DE69233186T2

DE69233186T2 - Karcinoembryonale antigen expremierende rekombinante viren und methoden ihrer anwendung

Info

Publication number: DE69233186T2
Application number: DE69233186T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey Schlom; Judith Kantor
Original assignee: National Institutes of Health NIH
Current assignee: National Institutes of Health NIH
Priority date: 1991-05-06
Filing date: 1992-05-06
Publication date: 2004-06-03
Anticipated expiration: 2012-05-07
Also published as: US5698530A; JPH06508025A; DK0584266T3; ES2206446T3; AU674492B2; JP3399943B2; EP0584266B1; EP0584266A4; ATE248924T1; AU2006092A; CA2102623C; EP0584266A1; DE69233186D1; CA2102623A1; WO1992019266A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen ein rekombinantes Virus. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Vaccinia-Virus oder andere Virus-Vektoren, in die karzinoembryonales Antigen eingesetzt wurde, die in der Lage sind, eine aktive Immunantwort hervorzurufen.
Karzinoembryonales Antigen (CEA) ist ein stark glycolysiertes Protein von 180.000 Dalton, das in den meisten Gastrointestinalkarzinomen einschließlich einer großen Zahl primärer und metastatischer Kolon- und Rektumtumore exprimiert wird und auch in einigen normalen, aus dem Entoderm entwickelten Geweben auftritt, allerdings in sehr viel niedrigeren Konzentrationen.
CEA wurde das erste Mal 1965 beschrieben, das Gen wurde jedoch bis 1987 weder isoliert, noch seine Sequenz bestimmt (siehe Oikawa et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 142: 511–518 (1987)). CEA ist eins der meistuntersuchten der onkofetalen, Tumor-assoziierten Antigene. CEA wurde klinisch bei der postoperativen Überwachung von Patienten nach Primärtumorresektion verwendet. Außerdem wurden monoklonale anti-CEA-Antikörper erfolgreich in der diagnostischen Darstellung von Kolonprimärtumoren angewandt, sowie in der Immunolokalisation metastatischer Erkrankungen (siehe z. B. Sikorska et al., Cancer Det. Prev. 12: 321–355 (1988); Goldenberg et al., „Cancer diagnosis and therapy with radiolabeled antibodies." In: C. W. Vogel (ed.), Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy of Cancer, S. 259–280. New York: Oxford University Press, 1987; Mach et al., Immunol. Today 2: 239–249 (1981)).
Während CEA im Allgemeinen als in Menschen nur schwach immunogen betrachtet wird (kein Anzeichen für eine humorale oder zellvermittelte Immunität auf CEA in normalen oder Krebspatienten ist festgestellt worden), betrifft die vorliegende Erfindung die gleichzeitige Verabreichung von CEA mit einem starken Immunogen, um eine Anti-CEA-Antwort in vivo hervorzurufen, d. h. in der Tumorimmuntherapie.
Das Vaccinia-Virus ist stark immunogen und ruft sowohl humorale, als auch zellvermittelte Antworten hervor; es ist auch in der Lage, Tumorantigene mit Major-Histocompatibility-Complex-Antigenen von Zellen anzubieten. Außerdem ist die Verwendung des rekombinanten Vaccinia-Virus in vivo vorteilhaft aufgrund seiner Sicherheit, Wirksamkeit und seines Preises. Die Virulenz des Virus kann durch Verwendung unterschiedlicher Stämme des Virus verringert werden; Zerstörung des viralen Thymidinkinase-Gens (TK) oder von Teilen davon führt ebenfalls zu einem stark attenuierten Vaccinia-Virus; das Virus ist über lange Zeiträume stabil und kann leicht großen Bevölkerungsteilen verabreicht werden; die Entwicklungskosten eines Impfstoffes mit Vaccinia als Vektor sind geringer, als die vieler anderer Verfahren der Impfstoffentwicklung; außerdem können rekombinante Vaccinia-Viren bei Personen angewandt werden, die vorher dem Vaccinia-Virus ausgesetzt waren, ohne dass die Immunogenität des gemeinsam mit ihm verabreichten Antigens verringert würde.
In der Vergangenheit wurden rekombinante Vaccinia-Virus-Konstrukte gegen eine Reihe infektiöser Krankheiten, darunter Hepatitis B, Herpes-simplex-Virus, Parainfluenza Typ 3 und Lassafiebervirus, präpariert und effektiv verwendet (Moss et al., Nature 311: 67–69 (1984); Wachsman et al., Biosci. Rep. 8: 323–334 (1988); Spriggs et al., J. Virol. 62: 1293–1296 (1988); bzw. Fisher-Hoch et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 317–321 (1989)). Schutz gegen Tumorkontakt wurde ebenfalls in Tiermodellen unter Verwendung rekombinanter Vaccinia-Viren gezeigt (siehe Lathe et al., Nature (London) 326: 878–880 (1987); Bernards et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 6854–6858 (1987); Estin et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85: 1052–1056 (1988)).
Die vorliegende Erfindung ermöglicht Verfahren zur Behandlung von Karzinomen, die das CEA-Protein exprimieren, einschließlich gastrointestinaler und anderer Karzinome, die CEA exprimieren, unter Verwendung eines rekombinanten CEA-Vaccinia-Virus. „Karzinombehandlung" wird definiert als Anregung des Immunsystems gegen Karzinomzellen, die CEA emprimieren, durch Verabfolgen (Immunisierung oder Impfung) eines rekombinanten CEA/Vaccinia-Virus, der eine Immunantwort auf CEA hervorruft, an einen Patienten Die Erfindung wird in Übereinstimmung mit den beigefügten Ansprüchen definiert.
Diese Erfindung betrifft rekombinante Viren, die das Human-Tumor-assoziierte Antigen CEA exprimieren. Erfindungsgemäße Viruskonstrukte exprimieren ein Protein (CEA), das von monoklonalen anti-CEA-Antikörpern erkannt wird. Außerdem ruft das rekombinante Virus eine humorale und/oder zellvermittelte Immunantwort gegen CEA hervor, wenn es in vivo verwendet wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung umfasst ein rekombinantes CEA-Vaccinia-Virus mit der Bezeichnung rV-CEA, das durch Einsetzen eines Sma-I-Restriktionsendonukleasefragmentes von CEA von 2,4 Kilobasen (kb) (das die vollständige Kodierungssequenz für CEA enthält – ein Kodierungsbereich von 2.106 Nucleotiden, einschließlich eines Teils der beiden nicht translatierten Bereiche 51 und 31) in ein Vaccinia-Virus-Genom durch homologe Rekombinantion konstruiert wurde. Das entstehende Virus exprimiert CEA an der Oberfläche infizierter Zellen.
Diese Erfindung ermöglicht dem rV-CEA-Konstrukt oder einem anderen Vaccinia-Virus-CEA-Konstrukt, das den allgemeinen Prinzipien entsprechend präpariert wurde, die hierin beschrieben werden, als Therapiemittel in der Behandlung von Human-Karzinomen, die CEA exprimieren, zu dienen.
1 ist ein schematisches Diagramm des PSC11-CEA-Plasmid-Konstruktes. Eine Sma-I-Spaltstelle zur Einsetzung fremder genetischer Segmente liegt unmittelbar neben dem Vaccinia-p7.5-Promotor, der den Viruspromotor mit der Startstelle des klonierten Gens ausrichtet. Das LacZ-Gen von E. coli, das für β-Galaktosidase kodiert, unterliegt der Regelung des p11-Promotors des Vaccinia-Virus. Das LacZ-Gen und die Sma-1-Klonierungsstelle befinden sich innerhalb eines Segmentes der rechten (TK-R) und linken (TK-L) Thymidinkinase-Gensequenzen von Vaccinia. Diese Virussequenzen steuern die Insertion des rekombinanten Plasmids in das TK-Gen des Wildtyp-Vaccinia-Virus. Vaccinia-TK ist ein nicht essentielles Virusgen und homologe Rekombinantion mit dem PSC-11-Klonierungsplasmid führt zu einem TK-freien Virus (1A). Das Insertionsgensegment ist ein CDNA-Klon von CEA, das 95 Basenpaare des nicht translatierten Bereiches 5' enthält, 264 Basenpaare des nicht translatierten Bereiches 3' und 2.106 Basenpaare Kodierungssequenzen. P₁ und P₂ sind Primer, die zur DNA-Amplifikation durch PCR verwendet werden. Die CDNA wurde in die Sma I- Klonierungsstelle von PSC-11 durch Ligation glatter Enden gebunden (1B). Das entstehende chimäre Konstrukt, bezeichnet mit PSC 11-CEA, wurde durch Restriktionsendonukleasekartierung mit Bam H1 orientiert.
2 zeigt Plaques, die mit rekombinantem Vaccinia-CEA-Virus beimpft wurden. Die Gewebekulturplatten zeigen eine konfluente einschichtige Kultur von HuTK-143B-Zellen, die mit (A) dem Wildtyp-Virus, V-WR, oder (B) dem rekombinanten Vaccinia-CEA-Virus, rV-CEA, infiziert wurden. Die Ausbreitung der Virusinfektion erfolgte in Medien, die mit 25 μl/ml BUDR und 300 μg/ml X-Gal supplementiert waren. Rekombinante Viren erzeugen unter diesen Bedingungen sichtbare blaue Flecken.
3 ist eine Analyse durch Southern-Blot des rekombinanten Vaccinia-CEA-Virus. V-WR und rV-CEA wurden mit Hind III verdaut und mit (A) einer radioaktiv markierten Vaccinia-Virus-DNA-Sonde oder (B) einer radioaktiv markierten β-Galaktosidase-DNA-Sonde hybridisiert. Southern-Blot (A) zeigt das Fehlen des Hind III J-Fragmentes von 5,1 Kilobasen (kb) im rV-CEA-Konstrukt. Southern-Blot (B) zeigt die Anwesenheit eines Hind III Fragmentes von 9,2 Kilobasen (kb), das das β-Galaktosidase-Gen enthält, das das rekombinante Plasmid-Konstrukt im Hind III J-Fragment von Vaccinia repräsentiert.
4 zeigt den Nachweis des rekombinanten Virus durch direkte Plaquehybridisierung. (A) V-WR, (B) rV-CEA, oder (C) rekombinantes Vaccinia-β-Galaktosidase-Virus wurden von einer einschichtigen Zellkultur abgenommen und auf eine Nylonmembran übertragen und mit einer radioaktiv markierten CEA- Sonde hybridisiert.
5 ist eine Analyse von rekombinantem Vaccinia-CEA-Virus durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Virusplaques wurden ausgestochen und unter Verwendung von Primern, die aus dem 5'- und dem 3'-Ende des CEA-Gens konstruiert wurden, einer PCR-Analyse unterworfen. Aliquote Mengen der PCR-Reaktion wurden einer Elektrophorese unterworfen, auf eine Nylonmembran übertragen und mit einer radioaktiv markierten CEA-Sonde hybridisiert. Spur 1: CEA-positive Kontrollprobe; Spuren 2–9: einzelne Isolate von rekombinantem Vaccinia-Virus (rV-CEA); Spur 10: Wildtyp (V-WR).
6 zeigt den immunologischen Nachweis von CEA in Zellen unter Verwendung von monoklonalem anti-CEA-Antikörper COL-1 zur Immunofluoreszenz-Färbung und die entsprechenden Licht-Mikrophotographien einer mit dem Vaccinia-Virus infizierten einschichtigen Zellkultur. Tafel (A) ist eine Licht-Mikrophotographie von HuTK-143B-Zellen, die mit rekombinantem Vaccinia-Virus (rV-CEA) infiziert wurden. Tafel (B) ist die Immunofluoreszenz-Färbung von HuTK^–143B-Zellen, die mit rekombinanten Vaccinia-Viren (rV-CEA) infiziert und mit monoklonalem Antikörper COL-1 behandelt wurden. Tafel (C) ist eine Licht-Mikrophotographie von HuTK-143B-Zellen, die mit Wildtyp-Viren (V-WR) infiziert wurden. Tafel (D) ist die Immunofluoreszenz-Färbung von HuTK^–143B-Zellen, die mit Wildtyp-Viren (V-WR) infiziert und mit monoklonalem Antikörper COL-1 behandelt wurden. Tafel (E) ist eine Licht-Mikrophotographie von HuTK^–143B-Zellen, die mit rekombinantem Vaccinia-Virus (rV-CEA) infiziert wurden. Tafel (F) ist die Immunofluoreszenz-Färbung von HuTK^–143B-Zellen, die mit rekombinanten Vaccinia-Viren (rV-CEA) infiziert und mit monoklonalem Antikörper B72.3 behandelt wurden.
7 vergleicht die anti-CEA-Antikörperantwort in Mäusen, die mit Wildtyp- und rekombinantem CEA-Vaccinia-Virus immunisiert wurden. Acht Wochen alte, weibliche C57/BL6-Mäuse, 10 pro Gruppe, wurden dreimal in 14-tägigen Abständen durch intraperitoneale Injektion von 100 μl Rohlysat immunisiert, das 1·10⁸ pfu Vaccinia-Virus (V-WR) oder dessen rekombinantes Derivat (rV-CEA) enthielt. Serumproben wurden 2 Wochen nach der Primärimmunisierung und 1 Woche nach der dritten Immunisierung abgenommen. Anti-CEA-Antikörper wurde durch „enzyme-linked immunosorbent assay" (ELISA) quantifiziert.
8 zeigt die Wirkung der Verabreichung des CEA-Vaccinia-Konstruktes auf das Wachstum einer Maus-Adenokarzinom-Zelllinie, der Human-CEA transduziert wurde, das sie exprimiert. Zehn weibliche C57/BL6-Mäusen pro Gruppe wurden subkutan 2·10⁵ Maus-Kolonkarzinom-Tumorzellen MCA38 injiziert, die CEA exprimieren. Sieben Tage später wurde ihnen durch Schwanzhautritzung entweder 10 μl 1·10¹⁰ pfu Wildtyp- (V-WR) oder rekombinantes (rV-CEA) Vaccinia-Virus verabreicht, gefolgt von zwei weiteren Inokulationen im Abstand von 14 Tagen. Subkutane Tumor wurden in zwei Dimensionen wöchentlich gemessen und die Volumina nach der Formel Breite²·Länge : 2 berechnet. Tafel (A) zeigt das Tumorwachstum 10 einzelner Mäuse, denen das Wildtyp-Vaccinia-Virus (V-WR) inokuliert wurde. Tafel (B) zeigt das Wachstum von Tumoren 10 einzelner Mäuse, denen das rekombinante Vaccinia-Virus (rV-CEA), das Human-CEA enthält, übertragen wurde.
9 stellt die Vorbeugung gegen das subkutane Wachstum einer Maus-Adenokarzinom-Zelllinie dar, der Human-CEA transduziert wurde, das sie exprimiert, nach drei Immunisierungen unter Verwendung des rekombinanten CEA-Vaccinia-Konstruktes. Zehn weibliche C57/BL6-Mäuse pro Gruppe wurden durch Schwanzhautritzung mit 10 μl rohem Wildtyp- (V-WR) oder rekombinantem (rV-CEA) Vaccinia-Virus immunisiert. Jede Immunisierung wurde im Abstand von 14 Tagen verabreicht. Die Impfungen erfolgten an den Tagen –30, –16, –2. Zwei Tage nach der letzten Immunisierung wurden subkutan 2·10⁵ MCA38-Kolonkarzinomzellen transplantiert, die Human-CEA exprimieren. Tafel (A) zeigt das Tumorwachstum bei 10 einzelnen Tieren, die mit Wildtyp-Virus (V-WR) immunisiert wurden. Tafel (B) zeigt das Wachstum von Tumoren bei 10 Tieren, die mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus (rV-CEA), der Human-CEA enthält, immunisiert wurden.
10 zeigt die Wirkung der Verabreichung von Cyclophosphamid in Verbindung mit dem rekombinanten CEA-Vaccinia-Konstrukt auf das Wachstum einer Maus-Adenokarzinom-Zelllinie dar, die Human-CEA exprimiert. Den weiblichen C57/BL6-Mäusen wurde Cyclophosphamid (100 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion zwei Tage vor der Implantation des Tumors verabreicht. 2·10⁵ MCA38-Adenokarzinomzellen, die Human-CEA exprimieren, wurden durch subkutane Injektion transplantiert und zwei Tage später wurden durch Schwanzhautritzung entweder 10 μl 1·10¹⁰ pfu Wildtyp- (V-WR) oder rekombinantes (rV-CEA) Vaccinia-Virus verabreicht, gefolgt von zwei weiteren Inokulationen im Abstand von 14 Tagen. Subkutane Tumore wurden in zwei Dimensionen wöchentlich gemessen und die Volumina berechnet. Tafel (A) zeigt das Tumorwachstum bei 10 einzelnen Mäusen, denen Cyclophosphamid verabreicht und der Wildtyp-Vaccinia-Virus (V-WR) inokuliert wurde. Tafel (B) zeigt das Wachstum von Tumoren bei 10 einzelnen Mäusen, denen das rekombinante Vaccinia-Virus (rV-CEA), das Human-CEA enthält, inokuliert wurde. Die Pfeile bezeichnen die Tage der Vaccinia-Inokulationen.
11 zeigt die Wirkung der Verabreichung von rekombinantem Human-Interleukin-2 (rh IL-2) und rekombinantem CEA-Vaccinia-Konstrukt auf das Wachstum einer Maus-Adenokarzinom-Zelllinie, die Human-CEA exprimiert. Fünf Mäusen pro Gruppe wurden 2·10⁵ MCA38-Maus-Adenokarzinom-Zelllen, die Human-CEA exprimieren, transplantiert. Rekombinantes Human-Interleukin-2 (rh IL-2) wurde zweimal täglich durch Intraperitoneale Injektion (25.000 Einheiten/Injektion) an den Tagen +1, +2, +3, +4 nach Tumortransplantation verabreicht. 10 μl von 1·10¹⁰ pfu entweder Wildtyp- (V-WR) oder rekombinantes (rV-CEA) Vaccinia-Virus wurden am Tag +2 durch Schwanzhautritzung verabreicht. Zwei weitere Übertragungen erfolgten im Abstand von 14 Tagen. Die Pfeile bezeichnen Immunisierungstage und die Sterne die Tage der Injektionen von rekombinantem Human-Interleukin-2 (rh IL-2). Tafel (A) stellt Tumorwachstum in Tieren dar, die nur rekombinantes Human-Interleukin-2 (rh IL-2) erhielten. Tafel (B) stellt Tumorwachstum bei Tieren dar, denen während 42 Tagen rh IL-2 und Wildtyp-Vaccinia-Virus (V-WR) verabreicht wurden. Tafel (C) stellt Tumorwachstum bei Tieren dar, denen rh IL-2 und rekombinantes Vaccinia-Virus (rV-CEA) verabreicht wurde.
12 zeigt die Wirkung einer vorherigen Impfung mit dem rekombinanten CEA-Vaccinia-Konstrukt auf das Wachstum einer transplantierten Maus-Adenokarzinom-Zelllinie, die Human-CEA exprimiert. Zehn Mäuse pro Gruppe wurden durch Schwanzhautritzung mit 10 μl von 10⁷ PFU entweder V-NYC (Tafeln A und C) oder rV (NYC) – CEA (Tafeln B und D) geimpft. Drei Impfungen erfolgten im Abstand von 14 Tagen. Sieben Tage nach der letzten Impfung (Tag 0) wurden 2·10⁵ Tumorzellen durch subkutane Inokulation transplantiert. Tafeln A und B stellen die Wachstumsraten der CEA nicht exprimierenden Zelllinie MC-38 dar und die Tafeln C und D zeigen die Wachstumsrate der CEA-exprimierenden Tumore MC-38-CEA-2. Wöchentliche Messungen erfolgten in zwei Dimensionen.
13 stellt die Behandlung von Mäusen dar, die CEA-transduzierte und nicht transduzierte MC-38-Maus-Kolon-Adenokarzinome aufwiesen mit rV (NYC) – CEA. Zehn Mäusen pro Gruppe wurden subkutan 2·10⁵ MC-38-Zellen (Tafeln A und B) oder CEA-transduzierte MC-38-CEA-2-Zellen (Tafeln C und D) am Tag 0 injiziert. Sieben Tage später wurden die Tiere durch Schwanzhautritzung mit 10 μl von 10⁷ PFU entweder V-NYC (Tafeln A und C) oder rV (NYC) – CEA (Tafeln B und D) geimpft. Zwei weitere Impfungen erfolgten im Abstand von 14 Tagen an den Tagen 21 und 35. Die Tumore wurden wöchentlich in zwei Dimensionen gemessen.
14 stellt Antikörper-Antworten auf Inokulationen mit rekombinantem Vaccinia-Virus bei Affen dar. Die Tiere wurden an den Tagen 1, 42, 84 (Pfeile) entweder mit V-NYC (leere Symbole) oder rV(NYC) – CEA (ausgefüllte Symbole) geimpft. Anti-CEA-Antikörper wurde zu verschiedenen Zeitpunkten durch ELISA quantifiziert.
15 zeigt die Spezifizität der Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizitäts-(ADCC)Aktivität von menschlichen PBMC (peripheren mononukleären Zellen des Blutes) durch rV-CEA-induzierte Affenantiseren. (A) Seren, die von Affen erhalten wurden, die zweimal mit rV-CEA inokuliert wurden, wurden in einem ADCC-Assay auf Aktivität gegen Mäusetumorzellen getestet, die das CEA-Protein exprimieren. Vor dem Zusatz von menschlichen PBMC wurden die Zielzellen (1·10⁴) für eine Stunde bei 37°C mit Seren vor Immunisierung (leere Symbole) oder mit Seren, die 21 Tage nach der zweiten Immunisierung (ausgefüllte Symbole) gewonnen wurden, in einer Verdünnung von 1 : 50. Die Seren wurden auf ADCC-Aktivität gegen eine mit CEA transfizierte (Quadrate) Maus-Kolonkarzinom-Zellinie oder nicht-transduzierte Kontroll-Tumorzellen (Kreise) getestet. (B) Das Gleiche, wie A, außer dass menschliche Effektorzellen für 18 Stunden mit IL-2 (100 U/ml) vorbehandelt wurden. Die Seren wurden auf ADCC-Aktivität gegen eine mit CEA transfizierte Maus-Kolonkarzinom-Zelllinie getestet.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes Virus, das einen Vaccinia-Vektor oder andere Virusvektoren umfasst, in die karzinoembryonales Antigen (CEA) eingesetzt wurde, wobei dieses rekombinante Virus CEA oder ein antigenes Fragment davon an der Oberfläche von mit ihm infizierten Zellen exprimiert und wobei dieses rekombinante Virus in vivo eine Immunantwort hervorruft, die gegen CEA und CEA exprimierende Zellen gerichtet ist. Vorzugsweise kommt das Vaccinia-Virus aus einem V-WR- oder NYC-Stamm, in den für CEA kodierende DNA oder immunogene Fragmente davon eingesetzt oder rekombiniert wurden, oder es können andere attenuierte Human-Vaccinia-Virus-Stämme verwendet werden. Die Präparation rekombinanter Vaccinia-Präparate zur Verwendung als Immunogene wird beispielsweise in den US-Patenten Nr. 4 722 848 und 5 017 487 und in der PCT- Veröffentlichung WO 87/022 038 beschrieben. Das Vaccinia-Virus kann einen Promotor enthalten, der die CEA-Expression erhöht, z. B. synthetischen späten Promotor des Plasmids PMJ601 (Davison, A. J. & Moss, B., Nucl. Acids Res. 18: 4285–4286 (1990)). Andere Virus-Vektoren können ebenfalls verwendet werden, wie dem Fachmann deutlich sein wird. Diese umfassen beispielsweise Baculovirus (beschrieben z. B. in der Veröffentlichung des EPA EP 228 036 ), Human-Adenovirus, SV40, Geflügelpocken- oder Rinder-Papillomavirus, in die für CEA kodierende DNA oder der gewünschte immunogene Teil davon eingesetzt wurde.
Zusätzlich kann das CEA ein einziges oder multiples immunodominantes T-Zellen-Epitop aufweisen. Ein CEA/Vaccinia-Virus bestehend aus rV-CEA wurde beim ATCC angemeldet und erhielt die Zugangsnummer VR 2323. Die CEA-Sequenz ist in Oikawa et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 142: 511–518 (1987) beschrieben und die Charakterisierung von cDNA-Klonen, die für Human-CEA kodieren, ist in Zimmerman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 2960–2964 (1987) beschrieben. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung können die Sequenzen aus der ganzen oder aus antigenen Abschnitten der CEA-Sequenz abgeleitet werden. Die Nucleotid- oder Aminosäurensequenzen können geändert oder antigene Abschnitte identifiziert und in die erfindungsgemäßen rekombinanten Impfstoff-Präparate entsprechend Techniken eingesetzt werden, die dem Fachmann vertraut sind.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das oben beschriebene rekombinante Virus enthält und eine) pharmazeutisch vertretbares) Verdünnungsmittel, Trägersubstanz oder Exzipiens. Die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung enthält das rekombinante CEA/Vaccinia-Virus in einer Menge, die in Abhängigkeit vom Verabreichungsweg ausgewählt wurde. Bevorzugte Verabreichungswege schließen intravenöse, intraperitoneale, Hautabschürfungs-, orale, subkutane oder intradermale Wege ein. Der Fachmann wird es schätzen, dass Mengen, die nach irgendeinem bestimmten Behandlungsprotokoll verabreicht werden müssen, leicht bestimmt werden können. Es wäre zu erwarten, dass, geeignete Mengen im Bereich von 10⁵ pfu bis 10⁹ pfu liegen.
Die vorliegende Erfindung macht ein Verfahren zur Behandlung von ein Karzinom aufweisenden Patienten möglich, bei denen Zellen des Karzinoms CEA exprimieren, das das Verabfolgen des oben beschriebenen rekombinanten Virus an den Patienten umfasst. Insbesondere handelt es sich bei den Karzinomzellen um gastrointestinale, Brust-, Pankreas-, Blasen-, Eierstock-, Lungen- oder Prostata-Karzinomzellen, die CEA-Epitope exprimieren. Das oben genannte Verfahren kann vorzugsweise außerdem die Verabreichung eines Modifikators der biologischen Antwort (Biological Response Modifier) mit dem rekombinanten Virus umfassen. Vorzugsweise wird der Modifikator der biologischen Antwort aus der Gruppe ausgewählt, die aus Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-6 (IL-6), Interferon, Tumornekrosefaktor (TNF) und Cyclophosphamid besteht, deren Präparation oder Verfügbarkeit dem Fachmann bekannt ist. Beispielsweise wird die Präparation von rekombinantem Human-IL-2 im Einzelnen in den US-Patenten Nr. 4 738 927 und 4 992 367 beschrieben, und die Expression von TNF wird im Einzelnen in US-Patent Nr. 4 650 674 beschrieben. Das oben beschriebene Verfahren kann außerdem die Verabreichung eines Adjuvans mit dem rekombinanten Virus umfassen. Ein Fachman wird schätzen, dass die zu verabfolgenden Mengen für irgendein bestimmtes Behandlungsprotokoll leicht bestimmt werden können. Geeignete Adjuvantien umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, anorganische Gele, z. B. Aluminiumhydroxid, Alaun, oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin, Pluronic Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen und dergleichen.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht ebenfalls ein Verfahren zur Stimulierung des Immunsystems eines Säugetiers gegen CEA zum Zweck der Vorbeugung gegen die Bildung und das Wachstum von Karzinomzellen, umfassend das Verabfolgen des oben beschriebenen rekombinanten Virus an das Säugetier in einer ausreichenden Menge, um die genannte Stimulierung zu bewirken. Der Vaccinia-Virus kann aus dem NYC-Stamm stammen oder mit einem attenuierten Human-Vaccinia-Virus-Stamm rekombiniert sein. Das oben beschriebene Verfahren kann vorzugsweise außerdem die Verabreichung eines Modifikators der biologischen Antwort mit dem rekombinanten Virus umfassen (vorzugsweise wird der Biological Response Modifier aus der Gruppe ausgewählt, die aus Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-6 (IL-6), Interferon, Tumornekrosefaktor (TNF) und Cyclophosphamid besteht). Das oben beschriebene Verfahren kann außerdem die Verabreichung eines Hilfsstoffes mit dem rekombinanten Virus umfassen. Ein Fachman wird schätzen, dass die zu verabfolgenden Mengen für irgendein bestimmtes Behandlungsprotokoll leicht bestimmt werden können. Die bevorzugten Verabreichungswege sind die oben beschriebenen.
Die vorliegende Erfindung wird detaillierter in den folgenden nicht-einschränkenden Beispielen beschrieben.
BEISPIEL 1
Konstruktion von rekombinantem Vaccinia-Virus-CEA
Rekombinante Vaccinia-Viren wurden im Allgemeinen so konstruiert, wie von Mackett et al. („The construction and characterization of vaccinia virus recombinants expressing foreign genes." In: D. M. Glover (Hrsg.) DNA Cloning A Practical Approach, Seiten 191–211. Oxford Press (1985)) beschrieben. Insbesondere wurde ein cDNA-Klon für Human-CEA aus einer Menschen-Kolontumorzellenbank isoliert. Poly-A+-RNA aus GEO-Zellen (Laboratory of Tumor Immunology and Biology, NCl) wurde isoliert, cDNA durch reverse Transkription synthetisiert und mit DNA-Polymerase doppelsträngig gemacht. Linker, die die Restriktionsenzymstellen, Hind III und Bam H1 enthalten, wurden an die cDNA ligiert und in den direktionalen Klonierungsvektor λ-orf-8 eingesetzt (nach den von Meissner et al.; PNAS 84: 4171–4175 (1987) beschriebenen Verfahren). Rekombinierte Plaques, die CEA enthalten, wurden unter Verwendung von Nucleinsäuren-Hybridisierungsverfahren nachgewiesen. Positive Plaques wurden gereinigt und sequenziert. Es wurde festgestellt, dass ein Klon von 2,8 Kilobasen (kb) den gesamten Kodierungsabschnitt für CEA (2.106 Nucleotide) enthielt und über 100 Nucleotide des nicht translatierten 5'-Abschnittes, einschließlich des Poly-A°-Schwanzes. Ein Sma I-Fragment von 2,4 Kilobasen (kb) wurde aus diesem Klon isoliert und durch Ligation mit glatten Enden in die Sma I-Spaltstelle des Spender-Plasmids pSC-11 ligiert. Die Orientierung des Plasmidinserts wurde durch Endonuklease-Verdauung mit Bam H1 und Analyse bestimmt. Das erhaltene Plasmid-Konstrukt wurde mit PSC 11-CEA bezeichnet (1).
Homologe Rekombination von PSC 11-CEA mit einem Vaccinia-Virus, das ein nichtwesentliches TK-Gen im Hind III J-Fragment enthält, des chimären Virus (siehe Mackett et al., Id.; PNAS 79: 7415–7419 (1982)). Die Anwesenheit des LacZ-Gens von PSC 11-CEA, das für β-Galaktosidase kodiert, im rekombinanten Virus, stellte ein Auswahlverfahren zur Verfügung.
Das rekombinante Virus rV-CEA wurde folgendermaßen konstruiert: Eine Gewebekulturschale von 60 mm von nahezu konfluenten CV-1-Zellen, Nierenzellen der afrikanischen Grünen Meerkatze (ATCC Nr. CCL 70), wurden mit ungefähr 0,20 Plaque-bildenden Einheiten/Zelle (pfu/Zelle) V-WR während ungefähr zwei Stunden bei 37°C infiziert. Während des Voranschreitens der Infektion wurde ein Niederschlag von PSC 11-CEA-DNA unter Verwendung von 1 Milliliter (ml) Transinfektionspuffer (0,14 M NaCl, 5 mM KCl, 1 mM Na₂HPO₄, 0,1% Dextrose und 20 mM HEPES (4[2-Hydroxethyl]-1-piperazin-ethansulfonsäure), pH-Wert auf 7,0–7,1 eingestellt, 5 μg chimäre PSC-11-CEA-Plasmid-DNA und 1 μg Vaccinia-Virus-DNA als Träger präpariert. Diese Lösung wurde gemischt und ungefähr 50 μl 2,5 -molares CaCl₂ hinzugefügt, das Gemisch leicht geschüttelt und ungefähr 20 Minuten bei Raumtemperatur gelagert, während die DNA ausfällte.
Nach der Infektion wurde das virale Inokulum von der einschichtigen CV-1-Kultur abgesaugt, die dann zweimal mit 1 × Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gespült wurde. Der DNA-Niederschlag wurde der CV-1-Schicht tropfenweise hinzugefügt und ungefähr 30 Minuten bei Raumtemperatur auf den Zellen belassen, woraufhin 5 ml frisches Kulturmedium (Dulbeccos Medium; Gibco/BRL), supplementiert mit 5% Kälberfötusserum (FCS), zugesetzt und die Zellen bei 37°C ungefähr drei Stunden lang inkubiert wurden. Das Medium wurde dann von der Schale abgesaugt und durch 5 ml frisches Medium, supplementiert mit 5% FCS, ersetzt und die Zellen erneut bei 37°C inkubiert, diesmal für ungefähr 48 Stunden.
Nach der Inkubation wurden die Zellen ins Kulturmedium geschabt und durch Zentrifugieren gesammelt. Das Zellpellet wurde in 0,5 ml MEM (Minimal Essential Media; Gibco/BRL) resuspendiert. Die erzeugten Viren wurden aus den Zellen durch drei Gefrier-Auftau-Zyklen freigesetzt, gefolgt von Sonifikation der Zellen in einem 450W-Wasserbad-Sonicator für 1 Minute.
Die erzeugten Viren ebenso, wie die V-WR-Wildtyp-Vergleichsprobe, wurden auf konfluenten einschichtige Kulturen von HuTK^–143B-Zellen plattiert, einer Human-Osteosarkom-Zelllinie mit fehlendem Thymidinkinase-Gen (ATCC Nr. CRL 8303), in Anwesenheit von 25 μg/ml 5-Bromodeoxyuridin (BuDR; erhalten von Boehringer Mannheim Biochemikalien) und 300 μg/ml 5-Bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-Galaktosidase (X-Gal; Gibco/ BRL). Rekombinante Virusklone wurden nach Wachstum auf den HuTK^–143B-Zellen ausgewählt, wie es durch die Bildung blauer Plaques sichtbar wird (2B).
Die Plaques wurden dann isoliert und der erzeugte Virus durch fünf Zyklen Plaque-Reinigung unter ähnlichen Auswahlbeding-ungen gereinigt, wie sie oben beschrieben wurden. Lysate mit hohem Titer der gereinigten isolierten Viren wurden durch aufeinanderfolgende Übergabe in T-Flaschen nach Standardtechniken bereitet (siehe Mackett et al.; (1982), supra). Im Allgemeinen wurden Titer von 1·10⁸ pfu/ml bis 1·10⁹ pfu/ml erhalten. Die Viren wurden bei –70°C gelagert.
BEISPIEL 2
Prüfung
Die DNA von rekombinantem CEA-Vaccinia-Virus wurde extrahiert und die Virusgenome durch Restriktionsendonuklease-Verdauung mit Hind III und Southern-Blot analysiert. Für die Zwecke dieser Darstellung wird nur auf das bevorzugte rekombinante Vaccinia-Virus-CEA-Isolat rV-CEA Bezug genommen.
Um Proben rekombinanter und Vergleichs-Wildtyp-Virus-DNA zu erhalten, wurden fast konfluente einschichtige Kulturen von HuTK-143B-Zellen mit ungefähr 30 pfu/Zelle V-WR oder rV-CEA infiziert, im Allgemeinen wie oben beschrieben. Die Entwicklung der Infektionen wurden solange zugelassen, bis maximale zytopathische Wirkung beobachtet wurde, ungefähr 24 Stunden, woraufhin die Zellen ins Kulturmedium geschabt, durch Zentrifugieren pelletiert und in ungefähr 50 μl 1 × PBS resuspendiert wurden.
Jeder Probe wurden 300 μl Niedrigsalzpuffer (20 mM Tris-HCl, [Tris (hydroxymethyl) aminomethan], auf einen pH-Wert von 8,0 gepuffert, 10 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) und 0,75% SDS (Natriumdodecylsulfat) und 20 μl Proteinase K (10 mg/ml von Boehringer Mannheim Biochemikalien) zugesetzt und gemischt. Das Gemisch wurde über Nacht bei 37°C unter Schütteln inkubiert, zweimal mit einem Gemisch aus Phenol und Chloroform und zweimal mit Chloroform alleine extrahiert. Natriumazetat mit pH-Wert 5,0 wurde bis 0,3 N zugesetzt und zwei Volumina Ethanol hinzugefügt, um die DNA auszufällen. Die DNA wurde durch Zentrifugieren gesammelt und zweimal mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und analysiert, wie unten beschrieben.
BEISPIEL 3
Analyse mit Restriktions-Endonuklease
DNA aus V-WR und rV-CEA wurde mit der Endonuklease Hind III den Angaben des Herstellers (Gibco/BRL) entsprechend verdaut, über Nacht einer Elektrophorese auf einem 0,6%-igen Agarosegel bei 45 Volt ausgesetzt, die DNA auf eine Biotran-Nylonmembran (ICN) übertragen und mit einer ³²P-dCTP-markierten Vaccinia-Virus-DNA-Sonde hybridisiert. Vaccinia-Virus-DNA wurde nach diesem bewährten Verfahren isoliert. 20 A₂₆₀-Eineiten gereinigtes Wildtyp-Vaccinia-Virus (≈50 μg) wurden in 50 mM Tris-HCl; pH = 7 – 8 [Tris (hydroxymethyl) aminomethan] auf ein Endvolumen von 1,2 ml gebracht. Dieser Lösung wurden 0,1 ml 10%-iges SDS (Natriumdodecylsulfat), 0,2 ml 60%-ige Saccharose, 0,4 ml Proteinase K (10 mg/ml; Boehringer Mannheim Biochemikalien) zugesetzt und sie wurde 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Diese Lösung wurde zweimal mit dem gleichen Volumen mit 50 mM Tris-HCl mit pH = 7 – 8 gesättigtem Phenol extrahiert und einmal mit Phenol/Chloroform (1 : 1). Ein Zehntel des Volumens 1-molares Natriumazetat (pH = 7,0) und 2,5 Volumen Ethanol wurden zugesetzt und die DNA bei –20°C über Nacht ausfällen gelassen. Die DNA wurde durch Zentrifugieren gesammelt, der Überstand abgesaugt und das Pellet mit 95%-igem Ethanol gewaschen und an der Luft getrocknet. Das getrocknete Pellet wurde in 100 μl H₂O resuspendiert und die Konzentration durch Absorption bei 260 nm bestimmt. Fünfundzwanzig ng dieser DNA wurden mit ³²P-dCTP unter Verwendung des „Random Primers DNA Labelling"-Systems von Gibco/BRL entsprechend den Herstelleranweisungen mit ³²P-dCTP markiert. Die Filter wurden über Nacht bei 37°C in 40%-igem Formamid (Clonetech) und 5 × Denhardt-Puffer (0,1% Ficoll 400 (Sigma); 0,1 Polyvinyl-pyrrolidin (Sigma) und 0,1% BSA (Rinderserumalbumin; Boehringer Mannheim Biochemikalien); 3 × SSC (0,45 M NaCl; 0,045 M Natriumcitrat), 2,5% Dextran-Sulfat (Sigma) und 0,1 mg/ml denaturierter Lachssperma-DNA (Lofstrand Laboratories) vorhybridisiert. 1·10⁶ cpm/ml mit dCTP markierte denaturierte Vaccinia-Virus-Sonde wurde zugesetzt und bei 37°C unter Schütteln über Nacht hybridisiert. Der Filter wurde zweimal für fünfzehn Minuten in 2 × SSC und 0,1% SDS bei Raumtemperatur und dann zweimal für fünfzehn Minuten in 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C gewaschen. Dem Blot wurde vier Stunden lang Röntgenfilm ausgesetzt, der entwickelt und auf die Anwesenheit eines 5,1-Kilobasen-Bandes entsprechend dem Hind III J-Fragment des Wildtyps analysiert wurde.
V-WR-DNA zeigte ein typisches Vaccinia-Virus-Restriktionsmuster (siehe McCarron et al., Virol. 86: 88–101 (1978)) einschließlich eines 5,1-Kilobasen-Bandes, das dem Hind III J-Fragment entspricht. Dagegen zeigte rV-CEA-DNA aufgrund der Einsetzung des chimären Plasmid-Konstrukts in das TK-Gen des Virus nicht das 5,1-Hind III-Band.
Wie in 3A gezeigt, hybridisierte ein Hind III J-Fragment von 5,1-Kilobasen in der Wildtyp-V-WR-DNA mit der Vaccinia-Virus-DNA-Sonde. In diesem Größenbereich wurde in der rV-CEA-DNA kein entsprechendes Band gefunden. In der rV-CEA-DNA fehlt also eindeutig das Hind III J-Fragment von 5,1-Kilobasen.
Zur Bestimmung der Größe des rekombinanten J-Fragmentes wurden Southern Blots, die mit Hind III verdaute V-WR-, rV-CEA- und Humangenom-DNA enthielten, mit einer ³²P-dCTP-markierten Sonde an das β-Galaktosidase-Gen von E. coli hybridisiert. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde unter Verwendung zweier spezifischer Oligomere von 20 Basen (5' GGGAAAACCCTGGCGTTACC 3' und 5' TCGAATCAGCAACGGCTTGC 3') als Primer ausgeführt, die ein Fragment des β-Galaktosidase-Gens von 1 Kilobase (kb) banden. Dies wurde einer PCR mit VSC 8 unterworfen, das 1-Kilobasen-Band wurde aus einem 0,8%-igen Agarosegel ausgeschnitten und unter Verwendung des „Random Primers Labelling"-Systems von Gibco/BRL entsprechend den Herstelleranweisungen markiert; Folge übernommen von Shapira et al., Gene 25: 71–82 (1983).
Wie in 3B dargestellt, ist das β-Galaktosidase-Gen im rekombinanten Virus anwesend, wie das deutliche Band bei 9,2 kb im Blot der Virus-DNA von rV-CEA beweist. Dieses Ergebnis ist konsistent mit der erwarteten Größe des rekombinanten Hind III J-Fragmentes. Das β-Galaktosidase-Gen fehlt im Wildtyp-Vaccinia-Genom und in der Humangenom-DNA.
BEISPIEL 4
Analyse durch Plaque-Hybridisierung
Die Anwesenheit des CEA-Gens im Genom des rekombinanten Vaccinia-Virus wurde durch Analyse durch DNA-Hybridisierung und Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nachgewiesen.
In der Hybridisierungsuntersuchung wurden nahezu konfluente einschichtige Kulturen von HuTK^–143B-Zellen, die in 60 mm großen Gewebekulturschalen gezüchtet worden waren, mit ungefähr 10 pfu/Zelle rV-CEA, mit V-WR als negativer Vergleichsprobe und rekombinantem Vaccinia-β-Galaktosidase-Virus (VSC 8; erhalten von Dr. Bernard Moss, NIAID, Bethesda, MD) als positiver Vergleichsprobe infiziert. VSC 8 ist ein rekombinantes Vaccinia-Virus, das das LacZ-Gen von E. coli, eingesetzt ins TK-Gen von Vaccinia, enthält (Chakrabarti et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3403–3409 (1985)). Die infizierten Zellen wurden bei 37°C für ungefähr 24 Stunden inkubiert und nach der Inkubation wurde die Virus-DNA direkt durch zehnminütiges unmittelbares Auflegen der Membran auf die Einschicht-Zellkultur auf Nylonmembranen übertragen. Nach Beendigung der DNA-Übertragung wurde die Membrane von der Platte entfernt, denaturiert, neutralisiert und in 2 × SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M Natriumcitrat) für mehrere Minuten eingeweicht. Danach wurde die DNA mit der Membran durch Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlung (UV) während ungefähr 2 Minuten unter Verwendung einer DNA-Übertragungslampe (Foto Dyne, New Berlin, WI) vernetzt. Nach der UV-Bestrahlung wurde die Membran mit einer ³²P-dCTP-markierten CEA-Sonde hybridisiert und über Nacht Röntgenfilm damit belichtet. Die CEA-Probe war ein PST I-Fragment von 560 Basenpaaren, ausgeschnitten aus dem Vektor pGEM 7 (Dr. John Shively, City of Hope, Duarte, Kalifornien). Fünfundzwanzig ng dieses Fragmentes wurden mit dCTP³² unter Verwendung des „Random Primers Labelling"-Systems von Gibco/BRL entsprechend den Herstelleranweisungen markiert. Die Sonde wurde wie oben beschrieben an die Blots hybridisiert.
Wie 4 zeigt, hybridisierten die rV-CEA-Plaques (4B) gut mit der CEA-Sonde, während die V-WR- (4A) und die VSC-8-Plaques (4C) dies nicht taten.
BEISPIEL 5
Analyse durch Polymerase-Kettenreaktion
Für die Untersuchungen mit PCR wurden nahezu konfluente einschichtige Kulturen von HuTK^–143B-Zellen in 60 mm großen Gewebekulturschalen gezüchtet, mit ungefähr 10 pfu/Zelle rV-CEA oder V-WR infiziert und bei 37°C für ungefähr 24 Stunden inkubiert. Nach der Infektion wurden die einschichtigen Kulturen mit Agarose-Überschichten bedeckt, wodurch die Orte der Virus-Plaques auf der Schale fixiert werden. Einzelne Plaques wurden dann durch Zahnstocher-Übertragung isoliert, in ungefähr 1 ml 1 × PBS ohne Kalzium oder Magnesium gebracht und ungefähr 10 Minuten gekocht, gefolgt von Abkühlung auf Eis.
Eine Standard-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde nach den Herstelleranweisungen unter Verwendung des von Cetus Corp. gelieferten Amplifizierungskits ausgeführt. Für diese Untersuchung wurden Oligonukleotid-Primer konstruiert, die den gesamten CEA-cDNA-Abschnitt erkennen, um als Primer für die PCR-Reaktion zu dienen, d. h. Primer wurden aus dem 5'- und dem 3'-Ende des CEA-Gens konstruiert (siehe 1A, P₁ und P₂). Eine Wildtyp-Vaccinia-Virus-Plaque wurde als negative Vergleichsprobe verwendet.
Nach 30 Zyklen Virus-Amplifikation wurde eine Elektrophorese von Proben jedes Plaque-Isolates auf einem 1%-igen Agarosegel vorgenommen, auf eine Nylonmembran übertragen und wie oben beschrieben mit der radioaktiv markierten CEA-Sonde hybridisiert. Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt. Alle rekombinanten Isolate und die positive CEA-Vergleichsprobe (Spuren 1–9) hybridisierten mit der CEA-Gen- Sonde, während die DNA des Wildtyp-Vaccinia-Virus (Spur 10) keinerlei Hybridisierung zeigte.
BEISPIEL 6
Proteinexpressions-Analyse
CEA-Proteinexpression und Lokalisierung wurden durch Immunofluoreszenz-Färbung von mit V-WR und rV-CEA infizierten Zellen unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers COL-1, einem monoklonalen Maus-Antikörper, der gegen CEA gerichtet ist und mit CEA reagiert (Muraro et al., Cancer Res. 45: 5769–5780 (1985)) bestimmt. Zum Testen der CEA-Proteinexpression wurden nahezu konfluente einschichtige Kulturen von HuTK^–143B-Zellen mit 30 pfu/Zelle V-WR oder rV-CEA inokuliert und bei 37°C ungefähr 5 Stunden inkubiert. Das Virus-Inokulum wurde dann von den Zellen abgesaugt und die einschichtige Kultur dreimal mit 1 × PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann bei Raumtemperatur in ungefähr 30 Minuten unter Verwendung einer frisch präparierten Lösung von 2% Paraformaldehyd in PBS fixiert. Nach der Fixierung wurden die Zellen dreimal mit Minimal Essential Medium (MEM; Gibco/BRL) gewaschen und mit 1% BSA in PBS in ungefähr 30 Minuten „blockiert".
Im Anschluss an die obige Behandlung wurden die fixierten, blockierten Zellen durch Zusatz von 1 μg/ml monoklonalem Antikörper COL-1 oder monoklonalem Antikörper B72.3 (Laboratory of Tumor Immunology and Biology, NCl) behandelt, einem negativen Maus-Vergleichsantikörper, der nicht mit CEA reagiert, und bei Raumtemperatur für ungefähr 1 Stunde geschüttelt. Die Zellen wurden dann fünfmal mit 1 × PBS gewaschen und fluorochromierter Anti-Maus-Sekundär-Antikörper von Ziegen (Kierkegaard und Perry Laboratories Inc) in einer Verdünnung von 1 : 100 zugesetzt. Nach ungefähr 30 Minuten wurden die Zellen fünfmal mit 1 × PBS gewaschen und die Expression und die Lokalisierung von CEA in den Zellen im Immunofluoreszenz-Mikroskop bestimmt. Die Immunofluoreszenz-Färbung war binnen 5 Stunden nach der ersten Virusinfektion maximal. Weitere Inkubation mit dem Virus führte zur Zytolyse infizierter Zellen und Abbau von Membranprotein.
Wie in den 6A und 6B dargestellt, zeigten mit rekombinantem Vaccinia-Virus (rV-CEA) infizierte Zellen mit monoklonalem Antikörper COL-1 bei Fluoreszenz deutliche Verfärbung der Zellenoberfläche, da der rekombinante Vaccinia-Virus (rV-CEA) CEA in der Zellmembran infizierter Zellen exprimiert, in Übereinstimmung mit der normalen Lokalisierung von CEA in der Zelle. Dagegen zeigten Zellen, die mit Wildtyp-Vaccinia-Virus (V-WR) infiziert waren, keinerlei Immunofluoreszenz-Färbung mit COL-1 (6C und D). Immunofluoreszenz-Färbung mit dem im Isotyp übereinstimmenden, negativen Vergleichsantikörper B72.3 rief keinerlei Abbildung bei Zellen hervor, die mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus (rV-CEA) infiziert waren ( 6E und F).
BEISPIEL 7
Analyse durch ELISA
Acht Wochen alte, weibliche C57/BL6-Mäuse (Frederick Cancer Research Facility), 10 pro Testprobe, wurden dreimal in 14-tägigen Abständen durch intraperitoneale Injektion (IP) von 100 μl rohem Lysat inokuliert, das ungefähr 1·10⁸ pfu Wildtyp (V-WR) oder rekombinantes Vaccinia (rV-CEA) enthielt.
Ungefähr zwei Wochen nach der ersten Injektion und eine Woche nach einer dritten Injektion wurde jeder Maus Blut abgenommen und die Seren abgetrennt. Wie in Tabelle 1 unten und 7 dargestellt, entwickelten die Mäuse ungefähr 14 Tage nach Inokulation Antikörper-Titer gegen CEA, eine Antwort, die durch weitere Immunisierungen erhöht wurde.
Tabelle 1 Immunantwort auf Human-CEA-Antigen und Vaccinia-Virus-Antigene in mit rV-CEA und V-WR immunisierten Mäusen
Anti-CEA- und anti-Vaccinia-Virus-Antikörper wurden in den Seren durch „enzymelinked immunosorbent assay" (ELISA) folgendermaßen quantifiziert: Eine 96-Kavitäten-Mikrotiterplatte wurde mit 100 μl Wildtyp- (V-WR-) Antigen (d. h. ungefähr 1·10⁷ Virusteilchen) in 0,1-molarem Natriumkarbonatpuffer, pH = 9,6, über Nacht beschichtet. Die Platten wurden dann mit 1% BSA in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) blockiert, die 0,1% Glutaraldehyd enthielt, dreimal in PBS gewaschen und ungefähr 1 Stunde bei Raumtemperatur mit dem oben erhaltenen Mausserum inkubiert.
Mausserum-Antikörper, die sich an das V-WR-Vaccinia-Antigen banden, wurden unter Verwendung des „Immuno Select Kit" von Gibco/BRL nachgewiesen. Dieses Kit erlaubt den Nachweis von Kaninchen- oder Maus-Primärantikörpern, polyklonalen oder monoklonalen, die zu auf einem festen Träger immobilisierten Antigenen gehören. Ein biotinylierter (Ziegen-anti-Maus-) Sekundärantikörper ist an ein Streptaviden-Alkaliphosphatase-Konjugat gebunden und dieser vorgeformte Komplex wird der ELISA-Platte nach dem Primärantikörper zugesetzt. Die Platten wurden mit Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) gewaschen und der sich ergebende alkalische Phosphatase-Komplex unter Verwendung des chromogenen pNPP (p-Nitrophenylphosphat) nachgewiesen. Die Reaktion wurde durch Zusatz von Natriumhydroxid abgebrochen und Probenabsorption bei 405 nm mit einem ELISA-Ablesegerät (Bio-Tek Microplate Reader, Modell EL 310) abgelesen. Ein polyklonaler Kaninchen-anti-Vaccinia-Antikörper (zur Verfügung gestellt von Dr. Mark Buller, NIAID, Bethesda, MD) wurde als positive Vergleichsprobe auf den anti-Vaccinia-Platten verwendet.
Ähnliche Verfahren folgten unter Verwendung von CEA als Test-Antigen. 96-Kavitäten-Mikrotiterplatten wurden mit 100 μl (250 ng) gereinigtem CEA-Protein (International Enzyme, San Diego, CA) gereinigt und bei 37°C über Nacht gelagert. Die Platten wurden dann mit 1% BSA in TBS blockiert. Dann wurde das oben beschriebene ELISA-Verfahren ausgeführt, abgesehen davon, dass monoklonaler Antikörper COL-1 als positiver Vergleichs-Antikörper verwendet wurde.
Die Ergebnisse dieser Tests wurden zusammengestellt und eine Standardkurve aufgestellt, die die A405-Ablesungen mit der Menge zugesetzten monoklonalen Antikörpers COL-1 korreliert. Die Menge in jeder Experimentprobe anwesenden CEAspezifischen Antikörpers wurde dann aus den A405-Ablesungen im linearen Bereich, die mit den geeigneten Verdünnungen erhalten wurden, in Äquivalente monoklonalen Antikörpers umgerechnet und die anti-Vaccinia-Antikörperproduktion mit der anti-CEA-Antikörperproduktion korreliert. Die Ergebnisse der Untersuchung sind in 7 zusammengefasst.
Im ELISA-Test wurde die Antwort in vivo von Mäusen auf den Vaccinia-Virus selbst auch durch Test auf anti-Vaccinia-Antikörper gemessen, um sicherzustellen, dass die Mäuse angemessen mit dem Vaccinia-Virus immunisiert worden waren. Tabelle 1 zeigt die Antikörper-Antwort auf den Vaccinia-Virus und zeigt deutlich, dass die Mäuse ein angemessenes Virus-Inokulum erhalten hatten.
Für diese Untersuchung in vivo erhielt eine Vergleichsgruppe von Mäusen in zweiwöchigem Abstand 1·10⁸ pfu/ml Wildtyp-Vaccinia-Virus (V-WR). Diese Mäuse entwickelten eine ähnliche Antikörper-Antwort auf den Vaccinia-Virus, wie die mit dem rekombinanten Virus (rV-CEA) behandelten Tiere. Die Vergleichstiere entwickelten keine Antikörperantwort auf CEA (Tabelle 1; 7). Keine der geimpften Mäuse wies in der 42-tägigen Beobachtungszeit nach der Immunisierung Anzeichen von Toxizität auf.
Diese Daten legen nahe, dass Inokulation eines rekombinanten Vaccinia-Virus (rV-CEA) das Immunsystem befähigt, Human-CEA zu erkennen und eine humorale Immunantwort gegen das Antigen hervorzubringen.
BEISPIEL 8
Therapie-Untersuchungen
Vier bis fünf Wochen alten, weiblichen C57/BL6-Mäusen, erhalten von der Frederick Cancer Research Facility, wurden durch subkutane Injektion 2·10⁵ MCA38-Maus-Adenokarzinomzellen inokuliert, die mit dem Human-CEA-Gen transduziert worden waren. Es ist gezeigt worden, dass diese Zellen das Human-CEA-Gen exprimieren, das COL 1-Epitope enthält. Zehn Tieren pro Gruppe wurden durch Schwanzhautritzung 7 Tage nach der Tumorimplantation 10 μl rohen Lysates inokuliert, das 1·10¹⁰ pfu Wildtyp, V-WR oder rekombinantes Vaccinia, rV-CEA, enthielt. Die zweite und die dritte Immunisierung erfolgten in Abständen von 14 Tagen. Die Tiere wurden wöchentlich auf die Anwesenheit von Tumoren untersucht. Die Tumore wurden mit Hilfe von Kalibern in zwei Dimensionen gemessen und das Volumen nach der Formel Breite² × Länge : 2 berechnet.
8 zeigt die Ergebnisse des Wachstums von 7 Tage alten subkutanen Tumoren von 10 einzelnen Mäusen, denen entweder Wildtyp-Vaccinia-Virus (V-WR; 8A) oder rekombinantes Vaccinia-Virus (rV-CEA, 8B) verabreicht worden war. Tiere, die das rekombinante, Human-CEA enthaltende Vaccinia-Virus erhalten hatten, erfuhren eine dramatische Verringerung des Tumorwachstums im Verlauf von 42 Tagen; außerdem entwickelten zwei der Tiere, die das rekombinante Vaccinia (rV-CEA) erhalten hatten, nie einen Tumor. Diese Tumor-freien Tiere wurden dann erneut mit 2·10⁵ mit CEA transduzierten MCA38-Zellen kontaktiert. Auch nach 90 Tagen waren sie noch Tumorfrei. Dagegen entwickelten Tiere, denen Wildtyp-Virus (V-WR) verabreicht wurde, schnell wachsende Tumore. Tiere, die kein Vaccinia-Konstrukt erhalten hatten, entwickelten ebenfalls Tumore und deren Wachstumsrate ähnelte der der Tiere, denen Wildtyp-Vaccinia (V-WR) verabreicht worden war.
BEISPIEL 9
Untersuchung zur Vorbeugung
Fünf bis sechs Wochen alten, weiblichen C57/BL6-Mäusen, erhalten von der Frederick Cancer Research Facility, wurden dreimal im Abstand von vierzehn Tagen 10 μl rohen Lysates, das 1·10¹⁰ pfu Virus enthielt, inokuliert. Zehn Tiere pro Gruppe erhielten entweder das Wildtyp-Vaccinia-Virus (V-WR) oder das rekombinante Vaccinia-Virus (rV-CEA). Zwei Tage nach der letzten Immunisierung wurden 2·10⁵ MCA38-Maus-Adenokarzinomzellen, denen das Human-CEA-Gen transduziert worden war, subkutan in die Mäuse transplantiert. Die Tiere wurden wöchentlich auf Tumoranwesenheit untersucht. Die Tumore wurden mit Hilfe von Kalibern in zwei Dimensionen gemessen und das Volumen nach der Formel Breite² × Länge : 2 berechnet.
9 zeigt die Ergebnisse des Wachstums von subkutanen Tumoren von 10 einzelnen Mäusen nach drei Immunisierungen mit entweder dem Wildtyp-Vaccinia-Virus (V-WR; 9A) oder dem rekombinanten Vaccinia-Virus (rV-CEA; 9B). Es ergab sich nicht nur eine dramatische Verringerung des Tumorwachstums, sondern Immunisierungen mit rekombinanten Vaccinia (rV-CEA) verzögerten das Einsetzen des Tumorwachstums um 7–10 Tage. Dagegen wiesen die Tiere, denen Wildtyp-Virus (V-WR) verabreicht worden war, über die gesamte Beobachtungszeit von 56 Tagen schnell wachsende Tumore auf.
BEISPIEL 10
Therapie mit Vaccinia und Cyclophosphamid
Vier bis fünf Wochen alte, weibliche C57/BL6-Mäuse, erhalten von der Frederick Cancer Research Facility, wurden mit Cyclophosphamid (100 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion behandelt. Zwei Tage nach dieser Injektion wurden 2.10⁵ MCA38-Maus-Adenokarzinomzellen, denen das Human-CEA-Gen transduziert worden war, durch subkutane Injektion transplantiert. Zehn Tieren pro Gruppe wurden zwei Tage nach Tumor-Implantation 10 μl rohen Lysates inokuliert, das 1·10¹⁰ pfu Wildtyp-, V-WR- oder rekombinantes Vaccinia-Virus, rV-CEA, enthielt. Die zweite und die dritte Virus-Inokulation erfolgten in 14-tägigen Abständen. Die Tiere wurden wöchentlich auf die Anwesenheit von Tumoren untersucht. Die Tumore wurden mit Hilfe von Kalibern in zwei Dimensionen gemessen und das Volumen nach der Formel Breite² × Länge : 2 berechnet.
Cyclophosphamid ist ein Alkylierungsmittel, von dem angenommen wird, dass es Immunantworten in Tumor-kranken Tieren und Menschen moderiert. Es ist bekannt, dass Suppressor-T-Zellen auf diesen Stoff in Konzentrationen empfindlich sind, die auf andere Subpopulationen von Lymphozyten keine Wirkung haben. Dieser Stoff kann daher vielleicht die zelluläre Wirts-Immunerkennung und -antworten gegen Tumorzellen verstärken. Wir zeigen, dass Immunmodulation des Wirts-Immunsystems mit Cyclophosphamid, das vor der Impfung verabreicht wird, die Antitumor-Antwort auf die Immunisierungen verstärken kann.
10 zeigt die Ergebnisse des Wachstums von Human-CEA exprimierenden MCA38-Tumoren in Tieren, denen Cyclophosphamid und Vaccinia-Immunisierungen verabreicht wurden. Zehn einzelnen Tieren wurden 3 Immunisierungen mit entweder Wildtyp-Vaccinia (V-WR; 10A) oder rekombinantem (rV-CEA; 10B) nach Tumorimplantation verabreicht. Tiere, die Cyclophosphamid und rekombinantes Vaccinia (rV-CEA) erhielten, zeigten eine dramatische Größenverringerung der Tumore über 49 Tage. Zwei Tiere bildeten keine Tumore aus. Diese Tiere wurden dann erneut mit 2·10⁵ MCA38-Maus-Adenokarzinomzellen, die CEA exprimieren, kontaktiert und entwickelten 120 Tage nach dem Kontakt keine Tumore. Dagegen wurde das Tumorwachstum in Tieren, denen das Wildtyp-Vaccinia (V-WR) und Cyclophosphamid verabreicht worden war, nicht abgebrochen. Auch Tiere, die keine Vaccinia, aber Cyclophosphamid erhielten, unterbanden nicht das Tumorwachstum.
BEISPIEL 11
Therapie mit Vaccinia und rekombinantem Human-Interleukin-2
Vier bis fünf Wochen alte, weibliche C57/BL6-Mäuse, erhalten von der Frederick Cancer Research Facility, wurden durch subkutane Injektion von 2 μ10⁵ MCA38-Maus-Adenokarzinomzellen inokuliert, die Human-CEA exprimieren. An den Tagen +1, +2, +3 und +4 nach Tumortransplantation wurden den Mäusen 25.000 Einheiten gereinigtes rekombinantes Human-Interleukin-2 (rh IL-2; Cetus Corp.), 3,6·10⁶ Einheiten/mg, zweimal täglich durch intraperitoneale Injektion verabreicht. Ebenfalls am Tag +2 wurden den Tieren durch Schwanzhautritzung 10 μl von 1·10¹⁰ pfu entweder Wildtyp(V-WR) oder rekombinantes Vaccinia-Virus (rV-CEA) verabreicht. Die beiden nächsten Immunisierungen erfolgten im Abstand von 14 Tagen. Die Tiere wurden wöchentlich auf die Anwesenheit von Tumoren untersucht. Die Tumore wurden mit Hilfe von Kalibern in zwei Dimensionen gemessen und das Volumen nach der Formel Breite² × Länge : 2 berechnet.
Mitunter wurden Antitumor-Wirkungen sowohl in Maustumor-Modellen, als auch in der Behandlung von Menschen mit metastatischem Krebs bei Verwendung hoher Dosen individueller rekombinanter Zytokine erzielt. So haben beispielsweise Rosenberg et al. (N. Eng. J. Med. 131: 1485–1492, 1985) Tumorrückbildung bei Verwendung hoher Dosen von Interleukin-2 allein oder in Verbindung mit adaptiver Zelltherapie bei Mäusen und Menschen erreicht. Interleukin-2 ist ein Protein, das von aktivierten Helfer-T-Lymphozyten abgegeben wird. Es ist wesentlich für die Entwicklung durch Antigen ausgelöster T-Lymphozyten und zytotoxischer T-Zellen, die bei Malignität häufig gehemmt werden. Es ist gezeigt worden, dass die durch Interleukin-2 (IL-2) entwickelten zytotoxischen T-Zellen in vivo Antitumor-Aktivität behalten.
Interleukin-2 fördert auch das Wachstum natürlicher Killerzellen (NK) und stärkt in vivo die natürliche Maus-Killerzellen-Zytotoxizität. Es wurde gezeigt, dass Immunmodulation des Immunsystems des Wirtes durch rekombinantes Human-Interleukin-2 (rh IL-2), das vor der Impfung mit dem rekombinanten Impfstoff verabreicht wurde, Antitumor-Antworten verstärkte.
11 stellt die Wirkung der Verabreichung von rekombinantem Interleukin-2 (rh IL-2) und rekombinantem Vaccinia-Virus (rV-CEA) auf das Wachstum von MCA38-Maus-Adenokarzinomzellen, die Human-CEA exprimieren, dar. Fünf Tieren pro Gruppe wurde rekombinantes Human-Interleukin-2 (rh IL-2) allein (11A) verabreicht, oder rekombinantes Human-Interleukin-2 und folgende Immunisierungen mit entweder Wildtyp-Vaccinia-Virus (V-WR; 11B), oder rekombinantem Vaccinia-Virus (rV-CEA; 11C) durch Schwanzhautritzung 2 Tage nach der Tumortransplantation. Tiere, die rekombinantes Human-Interleukin-2 (rh IL-2) und das rekombinante Vaccinia-Virus (rV-CEA) erhielten, zeigten eine dramatische Verringerung des Tumorwachstums im Laufe von 42 Tagen. Dagegen entwickelten Tiere, denen das rekombinante Human-Interleukin-2 (rh IL-2) und Wildtyp-Virus (V-WR) oder rekombinantes Human-Interleukin-2 (rh IL-2) alleine verabreicht wurde, schnell wachsende Tumore.
BEISPIEL 12
Konstruktion und Test rekombinanter Vaccinia-CEA unter Verwendung des New-York-City-Stammes von Vaccina
Ein rekombinantes CEA-Vaccinia-Virus wurde unter Verwendung des Vaccina-Virus-Stammes des New York City Board of Health, erhalten von ATCC (Nr. VR-325; Rockville), hergestellt. Das rekombinante Virus, bezeichnet mit rV (NYC)-CEA, wurde durch homologe Rekombination des PSC 11-Plasmids, das das Human-CEA-Gen enthält, hergestellt, wie im Allgemeinen in Beispiel 1 oben beschrieben wurde. Das PSC 11-Plasmid enthielt das LacZ-Gen von E. coli unter der Kontrolle des späten Promotors p-11 des Vaccinia-Virus. Die Verwendung dieses Plasmids stellte ein Auswahl-Verfahren zum Erhalten rekombinanter Virus-Teilchen zur Verfügung. Die Expression von rV (NYC)-CEA wurde durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung von monoklonalem Antikörper COL-1 nachgewiesen. Das Virus wurde in Spinner-Kulturen auf HeLa-Zellen gezüchtet, direkt durch Zentrifugieren pelletiert und auf 20–40% Saccharose-Gradient nach Mackett et al., J. Virol. 49: 857–864, gereinigt.
Die Molekulargewichte des CEA-Produktes, das von den rekombinanten Konstrukten rV(NYC)-CEA und rV(WR)-CEA exprimiert wurde, wurden durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung von monoklonalem anti-CEA-Antikörper-COL-1 bestimmt. Das Produkt von 180 Kilodalton von gereinigtem Human-CEA und CEA, das in einem Extrakt der anerkannten Human-Kolonkarzinom-Zelllinie GEO festgestellt wurde, wurden als Vergleichsproben verwendet. Extrakte von Zellen, die mit V-NYC, rV(NYC)-CEA, V-WR und rV(WR)-CEA infiziert worden waren, wurden ebenfalls auf Membranen übertragen und mit COL-1 analysiert.
Die mit rV(NYC)-CEA infizierten Zellen exprimierten ein Produkt von 90 Kilodalton, während die mit dem Wildtyp V-NYC oder V-WR infizierten Zellen keine Anwesenheit von CEA zeigten. Auf der anderen Seite exprimierten mit rV(WR)-CEA infizierte Zellen Produkte von 90 und 180 Kilodalton, die mit COL-1 reagierten. Die Gründe für die Variante beim Expressionsprodukt sind gegenwärtig nicht bekannt; Northern-Blot-Analyse von mit entweder rV(NYC)-CEA oder rV(WR)-CEA infizierten BS-C-1-Zellen ergab mRNA-Arten von 2,4 bis 2,5 kb, was zeigt, dass das gesamte CEA-Transkript in diesen Zellen vorhanden war.
Das stärker attenuierte rV(NYC)-CEA-Konstrukt wurde verwendet, um die Entwicklung von Tumortransplantaten in einem Tiermodell zu verhüten. Die MC-38-Kolonkarzinomzellen mit und ohne das transduzierte Human-CEA-Gen wurden verwendet, um festzustellen, ob Antitumor-Wirkungen gegen CEA gerichtet waren. Der Wildtyp V-NYC wurde ebenfalls als Vergleichs-Immunogen verwendet, um sicherzustellen, dass die erzeugten schützenden Immunantworten die Folge des Human-CEA-Gens waren, das in den NYC-Vaccinia-Stamm eingesetzt worden war.
Wie in den 12A und 12B dargestellt, verliehen weder das Wildtyp-, noch das rekombinante Vaccinia-Konstrukt ohne CEA-Insert irgendeinen Schutz gegen das Wachstum transplantierter, nicht mit CEA transduzierter Tumorzellen. Tumore aller zehn Mäuse jeder Gruppe wuchsen schnell mit ungefähr derselben Rate. Nicht transduzierte und mit CEA transduzierte MC-38 Tumore wuchsen mit ähnlichen Raten in Vergleichstieren, die keine Vaccinia-Inokulation erhalten hatten, und mit derselben Rate, wie Tumore, die in Mäusen wuchsen, die Inokulationen von Wildtyp-Vaccinia (V-NYC) erhalten hatten.
12C und 12D vergleichen die Effektivität von V-NYC gegenüber rV(NYC)-CEA in der Hemmung der Transplantation von mit CEA transduzierten Kolonkarzinomzellen. Wie in 12C zu sehen, wuchsen in Mäusen, die mit dem Wildtyp V-NYC geimpft waren, 8/10 der transplantierten Tumore schnell und gegebenenfalls wuchsen alle 10 Tumore. Dagegen wuchsen keine Tumore in irgendeiner der 10 mit dem rV(NYC)-CEA-Konstrukt geimpften Mäuse. Darüber hinaus blieben diese mit rV(NYC)-CEA immunisierten Mäuse für 120 Tage nach ihrer ersten Tumor-Belastung Tumor-frei; am Tag 120 wurden sie mit 1·10⁶ mit CEA transduzierten Tumorzellen kontaktiert und blieben wieder über eine weitere Beobachtungszeit von 120 Tagen Tumor-frei. Es wurde keine Toxizität aufgrund der Verabreichung von rV(NYC)-CEA oder V-NYC beobachtet.
Es wurde auch gezeigt, dass Impfung mit dem rV(NYC)-CEA-Konstrukt in der Tumorbehandlung wirksam ist, d. h. das Wachstum gebildeter Tumore hemmt. Tumore wurden sieben Tage vor Behandlung mit rekombinantem Vaccinia-Virus Tieren transplantiert. Wie in den 13A und 13B zu sehen, waren die Wachstumsraten der MC-38-Karzinomzellen (nicht mit CEA transduziert) ähnlich, unabhängig davon, ob die V-NYC- oder rV(NYC)-CEA-Konstrukte für die Behandlung verwendet wurden. Ähnliche Tumor-Wachstumsraten wurden auch an Mäusen beobachtet, die die mit CEA transduzierten MC-38-Zellen trugen, wenn sie mit dem Wildtyp-V-NYC behandelt wurden (13C). Dagegen wurde jedoch stark verringertes Tumor-Wachstum in allen 10 Tumore tragenden Mäusen festgestellt, die mit dem rV(NYC)-CEA-Konstrukt behandelt wurden (13D). Darüber hinaus wurden drei Tiere in dieser Gruppe, die in vier Monaten keine Tumore entwickelten, erneut mit 1·10⁶ mit CEA transduzierten MC-38-Zellen kontaktiert und blieben über eine zusätzliche Beobachtungszeit von 120 Tagen Tumor-frei. Nicht mit CEA transduzierte MC-38-Tumore, die gleichzeitig auf der gegenüberliegenden Seite implantiert wurden, wuchsen an der Stelle. Keine Toxizität aufgrund der Verabreichung von rV(NYC)-CEA wurde bei den behandelten Tieren beobachtet.
Die Art der vom rV(NYC)-CEA-Vaccinia-Impfstoff hervorgerufenen Immunantwort wurde untersucht. Wie Tabelle 2 zu entnehmen, betrugen die Serum-Titer auf CEA bei Mäusen, denen rV(NYC)-CEA verabreicht worden war, von 1 : 700 bis 1 : 5.250 (Mittelwert 1 : 2.255), während Titer bei oder unter 1 : 20 (Mittelwert ≤:1 : 82) in allen 14 Mäusen beobachtet wurden, die mit V-NYC inokuliert worden waren, und bei allen 24 Seren vor Inokulation. Alle Seren in der Gruppe vor Inokulation und in Gruppen, die mit einem der Vaccinia-Konstrukte inokuliert worden waren, waren auch negativ oder schwach positiv in der Reaktivität auf Ovalbumin, mit Ausnahme einer Maus mit einem Titer von 1 : 750. Die Dynamik des Anwachsens der Antikörper-Titer nach Inokulation mit rV(NYC)-CEA wurde ebenfalls beobachtet. Nach der ersten Inokulation gab es einen leichten Anstieg des anti-CEA-Titers, der nach der zweiten und dritten Inokulation mit rV(NYC)-CEA stark anwuchs.
Tabelle 2 Reaktivität von Seren, die aus mit rV(NYC)-CEA und V-NYC inokulierten Mäusen stammten, gegen gereinigtes CEA und Ovalbumin
Humorale Antwort von Mäusen, die mit rV(NYC)-CEA und Wildtyp rV-NYC inokuliert worden waren. C57/BL6-Mäuse wurden dreimal durch Schwanzhautritzung mit 10⁷ pfu gereinigten rV(NYC)-CEA oder V-NYC inokuliert. Beginnend mit 1 : 50, fünffache Verdünnungen von Seren, die vor der Immunisierung abgenommen worden waren (mit „Vor" bezeichnet) und am Tag 35 nach Immunisierung wurden durch ELISA auf Reaktivität mit gereinigtem CEA und Vergleichsantigen, Ovalbumin, getestet. Individuelle Serum-Titer wurden als Verdünnungsfaktor bei einer optischen Dichte (A490) von 0,5 bestimmt.
Zellvermittelte Immunantworten auf das rV(NYC)-CEA-Konstrukt wurden unter Verwendung von Tests auf Spättyp-Hypersensibilität (DTH), Lymphozytenvermehrung und Zytotoxizität gemessen. DTH-Reaktionen wurden in Mäusen bestimmt, die entweder zwei- oder dreimal mit rV(NYC)-CEA oder V-NYC durch Schwanzhautritzung (10 μl von 10⁷ pfu) in 14-tägigem Abstand inokuliert worden waren. Sechs Tage nach der letzten Vaccinia-Inokulation wurden in eine Pfote bestrahlte, nicht transduzierte MC-38-Zellen injiziert (20 μl mit 5·10⁵ MC-38-Zellen in PBS) und in die andere bestrahlte, mit CEA transduzierte MC-38-Zellen (5·10⁵ MC-38-CEA-2-Zellen in PBS). Die Dicke der Pfoten wurde 48 Stunden nach der Belastung gemessen.
Keine oder geringe Unterschiede zwischen den Pfoten wurden bei Mäusen festgestellt, denen PBS-Vergleichslösung injiziert worden war, und die dann zur Bestimmung von Bezugslinienwerten verwendet wurden. Ähnliche negative Werte wurden erhalten, als Mäusen zweimal das V-NYC-Konstrukt inokuliert wurde. Zwei von zehn Mäusen, denen zweimal rV(NYC)-CEA injiziert wurde, zeigten eine gewisse Differential-Schwellung in der Pfote, in die die mit CEA transduzierten Tumorzellen injiziert worden waren. Mäuse, denen dreimal V-NYC-Konstrukt injiziert worden war, zeigten eine geringe oder keine DTH-Antwort auf die mit CEA transduzierten Tumore, während die Mehrheit der Mäuse (14/20), denen dreimal rV(NYC)-CEA-Konstrukt injiziert wurde, eine Differential-DTH-Reaktivität auf die mit CEA transduzierten Tumorzellen zeigten. Der Unterschied in den DTH-Ergebnissen nach drei Injektionen von rV(NYC)-CEA gegenüber dem V-NYC-Konstrukt war statistisch signifikant (p < 0,001, Student-Test). Die Ergebnisse zeigten also, dass drei Verabreichungen von rV(NYC)-CEA deutlich effektiver waren, als zwei Verabreichungen (p-Wert von <0,001 gegenüber <0,01), für die Bewirkung einer DTH-Reaktion auf mit Human-CEA transduzierte Tumorzellen.
Zur Einschätzung der Lymphozytenvermehrung in Antwort auf Impfung mit rV(NYC)-CEA wurden T-Zellen aus der Milz aus nicht immunisierten oder immunisierten Mäusen 28 Tage nach der dritten und letzten Impfung auf funktionelle Kompetenz und Antigenspezifizität, angegeben durch Vermehrung in Antwort auf verschiedene Stimuli, untersucht (Tabelle 3). Von den drei Gruppen getesteter T-Lymphozyten antworteten nur die von mit rV(NYC)-CEA immunisierten Mäuse auf lösliches CEA. Die Antigenspezifizität wurde unter Verwendung von Ovalbumin bestimmt, einem irrelevanten löslichen Antigen, das keine Lymphozyten von diesen Mäusen stimulierte. Zusätzlich zu CEA antworteten Lymphozyten aus rV(NYC)-CEA-Mäusen auf durch UV-Bestrahlung inaktivierte Vaccinia-Viren bei Erinnerungs-Kontakt in vitro. Außerdem zeigten Lymphozyten aus Mäusen, die V-NYC erhielten, aber nicht von nicht immunisierten Mäusen, Reaktivität auf durch UV-Bestrahlung inaktivierte Vaccinia-Viren, wodurch Spezifizität auf dieses Virus-Antigen und funktionelle Kompetenz der V-NYC-Gruppe bestätigt wurde. Schließlich antworteten alle drei Gruppen von Lymphozyten stark auf Con A als allgemeinen Maßstab für funktionelle Kompetenz von T-Zellen. Immunisierung mit rV(NYC)-CEA, aber nicht V-NYC, bewirkte also eine T-Zellen-Antwort auf CEA, was mit einer Antitumorwirkung in vivo korreliert.
Tabelle 3 Lymphozytenvermehrungs-Antworten von mit V-NYC oder rV(NYC)-CEA immunisierten Mäusen
Um die Anwesenheit einer durch den Impfstoff induzierten anti-CEA-Zytotoxizitäts-Antwort in den Tieren zu bestimmen, wurden T-Lymphozyten aus der Milz direkt von mit V-NYC oder rV(NYC)-CEA immunisierten Mäusen 5 Tage nach einem zweiten Kontakt mit Vaccinia isoliert, da die Anregung zytotoxischer Lymphozyten kurz nach einer Auffrischung maximal sein sollte. Die in Tabelle 4 angegebenen Ergebnisse zeigen, dass Lymphozyten von mit rV(NYC)-CEA, nicht aber mit V-NYC immunisierten Mäusen die Lyse von MC-38-CEA-2-Tumorzellen vermittelten, die das verwandte Antigen aufweisen. Dagegen konnten unter ähnlichen Inkubationsbedingungen mit beiden Effektor-Gruppen nur Hintergrundniveaus lytischer Aktivität gegen MC-38, das CEA-negative Tumorziel, festgestellt werden. In Anwesenheit von Con A, das Antigenspezifische Erkennung umgeht und Lektin-abhängige zelluläre Zytotoxizität erleichtert, lysierten beide Effektor-Gruppen wirksam MC-38, was bestätigt, dass Lymphozyten von Mäusen, die V-NYC erhalten, lytisch aktiv waren und dass die Tumorzelllinie nicht an sich gegen Lyse resistent war.
Tabelle 4 Durch zytotoxische Lymphozyten vermittelte Lyse bei CEA exprimierenden Tumoren
BEISPIEL 13
Immunogenität und Sicherheit von rV(NYC)-CEA-Impfstoffen bei Primaten Untersuchungen wurden ausgeführt, um die Immunantwort zu bestimmen, die von rV(NYC)-CEA-Impfstoff bei Primaten hervorgerufen wird, und um die Sicherheit eines derartigen Impfstoffs einzuschätzen.
Zwölf erwachsene, männliche Rhesusaffen (Macaca mulatta), 5 bis 7 Jahre alt, wurden verwendet. Die Affen wurden entweder drei- oder viermal in Abständen von 6 Wochen durch Hautritzung mit 10 μl oder 50 μl gereinigtem Virus immunisiert, die 1·10⁸ oder 5·10⁸ Plaquebildungseinheiten (plaque forming units, pfu) von entweder rV(NYC)-CEA oder V-NYC enthielten. Vier Tiere erhielten 1·10⁸ pfu rV(NYC)-CEA, vier Tiere erhielten 5·10⁸ pfu rV(NYC)-CEA und vier Tiere erhielten 5·10⁸ pfu V-NYC. Das Immunisierungsprotokoll ist im Einzelnen in Tabelle 5 angegeben.
Tabelle 5 Inokulationsprotokoll von Rhesusaffen mit dem rekombinanten CEA- und Wildtyp-Vaccinia-Virus
Sicherheit: Der Bereich der Läsionen, die mit den Impfstoffen behandelt wurden, wurde 24 Stunden nach jeder Inokulierung analysiert. Im Allgemeinen wurden stärkere Schwellungen nach den ersten beiden Inokulationen festgestellt, als nach der dritten oder vierten Inokulation. Die Dauer der Läsionen nach jeder Immunisierung war jedoch ungefähr dieselbe. Örtliche Lymphknotenschwellungen nach der Impfung waren in einigen Affen nach der ersten Immunisierung stärker, als nach der zweiten, dritten oder vierten Immunisierung. Im Allgemeinen wurden keine Unterschiede in den Parametern bei Verwendung von rV(NYC)-CEA- oder V-NYC-Impfstoff festgestellt.
Affen, die das Wildtyp-Vaccinia-Virus erhielten, wurden mit den Affen, die das rekombinante Vaccinia-Virus erhielten, in Hinsicht auf Temperatur, Gewicht, örtliche Lymphadenopathie und die Anwesenheit von Splenomegalie und Nepatomegalie verglichen. Geringe Temperaturerhöhungen wurden in allen Tieren nach der Impfung festgestellt. Eine geringe örtliche Lymphadenopathie wurde über mehrere Wochen nach den Immunisierungen beobachtet, es gab jedoch keinen Hinweis auf Gewichtsverlust, Hepatomegalie oder Splenomegalie in irgendeinem der Tiere und keine Unterschiede zwischen mit Vergleichs- und rekombinantem Impfstoff geimpften Tieren. Die Tiere wurden auf vollständiges Blutbild, Differentialblutbild, die Leber (Serumalbumin, Bilirubin, SGOT, SGPT und γ-Glutamyl-transpeptidase) und die Nieren (Niveaus von Harnstoftstickstoff und Serumcreatin im Blut) betreffende Zusammensetzung untersucht, die alle in allen Tieren über den ganzen Untersuchungszeitraum normal blieben, bzw. es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen mit rekombinantem Impfstoff geimpften und mit Wildtyp geimpften Tieren beobachtet.
Affen- (und Human-) Granulozyten wurden auf die Expression von nicht spezifischem Kreuzreaktions-Antigen (NCA) und CEA bestimmt. Es wurde gezeigt, dass das CEA-Gen zur Immunoglobulin-Gen-Familie gehört und eine gewisse Homologie zu Proteinen aufweist, die auf einigen normalen Erwachsenengeweben exprimiert werden, wie etwa NCA, das auf normalen Human-Granulozyten vorkommt. Es wurde früher nicht gezeigt, dass CEA auf Human-Granulozyten exprimiert wird. Die Möglichkeit der Einleitung einer immunologischen Kreuzreaktivität auf NCA wurde durch Differential-Blutbild und ELISA bestimmt. Es gab keinen Unterschied in den Differentialblutbildern irgendwelcher der geimpften Tiere und es wurden keine anti-NCA-Antworten durch Impfung mit rV(NYC)-CEA eingeleitet. Die Oberflächen-Expression von NCA auf Affen-Granulozyten wurde durch Durchflusszytometrie unter Verwendung monoklonaler B6.2-Antikörper (von denen früher gezeigt worden ist, dass sie mit Human-NCA reagieren; Horan Hand et al., Int. J. Biol. Mackers 7: 1–15 (1992) und B1.1-Antikörper bestimmt (von denen früher gezeigt worden ist, dass sie mit einem Epitop reagieren, das NCA und CEA gemeinsam ist; Kuroki et al., Int. J. Cancer 44: 208–218 (1989)). Beide Antikörper zeigten signifikante Oberflächen-Reaktivität auf NCA an der Oberfläche der Affen-Granulozyten. Immunisierung der Tiere mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus, das CEA exprimiert, rief keinerlei sichtbare Immunantworten gegen NCA-Epitope hervor.
Immunogenität: Immunisierte Affen wurden auf humorale und zelluläre Immunantworten getestet, die durch rV(NYC)-CEA eingeleitet wurden.
Seren jedes der Affen wurden in ELISA auf Immunoreaktivität auf CEA, NCA und Ovalbumin (OVA) als Vergleichsantigen analysiert. Anti-CEA-Antikörper wurde mit ELISA unter Verwendung von Mikrotiterplatten quantifiziert, die mit 100 ng gereinigtem CEA, NCA (gereinigt aus rohen Perchlorsäure-Auszügen normaler menschlicher Lunge nach Koroki et al., Cancer Res. 211: 713–720 (1981)) oder Ovalbumin (Sigma, St. Louis) in PBS beschichtet waren. Die Platten wurden mit 5% BSA in PBS blockiert, getrocknet und bei –20°C bis zur Verwendung gelagert. Die Platten wurden mit verschiedenen Verdünnungen von Affen-Seren, sowie monoklonalem Antikörper COL-1 als Standard-Vergleichsprobe für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und Antikörper mit auf mit Meerrettich-Peroxidase konjugiertem Ziegen-Anti-Mensch--IgG Fc spezifischen Antiseren (1 : 8000; Southern Biotechnology Inc., Birmingham, AL), gefolgt von einer Inkubation über 10 Minuten mit 100 μl 2,8 mM o-Phenylendiamin-dihydrochlorid in 0,015% Wasserstoffperoxid in 0,17 Phosphat-Citrat-Puffer, pH = 5,0, nachgewiesen. Die Reaktionen wurden durch Zusatz von 25 μl 4N-Schwefelsäure abgebrochen und die Absorption bei 490 nm unter Verwendung eines ELISA-Microplattenlesers von Bio-Tek abgelesen.
Die in Tabelle 6 angegebenen Ergebnisse zeigen, dass alle Seren vor Immunisierung negativ auf alle drei Antigene waren. Am Tag 28 nach der ersten Immunisierung wurden starke Antikörper-Titer (größer als 1 : 1.000 Serum-Verdünnung) gegen CEA in zwei der acht mit rV(NYC)-CEA inokulierten Affen beobachtet. Am Tag 49, eine Woche nach der ersten Auffrischung, wurden Antikörper-Titer von oder größer als 1 : 250 Serum-Verdünnung bei allen acht Affen beobachtet, die das rV(NYC)-CEA erhielten und bei keinem der Affen, die V-NYC erhielten. Ähnliche Ergebnisse wurden am Tag 63 beobachtet. Am Tag 91 (sieben Tage nach der zweiten Auffrischung) wurden Antikörper-Titer größer als 1 : 1.000 Serum-Verdünnung bei allen sieben getesteten Affen festgestellt, die rV(NYC)-CEA erhielten, mit Titern größer als oder gleich 1 : 5.800 bei vier Affen. Eine Immunantwort auf NCA von 1 : 1250 wurde bei einem der acht Affen, die rV(NYC)-CEA erhielten, am Tag 91 beobachtet, es wurde jedoch bei diesem Aften auch eine gewisse Reaktivität auf OVA festgestellt. Zwei andere Affen, einer, der V-NYC erhielt und einer, der rV(NYC)-CEA erhielt, zeigten ebenfalls einen gewissen Antikörper-Titer gegen NCA am Tag 91; identische Titer wurden jedoch auch gegen OVA festgestellt, was eine potentielle nicht spezifische Reaktivität nahelegt. Es wird also deutlich, dass das rV(NYC)-CEA eine starke Antwort auf auf CEA exprimierte Epitope in Rhesusaffen bei geringer oder ohne Antwort auf NCA-spezifische Epitope hervorrief. Der Zeitverlauf der Antwort gegen CEA ist in 14 dargestellt.
Eine Serumprobe von einem Affen 35 Tage nach der ersten Impfung mit rV-CEA wurde durch Western Blot auf Reaktivität auf CEA, NCA und Ovalbumin analysiert. Es zeigte sich in den Blots, dass das Antiserum gereinigtes CEA erkennt, nicht aber Ovalbumin oder gereinigtes NCA. Von demselben Affen stammende Seren vor Immunisierung stellten kein CEA, NCA oder Ovalbumin fest. Monoklonale Antikörper COL-1 und B6.2, die CEA bzw. NCA erkennen, wurden als positive Vergleichsproben verwendet.
Die biologische Aktivität der Immunglobuline, die vom rV(NYC)-CEA-Impfstoff hervorgerufen werden, wurde durch Antikörper-unabhängige Zytotoxizitäts-Tests analysiert, in denen menschliche periphere mononukleäre Zellen des Blutes als Effektoren und mit Human-CEA transduzierte Maus-Tumorzelllinien als Ziele dienten. Nicht transduzierte Zellen dienten als Vergleichsproben. Wie in 15A dargestellt, wurde spezifische Lyse der CEA exprimierenden Tumorzellen bei Verwendung des Serums eines Affen festgestellt, der mit rV(NYC)-CEA immunisiert worden war, während keine Lyse bei Verwendung nicht transduzierter Tumorzellen als Zielen beobachtet wurde. Keine Lyse wurde mit Vorimpfungsseren festgestellt oder mit Seren von einem Affen, der mit V-NYC inokuliert worden war. Wie in 15B dargestellt, wurde die Aktivität der Seren von mit rV(NYC)-CEA immunisierten Affen unter Verwendung von mit IL-2 aktivierten menschlichen peripheren mononukleären Zellen des Blutes verstärkt.
Zelluläre Immunantworten, die durch rV(NYC)-CEA hervorgerufen worden waren, wurden durch Tests auf Spättyp-Hypersensitivitäts-Antworten (DTH) und Lymphozyten-Vermehrung bestimmt. Die DTH-Antworten wurden durch Hauttests 7 Tage nach der letzten Immunisierung bestimmt. Gereinigtes CEA (Vitro Diagnostics, Littleton, CO) und Ovalbumin (Sigma, St. Louis, MO) wurden in einer Konzentration von 100 μg in 0,1 ml PBS intrakutan injiziert. Als positiver Vergleichstest wurden 1·10⁷ pfu mit UV-Bestrahlung (254 nm für 10 Minuten) inaktivierter Vaccinia-Viren injiziert. Schwellungen und Erytheme wurden 48 Stunden später gemessen und Punch-Biopsien von positiven Antworten vorgenommen und der DTH-Charakter der Reaktion durch histopathologische Untersuchung bestätigt. Die Ergebnisse zeigten, dass alle sieben Affen, die rV(NYC)-CEA erhielten, immunogen und vier von fünf Affen, die den Vergleichstest mit V-NYC erhielten, immunogen mit einer positiven DTH auf die Injektion von inaktiviertem V-NYC-Vaccinia-Virus antworteten, während keiner der zwölf Aften auf die Vergleichsantigenbelastung mit Ovalbumin antwortete. Keiner der Affen, die mit V-NYC inokuliert wurden, antwortete auf CEA als Test-Antigen, während sieben von acht Affen, die mit rV(NYC)-CEA immunisiert wurden, mit DTH-Reaktionen auf die Injektionen von CEA-Antigen reagierten. Diese Ergebnisse sind in 16 dargestellt.
Für die Tests auf Lymphozyten-Vermehrung wurden von immunisierten Affen sechs oder zwölf Monate nach ihrer letzten Immunisierung PBMC (periphere mononukleäre Zellen des Blutes) isoliert. PBMC wurden aus heparinisiertem Blut unter Verwendung von Lymphozyten-Trennmedium isoliert und PBMC wurden durch Ausplattieren von 2·10⁵ Zellen pro Kavität in 0,2 ml RPMI 1640, supplementiert mit 10% durch Wärme inaktiviertem Kälberfötusserum, in 96-Kavitäten-Platten mit flachem Boden (Costar, Cambridge, MA) 6 Tage lang mit dem entsprechenden Antigen oder 3 Tage lang mit Concanavalin A (Con A; Sigma) kultiviert. Die Zellen wurden für die letzten 18–24 Stunden der Inkubation mit 1 μCi pro Kavität [³H]-Thymidin (New England Nuclear) inkubiert und mit einem PHD-CeII-Harvester (Cambridge Technology, Cambridge, MA) geerntet. Die eingefügte Radioaktivität wurde durch Flüssigkeits-Szintillations-Spektroskopie (Beckman LS 3801) gemessen und die Ergebnisse von dreifachen Kavitäten gemittelt und als Mittelwert ± Standardmessfehler angegeben.
Die Ergebnisse, dargestellt in Tabelle 7, zeigten, dass alle Affen gut antworteten, unabhängig davon, ob sie rV(NYC)-CEA oder V-NYC erhielten. Geringe oder keine auf CEA spezifische Lymphozytenantworten im Vergleich mit Ovalbumin wurden bei den mit V-NYC immunisierten Affen festgestellt. Gegenüber Ovalbumin zeigten sich jedoch Differentialantworten auf CEA bei den drei Affen, die mit rV(NYC)-CEA immunisiert waren, sogar 12 Monate nach der letzten Immunisierung. Diese Ergebnisse und die DTH-Ergebnisse beweisen also die Fähigkeit des rV(NYC)-CEA-Impfstoffes, spezifische zelluläre Antworten auf CEA hervorzurufen.

Claims

Rekombinantes Virus zur Verwendung bei der Immunbehandlung eines Karzinoms bei einem Säugetier, wobei die Karzinomzellen das karzinoembryonale Antigen (CEA) des Säugetiers exprimieren, und wobei das Virus ein eingesetztes CEA-Gen des Säugetiers aufweist, wodurch Zellen, die mit dem Virus infiziert werden, das CEA auf ihrer Oberfläche exprimieren und das Virus in der Lage ist, in dem Säugetier eine humorale und/oder zellvermittelte Immunantwort hervorzurufen, die gegen das CEA des Säugetiers und gegen Zellen, die das CEA des Säugetiers exprimieren, gerichtet ist.
Rekombinantes Virus nach Anspruch 1, wobei das Virus ein Pockenvirus ist.
Rekombinantes Virus nach Anspruch 1, wobei das Virus ein Vaccinia-Virus ist.
Rekombinantes Virus nach Anspruch 3, wobei das Vaccinia-Virus dem Stamm V-WR angehört.
Rekombinantes Virus nach Anspruch 3, wobei das Vaccinia-Virus dem Stamm NYC angehört.
Rekombinantes Virus nach Anspruch 1, wobei das Virus ein Geflügelpockenvirus ist.
Rekombinantes Virus nach Anspruch 1, wobei das CEA ein einziges oder multiples immunodominantes T-Zellen-Epitop aufweist.
Rekombinantes Virus nach Anspruch 3, wobei das Vaccinia-Virus einen Promoter enthält, der die Expression von CEA erhöht.
Rekombinantes Vaccinia-Virus, das aus rV-CEA (ATCC-Zugangsnummer VR 2323) besteht.
Rekombinantes Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Säugetier ein Mensch ist und das CEA ein menschliches CEA ist.
Rekombinantes Virus nach Anspruch 1, wobei die Karzinomzellen aus dem Epithel stammende Karzinomzellen aufweisen, die Epitope des CEA exprimieren.
Rekombinantes Virus nach Anspruch 1, in Kombination mit einem Biological Response Modifier zur Verabreichung mit dem rekombinanten Virus.
Rekombinantes Virus nach Anspruch 12, wobei der Biological Response Modifier ausgewählt wird aus Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-6 (IL-6), Interferon, Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) und Cyclophosphamid.
Rekombinantes Virus nach Anspruch 1 in Kombination mit einem Adjuvans zur Verabreichung mit dem rekombinanten Virus.
Rekombinantes Virus nach einem der Ansprüche 3 bis 14, wobei das Vaccinia-Virus mit einem verdünnten menschlichen Vaccinia-Virus-Stamm rekombiniert wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die das rekombinante Virus eines der vorhergehenden Ansprüche sowie eine) pharmazeutisch vertretbares) Verdünnungsmittel, Trägersubstanz oder Exzipiens enthält.
Anwendung eines rekombinanten Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Karzinoms.
Anwendung nach Anspruch 17, wobei das zu behandelnde Karzinom ein gastrointestinales Karzinom, ein Karzinom in der Brust, ein Pancreas-, Blasen-, Eierstock-, Lungen- oder Prostatakarzinom ist.
Anwendung nach Anspruch 17, wobei die Behandlung des Karzinoms umfasst, dass das Immunsystem des Säugetiers gegen das CEA angeregt wird, um die Bildung und das Wachstum der Karzinomzellen zu verhindern.