WO2017170338A1 - 免疫誘導剤 - Google Patents

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amino acid
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貴之 藤田
文義 岡野
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東レ株式会社
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins

Definitions

  • the present invention relates to a novel immunity-inducing agent useful as an agent for treating and / or preventing cancer.
  • Cancer is a disease that occupies the top cause of all deaths, and the current treatment is a combination of radiation therapy and chemotherapy, mainly surgery. Despite the recent development of new surgical methods and the discovery of new anti-cancer drugs, the therapeutic results of cancer have not improved much except for some cancers. In recent years, advances in molecular biology and cancer immunology have identified cancer antigens recognized by cytotoxic T cells that respond to cancer, genes encoding cancer antigens, etc., and expectations for antigen-specific immunotherapy It is growing.
  • MRAP2 Melanocortin 2 receptor accessory protein 2
  • MCR melanocortin receptor
  • An object of the present invention is to find a novel polypeptide useful as an agent for treating and / or preventing cancer, and to provide use of the polypeptide as an immunity-inducing agent.
  • a cDNA encoding a protein that binds to an antibody present in serum derived from a cancer-bearing organism by the SEREX method using a canine testis-derived cDNA library and the serum of a dog with leukemia.
  • a canine Melanocortin 2 receptor accessor protein 2 hereinafter referred to as MRAP2
  • MRAP2 canine Melanocortin 2 receptor accessor protein 2
  • MRAP2 polypeptides are expressed in leukemia, malignant lymphoma, lung cancer, brain tumor, colon cancer, melanoma, neuroblastoma, pancreatic cancer, gastric cancer, liver cancer, ovarian cancer, esophageal cancer, renal cancer, mastocytoma, and perianal adenocarcinoma I found out. Furthermore, it has been found that by administering these MRAP2s to a living body, immune cells against MRAP2 can be induced in vivo, and tumors in vivo that express MRAP2 can be regressed. Furthermore, it has been found that a recombinant vector capable of expressing a polynucleotide encoding MRAP2 polypeptide or a fragment thereof induces an antitumor effect in vivo against cancer expressing MRAP2.
  • the MRAP2 polypeptide is capable of being presented by antigen-presenting cells to activate and proliferate cytotoxic T cells specific for the polypeptide (also referred to as “immunity-inducing activity”). Therefore, the polypeptide is useful for the treatment and / or prevention of cancer, and the antigen-presenting cells in contact with the polypeptide and the T cells in contact with the antigen-presenting cells are used for the treatment and / or prevention of cancer. It was found useful and the present invention was completed.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a immunity-inducing agent comprising a recombinant vector capable of expressing sac as an active ingredient.
  • the immunity-inducing agent according to (1) which is a treatment agent.
  • the immunity-inducing agent according to (1) which is an active ingredient of an agent for treating and / or preventing cancer.
  • the cancer is leukemia, malignant lymphoma, lung cancer, brain tumor, colon cancer, melanoma, neuroblastoma, pancreatic cancer, gastric cancer, liver cancer, ovarian cancer, esophageal cancer, renal cancer, mastocytoma or perianal adenocarcinoma, The immunity-inducing agent according to (3) or (4).
  • the immunopotentiator is Freund's incomplete adjuvant, Montanide, poly IC and derivatives thereof, CpG oligonucleotide, interleukin 12, interleukin 18, interferon ⁇ , interferon ⁇ , interferon ⁇ , interferon ⁇ , and Flt3 ligand
  • the immunity-inducing agent according to (6) which is at least one selected from the group consisting of: (8) A method for producing an antigen-presenting cell comprising a complex of the polypeptide and an MHC molecule, which comprises contacting the polypeptide defined in (1) with an antigen-presenting cell derived from a subject ex vivo or in vitro. .
  • the method according to (8), wherein the antigen-presenting cells are dendritic cells or B cells carrying MHC class I molecules.
  • It comprises contacting an antigen-presenting cell obtained by the method according to (8) or (9) and a T cell derived from a subject ex vivo or in vitro to activate the T cell (1 A method for producing cytotoxic T cells specific for the polypeptide defined in 1).
  • (11) at least one polypeptide selected from the following polypeptides (a) to (d) and having immunity-inducing activity, or a polynucleotide encoding the polypeptide, and the polypeptide in vivo:
  • a method for inducing immunity comprising administering a recombinant vector capable of expressing the gene to a subject.
  • the present invention provides a novel immunity-inducing agent useful for cancer treatment and / or prevention.
  • a novel immunity-inducing agent useful for cancer treatment and / or prevention.
  • the polypeptide used in the present invention when administered to a subject, immune cells can be induced in vivo, and further, cancer that has already occurred is reduced or regressed. Can be made. Therefore, the polypeptide is useful for treating or preventing cancer.
  • Reference number 1 shows the expression pattern of the canine MRAP2 gene in each tumor tissue shown in the figure. It is a figure which shows the expression pattern of the identified MRAP2 gene in each human tissue and cancer cell line.
  • Reference number 2 shows the expression pattern of human MRAP2 gene in each of the normal human tissues shown in the figure.
  • Reference number 3 shows the expression pattern of the human MRAP2 gene in each of the illustrated human cancer cell lines is shown.
  • PBMC indicates peripheral blood mononuclear cells. It is a figure which shows the expression pattern in mouse
  • Reference number 4 shows the expression pattern of mouse MRAP2 gene in each mouse cancer cell line shown.
  • polypeptides examples of the polypeptide contained as an active ingredient in the immunity-inducing agent of the present invention include the following polypeptides (a) to (d).
  • polypeptide refers to a molecule formed by peptide bonding of a plurality of amino acids, and not only a polypeptide molecule having a large number of amino acids but also a low molecular weight molecule having a small number of amino acids. (Oligopeptides) and full-length proteins are also included.
  • A a polypeptide having an immunity-inducing activity (b) consisting of 7 or more consecutive amino acids in the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8 in the sequence listing and not more than the full length )
  • c A polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8 in the sequence listing and having immunity-inducing activity (d) ) To (c) as a partial sequence, and a polypeptide having immunity-inducing activity
  • “having an amino acid sequence” means that amino acid residues are arranged in such an order.
  • “polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8” means Met, Glu, Met, Ser, Ala,... (Omitted), Ile, Asp, Leu, Asp shown in SEQ ID NO: 8.
  • “polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8” may be abbreviated as “polypeptide of SEQ ID NO: 8”. The same applies to the expression “having a base sequence”. In this case, the term “comprising” may be replaced by the expression “consisting of”.
  • immuno-inducing activity means the ability to induce immune cells that secrete cytokines such as interferon in vivo.
  • Whether or not the above polypeptide has immunity-inducing activity can be confirmed using, for example, a known Elispot assay. Specifically, cells such as peripheral blood mononuclear cells are obtained from a living body administered with a polypeptide whose immunity-inducing activity is to be evaluated, the cells are co-cultured with the polypeptide, and the amount of cytokine production from the cells is determined. Since the number of immune cells in the cells can be measured by measuring using a specific antibody, the immunity-inducing activity can be evaluated thereby.
  • Elispot assay Specifically, cells such as peripheral blood mononuclear cells are obtained from a living body administered with a polypeptide whose immunity-inducing activity is to be evaluated, the cells are co-cultured with the polypeptide, and the amount of cytokine production from the cells is determined. Since the number of immune cells in the cells can be measured by measuring using a specific antibody, the immunity-inducing activity can be evaluated thereby.
  • the tumor when the recombinant polypeptides (a) to (d) above are administered to a cancer-bearing organism, the tumor can be regressed due to its immunity-inducing activity. Therefore, the immunity-inducing activity can also be evaluated as the ability to suppress the growth of cancer cells or to reduce or eliminate cancer tissue (tumor) (hereinafter referred to as “anti-tumor activity”).
  • anti-tumor activity The antitumor activity of a polypeptide is confirmed by, for example, examining whether the tumor is actually reduced by administering the polypeptide to a cancer-bearing living body, as specifically described in the examples below. can do.
  • cytotoxic T cells induced by administering the polypeptide to a cancer-bearing organism exhibit cytotoxic activity against the tumor. It can. Measurement of the cytotoxic activity of T cells in vivo can be confirmed, for example, by examining whether or not the tumor is increased by administering an antibody that removes T cells from the body, but is not limited thereto. Not.
  • T cells stimulated with the polypeptide that is, T cells brought into contact with antigen-presenting cells presenting the polypeptide
  • the antitumor activity of the polypeptide can also be evaluated.
  • the T cell and the antigen-presenting cell can be contacted by co-culturing both in a liquid medium.
  • the cytotoxic activity can be measured by a known method called a 51 Cr release assay described in, for example, Int. J. Cancer, 58: p317,1994.
  • the polypeptide is used for cancer treatment and / or prevention, it is not particularly limited, but it is preferable to evaluate immunity induction activity using antitumor activity as an index.
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8 in the sequence listing disclosed by the present invention are derived from cancer-bearing dogs by the SEREX method using a dog testis-derived cDNA library and the serum of cancer-bearing dogs. It is the amino acid sequence of MRAP2 isolated as a polypeptide that binds to an antibody specifically present in serum and its human, cat, and mouse homologous factors (see Example 1).
  • human MRAP2 which is a human homologous factor of canine MRAP2
  • sequence identity is 91% base sequence and 94% amino acid sequence
  • cat feline MRAP2 which is a feline homologous factor
  • sequence identity is 95% base sequence and 96% amino acid sequence.
  • sequence identity is 84% nucleotide sequence and 88% amino acid sequence.
  • the polypeptide of (a) above is composed of 7 or more, preferably 8, 9 or 10 or more consecutive amino acids in the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8.
  • a polypeptide having immunity-inducing activity is particularly preferably, the polypeptide has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8.
  • a polypeptide having about 7 amino acid residues or more can exhibit antigenicity and immunogenicity.
  • immunity induction activity Can be used for the preparation of the immunity-inducing agent of the present invention.
  • the polypeptide is taken up by antigen-presenting cells and then decomposed by peptidase in the cells to become smaller fragments and presented on the surface of the cells. It is known that cytotoxic T cells and the like recognize this and selectively kill cells presenting the antigen.
  • the size of the polypeptide presented on the surface of the antigen-presenting cell is relatively small, and is about 7 to 30 amino acids. Therefore, from the viewpoint of presentation on antigen-presenting cells, the above-mentioned polypeptide (a) is about 7 to 30 continuous in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8. Is a preferred embodiment, and it is sufficient if it is composed of about 8 to 30 or 9 to 30 amino acids.
  • These relatively small polypeptides may be presented directly on the cell surface on antigen-presenting cells without being taken up into antigen-presenting cells.
  • Polypeptides taken up by antigen-presenting cells are cleaved at random positions by peptidases in the cells to generate various polypeptide fragments, and these polypeptide fragments are presented on the surface of antigen-presenting cells. Therefore, if a polypeptide having a large size such as the full-length region of SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8 is administered, the polypeptide is effective for inducing immunity via antigen-presenting cells by degradation in the antigen-presenting cells. Fragments are inevitably produced.
  • a polypeptide having a large size can be preferably used for immunity induction via antigen-presenting cells, and the number of amino acids is 30 or more, more preferably 100 or more, more preferably 200 or more, and more preferably SEQ ID NOs: 2, 4 , 6 or 8 full length polypeptide.
  • the polypeptide (c) is a polypeptide in which a small number (preferably one or several) amino acid residues of the polypeptide (a) are substituted, deleted and / or inserted. It has 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more or 99.5% or more sequence identity with the original sequence, and immunity-inducing activity
  • a polypeptide having In general, a protein antigen may have almost the same antigenicity as the original protein even if a small number of amino acid residues in the amino acid sequence of the protein are substituted, deleted or inserted. It is well known to those skilled in the art.
  • the polypeptide (c) can also exert immunity-inducing activity, it can be used for the preparation of the immunity-inducing agent of the present invention.
  • the polypeptide (b) one to several amino acid residues are substituted, deleted and / or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8. Also preferred are polypeptides. “Several” in the present specification represents an integer of 2 to 10, preferably an integer of 2 to 6, and more preferably an integer of 2 to 4.
  • sequence identity of amino acid sequences or base sequences means that both amino acid sequences (or bases) so that the amino acid residues (or bases) of the two amino acid sequences (or base sequences) to be compared match as much as possible. Sequence) and the number of matched amino acid residues (or the number of matched bases) divided by the total number of amino acid residues (or the total number of bases) is expressed as a percentage. In the above alignment, a gap is appropriately inserted in one or both of the two sequences to be compared as necessary. Such alignment of sequences can be performed using a known algorithm such as BLAST, FASTA, or CLUSTALW.
  • the total number of amino acid residues is the number of residues obtained by counting one gap as one amino acid residue.
  • the sequence identity (%) is the total number of amino acid residues in the longer sequence, and the amino acid residues that match. Calculated by dividing the number.
  • the 20 kinds of amino acids constituting the natural protein are neutral amino acids having low polarity side chains (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), neutral amino acids having hydrophilic side chains (Asn). , Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (Arg, Lys, His), and aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp) It is known that the properties of a polypeptide often do not change if substitution is made between these groups. Therefore, when substituting an amino acid residue in the polypeptide of the above (a) of the present invention, substitution between these groups increases the possibility that the immunity-inducing activity can be maintained, which is preferable. .
  • the polypeptide (d) is a polypeptide having any of the polypeptides (a) to (c) as a partial sequence and having immunity-inducing activity. That is, it is a polypeptide having immunity-inducing activity, in which another amino acid or polypeptide is added to one or both ends of the polypeptide of any one of (a) to (c). Such a polypeptide can also be used for the preparation of the immunity-inducing agent of the present invention.
  • the polypeptide can be synthesized according to a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). Moreover, it can also synthesize
  • a polynucleotide encoding the above polypeptide is prepared, the polynucleotide is incorporated into an expression vector and introduced into a host cell, and the polypeptide is produced in the host cell. Thus, the desired polypeptide can be obtained.
  • the polynucleotide encoding the above polypeptide can be easily prepared by a known genetic engineering technique or a conventional method using a commercially available nucleic acid synthesizer.
  • DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 3 is subjected to PCR using a canine chromosomal DNA or cDNA library as a template and a pair of primers designed to amplify the base sequence described in SEQ ID NO: 3.
  • PCR reaction conditions can be set as appropriate. For example, one cycle of a reaction step consisting of 94 ° C.
  • the conditions include, but are not limited to, conditions of reacting at 72 ° C. for 7 minutes after 30 cycles.
  • appropriate probes and primers are prepared based on the nucleotide sequence and amino acid sequence information shown in SEQ ID Nos. 1 and 3 in the sequence listing in the present specification, and cDNA libraries such as humans and dogs are prepared using the probes and primers.
  • the desired DNA can be isolated by screening for.
  • the cDNA library is preferably prepared from cells, organs or tissues expressing the proteins of SEQ ID NOs: 2, 4.
  • nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the polypeptide of (b) to (d) above can be easily specified, such a polynucleotide can also be obtained by a conventional method using a commercially available nucleic acid synthesizer. It can be easily synthesized.
  • the host cell may be any cell that can express the polypeptide.
  • prokaryotic cells include Escherichia coli, and examples of eukaryotic cells include monkey kidney cells COS1, Chinese hamster ovary cells. Examples include, but are not limited to, cultured mammalian cells such as CHO, budding yeast, fission yeast, silkworm cells, and Xenopus egg cells.
  • an expression vector having an origin, a promoter, a ribosome binding site, a DNA cloning site, a terminator and the like that can replicate in the prokaryotic cell is used as the expression vector.
  • Examples of the expression vector for E. coli include pUC system, pBluescript II, pET expression system, pGEX expression system and the like.
  • an expression vector for a eukaryotic cell having a promoter, a splicing region, a poly (A) addition site and the like is used as an expression vector.
  • expression vectors include pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV vector, pRS, pcDNA3.1, pSecTag (A, B, C), pMSG, pYES2, etc. it can.
  • a DNA encoding the above polypeptide is incorporated into such an expression vector, and after transforming a eukaryotic host cell with the vector, the resulting transformant is cultured, and the DNA encodes. Can be expressed in eukaryotic host cells.
  • pIND / V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1, etc. are used as an expression vector, fusion with various tags such as His tag, FLAG tag, myc tag, HA tag, GFP
  • the polypeptide can be expressed as a protein.
  • a known method such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a liposome method, or a DEAE dextran method can be used.
  • Polypeptides obtained by the above methods include those in the form of fusion proteins with other arbitrary proteins as described above. Examples thereof include glutathione-S-transferase (GST) and a fusion protein with a His tag. Such a polypeptide in the form of a fusion protein is also included in the scope of the present invention as the polypeptide (d). Furthermore, the polypeptide expressed in the transformed cell may be subjected to various modifications in the cell after being translated. Such post-translationally modified polypeptides are also included in the scope of the present invention as long as they have immunity-inducing activity. Examples of such translational modifications include elimination of N-terminal methionine, N-terminal acetylation, sugar chain addition, limited degradation by intracellular protease, myristoylation, isoprenylation, phosphorylation and the like.
  • the immunity-inducing agent of the present invention can be used as a therapeutic and / or prophylactic agent for cancer.
  • the polypeptide having the above-described immunity-inducing activity can be used in a method for treating and / or preventing cancer by immunity induction.
  • the target cancer is not particularly limited as long as it is a cancer that expresses MRAP2, but is preferably a cancer that expresses MRAP2 significantly more than normal cells, specifically leukemia, malignant It is lymphoma, lung cancer, brain tumor, colon cancer, melanoma, neuroblastoma, pancreatic cancer, gastric cancer, liver cancer, ovarian cancer, esophageal cancer, renal cancer, mastocytoma or perianal adenocarcinoma.
  • These specific cancers include, for example, acute nonlymphocytic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, acute granulocytic leukemia, chronic granulocytic leukemia, acute promyelocytic leukemia, adult T cell leukemia, leukemic Leukemia, leukemia leukemia, basophil leukemia, blast leukemia, bovine leukemia, chronic myelocytic leukemia, skin leukemia, embryonal leukemia, eosinophilic leukemia, gross leukemia, leader Cellular leukemia, Schilling leukemia, stem cell leukemia, subleukemia leukemia, undifferentiated cell leukemia, hairy cell leukemia, hemoblastic leukemia, hemocytoblastic leukemia, tissue Sphere leukemia, stem cell leukemia, acute monocytic leukemia, white blood Decreased leukemia, lymphoid leukemia, lymphoblastic leukemia, lymphocytic leukemia,
  • the subject (animal) to be used is preferably a mammal, more preferably a mammal including a primate, a pet animal, an animal bred in a zoo, a domestic animal, a sport animal, and the like. Particularly preferred are humans, dogs and cats.
  • the administration route to the living body of the immunity-inducing agent of the present invention may be oral administration or parenteral administration, but parenteral administration such as intramuscular administration, subcutaneous administration, intravenous administration and intraarterial administration is preferred.
  • parenteral administration such as intramuscular administration, subcutaneous administration, intravenous administration and intraarterial administration is preferred.
  • the immunity-inducing agent When used for the purpose of treating cancer, it can be administered to regional lymph nodes in the vicinity of the tumor to be treated in order to enhance the anticancer effect.
  • the dose may be an amount effective for inducing immunity. For example, if it is used for the treatment and / or prevention of cancer, it may be an amount effective for the treatment and / or prevention of cancer.
  • the amount effective for the treatment and / or prevention of cancer is appropriately selected according to the size, symptoms, etc. of the tumor.
  • the effective amount per day for the subject animal is 0.0001 to 1000 ⁇ g, preferably 0.
  • the dose is 001 to 1000 ⁇ g and can be administered once or divided into several times. Preferably, it is divided into several times and administered every few days to several months.
  • the immunity-inducing agent of the present invention can regress tumors. Therefore, since anticancer activity can be exerted on a small number of cancer cells at the early stage of development, onset and recurrence of cancer can be prevented if used before onset of cancer or after treatment of cancer. That is, the immunity-inducing agent of the present invention is useful for both treatment and prevention of cancer.
  • the immunity-inducing agent of the present invention may consist only of a polypeptide, or may be appropriately mixed with additives such as pharmacologically acceptable carriers, diluents and excipients suitable for each administration form. It can also be formulated. Formulation methods and usable additives are well known in the field of pharmaceutical formulations, and any method and additive can be used. Specific examples of additives include diluents such as physiological buffers; excipients such as sugar, lactose, corn starch, calcium phosphate, sorbitol, glycine; syrup, gelatin, gum arabic, sorbitol, polyvinyl chloride, tragacanth, etc.
  • additives include diluents such as physiological buffers; excipients such as sugar, lactose, corn starch, calcium phosphate, sorbitol, glycine; syrup, gelatin, gum arabic, sorbitol, polyvinyl chloride, tragacanth, etc.
  • Binders such as magnesium stearate, polyethylene glycol, talc, silica and the like, but are not limited thereto.
  • the dosage form include oral preparations such as tablets, capsules, granules, powders, and syrups, and parenteral preparations such as inhalants, injections, suppositories, and liquids. These preparations can be made by generally known production methods.
  • the immunity-inducing agent of the present invention can be used in combination with an immunity enhancing agent capable of enhancing the immunological response in vivo.
  • the immunopotentiator may be contained in the immunity-inducing agent of the present invention, or may be administered to a patient in combination with the immunity-inducing agent of the present invention as a separate composition.
  • the above immunopotentiator examples include an adjuvant.
  • Adjuvants provide a reservoir of antigen (extracellular or within macrophages) and can enhance immunological responses by activating macrophages and stimulating specific sets of lymphocytes, thus enhancing anticancer effects be able to. Therefore, particularly when the immunity-inducing agent of the present invention is used for the treatment and / or prevention of cancer, it is preferable that the immunity-inducing agent further contains an adjuvant in addition to the above-mentioned polypeptide which is an active ingredient. Many types of adjuvants are well known in the art, and any adjuvant can be used.
  • adjuvants include MPL (SmithKline Beecham), Salmonella minnesota Re 595 lipopolysaccharide, and the like obtained after purification and acid hydrolysis; QS21 (SmithKline Beecham), purified from Quillajasapur. QA-21 saponin; DQS21 described in WO 96/33739 (SmithKline Beecham); QS-7, QS-17, QS-18 and QS-L1 (So, outside 10 persons, “Molecules and Cell ( Molecules and cells), 1997, Vol. 7, p.
  • the mixing ratio of the adjuvant to the polypeptide is typically about 1:10 to 10: 1, preferably about 1: 5 to 5: 1, more preferably about 1: 1.
  • the adjuvant is not limited to the above examples, and other adjuvants known in the art may be used when administering the immunity-inducing agent of the present invention (for example, “Goding”, “Monoclonal antibodies: Principles and Practices (see Monoclonal Antibodies: Principles and Practices, 2nd edition, 1986). Methods for preparing polypeptide and adjuvant mixtures or emulsions are well known to those skilled in vaccination.
  • factors that stimulate the immune response of the subject can also be used as the immune enhancer.
  • various cytokines having the property of stimulating lymphocytes and antigen-presenting cells can be used in combination with the immune inducer of the present invention as an immune enhancer.
  • Numerous cytokines capable of enhancing such immunological responses are known to those skilled in the art, such as interleukin-12 (IL-12), which has been shown to enhance the protective effects of vaccines, Examples include, but are not limited to, GM-CSF, IL-18, interferon ⁇ , interferon ⁇ , interferon ⁇ , interferon ⁇ , and Flt3 ligand.
  • IL-12 interleukin-12
  • Such factors can also be used as the above-mentioned immunity enhancing agent, and can be administered to patients in the immunity-inducing agent of the present invention or in combination with the immunity-inducing agent of the present invention as a separate composition.
  • Antigen-presenting cell or cytotoxic T cell The polypeptide can be presented to an antigen-presenting cell by contacting the polypeptide and an antigen-presenting cell (from a subject) ex vivo or in vitro. That is, the above polypeptides (a) to (d) can be used as treatment agents for antigen-presenting cells.
  • dendritic cells or B cells carrying MHC class I molecules can be preferably used as antigen-presenting cells.
  • MHC class I molecules have been identified and are well known. MHC molecules in humans are called HLA. Examples of HLA class I molecules include HLA-A, HLA-B, and HLA-C.
  • HLA-A1 HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602, and the like.
  • Dendritic cells or B cells carrying MHC class I molecules can be prepared from peripheral blood by well-known methods. For example, dendritic cells are induced from bone marrow, umbilical cord blood or patient peripheral blood using granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and IL-3 (or IL-4), and tumor-related peptides are introduced into the culture system. Can be added to induce tumor-specific dendritic cells.
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
  • IL-3 or IL-4
  • the cells used can be bone marrow and umbilical cord blood provided by healthy people, the patient's own bone marrow and peripheral blood, etc., but when using the patient's own autologous cells, it is highly safe and has serious side effects. It can also be expected to avoid it.
  • Peripheral blood or bone marrow may be a fresh sample, a cryopreserved sample, or a cryopreserved sample.
  • whole blood may be cultured, or only the leukocyte component may be separated and cultured, but the latter is more efficient and preferable.
  • mononuclear cells may be separated among the leukocyte components.
  • the whole cells constituting the bone marrow may be cultured, or mononuclear cells may be separated and cultured from this.
  • Peripheral blood, its white blood cell components, and bone marrow cells include mononuclear cells, hematopoietic stem cells, immature dendritic cells, CD4 positive cells, and the like that are the origin of dendritic cells.
  • the cytokine used has a property that has been confirmed to be safe and physiologically active, it does not matter whether it is a natural type or a genetically engineered type, and its production method is preferably ensured. Are used in the minimum amount required.
  • the concentration of the cytokine to be added is not particularly limited as long as it is a concentration at which dendritic cells are induced, and is usually preferably about 10 to 1000 ng / mL, more preferably about 20 to 500 ng / mL as the total concentration of cytokines.
  • the culture can be performed using a well-known medium usually used for culturing leukocytes.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as leukocyte growth is possible, but is most preferably about 37 ° C. which is the human body temperature.
  • the gas environment during the culture is not particularly limited as long as leukocytes can grow, but it is preferable to aerate 5% CO 2 .
  • the culture period is not particularly limited as long as a necessary number of cells are induced, but it is usually performed for 3 days to 2 weeks.
  • a device used for cell separation and culture an appropriate device can be used as appropriate, but it is preferable that safety is confirmed for medical use and that the operation is stable and simple.
  • stacked containers, multistage containers, roller bottles, spinner bottles, bag-type incubators, hollow fiber columns, etc. can be used regardless of general containers such as petri dishes, flasks, and bottles. .
  • the method of contacting the polypeptide and the antigen-presenting cell ex vivo or in vitro can be performed by a well-known method. For example, it can be performed by culturing antigen-presenting cells in a culture solution containing the polypeptide.
  • the peptide concentration in the medium is not particularly limited, but is usually about 1 to 100 ⁇ g / ml, preferably about 5 to 20 ⁇ g / ml.
  • the cell density at the time of culture is not particularly limited, but is usually about 10 3 to 10 7 cells / ml, preferably about 5 ⁇ 10 4 to 5 ⁇ 10 6 cells / ml. Cultivation is preferably performed according to a conventional method in an atmosphere of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the length of the peptide that can be presented on the surface by antigen-presenting cells is usually about 30 amino acid residues at the maximum. Therefore, although not particularly limited, when the antigen-presenting cell is contacted with the polypeptide ex vivo or in vitro, the polypeptide may be prepared to a length of about 30 amino acid residues or less.
  • an isolated antigen-presenting cell containing a complex of the polypeptide and MHC molecule can be prepared using the polypeptide.
  • the present invention also provides an antigen presentation comprising a complex of the polypeptide and an MHC molecule, which comprises contacting the above-described polypeptide and a subject-derived antigen-presenting cell ex vivo or in vitro.
  • an antigen presentation comprising a complex of the polypeptide and an MHC molecule, which comprises contacting the above-described polypeptide and a subject-derived antigen-presenting cell ex vivo or in vitro.
  • the present invention also provides an antigen-presenting cell obtained by this method and comprising a complex of the above polypeptide and MHC molecule.
  • a cytotoxic T specific to the polypeptide is obtained.
  • Cells can be induced and grown. This can be done by co-culturing the antigen-presenting cells and T cells in a liquid medium. For example, it can be carried out by suspending antigen-presenting cells in a liquid medium, placing them in a container such as a well of a microplate, adding T cells thereto, and culturing.
  • the mixing ratio of antigen-presenting cells and T cells during co-culture is not particularly limited, but is usually about 1: 1 to 1: 100, preferably about 1: 5 to 1:20 in terms of the number of cells.
  • the density of antigen-presenting cells suspended in the liquid medium is not particularly limited, but is usually about 1 to 10 million cells / ml, preferably about 10,000 to 1 million cells / ml.
  • the co-culture is preferably performed according to a conventional method in an atmosphere of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the culture time is not particularly limited, but is usually 2 days to 3 weeks, preferably about 4 days to 2 weeks.
  • the coculture is preferably performed in the presence of one or more interleukins such as IL-2, IL-6, IL-7 and IL-12.
  • the concentration of IL-2 and IL-7 is usually about 5 to 20 U / ml
  • the concentration of IL-6 is usually about 500 to 2000 U / ml
  • the concentration of IL-12 is usually about 5 to 20 ng / ml.
  • the above co-culture may be repeated once to several times by adding fresh antigen-presenting cells. For example, the operation of discarding the culture supernatant after co-culture, adding a fresh antigen-presenting cell suspension, and further co-culturing may be repeated once to several times.
  • the conditions for each co-culture may be the same as described above.
  • cytotoxic T cells specific for the polypeptide are induced and proliferated. Therefore, isolated T cells that selectively bind to the complex of the polypeptide and MHC molecule can be prepared using the polypeptide.
  • the present invention further comprises a cytotoxicity specific to the above polypeptide, comprising activating said T cell by contacting said antigen-presenting cell and T cell derived from a subject ex vivo or in vitro.
  • a method for producing sex T cells is provided.
  • the present invention also provides cytotoxic T cells obtained by this method and specific for the above polypeptides.
  • the MRAP2 gene is leukemia, malignant lymphoma, lung cancer, brain tumor, colon cancer, melanoma, neuroblastoma, pancreatic cancer, gastric cancer, liver cancer, ovarian cancer, esophageal cancer, renal cancer, mastocytoma. Or it is specifically expressed in perianal adenocarcinoma. Therefore, it is considered that MRAP2 is significantly more present than normal cells in these cancer types.
  • the cytotoxic T cells prepared as described above are administered in vivo so that a part of the MRAP2 polypeptide present in the cancer cells is presented to MHC molecules on the surface of the cancer cells, As a landmark, cytotoxic T cells can damage cancer cells.
  • antigen-presenting cells that present part of the MRAP2 polypeptide can induce and proliferate cytotoxic T-cells specific for the polypeptide in vivo, so that the antigen-presenting cells can survive. Cancer cells can also be damaged by administration into the body. That is, the cytotoxic T cell and the antigen-presenting cell prepared using the polypeptide are also useful as a cancer treatment and / or prevention agent, like the immunity-inducing agent of the present invention.
  • Presenting cells or T cells are preferably prepared using the polypeptides (a) to (d) as described above.
  • the administration route of the therapeutic and / or prophylactic agent for cancer comprising isolated antigen-presenting cells or isolated T cells as an active ingredient is preferably parenteral administration such as intravenous administration or intraarterial administration.
  • the dose is appropriately selected according to symptoms, administration purposes, etc., but is usually 1 to 10 trillion, preferably 1 million to 1 billion, and this is once every few days to several months. Administration is preferred.
  • the preparation may be, for example, one in which cells are suspended in physiological buffer saline, and can be used in combination with other anticancer agents, cytokines, and the like.
  • one or two or more additives well known in the pharmaceutical field can be added.
  • the immunity-inducing agent of the present invention comprises a polynucleotide encoding the above-mentioned polypeptides (a) to (d), and contains a recombinant vector capable of expressing the polypeptide in vivo as an active ingredient. There may be. As shown in the Examples described later, a recombinant vector capable of expressing such an antigen polypeptide is also called a DNA vaccine.
  • the vector used for producing the DNA vaccine is not particularly limited as long as it can be expressed in the target animal cell (preferably in the mammalian cell), and may be a plasmid vector or a virus vector, and is known in the field of DNA vaccines. Any of these vectors may be used.
  • a polynucleotide such as DNA or RNA encoding the polypeptide can be easily prepared by a conventional method.
  • the polynucleotide can be incorporated into a vector by a method well known to those skilled in the art.
  • the administration route of the DNA vaccine is preferably a parenteral administration route such as intramuscular administration, subcutaneous administration, intravenous administration or intraarterial administration, and the dosage can be appropriately selected according to the type of antigen.
  • the weight of the DNA vaccine per kg body weight is about 0.1 ⁇ g to 100 mg, preferably about 1 ⁇ g to 10 mg.
  • Examples of methods using viral vectors include retrovirus, adenovirus, adeno-associated (also referred to as “adeno-associated”) virus, herpes virus, vaccinia virus, pox virus, poliovirus, Sindbis virus, and other RNA viruses or DNA viruses. And a method of incorporating a polynucleotide encoding the polypeptide and infecting the subject animal with the polynucleotide.
  • retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, vaccinia viruses and the like are particularly preferred.
  • Examples of other methods include a method in which an expression plasmid is directly administered into muscle (DNA vaccine method), a liposome method, a lipofectin method, a microinjection method, a calcium phosphate method, an electroporation method, and the like. The method is preferred.
  • an in vivo method for directly introducing the gene into the body, and collecting a certain cell from the target animal and transferring the gene to the cell outside the body There is an ex vivo method that introduces the cells into the body and returns the cells to the body (Nikkei Science, April 1994, p20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 1994, Vol. 36, No. 1, p. 23-48, Experimental Medicine) Special edition, 1994, Vol. 12, No. 15, and references cited therein), in vivo method is more preferable.
  • an in vivo method When administered by an in vivo method, it can be administered by an appropriate administration route according to the disease or symptom or the like for the purpose of treatment. For example, it can be administered intravenously, artery, subcutaneously, intramuscularly. In the case of administration by an in vivo method, for example, it can be in the form of a preparation such as a liquid, but is generally an injection containing the DNA encoding the polypeptide of the present invention, which is an active ingredient, and is necessary. Depending on the case, conventional carriers may be added.
  • the liposome or membrane-fused liposome containing the DNA can be in the form of a liposome preparation such as a suspension, a freezing agent, or a centrifugal concentrated freezing agent.
  • base sequence shown in SEQ ID NO: 1 includes the base sequence actually shown in SEQ ID NO: 1 as well as a complementary sequence thereto. Therefore, for example, when saying “polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1”, a single-stranded polynucleotide having the base sequence actually shown in SEQ ID NO: 1, its complementary base sequence And double-stranded polynucleotides comprising these.
  • any base sequence is appropriately selected, but those skilled in the art can easily select it.
  • Example 1 Acquisition of novel cancer antigen protein by SEREX method (1) Preparation of cDNA library Total RNA was extracted from dog testis by acid-guanidinium-phenol-chloroform method (Acid guanidinium-Phenol-Chloroform method), PolyA RNA was purified using Oligotex-dT30 mRNA purification Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) according to the protocol attached to the kit.
  • a cDNA phage library was synthesized using the obtained mRNA (5 ⁇ g).
  • the cDNA phage library was prepared by using cDNA Synthesis kit, Zap-cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (manufactured by STRATAGENE) according to the protocol attached to the kit.
  • the size of the prepared cDNA phage library was 1 ⁇ 10 6 pfu / ml.
  • the membrane was recovered, immersed in TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7.5) containing 0.5% nonfat dry milk, and shaken at 4 ° C. overnight to suppress nonspecific reaction.
  • TBS 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7.5
  • This filter was reacted with serum of a patient dog diluted 500 times at room temperature for 2 to 3 hours.
  • the serum pretreatment method is as follows. That is, ⁇ ZAP Express phage into which no foreign gene was inserted was infected with host E. coli (XL1-BLue MRF ′), and then cultured overnight at 37 ° C. on NZY plate medium. Next, a buffer of 0.2 M NaHCO 3 pH 8.3 containing 0.5 M NaCl was added to the plate and allowed to stand at 4 ° C. for 15 hours, and then the supernatant was recovered as an E. coli / phage extract. Next, the recovered E.
  • coli / phage extract was passed through an NHS column (GE Healthcare Bio-Science) to immobilize the E. coli / phage derived protein.
  • Serum dog serum was passed through and reacted with this protein-immobilized column, and antibodies adsorbed to E. coli and phage were removed from the serum.
  • the serum fraction passed through the column was diluted 500 times with TBS containing 0.5% nonfat dry milk, and this was used as an immunoscreening material.
  • the membrane on which the treated serum and protein were blotted was washed 4 times with TBS-T (0.05% Tween20 / TBS), and then 5000 times with TBS containing 0.5% nonfat dry milk as a secondary antibody.
  • TBS-T 0.05% Tween20 / TBS
  • TBS containing 0.5% nonfat dry milk as a secondary antibody.
  • the diluted goat anti-dog IgG (Goat anti-Dog IgG-h + L HRP conjugated: manufactured by BETHYL Laboratories) was reacted at room temperature for 1 hour, and detected by an enzyme color reaction using an NBT / BCIP reaction solution (manufactured by Roche).
  • colonies that coincide with the color development reaction positive site were collected from ⁇ 90 ⁇ 15 mm NZY agarose plate and dissolved in 500 ⁇ l of SM buffer (100 mM NaCl, 10 mM MgClSO 4 , 50 mM Tris-HCl, 0.01% gelatin pH 7.5). I let you.
  • SM buffer 100 mM NaCl, 10 mM MgClSO 4 , 50 mM Tris-HCl, 0.01% gelatin pH 7.5.
  • the secondary and tertiary screening are repeated in the same manner as described above until the chromogenic positive colonies are unified, and about 10,000 phage clones that react with IgG in the serum are screened to identify one positive clone. Released.
  • the supernatant was collected as a phagemid solution.
  • 200 ⁇ l of a phagemid host Escherichia coli (SOLR) solution having an absorbance OD 600 of 1.0 was mixed with 10 ⁇ l of the purified phage solution and reacted at 37 ° C. for 15 minutes, and 50 ⁇ l was treated with ampicillin (final concentration 50 ⁇ g / ml).
  • SOLR phagemid host Escherichia coli
  • the purified plasmid was analyzed for the full-length insert sequence by the primer walking method using the T3 primer shown in SEQ ID NO: 9 and the T7 primer shown in SEQ ID NO: 10.
  • the gene sequence described in SEQ ID NO: 3 was obtained by this sequence analysis.
  • a sequence identity search program BLAST search http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ was used to perform sequence identity searches with known genes. As a result, the obtained gene was found to be the MRAP2 gene.
  • human MRAP2 which is a human homologous factor of canine MRAP2
  • sequence identity is 91% base sequence and 94% amino acid sequence
  • cat feline MRAP2 which is a feline homologous factor
  • sequence identity is 95% base sequence and 96% amino acid sequence
  • sequence identity was 84% base sequence and 88% amino acid sequence.
  • the nucleotide sequence of human MRAP2 is SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 2, the cat MRAP2 nucleotide sequence is SEQ ID NO: 6, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 6, the mouse MRAP2 nucleotide sequence is SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence is SEQ ID NO: 5.
  • the number 8 is shown.
  • RT-PCR Reverse Transcription-PCR
  • the reverse transcription reaction was performed as follows. That is, total RNA was extracted from 50 to 100 mg of each tissue and 5 to 10 ⁇ 10 6 cells of each cell line using TRIZOL reagent (manufactured by Life technology) according to the attached protocol. Using this total RNA, cDNA was synthesized according to the attached protocol by Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR (manufactured by Life Technology).
  • Gene pool cDNA (manufactured by Life technology), QUICK-Clone cDNA (manufactured by Clontech) and Large-Insert cDNA Library (manufactured by Clontech) were used as cDNAs for human normal tissues (brain, testis, colon, placenta).
  • the PCR reaction was performed using the obtained gene-specific primers (SEQ ID NOs: 11 and 12 for dog primers, SEQ ID NOs: 13 and 14 for human primers, and SEQ ID NOs: 15 and 16 for mouse primers) as follows.
  • MRAP2 gene expression In human MRAP2 gene expression, expression is not observed in most tissues in healthy human tissues, while leukemia, malignant lymphoma, lung cancer, brain tumor, colon cancer, pancreatic cancer, stomach cancer, liver cancer, ovarian cancer, esophagus in human cancer cells. Strong expression was observed in cell lines of cancer and renal cancer (FIG. 2). Furthermore, the expression of mouse MRAP2 gene was detected in leukemia, melanoma and neuroblastoma cell lines (FIG. 3).
  • Example 2 Analysis of cancer antigenicity of MRAP2 in vivo
  • Preparation of recombinant vector expressing mouse MRAP2 in vivo Based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, in vivo A recombinant vector expressing mouse MRAP2 was prepared.
  • PCR was prepared from the mouse leukemia cell line EL4 (purchased from ATCC) in which expression was observed in Example 1.
  • Primer HS polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) 1 ⁇ l of cDNA, 2 types of primers (described in SEQ ID NOs: 17 and 18) containing EcoRI and NotI restriction enzyme cleavage sequences, 0.4 ⁇ M, 0.2 mM dNTP, 1.25 U Add each reagent and the attached buffer so that the total volume becomes 50 ⁇ l, and use Thermal Cycler (manufactured by BIO RAD), 30 cycles of 98 ° C-10 seconds, 55 ° C-15 seconds, 72 ° C-1 minutes This was done by repeating.
  • the above two types of primers amplify the region encoding the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. After PCR, the amplified DNA was electrophoresed on a 1% agarose gel, and a DNA fragment of about 600 bp was purified using QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN).
  • the purified DNA fragment was ligated to the cloning vector pCR-Blunt (Life technology). After transforming this into E. coli, the plasmid was recovered, and it was confirmed by sequencing that the amplified gene fragment matched the target sequence.
  • a plasmid corresponding to the target sequence was treated with EcoRI and NotI restriction enzymes, purified with QIAquick Gel Extraction Kit, and then inserted into a mammalian expression vector pcDNA3.1 (manufactured by Invitrogen) treated with EcoRI and NotI restriction enzymes. (Hereinafter referred to as mouse MRAP2 / pcDNA3.1).
  • mouse MRAP2 / pcDNA3.1 mouse MRAP2 protein in mammalian cells.
  • gold particles 50 ⁇ g of gold particles (manufactured by Bio Rad), 100 ⁇ l of spermidine (manufactured by SIGMA), and 100 ⁇ l of 1M CaCl 2 (manufactured by SIGMA) were added to 100 ⁇ g of the plasmid DNA prepared above, and the mixture was stirred by vortexing and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. (Hereinafter referred to as gold-DNA particles). After centrifugation at 3000 rpm for 1 minute, the supernatant was discarded and washed 3 times with 100% ethanol (manufactured by WAKO).
  • Tefzel Tubing manufactured by BioRad
  • Tefzel Tubing ethanol with gold-DNA particles attached was air-dried and cut to a length suitable for a gene gun (hereinafter referred to as mouse MRAP2 / tube).
  • a recombinant vector expressing human MRAP2 in vivo was prepared by the following method. PCR was prepared from the human leukemia cell line K562 (purchased from ATCC) in which expression was observed in Example 1.
  • the purified DNA fragment was ligated to a cloning vector pCR-Blunt (Life Technology). After transforming this into E. coli, the plasmid was recovered, and it was confirmed by sequencing that the amplified gene fragment matched the target sequence.
  • a plasmid corresponding to the target sequence was treated with EcoRI and NotI restriction enzymes, purified with QIAquick Gel Extraction Kit, and then inserted into a mammalian expression vector pcDNA3.1 (manufactured by Invitrogen) treated with EcoRI and NotI restriction enzymes. (Hereinafter, human MRAP2 / pcDNA3.1).
  • the use of this vector produces human MRAP2 protein in mammalian cells.
  • gold particles 50 ⁇ g of gold particles (manufactured by Bio Rad), 100 ⁇ l of spermidine (manufactured by SIGMA), and 100 ⁇ l of 1M CaCl 2 (manufactured by SIGMA) were added to 100 ⁇ g of the plasmid DNA prepared above, and the mixture was stirred by vortexing and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. (Hereinafter referred to as gold-DNA particles). After centrifugation at 3000 rpm for 1 minute, the supernatant was discarded and washed 3 times with 100% ethanol (manufactured by WAKO).
  • Tefzel Tubing manufactured by BioRad
  • Tefzel Tubing ethanol with gold-DNA particles attached was air-dried and cut to a length suitable for a gene gun (hereinafter human MRAP2 / tube).
  • the present invention is useful for the treatment and / or prevention of cancer because it provides an immunity-inducing agent comprising a polypeptide that exhibits antitumor activity against various cancers.

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Abstract

本発明は、癌の治療及び／又は予防のための新規な免疫誘導剤に関し、具体的には、ＭＲＡＰ２由来のポリペプチド類及びその改変体から選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター、を有効成分として含有する免疫誘導剤、及び、該免疫誘導剤を被験体に投与することを含む、免疫誘導方法に関する。

Description

免疫誘導剤
　本発明は、癌の治療及び／又は予防剤等として有用な新規な免疫誘導剤に関する。
　癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。近年、分子生物学や癌免疫学の進歩で癌に反応する細胞障害性Ｔ細胞により認識される癌抗原、癌抗原をコードする遺伝子などが同定されており、抗原特異性免疫療法への期待が高まっている。
　Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ　２　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｃｅｓｓｏｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２（ＭＲＡＰ２）は１型又は２型の膜貫通タンパク質であり、メラノコルチンレセプター（ＭＣＲ）の活性制御に関わっており、生体内のエネルギー代謝において機能している（非特許文献１）。また、ＭＲＡＰ２欠損マウスでは過食がないにも関わらず肥満になることが報告されており、ヒトにおいても重度の肥満患者の中には、ＭＲＡＰ２遺伝子に変異を有する患者がいることが報告されている（非特許文献２）。しかし、ＭＲＡＰ２タンパク質が癌細胞に対する免疫誘導活性を有し、それによって該タンパク質が癌の治療や予防に有用であるという報告はない。
Jackson DS. et al. Front.Neurosci, 9:213(2015) Asai M. et al. Science, 341:275-278(2013)
　本発明の目的は、癌の治療及び／又は予防剤等として有用な新規なポリペプチドを見出し、該ポリペプチドの免疫誘導剤への使用を提供することである。
　本願発明者らは、鋭意研究の結果、イヌ精巣由来ｃＤＮＡライブラリーと白血病患犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌生体由来の血清中に存在する抗体と結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡを取得し、そのｃＤＮＡを基にして、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するイヌＭｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ　２　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｃｅｓｓｏｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２（以下、ＭＲＡＰ２と記載する）のポリペプチドを作製した。また、取得したイヌ遺伝子のヒト、ネコ及びマウス相同性遺伝子を基にして、配列番号２、６、８で示されるアミノ酸配列を有するヒト、ネコ及びマウスＭＲＡＰ２ポリペプチドを作製した。そしてこれらＭＲＡＰ２ポリペプチドが白血病、悪性リンパ腫、肺癌、脳腫瘍、大腸癌、メラノーマ、神経芽腫、膵癌、胃癌、肝癌、卵巣癌、食道癌、腎癌、肥満細胞腫、及び肛門周囲腺癌に発現していることを見出した。さらにまた、これらＭＲＡＰ２を生体に投与することによって、生体内にＭＲＡＰ２に対する免疫細胞を誘導することができること、及びＭＲＡＰ２を発現する生体内の腫瘍を退縮させることができることを見出した。さらにまた、ＭＲＡＰ２のポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドを発現可能な組換えベクターが、ＭＲＡＰ２を発現する癌に対し生体内で抗腫瘍効果を誘導することを見出した。
　さらにまた、ＭＲＡＰ２のポリペプチドが、抗原提示細胞により提示されて、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を活性化及び増殖させる能力（「免疫誘導活性」とも称する。）を有すること、このため、該ポリペプチドが癌の治療及び／又は予防に有用であり、また、該ポリペプチドと接触した抗原提示細胞や、該抗原提示細胞と接触したＴ細胞が癌の治療及び／又は予防に有用であることを見出し、本発明を完成した。
　従って、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）以下の（ａ）～（ｄ）のポリペプチドから選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、かつ生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター、を有効成分として含有する免疫誘導剤。
（ａ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上から全長以下のアミノ酸から成るポリペプチド
（ｂ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｃ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｄ）前記（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
（２）抗原提示細胞の処理剤である、（１）に記載の免疫誘導剤。
（３）癌の治療及び／又は予防剤の有効成分である、（１）に記載の免疫誘導剤。
（４）前記癌がＭＲＡＰ２を発現する癌である、（３）に記載の免疫誘導剤。
（５）前記癌が白血病、悪性リンパ腫、肺癌、脳腫瘍、大腸癌、メラノーマ、神経芽腫、膵癌、胃癌、肝癌、卵巣癌、食道癌、腎癌、肥満細胞腫又は肛門周囲腺癌である、（３）又は（４）に記載の免疫誘導剤。
（６）免疫増強剤をさらに含む、（１）～（５）のいずれかに記載の免疫誘導剤。
（７）前記免疫増強剤が、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリＩＣ及びその誘導体、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、インターロイキン１２、インターロイキン１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ、及びＦｌｔ３リガンドから成る群より選ばれる少なくとも一つである、（６）に記載の免疫誘導剤。
（８）（１）に定義するポリペプチドと被験体由来の抗原提示細胞とをｅｘ　ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させることを含む、該ポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含む抗原提示細胞の作製方法。
（９）前記抗原提示細胞が、ＭＨＣクラスＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞である、（８）に記載の方法。
（１０）（８）又は（９）に記載の方法によって得られる抗原提示細胞と被験体由来のＴ細胞とをｅｘ　ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させて該Ｔ細胞を活性化することを含む、（１）に定義するポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞の作製方法。
（１１）以下の（ａ）～（ｄ）のポリペプチドから選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、かつ生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター、を被験体に投与することを含む、免疫誘導方法。
（ａ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上から全長以下のアミノ酸から成るポリペプチド
（ｂ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｃ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｄ）前記（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
　本願は、２０１６年３月２８日に出願された日本国特許出願２０１６－０６４０３２号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書に記載される内容を包含する。
　本発明により、癌の治療及び／又は予防等に有用な新規な免疫誘導剤が提供される。後述の実施例において具体的に示されるように、本発明で用いられるポリペプチドを被験体に投与すると、生体内において免疫細胞を誘導することができ、さらに、既に生じている癌を縮小もしくは退縮させることができる。従って、該ポリペプチドは癌の治療や予防に有用である。
同定したＭＲＡＰ２遺伝子の、イヌの腫瘍組織での発現パターンを示す図である。参照番号１；イヌＭＲＡＰ２遺伝子の、図示したイヌの各腫瘍組織での発現パターンを示す。 同定したＭＲＡＰ２遺伝子の、ヒトの各組織及び癌細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号２；ヒトＭＲＡＰ２遺伝子の、図示したヒトの各正常組織での発現パターンを示す。参照番号３；ヒトＭＲＡＰ２遺伝子の、図示したヒトの各癌細胞株での発現パターンを示す。図中、ＰＢＭＣは末梢血単核球を示す。 同定したＭＲＡＰ２遺伝子の、マウスの各癌細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号４；マウスＭＲＡＰ２遺伝子の、図示したマウスの各癌細胞株での発現パターンを示す。
１．ポリペプチド
　本発明の免疫誘導剤に有効成分として含まれるポリペプチドとしては、以下の(ａ）～（ｄ）のポリペプチドが挙げられる。なお、本発明において、「ポリペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合することによって形成される分子をいい、構成するアミノ酸数が多いポリペプチド分子のみならず、アミノ酸数が少ない低分子量の分子（オリゴペプチド）や、全長タンパク質も包含される。
（ａ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド中の連続する７個以上から全長以下のアミノ酸から成り、かつ免疫誘導活性を有するポリペプチド
（ｂ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するポリペプチド
（ｄ）前記（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチドを部分配列として含み、かつ免疫誘導活性を有するポリペプチド
　なお、本発明において、「アミノ酸配列を有する」とは、アミノ酸残基がそのような順序で配列しているという意味である。従って、例えば、「配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、配列番号８に示されるＭｅｔ，Ｇｌｕ，Ｍｅｔ，Ｓｅｒ，Ａｌａ・・(中略)・・Ｉｌｅ，Ａｓｐ，Ｌｅｕ，Ａｓｐのアミノ酸配列を持つ、２０７アミノ酸残基のサイズのポリペプチドを意味する。また、例えば、「配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」を「配列番号８のポリペプチド」と略記することがある。「塩基配列を有する」という表現についても同様である。この場合、「有する」という用語は、「からなる」という表現で置き換えてもよい。
　ここで、「免疫誘導活性」とは、生体内でインターフェロン等のサイトカインを分泌する免疫細胞を誘導する能力を意味する。
　上記ポリペプチドが免疫誘導活性を有するか否かは、例えば公知のエリスポットアッセイ等を用いて確認することができる。具体的には、免疫誘導活性を評価すべきポリペプチドを投与した生体から末梢血単核球等の細胞を得て、該細胞を該ポリペプチドと共存培養し、該細胞からのサイトカイン産生量を、特異抗体を用いて測定することにより、該細胞中の免疫細胞数を測定することができるので、これにより免疫誘導活性を評価することができる。
　また、後述の実施例に記載されるように、上記（ａ）～（ｄ）の組換えポリペプチドを担癌生体に投与すると、その免疫誘導活性により腫瘍を退縮させることもできる。よって、上記免疫誘導活性は、癌細胞の増殖を抑制し又は癌組織（腫瘍）を縮小若しくは消滅させる能力（以下、「抗腫瘍活性」という）として評価することもできる。ポリペプチドの抗腫瘍活性は、例えば後述の実施例に具体的に記載されるように、実際に該ポリペプチドを担癌生体に投与して腫瘍が縮小等されるか否かを調べることよって確認することができる。また、該ポリペプチドを担癌生体に投与して誘導された細胞障害性Ｔ細胞が、腫瘍に対して細胞障害活性を示すか否かを調べることによってポリペプチドの抗腫瘍活性を評価することもできる。生体内におけるＴ細胞の細胞障害活性の測定は、例えばＴ細胞を生体内から除去する抗体を投与することで腫瘍が増大等されるか否かを調べることよって確認することができるがこれに限定されない。
　あるいは、該ポリペプチドで刺激したＴ細胞（すなわち、該ポリペプチドを提示する抗原提示細胞と接触させたＴ細胞）が、生体外で腫瘍細胞に対して細胞障害活性を示すか否かを調べることによって、該ポリペプチドの抗腫瘍活性を評価することもできる。Ｔ細胞と抗原提示細胞との接触は、後述するように、両者を液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。細胞障害活性の測定は、例えばInt.J.Cancer,58:p317,1994に記載された５１Ｃｒリリースアッセイと呼ばれる公知の方法により行なうことができる。上記ポリペプチドを癌の治療及び／又は予防用途に用いる場合には、特に限定されないが、抗腫瘍活性を指標として免疫誘導活性を評価することが好ましい。
　本発明が開示する配列表の配列番号２、４、６、又は８にそれぞれ示されるアミノ酸配列は、イヌ精巣由来ｃＤＮＡライブラリーと担癌犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌犬由来の血清中に特異的に存在する抗体と結合するポリペプチド及びそのヒト、ネコ、及びマウス相同因子として単離された、ＭＲＡＰ２のアミノ酸配列である（実施例１参照）。イヌＭＲＡＰ２のヒト相同因子であるヒトＭＲＡＰ２では、配列同一性が塩基配列９１％、アミノ酸配列９４％であり、ネコ相同因子であるネコＭＲＡＰ２では配列同一性は塩基配列９５％、アミノ酸配列９６％であり、マウス相同因子であるマウスＭＲＡＰ２では配列同一性は塩基配列８４％、アミノ酸配列８８％である。
　上記（ａ）のポリペプチドは、配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド中の連続する７個以上、好ましくは連続する８、９又は１０個以上のアミノ酸から成るポリペプチドであって、免疫誘導活性を有するものである。特に好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列を有する。なお、この分野で公知の通り、約７アミノ酸残基以上のポリペプチドであれば抗原性及び免疫原性を発揮できる。従って、配列番号２、４、６、又は８のアミノ酸配列中の連続する７アミノ酸残基（７個）以上から全アミノ酸残基（全長）以下のアミノ酸からなるポリペプチドであれば、免疫誘導活性を有し得るので、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。
　また、癌抗原ポリペプチドを投与することによる免疫誘導の原理として、ポリペプチドが抗原提示細胞に取り込まれ、その後該細胞内でペプチダーゼによる分解を受けてより小さな断片となり、該細胞の表面上に提示され、それを細胞障害性Ｔ細胞等が認識し、その抗原を提示している細胞を選択的に殺していくということが知られている。抗原提示細胞の表面上に提示されるポリペプチドのサイズは比較的小さく、アミノ酸数で７～３０程度である。従って、抗原提示細胞上に提示させるという観点からは、上記（ａ）のポリペプチドとしては、配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列中の連続する７～３０程度であることが好ましい態様のひとつであり、より好ましくは８～３０もしくは９～３０程度のアミノ酸から成るものであれば十分である。これら比較的小さなサイズのポリペプチドは、抗原提示細胞内に取り込まれることなく、直接抗原提示細胞上の細胞表面に提示される場合もある。
　また、抗原提示細胞に取り込まれたポリペプチドは、該細胞内のペプチダーゼによりランダムな位置で切断を受けて、種々のポリペプチド断片が生じ、これらのポリペプチド断片が抗原提示細胞表面上に提示されるので、配列番号２、４、６、又は８の全長領域のように大きなサイズのポリペプチドを投与すれば、抗原提示細胞内での分解によって、抗原提示細胞を介する免疫誘導に有効なポリペプチド断片が必然的に生じる。従って、抗原提示細胞を介する免疫誘導にとっても、サイズの大きなポリペプチドを好ましく用いることができ、アミノ酸数を３０以上、さらに好ましくは１００以上、さらに好ましくは２００以上、さらに好ましくは配列番号２、４、６、又は８の全長領域のポリペプチドとしてもよい。
　上記（ｃ）のポリペプチドは、上記（ａ）のポリペプチドのうちの少数の（好ましくは、１個もしくは数個の）アミノ酸残基が置換し、欠失し及び／又は挿入されたポリペプチドであって、元の配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上又は９９．５％以上の配列同一性を有し、かつ、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。一般に、タンパク質抗原において、該タンパク質のアミノ酸配列のうち少数のアミノ酸残基が置換され、欠失され又は挿入された場合であっても、元のタンパク質とほぼ同じ抗原性を有している場合があることは当業者において広く知られている。従って、上記（ｃ）のポリペプチドも免疫誘導活性を発揮し得るので、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。また、上記（ｂ）のポリペプチドは、配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列のうち、１個ないし数個のアミノ酸残基が置換し、欠失し及び／又は挿入されたポリペプチドであることも好ましい。本明細書中の「数個」とは、２～１０の整数、好ましくは２～６の整数、さらに好ましくは２～４の整数を表す。
　ここで、アミノ酸配列又は塩基配列の「配列同一性」とは、比較すべき２つのアミノ酸配列（又は塩基配列）のアミノ酸残基（又は塩基）ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列（又は塩基配列）を整列させ、一致したアミノ酸残基数（又は一致した塩基数）を全アミノ酸残基数（又は全塩基数）で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ等の周知のアルゴリズムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全アミノ酸残基数は、１つのギャップを１つのアミノ酸残基として数えた残基数となる。このようにして数えた全アミノ酸残基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、配列同一性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸残基数で、一致したアミノ酸残基数を除して算出される。
　なお、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Ｇｌｙ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ａｌａ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏ）、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｔｙｒ，Ｃｙｓ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ，Ｇｌｕ）、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ,Ｔｙｒ，Ｔｒｐ）のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればポリペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、本発明の上記（ａ）のポリペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループの間で置換することにより、免疫誘導活性を維持できる可能性が高くなるため、好ましい。
　上記（ｄ）のポリペプチドは、上記（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチドを部分配列として含み、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。すなわち、（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチドの一端又は両端に他のアミノ酸又はポリペプチドが付加されたものであって、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。このようなポリペプチドも、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。
　上記ポリペプチドは、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（t－ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。また、公知の遺伝子工学的手法を用いて、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、該宿主細胞中でポリペプチドを生産させることにより、目的とするポリペプチドを得ることができる。
　上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法や市販の核酸合成機を用いた常法により、容易に調製することができる。例えば、配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡは、イヌ染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号３に記載した塩基配列を増幅できるように設計した一対のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより調製することができる。配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡであれば、上記鋳型としてヒト染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを使用することで同様に調製できる。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒～１分間（アニーリング）、７２℃で１分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができるが、これに限定されない。また、本明細書中の配列表の配列番号１、３に示される塩基配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて、適当なプローブやプライマーを調製し、それを用いてヒトやイヌなどのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、所望のＤＮＡを単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、配列番号２、４のタンパク質を発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。上記のプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、ならびに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラバイオロジー等に記載された方法に準じて行うことができる。このようにして得られたＤＮＡから、上記（ａ）のポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。また、各アミノ酸をコードするコドンは公知であるから、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は容易に特定することができる。従って、上記の（ｂ）～（ｄ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列も容易に特定することができるので、そのようなポリヌクレオチドも、市販の核酸合成機を用いて常法により容易に合成することができる。
　上記宿主細胞としては、上記ポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌など、真核細胞の例としてはサル腎臓細胞ＣＯＳ１、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ等の哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
　宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。
　宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ－ＣＭＶ、ｐＢＫ－ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３.１、ｐＳｅｃＴａｇ（Ａ、Ｂ、Ｃ）、ｐＭＳＧ、ｐＹＥＳ２等が例示できる。上記と同様に、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてｐＩＮＤ／Ｖ５－Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ－２、ｐＥＧＦＰ－Ｎ１、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１等を用いた場合には、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合タンパク質として、上記ポリペプチドを発現させることができる。
　発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の周知の方法を用いることができる。
　宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられるが、これらに限定されない。
　以上の方法によって得られるポリペプチドには、上述した通り、他の任意のタンパク質との融合タンパク質の形態にあるものも含まれる。例えば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やＨｉｓタグとの融合タンパク質などが例示できる。このような融合タンパク質の形態のポリペプチドも、上記の（ｄ）のポリペプチドとして本発明の範囲に含まれる。さらに、形質転換細胞で発現されたポリペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。このような翻訳後修飾されたポリペプチドも、免疫誘導活性を有する限り、本発明の範囲に含まれる。この様な翻訳修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。
２．免疫誘導剤
　後述の実施例に具体的に記載される通り、上記の免疫誘導活性を有するポリペプチドを担癌生体に投与すると、腫瘍を退縮させることができる。従って、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療及び／又は予防剤として用いることができる。また、上記の免疫誘導活性を有するポリペプチドは、免疫誘導による癌の治療及び／又は予防方法に用いることができる。
　ここで、「腫瘍」及び「癌」という用語は、悪性新生物を意味し、互換的に使用される。
　この場合、対象となる癌としては、ＭＲＡＰ２を発現する癌であれば特に限定されないが、好ましくは正常細胞よりも有意に多くＭＲＡＰ２を発現している癌であり、具体的には、白血病、悪性リンパ腫、肺癌、脳腫瘍、大腸癌、メラノーマ、神経芽腫、膵癌、胃癌、肝癌、卵巣癌、食道癌、腎癌、肥満細胞腫もしくは肛門周囲腺癌である。これらの特定の癌には、例えば、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、無白血病性白血病、白血球血症性白血病（ｌｅｕｋｏｃｙｔｈｅｍｉｃ　ｌｅｕｋｅｍｉａ）、好塩基球性白血病、芽細胞性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄球性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病、幹細胞性白血病、亜白血性白血病、未分化細胞性白血病、有毛状細胞性白血病、血球芽細胞性白血病（ｈｅｍｏｂｌａｓｔｉｃ　ｌｅｕｋｅｍｉａ）、血球芽細胞性白血病（ｈｅｍｏｃｙｔｏｂｌａｓｔｉｃ　ｌｅｕｋｅｍｉａ）、組織球白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ向性白血病、リンパ様白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞白血病、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫（ＢＬ）、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ球性白血病（ＳＬＬ／ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、辺縁帯（ｍａｒｇｉｎａｌ　ｚｏｎｅ）リンパ腫（ＭＺＬ）、毛状細胞白血病（ＨＣＬ）、リンパ形質細胞性白血病（ＬＰＬ）、粘膜結合類リンパ組織（ＭＡＬＴ）の結節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、縦隔大細胞リンパ腫、血管内大細胞リンパ腫、原発性滲出リンパ腫、前駆Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫、前駆Ｔ細胞及びＮＫ細胞リンパ腫（前駆Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫、ＮＫ芽細胞性リンパ腫）、成熟Ｔ及びＮＫ細胞の腫瘍（抹消Ｔ細胞リンパ腫及び白血病（ＰＴＬ）を含む）、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫及び大型顆粒性リンパ球性白血病、Ｔ細胞慢性リンパ球性白血病／前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大型顆粒性リンパ球性白血病、攻撃性ＮＫ細胞白血病、結節外Ｔ－／ＮＫ細胞リンパ腫、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾臓性Ｔ細胞リンパ腫、無構造性大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、アンギオセトリック（ａｎｇｉｏｃｅｔｒｉｃ）及び血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫／セザリー症候群、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ））、ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、扁平上皮癌（類表皮癌）、肺腺癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌、神経膠腫、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、乏突起膠腫、非神経膠腫、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、原発性脳リンパ腫、胚細胞腫瘍、表在型大腸癌、腫瘤型大腸癌、潰瘍浸潤型大腸癌、びまん浸潤型大腸癌、基底細胞癌、有棘細胞癌、黒色腫、表在性拡大型黒色腫、結節型黒色腫、悪性黒子黒色腫、末端性黒子性黒色腫、神経芽細胞腫、神経節芽腫、神経節腫、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、カルチノイド、膵島細胞腫瘍、腫瘤型胃癌、潰瘍限局型胃癌、潰瘍浸潤型胃癌、びまん浸潤型胃癌、肝細胞癌及び肝芽腫、上皮性卵巣癌、境界型腫瘍、胚細胞腫瘍、間質性腫瘍、漿液性腺癌、明細胞腺癌、類内膜腺癌、移行上皮癌、粘液性腺癌、混在型卵巣癌、扁平上皮癌、食道腺癌、腎細胞癌、腎腺癌、副腎腫、腎線維肉腫、移行上皮癌（腎盂及び／又は尿管（uterer））、肥満細胞腫、肛門周囲腺腫、肛門周囲腺癌が包含されるが、これらに限定されない。
　また、対象となる被験体（動物）は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは霊長類、ペット動物、動物園等で飼育されている動物、家畜類、競技用動物などを含む哺乳動物であり、特に好ましくはヒト、イヌ又はネコである。
　本発明の免疫誘導剤の生体への投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよいが、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。癌の治療目的で該免疫誘導剤を用いる場合には、抗癌作用を高めるため、治療対象となる腫瘍の近傍の所属リンパ節に投与することもできる。投与量は、免疫誘導するのに有効な量であればよく、例えば癌の治療及び／又は予防に用いるのであれば、癌の治療及び／又は予防に有効な量であればよい。癌の治療及び／又は予防に有効な量は、腫瘍の大きさや症状等に応じて適宜選択されるが、通常、対象動物に対し１日当りの有効量として０．０００１～１０００μｇ、好ましくは０．００１～１０００μｇであり、１回又は数回に分けて投与することができる。好ましくは、数回に分け、数日ないし数月おきに投与する。後述の実施例に具体的に示されるとおり、本発明の免疫誘導剤は、腫瘍を退縮させることができる。従って、発生初期の少数の癌細胞にも抗癌作用を発揮し得るので、癌の発症前や癌の治療後に用いれば、癌の発症や再発を防止することができる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療と予防の双方に有用である。
　本発明の免疫誘導剤は、ポリペプチドのみから成っていてもよいし、各投与形態に適した、薬理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤等の添加剤を適宜混合させて製剤することもできる。製剤方法及び使用可能な添加剤は、医薬製剤の分野において周知であり、いずれの方法及び添加剤をも用いることができる。添加剤の具体例としては、生理緩衝液のような希釈剤；砂糖、乳糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等のような賦形剤；シロップ、ゼラチン、アラビアゴム、ソルビトール、ポリビニルクロリド、トラガント等のような結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、タルク、シリカ等の滑沢剤等が挙げられるが、これらに限定されない。製剤形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤、吸入剤、注射剤、座剤、液剤などの非経口剤などを挙げることができる。これらの製剤は一般的に知られている製法によって作ることができる。
　本発明の免疫誘導剤は、生体内での免疫学的応答を強化することができる免疫増強剤と組み合わせて用いることができる。免疫増強剤は、本発明の免疫誘導剤に含まれていてもよいし、別個の組成物として本発明の免疫誘導剤と併用して患者に投与してもよい。
　上記免疫増強剤としては、例えばアジュバントを挙げることができる。アジュバントは、抗原の貯蔵所（細胞外又はマクロファージ内）を提供し、マクロファージを活性化し、かつ特定組のリンパ球を刺激することにより、免疫学的応答を強化し得るので、抗癌作用を高めることができる。従って、特に、本発明の免疫誘導剤を癌の治療及び／又は予防に用いる場合、免疫誘導剤は、有効成分である上記ポリペプチドに加えてさらにアジュバントを含むことが好ましい。多数の種類のアジュバントが当業界で周知であり、いずれのアジュバントでも用いることができる。
　アジュバントの具体例としては、ＭＰＬ（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｍ）、サルモネラ属のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍｉｎｎｅｓｏｔａ　Ｒｅ　５９５リポ多糖類の精製及び酸加水分解後に得られる同類物；ＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｍ）、Ｑｕｉｌｌｊａ　ｓａｐｏｎａｒｉａ抽出物から精製される純ＱＡ－２１サポニン；ＷＯ９６/３３７３９（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｍ）に記載されたＤＱＳ２１；ＱＳ－７、ＱＳ－１７、ＱＳ－１８及びＱＳ－Ｌ１（ソ（So）、外１０名、「モレキュルズ・アンド・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ａｎｄ　ｃｅｌｌｓ）」、１９９７年、第７巻、ｐ．１７８－１８６）；フロイントの不完全アジュバント；フロイントの完全アジュバント；ビタミンＥ；モンタニド；ミョウバン；ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、クレイグ（Ｋｒｅｉｇ）、外７名、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、第３７４巻、ｐ．５４６－５４９）を参照）；ポリＩＣ及びその誘導体（ポリＩＣＬＣ等）、ならびにスクアレン及び／又はトコフェロールのような生分解性油から調製される種々の油中水エマルションが挙げられる。中でも、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリＩＣ及びその誘導体、ＣｐＧオリゴヌクレオチドが好ましい。上記アジュバントとポリペプチドの混合比は、典型的には約１：１０～１０：１、好ましくは約１：５～５：１、より好ましくは約１：１である。ただし、アジュバントは上記例示に限定されず、当業界で公知の上記以外のアジュバントも本発明の免疫誘導剤を投与する際に用いられ得る（例えば、ゴッディング（Ｇｏｄｉｎｇ）著,「モノクローナル・アンチボディーズ：プリンシプル・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、第２版、１９８６年を参照）。ポリペプチド及びアジュバントの混合物又はエマルションの調製方法は、予防接種の当業者には周知である。
　また、上記免疫増強剤としては、上記アジュバント以外にも、対象の免疫応答を刺激する因子を用いることもできる。例えば、リンパ球や抗原提示細胞を刺激する特性を有する各種サイトカインを免疫増強剤として本発明の免疫誘導剤と組み合わせて用いることができる。そのような免疫学的応答を増強可能な多数のサイトカインが当業者に公知であり、その例としては、ワクチンの防御作用を強化することが示されているインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ及びＦｌｔ３リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。このような因子も上記免疫増強剤として用いることができ、本発明の免疫誘導剤に含ませて又は別個の組成物として本発明の免疫誘導剤と併用して患者に投与することができる。
３．抗原提示細胞又は細胞障害性Ｔ細胞
　上記ポリペプチドと（被験体由来の）抗原提示細胞とをｅｘ　ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドを抗原提示細胞に提示させることができる。すなわち、上記の（ａ）～（ｄ）のポリペプチドは、抗原提示細胞の処理剤として利用し得る。ここで、抗原提示細胞としては、ＭＨＣクラスＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞を好ましく用いることができる。種々のＭＨＣクラスＩ分子が同定されており、周知である。ヒトにおけるＭＨＣ分子はＨＬＡと呼ぶ。ＨＬＡクラスＩ分子としては、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃを挙げることができ、より具体的には、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ０２０１、ＨＬＡ－Ａ０２０４、ＨＬＡ－Ａ０２０５、ＨＬＡ－Ａ０２０６、ＨＬＡ－Ａ０２０７、ＨＬＡ－Ａ１１、ＨＬＡ－Ａ２４、ＨＬＡ－Ａ３１、ＨＬＡ－Ａ６８０１、ＨＬＡ－Ｂ７、ＨＬＡ－Ｂ８、ＨＬＡ－Ｂ２７０５、ＨＬＡ－Ｂ３７、ＨＬＡ－Ｃｗ０４０１、ＨＬＡ－Ｃｗ０６０２などを挙げることができる。
　ＭＨＣクラスＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞は、周知の方法により末梢血から調製することができる。例えば、骨髄、臍帯血あるいは患者末梢血から、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）とＩＬ－３（あるいはＩＬ－４）を用いて樹状細胞を誘導し、その培養系に腫瘍関連ペプチドを加えることにより、腫瘍特異的な樹状細胞を誘導することができる。
　この樹状細胞を有効量投与することで、癌の治療に望ましい応答を誘導できる。用いる細胞は、健康人から提供された骨髄や臍帯血、患者本人の骨髄や末梢血等を用いることができるが、患者本来の自家細胞を使う場合は、安全性が高く、重篤な副作用を回避することも期待できる。末梢血又は骨髄は新鮮試料、低温保存試料及び凍結保存試料のいずれでもよい。末梢血は、全血を培養してもよいし、白血球成分だけを分離して培養してもよいが、後者の方が効率的で好ましい。さらに白血球成分の中でも単核球を分離してもよい。また、骨髄や臍帯血を起源とする場合には、骨髄を構成する細胞全体を培養してもよいし、これから単核球を分離して培養してもよい。末梢血やその白血球成分、骨髄細胞には、樹状細胞の起源となる単核球、造血幹細胞又は未成熟樹状細胞やＣＤ４陽性細胞等が含まれている。用いられるサイトカインは、安全性と生理活性が確認された特性のものであれば、天然型、あるいは遺伝子組み換え型等、その生産手法については問わないが、好ましくは医療用に用いられる品質が確保された標品が必要最低量で用いられる。添加するサイトカインの濃度は、樹状細胞が誘導される濃度であれば特に限定されず、通常サイトカインの合計濃度で１０～１０００ｎｇ／ｍＬ程度が好ましく、より好ましくは２０～５００ｎｇ／ｍＬ程度である。培養は、白血球の培養に通常用いられている周知の培地を用いて行うことができる。培養温度は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、ヒトの体温である３７℃程度が最も好ましい。また、培養中の気体環境は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、５％ＣＯ２を通気することが好ましい。さらに培養期間は、必要数の細胞が誘導される期間であれば特に限定されないが、通常３日～２週間の間で行われる。細胞の分離や培養に供される機器は、適宜適当なものを用いることができるが、医療用に安全性が確認され、かつ操作が安定して簡便であることが好ましい。特に細胞培養装置については、シャーレ、フラスコ、ボトル等の一般的容器に拘わらず、積層型容器や多段式容器、ローラーボトル、スピナー式ボトル、バッグ式培養器、中空糸カラム等も用いることができる。
　上記ポリペプチドと抗原提示細胞とをｅｘ　ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させる方法自体は、周知の方法により行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を、上記ポリペプチドを含む培養液中で培養することにより行なうことができる。培地中のペプチド濃度は、特に限定されないが、通常１～１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは５～２０μｇ／ｍｌ程度である。培養時の細胞密度は特に限定されないが、通常１０３～１０７細胞／ｍｌ程度、好ましくは５×１０４～５×１０６細胞／ｍｌ程度である。培養は、常法に従い、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で行なうことが好ましい。なお、抗原提示細胞が表面上に提示できるペプチドの長さは、通常、最大で３０アミノ酸残基程度である。従って、特に限定されないが、抗原提示細胞とポリペプチドをｅｘ　ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させる場合、該ポリペプチドをおよそ３０アミノ酸残基以下の長さに調製してもよい。
　上記ポリペプチドの共存下において抗原提示細胞を培養することにより、ペプチドが抗原提示細胞のＭＨＣ分子に取り込まれ、抗原提示細胞の表面に提示される。従って、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞を調製することができる。
　よって、本発明はまた、上記のポリペプチドと被験体由来の抗原提示細胞とをｅｘ　ｖｉｖｏ又はインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で接触させることを含む、該ポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含む抗原提示細胞の作製方法を提供する。
　本発明はまた、この方法によって得られる、かつ上記のポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含むことを特徴とする、抗原提示細胞を提供する。
　上記のようにして調製される、上記ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体とを含む抗原提示細胞を、Ｔ細胞とｅｘ　ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。これは、上記抗原提示細胞とＴ細胞とを液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を液体培地に懸濁して、マイクロプレートのウェル等の容器に入れ、これにＴ細胞を添加して培養することにより行なうことができる。共存培養時の抗原提示細胞とＴ細胞の混合比率は、特に限定されないが、通常、細胞数の比率で１：１～１：１００程度、好ましくは１：５～１：２０程度である。また、液体培地中に懸濁する抗原提示細胞の密度は、特に限定されないが、通常、１００～１０００万細胞／ｍｌ程度、好ましくは１００００～１００万細胞／ｍｌ程度である。共存培養は、常法に従い、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で行なうことが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、通常、２日～３週間、好ましくは４日～２週間程度である。また、共存培養は、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－７及びＩＬ－１２のようなインターロイキンの１種又は複数の存在下で行なうことが好ましい。この場合、ＩＬ－２及びＩＬ－７の濃度は、通常５～２０Ｕ／ｍｌ程度、ＩＬ－６の濃度は通常５００～２０００Ｕ／ｍｌ程度、ＩＬ－１２の濃度は通常５～２０ｎｇ／ｍｌ程度であるが、これらに限定されるものではない。上記の共存培養は、新鮮な抗原提示細胞を追加して１回ないし数回繰り返してもよい。例えば、共存培養後の培養上清を捨て、新鮮な抗原提示細胞の懸濁液を添加してさらに共存培養を行なうという操作を、１回ないし数回繰り返してもよい。各共存培養の条件は、上記と同様でよい。
　上記の共存培養により、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞が誘導され、増殖される。従って、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体に選択的に結合する、単離Ｔ細胞を調製することができる。
　よって、本発明はさらに、上記の抗原提示細胞と被験体由来のＴ細胞とをｅｘ　ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させて該Ｔ細胞を活性化することを含む、上記のポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞の作製方法を提供する。
　本発明はまた、この方法によって得られる、かつ上記のポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を提供する。
　後述の実施例に記載される通り、ＭＲＡＰ２遺伝子は、白血病、悪性リンパ腫、肺癌、脳腫瘍、大腸癌、メラノーマ、神経芽腫、膵癌、胃癌、肝癌、卵巣癌、食道癌、腎癌、肥満細胞腫又は肛門周囲腺癌に特異的に発現している。従って、これらの癌種においては、ＭＲＡＰ２が正常細胞よりも有意に多く存在していると考えられる。癌細胞内に存在するＭＲＡＰ２のポリペプチドの一部が癌細胞表面上のＭＨＣ分子に提示されるよう、上記のようにして調製した細胞障害性Ｔ細胞が生体内に投与されると、これを目印として細胞障害性Ｔ細胞が癌細胞を障害することができる。また、ＭＲＡＰ２のポリペプチドの一部を提示する抗原提示細胞は、生体内においても該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができるので、該抗原提示細胞を生体内に投与することによっても、癌細胞を障害することができる。すなわち、上記ポリペプチドを用いて調製された上記細胞障害性Ｔ細胞や上記抗原提示細胞もまた、本発明の免疫誘導剤と同様に、癌の治療及び／又は予防剤として有用である。
　上記の単離抗原提示細胞や単離Ｔ細胞を被験体に投与する場合には、これらの細胞を異物として攻撃する生体内での免疫応答を回避するために、治療を受ける患者から採取した抗原提示細胞又はＴ細胞を、上記のように上記（ａ）～（ｄ）のポリペプチドを用いて調製したものであることが好ましい。
　単離抗原提示細胞又は単離Ｔ細胞を有効成分として含む癌の治療及び／又は予防剤の投与経路は、静脈内投与や動脈内投与のような非経口投与が好ましい。また、投与量は、症状や投与目的等に応じて適宜選択されるが、通常１個～１０兆個、好ましくは１００万個～１０億個であり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。製剤は、例えば、細胞を生理緩衝食塩水に懸濁したもの等であってよく、他の抗癌剤やサイトカイン等と併用することもできる。また、製剤分野において周知の１又は２以上の添加剤を添加することもできる。
４．ＤＮＡワクチン
　また、上記（ａ）～（ｄ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象動物の体内で発現させることによっても、該生体内で抗体生産や細胞障害性Ｔ細胞を誘導することができ、ポリペプチドを投与するのと同等の効果が得られる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、上記の（ａ）～（ｄ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含むものであってもよい。後述の実施例に示されるように、このような抗原ポリペプチドを発現可能な組換えベクターは、ＤＮＡワクチンとも呼ばれる。
　ＤＮＡワクチンを製造するために用いるベクターは、対象動物細胞内（好ましくは哺乳動物細胞内）で発現可能なベクターであれば特に限定されず、プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよく、ＤＮＡワクチンの分野で公知のいかなるベクターを用いてもよい。なお、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡやＲＮＡ等のポリヌクレオチドは、上述した通り、常法により容易に調製することができる。また、ベクターへの該ポリヌクレオチドの組み込みは、当業者に周知の方法を用いて行なうことができる。
　ＤＮＡワクチンの投与経路は、好ましくは筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与経路であり、投与量は、抗原の種類等に応じて適宜選択することができるが、通常、体重１ｋｇ当たり、ＤＮＡワクチンの重量で０．１μｇ～１００ｍｇ程度、好ましくは１μｇ～１０ｍｇ程度である。
　ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連（「アデノ随伴」とも称する。）ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス等のＲＮＡウイルス又はＤＮＡウイルスに、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込み、これを対象動物に感染させる方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
　その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
　本発明で用いられる上記ポリペプチドをコードする遺伝子を実際に医薬として作用させるには、遺伝子を直接体内に導入するｉｎ　ｖｉｖｏ方法、及び対象動物からある種の細胞を採取し体外で遺伝子を該細胞に導入しその細胞を体内に戻すｅｘ　ｖｉｖｏ方法があるが（日経サイエンス，１９９４年４月，ｐ２０－４５、月刊薬事，１９９４年，第３６巻，第１号，ｐ．２３－４８、実験医学増刊，１９９４年，第１２巻，第１５号、及びこれらの引用文献等）、ｉｎ　ｖｉｖｏ方法がより好ましい。
　ｉｎ　ｖｉｖｏ方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することが出来る。ｉｎ　ｖｉｖｏ方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には、有効成分である本発明の上記ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、該ＤＮＡを含有するリポソーム又は膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）－リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
　なお、本発明において、例えば「配列番号１に示される塩基配列」と言った場合には、配列番号１に実際に示されている塩基配列の他、これと相補的な配列も包含する。従って、例えば「配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド」と言った場合には、配列番号１に実際に示されている塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、その相補的な塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、及びこれらから成る二本鎖ポリヌクレオチドが包含される。本発明で用いられるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製する場合には、適宜いずれかの塩基配列を選択することとなるが、当業者であれば容易にその選択をすることができる。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
（実施例１）ＳＥＲＥＸ法による新規癌抗原タンパクの取得
（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
　犬の精巣から酸－グアニジウム－フェノール－クロロフォルム法（Ａｃｉｄ　ｇｕａｎｉｄｉｕｍ－Ｐｈｅｎｏｌ－Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法）により全ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ－ｄＴ３０　ｍＲＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（宝酒造株式会社製）を用いてキット添付のプロトコールに従ってポリＡ　ＲＮＡを精製した。
　この得られたｍＲＮＡ（５μｇ）を用いてｃＤＮＡファージライブラリーを合成した。ｃＤＮＡファージライブラリーの作製にはｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ，Ｚａｐ－ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ，ＺＡＰ－ｃＤＮＡ　ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ　Ｇｏｌｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、キット添付のプロトコールに従ってライブラリーを作製した。作製したｃＤＮＡファージライブラリーのサイズは１×１０６ｐｆｕ／ｍｌであった。
（２）血清によるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
　上記作製したｃＤＮＡファージライブラリーを用いて、イムノスクリーニングを行った。具体的にはΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレートに約２５００クローンとなるように宿主大腸菌（ＸＬ１－Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ'）に感染させ、４２℃、３～４時間培養し、溶菌斑（プラーク）を作らせ、ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド）を浸透させたニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ　Ｃ　Ｅｘｔｒａ:ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｅｃａｒｅ　Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｃｅ社製）でプレートを３７℃で４時間覆うことによりタンパク質を誘導・発現させ、メンブレンにタンパク質を転写した。その後メンブレンを回収し０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．５）に浸し４℃で一晩振盪することによって非特異反応を抑制した。このフィルターを５００倍希釈した患犬血清と室温で２～３時間反応させた。
　上記患犬血清としては、白血病の患犬より採取した血清を用いた。これらの血清は－８０℃で保存し、使用直前に前処理を行った。血清の前処理方法は、以下の方法による。すなわち、外来遺伝子を挿入していないλ　ＺＡＰ　Ｅｘｐｒｅｓｓファージを宿主大腸菌（ＸＬ１－ＢＬｕｅ　ＭＲＦ'）に感染させた後、ＮＺＹプレート培地上で３７℃、一晩培養した。次で０．５Ｍ　ＮａＣｌを含む０．２Ｍ　ＮａＨＣＯ３　ｐＨ８．３のバッファーをプレートに加え、４℃で１５時間静置後、上清を大腸菌／ファージ抽出液として回収した。次に、回収した大腸菌／ファージ抽出液をＮＨＳ－カラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｅｃａｒｅ　Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）に通液して、大腸菌・ファージ由来のタンパク質を固定化した。このタンパク固定化カラムに患犬血清を通液・反応させ、大腸菌及びファージに吸着する抗体を血清から取り除いた。カラムを素通りした血清画分は、０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５００倍希釈し、これをイムノスクリーニング材料とした。
　かかる処理血清とタンパク質をブロットした上記メンブレンをＴＢＳ－Ｔ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）にて４回洗浄を行った後、二次抗体として０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５０００倍希釈を行ったヤギ抗イヌＩｇＧ（Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ　Ｄｏｇ　ＩｇＧ－ｈ＋Ｌ　ＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ:ＢＥＴＨＹＬ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を、室温1時間反応させ、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ反応液（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた酵素発色反応により検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌＳＯ４、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．０１％　ゼラチン　ｐＨ７．５）５００μlに溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、血清中のＩｇＧと反応する約１００００個のファージクローンをスクリーニングして、１個の陽性クローンを単離した。
（３）単離抗原遺伝子の配列同一性検索
　上記方法により単離した１個の陽性クローンを塩基配列解析に供するため、ファージベクターからプラスミドベクターに転換する操作を行った。具体的には宿主大腸菌（ＸＬ１－Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ'）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μlと、精製したファージ溶液１００μｌさらにＥｘＡｓｓｉｓｔ　ｈｅｌｐｅｒ　ｐｈａｇｅ　（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）１μｌを混合した後３７℃で１５分間反応後、ＬＢ培地を３ｍｌ添加し３７℃で２．５～３時間培養を行い、直ちに７０℃の水浴にて２０分間保温した後、４℃、１０００×ｇ、１５分間遠心を行い、上清をファージミド溶液として回収した。次いでファージミド宿主大腸菌（ＳＯＬＲ）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μlと、精製したファージ溶液１０μｌを混合した後３７℃で１５分間反応させ、５０μlをアンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に播き３７℃一晩培養した。トランスフォームしたＳＯＬＲのシングルコロニーを採取し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地３７℃にて培養後、ＱＩＡＧＥＮ　ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ(キアゲン社製）を使って目的のインサートを持つプラスミドＤＮＡを精製した。
　精製したプラスミドは、配列番号９に記載のＴ３プライマーと配列番号１０に記載のＴ７プライマーを用いて、プライマーウォーキング法によるインサート全長配列の解析を行った。このシークエンス解析により配列番号３に記載の遺伝子配列を取得した。この遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を用いて、配列同一性検索プログラムＢＬＡＳＴサーチ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を行い既知遺伝子との配列同一性検索を行った結果、得られた遺伝子はＭＲＡＰ２遺伝子であることが判明した。イヌＭＲＡＰ２のヒト相同因子であるヒトＭＲＡＰ２では、配列同一性が塩基配列９１％、アミノ酸配列９４％であり、ネコ相同因子であるネコＭＲＡＰ２では配列同一性は塩基配列９５％、アミノ酸配列９６％であり、マウス相同因子であるマウスＭＲＡＰ２では配列同一性は塩基配列８４％、アミノ酸配列８８％であった。ヒトＭＲＡＰ２の塩基配列を配列番号１、アミノ酸配列を配列番号２に、ネコＭＲＡＰ２の塩基配列を配列番号５、アミノ酸配列を配列番号６に、マウスＭＲＡＰ２の塩基配列を配列番号７、アミノ酸配列を配列番号８に示す。
（４）各組織での遺伝子発現解析
　上記方法により得られた遺伝子に対しイヌ、ヒト及びマウスの各種正常組織、各種腫瘍組織及び各種癌細胞株における発現をＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＰＣＲ）法により調べた。逆転写反応は以下の通り行った。すなわち、各組織５０～１００ｍｇ及び各細胞株５～１０×１０６個の細胞からＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ＲＴ－ＰＣＲ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）により添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。ヒト正常組織（脳、精巣、結腸、胎盤）のｃＤＮＡは、ジーンプールｃＤＮＡ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ＱＵＩＣＫ－Ｃｌｏｎｅ　ｃＤＮＡ（クロンテック社製）及びＬａｒｇｅ－Ｉｎｓｅｒｔ　ｃＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ（クロッンテック社製）を用いた。ＰＣＲ反応は、取得した遺伝子特異的なプライマー（イヌプライマーは配列番号１１及び１２、ヒトプライマーは配列番号１３及び１４、マウスプライマーは配列番号１５及び１６に記載）を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したサンプル０．２５μｌ、上記プライマーを各２μＭ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．６５ＵのＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を２５μlとし、Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ(ＢＩＯ　ＲＡＤ社製）を用いて、９４℃－３０秒、５５℃－３０秒、７２℃－１分のサイクルを３０回繰り返して行った。その結果、図１に示すように、イヌＭＲＡＰ２遺伝子は、イヌ腫瘍組織では肥満細胞腫、肛門周囲腺癌で強い発現が見られた（図１）。ヒトＭＲＡＰ２遺伝子発現においては、健常なヒト組織ではほとんどの組織で発現が見られず、一方、ヒト癌細胞では白血病、悪性リンパ腫、肺癌、脳腫瘍、大腸癌、膵癌、胃癌、肝癌、卵巣癌、食道癌、腎癌の細胞株で強い発現が見られた（図２）。さらに、マウスＭＲＡＰ２遺伝子の発現は、白血病、メラノーマ、神経芽腫の細胞株で発現が検出された（図３）。
（実施例２）ＭＲＡＰ２の生体内での癌抗原性の解析
（１）生体内でマウスＭＲＡＰ２を発現する組換えベクターの作製
　配列番号７の塩基配列を基に、以下の方法にて、生体内でマウスＭＲＡＰ２を発現する組換えベクターを作製した。ＰＣＲは、実施例１において発現の見られたマウス白血病細胞株ＥＬ４（ＡＴＣＣより購入）より調製した。ｃＤＮＡを１μｌ、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号１７及び１８に記載）を各０．４μＭ、０．２ｍＭ　ｄＮＴＰ、１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μlとし、Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ　ＲＡＤ社製）を用いて、９８℃－１０秒、５５℃－１５秒、７２℃－１分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号８のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約６００ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
　精製したＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔで精製後、目的遺伝子配列を、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で処理した哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入した（以下、マウスＭＲＡＰ２／ｐｃＤＮＡ３．１）。このベクターの使用により哺乳類の細胞内でマウスＭＲＡＰ２タンパクが産生される。
　上記で作製したプラスミドＤＮＡ１００μｇに５０μｇの金粒子（Ｂｉｏ　Ｒａｄ社製）、スペルミジン１００μｌ（ＳＩＧＭＡ社製）、１Ｍ　ＣａＣｌ２　１００μｌ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加し、ボルテックスによって攪拌し１０分室温で静置した（以後金-ＤＮＡ粒子と記載する）。３０００ｒｐｍで１分遠心した後、上清を捨て１００％　エタノール（ＷＡＫＯ社製）によって３回洗浄した。金－ＤＮＡ粒子に１００％　エタノール６ｍｌを加えボルテックスによって十分に攪拌した後、金－ＤＮＡ粒子をＴｅｆｚｅｌ　Ｔｕｂｉｎｇ（Ｂｉｏ　Ｒａｄ社製）に流し込み、壁面に沈殿させた。金－ＤＮＡ粒子が付着したＴｅｆｚｅｌ　Ｔｕｂｉｎｇのエタノールを風乾し、遺伝子銃に適した長さにカットした（以下、マウスＭＲＡＰ２／チューブ）。
（２）ＤＮＡワクチン法によるマウスＭＲＡＰ２の抗腫瘍効果－１
　５匹のＡ／Ｊマウス（７週齢、雄、日本ＳＬＣ社から購入）に対して、上記で作製したチューブ（マウスＭＲＡＰ２／チューブ）を遺伝子銃に固定し、純ヘリウムガスを用いて４００ｐｓｉの圧力で、剃毛したマウスの腹腔にＤＮＡワクチンを７日ごとに計３回、経皮投与した後に（プラスミドＤＮＡ接種量は２μｇ／匹になる）実施例１においてＭＲＡＰ２遺伝子の発現の見られたマウス白血病細胞株ＥＬ４細胞を移植して抗腫瘍効果を評価した（予防モデル）。なお、コントロールとして、マウスＭＲＡＰ２遺伝子が挿入されていないプラスミドＤＮＡを予防モデルで５匹投与した。
　抗腫瘍効果は、腫瘍の大きさ（長径×短径２／２）及び生存マウスの割合で評価した。本検討の結果、予防モデルにおいて、２８日後には、コントロール群及びマウスＭＲＡＰ２プラスミド投与群で、それぞれ、１３５９ｍｍ３、６０１ｍｍ３となり、マウスＭＲＡＰ２プラスミド投与群では腫瘍の顕著な退縮が観察された。また、生存の経過を観察した結果、予防モデルにおいて、コントロール群では投与後６１日で全例死亡したのに対し、マウスＭＲＡＰ２プラスミド投与群では、６０％のマウスが生存していた。以上の結果から、マウスＭＲＡＰ２プラスミド投与群はコントロール群に比べて有意な抗腫瘍効果が認められた。
（３）ＤＮＡワクチン法によるマウスＭＲＡＰ２の抗腫瘍効果－２
　５匹のＡ／Ｊマウス（７週齢、雄、日本ＳＬＣ社から購入）に対して、上記で作製したチューブ（マウスＭＲＡＰ２／チューブ）を遺伝子銃に固定し、純ヘリウムガスを用いて４００ｐｓｉの圧力で、剃毛したマウスの腹腔にＤＮＡワクチンを７日ごとに計３回、経皮投与した後に（プラスミドＤＮＡ接種量は２μｇ／匹になる）実施例１において発現の見られたマウスメラノーマ細胞株Ｂ１６細胞を移植して抗腫瘍効果を評価した（予防モデル）。なお、コントロールとして、マウスＭＲＡＰ２遺伝子が挿入されていないプラスミドＤＮＡを予防モデルで５匹投与した。
　抗腫瘍効果は、腫瘍の大きさ（長径×短径２／２）及び生存マウスの割合で評価した。本検討の結果、予防モデルにおいて、２８日後には、コントロール群及びマウスＭＲＡＰ２プラスミド投与群で、それぞれ、９３６ｍｍ３、４８３ｍｍ３となり、マウスＭＲＡＰ２プラスミド投与群では腫瘍の顕著な退縮が観察された。また、生存の経過を観察した結果、予防モデルにおいて、コントロール群では投与後６８日で全例死亡したのに対し、マウスＭＲＡＰ２プラスミド投与群では、６０％のマウスが生存していた。以上の結果から、マウスＭＲＡＰ２プラスミド投与群はコントロール群に比べて有意な抗腫瘍効果が認められた。
（４）生体内でヒトＭＲＡＰ２を発現する組換えベクターの作製
　配列番号１の塩基配列を基に、以下の方法にて、生体内でヒトＭＲＡＰ２を発現する組換えベクターを作製した。ＰＣＲは、実施例１において発現の見られたヒト白血病細胞株Ｋ５６２（ＡＴＣＣより購入）より調製した。ｃＤＮＡを１μｌ、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号１９及び２０に記載）を各０．４μＭ、０．２ｍＭ　ｄＮＴＰ、１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μlとし、Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ　ＲＡＤ社製）を用いて、９８℃－１０秒、５５℃－１５秒、７２℃－１分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号２のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約６００ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
　精製したＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔで精製後、目的遺伝子配列を、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で処理した哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入した（以下、ヒトＭＲＡＰ２／ｐｃＤＮＡ３．１）。このベクターの使用により哺乳類の細胞内でヒトＭＲＡＰ２タンパクが産生される。
　上記で作製したプラスミドＤＮＡ１００μｇに５０μｇの金粒子（Ｂｉｏ　Ｒａｄ社製）、スペルミジン１００μｌ（ＳＩＧＭＡ社製）、１Ｍ　ＣａＣｌ２　１００μｌ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加し、ボルテックスによって攪拌し１０分室温で静置した（以後金-ＤＮＡ粒子と記載する）。３０００ｒｐｍで１分遠心した後、上清を捨て１００％　エタノール（ＷＡＫＯ社製）によって３回洗浄した。金－ＤＮＡ粒子に１００％　エタノール６ｍｌを加えボルテックスによって十分に攪拌した後、金－ＤＮＡ粒子をＴｅｆｚｅｌ　Ｔｕｂｉｎｇ（Ｂｉｏ　Ｒａｄ社製）に流し込み、壁面に沈殿させた。金－ＤＮＡ粒子が付着したＴｅｆｚｅｌ　Ｔｕｂｉｎｇのエタノールを風乾し、遺伝子銃に適した長さにカットした（以下、ヒトＭＲＡＰ２／チューブ）。
（５）全長ヒトＭＲＡＰ２定常発現細胞の樹立
　上記で作製したヒトＭＲＡＰ２／ｐｃＤＮＡ３．１をマウス神経芽細胞腫細胞株Ｎ２ａ細胞（ＡＴＣＣ社）へリポフェクション法により導入し、５００μｇ/ｍｌのＧ４１８（ナカライ社）による選抜により、全長ヒトＭＲＡＰ２を定常的に発現するＮ２ａ細胞株を樹立した（Ｎ２ａ－ヒトＭＲＡＰ２）。また、ヒトＭＲＡＰ２をコードするｃＤＮＡが挿入されていない発現ベクター（以下、ｅｍｐ/ｐｃＤＮＡ３．１）を上記と同様に導入して選抜した細胞をコントロール細胞とした（以下、Ｎ２ａ－ｅｍｐ）。
（６）ＤＮＡワクチン法によるヒトＭＲＡＰ２の抗腫瘍効果
　５匹のＡ／Ｊマウス（７週齢、雄、日本ＳＬＣ社から購入）に対して、上記で作製したチューブ（ヒトＭＲＡＰ２／チューブ）を遺伝子銃に固定し、純ヘリウムガスを用いて４００ｐｓｉの圧力で、剃毛したマウスの腹腔にＤＮＡワクチンを７日ごとに計３回、経皮投与した後に（プラスミドＤＮＡ接種量は２μｇ／匹になる）上記で作製したＮ２ａ－ヒトＭＲＡＰ２又はＮ２ａ－ｅｍｐをそれぞれ移植して抗腫瘍効果を評価した（予防モデル）。なお、コントロールとして、ヒトＭＲＡＰ２遺伝子が挿入されていないプラスミドＤＮＡを予防モデルで５匹投与した。
　抗腫瘍効果は、腫瘍の大きさ（長径×短径２／２）及び生存マウスの割合で評価した。本検討の結果、Ｎ２ａ－ヒトＭＲＡＰ２の予防モデルにおいて、２８日後には、コントロール群及びヒトＭＲＡＰ２プラスミド投与群で、それぞれ、１３７９ｍｍ３、５１３ｍｍ３となり、ヒトＭＲＡＰ２プラスミド投与群では腫瘍の顕著な退縮が観察された。また、生存の経過を観察した結果、コントロール群では投与後６１日で全例死亡したのに対し、ヒトＭＲＡＰ２プラスミド投与群では、６０％のマウスが生存していた。以上の結果から、Ｎ２ａ－ヒトＭＲＡＰ２の予防モデルにおいて、ヒトＭＲＡＰ２プラスミド投与群はコントロール群に比べて有意な抗腫瘍効果が認められた。一方、Ｎ２ａ－ｅｍｐの予防モデルにおいては、ヒトＭＲＡＰ２プラスミド投与群はコントロール群に比べて有意な抗腫瘍効果は認められなかった。
　本発明は、各種癌に対して抗腫瘍活性を発揮するポリペプチドを含む免疫誘導剤を提供するため、癌の治療及び／又は予防に有用である。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。

Claims (11)

  1. 　以下の（ａ）～（ｄ）のポリペプチドから選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター、を有効成分として含有する免疫誘導剤。
    （ａ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上から全長以下のアミノ酸から成るポリペプチド
    （ｂ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （ｃ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （ｄ）前記（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
  2. 　抗原提示細胞の処理剤である、請求項１に記載の免疫誘導剤。
  3. 　癌の治療及び／又は予防剤の有効成分である、請求項１に記載の免疫誘導剤。
  4. 　前記癌がＭＲＡＰ２を発現する癌である、請求項３に記載の免疫誘導剤。
  5. 　前記癌が、白血病、悪性リンパ腫、肺癌、脳腫瘍、大腸癌、メラノーマ、神経芽腫、膵癌、胃癌、肝癌、卵巣癌、食道癌、腎癌、肥満細胞腫又は肛門周囲腺癌である、請求項３又は４に記載の免疫誘導剤。
  6. 　免疫増強剤をさらに含む、請求項１～５のいずれかに記載の免疫誘導剤。
  7. 　前記免疫増強剤が、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリＩＣ及びその誘導体、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、インターロイキン１２、インターロイキン１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ、及びＦｌｔ３リガンドから成る群より選ばれる少なくとも一つである、請求項６に記載の免疫誘導剤。
  8. 　請求項１に定義するポリペプチドと被験体由来の抗原提示細胞とをｅｘ　ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させることを含む、該ポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含む抗原提示細胞の作製方法。
  9. 　前記抗原提示細胞が、ＭＨＣクラスＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞である、請求項８に記載の方法。
  10. 　請求項８又は９に記載の方法によって得られる抗原提示細胞と被験体由来のＴ細胞とをｅｘ　ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させて該Ｔ細胞を活性化することを含む、請求項１に定義するポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞の作製方法。
  11. 　以下の（ａ）～（ｄ）のポリペプチドから選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター、を被験体に投与することを含む、免疫誘導方法。
    （ａ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上から全長以下のアミノ酸から成るポリペプチド
    （ｂ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （ｃ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （ｄ）前記（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
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