ES2262180T3 - Il12 para la terapia genetica de tumores. - Google Patents
Il12 para la terapia genetica de tumores.Info
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Abstract
EN UNA FORMA DE TERAPIA GENETICA PARA EL TRATAMIENTO DE TUMORES, SE ADMINISTRA UNA CONSTRUCCION GENETICA QUE CODIFICA LAS SUBUNIDADES P35 Y P40 DE LA IL-12 DE LA CITOQUINA A CELULAS DE INDIVIDUOS QUE NECESITEN LA TERAPIA DE MANERA QUE SE EXPRESE LA IL-12 EN LA CELULAS Y QUE SE PROVOQUE UNA REGRESION DE LOS TUMORES INSTALADOS.
Description
IL 12 para la terapia genética de tumores.
La presente invención se refiere de manera
general a construcciones genéticas para el tratamiento de tumores y,
en particular, se refiere a una construcción genética que contiene
el gen de la IL-12 para su administración directa
a células de la piel.
La interleuquina (IL) 12, anteriormente
denominada factor estimulante de las células destructoras naturales
o factor de maduración de linfocitos citotóxicos, es una citoquina
heterodimérica unida por disulfuro compuesta por subunidades de 35
y 40 kDa; las subunidades son denominadas comúnmente "p35" y
"p40". Los ADNs complementarios que codifican las subunidades
p35 y p40 de ratón y humano han sido secuenciados y clonados y se ha
demostrado que la IL-12 humana y de ratón actúan
como factores de crecimiento para las células destructoras naturales
("NK") y para las células T, in vitro e in vivo.
Además, la IL-12 ha demostrado también ser eficaz
en la regresión y desaparición completa de tumores murinos. Tahara y
col., Cancer Research 54(1): 182-9,
1994; Brunda y col., J. EXP. MED. 178(4):
123-30, 1993.
Sin embargo, como la IL-12 tiene
una corta semivida in vivo, se necesitan inyecciones
frecuentes de la citoquina para conseguir efectos terapéuticos.
Además, se requieren típicamente cantidades relativamente grandes
de IL-12 (en el rango de 1-10
\mug/día). Por tanto, la administración de IL-12
recombinante tenía a menudo como resultado toxicidad.
Se están llevando a cabo en varios laboratorios
terapias con el gen de IL-12 utilizando vectores
retrovíricos, y se ha demostrado su efecto antitumoral. Lotze, M.T.
y col., J. Cell. Biochem., p. 184, 1993; Robbins y col.,
Cancer Gene Therapy 1(2): 147, 1994. En el estudio de
Lotze y col., los genes de las subunidades p35 y p40 de
IL-12 fueron insertados en fibroblastos NIH 3T3. Los
fibroblastos fueron utilizados para transportar
IL-12 al lugar de los tumores, retrasando el
crecimiento de una variedad de tumores murinos. En el estudio de
Robbins y col., la administración directa de IL-12 a
varias líneas tumorales de ratón diferentes mediante transducción
mediada por retrovirus antes de la inoculación, o a fibroblastos que
fueron coadministrados posteriormente con las células tumorales,
tuvo como resultado la inhibición del crecimiento del tumor así como
la inducción de inmunidad antitumoral. La administración mediada
por partículas del gen de IL-12 a la piel y los
efectos de la misma sobre la regresión de tumores están descritos en
Proc. Am. Assoc. Can. Res. Ann. Meet., Vol. 37, 1996,
347.
Sin embargo, hasta la fecha, no ha sido posible
producir una regresión fiable de tumores establecidos y de sus
metástasis espontáneas utilizando una terapia directa con el gen de
la IL-12.
La presente invención se resume en que puede
conseguirse una respuesta antitumoral después de la transferencia a
un animal mamífero de una molécula de ADN que codifique la citoquina
IL-12.
Es un objeto de la presente invención
posibilitar el tratamiento de tumores mediante la utilización de una
construcción genética de IL-12.
Es una característica de la presente invención
el que está adaptada a la administración epidérmica o mucosal de la
construcción plasmídica.
De acuerdo con la invención, se proporciona por
tanto la utilización de una construcción plasmídica que
comprende:
- una secuencia de ADN que codifica una
subunidad p35 de la citoquina IL-12 y que está bajo
el control de un promotor operativo en las células diana a las que
va a administrarse la construcción y
- una secuencia de ADN que codifica una
subunidad p40 de la citoquina IL-12 y que está bajo
el control de un promotor separado que es también operativo en las
células diana a las cuales se va a administrar la construcción,
en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de tumores en un mamífero mediante la administración de
copias de la construcción a células diana epidérmicas o mucosales
del mamífero in vivo.
En otro aspecto, la invención proporciona una
construcción plasmídica adecuada para ser utilizada en el
tratamiento de tumores de un mamífero mediante la administración de
copias de la construcción a células diana epidérmicas o mucosales
del mamífero in vivo, construcción que comprende:
- una secuencia de ADN que codifica una
subunidad p35 de la citoquina IL-12 y que está bajo
el control de un promotor operativo en las células diana a las que
va a administrarse la construcción y
- una secuencia de ADN que codifica una
subunidad p40 de la citoquina IL-12 y que está bajo
el control de un promotor separado que es también operativo en las
células diana a las cuales se va a administrar la construcción.
Una ventaja del tratamiento genético de la
presente invención es que el mismo es inherentemente seguro, no es
doloroso en la administración y no tendrá como resultado
consecuencias adversas para los individuos tratados.
Una ventaja adicional del tratamiento genético
de la presente invención es que el tratamiento genético es eficaz
incluso cuando es administrado en un lugar distinto del tumor y el
que la memoria inmunológica se conserve después del cese del
tratamiento genético.
Otros objetos, ventajas y características de la
presente invención serán obvios a partir de la especificación
siguiente.
La Fig. 1 es un mapa plasmídico del plásmido
pWRG3169 de IL-12.
La Fig. 2 es un mapa plasmídico del plásmido
pWRG3196 de IL-12.
La Fig. 3 es una gráfica que presenta patrones
de crecimiento tumoral en ratones tratados con el gen de
IL-12 y en ratones control.
Las Figs. 4A-4F son gráficas que
presentan el cambio del diámetro de varios tumores sólidos inducidos
después del tratamiento utilizando genes de
IL-12.
La presente especificación describe la
utilización de una construcción plasmídica que codifica las
subunidades p35 y p40 de la proteína IL-12 en la
fabricación de un medicamento que es administrado en la epidermis de
un paciente en el lugar del tumor. Los tumores pueden ser tumores
sólidos o tumores metastásicos o diseminados y pueden ser
microscópicos o visibles a simple vista. Una vez que la construcción
es administrada, se expresa la citoquina heterodimérica
IL-12, teniendo como resultado la creación de una
respuesta antitumoral en los individuos tratados, incluso cuando el
tumor está lejos del lugar de administración.
Con el fin de conseguir el tratamiento genético
buscado de la presente invención, se crea una construcción
plasmídica de IL-12 en la cual los genes que
codifican IL-12 están colocados bajo el control de
un promotor operativo en las células de un animal mamífero diana.
Cuando es transfectada en las células de un animal tratado, una
construcción adecuada produce la expresión de la proteína
IL-12.
La proteína IL-12 es realmente
un heterodímero que incluye una subunidad de 35 kDa (p35) y una
subunidad de 40 kDa (p40). Cada subunidad está codificada por un gen
distinto. Las secuencias de ADN que codifican p35 y p40 de
IL-12 pueden ser obtenidas o derivadas de una fuente
animal mamífero, preferiblemente de una fuente humana. Una secuencia
de ADN de longitud completa que codifica subunidades de la
IL-12 humana ha sido publicada por Gubler y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4143-4147,
1991. Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de una
subunidad p35 humana publicadas están disponibles en el GenBank,
Número de Acceso M65271. De manera similar, las secuencias de ácido
nucleico y de aminoácidos de una subunidad p40 humana están también
disponibles en el GenBank, número de Acceso M65272.
Alternativamente, las secuencias que codifican
las subunidades de IL-12 pueden ser obtenidas de
cualquier otro animal no humano que produzca IL-12.
Las secuencias que codifican las subunidades de
IL-12 pueden ser obtenidas o derivadas de otras
especies que demuestren una identidad de secuencias suficiente para
ser funcionalmente equivalentes a la IL-12 humana.
Por ejemplo, se sabe que la IL-12 es producida por
ratones. Secuencias de ratones fueron utilizadas en las
construcciones de los ejemplos descritas en la presente. Un ADN que
codifica p35 está descrito en el GenBank, Número de Acceso M86672.
El ADN que codifica p40 está también disponible en el GenBanK.
Además, pueden prepararse fácilmente secuencias
codificadoras sintetizadas in vitro que codifiquen las
subunidades p35 y p40 de IL-12 en cantidades
suficientes para el clonaje molecular utilizando técnicas
recombinantes estándar de biología molecular, incluyendo
amplificación por PCR e hibridación, utilizando como molde guía la
secuencia de ADN publicada.
Puede ser también posible modificar
adicionalmente las moléculas de ADN que codifican las subunidades y
las subunidades de la proteína descritas en la presente, mientras
se mantiene todavía la actividad antitumoral de la presente
invención. La presente invención tiene la intención de incluir ADN
de la IL-12 natural truncado que tiene las
secuencias de ácido nucleico descritas en la presente, además de
todas las formas alteradas, variadas y modificadas del ADN. Éstas
pueden incluir, pero no se limitan a, fragmentos de ADN
sustancialmente homólogos que tienen adiciones, deleciones y
mutaciones puntuales, con relación a las secuencias de ácido
nucleico descritas que incluyen un truncamiento en el extremo 5' y/o
3'. Un fragmento de ADN sustancialmente homólogo es uno en el que el
fragmento codifica un polipéptido que presenta una actividad
antitumoral significativa y/o una regresión después de la
administración, incluso si tal ADN difiere en la secuencia de
nucleótidos o codifica una proteína que difiere en la secuencia de
aminoácidos de los fragmentos de ADN o proteínas descritos en la
presente. La actividad antitumoral de tales moléculas de ADN
truncadas puede ser monitorizada según se describe más adelante.
Una persona experta en la técnica reconocerá que
ciertos cambios silentes en la secuencia de ácido nucleico no tienen
efecto sobre el aminoácido codificado por un triplete particular.
Incluso ciertos cambios de aminoácidos que no afectan, o que
afectan solamente un tanto, a la actividad IL-12 de
la proteína codificada pueden ser utilizados dentro del ámbito de
la invención. Cualquier secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos
que tenga como resultado una actividad antitumoral que sea al menos
el 75% de la actividad obtenida utilizando los genes de la
IL-12 murina (mIL-12) analizada
según se describe en los ejemplos siguientes, puede ser utilizada en
la presente invención.
Por supuesto, si el gen que codifica una
proteína IL-12 es introducido en una construcción
genética para ser administrada a un huésped de una especie distinta
de la que deriva el gen, puede tener lugar una respuesta inmune
después de la transferencia del gen. Sin embargo, una persona con
experiencia en la técnica comprenderá que es posible eliminar tal
efecto modificando la secuencia de ácido nucleico de la porción de
la IL-12 madura del gen que va a ser
administrado.
Con el fin de expresar apropiadamente las
secuencias genéticas de la subunidad de IL-12 en las
células transfectadas, se necesita una secuencia promotora
operativa en las secuencias diana. Se conocen varios de tales
promotores para sistemas de mamífero que pueden ser unidos 5', o
corriente arriba, de la secuencia codificadora de la proteína que
va a ser expresada. Un promotor preferido es el promotor de CMV,
cuya secuencia es bien conocida y ha sido publicada en Cell
41: 521-530 (1995). Un terminador transcripcional
corriente abajo, o secuencia de poliadenilación, puede ser también
añadido en 3' a la secuencia que codifica la proteína. Una secuencia
de poliadenilación preferida es la región poli A de la hormona de
crecimiento bovina, cuya secuencia es conocida. Pueden colocarse
también en la construcción, si se desea, sitios donadores de ayuste
y sitios aceptores de ayuste (SD/SA), tales como los SD/SA de SV40,
igual que un sitio interno de entrada de ribosomas (IRES), tal como
el IRES clonado a partir del virus de la encefalomiocarditis.
Según describen los inventores con más detalle
en los ejemplos más adelante, se ha determinado que la expresión de
las dos secuencias codificadoras de proteínas de unidades de
transcripción separadas en un único plásmido, tiene como resultado
niveles de proteína significativamente más elevados que los
observados cuando la expresión bicistrónica de los genes es llevada
a cabo a partir de un único promotor. Por tanto, para los fines de
esta invención, cada región codificadora se proporciona con un
promotor separado.
En la presente invención, una construcción
plasmídica adecuada que codifica subunidades de la proteína
IL-12 es transferida al individuo susceptible. Un
tratamiento genético puede ser administrado de manera no invasiva a
una variedad de tipos tisulares susceptibles con el fin de conseguir
en el individuo la respuesta inmunológica deseada.
Se describe en la presente que cuando se tratan
tumores con la construcción plasmídica de IL-12, las
células diana preferidas son células epidérmicas más que células de
capas de la piel más profundas tales como la dermis. Las células
epidérmicas son los receptores preferidos de la construcción
genética de IL-12, ya que son las células más
accesibles del organismo. Los pacientes con necesidad de tal terapia
genética pueden ser por tanto tratados de manera ventajosa no
invasivamente. Además, bastante inesperadamente y al contrario de lo
que podría pensarse, la administración epidérmica del gen de la
IL-12 trata con éxito tumores muy distantes del
lugar de administración y, además, genera una inmunidad antitumoral
sistémica, una memoria inmunológica y respuestas citotóxicas. Por
tanto, la administración epidérmica es particularmente muy adecuada
para la administración no invasiva de los genes de
IL-12.
Puesto que el tratamiento con la construcción
plasmídica de IL-12 ha resultado satisfactorio en la
producción de respuestas antitumorales con éxito después de la
administración a la piel de la construcción plasmídica de
IL-12 basada en una pistola de genes, es también
probable que la administración no invasiva de la construcción
plasmídica de IL-12 a superficies mucosales tenga
como resultado también respuestas al tratamiento satisfactorias.
Se prevé también específicamente que gotitas
acuosas conteniendo ADN de IL-12 desnudo puedan ser
administradas directamente a los tejidos del individuo que solicita
ser tratado. Con cierta frecuencia, tal ADN "desnudo" será
captado por los tejidos tratados.
El medio de transferencia preferido para la
administración no invasiva es un dispositivo de transferencia génica
de partículas aceleradas, aunque es aceptable cualquier medio que
pueda transferir de manera fiable la construcción a los sitios
diana adecuados (epidermis o tejido mucosal). La técnica de
administración génica con partículas aceleradas está basada en el
revestimiento de construcciones genéticas para ser administradas a
las células sobre partículas transportadoras extremadamente
pequeñas, preferiblemente partículas de oro, que están diseñadas
para que sean pequeñas con relación a las células que se busca que
sean transformadas por el proceso. Las partículas de oro pueden ser
perlas o esferas u oro amorfo. Todas son adecuadas para ser
utilizadas en la presente invención. La referencia en la presente a
partículas tiene la intención de incluir todas estas formas. Se ha
demostrado en otros sistemas de dianas biológicas que el oro amorfo,
tal como el oro microcristalino de Englehard, consigue una mayor
administración a las células diana que otros tipos de oro.
Sin tener en cuenta el tipo de aparato de
aceleración de partículas o las partículas adecuadas utilizadas, las
partículas transportadoras revestidas son posteriormente aceleradas
físicamente hacia las células que van a ser transformadas, de tal
manera que las partículas transportadoras penetran en el interior de
las células diana. Esta técnica puede ser utilizada con células
in vitro o in vivo. Con cierta frecuencia, el ADN que
ha sido revestido previamente sobre las partículas transportadoras
es expresado en las células diana. Se ha demostrado que esta técnica
de expresión génica funciona en procariotas y eucariotas, desde
bacterias y levaduras hasta plantas y animales superiores. Por
tanto, el método de partículas aceleradas proporciona una
metodología idónea para la administración de genes a las células de
una amplia variedad de tipos tisulares, y ofrece la capacidad de
administrar esos genes a células in situ e in vivo sin
ningún impacto o efecto adverso sobre el individuo tratado. El
método de partículas aceleradas es también preferido en cuanto a que
permite que una construcción genética para tratamiento sea dirigida
a un tejido particular y a una capa de células particular en el
tejido, variando el sitio de administración y la fuerza con la cual
las partículas son aceleradas, respectivamente.
El procedimiento general de la tecnología de
transfección génica con partículas aceleradas está descrito en la
Patente de EE.UU. Nº 4.945.050 para Sanford. Un instrumento basado
en una variante mejorada de ese procedimiento está disponible
comercialmente en BioRad Laboratories. Un procedimiento alternativo
a un aparato de transfección con partículas aceleradas está
descrito en la Patente de EE.UU. Nº 5.015.580, la cual, aunque está
dirigida a la transfección de plantas de soja, describe un aparato
que es igualmente adaptable para ser utilizado con células de
mamífero y con mamíferos completos intactos. La Patente de EE.UU. Nº
5.149.655, describe una versión portátil, práctica, de un
dispositivo de administración de genes con partículas aceleradas.
Otro de tales dispositivos puede estar basado en otras fuentes de
propulsión utilizando, por ejemplo, gas comprimido como fuerza
motriz.
La administración con una pistola de genes
permite el control preciso del nivel y la forma de producción de
IL-12 en un lugar epidérmico dado, ya que la
administración intracelular de ADN puede ser controlada variando
sistemáticamente el número de partículas administradas y el número
de copias del plásmido por partícula. Este control preciso sobre el
nivel y la forma de producción de la citoquina puede permitir un
control sobre la naturaleza de la respuesta resultante.
El término "transfectadas" es utilizado en
la presente para hacer referencia a células que han incorporado la
construcción plasmídica de IL-12 foránea
administrada, cualquiera que sea la técnica de administración
utilizada. El término transfección se utiliza con preferencia al
término transformación para evitar la ambigüedad inherente a este
último término, que es también utilizado para referirse a los
cambios celulares en el proceso de la oncogénesis.
La presente invención será mejor comprendida
mediante referencia los ejemplos siguientes, que tienen la intención
de ser meramente ejemplares de la invención. En los ejemplos, se
han utilizado ratones como receptor modelo de la construcción de
expresión de IL-12. Los ratones son el modelo animal
estándar para la extrapolación a tumores humanos, y la política
general de la FDA requiere que los investigadores demuestren la
eficacia de un tratamiento propuesto para el cáncer en modelos de
ratón antes de llevar a cabo ensayos clínicos.
Se han utilizado dos construcciones de
IL-12 murina, cada una de las cuales codifica las
subunidades p35 y p40 de la mIL-12. Estas
subunidades fueron clonadas a partir de una biblioteca de ADNc de
bazo de ratón. Todos los plásmidos fueron producidos con la
finalidad expresa de incrementar la expresión génica de la citoquina
IL-12, y con el uso inmediato deseado en un
programa de terapia génica del cáncer.
El plásmido pWRG3169 es un plásmido tándem que
codifica los genes de ambas subunidades de mIL-12.
Un mapa del plásmido pWRG3169 está proporcionado en la Fig. 1 y la
secuencia de nucleótidos completa del plásmido está presentada en
la SEC ID Nº: 1. Los productos p35 y p40 del plásmido están
descritos como SEC ID Nº: 2 y SEC ID Nº: 3, respectivamente. El gen
que codifica cada subunidad está bajo el control transcripcional de
un promotor de citomegalovirus (CMV) separado. Se proporciona un
donante de ayuste/aceptor de ayuste (SA/SD) de SV40 entre el
segmento que codifica cada subunidad y su promotor de CMV. Justo
corriente abajo (3') del segmento que codifica cada subunidad hay
una señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina
(bGH pA). Cada unidad (promotor - SA/SD - región codificadora -
señal de poli A) es transcrita en serie (esto es, en la misma
dirección) a partir del plásmido. El esqueleto del plásmido pUC19
deriva de un vector Bluescript® SK(+) con un gen de resistencia a
ampicilina, que está disponible comercialmente en Stratagene Cloning
Systems, La Jolla, CA.
El plásmido pWRG3196 es un plásmido bicistrónico
que codifica ambas subunidades de la mIL-12. un mapa
del plásmido pWRG3196 está proporcionado en la Fig. 2 y la secuencia
completa está mostrada en la SEC ID Nº: 4. Los productos p35 y p40
del plásmido están descritos como SEC ID Nº: 5 y SEC ID Nº: 6,
respectivamente. El esqueleto del plásmido pUC19 derivaba de un
vector Bluescript SK(+) con un gen de resistencia a ampicilina. Este
vector contiene un único promotor de citomegalovirus (CMV), un
donante de ayuste/aceptor de ayuste de SV40 y la señal de
poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Los genes de
p35 y p40 se proporcionan ambos corriente abajo del sitio de SD/SA y
corriente arriba del sitio poli A de SV40. El gen de p35 está
corriente arriba de (esto es, más próximo al promotor que) el gen
de p40. Entre los genes de p35 y p40 hay un elemento que es un sitio
interno de entrada de ribosomas (IRES) clonado a partir del virus de
la encefalomiocarditis. El elemento IRES es una región no
codificadora que funciona como punto interno de entrada para el
inicio o la continuación de la traducción por ribosomas
eucarióticos.
El pWRG3169 y el pWRG3196 dirigen ambos la
expresión de mIL-12. Desde un punto de vista
molecular, sin embargo, el vector con un IRES bicistrónico
(pWRG3196) produce un único ARNm, mientras que el vector tándem
(pWRG3169) produce un ARNm separado para p35 y p40. En los estudios
de expresión génica, los presentes inventores descubrieron que
pWRG3169 inducía al menos el doble de expresión que el pWRG3196
bicistrónico, in vivo e in vitro. Por ejemplo, cuando
los vectores pWRG3169 y pWRG3196 fueron transfectados separadamente
a células tumorales B16 in vitro, o a piel murina in
vivo, se observaron niveles de expresión de la proteína
mIL-12 de 3-8 veces más elevados
cuando se transfectó el vector pWRG3169. Se observaron niveles de
expresión todavía menores cuando se transfectaron dos vectores
separados, codificando cada uno de ellos una de las proteínas
subunidad de mIL-12.
Y lo que es más importante, se detectó citoquina
IL-12 biológicamente activa localmente después de la
transferencia a células de melanoma murino B16 y después del
bombardeo de la piel utilizando un instrumento de aceleración de
partículas. Cuando se administraron 1,25 \mug de ADN de pWRG3169
mediante aceleración de partículas a 1 x 10^{6} células B16, se
detectaron 49,8 \pm 10,2 ng/ml después de 24 horas. Veinticuatro
horas después de que la piel fue bombardeada cuatro veces con un
total de 5 \mug de ADN de pWRG3169, se detectaron 266 \pm 27,8
pg de IL-12 por 0,172 \pm 0,026 g de tejido en una
biopsia de piel estándar de 1,5 x 1,5 cm^{2} de espesor total que
contenía cuatro sitios tratados. El nivel de IL-12
fue determinado empleando un ensayo de proliferación celular
utilizando esplenocitos murinos activados con Con-A
según está descrito por Schoenhaut y col., J. Immunol. 148:
3433 (1992).
Se prevé que puedan crearse construcciones de
vectores competentes para la expresión similares que incluyan p35
humano y p40 humano (la secuencia de los cuales se proporciona en la
presente) para utilización en estudios clínicos de terapia génica
del cáncer. Además, los futuros vectores incluirán Intrón A y
posiblemente un elemento episómico tal como EBNA-1
del virus de Epstein-Barr.
La línea celular tumoral de adenocarcinoma renal
(Renca) y la línea celular tumoral de fibrosarcoma inducido por
metilcolantreno (MethA), son singénicas en ratones Balb/c. El
linfoma L5178Y y el mastocitoma P815 son singénicos en ratones
DBA/2. El sarcoma SA-1 y el melanoma B16 son
singénicos en A/Sn y C57Bl/6, respectivamente. Las líneas celulares
tumorales fueron mantenidas in vitro bajo condiciones
establecidas.
Para inducir la formación de tumores, ratones
receptores adecuados fueron afeitados en su área abdominal y fueron
inyectados con 1 x 10^{6} células tumorales en 50 \mul de PBS
intradérmicamente (exceptuando que se administraron 10^{5}
células B16). El crecimiento tumoral fue monitorizado
2-3 veces por semana midiendo dos diámetros
perpendiculares del tumor utilizando un calibre.
Los experimentos utilizaron un dispositivo de
aceleración de partículas con un pulso de helio del tipo descrito
en la Solicitud PCT publicada número PCT/US95/00780 (Publicación
Número WO 95/19799).
El ADN plasmídico fue precipitado sobre
partículas de oro de 2 micras utilizando PEG/CaCl_{2} o
espermidina/CaCl_{2}. Las partículas fueron suspendidas en una
solución de 0,1 mg/ml de polivinilpirrolidona en etanol absoluto.
Esta preparación de ADN/partículas de oro fue revestida sobre la
superficie interna de un tubo Tefzel según está descrito en la
Publicación Nº WO 95/19799. El tubo fue cortado posteriormente en
cartuchos de 0,5 pulgadas de longitud, para conseguir la
administración de 0,5 mg de oro y 1,25 \mug de ADN plasmídico por
bombardeo con un único cartucho.
Las partículas revestidas con ADN depositadas
fueron recogidas de los cartuchos y administradas a la epidermis
del ratón bajo la fuerza de un pulso de helio de 300 psi. El examen
histológico y los análisis inmunohistoquímicos estándar utilizando
un anticuerpo monoclonal anti-IL-12,
demostraron que bajo esta fuerza las partículas de oro penetraban
principalmente en las capas de células epidérmicas del tejido
cutáneo del ratón, pero no penetraban en las células tumorales
subyacentes y, de igual modo, que la mIL-12
transgénica se expresaba solamente en las capas de células
epidérmicas.
En cada punto de tiempo de la transfección, los
ratones individuales recibieron cuatro bombardeos con la
construcción genética de ADN de mIL-12 o con ADN
control (pCMVLuc; Cheng y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90: 4455 (1993)). Un bombardeo fue directamente sobre el tumor y
tres bombardeos adicionales estaban separados uniformemente
alrededor de la circunferencia del tumor en un patrón
triangular.
Ratones Balb/c fueron inoculados según se
describió anteriormente con 1 x 10^{6} células de las líneas
tumorales Renca o MethA. Al tiempo indicado después de la
inoculación, los sitios de inyección de los tumores fueron
bombardeados una vez al día durante 3-5 días con
pWRG3196, con pWRG3169 o con el plásmido control pCMVLuc, comenzando
el día 7 del crecimiento del tumor (en el primer experimento, el
bombardeo comenzó los días 1, 4 ó 7 del crecimiento del tumor).
Los resultados de cuatro experimentos
preliminares están presentados en la Tabla 1. En el primer
experimento, 3 de 7 (42%), 3 de 6 (50%) y 5 de 7 (71%) ratones
tratados los días 1-5, 4-8 y
7-11, respectivamente, rechazaron completamente sus
tumores, mientras que todos los ratones control (no tratados) fueron
sacrificados hacia el día 18 debido a un crecimiento tumoral
progresivo. El patrón de crecimiento tumoral en los ratones tratados
con el gen de IL-12 y en los ratones control está
presentado en la Figura 3.
Puede observarse que la regresión comenzó varios
días después de finalizar el tratamiento, sugiriendo que el efecto
antitumoral está mediado inmunológicamente. Además, es importante
observar que en éste y en otros experimentos, el bombardeo in
situ con el plásmido que codifica mIL-12 produjo
la regresión de tumores murinos sólidos establecidos
(5-10 mm de diámetro).
En el segundo experimento, el tratamiento con
mIL-12 produjo una rápida regresión de los tumores
en todos los ratones. Sin embargo, debido al fuerte bombardeo de la
piel, un 28% de los ratones transfectados con el gen control
rechazaron también sus tumores. Con el fin de eliminar este efecto
no específico y antitumoral, se redujo la duración del tratamiento
a tres bombardeos en días alternos.
De hecho, en el tercer experimento todos los
tumores bombardeados con el gen control crecieron progresivamente,
mientras que el 62% de los ratones bombardeados con la construcción
genética de mIL-12 rechazaron sus tumores.
En el experimento 4, se utilizó el sarcoma MethA
en lugar del tumor Renca y mostró una sensibilidad elevada similar
al tratamiento con el gen de IL-12.
\vskip1.000000\baselineskip
| Experimento | Tumor | Tratamiento/días | Nº de ratones sin | Rechazo (%) |
| tumor/total | ||||
| 1 | Renca | Ninguno | 0/7 | 0 |
| pIL-12^{a}/1-5 | 3/7 | 42 | ||
| pIL-12^{a}/4-8 | 3/6 | 50 | ||
| pIL-12^{a}/7-11 | 5/7 | 71 | ||
| 2 | Renca | pCMVLUC/7-11 | 2/7 | 28 |
| pIL-12^{b}/7-11 | 7/7 | 100 | ||
| 3 | Renca | pCMVLUC/7,9,11 | 0/8 | 0 |
| pIL-12^{b}/7,9,11 | 5/8 | 62 | ||
| 4 | MethA | pCMVLUC/7,8,10,11 | 1/8 | 12 |
| pIL-12^{b}/7,8,10,11 | 6/8 | 75 | ||
| a - pWRG3196 (IRES); b - pWRG3169 (Tándem) |
\vskip1.000000\baselineskip
Los presentes inventores utilizaron también el
método de tratamiento con IL-12 de la presente
invención con otros tumores murinos, según se describe a
continuación. En todos los casos, se observó una reducción del
crecimiento tumoral después de la transfección del gen de
mIL-12.
Se sabe que ciertos tumores inmunogénicos
murinos pueden inducir una respuesta inmune mediada por células T
que se detecta muy bien los días 7-9 del crecimiento
tumoral en modelos tumorales definidos (17). Por tanto, los
tratamientos con ADNc de mIL-12 comenzaron a los 7
días después de la implantación de las células tumorales, con el fin
de incrementar la respuesta inmune antitumoral endógena ya activada.
Utilizando esta estrategia experimental, la administración in
vivo de los genes de IL-12 quiméricos en los
tejidos cutáneos que recubrían tumores de 7 días establecidos, tuvo
como resultado la regresión completa del tumor o la supresión del
crecimiento del tumor en 4 modelos tumorales. En ratones adecuados
portadores de tumores Renca, L5178Y, MethA o Sa-1,
se consiguió una regresión completa del tumor en el 87,5% (7/8), en
el 87,5% (7/8), en el 57% (4/7) y en el 37,5% (3/8) de los ratones
del ensayo, respectivamente. Se consiguieron resultados casi
idénticos con tumores Renca después de un único tratamiento con ADNc
de IL-12 el día 7. El efecto de la terapia con el
gen de mIL-12 sobre el crecimiento tumoral en estos
4 modelos tumorales está mostrado en la Fig. 4.
Además, en los ratones portadores de mastocitoma
P815 o de melanoma B16, se consiguió una supresión significativa
del crecimiento tumoral (Fig. 4). Por ejemplo, el día 13 después de
la implantación de las células tumorales P815, el diámetro medio del
tumor en los ratones tratados con pWRG3169 era de 8,89 \pm 0,27,
en comparación con 12,28 \pm 0,46 mm para el gen control pCMVLuc
en el mismo plásmido de expresión (p<0,001). De igual modo, el
día 15 después de la implantación de las células tumorales B16, el
diámetro del tumor en los ratones tratados con pWRG3169 era de 6,30
\pm 0,045 en comparación con 11,8 \pm 0,31 mm para el plásmido
con el gen control pCMVLuc (p<0,001). Para estos dos sistemas de
tumores débilmente inmunogénicos, no está claro si los regímenes o
pautas de transferencia de genes modificados pueden mejorar la
terapia y tener como resultado la regresión del tumor, y esto
justifica aparentemente evaluaciones sistemáticas en futuros
estudios.
Los experimentos de terapia con el gen de
mIL-12 fueron repetidos 5 veces con el sistema
tumoral Renca, 4 veces con los tumores MethA y P815, 3 veces con el
tumor B16 y una vez con el modelo tumoral L5178Y, y se obtuvieron
resultados similares. En cada tratamiento, los ratones recibieron
cuatro transfecciones con ADN de IL-12 (círculos) o
con ADN de pCMVLuc (cuadrados). Las flechas de las Figs.
4A-4F indican los días después de la implantación
del tumor en los cuales se llevó a cabo el tratamiento. Cada grupo
contenía 7-8 ratones, excepto el modelo tumoral B16
que contenía 12 ratones por grupo.
Es importante señalar que para todos los modelos
tumorales de ratón analizados, los tumores estaban ya bien
establecidos al comienzo de la terapia, y habían alcanzado
5-8 mm de diámetro. Hasta lo que sabemos, ésta es
la primera prueba de que la terapia con el gen de
IL-12 puede producir una regresión completa de
tumores establecidos, grandes. Estudios previos han demostrado que
la terapia con el gen de IL-12 utilizando vectores
retrovíricos tuvo como resultado la prevención del desarrollo
tumoral o la regresión de pequeños sarcomas MCA207 de 3 días en el
33% de los ratones tratados. Es también digno de señalar que
solamente 1-4 días de terapia (utilizando 4
bombardeos por sitio tumoral cada día de terapia) tuvieron como
resultado la regresión del tumor o la supresión del crecimiento del
tumor en virtualmente todos nuestros experimentos.
En estudios previos en los que se empleó terapia
con proteínas recombinantes, la regresión tumoral requirió
inyecciones diarias de IL-12 a dosis de 0,1 a 10
\mug durante 1 semana, o durante 5 días por semana durante 4
semanas. Junto con nuestros hallazgos previos utilizando otros genes
de citoquinas, los resultados presentados en las Figs. 1, 2
sugieren que la producción de IL-12 transgénica por
células epidérmicas normales en la proximidad del tumor puede ser
responsable del efecto antitumoral de la terapia con el gen de
IL-12.
La regresión tumoral observada dependía de la
presencia de células CD8^{+}. La disminución in vivo de
células T CD8^{+}, pero no la disminución de células T CD4^{+},
suprimía el efecto de la terapia con el gen de
mIL-12. Para demostrar esto, ratones Balb/c fueron
inyectados intradérmicamente con 1 x 10^{6} células Renca. La piel
fue transfectada con vectores de expresión que contenían ADNc de
IL-12 o de pCMVLuc los días 7, 9 y 11 después de la
implantación del tumor. Se administraron intraperitonealmente el mAb
anti-CD4 (clon GK1.5) o el mAb
anti-CD8 (clon 2.43), obtenidos ambos del Trudeau
Institute, Saranac Lake, NY, los días 8 (300 \mug/ratón) y 12 (150
\mug/ratón) después de la implantación del tumor. Los grupos
control incluían ratones que fueron tratados con el gen de
IL-12 y recibieron IgG de rata (Sigma) a las mismas
dosis y pautas que los mAb anti-CD8 y
anti-CD4, o ratones tratados con el gen de pCMVLuc
en lugar de con el gen de IL-12. Los mAb
anti-CD4 y anti-CD8 utilizados en
este estudio produjeron la disminución de más del 90% de subgrupos
de células T relevantes en los ratones durante 4-5
días después de una única inyección. La masa tumoral de 8 ratones
por grupo continuó aumentando cuando se eliminaron las células T
CD8^{+}, pero se observó una regresión o una eliminación del
tumor cuando se eliminaron las células T CD4^{+} o cuando se
inyectó IgG de rata. Estos datos están de acuerdo con los hallazgos
de Brunda y col., J. Exp. Med. 178(4):
123-30 (1993), de que la regresión tumoral causada
por IL-12 recombinante está mediada por células T
CD8^{+}, pero no por células T CD4^{+}. De hecho, la disminución
de células T CD4^{+} con el anticuerpo monoclonal (mAb)
anti-CD4 parecía tener como resultado una regresión
del tumor ligeramente acelerada, implicando que las células T
CD4^{+} pueden suprimir el efecto antitumoral de
IL-12 en este modelo de tumor. En efecto, se ha
demostrado que tumores establecidos inducen células T supresoras
CD4^{+} similares a Th2, las cuales pueden inhibir las respuestas
inmunes mediadas por células T CD8^{+}. El efecto beneficioso del
tratamiento con mAb anti-CD4 en inmunoterapia
tumoral con la proteína IL-12 recombinante o con el
gen de IL-12, ha sido descrito previamente. Datos
secundarios muestran que la proteína IL-12 puede
activar células T CD8^{+} específicas del tumor in vitro y
mediar un efecto antisupresor en células T CD4^{+} Th2 in
vivo.
La observación de que la regresión del tumor
causada por la terapia local con el gen de IL-12
requiere células T CD8^{+}, sugiere que la administración local
del gen de IL-12 podría tener como resultado un
efecto antitumoral sistémico. Esta hipótesis fue analizada
utilizando el sistema tumoral P815, en el que las células tumorales
metastatizan en los órganos viscerales varios días después de la
implantación intradérmica, produciendo de este modo la muerte de los
ratones incluso cuando el tumor primario ha sido extraído
quirúrgicamente.
Ratones DBA/2 fueron inyectados
intradérmicamente con 1 x 10^{6} células P815. Los tejidos
cutáneos que cubrían y rodeaban al tumor diana fueron tratados con
pWRG3169 administrado mediante aceleración de partículas (8
ratones/grupo) o con pCMVLuc (5 ratones/grupo) los días 12 y 14
después de la implantación de las células tumorales. La escisión
quirúrgica del tumor se realizó el día 15, cuando el tamaño del
tumor había alcanzado 13 mm de diámetro aproximadamente. Se
realizaron transfecciones adicionales en la piel, a ambos lados del
abdomen, de las construcciones control y de ensayo los días 16, 18 y
20 después de la implantación.
Todos los ratones tratados con pCMVLuc murieron
en 28,0 \pm 0,6 días después de la implantación de las células
tumorales. El examen macroscópico reveló que la muerte fue causada
por metástasis espontáneas de las células tumorales en los órganos
internos, principalmente en el hígado. La terapia con el gen
mIL-12 prolongó eficazmente la supervivencia de los
ratones (tiempo de supervivencia 41,4 \pm 4,9 días, p<0,05) y 1
de 8 ratones fue "curado".
Este experimento fue repetido sin las
transfecciones adicionales después de la escisión del tumor y mostró
que todos los ratones tratados con el ADNc de Luc (n=11) murieron en
43,9 \pm 7,1 días, mientras que 5 de 12 (41,6%) ratones tratados
con la terapia del gen de IL-12 sobrevivieron
durante al menos 180 días y por tanto fueron considerados
"curados". Estos resultados sugieren que la administración
local de IL-12 en los tejidos cutáneos que cubren y
rodean al tumor primario, puede aumentar la respuesta inmune
antitumoral sistémica y dar lugar a la erradicación de metástasis
espontáneas establecidas.
Ratones Balb/c fueron inyectados
intradérmicamente con 10^{6} células Renca, en el lado izquierdo y
en el lado derecho del abdomen. Los tumores del lado derecho fueron
bombardeados con pWRG3169 o con pCMVLuc los días 5, 7 y 9 del
crecimiento tumoral. La terapia con el gen de IL-12
tuvo como resultado una reducción significativa del crecimiento en
el tumor no tratado (izquierda) en comparación con el crecimiento de
los tumores no tratados en los ratones control (diámetro del tumor
el día 22: 9,58 \pm 1,82 y 13,18 \pm 2,03, respectivamente; n=8
ratones/grupo, p<0,005). Se realizó un experimento similar en el
cual los tumores L5178Y del lado derecho del abdomen fueron
bombardeados con pWRG3169 o con pCMVLuc los días 3 y 6 del
crecimiento tumoral. En este marco experimental, la terapia con el
gen de IL-12 tuvo como resultado una completa
regresión tumoral de los tumores tratados (derecha) así como de los
no tratados (izquierda) en todos los ratones (n=8). Un experimento
adicional ha demostrado que el bombardeo de la piel con el gen de
IL-12, lejos de la región del tumor, no afecta al
crecimiento tumoral. Estos resultados sugieren que la activación
local de células inmunes en el lugar del tumor durante la terapia
con el gen de IL-12 genera inmunidad antitumoral
sistémica.
A. Rechazo de un desafío tumoral secundario
después de la terapia con el gen de IL-12. Los
ratones Balb/c que rechazaron los tumores Renca o MethA después de
la terapia con el gen de IL-12 fueron inyectados un
mes más tarde con 1 x 10^{6} células Renca y células MethA en el
lado derecho e izquierdo del abdomen, respectivamente. Como
control, las células tumorales fueron inyectadas en ratones Balb/c
nuevos de la misma edad sin tratar (5-8 ratones por
grupo).
Los ratones que rechazaron los tumores
intradérmicos Renca (Grupo A) o MethA (Grupo B) después de la
terapia con el gen de IL-12, o los ratones control
sin tratar, fueron inyectados en el lado derecho del abdomen con
células Renca y en el lado izquierdo del abdomen con células MethA.
Mientras que todos los ratones control desarrollaron ambos tumores,
los ratones del Grupo A desarrollaron tumores MethA pero no tumores
Renca, y viceversa, esto es, los ratones del Grupo B
desarrollaron tumores Renca pero no tumores MethA.
B. Inducción de actividad CTL en los ratones
que rechazaron los tumores después de la terapia con el gen de
IL-12. Se generaron CTL específicos del tumor
in vitro según está descrito por Rakhmilevich y col., Int.
J. Cancer 55: 338 (1993). Células de bazo (5 x 10^{6}),
derivadas de ratones Balb/c que habían rechazado los tumores Renca
debido a la terapia con el gen de IL-12 y que habían
permanecido sin tumores durante dos meses, o de ratones nuevos sin
tratar de la misma edad, fueron cocultivadas con 5 x 10^{4}
células Renca tratadas con mitomicina C en placas de cultivo de 24
pocillos en medio RPMI-1640 completo. Después del
cultivo durante 5 días in vitro, un número graduado de
células efectoras viables y de células Renca marcadas con ^{51}Cr
(10^{4}) fueron colocadas en los pocillos de placas de 96 pocillos
de fondo redondo. Después de incubar durante 4 horas a 37ºC, se
determinó la radiactividad de los sobrenadantes. Media \pm SEM de
4 ratones por grupo. Las células esplénicas de los ratones tratados
con el gen de IL-12 generaron niveles de actividad
CTL 3-4 veces mayores que las células esplénicas
procedentes de los ratones nuevos sin tratar (p<0,005). Estos
resultados indican que la terapia con el gen de
IL-12 genera una inmunidad antitumoral
sistémica.
En un estudio similar, utilizando células
esplénicas de ratones que habían rechazado previamente los tumores
L5178Y, los CTL generados fueron capaces de lisar las células L5178Y
pero no las células P815 singénicas.
En resumen, los resultados indican que la
terapia con el gen de IL-12 utilizando un
instrumento de transferencia de genes mediada por partículas, es
eficaz contra varios tumores murinos y puede ser aplicada como
tratamiento de tumores inmunogénicos humanos. Además, los hallazgos
indican que el ADN de IL-12 es administrado a la
piel, pero no al tejido tumoral, después del bombardeo in
vivo. Por tanto, la terapia con el gen de IL-12
mediada por partículas puede ser aplicada rutinariamente a tumores
subcutáneos o a nódulos metastásicos sin manipulaciones
quirúrgicas.
Además, los inventores encontraron 250 pg
aproximadamente de IL-12 en el lugar de bombardeo
del tumor, que representan de 1/400 a 1/40.000 aproximadamente de la
"dosis terapéutica" de la IL-12 recombinante
(0,1-10 \mug). Además, se sabe también que la
dosis terapéutica de IL-12 produce niveles de
toxicidad inaceptables. Por tanto, en comparación con el
tratamiento con IL-12 recombinante, el tratamiento
mediante terapia con el gen de IL-12 de la presente
invención es mucho menos tóxico (si es que es tóxico) y mucho menos
caro.
Por tanto, se demuestra que pueden crearse in
vivo niveles circulantes de la citoquina IL-12
mediante la administración a un paciente con necesidad de
tratamiento de un tumor, no de cantidades de la propia
IL-12 sino más bien mediante la administración al
paciente de secuencias génicas que producen la expresión de
IL-12 en células del individuo tratado. El método de
terapia génica de la presente invención permite la creación de una
respuesta antitumoral en un individuo tratado sin administrar la
proteína IL-12 al individuo.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Rakhmilevich, Alexander
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Terapia de Tumores con el Gen de la IL-12
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Robins & Associates
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 90 Middlefield Road, Suite 200
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Menlo Park
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 94025
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1,30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL REPRESENTANTE/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: McCracken, Thomas P.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 38.548
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 7011-0023.40
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 415-325-7812
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 415-325-7823
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7287 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN Plasmídico"
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- CLON: pWRG3169
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: promotor
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..628
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: ADNi
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 629..810
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: unión (953..1258, 1332..1673)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "producto génico de p35"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio_poliA
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1797..2024
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: promotor
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2110..2737
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: ADNi
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2738..2919
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2983..3990
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "producto génico de p40"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio_poliA
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 4075..4306
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 216 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 336 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6295 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "plásmido pWRG3196"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: unión (955..1260, 1334..1675)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "producto génico de p35"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2377..3384
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "producto génico de p40"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 216 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 336 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (10)
1. Utilización de una construcción plasmídica
que comprende:
- una secuencia de ADN que codifica una
subunidad p35 de la citoquina IL-12 y que está bajo
el control de un promotor operativo en las células diana a las que
se va a administrar la construcción y
- una secuencia de ADN que codifica una
subunidad p40 de la citoquina IL-12 y que está bajo
el control de un promotor separado que es también operativo en las
células diana a las que se va a administrar la construcción,
en la producción de un medicamento para el
tratamiento de tumores en un mamífero mediante la administración de
copias de la construcción a células diana epidérmicas o mucosales
del mamífero in vivo.
2. Utilización de acuerdo con la Reivindicación
1, en la que las copias de la construcción plasmídica están
revestidas sobre partículas transportadoras.
3. Utilización de acuerdo con la Reivindicación
1 ó 2, en la que la secuencia de ADN de la subunidad p35 codifica la
proteína de SEC ID Nº: 2 y la secuencia de ADN de p40 codifica la
proteína de SEC ID Nº: 3.
4. Utilización de acuerdo con la Reivindicación
1 ó 2, en la que la secuencia de ADN que codifica la subunidad p35
es la SEC ID Nº: 1 en las bases 953-1258 y
1332-1673, y la secuencia de ADN que codifica la
subunidad p40 es la SEC ID Nº: 1 en las bases
2983-3990.
5. Utilización de acuerdo con la Reivindicación
1 ó 2, en la que la secuencia de ADN que codifica la subunidad p35
es sustancialmente homóloga a la SEC ID Nº: 1 en las bases
953-1258 y 1332-1673, y la secuencia
de ADN que codifica la subunidad p40 es sustancialmente homóloga a
la SEC ID Nº: 1 en las bases 2983-3990.
6. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que cada promotor es un promotor
de citomegalovirus.
7. Una construcción plasmídica adecuada para ser
utilizada en el tratamiento de tumores de un mamífero mediante la
administración de copias de la construcción a células diana
epidérmicas o mucosales del mamífero in vivo, construcción
que comprende:
- una secuencia de ADN que codifica una
subunidad p35 de la citoquina IL-12 y que está bajo
el control de un promotor operativo en las células diana a las que
se va a administrar la construcción y
- una secuencia de ADN que codifica una
subunidad p40 de la citoquina IL-12 y que está bajo
el control de un promotor separado que es también operativo en las
células diana a las que se va a administrar la construcción.
8. Una construcción de acuerdo con la
Reivindicación 7, en la que dichas secuencias de ADN son como las
definidas en cualquiera de las Reivindicaciones 3 a 5.
9. Una construcción de acuerdo con la
Reivindicación 7 u 8, en la que los promotores son promotores de
citomegalovirus.
10. Un dispositivo para transferencia de genes
con partículas aceleradas cargado con partículas transportadoras
revestidas con copias de una construcción como la definida en
cualquiera de las Reivindicaciones 7 a 9.
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