unter Verwendung von IL-12-Genen zeigen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Beschreibung beschreibt die Verwendung eines Plasmidkonstrukts, das die p35- und p40-Untereinheit des IL-12-Proteins codiert, in der Herstellung eines Medikaments, das in die Epidermis eines Patienten an der Tumorstelle transportiert wird. Die Tumoren können feste Tumoren oder metastasierende oder streuende Tumoren sein und können mikroskopisch kleine oder mit bloßem Auge sichtbare Tumoren sein. Sobald das Konstrukt transportiert ist, wird das IL-12-Zytokin exprimiert, was zur Auslösung einer Antitumor-Antwort in den behandelten Individuen führt, selbst wenn der Tumor weit entfernt von der Transportstelle ist.
Um die von der Erfindung gesuchte genetische Behandlung zu vollbringen, wird ein IL-12-Plasmidkonstrukt hergestellt, in dem die IL-12 codierenden Gene unter der Kontrolle eines Promotors stehen, der in den Zellen eines Zielsäugers operativ ist. Ein geeignetes Konstrukt ruft eine Expression des IL-12-Proteins hervor, wenn es in Zellen eines behandelten Tiers transfiziert ist.
Tatsächlich ist das IL-12-Protein ein Heterodimer, das eine 35 kDa (p35) und eine 40 kDa (p40) Untereinheit umfasst. Jede Untereinheit ist von einem anderen Gen codiert. Die IL-12 p35- und p40-codierenden DNA-Sequenzen können von einer Säugetier-Quelle, vorzugsweise von einer menschlichen Quelle, erhalten oder abgeleitet sein. Eine vollständige DNA-Sequenz, die humane IL-12-Untereinheiten codiert, ist von Gubler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4143-4147, 1991, publiziert worden. Die publizierte Nukleinsäure- und Aminosäure-Sequenzen einer p35-Untereinheit sind unter der GenBank-Zugriffsnummer M65271 zugänglich. Ähnlicherweise sind die Nukleinsäure- und Aminosäure-Sequenzen einer p40-Untereinheit unter der GenBank-Zugriffsnummer M65272 ebenfalls zugänglich.
Alternativ können die IL-12-Untereinheiten codierenden Sequenzen von anderen nicht-humanen Tieren, die IL-12 produzieren, erhalten sein. Die IL-12-Untereinheiten codierenden Sequenzen können von anderen Spezies erhalten oder abgeleitet sein, die eine hinreichende Sequenzidentität zeigen, um für humanes IL-12 funktionell äquivalent zu sein. Zum Beispiel wird IL-12 bekanntermaßen von Mäusen produziert. Murine Sequenzen waren in den hier genannten Beispielkonstrukten verwendet worden. Eine p35-codierende DNA wird unter der GenBank-Zugriffsnummer M6672 genannt. Die p40-codierende DNA ist ebenfalls bei GenBank zugänglich.
Ebenso können in vitro synthetisierte codierende Sequenzen, die die p35 und p40-Untereinheit von IL-12 codieren, ohne weiteres in hinreichenden Mengen für eine molekulare Klonierung unter Anwendung rekombinanter molekularbiologischer Standardtechniken, einschließlich PCR-Amplifizierung und Hybridisierung, unter Verwendung der publizierten DNA-Sequenz als Leitmatrize, hergestellt sein.
Es ist ebenfalls möglich, die hier offen gelegten Untereinheiten-codierenden DNA-Moleküle und Proteinuntereinheiten noch weiter zu modifizieren, während die Antitumor-Aktivität der vorliegenden Erfindung noch beibehalten ist. Die vorliegende Erfindung soll verkürzte natürliche IL-12-DNA mit der hier beschriebenen Nukleinsäure-Sequenz wie auch alle veränderten, variierten und modifizierten Formen der DNA umfassen. Diese können umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, im Wesentlichen homologe DNA-Fragmente mit Additionen, Deletionen und Punktmutationen bezogen auf die offen gelegten Nukleinsäure-Sequenzen, einschließlich Verkürzungen am 5'- und/oder 3'-Ende. Ein im Wesentlichen homologes DNA-Fragment ist eines, bei dem das Fragment ein Polypeptid codiert, das eine signifikante Antitumor-Aktivität und/oder Regression nach dem Transport zeigt, selbst wenn eine derartige DNA sich in der Nukleinsäure-Sequenz unterscheidet oder ein Protein codiert, das sich in der Aminosäure-Sequenz von den hier offen gelegten DNA-Fragmenten oder Proteinen unterscheidet. Eine Antitumor-Aktivität von derartigen verkürzten DNA-Molekülen kann wie unten beschrieben überwacht werden.
Ein Fachmann weiß, dass bestimmte stille Änderungen in der Nukleinsäure-Sequenz keine Wirkung auf die von einem bestimmten Triplett codierte Aminosäure besitzen. Selbst bestimmte Änderungen bei Aminosäuren, die keinen oder nur etwas Einfluss auf die IL-12-Aktivität des codierten Proteins besitzen, können im Rahmen der Erfindung verwendet werden. Es kann in der vorliegenden Erfindung jede Nukleinsäure- oder Aminosäure-Sequenz verwendet werden, die zu einer Antitumor-Aktivität führt, die wenigstens 75% der unter Verwendung der murinen IL-12 (mIL-12) Gene, die in den folgenden Beispielen getestet werden, erhaltenen Aktivität entspricht.
Falls das ein IL-12-Protein codierende Gen in ein genetisches Konstrukt zum Transport in einen Wirt einer anderen Spezies als derjenigen eingebaut ist, von der das Gen stammt, kann selbstverständlich eine Immunantwort nach dem Gentransfer hervorgerufen werden. Allerdings weiß der Fachmann, dass es durch Modifizieren der Nukleinsäure-Sequenz des reifen IL-12-Teils des transportierten Gens möglich ist, eine derartige Wirkung auszuschließen.
Um die Gensequenzen der IL-12-Untereinheit in den transfizierten Zellen korrekt zu exprimieren, ist eine in den Zielzellen operative Promotorsequenz erforderlich. Mehrere derartige Promotoren sind für Säugerorganismen bekannt, die 5' oder stromaufwärts der codierenden Sequenz für das zu exprimierende Protein verbunden sein können. Ein bevorzugter Promotor ist der CMV-Promotor, dessen Sequenz bekannt ist und in Cell, 41:521-530 (1995) publiziert worden ist. Ein stromabwärts liegender Transkriptionsterminator oder Polyadenylierungssequenz kann ebenfalls 3' zu der Protein codierenden Sequenz zugefügt sein. Eine bevorzugte Polyadenylierungs sequenz ist die polyA-Region des bovinen Wachstumsfaktors, dessen Sequenz bekannt ist. Spleißdonor- und Spleißakzeptor-(SD/SA)-Stellen, wie die SV40-SD/SA können ebenfalls, falls erwünscht, in dem Konstrukt positioniert sein, wie auch eine interne Ribosom-Eingangsstelle (IRES), wie vom Enzephalomyokarditis-Virus codierte IRES.
Wie die Erfinder in den Beispielen unten noch detaillierter beschreiben, ist festgestellt worden, dass eine Expression der beiden Protein-codierenden Sequenzen von separaten Transkriptionseinheiten auf einem einzigen Plasmid zu signifikant höheren Proteinlevels führt, als bei einer von einem einzigen Promotor gesteuerten bicistronischen Expression der Gene zu beobachten ist. Folglich ist jede codierende Region für Zwecke dieser Erfindung mit einem separaten Promotor ausgestattet.
Einführung des genetischen Materials
In der vorliegenden Erfindung wird ein geeignetes Plasmidkonstrukt, das die IL-12-Proteinuntereinheiten codiert, in das empfangende Individuum transferiert. Eine genetische Behandlung kann in nichtinvasiver Weise in einer Reihe an empfangenden Gewebearten erfolgen, um die erwünschte Immunantwort in dem Individuum zu erzielen.
Es ist hier offen gelegt, dass dann, wenn die Tumoren mit dem IL-12-Plasmidkonstrukt behandelt werden, die bevorzugten Zielzellen eher epidermale Zellen als Zellen der tieferen Hautschichten wie der Dermis sind. Epidermale Zellen sind bevorzugte Empfänger des IL-12 genetischen Konstrukts, weil sie die zugänglichsten Zellen des Körpers sind. Patienten, die einer derartigen genetischen Therapie bedürfen, können deshalb als Vorteil nichtinvasiv behandelt werden. Darüber hinaus können recht unerwartet und entgegen der Auffassung Einiger durch den epidermalen Transport des IL-12-Gens erfolgreich Tumoren behandelt werden, die weit entfernt von der Transportstelle sind, und außerdem eine systemische Antitumor-Immunität, ein immunologisches Gedächtnis und cytotoxische Antworten generiert werden. Deshalb ist der epidermale Transport für einen nichtinvasiven Transport der IL-12-Gene besonders gut geeignet.
In Anbetracht der Tatsache, dass eine Behandlung mit dem IL-12-Plasmidkonstrukt sich darin als erfolgreich erwiesen hat, Antitumor-Antworten im Anschluss an einen Transport eines IL-12-Plasmidkonstrukts mit einer Genkanone erfolgreich auszulösen, ist es ebenfalls wahrscheinlich, dass ein nichtinvasiver Transport des IL-12-Plasmidkonstrukts zu Schleimhautoberflächen ebenso zu erfolgreichen Behandlungsreaktionen führt.
Es ist ebenfalls spezifisch angedacht, dass wässrige Tröpfchen, die nackte IL-12-DNA enthaften, direkt in die zu behandelnden Gewebe des Individuums transportiert werden können. Mit einer gewissen Häufigkeit wird eine derartige „nackte" DNA in die behandelten Gewebe aufgenommen werden.
Das bevorzugte Transfermittel für einen nichtinvasiven Transport ist eine Vorrichtung für die Übertragung beschleunigter Genpartikel, obwohl jedes Mittel, welches das Konstrukt in geeignete Zielstellen (Epidermis oder Schleimhautgewebe) zuverlässig transferieren können, einsetzbar ist. Die Technik des Gentransports mit beschleunigten Partikeln beruht auf dem Beschichten von extrem kleinen Trägerpartikeln, vorzugsweise Goldpartikeln, die im Verhältnis zu den mit dem Verfahren zu transformierenden Zellen klein gestaltet sind, mit genetischen Konstrukten, die in Zellen transportiert werden sollen. Die Goldpartikel können Kügelchen oder sphärisches oder amorphes Gold sein. Sie sind alle für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Referenzen für Partikel sollen alle derartigen Formen umfassen. Für amorphes Gold, wie für mikrokristallines Gold von Engelhard, ist in anderen biologischen Zielsystemen gezeigt worden, dass es einen vermehrten Transport in Zielzellen als andere Goldarten erzielt.
Gleich welche Art von Partikelbeschleunigungsapparat oder welche geeignete Partikel eingesetzt werden, werden die beschichteten Partikel dann physikalisch in Richtung der zu transformierenden Zellen beschleunigt, so dass die Trägerpartikel im Innern der Zielzellen stecken bleiben. Diese Technik kann entweder mit Zellen in vitro oder in vivo angewendet werden. Mit einer gewissen Häufigkeit wird die DNA, die zuvor auf die Trägerpartikel aufgebracht worden ist, in den Zielzellen exprimiert. Von dieser Genexpressionstechnik ist gezeigt worden, dass sie in Prokaryoten und Euka ryoten, von den Bakterien und Hefen bis zu den höheren Pflanzen und Tieren, funktioniert. Folglich stellt das Verfahren mit beschleunigten Partikeln eine bequeme Methodologie für den Transport von Genen in die Zellen einer großen Vielfalt an Gewebetypen bereit und bietet die Fähigkeit des Transports dieser Gene zu Zellen in situ und in vivo ohne irgendwelche nachteiligen Wirkungen und Effekte für das behandelte Individuum. Das Verfahren mit beschleunigten Partikeln ist ebenfalls bevorzugt, weil damit ein Genkonstrukt für eine Behandlung sowohl in ein bestimmtes Gewebe wie auch zu einer bestimmten Zellschicht in einem Gewebe durch die Variation der Transportstelle beziehungsweise der Kraft, mit der die Partikel beschleunigt werden, gelenkt werden kann.
Der allgemeine Versuchsansatz einer Gentransfektionstechnologie mit beschleunigten Partikeln ist im US-Patent Nr. 4.945.050, von Sanford beschrieben.
Ein Gerät, das auf einer verbesserten Variante dieses Versuchsansatzes basiert, ist von BioRad Laboratories im Handel erhältlich. Ein alternativer Versuchsansatz für eine Partikelbeschleunigungs-Transfektionsapparatur ist in US-Patent Nr. 5.015.580 offen gelegt, das eine Apparatur beschreibt, die sowohl für eine Verwendung mit Säugerzellen als auch intakten ganzen Zellen adaptierbar ist. US-Patent Nr. 5.149.655 beschreibt eine einfach handhabbare Handversion einer Gentransportvorrichtung mit beschleunigten Partikeln. Andere Vorrichtungen können auf anderen Treibmitteln, zum Beispiel einem komprimierten Gas, als Antriebskraft basieren.
Die Genkanonenvorrichtung erlaubt eine genaue Kontrolle des Levels und der Form der IL-12-Produktion in einer gegebenen Epidermisstelle, da der intrazelluläre DNA-Transport durch eine systematische Änderung der Anzahl an transportierten Partikeln und der Anzahl an Plasmidkopien pro Partikel gesteuert werden kann. Die genaue Kontrolle des Levels und der Form der Zytokin-Produktion kann eine Kontrolle der Natur der resultierenden Antwort erlauben.
Der Ausdruck „transfiziert", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Zellen, die das transportierte fremde IL-12-Plasmidkonstrukt eingebaut haben, ganz gleich welches Transportverfahren angewendet wird. Der Ausdruck „transfiziert" wird dem Ausdruck „Transformation" vorgezogen, um die inhärente Mehrdeutigkeit des letzteren Ausdrucks zu vermeiden, der ebenfalls bezogen auf zelluläre Änderungen im Onkogenese-Prozess Verwendung findet.
Die vorliegende Erfindung wird mit Bezug auf die nachfolgenden Beispiele umfassender verstanden, die nur Musterbeispiele der Erfindung sein sollen. In den Beispielen ist die Maus als Modellempfänger für das IL-12-Expressionskonstrukt eingesetzt worden. Die Maus ist ein Tierstandardmodell für eine Extrapolation auf humane Tumoren, da die allgemeinen Regeln der FDA verlangen, dass die Wirksamkeit einer vorgeschlagenen Krebsbehandlung in Mausmodellen nachgewiesen werden muss, bevor klinische Versuche durchgeführt werden können.
BEISPIELE
Konstruktion von Plasmiden, die murines IL-12 codieren
Zwei murine IL-12-Konstrukte sind verwendet worden, wobei jedes sowohl die p35 als auch die p40-Untereinheit von mIL-12 codiert. Diese Untereinheiten wurden aus einer cDNA-Bank der Maus-Milz kloniert. Alle Plasmide wurden eigens für den Zweck der Steigerung der Zytokin-Genexpression von IL-12 und der unmittelbar beabsichtigten Verwendung in einem Programm der Krebs-Gentherapie hergestellt.
Das Plasmid pWRG3169 ist ein Tandemplasmid, das beide Gene für die mIL-12-Untereinheiten codiert. Eine Plasmidkarte von pWRG3169 ist in Fig. gezeigt und die vollständige Nucleotidsequenz des Plasmids ist in SEQ ID NR: 1 dargestellt. Das p35- und p40-Produkt des Plasmids ist als SEQ ID NR: 2 beziehungsweise SEQ ID NR: 3 angegeben. Jedes eine Untereinheit codierende Gen steht unter der transkriptionellen Kontrolle eines separaten Cytomegalovirus-(CMV)-Promotors. Ein SV40-Spleißdonor/Spleißakzeptor (sa/sd) liegt zwischen jedem eine Untereinheit codierenden Segment und seinem CMV-Promotor. Genau stromabwärts (3') zu jedem eine Untereinheit codierenden Segment liegt ein Polyadenylierungssignal des bovinen Wachstumshormons(bGH pA). Jede Einheit (Promotor – sa/sd – codierende Region – Poly A Signal) wird seriell (d. h. in der gleichen Richtung) vom Plasmid transkribiert. Das pUC19-Plasmidrückgrat stammt von einem Bluescript^® SK(+)-Vektor mit einem Ampicillin-Resistenzgen, der im Handel von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, erhältlich ist.
Das Plasmid pWRG3196 ist ein bicistronisches Plasmid, das beide mIL-12-Untereinheiten codiert. Eine Plasmidkarte von pWRG63196 ist in 2 dargestellt und die vollständige Sequenz ist in SEQ ID NR: 4 gezeigt. Das p35- und p40-Produkt des Plasmids ist als SEQ ID NR: 5 beziehungsweise SEQ ID NR: 6 bezeichnet. Das pUC19-Plasmidrückgrat stammt von einem Bluescript SK (+)-Vektor mit einem Ampicillin-Resistenzgen. Dieser Vektor enthält einen einzigen Cytomegalovirus-(CMV)-Promotor, SV40-Spleißdonor/Spleißakzeptor und ein Polyadenylierungsignal des bovinen Wachstumshormons. Sowohl das p35 als auch das p40-Gen liegt stromabwärts von der sd/sa-Stelle und stromaufwärts der SV40-PolyA-Stelle. Zu dem p40-Gen liegt das p35-Gen stromaufwärts (d.h. näher an dem Promotor als das p40-Gen). Zwischen dem p35- und p40-Gen liegt ein aus dem Encephalomyocarditis-Virus kloniertes Element der internen Ribosom-Eintrittstelle (IRES). Das IRES-Element ist eine nicht-codierende Region, die als ein interner Eintrittspunkt zur Initiation oder zur Aufrecherhaltung der Translation durch eukaryotische Ribosomen dient.
Sowohl pWRG3169 als auch pWRG3196 steuern die Expression von mIL-12. Vom molekularen Standpunkt stellt allerdings der bicistronische IRES-Vektor (pWRG3196) eine einzige mRNA her, während der Tandem-Vektor (pWRG3169) für p35 und p40 eine separate mRNA herstellt. Bei Untersuchungen der Genexpression entdeckten die Erfinder, dass pWRG3169 mindestens das Doppelte der Expression des bicistronischen pWRG3196 induziert, sowohl in vivo als auch in vitro. Wenn zum Beispiel die Vektoren pWRG3169 und pWRG3196 in B16-Tumorzellen in vitro oder in murine Haut in vivo separat transfiziert wurden, waren die beobachteten Expressionslevels des mIL-12-Proteins 3-8 mal höher, wenn der Vektor pWRG3169 transfiziert war. Noch geringere Expressionslevels wurden beobachtet, wenn zwei separate Vektoren transfiziert wurden, wobei jeder eine der mIL-12 Proteinuntereinheiten codierte.
Wichtig ist, dass biologisch aktives IL-12 Zytokin nach dem Transfer in murine B16-Melanomzellen und nach dem Bombardement der Haut unter Verwendung eines Partikelbeschleunigungsgeräts lokal detektiert wurde. Wenn 1,25 μg pWRG3169- DNA mit Hilfe der Partikelbeschleunigung in 1 × 10⁶ B16-Zellen transportiert wurde, wurden nach 24 Stunden 49,8 ± 10,2 ng/ml detektiert. Vierundzwanzig Stunden nachdem die Haut viermal mit insgesamt 5 μg pWRG3169-DNA bombardiert wurde, wurden 266 ± 27,8 pg IL-12 pro 0,172 ± 0,026 g Gewebe in einer standardisierten 1,5 × 1,5 cm² Gesamthautbiopsie detektiert, die vier behandelte Stellen umfasste. Der IL-12-Level wurde mit Hilfe eines Zellproliferationstests unter Verwendung von murinen Con-A-aktivierten Splenozyten bestimmt, wie von Schoenhaut, et al., J. Immunol. 148:3433 (1992) beschrieben.
Es ist angedacht, dass ähnliche expressionskompetente Vektorkonstrukte entwickelt werden können, die humanes p35 und humanes p40 umfassen (deren Sequenz hier bereitgestellt ist), zur Verwendung in klinischen Gentherapie-Krebsstudien. Zusätzlich werden zukünftige Vektoren Intron A und möglicherweise ein episomales Element, wie EBNA-1 vom Epstein-Barr-Virus, umfassen.
Implantation von Tumoren in Mäuse
Renales Zelladenocarcinom (Renca) und Methylcholanthren-induziertes Fibrosarkom (MethA)-Tumorzelllinien sind in Balb/c-Mäusen syngen. L51178Y-Lymphom und P815-Mastocytom sind in DBA/2-Mäusen syngen. SA-1 Sarkom und B16-Melanom sind in A/Sn beziehungsweise C57B1/6 syngen. Tumorzelllinien wurden in vitro unter etablierten Bedingungen gehalten.
Um eine Tumorbildung zu induzieren, wurden geeignete Empfängermäuse am Abdomen rasiert, und es wurden ihnen 1 × 10⁶ Tumorzellen in 50 μl PBS intradermal injiziert (außer 10⁵ B16-Zellen wurden eingesetzt). Das Tumorwachstum wurde 2-3 mal in der Woche durch die Messung zweier Tumordurchmesser im rechten Winkel zueinander mit Hilfe eines Tastzirkels erfasst.
Verwendung von mIL-12-Plasmiden bei der Tumorbehandlung
Für die Experimente wurde eine Heliumstoß-Partikelbeschleunigungsvorrichtung des Typs verwendet, der in der veröffentlichen PCT Anmeldung PCT/US95/00780 (Veröffentlichungsnummer WO 95/19799) beschrieben ist.
Die Plasmid-DNA wurde auf 2 μm Goldpartikel unter Verwendung von PEG/CaCl₂ oder Spermidin/CaCl₂ präzipitiert. Die Partikel wurden in einer Lösung aus 0,1 mg/ml Polyvinylpyrrolidon in absoluten Ethanol suspendiert. Mit diesem DNA/Goldpartikel-Präparat wurde die innere Oberfläche eines Tefzel-Röhrchens beschichtet, wie in der Veröffentlichung Nr. WO 95/19799 beschrieben. Das Röhrchen wurde dann in 0,5 Inch lange Hülsen geschnitten, um einen Transport von 0,5 mg Gold und 1,25 μg Plasmid-DNA pro Bombardement mit einer einzigen Hülse zu erhalten.
Die angelagerten DNA-beschichteten Partikel wurden aus den Hülsen heraus befördert und in die Epidermis der Maus mit einer Kraft eines 300 psi Heliumstoßes transportiert. Eine histologische Untersuchung und immunohistochemische Standardanalysen unter Verwendung eines monoklonalen Anti-IL-12-Antikörpers zeigten, dass mit dieser Kraft die Goldpartikel primär die Epidermiszellschichten des Hautgewebes der Maus penetrierten, aber nicht in die darunter liegenden Tumorzellen eindrangen, und auch, dass das transgene mIL-12 nur in den Epidermiszellschichten exprimiert wurde.
Zu jedem Transfektionszeitpunkt erhielten einzelne Mäuse vier Bombardements mit dem genetischen mIL-12 DNA-Konstrukt oder mit Kontroll-DNA (pCMVLuc; Cheng, et al., 90 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 4455 (1993)). Ein Bombardement erfolgte direkt über dem Tumor und drei weitere Bombardements waren genau in einem Dreiecksmuster um die Peripherie des Tumors herum verteilt.
Regression muriner Renca- und MethA-Tumoren in Mäusen
Balb/c-Mäuse wurden, wie oben beschrieben, mit 1 × 10⁶ Renca oder MethA-Tumorzelllinien beimpft. Zu der angegebenen Zeit nach der Inoculation wurden die Tumorinjektionsstellen einmal täglich 3-5 Tage mit pWRG3196, mit pWRG3169 oder mit dem Kontrollplasmid pCMVLuc beschossen, beginnend am Tag 7 des Tumorwachstums (in dem ersten Experiment begann das Bombardement am Tag 1, 4 oder 7 des Tumorwachstums).
Die Ergebnisse von vier vorausgehenden Experimenten sind in Tabelle 1 dargestellt. In dem ersten Experiment stießen 3 von 7 (42%), 3 von 6 (50%) und 5 von 7 (71 %) der an den Tagen 1-5, 4-8 beziehungsweise 7-11 behandelten Mäuse ihre Tumoren vollständig ab, während alle Kontrollmäuse (unbehandelte Mäuse) am Tag 18 wegen ihres progressiven Tumorwachstums getötet wurden. Das Muster des Tumorwachstums in IL-12-Gen-behandelten und Kontrollmäusen ist in 3 dargestellt.
Es kann beobachtet werden, dass die Regression mehrere Tage nach Beendigung der Behandlung begann, was vermuten lässt, dass die Antitumor-Wirkung immunologisch vermittelt ist. Darüber hinaus ist die Anmerkung wichtig, dass in diesem und anderen Experimenten ein in situ Bombardement mit dem mIL-12 codierenden Plasmid eine Regression etablierter (5-10 mm im Durchmesser) fester muriner Tumoren hervorrief.
In dem zweiten Experiment rief eine mIL-12-Behandlung eine schnelle Regression der Tumoren in allen Mäusen hervor. Aufgrund des schweren Bombardements der Haut stießen allerdings 28% der mit dem Kontrollgen transfizierten Mäuse ebenfalls ihre Tumoren ab. Um diese unspezifische und antitumorale Wirkung auszuschließen, wurde die Behandlungsdauer auf drei Bombardements an jedem zweiten Tag reduziert.
Tatsächlich wuchsen in dem dritten Experiment alle mit dem Kontrollgen beschossenen Tumoren progressiv, während 62% der mit dem genetischen mIL-12-Konstrukt beschossenen Mäuse ihre Tumoren abstießen.
Im vierten Experiment wurde ein MethA-Sarkom anstelle eines Renca-Tumors verwendet und zeigte eine ähnlich hohe Empfindlichkeit auf eine IL-12-Genbehandlung. Tabelle 1 Abstoßung muriner intradermaler Tumoren nach einer IL-12 Gentherapie

a = pWRG3196 (IRES); b = pWRG3169 (Tandem)

Zusätzliche Beweise der Tumorregression
Die Erfinder wandten ebenfalls das IL-12-Behandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung mit anderen murinen Tumoren an, wie es unten beschrieben ist. In allen Fällen wurde eine Verminderung des Tumorwachstums nach einer mIL-12-Gentransfektion beobachtet.
Es ist bekannt, dass bestimmte murine immunogene Tumoren eine T-Zell-vermittelte Immunantwort induzieren können, die in definierten Tumormodellen am besten an den Tagen 7-9 des Tumorwachstums detektiert werden (17). Deshalb wurden mIL-12 cDNA-Behandlungen 7 Tage nach der Implantation der Tumorzellen begonnen, um die bereits aktivierte endogene Antitumor-Immunantwort zu verstärken. Mit Hilfe dieser experimentellen Strategie führte die in vivo Beförderung der chimären IL-12-Gene in die darüber liegenden Hautgewebe der etablierten 7-Tage-Tumoren zu einer vollständigen Regression oder Suppression des Tumorwachstums in 4 Tumormodellen. Bei geeigneten Renca, L51178Y, MethA oder SA-1-Tumoren tragenden Mäusen wurde eine vollständige Tumorregression in 87,5% (7/8), 87,5% (7/8), 57% (4/7) beziehungsweise 37,5% (3/8) der Testmäuse erzielt. Nahezu identische Ergebnisse wurden mit Renca-Tumoren nach einer einzigen IL-12 cDNA-Behandlung an Tag 7 erzielt. Die Wirkung der mIL-12-Gentherapie auf das Tumorwachstum in diesen 4 Tumormodellen ist in 4 gezeigt.
Außerdem wurde bei Mäusen, die ein P815-Mastocytom oder B16-Melanom haben, eine signifikante Suppression des Tumorwachstums erzielt (4). Zum Beispiel betrug am Tag 13 nach der P815-Tumorzellimplantation der mittlere Tumordurchmesser in Mäusen, die mit pWRG3169 behandelt waren, 8,89 ± 0,27 im Gegensatz zu 12,28 ± 0,46 mm für die pCMVLuc-Kontrollgene im gleichen Expressionsplasmid (p<0,001). Ähnlich betrug der Tumordurchmesser am Tag 15 nach der B16-Tumorzellimplantation in mit pWRG3169 behandelten Mäusen 6,30 ± 0,045 im Gegensatz zu 11,8 ± 0,31 mm für das pCMVLuc-Kontrollgenplasmid (p<0,001). Für diese beiden schwach immunogenen Tumorsysteme ist es unklar, ob modifizierte Gentransfermuster oder das Zeitschema die Therapie und Ergebnisse bei der Tumorregression verbessern können, was offensichtlich systematische Evaluation in zukünftigen Untersuchungen verlangt.
Die Experimente der mIL-12-Gentherapie wurden fünfmal mit dem Renca-Tumorsystem, viermal mit MethA- und P815-Tumoren, dreimal mit dem B16-Tumor und einmal mit dem L5178Y-Tumormodell wiederholt, und es wurden ähnliche Ergebnisse erhalten. Bei jeder Behandlung erhielten die Mäuse 4 Transfektionen mit IL-12-DNA (Kreise) oder pCMVLuc-DNA (Quadrate). Die Pfeile in 4A-4F weisen auf die Tage nach der Tumorimplantation, an denen die Behandlung durchgeführt wurde. Jede Gruppe umfasste 7-8 Mäuse außer beim B16-Tumormodell, das 12 Mäuse pro Gruppe umfasste.
Es ist wichtig, anzumerken, dass bei allen getesteten murinen Tumormodellen zu Beginn der Therapie die Tumoren bereits gut etabliert waren und einen Durchmesser von 5-8 mm erreicht hatten. Nach unserem Wissen ist dies der erste Beweis, dass eine IL-12 Gentherapie eine vollständige Regression großer und etablierter Tumoren hervorrufen kann. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass eine IL-12-Gen therapie mit Hilfe retroviraler Vektoren zu einer Prävention der Tumorentwicklung oder zu einer Regression kleiner 3 Tage alter MCA207-Sarkome in 33% der behandelten Mäuse führte. Es ist ebenfalls bemerkenswert, dass nur 1-4 Therapietage (unter Verwendung von 4 Bombardements pro Tumorstelle an jedem Therapietag) zu einer Tumorregression oder Wachstumssuppression in praktisch allen unseren Experimenten führte.
In früheren Untersuchungen unter Anwendung einer Therapie mit rekombinantem Protein erforderte eine Tumorregression tägliche IL-12- Injektionen mit Dosen von 0,1 bis 10 μg für 1 Woche oder 5 Tage die Woche in 4 Wochen. In Verbindung mit unseren früheren Feststellungen unter Verwendung anderer Zytokingene lassen die in 1 und 2 dargestellten Ergebnisse vermuten, dass eine transgene IL-12-Produktion von gewöhnlichen Epidermiszellen in unmittelbarer Nähe des Tumors für die Antitumor-Wirkung der IL-12-Gentherapie verantwortlich sein kann.
Eine IL-12 induzierte Tumorregression involviert CD8⁺-T-Zellen
Die beobachtete Tumorregression ist von der Gegenwart von CD8⁺-Zellen abhängig. Eine in vivo Verarmung an CD8⁺-T-Zellen, aber nicht die Verarmung an CD4⁺-T-Zellen hebt die Wirkung einer mIL-12-Gentherapie auf. Um dies zu zeigen, wurden Balb/c-Mäusen intradermal 1 × 10⁶ Renca-Zellen injiziert. Die Haut wurde mit IL-12 oder pCMVLuc cDNA-Expressionsvektoren an Tag 7, 9 und 11 nach der Tumorimplantierung transfiziert. Anti-CD4-mAk (Klon GK1.5) oder Anti-CD8-mAk (Klon 2.43), die beide vom Trudeau Institute, Saranac Lake, NY, erhalten wurden, wurden intraperitoneal an Tag 8 (300 μg/Maus) und an Tag 12 (150 μg/Maus) nach der Tumorimplantation verabreicht. Die Kontollgruppen umfassten Mäuse, die mit dem IL-12-Gen behandelt wurden und Ratten-IgG (Sigma) mit der gleichen Dosis und dem gleichen Dosierungsschema wie die Anti-CD8- und CD4-mAk erhielten, oder Mäuse, die mit dem pCMVLuc Gen anstelle des IL12 Gens behandelt wurden. Die in dieser Untersuchung verwendeten Anti-CD4- und Anti-CD8-mAk verursachten nach einer einzigen Injektion eine Verarmung von mehr als 90% der relevanten T-Zellteilmengen in den Mäusen für 4-5 Tage. Die Tumormasse bei 8 Mäusen pro Gruppe vergrößerte sich weiter, wenn die CD8⁺-T-Zellen eliminiert waren, jedoch wurde eine Tumorregression oder Beseitigung beobachtet, wenn CD4⁺-T-Zellen entfernt worden waren, oder wenn Ratten-IgG injiziert wurde. Diese Daten stehen in Übereinstimmung mit den Erkenntnissen von Brunda et al., J. Exp. Med. 178(4): 123-30 (1993), dass die durch rekombinantes IL-12 verursachte Tumorregression von CD8⁺-T-Zellen, aber nicht von CD4⁺-T-Zellen vermittelt ist. Tatsächlich schien eine Verarmung an CD4⁺-T-Zellen mit monoklonalem Anti-CD4-Antikörper (mAk) zu einer leicht beschleunigten Tumoregression zu führen, was impliziert, dass CD4⁺-T-Zellen die Antitumor-Wirkung von IL-12 in diesem Tumormodell supprimieren können. Tatsächlich ist gezeigt worden, dass etablierte Tumoren Th2-ähnliche CD4⁺-T-Suppressorzellen induzieren, welche die CD8⁺-T-Zell-vermittelten Immunantworten hemmen können. Die vorteilhafte Wirkung einer Anti-CD4-mAk-Behandlung für eine Tumor-Immuntherapie mit rekombinantem IL-12-Protein oder IL-12-Gen ist zuvor erwähnt worden. Zusätzliche Daten zeigen, dass das IL-12-Protein Tumorspezifische CD8⁺-T-Zellen in vitro aktivieren kann und eine anti-supprimierende Wirkung auf Th2 CD4⁺-T-Zellen in vivo vermitteln kann.
Transport des IL-12-Gens in die Tumorstelle mit einer Genkanone ruft eine systemische Antitumor-Wirkung hervor, die zu einer Reduktion des Wachstums eines entfernt liegenden Tumors führt.
Die Beobachtung, dass eine durch eine lokale IL-12-Gentherapie verursachte Tumorregression CD8⁺-T-Zellen benötigt, lässt vermuten, dass ein lokaler IL-12-Gentransport zu einer systemischen Antitumor-Wirkung führen könnte. Diese Hypothese wurde mit Hilfe des P815-Tumorsystems getestet, bei dem Tumorzellen mehrere Tage nach der intradermalen Implantation in die inneren Organe metastasieren und dadurch den Tod der Mäuse hervorrufen, selbst wenn der Primärtumor chirurgisch entfernt worden ist.
DBA/2-Mäusen wurden 1 × 10⁶ P815-Zellen intradermal injiziert. Darüber liegendes und den Zieltumor umgebendes Hautgewebe wurde mit pWRG3169 behandelt, das mittels Partikelbeschleunigung transportiert wurde (8 Mäuse/Gruppe), oder mit pCMVLuc (5 Mäuse/Gruppe) an Tag 12 und 14 nach der Tumorzellimplantation behandelt. Eine chirurgische Entfernung des Tumors wurde an Tag 15 durchgeführt, wenn die Tumorgröße etwa 13 mm im Durchmesser erreichte. Zusätzliche Transfek tionen von Kontroll- und Testkonstrukten in die Haut auf beiden Seiten des Abdomens wurden am Tag 16, 18 und 20 nach der Implantation durchgeführt.
Alle mit pCMVLuc behandelten Mäuse starben 28,0 ± 0,6 Tage nach der Tumorzellimplantation. Makroskopische Untersuchungen zeigten, dass der Tod durch spontane Metastasenbildung der Tumorzellen in den inneren Organen, hauptsächlich in der Leber, verursacht wurde. Eine m-IL12 Gentherapie verlängerte das Überleben der Mäuse (Überlebenszeit 41,4 ± 4,9 Tage, p<0,05) wirksam und 1 von 8 Mäusen wurde „geheilt".
Dieses Experiment wurde ohne zusätzliche Transfektionen nach der Tumorentfernung wiederholt und zeigte, dass alle mit der Luc-cDNA behandelten Mäuse (n=11) nach 43,9 ± 7,1 Tagen starben, während 5 oder 12 (41,6%) der mit der IL-12-Gentherapie behandelten Mäuse mindestens 180 Tage überlebten und folglich als „geheilt" betrachtet wurden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass ein lokaler Transport des IL-12-Gens in die darüber liegenden und umgebenden Hautgewebe des Primärtumors die systemische Antitumor-Immunantwort verstärken kann und zu einer Eradikation etablierter spontaner Metastasen führt.
Balb/c-Mäusen wurden 10⁶ Renca-Zellen sowohl in die linke als auch in die rechte Seite des Abdomens intradermal injiziert. Die Tumoren auf der rechten Seite wurden entweder mit pWRG3169 oder pCMVLuc an Tag 5, 7 und 9 des Tumorwachstums beschossen. Die IL-12-Gentherapie führte im Vergleich mit dem Wachstum von unbehandelten Tumoren in Kontrollmäusen (Tumordurchmesser an Tag 22: 9,58 ± 1,82 beziehungsweise 13,18 ± 2,03; n = 8 Mäuse/Satz, p<0,005) zu einer signifikanten Wachstumsverminderung in dem unbehandelten (linken) Tumor. Ein ähnliches Experiment wurde mit den L5178Y-Tumoren auf der rechten Seite des Abdomens durchgeführt, diese wurden entweder mit pWRG3169 oder mit pCMVLuc an Tag 3 und 6 des Tumorwachstums beschossen. In dieser Versuchsreihe führte die IL-12-Gentherapie zu einer vollständigen Tumorregression bei den behandelten (rechten) wie auch bei den unbehandelten (linken) Tumoren in allen Mäusen (n = 8). Ein zusätzliches Experiment hat gezeigt, dass ein IL-12-Gen-Bombardement der Haut entfernt von der Tumorumgebung das Tumorwachstum nicht beeinflusst. Diese Ergeb nisse lassen vermuten, dass eine lokale Aktivierung von Immunzellen an der Tumorstelle während der IL-12-Gentherapie eine systemische Antitumor-Immunität erzeugt.
Mäuse, die die Tumoren nach der IL-12-Gentherapie abstießen, entwickeln ein Tumor-spezifisches immunologisches Gedächtnis.
A. Abstoßung eines sekundären Tumors nach einer IL-12-Gentherapie.
Balb/c-Mäusen, die Renca- oder MethA-Tumoren nach einer IL-12-Gentherapie abstießen, wurden einen Monat später sowohl 1 × 10⁶ Renca-Zellen als auch MethA-Zellen in die rechte beziehungsweise linke Seite des Abdomens injiziert. Als Kontrolle wurden die Tumorzellen in gleichaltrige naive Balb/c-Mäuse (5-8 Mäuse pro Gruppe) injiziert.
Es wurde Mäusen, die die intradermalen Renca- (Gruppe A) oder MethA-Tumoren (Gruppe B) nach einer IL-12-Gentherapie abstießen, oder naiven Kontrollmäusen in die rechte Seite des Abdomens Renca-Zellen und in die linke Seite des Abdomens MethA-Zellen injiziert. Während sämtliche Kontrollmäuse beide Tumoren entwickelten, entwickelten Mäuse der Gruppe A MethA-Tumoren, aber keine Renca-Tumoren und umgekehrt; das heißt, Mäuse der Gruppe B entwickelten Renca-Tumoren, aber keine MethA-Tumoren.
B. Induktion der CTL-Aktivität in Mäusen die nach einer IL-12-Gentherapie Tumoren abstießen.
Tumor-spezifische CTL wurden in vitro erzeugt, wie von Rakhmilevich et al., Int. J. Cancer, 55:338 (1993) beschrieben. Milzzellen (5 × 10⁶), die von Balb/c-Mäusen, die Renca-Tumoren aufgrund einer IL-12-Gentherapie abgestoßen hatten und zwei Monate tumorfrei blieben, oder von gleichaltrigen naiven Mäuse stammten, wurden mit 5 × 10⁴ Mytomicin-C behandelten Renca-Zellen in Kulturplatten mit 24 Vertiefungen in RPMI-1640 Komplettmedium gemeinsam kultiviert. Nach einer 5-tägigen Kultivierung in vitro wurde eine abgestufte Anzahl lebensfähiger Effektorzellen und ⁵¹Cr-markierter Renca-Zellen (10⁴) in die Vertiefungen einer rundbödigen Platte mit 96 Vertiefungen verbracht. Nach 4 h Inkubation bei 37°C wurde die Radioaktivität in den Überständen bestimmt. Mittelwert ± Standardabweichung von 4 Mäusen pro Gruppe. Milzzellen von IL-12-Gen-behandelten Mäusen erzeugten 3-4-fach höhere Levels an CTL-Aktivität als Milzzellen von naiven Mäusen (p<0,005). Diese Ergebnisse zeigen, dass eine IL-12-Gentherapie eine systemische Antitumor-Immunität erzeugt.
In einer ähnlichen Untersuchung unter Verwendung von Milzzellen aus Mäusen, die zuvor L5178Y-Tumoren abgestoßen hatten, waren die generierten CTL in der Lage, L5178Y-Zellen zu lysieren, aber nicht die syngenen P815-Zellen.
Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass eine IL-12-Gentherapie mit einem Gerät für die Partikel-vermittelte Genübertragung gegen verschiedene murine Tumoren wirksam ist und als eine Behandlung von immunogenen humanen Tumoren angewandt werden kann. Zusätzlich zeigen die Erkenntnisse, dass nach einem in vivo Bombardement IL-12-DNA in die Haut, aber nicht in das Tumorgewebe transportiert wurde. Deshalb kann die Partikel-vermittelte IL-12-Gentherapie routinemäßig bei subkutanen Tumoren oder Metastaseknoten ohne irgendwelche chirurgische Eingriffe angewendet werden.
Ferner stellten die Erfinder etwa 250 pg IL-12 an der bombardierten Tumorstelle fest, was etwa 1/400 bis 1/40.000 der „therapeutischen Dosis" an rekombinantem IL-12 (0,1-10 μg) darstellt. Darüber hinaus ist von der therapeutischen IL-12-Dosis ebenfalls bekannt, dass sie nicht akzeptable Toxizitätslevels verursacht. Deshalb ist im Vergleich mit einer Behandlung mit rekombinanten IL-12 eine Behandlung mit der IL-12-Gentherapie der vorliegenden Erfindung wesentlich weniger toxisch (falls überhaupt) und wesentlich weniger teuer.
Folglich ist gezeigt worden, dass zirkulierende Levels an Zytokin IL-12 in vivo nicht durch den Transport von IL-12 in einem Patienten entstehen können, der einer derartigen Behandlung bedarf, sondern eher durch den Transport von Gensequenzen in den Patienten, die eine Expression von IL-12 in dem behandelten Individuum auslösen. Das gentherapeutische Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Bildung einer Antitumor-Antwort in einem behandelten Individuum, ohne das IL-12-Protein in das Individuum zu befördern. SEQUENZLISTE

Claims

Verwendung eines Plasmidkonstrukts, umfassend: eine DNA-Sequenz, welche eine p35-Untereinheit von Zytokin IL-12 codiert und welche unter der Kontrolle eines Promotors ist, der in den Zielzellen, in die das Konstrukt transportiert werden soll, operativ ist, und eine DNA-Sequenz, welche eine p40-Untereinheit von Zytokin IL-12 codiert und welche unter der Kontrolle eines separaten Promotors ist, der ebenfalls in den Zielzellen, in die das Konstrukt transportiert werden soll, operativ ist, in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumoren in einem Säuger durch Transportieren von Kopien des Konstrukts in epidermale oder mukosale Zielzellen des Säugers in vivo.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei Kopien des Plasmidkonstrukts auf Trägerpartikel aufgetragen werden.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die p35- Unterheit der DNA-Sequenz das Protein der SEQ ID NR: 2 codiert und die p40-DNA-Sequenz das Protein der SEQ ID NR. 3 codiert.
Verwendung nach dem Anspruch in Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA-Sequenz, die die p35-Unterheit codiert, SEQ ID NR. 1 bei Basen 953-1258 und 1332-1673 ist und die DNA-Sequenz, die die p40-Unterheit codiert, SEQ ID NR. 1 bei Basen 2983-3990 ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA-Sequenz, die die p35-Unterheit codiert, im wesentlichen homolog zu SEQ ID NR. 1 bei Basen 953-1258 und 1332-1673 ist und die DNA-Sequenz, die die p40-Unterheit codiert, im wesentlichen homolog zu SEQ ID NR. 1 bei Basen 2983-3990 ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei jeder Promotor ein Zytomegalovirus-Promotor ist.
Plasmidkonstrukt, geeignet zur Verwendung in der Behandlung von Tumoren in einem Säuger durch Transportieren von Kopien des Konstrukts in epidermale oder mukosale Zielzellen des Säugers in vivo, welches Konstrukt umfasst: eine DNA-Sequenz, welche eine p35-Untereinheit von Zytokin IL-12 codiert und welche unter der Kontrolle eines Promotors ist, der in den Zielzellen, in die das Konstrukt transportiert werden soll, operativ ist, und eine DNA-Sequenz, welche eine p40-Untereinheit von Zytokin IL-12 codiert und welche unter der Kontrolle eines separaten Promotors ist, der ebenfalls in den Zielzellen, in die das Konstrukt transportiert werden soll, operativ ist,
Konstrukt nach Anspruch 7, worin die DNA-Sequenzen wie in einem der Ansprüche 3 bis 5 definiert sind.
Konstrukt nach Anspruch 7 oder 8, worin die Promotoren Zytomegalovirus-Promotoren sind.
Teilchenbeschleunigerapparat für den Gentransfer, beladen mit Trägerpartikeln, die überzogen sind mit Kopien eines Konstrukts, wie in einem der Ansprüche 7 bis 9 definiert.