AT399656B - Verfahren zur herstellung von krebsvakzinen - Google Patents

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Description

AT 399 656 B
Die Erfindung bezieht sich auf die Gentherapie, insbesondere auf ihre Anwendung im Rahmen der Krebstherapie.
In den letzten 20 Jahren hat es keinen entscheidenden Durchbruch bei der Behandlung von Krebserkrankungen gegeben, erst der kürzlich entwickelte Ansatz der sog. "Krebsvakzine" hat die Hoffnung auf einen Fortschritt in der Krebstherapie geweckt
In Krebspatienten hat das Immunsystem einen großen Einfluß auf die Entwicklung des Tumors und auf die Prognose der Krankheit Im Patienten mit malignem Melanom kann die Immunantwort zu einer vollständigen Rückbildung des Tumors in 0.5 % der Patienten führen. In den meisten Patienten wird jedoch eine Immunantwort, die die Tumorentwicklung kontrolliert, jedoch nicht alle Krebszellen ausschalten kann, in frühen Stadien des Tumors beobachtet. In fortgeschrittenen Stadien findet man oft die Situation, daß die Krebszellen der Immunerkennung entkommen oder das Immunsystem spezifisch unterdrückt wird (Hoon et al., 1990). Es wurde vorgeschiagen, nach der chirurgischen Entfernung des Primärtumors dem Patienten Krebsvakzine zu verabreichen. Krebsvakzinem enthalten Krebszellen, die genetisch modifiziert sind, oder Krebszellen in Kombination mit immunstimulierenden Adjuvantien, die im Patienten eine krebsspezifische Immunantwort induzieren oder reaktivieren (s. z.B. Hoon et al., 1990; Bystryn et al., 1990 und 1992; Berd et al., 1990; Fearon et al., 1990; Lotze et al., 1992; Pardoll, 1992; Rosenberg et al-, 1992, Schirrmacher, 1990). Mit der krebsspezifischen Immunantwort soll erreicht werden, daß nach Entfernung des Tumors Mikrometastasen, die bisher klinisch nicht nachweisbar sind und chirurgisch nicht entfernt werden können, zerstört werden, um ein späteres Wiederauftreten von Krebs zu verhindern.
Eine Therapie auf Basis von Krebsvakzinen stellt - im Gegensatz zur unspezifischen Stimulation des Immunsystems - eine aktiv-spezifische Immuntherapie mit Impfstoffen aus inaktivierten, möglichst patienteneigenen Tumorzellen oder Teilen davon dar, wodurch das Immunsystem des Patienten gezielt gegen Antigene des individuellen Tumors oder zumindest desselben Tumortyps mobilisiert wird.
Nachdem sich gezeigt hatte, daß eine Inaktivierung der Tumorzellen eine Verminderung der Immunantwort bewirken kann, wurden in jüngster Zeit Krebsvakzinen entwickelt, die aus lebensfähigen Tumorzellen bestehen (Rosenberg et al., 1992). Es ist jedoch aus Sicherheitsgründen ein Impfstoff auf der Grundlage nicht mehr teilungsfähiger Zellen erstrebenswert, die eine begrenzte Lebensdauer haben.
Einer der kritischen Schritte bei der Herstellung von Krebsvakzinen ist ferner der Gentransfer in die Zellen, die das Vakzin bzw. einen Bestandteil davon darstellen.
Die bisher für den Transfer von Genen in die Zelle, u.aJm Rahmen der Anwendung von Krebsvakzinen, am weitesten fortgeschrittene Technik benutzt rekombinante retrovirale Vektoren; eine solche Methode wurde kürzlich von Rosenberg et al., 1992, vorgeschlagen. Die Verwendung von Retroviren ist jedoch problematisch, weil sie, zumindest zu einem geringen Prozentsatz, die Gefahr von Nebenwirkungen, wie Infektion mit dem Virus, in sich birgt. Darüber hinaus können Retroviren nur sich teilende Zellen transduzie-ren. Außerdem sind diese Vektoren, wie auch die als Alternative zum retroviralen System vorgeschlagenen rekombinanten Adenoviren, Beschränkungen, und zwar hinsichtlich der Größe und Konstruktion der zu transferierenden DNA, unterworfen. Kürzlich wurde in mehreren Arbeiten der Einsatz von nichtrekombinanten Adenoviren aufgrund der Fähigkeit dieser Viren, den Inhalt von Endosomen freisetzen zu können, für den Gentransfer mit DNA-Komplexen mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose vorgeschlagen. Der Einsatz von Adenoviren bewirkt eine Steigerung der Effizienz des Gentransfers, indem der Abbau der in die Zelle intemalisierten DNA-Komplexe in den Lysosomen vermieden wird (Curiel et al., 1991; Curiel et al., 1992a; Zatioukal et al., 1992; Cotten et al., 1992; Wagner et al., 1992; Curiel et al., 1992b). U.a. wurde vorgeschlagen, die Adenoviren durch Bindung an Polylysin zu modifizieren. Die Adenovirus-Polylysin-Konjugate können zusammen mit Konjugaten aus Transferrin-Polylysin mit DNA komplexiert werden, wobei ternäre Transferrin-Polyly-sin/Adenovirus-Poiylysin/DNA-Komplexe entstehen (Wagner et al., 1992). Die Komplexe binden an Transferrin- und Adenovirusrezeptoren auf den Zielzelten. Nach der Endozytose bewirkt das Adenovirus den Aufbruch von Endosomen, das hat die Freisetzung des Materials vom Endosom ins Zytoplasma zur Folge. Die DNA kann daraufhin in den Kern eintreten, wo das Gen exprimiert wird, überwiegend von episomal lokalisierter DNA. Diese Technik hat gegenüber den konventionellen viralen und nichtviralen Gentransfermethoden folgende Vorteile: Da in diesem Zusammenhang das Adenovirus nur als Mittel für die Freisetzung der Transfektionskomplexe aus dem Endosom fungiert, kann das Virus mittels genetischer und/oder chemischen Methoden inaktiviert werden, was die Sicherheit gegenüber konventionellen viralen Techniken erhöht (Cotten et aJ., 1992). Ferner wird das Genkonstrukt an der Außenseite des Virus transportiert; es ist nicht Teil des Virusgenoms. Daher müssen keine viralen Vektoren hergestellt werden, und es gibt beinahe keine Beschränkungen hinsichtlich Größe (wenigstens bis zu 48 kb) und Sequenz der transportierten DNA. Ein weiterer Vorteil liegt in der Breite der Anwendbarkeit hinsichtlich der Zielzellen, weil die Komplexe über Transferrin- und/oder Adenovirusrezeptoren aufgenommen werden können. Statt Transferrin können auch 2
AT 399 656 B andere Liganden, spezifisch für bestimmte Zellpopulationen, verwendet werden, für Melanomzellen hat sich z.B. LDL als sehr geeignet erwiesen. Es können mit Hilfe dieses Systems hohe Werte für die Genexpression in vielen Zelltypen erhalten werden (10 - 100fach höher als für retroviral transfizierte Zellen (Lotze et al., 1992; Rosenberg et al., 1992) oder für mittels CaPO* Co-Präzipitation erhaltene stabil transfizierte Zellen (Fearon et al., 1990)). Ferner können Vielfachkopien des Genkonstrukts in die Zeilen transportiert werden. Es können teilende und nichtteilende Zellen transfiziert werden. Die Expression der in die Zelle transportierten DNA hält über mehrere Monate in konfluenten (wachstumsarretierten) Zellkulturen an (Zatloukal et al., 1992).
Die mit dem Adenovirus dl312 durchgeführten Versuche sind mit Toxizitätsproblemen verbunden; der Replikationsdefekt des Virus, der auf einen Defekt in der E1A-Region zurückzuführen ist, konnte von den transfizierten Zellen teilweise umgangen werden, der Defekt ist also "undicht". Darüberhinaus war die Ausbeute an Virus in den Verpackungszellinien, die verfügbar sind, um die Defekte von Ad5 dl312 zu komplementieren, nicht befriedigend.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Krebsvakzinen auf der Grundlage eines verbesserten Gentransfersystems bereitzustellen.
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von Krebsvakzinen, die autologe Tumorzellen enthalten. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet daß man Tumorzellen oder Fibroblasten kultiviert und die kultivierten Zellen ex vivo mit einer Zusammensetzung transfiziert, die folgende Komponenten enthält: ai) ein DNA-Molekül, das eine oder mehrere in der Zelle exprimierbare Sequenzen enthält, die für ein oder mehrere, gleiche oder verschiedene, immunstimulierende Polypeptide kodieren, oder mehrere DNA-Moleküle, enthaltend für verschiedene immunstimulierende Polypeptide kodierende Sequenzen, aii) gegebenenfalls ein weiteres DNA-Molekül, das frei ist von Sequenzen, die für ein in der zu transfizierenden Zelle funktionell aktives Polypeptid kodiert b) ein DNA-bindendes Molekül, gegebenenfalls konjugiert mit einem Internalisierungsfaktor, der an ein Oberflächenmolekül der zu transfizierenden Zellen bindet und in diese internalisiert wird, c) ein Konjugat zwischen einem DNA-bindenden Molekül und einem Adenovirus, das eine Mutation zumindest in der E4-Region aufweist, oder einem Adenovirus, das neben einem Effekt in der E1A-Region einen oder mehrere weitere genetische Defekte aufweist wobei die Komponenten b) und c) mit der in a) definierten DNA einen im wesentlichen elektroneutralen Komplex bilden, daß man die transfizierten Zellen derart inaktiviert, daß sie unter Beibehaltung ihrer Fähigkeit zur Expression der in ai) definierten DNA ihre Fähigkeit zur Teilung verlieren, wobei man im Falle der Transfektion von Fibroblasten diese mit nichttransfizierten sowie inaktivierten Tumorzellen mischt, und daß man die Zellpopulation gegebenenfalls mit pharmazeutisch annehmbaren Hilfs- und Trägerstoffen mischt
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Krebsvakzine enthalten gegenüber den von Rosenberg et al., 1992, vorgeschlagenen Krebsvakzinen inaktivierte Tumorzellen, die überraschenderweise trotz der Bestrahlung hinsichtlich der von ihnen ausgelösten Immunantwort voll wirksam sind. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, daß aufgrund der hohen Expressionsraten der immunstimulierenden Gene in den transfizierten Zellen eine durch die Inaktivierung der Zellen bewirkte Verminderung bzw. einen Verlust der Antigenizität zumindest teilweise kompensiert wird.
Als Ausgangsmaterial für Tumorvakzinein, die individuell für jeden einzelnen Patienten hergestellt werden, dienen autologe Tumorzellen, gegebenenfalls in Mischung mit Fibroblasten. Die Fibroblasten können ebenfalls autologe Zellen sein, es ist aber auch möglich, Zellen einer Fibroblastenzelünie einzusetzen, wodurch die Notwendigkeit wegfällt, in jedem einzelnen Fall eine individuelle Fibroblastenkultur hersteilen zu müssen, was mehrere Wochen erfordert.
Zunächst werden Tumorzellen und/oder Fibroblasten aus Gewebsproben des zu behandelnden Individuums isoliert. Die Methoden dazu sind dem Fachmann bekannt. Primäre Melanomzelien können z. B. am einfachsten aus Lymphknotenmetastasen isoliert werden, indem die Metastasen chirurgisch entfernt und unter sterilen Bedingungen mechanisch und gegebenenfalls zusätzlich enzymatisch dissoziiert werden.
Die Isolierung aus Primärtumoren ist im allgemeinen schwieriger, vor allem Im Fall von kleineren Tumoren. Dabei wird beispielsweise so vorgegangen, daß die Tumore chirurgisch entfernt, mechanisch zerkleinert und zusätzlich enzymatisch dissoziiert werden. Bekannte Vorschriften für die Dissoziierung, nach denen vorgegangen werden kann, wenden Collagenase und DNAse an.
Die Isolierung aus anderen Tumoren kann nach demselben Prinzip erfolgen, in Abhängigkeit vom umgebenden Gewebe werden die Methoden zur Isolierung und Dissoziierung variiert. Für Isolierung und Kultur von Tumorzellen können literaturbekannte Methoden angewendet werden, wie sie z.B. dem Fachbuch "Human Cancer in Primary Culture", Hsg. John R.W. Masters, 1991, entnehmbar sind. 3
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In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Genkonstrukte statt in Krebszellen in primäre Fibroblasten eingebracht die dann mit den nichttransfizierten bestrahlten Krebszellen, die Tumorantigene tragen, vermischt werden (Fakhrai et al., 1992). Der Vorteil dieser Ausführungsform besteht darin, daß Fibroblasten leicht und in großen Mengen vom Patienten erhalten werden können, was vor allem von s Bedeutung ist, wenn kleinere Tumore vorliegen und damit eine geringere Zahl von Tumorzellen vorhanden ist und daß der Gentransfer in autologe primäre Fibroblasten leichter standardisiert werden kann als die Transfektion in primäre Krebszellisolate von verschiedenen Patienten. Ein weiterer Vorteil dieser Ausfüh-rungsform besteht darin, daß die Tumorzeilen nicht Ober längere Zeit kultiviert werden müssen, womit ihr antigenes Spektrum, das durch die Kultivierung teilweise verloren gehen kann, erhalten bleibt. Damit wird jo außerdem der mit der Kultivierung von Tumorzellen verbundene Nachteil vermieden, daß einzelne Populationen, z.B. Fibroblasten, die im Tumorisolat zu einem geringen Anteil enthalten sind, oder Tumorzellklone die Kultur überwachsen.
In den Versuchen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, wurde die Melanomzelikultur in RPMI 1640 Medium plus FCS durchgeführt. Für die therapeutische Anwendung 75 werden die Zellen für die erfindungsgemäßen Tumorvakzine im Hinblick auf eine möglichst gute Verträglichkeit vorzugsweise in Serum der Blutgruppe AB kultiviert, weiters kann als Medium auch autologes Serum verwendet werden.
Fibroblasten werden nach bekannten Methoden aus Hautbiopsien isoliert und kultiviert.
Nach der Kultur werden die Zellen mit dem Transfektionsmedium, das die Komplexe mit den 20 Komponenten a) bis c) enthält, behandelt. Im allgemeinen wird eine gleichzeitige Verabreichung von Adenoviruskonjugat und dem Komplex zwischen DNA und Intemaiisierungsfaktor-Konjugat bevorzugt. Um die Genexpression zu verstärken, können die Komplexe auch wiederholt angewendet werden.
Nach der Transfektion werden die Zellen von überschüssigem Medium, das Transfektionskomplexe beinhaltet, befreit, mit frischem Kulturmedium gewaschen und beliebig weiter kultiviert. 25 Die Inaktivierung der Tumorzellen bzw. der Fibroblasten, die vorzugsweise in gleicher Weise wie die transfizierten Fibroblasten inaktiviert werden, kann mit an sich bekannten Methoden, z.B. physikalischen Methoden, wie Röntgenbestrahlung oder Gammastrahlung, und/oder mittels chemischer Behandlung mit Mitosehemmem, z.B. mit Mltomycin C, erfolgen. Geeignet sind Substanzen, die die DNA-Replikation blockieren oder sog. "Spindelgifte", das sind Substanzen, die die Mitosespindel hemmen. 30 Im Zuge der durchgeführten Versuche wurde festgestellt, daß eine Röntgenstrahlendosis bis zu 100 Gy die Expression der transfizierten Genkonstrukte nicht vermindert.
Die geeignete inaktivierungsdosis kann ermittelt werden, indem z.B. bei verschiedenen Strahlendosierungen bzw. Konzentrationen des chemischen Inaktivierungsmittels und/oder Behandlungsdauer einerseits der 3H-Thymidineinbau in die Zellen oder ihre Proliferationsrate und andererseits die Expression des 35 Fremdgens bestimmt wird.
Durch die Bestrahlung der transfizierten Zellen und ihrer damit begrenzten Lebenszeit werden etwaige Langzeitnebenwirkungen verhindert. Es wird eine temporäre, durch die Gendosis festgelegte, zeitlich begrenzte Genexpression erzielt.
Vorzugsweise werden die transfizierten Fibroblasten ebenfalls inaktiviert Mit dieser Maßnahme wird 40 eine bei der Transfektion und/oder Kultur etwa erworbene Tumorigenität ausgeschaltet.
Die Krebsvakzine, die ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können unmittelbar nach ihrer Herstellung verabreicht werden.
Die gebrauchsfertigen Krebsvakzine liegen vorzugsweise als Suspension vor, die gegebenenfalls durch Trypsinisierung erhalten wird. Die Zellen befinden sich suspendiert in einem physiologischen Medium 45 {physiologischer Kochsalz- oder Pufferlösung), das gegebenfalls diejenigen Nährstoffe, insbesondere Aminosäuren, enthält, die die Zellen für die Aufrechterhaltung ihres Metabolismus für die kurze Zeit zwischen Fertigstellung des Vakzins und dessen Verabreichung benötigen. ln dem Verfahren zur Herstellung der Krebsvakzine kann als Zwischenschritt ein Einfrieren der Zellen unter kontrollierten Bedingungen und unter Zusatz von Substanzen, die Gefrierschäden an den Zellen so vermeiden ("kryoprotectants”), z.B. Dimethylsulfoxid (DMSO), eingeschaltet sein. Der Gefrierschritt kann prinzipiell an beliebiger Stelle des Verfahrens vorgesehen sein, z.B. vor der Transfektion der kultivierten Zellen, oder nach der Transfektion, ein Einfrieren ist aber auch als letzter Schritt, also nach der Bestrahlung der Zellen und unmittelbar vor der Verabreichung, möglich. Durch das Einfrieren wird ein Vorrat an für die Transfektion bereiten bzw. bereits transfizierten Zellen verfügbar, der dann in Aliquots die Fertigstellung der 55 Tumorvakzine erleichtert. Zweckmäßig ist ein Gefrierpräparat, das zwischengelagert werden kann und vor der Anwendung nur noch einer Aufbereitung, gegebenfalls einschließlich Bestrahlung, unterzogen werden muß. 4
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Es ist in jedem Fall erforderlich, vor der Verabreichung der Tumorvakzine die Zellen von Gefrierschutzzusätzen zu reinigen.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in vitro hergestellten Krebsvakzinen werden dem Patienten verabreicht, um eine systemische, tumorspezifische Immunantwort auszulösen oder zu reaktivieren.
Die Menge an Tumorzellen pro Immunisierung liegt im Größenordnungsbereich von 105 - 107 Zellen. FQr die Ausführungsform, in der Fibroblasten kultiviert und transfiziert werden, liegt die Zahl an beigemischten Fibroblasten etwa in demselben Bereich, kann jedoch gegebenenfalls bis zu ca. 1/100 der Zellzahl verringert werden.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt die in dem Verfahren zur Anwendung kommenden Transfektionskomplexe, bestehend aus DNA, enthaltend eine oder mehrere für ein immunstimulierendes Polypeptid kodierende Sequenzen, einem DNA-bindenden Molekül, das vorzugsweise mit einem Intemali-sierungsfaktor für Tumorzellen und/oder Fibroblasten konjugiert Ist, insbesondere Polylysin, und einem Konjugat aus einem DNA-bindenden Molekül und dem oben definierten Adenovirus, wobei das DNAbindende Molekül und der DNA-bindende Anteil des Adenovirus-Konjugats an die DNA gebunden sind.
Es wurde festgestellt, daß mit Hilfe der erfindungsgemäßen Komplexe ein effizienter Gentransfer in primäre humane Melanomzellen und primäre humane Fibroblasten möglich ist, daß transfizierte Mausmelanomzellen bis zu 24.000 Einheiten IL-2 pro 1 x 10® Zellen pro 24 h produzierten, was mindestens 30 x mehr ist als die Werte, die mit anderen viralen (Lotze et al., 1992; Rosenberg et al-, 1992) oder nichtviralen (Fearon et al., 1990) Gentransfertechniken erhalten wurden, daß eine Bestrahlung von bis zu 100 Gy die Expression der transfizierten Genkonstrukte nicht vermindert. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde in einem Mausmodell die Wirkung eines Maus-Melanomvakzins gezeigt, das eine systemische Immunantwort in immunisierten Mäusen induziert und die Tiere nach Verabreichung von tumorigenen Dosen von Melanomzeilen vor einer Entwicklung von Tumoren schützt.
Das DNA-Molekül, definiert als Komponente ai), ist ein Plasmid, das eine für ein immunstimulierendes Polypeptid, insbesondere ein Zytokin, kodierende Sequenz enthält. Unter "immunstimulierend" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch die die Immunantwort verstärkende Eigenschaft der sog. co-stimulierenden Moleküle ("co-stimulatory molecules"), wie B7 (Schwartz, 1992; Townsend und Allison, 1993) oder Adhäsionsmoleküle, z.B. HSAs ("heat stable antigens", Kay et al., 1990) oder 1CAM (Springer et al., 1987) verstanden; ferner zählen zu immunstimulierenden Substanzen auch Fremdantigene (sog. "Neo-Antigene”), z.B. virale Antigene. Diese Sequenz steht in Verbindung mit regulatorischen Sequenzen, die eine möglichst hohe Expression des immunmodulatorischen Polypeptids in den Zielzellen ermöglichen. Vorzugsweise werden starke Promotoren wie der CMV-Promotor (Boshart et al., 1985) oder der ß-Aktin-Promotor (Gunning et al., 1987) verwendet. Das geeignete Konstrukt kann in Vorversuchen durch Vergleich der Expressionswerte ermittelt werden.
Vorzugsweise wird die für Interleukin 2 (IL-2) kodierende Sequenz verwendet.
Es können jedoch auch für andere Zytokine wie IL-4, IFN-y, TNF-α, GM-CSF kodierende DNA-Sequenzen eingesetzt werden (Pardoll, 1992). Es können auch Kombinationen von Zytokinsequenzen eingesetzt werden, um die immunstimulierende Wrkung zu verstärken, z.B. IL-2 + IFN-γ , IL-2 + li-4, IL-2 + TNF-β oder TNF-α + IFN-γ. Vorzugsweise liegen die für zwei verschiedene Zytokine kodierenden Sequenzen auf getrennten Plasmiden vor. Damit kann, wie z.B. in den erfindungsgemäß durchgeführten Experimenten anhand von IL-2 und IFN-γ gezeigt wurde, eine Feinabstufung der Zytokinexpression erhalten werden, indem die Mengenverhältnisse der beiden Plasmide variiert werden. Hinsichtlich der Größe des DNA-Konstrukts gibt es praktisch keine Limitierung, das zur Anwendung kommende Gentransfersystem hat sich für Konstrukte einer Größe von 48 kb als geeignet erwiesen (Cotten et al., 1992).
Gegebenenfalls liegt die für ein immunstimulierendes Polypeptid, insbesondere ein Zytokin, kodierende DNA, also die therapeutisch wirksame DNA, in Mischung mit einem in aii) definierten DNA-Molekül vor, das als "Füll-DNA" dient. Die Sequenz dieser DNA ist nicht kritisch, sie muß · neben den Anforderungen an die Reinheit, hinsichtlich derer sie der therapeutisch wirksamen DNA entsprechen muß - lediglich die Bedingung erfüllen, daß sie keine Sequenz enthält, die für ein in der Zelle funktionell aktives Polypeptid kodiert. Die Größe dieser DNA ist ebenfalls nicht kritisch, im allgemeinen ist es zweckmäßig, daß sie im Bereich der Größenordnung des gentherapeutisch wirksamen DNA-Moleküls liegt bzw. kleiner ist als diese.
Diese Füll-DNA kann, ausgehend von einer konstanten DNA-Menge im Hinblick auf ein definiertes Verhältnis der übrigen Komplexpartner, verschieden große Anteile der therapeutisch wirksamen DNA ersetzen. Dies hat den Vorteil, daß man die therapeutische DNA-Dosis und damit die in der Zelle exprimierte Zytokinmenge variieren kann, ohne die anderen Parameter verändern zu müssen, was im Rahmen eines standardisierten Turmorvakzinherstellungsprozesses von großem Interesse ist. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, daß die Menge des in der Zelle exprimierten Gens proportional zum Anteil an Füll-DNA abnimmt. 5
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Wenn die Zielzelle Rezeptoren für das Adenovirus aufweist, durch die eine Internalisierung in einem für die effiziente Expression der Fremd-DNA in der Zelle ausreichendem Maß gewährleistet, kann es genügen, als Komponente b) ein nicht mit einem weiteren Internalisierungsfaktor konjugiertes DNA-bindendes Molekül einzusetzen; im allgemeinen handelt es sich dabei um dasselbe Molekül wie das in c) definierte, vorzugsweise wird Polylysin verwendet Für diese Ausführungsform der Erfindung hat das Adenovirus selbst die Funktion des Internalisierungsfaktors, es ist in diesem Fall nicht erforderlich, die DNA-bindende Substanz mit einem weiteren Intemalisierungsfaktor zu konjugieren.
Die DNA-ist in der Ausführungsform der Erfindung, in der b) eine nicht-konjugierte DNA-bindende Substanz ist, mit dem Konjugat c) komplexiert; die Komponente b) hat in diesem Fall in erster Linie die Funktion, eine Kompaktierung und damit eine erleichterte Aufnahme der Komplexe in die Zelle zu bewirken (Wagner et al., 1991a).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die als Komponente b) definierte DNA-bindende Substanz mit einem Internalisierungsfaktor konjugiert. Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kommt vor allem dann zur Anwendung, wenn die Zielzelle keine oder nur wenige Rezeptoren für das Adenovirus aufweist, das als Bestandteil des Virus-Konjugats c) zur Anwendung kommt, z.B. wenn ein Virus einer entfernten Spezies eingesetzt wird, das nicht die Fähigkeit aufweist, von sich aus in die zu transfizierenden Zellen einzudringen. In Gegenwart eines weiteren lnternalisierungsfaktor-Konjugats profitieren die Virus-Konjugate von der Internalisierungsfähigkeit des Konjugats b), indem sie gemeinsam mit diesem an die Nukleinsäure komplexiert werden und als Bestandteil des so entstandenen Komplexes, im folgenden als "Kombinations-Komplex" oder "ternärer Komplex" bezeichnet, in die Zelle aufgenommen werden. Ohne auf diese Theorie festgelegt sein zu wollen, werden die Kombinations-Komplexe von Zellen entweder durch Bindung an den für den Intemalisierungsfaktor spezifischen Oberflächenrezeptor oder durch Bindung an den Virusrezeptor oder durch Bindung an beide Rezeptoren über den Weg der Rezeptorvermittelten Endozytose aufgenommen. Bei der Freisetzung der Viren aus den Endosomen wird auch die in den Komplexen enthaltene DNA in das Zytoplasma freigesetzt und entkommt dadurch dem lysosomalen Abbau.
Die in b) bevorzugt enthaltenen Konjugate zwischen einem Internalisierungsfaktor und einer DNAbindenden Substanz sind an sich bekannt.
Unter Intemalisierungsfaktor sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Liganden oder Fragmente davon zu verstehen, die nach Bindung an eine Tumorzelle oder einen Fibroblasten über Endozytose, vorzugsweise Rezeptor-vermittelte Endozytose, intemalisiert werden, oder Faktoren, deren Bin-dung/lnternalisierung über Fusion mit Zellmembranelementen erfolgt.
Beispiele für Internalisierungsfaktoren sind die Liganden Transferrin (Klausner et al., 1983), Asialoglyko-proteine (wie Asialotransferrin, Asialorosomucoid oder Asialofetuin), (Ashwell et al., 1982), Lectine (Goldstein et al., 1980; Sharon, 1987), bzw. Substanzen, die Galaktose enthalten und über den Asialogiykoproteinre-zeptor intemalisiert werden; mannosylierte Glykoproteine (Stahl et al., 1978), lysosomale Enzyme (Sly etal., 1982), LDL (Goldstein et al., 1982), modifizierter LDL (Goldstein et al., 1979), Lipoproteine, die über Rezeptoren in die Zelle aufgenommen werden (apo B100/LDL); virale Proteine; Antikörper (Mellman et al., 1984; Kuhn et al., 1982; Abrahamson et al., 1981) bzw. Fragmente davon gegen Zelioberflächenantigene, z.B. anti-CD4, anti-CD7, anti-CD3; Zytokine wie lnterleukin-1 (Mizel et al., 1987), lnterleukin-2 (Smith et al., 1985), TNF (Imamura et al., 1987), Interferons (Anderson et al., 1982); CSF ("Colony-stimulating Factor"), (Walker et al., 1987), Faktoren und Wachstumsfaktoren wie Insulin (Marshall, 1985), EGF ("Epidermal Growth Factor"), (Carpenter, 1984); PDGF ("Platelet-Derived Growth Factor"), (Heldin et al., 1982), TGFe -(Massague et al., 1986) und TGF0 ("Transforming Growth Factors” a, ß), HGF (Hepatocyte Growth Factor (Nakamura et al., 1989), Nervenwachstumsfaktor (Hosang et al., 1987), Insulinähnlicher Wachstumsfaktor I ("Insulin-like Growth Factor"), (Schalch et al., 1986), LH, FSH (Ascoli et al., 1978), Wachstumshormon (Hizuka et al., 1981), Prolactin (Posner et al., 1982), Glucagon (Asada-Kubota et al., 1983), Thyroidhormone (Cheng et al., 1980), α-2-Makroglobulin-Protease (Kaplan et al., 1979). Weitere Beispiele sind Immunglobuline oder Fragmente davon als Liganden für den Fc-Rezeptor oder Anti-Immunglobulin-Antikörper, die an slgs ("Surface Immunoglobulins") binden. Die Liganden können natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein (siehe Trends Pharmacol. Sei., 1989, und die darin zitierten Referenzen).
Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind als Intemalisierungsfaktor Transferrin und EGF.
Geeignete DNA-bindende Substanzen als Komponente b) (nicht-konjugiert oder als Konjugatbestandteil) bzw. als Bestandteil des Konjugats c) sind z.B. homologe organische Polykationen wie Polylysin, Polyargi-nin, Polyomithin oder heterologe Polykationen mit zwei oder mehr unterschiedlichen positiv geladenen Aminosäuren, wobei diese Polykationen verschiedene Kettenlänge aufweisen können, weiters nicht-peptidi-sche synthetische Polykationen wie Polyethyienimin. Geeignete DNA-bindende Substanzen sind ferner natürliche DNA-bindende Proteine polykationischen Charakters wie Histone oder Protamine bzw. Analoge 6
AT 399 656 B oder Fragmente davon, sowie Spermin oder Spermidine.
Die Länge des Polykations ist nicht kritisch, sofern die Komplexe im wesentlichen elektroneutral sind. Wenn die DNA aus 6.000 bp und 12.000 negativen Ladungen besteht, kann die Menge an Polykation pro Mol DNA z.B. sein: 60 Mol Polylysin 200 oder 30 Mol Polylysin 400 oder 120 Mol Polylysin 100, etc.
Der Durchschnittsfachmann kann mittels einfacher Routineversuche andere Kombinationen von Polykationlänge und molarer Menge auswählen.
Bevorzugt wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung Polylysin eingesetzt, insbesondere mit einer Kettenlänge von ca. 200 bis 300 Lysinen.
Wenn zur Herstellung der Konjugate c) das DNA-bindende Molekül im Hinblick auf die Kopplung an das Virus modifiziert wird, z.B. wenn Polylysin mit Streptavidin konjugiert wird, um an biotinyliertes Adenovirus gebunden zu werden, kann der Einfachheit halber das derart modifizierte DNA-bindende Molekül als Komponente b) eingesetzt werden. Das bedeutet in der Praxis, daß bei der Herstellung von Polylysin-Streptavidin/Biotin-Adenovirus-Konjugaten ein Überschuß an Polylysin-Streptavidin eingesetzt wird, der die Funktion der Komponente b) übernimmt.
Die Intemalisierungsfaktor-Polykation-Konjugate können auf chemischem oder, falls das Polykation ein Polypeptid ist, auf rekombinantem Weg hergesteilt werden, bezüglich der Herstellungsmethoden wird auf die Offenbarung der EP 388 758 Bezug genommen.
Die Konjugate können auch nach der von Wagner et al., 1991, beschriebenen Methode hergestellt werden, indem ein Glykoprotein, z.B. Transferrin, und das DNA-bindende Molekül, insbesondere Polylysin, über eine oder mehrere Kohlenhydratketten des Glykoproteins miteinander verbunden werden.
Bevorzugt ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Komponente c) ein Adenovirus mit einem Defekt in der E4-Region. Derartige Adenoviren wurden von Bridge und Ketner, 1989, beschrieben. Die Funktion der in der komplexen E4-Region kodierten Proteine ist erst teilweise aufgeklärt. Bisher ist bekannt, daß die E4-Region, wie die E1b-Reg!on, für den Übergang zwischen dem frühen und dem späten Genexpressionsprogramm des Virus und für das Abschalten der Wirtsproteinsynthese wesentlich ist, ferner für die Virusreplikation und den Virionzusammenbau. Es gibt 24 E4-mRNAs, bisher wurden sieben offene Leserahmen identifiziert, wobei angenommen wird, daß die Leserahmen 3 und 6 in erster Linie für den E4-Phänotyp verantwortlich sein dürften. Eine sehr wichtige Funktion hat das Genprodukt des offenen Leserahmens ORF 6/7. Dieses Protein bindet wahrscheinlich den zellulären Transkriptionsfaktor E2F, womit er zum hochspezifischen adenoviralen Transkriptionsfaktor wird. Es wurde überraschend festgestellt, daß ein Adenovirus, das einen Defekt in der E4-Region hat, als Bestandteil eines Gentransfersystems auf der Grundlage der Rezeptor-vermittelten Endozytose, bei dem das Adenovirus die Funktion eines die Endoso-men aufbrechenden Mittels hat, bei der Anwendung auf Tumorzellen geringe Toxizität bei gleichzeitig hoher Gentransporteffizienz aufweist.
Aus den von Bridge und Ketner beschriebenen Adenoviren wurde die Mutante dl1014, die einen intakten ORF 4 besitzt, in der jedoch ORF 3 und ORF 6 sowie ORF 6/7 defekt sind, aufgrund ihrer Eigenschaft ausgewählt, daß sie in der Synthese viraler Proteine am stärksten beeinträchtigt isL Da die Funktionen der in E4 kodierten Virusproteine noch nicht zur Gänze aufgeklärt sind, kann zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht definiert werden, in welchen Leserahmen die Mutationen gesetzt werden müssen, um den gewünschten Effekt zu erzielen. Weitere außer der Mutante <311014 geeignete Mutanten können empirisch ermittelt werden, indem E4-Mutanten, wie von Bridge und Ketner beschrieben, hergestellt und in standardisierten Transfektions- und Zytotoxizitätsexperimenten, wie sie in den Beispielen beschrieben sind, getestet werden. Für die orientierenden Transfektionstests kann zunächst statt des Zytokingens ein Reportergen verwendet werden. Mutanten, die vergleichbare Genexpressions- und Zytotoxizitätswerte bringen wie dH014 bzw. d!10l4 sogar überlegen sind, sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Bestandteile des Transfektionskomplexes geeignet, sofern sie weiters die Anforderung erfüllen, daß die Viren, wie z.B. d!1014 in der Zellinie W162, in einer den E4-Defekt komplementierenden Zeliinie zu hohen Titern gezüchtet werden können.
Alternativ zum Adenovirus mit einem E4-Defekt kann auch ein Adenovirus mit einem Defekt in der E1a-Region eingesetzt werden, das zusätzlich zu dem E1a-Defekt einen oder mehrere weitere Gendefekte aufweist, der/die mit chemisch/physikalischen oder genetischen Methoden gesetzt wurde(n). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat sich eine Adenovirus-Mutante der Bezeichnung dl312 (Jones und Shenk, 1979), die mit Psoralen/UV inaktiviert worden war, als für die Herstellung von Krebsvakzinen geeignet gezeigt. Weitere geeignete Ela-Mutanten können nach literaturbekannten Methoden hergestellt, zusätzlich mit verschiedenen Inaktivierungsmethoden und/oder -dosen behandelt und, wie für E4-Mutanten beschrie- 7
AT 399 656 B ben, auf ihre Eignung zur Herstellung von Tumorvakzinen als Bestandteil der Transfektionskomplexe getestet werden. Die mit Hilfe von physikalisch/chemischen Methoden gesetzten Defekte sind keine gezielten Defekte, sondern können über das ganze Virusgenom verstreut sein.
Das Polylysin-gekoppelte Adenovirus wird bevorzugt als Bestandteil eines ternären oder Kombinations-5 komplexes eingesetzt. Die Kopplung des Virus an Polylysin kann auf verschiedene Arten erfolgen:
Die Kopplung von Virus auf chemischem Weg kann in für die Kopplung von Peptiden an sich bekannter Weise erfolgen, wobei, falls erforderlich, die Einzelkomponenten vor der Koppiungsreaktion mit Linkersubstanzen versehen werden (diese Maßnahme ist dann erforderlich, wenn von vornherein keine für die Kopplung geeignete funktionelle Gruppe, z.B. eine Mercapto- oder Alkoholgruppe, verfügbar ist). Bei den jo Linkersubstanzen handelt es sich um bifunktionelle Verbindungen, die zunächst mit funktionellen Gruppen der Einzelkomponenten zur Reaktion gebracht werden, worauf die Kopplung der modifizierten Einzelkomponenten durchgeführt wird.
Eine mögliche Art der Kopplung des Virus an Polylysin erfolgt in ähnlicher Weise wie bei der Herstellung von Transferrin-Polylysinkonjugaten (Wagner et al., 1990) nach Modifizierung des defekten is Adenovirus mittels eines heterobifunktionellen Reagens. Falls ein Virus geeignete Kohlenhydratketten aufweist, kann es mit der DNA-bindenden Substanz über eine oder mehrere Kohlenhydratketten des Glykoproteins verbunden werden (Wagner et al., 1991).
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung der Virus-Polylysin-Konjugate ist die enzymatische Kopplung des Virus an eine DNA-bindende Substanz, insbesondere ein Polyamin, durch eine Transglutaminase so (Zatloukal et ai., 1992).
Eine weitere Methode zur Herstellung der Adenovirus-Polylysin-Konjugate besteht darin, das Virus über eine Biotin-Protein-Brücke, vorzugsweise eine Biotin-Streptavidin Brücke, an das Polykation zu koppeln (Wagner et al., 1992).
Gegebenenfalls kann die Bindung an Biotin auch über Avidin erfolgen. 25 Weiters ist es möglich, die Bindung zwischen Virus und Polylysin herzustellen, indem einerseits das Virus biotinyliert wird und andererseits ein anti-Biotin-Antikörper mit Polylysin konjugiert und die Bindung zwischen Virus und Polylysin über die Biotin/Antikörper-Bindung hergestellt wird, wobei handelsübliche polyklonale oder monoklonale Antikörper gegen Biotin eingesetzt werden können.
Die Bindung zwischen dem Virus und Polylysin kann auch hergestellt werden, indem Polylysin mit 30 einem Lectin gekoppelt wird, das Affinität zu einem Virus-Oberflächenglykoprotein hat, wobei die Bindung in einem solchen Konjugat über die Bindung zwischen dem Lectin und dem Glykoprotein erfolgt. Weist das Virus von sich aus keine geeigneten Kohlenhydratseitenketten auf, kann es entsprechend modifiziert werden.
Das Virus kann für den Fall, daß es auf seinen Oberflächenproteinen Regionen aufweist, die sauer sind 35 und daher an ein Polykation binden können, auch ionisch an das DNA-bindende Molekül gebunden sein.
Die Reihenfolge der Schritte für die Herstellung der Transfektionskomplexe ist nicht kritisch, es kann zweckmäßig wie folgt vorgegangen werden:
Ausgehend von den DNA-Molekülen wird die DNA-bindende Substanz nach Art und Menge bestimmt, die die Komplexierung der DNA gewährleistet, die erhaltenen Komplexe sind vorzugsweise im wesentlichen 40 elektroneutral. Für die Komplexe, die das Virus-Konjugat und ein Intemalislerungsfaktor-Konjugat enthalten, wird der Kationenanteil beider Konjugate hinsichtlich des Aspekts der Elektroneutralität in Betracht gezogen.
Bei der Bestimmung des molaren Verhältnisses der Komponenten a), b) und c) ist zu berücksichtigen, daß Komplexierung der DNA stattfindet und gewährleistet ist, daß der gebildete Komplex an die Zelle gebunden, in die Zelle befördert und daß er aus den Endosomen freigesetzt wird. 45 Das jeweils gewählte Verhältnis Intemalisierungsfaktor-Konjugat/DNA richtet sich vor allem nach der Größe der Polykationmoleküle sowie nach der Anzahl und Verteilung der positiv geladenen Gruppierungen, Kriterien, die auf Größe und Struktur der zu transportierenden DNA abgestimmt werden, wobei auch das Viruskonjugat in Rechnung zu stellen ist. Vorzugsweise beträgt das molare Verhältnis Internalisierungsfak-tor:Polylysln ca. 10:1 bis ca. 1:10. so Im Falle der Verwendung von nicht-konjugierter DNA-bindender Substanz kann nach Konstruktion und Synthese des Adenovirus-Konjugats und der Bestimmung des für die Effizienz der Transfektion und der Expression optimalen Verhältnisses KonjugatDNA mit Hilfe von Titrationen die Menge des Konjugat-AnteiJs bestimmt werden, der durch DNA-bindende Substanz ersetzbar ist.
Bevorzugt wird Polylysin sowohl als Komponente b), vorzugsweise konjugiert mit einem Intemalisie-55 rungsfaktor, als auch als Bestandteil des Adenvoviruskonjugats c) eingesetzt.
Eine geeignete Methode zur Bestimmung des Verhältnisses der in den Komplexen enthaltenen Komponenten besteht darin, zuerst das in die Zeile zu importierende Genkonstrukt zu definieren und, wie oben beschrieben, ein Virus zu finden, das für die Transfektion geeignet ist. Dann wird das Virus an das 8
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Poiykation gebunden und mit dem Genkonstrukt kompiexiert. Ausgehend von einer konstanten DNA-Menge wird durch Titrationen das optimale Verhältnis zwischen Virus-Konjugat und Internalisierungsfaktor-Konjugat bzw. nicht-konjugierter DNA-bindender Substanz bestimmt.
Die Komplexe können hergestellt werden, indem die Komponenten a), b) und c), die jeweils in Form 5 verdünnter Lösungen vorliegen, gemischt werden.
Das optimale Verhältnis von DNA zu Konjugat und nicht-konjugierter DNA-bindender Substanz wird durch Titrationen, d.h. in einer Reihe von Transfektionsexperimenten mit konstanter DNA-Menge und variabler Menge an Konjugat/Polylysin, bestimmt. Das optimale Verhältnis von KonjugatiPolykation in der Mischung kann mit Hilfe von Routineexperimenten bzw. aus dem Vergleich der optimalen Verhältnisse der io in den Titrationsexperimenten eingesetzten Mischungen erhalten werden.
Die Herstellung der DNA-Komplexe kann bei physiologischen Salzkonzentrationen erfolgen. Eine weitere Möglichkeit besteht im Einsatz hoher Salzkonzentrationen (etwa 2 M NaCI) und anschließender Einstellung auf physiologische Bedingungen durch langsames Verdünnen bzw. Dialyse.
Die jeweils am besten geeignete Reihenfolge für die Mischung der Komponenten wird im einzelnen in is Vorversuchen bestimmt.
Die Menge an eingesetztem Adenovirus-Konjugat richtet sich nach der im einzelnen vorgenommenen Transfektion. Es ist zweckmäßig, die Mindestmenge an Virus einzusetzen, die erforderlich ist, um die Internalisierung des Komplexes in einen Großteil der Zellen und seine Freisetzung aus den Endosomen zu gewährleisten. Die Menge an Viruskonjugat wird auf den jeweiligen Zelltyp abgestimmt, dabei ist vor allem zo die Infektiosität des Virus für diesen Zelltyp zu berücksichtigen. Ein weiteres Kriterium ist das jeweilige Intemalisierungsfaktor-Konjugat, insbesondere hinsichtlich des Intemalisierungsfaktors, für den die Zielzelle eine definierte Anzahl von Rezeptoren aufweist. Außerdem richtet sich die Menge an Viruskonjugat nach der Menge der zu importierenden DNA. Für eine spezielle Anwendung wird in Vorversuchen mit den jeweils für die Transfektion vorgesehenen Zielzellen und dem für die Transfektion vorgesehenen Vektorsystem die 25 optimale Viruskonzentration durch Titrieren ermittelt, wobei zweckmäßigerweise als DNA ein Genkonstrukt eingesetzt wird, das hinsichtlich der Größe mit dem für die konkrete Anwendung vorgesehenen weitgehend übereinstimmt und das zwecks einfacherer Messung der Effizienz des Gentransfers ein Reportergen enthält. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde die Eignung des Luciferasegens als Reportergen für derartige Versuche gezeigt. 30 Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt die mit den erfindungsgemäßen Komplexen transfizier-ten Tumorzellen bzw. Fibroblasten.
Dieser Typ von Krebsvakzinen, wie er mit Hilfe der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden kann, stellt eine neue Entwicklung auf dem Gebiet der Zytokintherapie dar. Sie hat den Vorteil, daß die schweren Nebenwirkungen systemisch verabreichter Zytokine aufgrund der lokal beschränkten Produktion und Wir-35 kung des Zytokins vermieden werden können. Außer für die Behandlung von Melanomen können auch andere Krebsarten mit Hilfe der erfindungsgemäßen Krebsvakzine behandelt werden, z.B. Darmkrebs, Nierenkrebs, Brustkrebs, etc.
Figurenübersicht 40
4S 50
Fig. 1: Gentransport in primäre humane Melanomzellkulturen
Fig. 2: Bestimmung der Liganden, die bei der Aufnahme von Gentransferkomplexen beteiligt sind.
Verwendung von nicht-konjugiertem Polylysin
Fig. 3: Effekt der Inaktivierung von Adenoviren durch Psoralen/UV auf die Genexpression in primä ren humanen Melanomzeilen
Fig. 4: Bestimmung der Langzeitzytotoxizität von Adenoviren
Fig. 5: Wirkung der Bestrahlung von Tumorzellen auf die Expression transfizierter Gene
Fig. 6: Einfluß der Plasmidkonzentration auf die Expression des Luciferase-Reportergens
Fig. 7: Einfluß der Plasmidkonzentration auf die Expression von IL-2 und/oder IFN-y
Fig. 8: Verlust der Tumorigenizität transfizierter Maus-Melanomzellen
Fig. 9: Induktion einer systemischen Immunantwort gegen Melanom in Mäusen durch Immunisie rung mit zytokintransfizierten, bestrahlten Tumorzeiten Rg. 10: EGF als Ligand für den Gentransfer in Zellen einer humanen epidermoiden Karzinomzellinie (A: plus 2 % FCS, B: ohne FCS)
Rg. 11: II-2 Expression in Maus-Melanomzellen unter Verwendung verschiedener Vektoren Rg. 12: II-2 Expression in Rbroblasten unter Verwendung verschiedener Vektoren In den folgenden Beispielen wurden, sofern nicht anders angegeben, die folgenden Materialien und Methoden verwendet: 9 55
AT 399 656 B a) Plasmid-Konstrukte i) DNA-Plasmid-Konstrukte, enthaltend die für humanes oder Maus-IL-2 kodierende Sequenz s Für die in den Beispielen 6 bis 8 durchgeführten Versuche wurde das von Karasuyama et al., 1989, beschriebene Plasmid BCMGneo-mlL-2 verwendet.
Alternativ wurde ein Plasmid der Bezeichnung pWS2m hergestellt, das das Maus-IL-2-Gen unter Kontrolle des Zytomegalovirus Enhancer/Promotors enthält: Das Plasmid pH/3APr-1 (Gunning et al., 1987) wurde mit BamHI und EcoRI geschnitten. Mittels Agarosegel-Reinigung wurde ein 2.5 kb Fragment isoliert, io das das Ampicillin-Resfistenzgen und den Replikationsursprung von pBR322 sowie das SV40-Polyadenyl-sierungssignal enthält Dieses Fragment wurde mit dem CMV-Promotor/Enhancer ligiert, das als ein 0.7 kb PCR-Fragment vom Vektor pAD-CMVI (beschrieben in der EP-A 393 438) amplifizlert und EcoRI/BamHI verdaut worden war. Das erhaltene Plasmid wurde pWS genannt Die für Maus-IL-2 kodierende cDNA wurde als PCR-Fragment vom Plasmid BMGneo-mlL-2 (Karasuyama und Melchers, 1988) erhalten. In 15 Richtung des 5' Endes vom ersten ATG Codon wurde die Sequenz GCCGCC zwecks optimaler Translationsinitiation angehängt. Die 3’-nicht-kodierende Region wurde entfernt. Das PCR-Fragment wurde in den mittels Sall/BamHI-Verdau geöffneten Vektor pWS ligiert. Für die Anwendung in Humanzellen wird der Vektor pWS2 eingesetzt der in ähnlicher Weise wie der Vektor pWS2m erhalten wird, mit dem Unterschied, daß als Vorlage für die PCR-Amplifikatäon statt dem 20 Plasmid BMGneo-mlL-2 das Plasmid plL2-50A (Taniguchi et al., 1983), der die für humanes IL-2 kodierende cDNA enthält dient.
Als Alternative zu einem Plasmid mit dem Ampicillin-Resistenzgen wurde ein Plasmid hergestellt, das das Tetracyclin-Resistenzgen, herausgeschnitten aus pBR322, enthält. Für das Plasmid pCM2 wurde die Maus-IL-2 Sequenz zusammen mit den 5'- und 3' flankierenden 25 Regionen (Spalt- und Poly(A)-Signale vom Kaninchen-j3-Globingen) als Sall/BamHI-Fragment aus BCMGneo-mlL-2 herausgeschnitten und in den Vektor pAD-CMV1 eingesetzt. ii) DNA-Plasmid-Konstrukt, enthaltend die für Maus-IFN-7 kodierende Sequenz so Es wurde das von Gray und Goeddel, 1983, beschriebene Plasmid pSVEmuIFN-y verwendet.
iii) Reporterplasmid-Konstrukt pCMVL
Das Plasmid pCMV wurde hergestellt, indem das BamHl-lnsert des Plasmids pSTCX556 (Seveme et 35 al., 1988) entfernt, das Plasmid mit Klenow-Fragment behandelt und das Hindlll/Sspl sowie Klenow-behandelte Fragment aus dem Plasmid pRSVL (enthaltend das Photinus pyralis Luciferasegen unter der Kontrolle des Rous Sarcoma Virus LTR Enhancer/Promoters (Uchida et al.. 1977, De Wet et al., 1987) eingesetzt wurde. Das Reporter-Plasmid wurde pCMVL bezeichnet 40 b) Herstellung von Transferrin-Polylysin-Konjugaten
Zur Synthese von Konjugaten aus Transferrin und Polylysin mit einer Kettenlänge von 290 Lysinresten wurde die Wagner et al., 1991, beschriebene Methode eingesetzt. 45 c) Herstellung von EGF-Polylysin-Konjugaten 1 mg EGF (Epidermal Growth Factor, Sigma, St. Louis, Cat. No. E-4127) wurde durch Gelfiltration (Sephadex G-10) mit HBS als Elutionspuffer gereinigt. 135 nmol (0.8 mg) Epidermal Growth Factor (EGF) in 1.5 ml HBS wurden mit einer 15 mM ethanolischer Lösung von SPDP (1.2 nmol) behandelt. Nach 2 h bei 50 Raumtemperatur wurde das modifizierte Protein über eine Sephadex G-10 Säule gelfiltriert, wobei 70 nmol EGF, modifiziert mit 50 nmol Dithiopyridinlinker, erhalten wurde. Das modifizierte Protein wurde mit 3-Mercaptopropionat-modifiziertem Polylysin (50 nmoi, durchschnittliche Kettenlänge 290 Lysinmonomere, modifiziert mit 150 nmol Mercaptopropionat-Linker) in insgesamt 1 ml HBS unter Argonatmosphäre reagieren gelassen. Konjugate wurden mittels Gelpermeationschromatographie auf einer Superdex 75 Säule ss (Pharmacia) isoliert (Puffer: 0.5 M Natriumchlorid). Die Produktfraktion enthielt ein Konjugat, bestehend aus 20 nmol Streptavidin und 25 nmol Polylysin. 10
AT 399 656 B d) Herstellung von Streptavidin-Polylysin-Konjugaten
Die Kopplung von Streptavidin mit Polylysin wurde nach der von Wagner et al., 1990, und in der EP-A1 388 758 für die Herstellung von Transferrin-Polylysin-Konjugaten beschriebenen Methode durchgeführt. 5 79 nmol (4.7 mg) Streptavidin in 1 ml 200 mM HEPES pH 7.9 und 300 mM NaCI wurden mit einer 15 mM ethanolischen Lösung von SPDP (236 nmol) behandelt. Nach 1.5 h bei Raumtemperatur wurde das modifizierte Protein über eine Sephadex G-25 Säule gelfiitriert, wobei 75 nmol Streptavidin, modifiziert mit 196 nmol Dithiopyridinlinker, erhalten wurde. Das modifizierte Protein wurde mit 3-Mercaptopropionat-modifiziertem Polylysin (75 nmol, durchschnittliche Kettenlänge 290 Lysinmonomere, modifiziert mit 190 io nmol Mercaptopropionat-Linker) in 2.6 ml 100 mM HEPES pH 7.9, 150 mM NaCI unter Argonatmosphäre reagieren gelassen. Konjugate wurden mittels Kationenaustauschchromatographie auf einer Mono S HR5-Säule (Pharmacia) isoliert. (Gradient: 20 - 100 % Puffer. Puffer A: 50 mM HEPES pH 7.9; Puffer B: Puffer A plus 3 M Natriumchlorid. Die Produktfraktion eluierte bei einer Salzkonzentration zwischen 1.2 M und 1.7 M. Dialyse gegen HBS (20 mM HEPES pH 7.3, 150 mM NaCI) ergab ein Konjugat, bestehend aus 45 nmol rs Streptavidin und 53 nmol Polylysin. e) Herstellung von biotinyliertem Adenovirus i) Adenovirus dl3l2-Präparationen 20
Es wurde der von Jones und Shenk, 1979, beschriebene Adenovirus-Stamm d!312, der eine Deletion in der Ela-Region aufweist, verwendet. Die Vermehrung des Virus wurde in der Ela-trans-komplementierenden Zeliinie 293 durchgeführt, wobei die Herstellung in großem Maßstab durchgeführt wurde, wie von Davidson und Hassell, 1987, beschrieben. Das gereinigte Virus wurde in Lagerpuffer (100 mM Tris, pH 8.0,100 mM 25 NaCI, 0.1 % BSA, 50 % Glyzerin) oder in HBS/40 % Glyzerin aufgenommen und Aliquots bei -70* C aufbewahrt. Die Bestimmung der Virion-Konzentration wurde mittels UV-spektrophotometrischer Analyse der extrahierten genomischen Virus-DNA durchgeführt (Formel: eine optische Dichteeinheit (OD, A250) entspricht 10'2 Viruspartikeln/ml; (Chardonnet und Dales, 1970)). 30 ii) Adenovirus dl1014-Präparation
Das Adenovirus dl1014, beschrieben von Bridge und Ketner, 1989, wurde in der Zeliinie W162, die von der Zeliinie Vero (ATCC No. CCL81) abgeleitet ist und deren Herstellung von Weinberg und Ketner, 1983, beschrieben wurde, propagiert. Die Herstellung in größerem Maßstab, Reinigung und Virionkonzentrations-35 bestimmung wurden durchgeführt, wie für dl312 beschrieben. rii) Biotinylierung von Adenovirus 2.4 ml einer gelfiltrierten (Sephadex G-25 PD10, Pharmacia) Lösung von Adenovirus dl312 (ca. 1011 40 Partikel) in 150 mM NaCI / 5 mM HEPES, pH 7.9 /10 % Glycerin, wurde mit 10 ul (10 nmol) einer 1 mM Lösung von NHS-LC-Biotin (Pierce 21335) versetzt. Nach 3 h bei Raumtemperatur wurde der Biotinmodifizierte Virus durch Gelfiltration (wie oben) vom überschüssigen Reagens abgetrennt. Die Lösung wurde durch Zugabe von Glycerin auf eine Glycerinkonzentration von 40 % gebracht (Gesamtvolumen 3.2 ml) und bei -25 "C gelagert. Die Biotinylierung des Virus konnte in einem qualitativem Nachweis nach 45 Tropfen von verschiedenen Verdünnungen auf Cellulose-Nitrat Membran nachgewiesen werden: nach Trocknen bei 80 *C / 2 h im Vakuumtrockenschrank, Blocken mit BSA, Inkubieren mit Streptavidin-konjugierter Alkalischer Phosphatase (BRL), Waschen und 1 h Inkubation mit der Entwicklungslösung NBT/X-Phosphat (Nitroblau-Tetrazolium Salz/5-Brom-4-ch!or-3-indolyIphosphat, Toluidin-Salz; Boehringer Mannheim) wurde eine positive Farbreaktion gefunden. 50 Bei der Biotinylierung von Adenovirus dH 014 wurde von 15 ml Adenoviruspräparation (1.2 x 1012 Partikel pro ml) ausgegangen, die mit 150 ul, 1 mM NHS-LC-Biotin behandelt wurden. Nach 3 h bei Raumtemperatur wurde gegen 1 I HBS plus 40 % Glyzerin bei 4”C über Nacht dialysiert, dann wurde der Puffer durch frischen ersetzt und eine zweite Dialyse durchgeführt. Es wurde eine Viruspräparation mit einem Titer von ca. 1.2 x 10,a Partikeln pro ml erhalten. 11 55
AT 399 656 B iv) Psoralen/UV-Inaktivierung von biotinyliertem Adenovirus
Die Inaktivierung von Adenovirus d!312 wurde wie folgt vorgenommen: Je 200 ul biotinylierte Viruspräparation wurden in zwei Vertiefungen einer 1.6 cm Gewebskulturplatte gegeben. Zu jeder Probe wurden 2 Ui (33 mg/ml) 8-Methoxypsoralen (in DMSO) gegeben, die Schale auf Eis gestellt und 10 min lang mit einer UV-Lampe (365 nm; UVP TL-33 Lampe) bestrahlt, wobei der Abstand der Probe vom Fifter 4 cm betrug. Nach der Bestrahlung wurden die zwei Proben vereinigt und gelfiltriert (G50, Nick-rSäule, Pharmacia), wobei die Säule mit 40 % Glycerin in HBS vorequilibriert worden war.
Die Inaktivierung von biotinyliertem Adenovirus dl1014 wurde durchgeführt, indem 4 ml Viruspräparation (1 x 10'2 Viruspartikel) mit 40 ul 8-Methoxypsoralen (33 ug/ul, in DMSO) versetzt wurden. Die Proben wurden eine Stunde lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und in 12 x 300 ul Kulturschalen gegeben, auf Eis gestellt und 25 min lang wie oben beschrieben UV-bestrahlt. Anschließend wurde eine Gelfiltration (in zwei Portionen) Ober eine G-25 PD10 Säule, mit HBS/40 % Glyzerin, durchgeführt. Es wurden 4.5 ml Viruspräparation mit einem Titer von 9.4 x 1011 Partikel pro ml erhalten. f) Herstellung von Transfektionskomplexen
Die ternären Komplexe wurden in drei Schritten hergestellt Im ersten Schritt wurde biotinyliertes Adenovirus in 100 ul HBS mit streptavidinyliertem Polylysin (StreptpL) in 100 ul HBS gemischt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Daraufhin wurden 6 ug Plasmid DNA in 150 ul HBS beigegeben, gut gemischt und weitere 30 min inkubiert. Abschließend wurde Polylysin-modifiziertes humanes Transferrin (TfpL) in 150 ul HBS beigegeben, gründlich gemischt und 30 min inkubiert. (Die Mengen für Adenovirus, StreptpL und TfpL werden jeweils bei den einzelnen Beispielen angegeben.) Das Verhältnis zwischen Plasmid DNA und Polylysin-Konjugaten wurde in Hinblick auf Elektroneutralität in den endgültigen Komplexen berechnet Für die Transfektion wurden die Komplexe auf die Zellen in einem Gesamtvolumen von 2 ml Kulturmedium ohne FCS aufgebracht Nach 4 h Inkubation bei 37’C wurde das Medium entfernt und frisches, Serum enthaltendes Kulturmedium beigegeben. g) Zellen und Kulturmedien i) Maus-Melanomzellen
Die Maus-Melanomzeilinie Cloudman S91 (Klon M3) wurde von ATCC (No. CCL 53.1) erworben. Die Zellen wurden in 6 cm Plastikschalen oder T25 Kulturflaschen, beschichtet mit 0.1 % Gelatine, in Ham’s F10 Medium, enthaltend 12.5 % Pferdeserum, 2.5 % FCS, 2 mM Glutamin und Antibiotika, gezüchtet. ii) Mausfibroblasten
Primäre Mausfibroblasten wurden wie folgt aus DBA/2 Mäusen isoliert: 4 Wochen alte DBA/2 Mäuse wurden durch zervikale Dislokation getötet und in 70 % Ethanol getaucht. Die Muskeln wurden unter sterilen Bedingungen von den hinteren Gliedmaßen entfernt und mit PBS gewaschen. Die Proben wurden in Stücke kleiner als 2 mm zerteilt und überschüssiges PBS entfernt. Dann wurden die Gewebsfragmente 3 x mit 5 ml PBS, enthaltend 0.25 % Trypsin (aus Schweinepankreas, Sigma, Katalog Nr. T-2904), 0.1 % Collagenase (Typ XI, Sigma, Katalog Nr. C-9407), 0.1 % BSA (Fraktion V, Boehringer Mannheim, Katalog Nr. 735 094), gewaschen und 30 min unter Schwenken bei 37 *C inkubiert. Daraufhin wurden die Gewebsfragmente 5 min lang absetzen gelassen, und der Überstand, der die freigesetzten Zellen enthielt, wurde mit 5 ml DMEM, enthaltend 20 % FCS, vermischt. Das nicht-dissoziierte Material wurde weitere 30 min lang verdaut und der Überstand, wie oben beschrieben, gesammelt. Dieser Vorgang wurde wiederholt, bis das gesamte Material dissoziiert war. Die vereinigten Überstände wurden 15 min bei 500 x g zentrifugiert, das Zellpellet in DMEM, enthaltend 20 % FCS, resuspendiert und die Zellen in Kulturflaschen ausgesät. Nach 30 min wurden die nicht adhäsierten Zellen abgesaugt und frisches Medium zugegeben. iii) Humane Melanomzellen
Primäre humane Melanomzellen wurden aus chirurgisch entfernten Melanomen isoliert. Die Tumore wurden mechanisch (mit Pinzette und chirurgischem Messer) in Gegenwart von RPMi 1640 Kulturmedium, enthaltend 5 % FCS, 2 mM Glutamin und Antibiotika, in kleine Fragmente zerteilt. Dann wurden die Gewebsfragmente vorsichtig mit dem Kolben einer Spritze durch ein Metallsieb gedrückt. Daraufhin wurde 12
AT 399 656 B das Material mehrere Maie durch Zentrifugation und Resuspension gewaschen, und die freigesetzten Zeilen wurden in T25 Kulturflaschen ausgesät iv) Humanfibroblasten
Nach der chirurgischen Entfernung wurden Hautbiopsien in 4*C DMEM, enthaltend 10 % FCS, 2 mM Glutamin und Antibiotika, gegeben. Die Biopsien wurden in einer Gewebekultureinrichtung ausgiebig mit Pinzette und chirurgischem Messer im laminaren Luftstrom in sterilen 6 cm Plastikschalen zerkleinert. Dann wurden 3 ml DMEM, enthaltend 20 % FCS, 2 mM Glutamin und Antibiotika beigegeben, und die Kultur in einen 37 *C Brutschrank gegeben. Nach 10 Tagen wurde das Medium durch DMEM, enthaltend 10 % FCS, ausgetauscht. Dann wurde das Medium weiter 2 x wöchentlich gewechselt. 4 Wochen nach Beginn der Kultur wurden die Zellen, die aus den Gewebsfragmenten herausgewachsen waren, trypsinisiert und für die Transfektion in neue Kulturschalen ausplattiert. v) KB-Zelien
Die humane epidermoide Karzinomzellinie KB wurde von ATCC (No. CCL 17) erworben. Die Zellen wurden in 6 cm Plastikschafen in MEM, 10 % FCS, 2 mM Glutamin und Antibiotika, gezüchtet. h) Bestimmung der Genexpression i) Luciferase-Assay
Die Herstellung von Zellextrakten, die Standardisierung des Proteingehalts sowie die Bestimmung der Luciferaseaktivität wurden durchgeführt, wie von Zenke et al., 1990, Cotten et al., 1990, bzw. in der EP 388 758 beschrieben. ii) IL-2 Assay
Die Expression von Interleukin-2 wurde mit Hilfe eines Bioassays bestimmt, wie von Karasuyama und Melchers, 1988, beschrieben. Zusätzlich wurde die IL-2 Produktion unter Verwendung des IL-2 EUSA-Kits von Becton Dickinson (Katalog Nr. 30032) nach Vorschrift des Herstellers durchgeführt. iii) IFN-7-Assay
Die Expression von Maus-IFN-γ wurde unter Verwendung des IFN-y ELISA "lntertest-y" (Genzyme, Katalog Nr. 1557-00) durchgeführt. j) Testung von Komplex-Komponenten
Um die Aussagekraft von Experimenten hinsichtlich Intemalisierungsfähigkeit von Liganden oder Effizienz von DNA-Konstrukten zu testen, wurden in Vorversuchen Transfektionsversuche mit verschiedenen Viruspräparationen durchgeführt. Diese Versuche haben gezeigt, daß die diesbezüglich mit d!312 erhaltenen Ergebnisse auf Psoralen/UV-inaktiviertes Adenovirus dl312 und auf (Psoralen/UV-inaktiviertes) Adenovirus dl1014 übertragen werden können. In einigen Versuchen wurde daher stellvertretend dl312 verwendet.
Beispiel 1
Gentransport in primäre humane Melanomzellkulturen
Primäre humane Melanomzell-Isolate, die von zwei verschiedenen Patienten erhalten worden waren (HMM-1 und HMM-2) wurden nach verschiedenen Zeitintervallen nach Kulturbeginn mit Komplexen transfi-ziert, die folgende Komponenten enthielten: 1.7 x 1010 Adenoviruspartikel d!312, 100 ng StreptpL, 6 ug pCMVL-DNA, 7 ug TfpL. 24 h nach der Transfektion wurde die Luciferaseexpression bestimmt. Die Expression wurde auf der Grundlage des Proteingehalts der Zellysate auf 1 x 106 Zellen standardisiert. Das Ergebnis dieser Transfektionsversuche ist in Fig. 1 dargestellt 13 AT 399 656 8
Beispiel 2
Bestimmung der Liganden, die bei der Aufnahme von Gentransferkomplexen beteiligt sind
Primäre humane Melanomzell-Isolate der Bezeichnung HMM-1 wurden mit 1.7 x 1010 Adenoviruspartikeln dl312,100 ng StreptpL, 6 ug pCMVL-DNA, 7 ug TfpL, 2 Wochen nach Beginn der Kultur transfiziert. Parallel dazu wurde die Transfektion in Gegenwart eines 50 molaren Überschusses von freiem, eisenbeladenem Transferrin als Konkurrent um die Internalisierung der TfpL-DNA-Adenovirus-Komptexe durchgeführt. Als Alternative wurden Transfektionskomplexe hergestellt, in denen das TfpL durch nicht konjugiertes pL ersetzt wurde (pL). Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 2 dargestellt. Es zeigte sich, daß der Zusatz von freiem Transferrin die Menge der Luciferaseexpression verringert, was darauf hindeutet, daß die Komplexe einerseits, zumindest teilweise, durch Bindung an den Transferrinrezeptor aufgenommen werden. Andererseits deutet jedoch die noch immer beträchtliche Genexpression, die in Gegenwart von freiem Transferrin gesehen wird, darauf hin, daß auch die Bindung an die Adenovirusrezeptoren einen größeren Beitrag leistet.
Beispiel 3
Einfluß der Inaktivierung von Adenovirus dl312 mit Psoralen/UV auf die Langzeit-Toxizität in transfizierten primären Humanmelanomzellen 3 x 105 HMM-1 primäre humane Melanomzellen pro 6 cm Petrischale wurden mit Komplexen transfiziert, die bestanden aus 12. x 10’° Adenoviruspartikeln dl3l2, 1.200 ng StreptpL, 0 ug pCMVL und 6.6 ug TfpL oder 7.5 x 109 Psoralen/UV/inaktivierten Adenoviruspartikeln dl3l2 (dl3i2 PI), 600 ng StreptpL, 6 ug pCMVL und 6.6 ug TfpL (die optimale Menge von StreptpL für die verschiedenen Viren war in Vorversuchen mittels Titration ermittelt worden). Nach Tag 1, Tag 3 und Tag 7 nach der Transfektion wurde die Luciferaseexpression pro 3 x 10® Zellen gemessen. Der Effekt der Psoralen/UV-lnaktivierung auf die Genexpression ist in Fig. 3 dargestellt. 7 Tage nach der Transfektion war eine starke Verringerung der Genexpression zu beobachten, die auch mit schweren zytopathischen Veränderungen in dieser Kultur korrelierte. Die Transfektion der Zellen mit Psoralen/UV-inaktiviertem Adenovirus verringerte die zytopathischen Veränderungen signifikant und führte am 7. Tag zu 10fach höheren Expressionswerten als das nichtinaktivierte Virus.
Beispiel 4
Bestimmung der Langzeitzytotoxizität von Adenoviren
Fibroblasten, die aus einem malignen Melanom stammen, wurden mit Kombinationskomplexen, die entweder Adenovirus dl312, Psoralen/UV-inaktiviertes Adenovirus dl312 oder Adenovirus dH 014 enthielten, transfiziert.
Die Zellen wurden mit Komplexen transfiziert, die folgende Komponenten enthielten: 6 ug pCMVL-DNA, 0.8 ug StreptpL, 6.8 ug TfpL und 20 ul Adenovirus dl312-Präparation (0.25 x 1C12 Viruspartikel pro ml) oder 40 ul Psoralen/UV-inaktivierter Adenovirus dl312-Präparation (0.13 x 1012 Viruspartikel pro ml) oder 3 ui Adenovirus dl1014-Präparation (4.1 x 1012 Viruspartikel pro ml). 100 ul Aliquots dieser Mischung bzw., um die in Fig. 4 angegebenen VlrusrZell-Verhältnisse zu erhalten, eine 1:3 Serienverdünnung dieser Mischung wurden auf 3x10* Zellen pro Vertiefung einer Zellkulturplatte (24 Vertiefungen pro Platte) in 500 ul RPM1 + 2 % FCS aufgebracht. Nach 2 h bei 37 "C wurde das Medium durch 2 ml RPMI + 10 % FCS ersetzt. Nach 8 Tagen wurde das Medium entfernt und die Zellen 5 min lang mit 4 % Formaldehyd und 150 mM NaCI fixiert und dann 10 min lang mit 0.1 % Kristallviolett in 2 % Ethanol gefärbt. Daraufhin wurden die Zellen 2 x mit PBS, 1 x mit Wasser gewaschen und photographiert. Das Ergebnis des Zytotoxizitätstests ist in Fig. 4 gezeigt Bei einem Standardverhältnis von Virus:Zelien von 10.000:1 ist Adenovirus d!312 zytotoxisch; diese Zytotoxizität wird durch Psoralen/UV-Behandiung des Virus abgeschwächt. Dieselbe Menge Adenovirus dl1014 zeigte keine zytotoxische Wirkung auf die Zellen. 14
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Beispiel 5
Wirkung der Bestrahlung der Tumorzellen auf die Genexpression 3 x 10s primäre humane Melanomzellen der Bezeichnung HMM-5 bzw. der Maus-Melanomzellinie M-3 wurden mit Komplexen behandelt, die 3 x 109 Psoralen/UV-inaktivierte Adenoviruspartikel dl1014, 600 ng StreptpL, 6 ng pCMVL und 6.8 ng TfpL enthielten. 6 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit Dosen im Bereich von 0 - 100 Gy bestrahlt. 48 h nach der Bestrahlung wurde die Expression des transfizierten Luciferasegens gemessen. Die in Fig. 5 angegebenen Werte stellen die Luciferaseexpression in Lichteinhei-ten pro ng Protein im Zellysat dar.
Beispiel 6
Einfluß der Plasmidkonzentration auf die Genexpression 3 x 105 M-3 Maus-Melanomzellen wurden mit Komplexen, bestehend aus 8.6 x 109 Psoralen/UV-inaktivierten Adenoviruspartikeln dl1014, 400 ng StreptpL, 6 ng DNA und 5.1 ng TfpL transfizlert. Die Komplexe wurden mit Plasmidkombinationen (pCMVL/pSP; pSVEmu-INF-y; IFN-y/pBCMGneo-mlL-2) bei verschiedenen Mengenverhältnissen der Plasmide transfiziert. Die Mengenverhältnisse der Plasmide sowie die erhaltenen Genexpressionswerte sind Tabelle I sowie Rg. 6 (Luciferaseexpression) und Rg. 7 (ΙΡΝ-γ/IL-2) entnehmbar.
Beispiel 7
Verlust der Tumorigenizitättransfizierter Maus-Melanomzellen M-3 Maus-Melanomzellen (3 x 109 Zellen pro 6 cm Petrischale) wurden mit 2 x 109 Adenoviruspartikeln dl312, 250 ng StreptpL, 6 ug Plasmid-DNA (enthaltend die Maus-IL-2- oder die Maus-IFN-y-Sequenz) und 7.5 ug TfpL transfiziert. 4 h nach der Transfektion wurden die Zellen 2 x mit Ham’s F10 Kulturmedium ohne Serum gewaschen. Anschließend wurden je 1 x 105 Zellen subkutan in den Rücken von 6 anästhesierten DBA/2 Mäusen verabreicht. Zur Kontrolle erhielt eine weitere Gruppe von 6 DBA/2 Mäusen 1 x 105 M-3 Zellen, die nicht transfiziert worden waren. Das Tgmorwachstum an der Injektionsstelle wurde wöchentlich kontrolliert. Rg. 8 zeigt den Verlauf der Tumorbildung.
Beispiel 8
Induktion einer systemischen Immunantwort gegen Melanom durch Immunisierung mit zytokintransfizierten, bestrahlten Tumorzellen a) M-3 Melanomzellen (3 x 105 Zellen pro T25 Kulturflasche) wurden mit 3 x 109 Psoralen/UV aktivierten Adenoviruspartikeln dl1014, 6 ng StreptpL, 6 ug IL-2 Plasmid-DNA oder pSP Plasmid-DNA (pSP 65, Boehringer Mannheim), die kein cDNA Insert enthält und daher nicht zur Expression eines Genproduktes in den transfizierten Zellen führt, und 6.8 ug TfpL transfiziert. 4 h nach der Transfektion wurden die Transfektionskomplexe entfernt und frisches, Serum enthaltendes Medium hinzugefügt. Dann wurden di© Zellen 6 h nach der Transfektion mit Röntgenstrahlen einer Dosis von 20 Gy bestrahlt und weitere 18 h kultiviert. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert und 2 x mit Earl's gepufferter Salzlösung (EBSS) gewaschen und die Kultur auf eine Konzentration von 1 x 106 Zellen pro ml eingestellt. Anästhesierte DBA/2 Mäuse wurden mit 1 x 10s Zellen, die subkutan in den Rücken verabreicht wurden, immunisiert. Parallel dazu wurde eine Gruppe von 6 Mäusen mit nichttransfizierten M-3 Zellen immunisiert, die bestrahlt und weiter behandelt worden waren wie die transfizierten Zellen. Eine Woche nach den ersten Immunisierungen erhielten die Mäuse Boosterimmunisierungen mit Zellzubereitungen, wie sie für die ersten Immunisierungen verwendet worden waren. Nach einer weiteren Woche wurden die Tiere der hochtumorigenen Dosis von 1 x 105 M-3 Zellen ausgesetzt, die an einer Stelle appliziert wurde, die von den früheren Immunisierungsstellen entfernt lag. Zusätzlich wurden 4 Mäuse, die nicht immunisiert worden waren, auf gleiche Art den tumorigenen Zellen ausgesetzt. 8 Wochen nach der Tumorzellimplantation hatten alle (4/4) nicht immunisierten Tiere Tumore entwickelt, während alle Mäuse, die mit den bestrahlten, IL-2 transfizierten M-3 Zellen immunisiert worden waren, frei von Tumoren waren (0 Tumore in 5 Tieren). Die Mäuse, die mit bestrahlten, nicht transfizierten M-3 15
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Zellen und mit bestrahlten M-3 Zellen, die mit einem "leeren" Plasmid (pSP) transfiziert worden waren, waren nur teilweise geschützt (4 von 6 Mäusen entwickelten Tumore). Die Entwicklung der Tumore in den Tieren ist in Tabelle II und in Fig. 9 zusammengefaßt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die Immunisierung von Mäusen mit IL-2 transfizierten, bestrahlten Tumorzellen eine systemische Immunantwort induziert, die die Tiere vor weiterer Tumorentwicklung schützt. b) In einer weiteren Versuchsreihe wurden die Mäuse nach demselben Immunisierungsprotokoll mit bestrahlten M-3 Zellen behandelt, die mit Komplexen transfiziert worden waren, die 3 x 109 Psoralen/UV-inaktivierte Adenoviruspartikel dl1014, 600 ng StreptpL, a) 6 ug IL-2 Plasmid pBCMGneo-mlL-2 (IL-2 100 %), b) 5.4 jxg pSP Plasmid und 0.6 ug IL-2 Plasmid (IL-2 10 %), c) 5.4 ug IL-2 Plasmid und 0.6 ug IFN-7 Plasmid (IL-2 90 % + IFN-7 10 %) oder d) 5.4 ug pSP Plasmid und 0.6 ug IFN-7 Plasmid (IFN-y 10 %), und 4.7 ug TfpL enthielten. Darüberhinaus wurde eine Gruppe von Mäusen mit bestrahlten M-3 Zellen immunisiert, die transfiziert worden waren mit 3.6 x IO3 inaktivierten Adenoviruspartikeln dl312, 600 ng StreptpL, 6 ug IL-2 Plasmid und 4.7 ug TfpL (IL-2 100 % dl312). Eine Woche nach der Boosterinjektion wurden den immunisierten Tieren und, zur Kontrolle, auch den nichfimmunisierten Tieren 1 x 10s M-3 Zellen implantiert. Die Entwicklung der Tumore ist in Tabelle III zusammengefaßt. c) Nach demselben Immunlsierungsprotokoll wie in den vorangegangenen Versuchen wurden die Mäuse mit bestrahlten M-3 Zellen behandelt, die transfiziert worden waren mit Komplexen, enthaltend 3 x 109 Psoralen/UV-inaktivierte Adenoviruspartikel dl1014, 600 ng StreptpL, a) 6 ug IL-2 Plasmid = 100 % IL-2, b) 5.76 ug pSP Plasmid und 0.24 ug IL-2 Plasmid = 4 % IL-2, oder c) 6 ug pSP Plasmid und 4.7 ug TfpL. Die Produktion von IL-2 durch die transfizierten, bestrahlten Zellen wurde am Tag der Immunisierung gemessen: M-3 Zellen, die mit 100 % IL-2 Plasmid transfiziert worden waren, produzierten 33.000 Einheiten IL-2 pro 1x10® Zellen und 24 h, während M-3 Zellen, transfiziert mit 4 % IL-2 Plasmid, 396 Einheiten IL-2 pro 1 x 106 Zellen und 24 h produzierten. Eine Woche nach der Boosterinjektion wurden in die immunisierten Tiere und, zur Kontrolle auch in die nicht-immunisierten Tiere 1 x 105 M-3 Zellen implantiert. Um mehr Information über das Ausmaß der Immunantwort zu bekommen, die durch die Immunisierungen bei Verwendung verschiedener Mengen IL-2 Plasmid induziert wird, wurden wetteren Gruppen von Mäusen 3 x 105 M-3 Zellen bzw. 1 x 10* M-3 Zellen implantiert. Um zu zeigen, daß die Immunantwort tumorspezifisch ist wurden einer Gruppe von Mäusen die mit 100 % IL-2 transfizierten, bestrahlten M-3 Zellen immunisiert worden war, 1 x 105 syngenische Plattenepithelkarzinomzellen KLN 205 (ATCC No. CRL 1453) implantiert. Die Entwicklung der Tumore ist in Tabelle IV gezeigt.
Beispiel 9
Gentransfer in Zellen einer epidermoiden Karzinomzellinie KB-Zellen wurden in einer Dichte von 400.000 Zellen pro 6 cm Schalen gezüchtet und mit verschiedenen Komplexen transfiziert, die 2.5 x 109 Adenoviruspartikel dl312, 200 ng StreptpL, 6 ug pCMVL-DNA und wahlweise 3.8 ug Polylysin, 3.8 u EGF-pL (Menge auf Polylysingehalt bezogen), oder 6 ug TfpL enthielten. Die Komplexe (je 500 ul) wurden mit 1.5 ml Medium entweder mit oder ohne 2 % FCS gemischt. In Kbmpetitionsexperimenten wurden noch je 1 ug EGF zu der Mischung aus Komplexen und Medium zugegeben. Die Komplexe mit Medium wurden zu den Zellen zugegeben. Nach 2 h Inkubation bei 37 *C wurde das Medium entfernt und frisches, Serum enthaltendes Medium beigegeben.
Ernten der Zellen nach 24 h und Luciferaseassay gab folgendes Ergebnis (Fig. 10A: Experiment mit 2 % FCS, Fig. 10B: Experiment ohne FCS): Fig. 10A: Mit EGFpL wurde ein Wert von 20,845.000 Lichteinheiten erhalten; dieser Wert war erheblich höher als mit TfpL (3,970.000) oder Polylysin (pLys 10,550.000). Im Kompetitionsversuch mit freiem EGF wurde im Gegensatz zu den Experimenten mit TfpL (TfpL+EGF 12,350.000 Lichteinheiten) oder Polylysin (pLys+EGF 14,055.000) die erwartete Verringerung des Signals (EGFpL+EGF 14,150.000) gefunden. Dies zeigt, daß der verstärkte Gentransfer Liganden-spezifisch über den EGF-Rezeptor verläuft. Im Experiment ohne FCS (Fig. 10B) war der Effekt von EGFpL noch ausgeprägter (EGFpL 15,150.000 , TfpL 2,000.000, pLys 5,100.000, EGFpL+EGF 5,900.000 Lichteinheiten). Die Expressionswerte beziehen sich auf 50 % der Zellen.
Analog wurden KB-Zellen mit Komplexen transfiziert, die 5 x 109 Psoralen/UV-inaktivierte Adenoviruspartikel d!1014 enthielten; es wurden vergleichbare Luciferaseexpressionswerte erhalten. 16
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Beispiel 10 IL-2 Expression unter Verwendung verschiedener Vektoren a) M-3 Zellen 3 x 105 M-3 Zeilen wurden mit verschiedenen Plasmidkonstrukten, die als Bestandteil ternärer Komplexe Vorlagen, transfiziert. 3 ul Adenovirus dl312 Präparation, 0.3 ul (ca. 200 ng) StreptpL, 6 ug TfpL und 6 ug Plasmid-DNA (BCMGneo-mlL-2, pWS2m, BMGneo-mlL-2 oder pCM2) wurden mit HBS auf ein Gesamtvolumen von 500 ul gebracht. Für die Versuche mit Psoralen/UV-inaktiviertem Adenovirus di1014 wurden folgende Transfektionskom-plexe eingesetzt: 9 ul Viruspräparation, 600 ng StreptpL, 6 ug TfpL, 6 ug BCMGneo-mlL-2.
Nach den in der Fig. 11 angegebenen Zeitabständen wurde die IL-2 Aktivität bestimmt. Für BCMGneo-mlL-2 wurden außerdem nach 48 Stunden 64.000 Einheiten und nach 28 Tagen 7.128 Einheiten erhalten (nicht in der Fig. gezeigt). Für pCM2 wurden nach 48 Stunden 3.227 Einheiten und nach 28 Tagen 950 Einheiten erhalten, für BMGneo-mlL-2 nach 24 Stunden 396 Einheiten, nach 48 Stunden 604 Einheiten, nach 7 Tagen 297 Einheiten und nach 14 Tagen 264 Einheiten (nicht in der Fig. gezeigt). b) Fibroblasten
Primäre humane Fibroblasten wurden wie in a) mit IL-2 Konstrukten transfiziert und die IL-2 Expression an den in der Fig. 12 angegebenen Tagen nach der Transfektion bestimmt Die Zusammensetzung des Transfektionsmediums war für BCMGneo-mlL-2 dieselbe wie für M-3 Zellen; ein identischer Transfektions-komplex wurde für BMGneo-mlL-2 hergestellt. 17
5 AT 399 656 B
Tabelle I
Plasmidverhältnis
Genexpression ng IFN-γ Einheiten IL-2 (pro 106 Zellen/24 h) IFN-γ 100 %/IL-2 0 % 369.6 - 75 IFN-γ 75 4/IL-2 25 % 290.4 7920 IFN-y 50 %/IL-2 50 % 204.6 11880 IFN-y 25 %/IL-2 75 % 83.8 14520 20 IFN-γ 10 %/IL-2 90 % 42.9 18150
Luciferase Lichteinheiten/pg Protein 25 pCMVL 100 %/pSP 0 % 1531438 pCMVL 75 %/pSP 25 % 1191660 30 pCMVL 50 %/pSP 50 % 700052 pCMVL 25 %/pSP 75 % 209914 pCMVL 12.5 %/pSP 87.5 % 48352 35 pCMVL 6.3 %/pSP 93.7 % 14632 pCMVL 3.1 %/pSP 96.9 % 7324 40 45 50 18 55
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Tabelle II M-3 Melanom Entwicklung in DBA/2 Mäusen o Ό Ό in *“ m Tf O £ sO SO m ! * «er ν 0 ‘S 5 * mm « SO W — — 5 00 T 0 a. E £ SO Ό in Ξ t** T m O V N O * ΊΤ 0 SC «Λ — —. E 'T m <*5 S 3 * * Ό SO Ul —. — —, "«» § «Λ in n Ä es C £ TT Ό SO W ---- s * T "t m e mm 0 £ Tt 'C Ό in ~~— *"*»· * 'T e £ Tf Ό NO in — TT rs er» 0 £ VC NO m -—. *-— —- «s O O 0 a X « es £ ac s S '-' K 3 V u Tf S -° et 0 V cn ’s b 0 bjd » S £ 4> *s 5 5 3 ü 3 SS te ‘E in s s <» c se u 100% $ 0 0 3 0 tt E ^ s x: A is £ - "ü V SU Cfl j Z a. 19
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Tabelle III £ 3 1Λ Ό 3 m C\ o fS 3 in <s s £ 3 m SO 3 in —N. ·***. .2 so o <N 3 in CS es £ * 3 3 in sO 3 in ----- cL^ 3 3 3 in ε Ξ * 3 Ό in 3 3 in ~N^ --.. s V \ä N 1. 3 o P4 3 in — <υ 05 I * 3 3 ΙΛ 3 3 in 5 — :C$ 3 V) 3 o 3 in H s * O Ό tn NO 3 in *—» •—. Λ 3 3 3 fS 3 in —< 55 < £ * 3 O ΙΛ NO 3 in SQ -—. —- **--. JS f*5 3 e N 3 in O U 0 1 £ NO in 3 3 in c ~--. w 3 <3 M S in ec £ 'S 3 in 3 Ό in β — —«* 3 wmt 3 e 3 3 3 ώί o *·* fi Ö M S 3 x 2 <s i £ S o W {fl O c «a o> s w •2 vs TT o 3 3 3 ** ?- 3 3 rT ** m SS jK* s sierung Zellen, Έ 3 c e # e 3 $ z ä. + £ 3 £ 3 3 # 3 •M o 3 O S i/) Os wm M-3 3 o 5 * ε - M "W Keine 1 n n 1 > <s t -J IFN-γ IL-2 20
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Tabelle IV
Tumorentwicklung in DBA/2 Mäusen
Immunisierungen (2 x) (1 x 10s M-3 Zellen) Wochen nach Tumorzellimplantation 1 w 2 w 3 w 4 w 1x10* M-3 Keine Immunisierung 0/6 2/6 6/6 6/6 pSP (dl1014) 0/6 1/6 3/6 4/6 lL-2 100 % (dl1014) 0/6 0/6 0/6 0/6 IL-2 4 % (dl1014) 0/5 0/5 1/5 1/5 3x10* M-3 IL-2 100 % (dl1014) 0/5 0/5 0/5 2/5 IL-2 4 % (di1014) 0/5 2/5 3/5 4/5 1 x 106 M-3 IL-2 100 % (dl10l4) 0/4 0/4 1/4 1/3 IL-2 4 % (dl1014) 1/5 3/5 4/5 4/5 1 x 105 KLN 205 IL-2 100 % (dl 1014) 0/6 2/6 6/6 6/6
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Claims (35)

  1. AT 399 656 B Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung von Krebsvakzinen, die autologe Tumorzellen enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß man Tumorzellen oder Fibroblasten kultiviert und die kultivierten Zellen ex vivo mit einer . Zusammensetzung transfiziert, die folgende Komponenten enthält: ai) ein DNA-Molekül, das eine oder mehrere in der Zelle exprimierbare Sequenzen enthält, die für ein oder mehrere, gleiche oder verschiedene, immunstimulierende Polypeptide kodieren, oder mehrere DNA-Moleküle, enthaltend für verschiedene immunstimulierende Polypeptide kodierende Sequenzen, aii) gegebenenfalls ein weiteres DNA-Molekül, das frei ist von Sequenzen, kodierend für ein in der zu transfizierenden Zelle funktionell aktives Polypeptid, b) ein DNA-bindendes Molekül, gegebenenfalls konjugiert mit einem Internalisierungsfaktor, der an ein Oberflächenmolekül der zu transfizierenden Zellen bindet und in diese internalisiert wird, c) ein Konjugat zwischen einem DNA-bindenden Molekül und einem Adenovirus, das eine Mutation zumindest in der E4-Region aufweist, oder einem Adenovirus, das neben einem Effekt in der E1A-Region einen oder mehrere weitere genetische Defekte aufweist, wobei die Komponenten b) und c) mit der in a) definierten DNA einen im wesentlichen elektroneutralen Komplex bilden, daß man die transfizierten Zellen derart inaktiviert, daß sie unter Beibehaltung ihrer Fähigkeit zur Expression der in ai) definierten DNA ihre Fähigkeit zur Teilung verlieren, wobei man im Falle der Transfektion von Fibroblasten diese mit nlchttransfizierten sowie inaktivierten Tumorzellen mischt, und daß man die Zellpopulation gegebenenfalls mit pharmazeutisch annehmbaren Hilfs- und Trägerstoffen mischt.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA eine oder mehrere für ein Zytokin kodierende Sequenz(en) enthält.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA ein Plasmid ist, die eine für humanes Interleukin 2 kodierende Sequenz enthält.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA ein Plasmid ist, die eine für humanes IFN-7 kodierende Sequenz enthält.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als in ai) definierte DNA zwei Plasmide eingesetzt werden, von denen eines die für humanes Interleukin 2 und eines die für IFN~y kodierende Sequenz enthält.
  6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich als in aii) definiertes DNA-Molekül ein Plasmid eingesetzt wird, das frei ist von Sequenzen, kodierend für ein in der zu transfizierenden Zelle funktionell aktives Polypeptid.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Komponente b) Polylysin, vorzugsweise einer Kettenlänge von ca. 200 bis 300 Lysinen, eingesetzt wird.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Polylysin mit humanem Transferrin als internalisierungsfaktor konjugiert ist.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Polylysin mit humanem EGF als Internalisierungsfaktor konjugiert ist.
  10. 10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Komponente c) ein Konjugat eingesetzt wird, das ein Adenovirus mit einem Defekt zumindest in der E4-Region enthält.
  11. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als E4-Mutante das Adenovirus der Bezeichnung dl1014 eingesetzt wird.
  12. 12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Komponente c) ein Konjugat eingesetzt wird, das ein Adenovirus mit einem Defekt in der Ela-Region, das zusätzlich mittels Psoralen/UV 23 AT 399 6S6 B inaktiviert wurde, enthält.
  13. 13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die transfizierten Zellen mit Röntgen· oder Gammastrahlen inaktiviert werden.
  14. 14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen Melanomzellen sind.
  15. 15. Verfahren-nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Fibroblasten transfiziert und inaktiviert werden.
  16. 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Fibroblasten autologe Fibroblasten sind.
  17. 17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Fibroblasten Zellen einer Fibrobla-stenzellinie sind.
  18. 18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die transfizierten und inaktivierten Fibroblasten mit autologen inaktivierten Tumorzellen gemischt werden.
  19. 19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen Melanomzellen sind.
  20. 20. Krebsvakzine, erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19.
  21. 21. Komplex zur Anwendung in einem Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er folgende Komponenten enthält: ai) ein DNA*Moiekül, das eine oder mehrere in der Zelle exprimierbare Sequenzen enthält, die für ein oder mehrere, gleiche oder verschiedene, immunstimulierende Polypeptide kodieren, oder mehrere DNA-Moleküle, enthaltend für verschiedene immunstimulierende Polyeptide kodierende Sequenzen, aii) gegebenenfalls ein weiteres DNA-Molekül, das frei ist von Sequenzen, kodierend für ein in der zu transfizierenden Zelle funktionell aktives Polypeptid, b) ein DNA-bindendes Molekül, gegebenenfalls konjugiert mit einem Internalisierungsfaktor, der an ein Oberflächenmolekül der zu transfizierenden Zellen bindet und in diese internalisiert wird, c) ein Konjugat zwischen einem DNA-bindenden Molekül und einem Adenovirus, das eine Mutation zumindest in der E4-Region aufweist, oder einem Adenovirus, das neben einem Effekt in der E1A-Region einen oder mehrere weitere genetische Defekte aufweist, wobei die Komponenten b) und c) mit der in a) definierten DNA einen im wesentlichen elektroneutralen Komplex bilden.
  22. 22. Komplex nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA eine oder mehrere für ein Zytokin kodierende Sequenz(en) enthält.
  23. 23. Komplex nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA ein Plasmid ist, die eine für humanes Interleukin 2 kodierende Sequenz enthält.
  24. 24. Komplex nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA ein Plasmid ist, die eine für humanes IFN-γ kodierende Sequenz enthält.
  25. 25. Komplex nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA aus zwei Plasmiden besteht, von denen eines die für humanes Interleukin 2 und eines die für IFN-y kodierende Sequenz enthält.
  26. 26. Komplex nach einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich als in aii) definiertes DNA-Molekül ein Plasmid enthält, das frei ist von Sequenzen, kodierend für ein in der zu transfizierenden Zelle funktionell aktives Polypeptid.
  27. 27. Komplex nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß er als Komponente b) Polylysin, vorzugsweise einer Kettenlänge von ca. 200 bis 300 Lysinen, enthält 24 ΑΤ 399 656 Β
  28. 28. Komplex nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Polylysin mit humanem Transferrin als Internalisierungsfaktor konjugiert ist.
  29. 29. Komplex nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Polylysin mit humanem EGF als Internalisierungsfaktor konjugiert ist.
  30. 30. Komplex nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß er als Komponente c) ein Konjugat enthält,-das ein Adenovirus mit einem Defekt zumindest in der E4-Region aufweist.
  31. 31. Komplex nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß er als E4-Mutante das Adenovirus der Bezeichnung dl1014 enthält.
  32. 32. Komplex nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß er als Komponente c) ein Konjugat enthält, das ein Adenovirus mit einem Defekt in der E1a-Region, das zusätzlich mittels Psoralen/UV inaktiviert wurde, enthält.
  33. 33. Humane Tumorzellen, transformiert mit einem der in einem der Ansprüche 21 bis 32 definierten Komplexe.
  34. 34. Humane Fibroblasten, transformiert mit einem der in einem der Ansprüche 21 bis 32 definierten Komplexe.
  35. 35. Fibroblasten nach Anspruch 34 in Mischung mit humanen Tumorzellen. Hiezu 12 Blatt Zeichnungen 25
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