EP0689604A1 - Verfahren zur herstellung von krebsvakzinen - Google Patents

Verfahren zur herstellung von krebsvakzinen

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EP0689604A1
EP0689604A1 EP94911921A EP94911921A EP0689604A1 EP 0689604 A1 EP0689604 A1 EP 0689604A1 EP 94911921 A EP94911921 A EP 94911921A EP 94911921 A EP94911921 A EP 94911921A EP 0689604 A1 EP0689604 A1 EP 0689604A1
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EP
European Patent Office
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dna
cells
adenovirus
transfected
virus
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP94911921A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Max L. Birnstiel
Michael Buschle
Matthew Cotten
Gerhard Maas
Christian Plank
Gotthold Schaffner
Walter Schmidt
Ernst Wagner
Kurt Zatloukal
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boehringer Ingelheim International GmbH
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International GmbH
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Filing date
Publication date
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Priority claimed from DE4326821A external-priority patent/DE4326821A1/de
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the invention relates to gene therapy
  • the immune system has a big one
  • Cancer cells can be observed in early stages of the tumor. In advanced stages one often finds the situation that the cancer cells of the tumor.
  • Cancer vaccines contain cancer cells that are genetically modified or cancer cells in combination with immunostimulating adjuvants that induce a cancer-specific immune response in the patient or
  • MHC-I or MHC-II antigens or by expression of viral proteins such as hemagglutinin (Itaya et al., 1987; Fearon et al., 1988; Plaksin et al., 1988 and Ostrand-Rosenberg et al., 1990) .
  • Interferons are used to activate the immune system so that it recognizes the tumor cells as foreign and rejects them.
  • Stimulation of T cells requires both activation of the T cell receptor and activation of a second receptor on the T cell by a molecule on the surface of the antigen presenting cell (Jenkins and Johnson, 1993).
  • the B7 / CD28 pair represents such a unit of co-stimulating molecules
  • HSA heat stable antigen
  • the aim of the cancer-specific immune response brought about by the transfection of the tumor cells with a gene from one of these groups is that, after removal of the tumor, micrometastases, which are still clinically undetectable and cannot be surgically removed, are destroyed in order to prevent recurrence To prevent cancer.
  • therapy based on cancer vaccines represents active-specific immunotherapy with vaccines from inactivated tumor cells or parts of them, if possible the patient's own, thereby reducing the immune system of the
  • Patients are specifically mobilized against antigens of the individual tumor or at least the same tumor type.
  • cancer vaccines consisting of viable tumor cells have recently been developed (Rosenberg et al., 1992). However, for safety reasons, a vaccine based on cells that are no longer divisible and have a limited lifespan is desirable.
  • One of the critical steps in the manufacture of cancer vaccines is gene transfer to the cells that make up the vaccine or a component thereof.
  • retroviruses can only transduce dividing cells.
  • vectors as are the alternative to the retroviral system
  • adenoviruses for the gene transfer with DNA complexes by means of receptor-mediated endocytosis has been proposed in several works due to the ability of these viruses to release the content of endosomes.
  • the use of adenoviruses increases the use of adenoviruses.
  • adenovirus-polylysine conjugates can be complexed with DNA together with conjugates of transferrin-polylysine, whereby ternary transferrin-polylysine / adenovirus-polylysine / DNA complexes arise (Wagner et al., 1992).
  • the complexes bind
  • the adenovirus breaks open endosomes, which results in the release of the material from the endosome into the cytoplasm.
  • the DNA can then enter the nucleus where the gene is expressed, mostly from episomally localized DNA.
  • This technique has compared to conventional viral and non- Viral gene transfer methods have the following advantages: In this context, since the adenovirus only acts as a means for releasing the transfection complexes from the endosome, the virus can be inactivated with the aid of genetic and / or chemical, possibly in combination with physical methods, which increases safety compared to conventional ones viral techniques increased (Cotten et al., 1992). Furthermore, that
  • Transferrin and adenovirus conjugates can thus be taken up via transferrin and / or adenovirus receptors.
  • transferrin other ligands, specific for certain cell populations, can also be used, e.g. melanoma cells LDL proved to be very suitable. It can be done with the help of this
  • Such peptides which are also referred to as "endosomolytic” or “fusogenic” peptides, have also been used to bring about an increase in gene expression during gene transfer by means of receptor-mediated endocytosis.
  • endosomolytic or “fusogenic” peptides
  • Replication defect of the virus which can be attributed to a defect in the E1A region, could of the
  • transfected cells are partially bypassed, so the defect is "leaky". Furthermore, the yield of virus in the packaging cell lines available to complement the defects of Ad5 dl312 was not satisfactory.
  • the object of the present invention was to develop a method for producing cancer vaccines
  • the invention thus relates to a method for
  • the method is characterized in that tumor cells or fibroblasts are cultivated and the cultivated cells are transfected ex vivo with a composition which contains the following components: ai) a DNA molecule which contains one or more sequences which can be expressed in the cell and which are suitable for one or several, the same or different,
  • Encoded polypeptide b) a conjugate between a DNA-binding molecule and an endosomolytic agent,
  • adenovirus which has a mutation at least in the E4 region
  • adenovirus which, in addition to an effect in the E1A region, has one or more further genetic defects, or
  • Cells binds and is internalized into these, components b) and c) forming an essentially electroneutral complex with the DNA defined in a) in such a way that the transfected cells are so
  • Transfection of fibroblasts mixes these with non-transfected and inactivated tumor cells, and that the cell population may be mixed with
  • the cancer vaccines obtainable by the method according to the invention contain inactivated tumor cells which, surprisingly, despite the
  • Autologous tumor cells possibly in a mixture with fibroblasts, serve as the starting material for tumor vaccines, which are produced individually for each individual patient.
  • the fibroblasts can also be autologous cells, but it is also possible to use cells from a fibroblast cell line, whereby the
  • tumor cells and / or fibroblasts are isolated from tissue samples of the individual to be treated.
  • the methods for this are known to the person skilled in the art.
  • Primary melanoma cells can e.g. B. the easiest
  • Lymph node metastases can be isolated by the
  • Conditions are dissociated mechanically and optionally additionally enzymatically.
  • Isolation from primary tumors is generally more difficult, especially in the case of smaller tumors.
  • the procedure is such that the tumors are surgically removed, mechanically crushed and additionally enzymatically dissociated.
  • Dissociation which can be followed, apply collagenase, DNAse and hyaluronidase.
  • the isolation from other tumors can be done according to the same principle, depending on the surrounding tissue, the methods for isolation and dissociation are varied.
  • methods known from the literature can be used, e.g. the specialist book "Human Cancer in Primary Culture", ed. John R.W. Masters, 1991.
  • the gene constructs are primary instead of in cancer cells
  • Fibroblasts are introduced, which are then mixed with the non-transfected irradiated cancer cells that carry tumor antigens (Fakhrai et al., 1992).
  • the advantage of this embodiment is that
  • Fibroblasts can be easily and in large quantities obtained from the patient, which is particularly important when there are smaller tumors and thus a smaller number of tumor cells, and that the
  • Gene transfer into autologous primary fibroblasts can be standardized more easily than transfection into primary cancer cell isolates from different patients.
  • Another advantage of this embodiment is that the tumor cells do not have to be cultivated over a long period of time, so that their antigenic spectrum, which can be lost in part due to the cultivation, is retained. This also avoids the disadvantage associated with the cultivation of tumor cells that individual populations, for example fibroblasts, that are present in the tumor isolate are contained in a small proportion, or tumor cell clones overgrow the culture.
  • Fibroblasts are made using known methods
  • Transfection medium containing the complexes with components a) to c) treated.
  • simultaneous administration of conjugate b) and the complex between DNA and internalizing factor conjugate is preferred.
  • the complexes can also be used repeatedly.
  • the inactivation of the tumor cells or the fibroblasts can be carried out using methods known per se, e.g. physical methods, such as treatment by means of X-ray or gamma radiation, and / or by means of chemical treatment with mitotic inhibitors, e.g. mitomycin C.
  • mitotic inhibitors e.g. mitomycin C.
  • the suitable inactivation dose can be determined, for example, by incorporating 3 H-thymidine into the cells or their cells at different radiation dosages or concentrations of the chemical inactivating agent and / or different treatment times Proliferation rate and on the other hand the expression of the foreign gene is determined.
  • the transfected fibroblasts are preferably also inactivated. With this measure, one acquired during transfection and / or culture
  • cryoprotectants e.g. Dimethyl sulfoxide (DMSO), switched on as an intermediate step.
  • DMSO Dimethyl sulfoxide
  • the freezing step can be carried out at any point in the process
  • the cancer vaccines produced in vitro by the method according to the invention are administered to the patient
  • Trigger or reactivate immune response Trigger or reactivate immune response.
  • the amount of tumor cells per immunization is in the order of 10 5 - 10 7 cells.
  • the number of added fibroblasts is approximately in the same range, but can optionally be reduced by up to approximately 1/100 of the cell number.
  • cancer vaccines these cells are detectable at the injection site. It was also examined whether these cells were distributed in the blood or in different organs. The detection was carried out using polymerase chain reactions.
  • the cancer vaccine was processed, the cells were transfected with interleukin-2 plasmid DNA. With specific primers, IL-2 and adenovirus DNA fragments were used as markers for the
  • the invention relates in a further aspect
  • Transfection complexes consisting of DNA, containing one or more sequences coding for an immunostimulating polypeptide, a DNA-binding molecule, which preferably has an internalization factor for
  • Tumor cells and / or fibroblasts is conjugated, in particular polylysine, and an endosomolytic conjugate of a DNA-binding molecule and the above-defined adenovirus or a peptide, wherein the DNA-binding molecule c) and the DNA-binding part of the conjugate b) to the DNA are bound.
  • complexes according to the invention an efficient gene transfer into primary human melanoma cells and primary human
  • Fibroblasts can be transfected
  • the DNA molecule is a plasmid which contains a sequence coding for an immunostimulating polypeptide, for example a cytokine, in expressible form.
  • immunostimulating also includes the property of the so-called co-stimulatory molecules, such as B7 (Schwartz, 1992; Townsend and Allison, 1993) or adhesion molecules, for example HSAs, which reinforce the immune response ("heat stable antigens", Kay et al., 1990) or ICAM (Springer et al., 1987); further include immunostimulating
  • Substances also foreign antigens (so-called "neo-antigens"), e.g. viral antigens.
  • the sequence coding for the immunostimulating polypeptide is related to regulatory sequences that are as high as possible
  • Enable expression of the immunomodulatory polypeptide in the target cells Preferably be strong
  • Promoters such as the CMV promoter (Boshart et al., 1985) or the ⁇ -actin promoter (Gunning et al., 1987)
  • the suitable construct can be determined in preliminary tests by comparing the expression values.
  • IL-2 interleukin 2
  • DNA sequences encoding other cytokines such as IL-4, IL-12, IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , GM-CSF can also be used (Pardoll, 1992). It can too
  • Combinations of cytokine sequences can be used to enhance the immunostimulating effect, e.g. IL-2 + IFN- ⁇ , IL-2 + IL-4, IL-2 + TNF- ⁇ or TNF- ⁇ + IFN- ⁇ .
  • sequences coding for two different cytokines are preferably present on separate plasmids. This can be done, for example, in the manner according to the invention Experiments based on IL-2 and IFN- ⁇ have been shown to fine-tune cytokine expression by varying the proportions of the two plasmids.
  • a DNA molecule which contains one or more sequence (s) coding for a stimulatory molecule.
  • the co-stimulatory molecule is the heat-stable antigen (Heat Stahle Antigen HSA).
  • HSA Heat-stable antigen
  • IL-2 coding DNA
  • IL-2 coding DNA
  • a DNA molecule which contains one or more sequence (s) coding for a neoantigen.
  • the neoantigen is one
  • Virus protein or a fragment thereof for example the Rabies glycoprotein.
  • a DNA containing the sequence coding for the virus protein can be used either alone or in combination with one for a cytokine,
  • IL-2 encoding DNA preferably IL-2 encoding DNA can be used.
  • the gene transfer system used has proven to be suitable for constructs with a size of 48 kb (Cotten et al., 1992).
  • the DNA coding for an immunostimulating polypeptide may be therapeutic
  • DNA Purity requirements with regard to which they are therapeutically effective DNA must only meet the condition that it contains no sequence that codes for a functionally active in the cell polypeptide.
  • the size of this DNA is also not critical, in general it is expedient that it is in the range of the order of magnitude of the gene therapy-active DNA molecule or is smaller than this.
  • this filler DNA can replace portions of the therapeutically active DNA of different sizes. This has the
  • the therapeutic DNA dose and thus the amount of cytokine expressed in the cell can be varied without having to change the other parameters, which is within the scope of a standardized
  • Turmorvakzin manufacturing process is of great interest.
  • the plasmid DNA used is free of lipopolysaccharides. It was surprisingly found that the expression values are increased considerably if the plasmid DNA is largely free of lipopolysaccharides. These represent a common one
  • the DNA can either be purified by suitable methods, e.g. by a combination of chromatographic methods including polymyxin chromatography, or it can, too
  • the transfection medium Lipopolysaccharide binding reagents such as polymyxin can be added.
  • the target cell is receptors for the adenovirus
  • adenovirus conjugates may suffice as component c) a DNA conjugate which is not conjugated with another internalization factor binding
  • Insert molecule in general, it is the same molecule as that contained in conjugate b), polylysine is preferably used.
  • the adenovirus itself has the function of the internalization factor, in this case it is not necessary to add another internalization factor to the DNA-binding substance
  • component c) primarily has the function of a
  • a non-conjugated DNA binding molecule as component c) can be omitted entirely.
  • the DNA-binding substance defined as component c) is conjugated with an internalization factor.
  • Embodiment of the present invention is used above all if, in the case of using an adenovirus conjugate, the target cell has no or only a few receptors for the adenovirus, for example in Use of a virus of a distant species, or if a peptide conjugate is used as the endosomolytic conjugate b). In the presence of another
  • Virus receptor or by binding to both receptors via the pathway of receptor-mediated endocytosis.
  • the viruses are released from the endosomes, the DNA contained in the complexes is also released into the cytoplasm and thereby escapes lysosomal degradation.
  • the conjugates preferably contained as c) between an internalization factor and a DNA-binding substance are known per se.
  • ligands or fragments thereof which are internalized after binding to a tumor cell or a fibroblast via endocytosis, preferably receptor-mediated endocytosis, or
  • internalization factors are the ligands transferrin (Klausner et al., 1983), asialoglycoproteins (such as asialotransferrin, asialorosomucoid or
  • Asialofetuin Asialofetuin
  • Lectine Goldstein et al., 1980; Sharon, 1987
  • mannosylated glycoproteins (Stahl et al., 1978), lysosomal enzymes (Sly et al., 1982), LDL (Goldstein et al., 1982), modified LDL (Goldstein et al., 1979), lipoproteins that are receptors in the Cell are taken up (apo B100 / LDL); viral proteins;
  • EGF Epidermal Growth Factor
  • TGF Factor Heldin et al., 1982
  • TGF ⁇ Massague et al., 1986
  • TGFß Transforming Growth Factors " ⁇ , ⁇ ”
  • HGF Hepatocyte Growth Factor (Nakamura et al., 1989)
  • nerve growth factor Hosang et al., 1987
  • Insulin-like growth factor I Insulin-like Growth factor
  • Transferrin and EGF are preferred as internalization factors in the context of the present invention.
  • Suitable DNA-binding substances as component c) are e.g. homologous organic
  • Polycations such as polylysine, polyarginine, polyornithine or heterologous polycations with two or more
  • these polycations can have different chain lengths, furthermore non-peptide synthetic
  • DNA-binding substances are also natural DNA-binding proteins of a polycationic character, such as histones or protamines or analogs or fragments thereof, and also spermine or spermidines.
  • the length of the polycation is not critical as long as the complexes are essentially electroneutral. If the DNA consists of 6,000 bp and 12,000 negative charges, the amount of polycation per mole of DNA can e.g. his:
  • the average specialist can use simple
  • Routine experiments select other combinations of polycation length and molar amount.
  • Polylysine is preferably used in the context of the present invention, in particular with a chain length of approximately 200 to 300 lysines.
  • the DNA-binding molecule modified in this way can be used as component c) for the sake of simplicity.
  • Component c) takes over.
  • the internalizing factor-polycation conjugates can be produced chemically or, if the polycation is a polypeptide, by a recombinant route, with regard to the production methods reference is made to the disclosure of EP 388 758.
  • the conjugates can also be prepared according to the method described by Wagner et al., 1991b, by using a glycoprotein, e.g. Transferrin, and the DNA-binding molecule, in particular polylysine, via one or more carbohydrate chains of the glycoprotein with one another
  • a glycoprotein e.g. Transferrin
  • the DNA-binding molecule in particular polylysine
  • An adenovirus conjugate preferably contains b)
  • Adenovirus with a defect in the E4 region was developed by Bridge and Ketner, 1989,
  • the gene product of the open reading frame ORF 6/7 has a very important function.
  • This protein probably binds the cellular transcription factor E2F, making it a highly specific adenoviral transcription factor. It was
  • Gene transfer system based on receptor-mediated endocytosis in which the adenovirus acts as an agent that disrupts the endosomes, has low toxicity when applied to tumor cells, and at the same time has high gene transport efficiency.
  • mutant d11014 which has an intact ORF 4, but in which ORF 3 and ORF 6 and ORF 6/7 are defective, was selected on the basis of its property that it is strongest in the synthesis of viral proteins is impaired. Since the functions of the virus proteins encoded in E4 have not yet been fully elucidated, it is currently not possible to define in which reading frame the mutations must be set in order to achieve the desired effect. Other mutants besides mutant d11014 can be determined empirically by producing E4 mutants as described by Bridge and Ketner and testing them in standardized transfection and cytotoxicity experiments as described in the examples. For the orienting transfection tests, a reporter gene can first be used instead of the cytokine gene.
  • Mutants which have comparable gene expression and cytotoxicity values as d11014 or d11014 are even superior are suitable in the context of the present invention as constituents of the transfection complex, provided they also meet the requirement that the viruses, such as d11014 in the cell line W162, in one the E4 defect
  • complementing cell line can be grown to high titers.
  • an adenovirus with an E4 defect it is also possible to use an adenovirus with a defect in the E1a region which, in addition to the Ela defect, has one or more further gene defects which are set using chemical, chemical / physical or genetic methods was (n).
  • the defects set with the help of chemical or physical / chemical methods are not targeted defects, but can be scattered over the entire virus genome.
  • dl312 an adenovirus mutant called dl312 (Jones and Shenk, 1979), which had been inactivated with 8-methoxypsoralen / UV, was shown to be suitable for the production of cancer vaccines.
  • Psoralen derivatives are used, e.g. 4'-aminomethyl-4, 5 ', 8-trimethylpsoralen, which has been found to be suitable for inactivating adenoviruses in view of their use in gene transfer.
  • a virus is advantageously used that has been inactivated if possible by a standardizable method. The requirement for the
  • Standardizability is mainly due to chemical
  • Inactivation methods fulfilled, which are superior to the chemical / physical methods in this regard.
  • An example of a chemical inactivation method is inactivation with ⁇ -propiolactone (Morgeaux et al., 1993; De Shu et al., 1986; Budowsky and Zalesskaya, 1991).
  • Standardizability is also advantageous. It has been found within the scope of the present invention that the treatment of adenovirus with two aliquots
  • ß-propiolactone causes a decrease in virus titer by 5 log for 4 h at room temperature, which is due to the inactivation achieved with 8-methoxypsoralen is comparable. DNA transport activity is maintained at medium doses of ß-propiolactone (0.3%), while treatment with 1% ß-propiolactone causes this ability to decrease significantly.
  • Analysis of the gene expression from the inactivated virus showed that both the psoralen derivatives and ⁇ -propiolactone block the virus gene expression (E1a and E3) to the same extent.
  • the more sensitive plaque assay showed that psoralen treatment inactivated the virus by more than 7 log, with no plaque observed at the highest virus doses.
  • ß-propiolactone inactivation only called for a drop in
  • Virus titer by 5 log with plaques being observed at higher virus doses.
  • a virus is therefore used which is inactivated using exclusively chemical methods, preferably using ⁇ -propiolactone.
  • ⁇ -propiolactone are illustrated can be determined.
  • the efficiency of virus inactivation by determining the virus titer and / or by means of the
  • Inactivation method takes effect, i.e. which sections can be destroyed can be done with DNA probes
  • Inactivation methods are tested to see if they can block virus replication and transcription functions.
  • Inactivation method when it delivers adenovirus particles that have the endosomolytic activity useful for the DNA transport function that a function of
  • CPE cytopathic endpoint assay
  • Psoralene derivatives completely replicated the virus, so that no plaques were detectable by means of this test.
  • RNA analysis for the detection of the gene expression was carried out either with an adenovirus 5 Ela probe, which recognizes a part of the Ela gene, which is deleted in the adenovirus d1312, or an adenovirus 5 E3 probe, which recognizes a part of the E3 region that codes for the abundant E3 19K glycoprotein (E1a serves as a control; an RNA signal should be missing for the virus dl312, but should be detectable for d11014, since this has a wild type E1 region).
  • E1a serves as a control; an RNA signal should be missing for the virus dl312, but should be detectable for d11014, since this has a wild type E1 region).
  • transfected cells could play because at least two of the E3 genes modulate the surface expression of MHC class I molecules and TNF receptor molecules on the surface of the infected cells.
  • a defect in the E3 region is therefore desirable for the use of the virus dll014 in gene therapy applications in which immunogenic tumor cells are produced, since the expression of this region in this context could interfere with the immune response to transfected cells.
  • polylysine-coupled (or ionically bound) endosomolytic agent is preferably used as part of a ternary or combination complex.
  • Adenovirus can be coupled to polylysine
  • the coupling of virus by chemical means can be carried out in a manner known per se for the coupling of peptides, wherein, if necessary, the individual components are provided with linker substances before the coupling reaction (this measure is necessary if by
  • linker substances are bifunctional compounds that start with
  • a virus has suitable carbohydrate chains, it can contain the DNA-binding substance via one or more
  • Carbohydrate chains of the glycoprotein are connected (Wagner et al., 1991b).
  • virus-polylysine conjugates Another method for producing the virus-polylysine conjugates is the enzymatic coupling of the virus to a DNA-binding substance, in particular a polyamine, by means of a transglutaminase (Zatloukal et al., 1992).
  • Another method for producing the adenovirus-polylysine conjugates is to couple the virus to the polycation via a biotin-protein bridge, preferably a biotin-streptavidin bridge
  • binding to biotin can also take place via avidin.
  • polyclonal or monoclonal antibodies against biotin can be used.
  • the link between the virus and polylysine can also be made by adding polylysine to a lectin is coupled, which has affinity for a virus surface glycoprotein, wherein the binding in such a conjugate takes place via the binding between the lectin and the glycoprotein. If the virus does not have suitable carbohydrate side chains, it can be modified accordingly.
  • the virus can, in case it is on its
  • Surface proteins has regions that are acidic and can therefore bind to a polycation, also ionically bound to the DNA-binding molecule.
  • Conjugates can also be a peptide that is covalently or by ionic binding to a DNA-binding molecule. Regarding the requirements of such
  • Peptides are made and their coupling to the DNA-binding molecule is referred to WO 93/07283.
  • Expression levels for IL-2 can be achieved in melanoma cells. Melanoma cells present in the presence of this
  • Peptide conjugates transfected with transferrin-polylysine conjugates with IL-2 plasmid DNA proved to be cancer vaccines with a prophylactic protective effect against tumor formation.
  • the DNA-binding substance is determined according to the type and amount that the Complexation of the DNA guaranteed, the complexes obtained are preferably essentially
  • Components a), b) and c) must be taken into account that complexation of the DNA takes place and it is ensured that the complex formed is bound to the cell, transported into the cell and that it is released from the endosomes.
  • the chosen internalization factor-conjugate / DNA ratio depends primarily on the size of the polycation molecules and on the number and distribution of the positively charged groups, criteria based on the size and structure of the DNA to be transported
  • the molar ratio of internalization factor: polylysine is preferably approximately 10: 1 to approximately 1:10.
  • the amount of the conjugate portion which is determined by DNA can be determined by titrations after determining the conjugate: DNA ratio which is optimal for the efficiency of transfection and expression -binding substance is replaceable.
  • Polylysine is preferred both as component c), preferably conjugated to a
  • a more suitable method for determining the ratio of the components contained in the complexes is to first import the one into the cell
  • the complexes can be prepared by the
  • Components a), b) and c), which are each in the form of dilute solutions, are mixed.
  • the optimal ratio of DNA to conjugate and non-conjugated DNA-binding substance is determined by
  • the DNA complexes can be produced at physiological salt concentrations. Another possibility is the use of high salt concentrations (about 2 M NaCl) and subsequent adjustment to physiological conditions by slow dilution or dialysis.
  • the amount of conjugate is matched to the respective cell type, especially the
  • a further criterion is the respective internalization factor conjugate, in particular with regard to the internalization factor for which the target cell has a defined number of receptors.
  • the amount of endosomolytic conjugate depends on the amount of DNA to be imported.
  • the optimal concentration of endosomolytic conjugate is determined by titration in preliminary tests with the target cells intended for the transfection and the vector system intended for the transfection, whereby a gene construct is expediently used as DNA, the size of which corresponds to that for the specific one Application largely matches, and for the purpose of simpler
  • the invention relates to those transfected with the complexes according to the invention
  • Tumor cells or fibroblasts Tumor cells or fibroblasts.
  • Fibroblasts mixed with tumor cells in a pharmaceutically acceptable formulation Fibroblasts mixed with tumor cells in a pharmaceutically acceptable formulation.
  • the ready-to-use cancer vaccines are preferably in the form of a suspension, which if necessary
  • Trypsinization is obtained.
  • the cells are suspended in a physiological medium
  • physiological saline or buffer solution which may contain those nutrients, in particular
  • FCS fetal calf serum
  • cell culture media with additives such as calf serum, human serum, human serum albumin and / or hydroxyethyl cellulose ensure the viability of a sufficient number of cells for the vaccine.
  • the tumor vaccines are expediently in serum of blood group AB, and autologous serum can also be used as the medium.
  • the medium may contain additions of growth factors or cytokines such as IFN-gamma or GM- CSF to favorably affect cell antigen presentation.
  • the type of cancer vaccine which can be provided with the aid of the present invention represents a new development in the field of cytokine therapy. It has the advantage that the serious side effects
  • Cancers are treated with the aid of the cancer vaccine according to the invention, e.g. Kidney cancer or breast cancer.
  • Fig. 1 gene transport in primary human
  • Fig. 2 Determination of the ligands involved in the uptake of gene transfer complexes.
  • Fig. 5 Effect of irradiation of tumor cells on the
  • FIG. 7 Influence of the plasmid concentration on the
  • Fig. 8 Loss of tumorigenicity of transfected
  • EGF as a ligand for gene transfer in cells of a human epidermoid carcinoma cell line (A: plus 2% FCS, B: without FCS)
  • Fig. 11 IL-2 expression in mouse melanoma cells under
  • Fig. 12 IL-2 expression in fibroblasts below
  • Fig. 13 Stimulation of an immune response by
  • Fig. 16 Titration of 4'-aminomethyl-4, 5 ', 8-trimethylpsoralen
  • Figure 18 Gene transport activity of adenovirus d11014
  • Methoxypsoralen in the virus genome Fig. 24 Growth of human melanoma cells as a function of the gamma radiation dose
  • Fig. 28 Interleukin-2 expression in human
  • Fig. 29 Influence of the endotoxin content of the DNA on the
  • Plasmid constructs i) DNA plasmid constructs containing the sequence coding for human or mouse IL-2
  • pWS2m a plasmid called pWS2m which contains the mouse IL-2 gene under the control of the cytomegalovirus enhancer / promoter:
  • the plasmid pH ⁇ APr-1 (Gunning et al., 1987) was cut with BamHI and EcoRI.
  • BamHI and EcoRI By means of agarose gel cleaning, a 2.5 kb fragment isolated which contains the ampicillin resistance gene and the origin of replication of pBR322 and the SV40 polyadenylation signal. This fragment was ligated to the CMV promoter / enhancer, which is a 0.7 kb PCR fragment from the vector pAD-CMVI
  • the plasmid obtained was called pWS.
  • the cDNA coding for mouse IL-2 was generated as a PCR fragment from the plasmid BMGneo-mIL-2
  • the vector pWS2 is used, which is obtained in a similar manner to the vector pWS2m, with the difference that, as a template for the PCR amplification, instead of the plasmid BMGneo-mIL-2, the plasmid pIL2-50A (Taniguchi et al., 1983), which contains the cDNA coding for human IL-2.
  • the vector pGShIL-2tet was produced, which contains the tetracycline resistance gene, cut out from pBR327.
  • mice IL-2 sequence For the plasmid pCM2, the mouse IL-2 sequence together with the 5 'and 3' flanking regions (cleavage and poly (A) signals from rabbit-ß-globingen) were used as
  • DNA plasmid construct containing the sequence coding for mouse IFN- ⁇ The plasmid pSVEmuIFN- ⁇ described by Gray and Goeddel, 1983 was used.
  • DNA-plasmid construct pHSA containing the sequence coding for HSA
  • the plasmid pHSA which contains the HSA sequence driven by the CMV promoter, was obtained by cloning the HSA cDNA (Kay et al., 1990) into the BstXI site of the plasmid pCDM8 (Seed, 1987).
  • DNA plasmid construct pWS-RABIES containing the sequence coding for the Rabies glycoprotein
  • the sequence coding for the Rabies glycoprotein was cloned from the vector pKSV-10 (Pharmacia), which contains the Rabies glycoprotein cDNA (Anilionis et al., 1982) into the Bgl II site down from the SV40 promoter as Bgl II Fragment isolated.
  • the vector pWS2m was cut with Bgl II and BamHI.
  • the fragment carrying the murine IL-2 cDNA was separated by agarose gel electrophoresis and the fragment corresponding to the vector pWS was isolated and ligated to the Rabies fragment.
  • the correct Rabies orientation was confirmed by sequencing.
  • the Rabies glycoprotein sequence is as
  • the vector pWS2 described in i) was cut with SalI and BamHI and the fragment thus released, coding for IL-2, was separated by agarose gel electrophoresis.
  • the DNA coding for murine GM-CSF was synthesized from 12 mutually overlapping Oligonucleotides produced.
  • the sequence used corresponded to the sequence described by Miyatake et al., 1985 (coding region from position 32 to position 457), with the difference between silent exchanges in position 178 (A instead of G), position 274 (C instead of G) and position 355 (C instead of G).
  • the AGC triplet was replaced by GTC.
  • the 5 'area was provided with a Sall-compatible overhang, the 3' area with a BamHI-compatible overhang.
  • the 5 'end was provided with a GCCGCC sequence analogous to the IL-2 sequence in pWS2.
  • the synthetic GM-CSF gene was cloned into the vector pWS2 and sequenced using the "shot-gun" method (Sambrook, 1989). The means
  • An IL-2 cassette containing the CMV enhancer / promoter, the sequence coding for IL-2 and the SV40-PolyA sequence was obtained by means of PCR using the vector pWS2 described in i).
  • the PCR product was subjected to restriction enzyme digestion with EcoRI and into the EcoRI / Smal site of the plasmid pUC19
  • the plasmid obtained was named pGShIL-2.
  • the plasmid pBR327 (Soberon et al., 1980), which had been digested with Sspl and Aval, served as the source for the tetracycline resistance gene and parts of the "upstream" region of the ⁇ -lactanase gene (ampicillin resistance gene) .
  • EcoRI / Aval adapter the isolated tet sequence was inserted into the
  • the plasmid pCMV was prepared by removing the BamHI insert of the plasmid pSTCX556 (Severne et al., 1988), treating the plasmid with Klenow fragment and the HindiII / Sspl and Klenow-treated fragment from the plasmid pRSVL (containing the Photinus pyralis
  • Luciferase gene under the control of the Rous Sarcoma Virus LTR enhancer / promoter (Uchida et al., 1977,
  • EGF Extracellular Growth Factor
  • HBS Hemtrachlorose
  • etrachlorose Hemtrachlorose
  • HBS Hetrachlorose
  • elution buffer 1 mg EGF (Epidermal Growth Factor, Sigma, St. Louis, Cat. No. E-4127) was purified by gel filtration (Sephadex G-10) with HBS as the elution buffer.
  • the modified protein was gel filtered at room temperature through a Sephadex G-10 column, whereby 70 nmol EGF, modified with 50 nmol dithiopyridine linker, was obtained.
  • the modified protein was treated with 3-mercaptopropionate-modified polylysine (50 nmol, average chain length 290 lysine monomers,
  • Dithiopyridine linker was obtained.
  • the modified protein was modified with 3-mercaptopropionate
  • Virion concentration was extracted by UV spectrophotometric analysis
  • genomic virus DNA performed (formula: a
  • optical density unit (OD, A260) corresponds to 10 12
  • the adenovirus d11014 described by Bridge and Ketner, 1989, was in the cell line W162, which is derived from the cell line Vero (ATCC No. CCL81) and their
  • Total volume 3.2 ml (Total volume 3.2 ml) and stored at -25oC.
  • biotinylation of the virus could be demonstrated in a qualitative detection after drops of different dilutions on cellulose nitrate membrane: after
  • the biotinylation of adenovirus d11014 was based on 15 ml adenovirus preparation (1.2 ⁇ 10 12 particles per ml), which were treated with 150 ⁇ l, 1 mM NHS-LC-biotin. After 3 hours at room temperature, dialysis was carried out against 1 1 HBS plus 40% glycerol at 4 ° C overnight, then the buffer was replaced with fresh one and a second dialysis was carried out. A virus preparation with a titer of approximately 1.2 ⁇ 10 12 particles per ml was obtained. iv) Inactivation of biotinylated adenovirus with 8-methoxypsoralen
  • the first step was biotinylated
  • Plasmid DNA in 150 ⁇ l HBS was added, mixed well and incubated for a further 30 min.
  • polylysine-modified human transferrin (TfpL) in 150 ⁇ l HBS was added, mixed thoroughly and incubated for 30 min.
  • TfpL polylysine-modified human transferrin
  • mouse melanoma cell line Cloudman S91 (clone M3) was purchased from ATCC (No. CCL 53.1). The cells were grown in 6 cm plastic dishes or T25 culture bottles coated with 0.1% gelatin in Ham's F10 medium containing 12.5% horse serum, 2.5% FCS, 2 mM glutamine and antibiotics. ii) mouse fibroblasts
  • Tissue fragments were allowed to settle for 5 minutes and the supernatant containing the released cells was mixed with 5 ml of DMEM containing 20% FCS. The undissociated material was digested for an additional 30 minutes and the supernatant collected as described above.
  • the combined supernatants were 15 min Centrifuged at 500 xg, the cell pellet in DMEM, containing 20% FCS, resuspended and the rows sown in culture bottles. After 30 minutes, the non-adhered cells were aspirated and fresh medium
  • tissue fragments were carefully pushed through a metal sieve with the plunger of a syringe. The material was then run through several times
  • Antibiotics penicillin / streptamycin or, in the case of human fibroblasts, gentamycin are given.
  • the biopsies were extensively crushed in a tissue culture facility using tweezers and a surgical knife in a laminar air flow in sterile 6 cm plastic dishes. Then were
  • Antibiotics were added and the culture was placed in a 37oC incubator. After 10 days, the medium was replaced with DMEM containing 10% FCS. Then the medium was changed twice a week. 4 weeks after the start of the culture, the cells which were from the Tissue fragments had grown out, trypsinized and plated out in new culture dishes for transfection.
  • An alternative, preferred method was to transfer the pieces of skin into fresh medium after comminution and to wash them with medium once or twice as required. 5 to 10 pieces of tissue were placed in a T25 tissue culture bottle, the surface of which had been wetted with DMEM plus 10% FCS, and distributed evenly, whereupon the bottle was turned over. This caused the biopsies to hang ("hanging drop
  • the KB human epidermoid carcinoma cell line was purchased from ATCC (No. CCL 17). The cells were 6 cm
  • Luciferase activity was performed as by Zenke et al., 1990, Cotten et al., 1990, or in EP 388 758. ii) IL-2 assay
  • interleukin-2 The expression of interleukin-2 was determined using a bioassay as described by Karasuyama and Melchers, 1988. In addition, IL-2 production was carried out using the Becton Dickinson IL-2 ELISA kit (catalog No. 30032) according to the manufacturer's instructions. iii) IFN- ⁇ assay
  • Virus preparations carried out. These experiments have shown that the results obtained with d1312 in this regard can be transferred to psoralen / UV-inactivated adenovirus d1312 and to (psoralen / UV-inactivated) adenovirus d11014. In some experiments, d1312 was used as a representative. example 1
  • HMM-1 and HMM-2 were transfected at different time intervals from the start of culture with complexes which contained the following components: 1.7 x 10 10 adenovirus particles d1312, 100 ng StreptpL, 6 ⁇ g pCMVL-DNA, 7 ⁇ g TfpL .
  • the expression of luciferase was determined 24 hours after the transfection. Expression was based on the protein content of the cell lysates on 1 x 10 6 cells
  • HMM-1 Primary human melanoma cell isolates of the designation HMM-1 were treated with 1.7 x 10 10 adenovirus particles d1312,
  • Transfection complexes were prepared in which the TfpL was replaced by non-conjugated pL (pL). The result of these tests is shown in Fig. 2. It was found that the addition of free transferrin reduced the amount of luciferase expression, which was indicated indicates that the complexes are taken up, at least in part, by binding to the transferrin receptor. On the other hand, however, the still significant gene expression seen in the presence of free transferrin suggests that binding to the adenovirus receptors is also greater
  • HMM-1 primary human melanoma cells per 6 cm petri dish were transfected with complexes consisting of 1.2 x 10 10 adenovirus particles d1312, 1,200 ng streptpL, 6 ⁇ g pCMVL and 6.6 ⁇ g TfpL or
  • Adenovirus particles d1312 (d1312 PI), 600 ng StreptpL, 6 ⁇ g pCMVL and 6.6 ⁇ g TfpL (the optimal amount of
  • Luciferase expression measured per 3 x 10 5 cells.
  • the effect of 8-methoxypsoralen / UV inactivation on gene expression is shown in FIG. 3. 7 days after the transfection there was a sharp decrease in
  • Fibroblasts derived from malignant melanoma were transfected with combination complexes containing either adenovirus d1312, 8-methoxypsoralen / UV-inactivated adenovirus d1312 or adenovirus d11014.
  • the cells were transfected with complexes which contained the following components: 6 ⁇ g pCMVL-DNA,
  • Virus particles per ml 100 ⁇ l aliquots of this mixture or, in order to obtain the virus: cell ratios shown in FIG. 4, a 1: 3 serial dilution of this mixture were applied to 3 ⁇ 10 4 cells per well of a cell culture plate (24 wells per plate) in 500 ⁇ l RPMI + 2% FCS applied. After 2 hours at 37 ° C the medium was replaced with 2 ml RPMI + 10% FCS. After 8 days, the medium was removed and the cells were fixed with 4% formaldehyde and 150 mM NaCl for 5 minutes and then stained with 0.1% crystal violet in 2% ethanol for 10 minutes. The cells were then washed twice with PBS, once with water and photographed. The result of the cytotoxicity test is shown in FIG. 4: With a standard virus: cell ratio of 10,000: 1, adenovirus dl312 is cytotoxic; this cytotoxicity is mitigated by psoralen / UV treatment of the virus.
  • Luciferase expression in light units per ⁇ g protein in the cell lysate was assessed for Luciferase expression in light units per ⁇ g protein in the cell lysate.
  • M-3 mouse melanoma cells (3 x 10 5 cells per 6 cm
  • Petri dish were transfected with 2 x 10 9 adenovirus particles d1312, 250 ng StreptpL, 6 ⁇ g plasmid DNA (containing the mouse IL-2 or the mouse IFN- ⁇ sequence) and 7.5 ⁇ g TfpL. 4 h after the transfection, the cells were washed twice with Ham 's F10 culture medium without serum.
  • proliferradiated tumor cells (“prophylactic mouse model”) a) M-3 melanoma cells (3 x 10 5 cells per T25
  • mice were immunized with 1 x 10 5 cells administered subcutaneously in the back. In parallel, a group of 6 mice were immunized with non-transfected M-3 cells, which were irradiated and further
  • mice had been treated like the transfected cells.
  • the mice received booster immunizations with cell preparations as used for the first immunizations.
  • the animals were exposed to the highly tumorigenic dose of 1 x 10 5 M-3 cells, which was applied at a location which was remote from the previous immunization sites.
  • 4 mice that had not been immunized were exposed to the tumorigenic cells in the same way. 8 weeks after tumor cell implantation, all (4/4) non-immunized animals developed tumors, while all mice immunized with the irradiated, IL-2 transfected M-3 cells were free of tumors (0 tumors in 5 animals) .
  • mice irradiated, non-transfected M-3 cells and irradiated M-3 cells that had been transfected with an "empty" plasmid (pSP) were only partially protected (4 out of 6 mice developed tumors).
  • the development of the tumors in the animals is summarized in Table II and in FIG. 9. The results obtained show that the immunization of mice with IL-2 transfected, irradiated tumor cells induces a systemic immune response that the animals before
  • mice were treated according to the same immunization protocol with irradiated M-3 cells that had been transfected with complexes containing 3 ⁇ 10 9 8-methoxypsoralen / UV-inactivated adenovirus particles d11014, 600 ng streptpL, a) 6 ⁇ g IL-2 plasmid pBCMGneo-mIL-2 (IL-2 100%), b) 5.4 ⁇ g pSP plasmid and 0.6 ⁇ g IL-2 plasmid (IL-2 10%), c) 5.4 ⁇ g IL-2 plasmid and 0.6 ⁇ g IFN - ⁇ plasmid
  • mice (IL-2 90% + IFN- ⁇ 10%) or d) 5.4 ⁇ g pSP plasmid and 0.6 ⁇ g IFN- ⁇ plasmid (IFN- ⁇ 10%), and 4.7 ⁇ g TfpL contained.
  • a group of mice was immunized with irradiated M-3 cells that had been transfected with 3.6 ⁇ 10 9 inactivated
  • Adenovirus particles d1312, 600 ng StreptpL, 6 ug IL-2 plasmid and 4.7 ug TfpL (IL-2 100% d1312).
  • 1 ⁇ 10 5 M-3 cells were implanted in the immunized animals and, as a control, also in the non-immunized animals.
  • the development of the tumors is summarized in Table III.
  • M-3 cells transfected with 100% IL-2 plasmid produced 33,000 units of IL-2 per 1 x 10 6 cells per 24 hours, while M-3 cells transfected with 4% IL-2 plasmid produced 396 units IL-2 produced per 1 x 10 6 cells and 24 h. A week after the
  • Booster injections were made in the immunized animals and, 1 x 10 ⁇ M-3 cells were also implanted in the non-immunized animals for control purposes.
  • further groups of mice were implanted with 3 ⁇ 10 5 M-3 cells and 1 ⁇ 10 6 M-3 cells . To show that the immune response
  • mice which had been immunized with 100% IL-2 transfected, irradiated M-3 cells were given 1 x 10 5 syngeneic
  • Squamous cell carcinoma cells KLN 205 (ATCC No. CRL 1453) implanted. The development of the tumors is shown in Table IV.
  • KB cells were grown at a density of 400,000 cells per 6 cm dish and transfected with various complexes containing 2.5 x 10 9 adenovirus particles d1312, 200 ng streptpL, 6 ⁇ g pCMVL-DNA and optionally 3.8 ⁇ g polylysine, 3.8 ⁇ EGF-pL ( Amount based on polylysine content), or 6 ⁇ g TfpL contained.
  • the complexes containing 2.5 x 10 9 adenovirus particles d1312, 200 ng streptpL, 6 ⁇ g pCMVL-DNA and optionally 3.8 ⁇ g polylysine, 3.8 ⁇ EGF-pL ( Amount based on polylysine content), or 6 ⁇ g TfpL contained.
  • the complexes containing 2.5 x 10 9 adenovirus particles d1312, 200 ng streptpL, 6 ⁇ g pCMVL-DNA and optionally 3.8 ⁇ g polylysine, 3.8 ⁇ E
  • FIG. 10A A value of 20,845,000 light units was obtained with EGFpL; this Value was significantly higher than with TfpL (3970000) or polylysine (plys 10550000).
  • TfpL TfpL + EGF 12350000 light units
  • polylysine pLys + EGF 14055000
  • the expression values refer to 50% of the cells.
  • KB cells were transfected with complexes which inactivated 5 ⁇ 10 9 8-methoxypsoralen / UV
  • Plasmid constructs which were present as a component of ternary complexes, were transfected. 3 ul adenovirus d1312
  • transfection complexes were used for the experiments with 8-methoxypsoralen / UV-inactivated adenovirus d11014 used: 9 ⁇ l virus preparation, 600 ng StreptpL, 6 ⁇ g TfpL, 6 ⁇ g BCMGneo-mIL-2.
  • the IL-2 activity was determined after the time intervals indicated in FIG. BCMGneo-mIL-2 also became 64,000 units after 48 hours and after
  • IL-2 constructs were transfected with IL-2 constructs as in a) and the IL-2 expression was determined on the days after the transfection shown in FIG. 12.
  • the composition of the transfection medium was the same for BCMGneo-mIL-2 as for M-3 cells; an identical transfection complex was made for BMGneo-mIL-2.
  • M3 cells were in Ham's F12 medium plus
  • Vaccine used within 60 min for injection into recipient mice.
  • mice were injected as described in the previous examples. There were two separate vaccine injections with each one week apart
  • mice 100,000 cells carried out in two different places on the back.
  • the mice were injected with 300,000 unmodified, non-irradiated M3 cells in 300 ⁇ l HBSS at a third location on the back.
  • the development of the tumors was checked at weekly intervals.
  • Fig. 13 shows the result of these experiments (the number of days is shown on the abscissa, the tumor size in mmX on the ordinate. The numbers next to the endpoints mean the number of mice with tumors compared to the total number of mice in each group.
  • pSP 6 ⁇ g pSP; 80 IL-2/20 pSP: 4.8 ⁇ g pWS2m plus
  • Tumor growth rate Considerable tumor masses were formed in 4 out of 6 mice.
  • the IL-2 producing cells caused only a moderate decrease in tumors in all mice in the group (3/3) that developed tumors.
  • mice that had been vaccinated with HSA-expressing M3 cells showed a strongly suppressed tumor growth.
  • the mice vaccinated with both HSA and IL-2 were administered at a reduced dose of IL-2 DNA.
  • expressing M3 cells developed tumors at a significantly reduced frequency (2 out of 6), and the tumors formed were small compared to the control tumors (vaccination with pSP-transfected cells); the average size was 18 mm 3 compared to 1149 mm 3 .
  • Example 11 M3 cells were treated and transfected as described in Example 11. Only the exposure time of the transfection complexes, which were produced in the same way as in Example 11 (6 ⁇ g plasmid DNA) on the cells, was four instead of two hours. The injections into the mice were also analogous to Example 11
  • FIG. 14 shows the result of the tests, the structure of the graphic is kept analogous to FIG. 13.
  • pSP negative control shows the expected, significant tumor growth.
  • Psoralen was removed by gel filtration: for this, the virus / psoralen sample (2 ml) was applied to a pharmacia
  • Inactivation performance is achieved when psoralens are used at concentrations close to saturation, while much better performances are achieved at lower concentrations. This could either be due to a crystallization phenomenon that made up the compound removed the solution, or on a filter effect
  • the CPE assay ("Cytopathic Endpoint Assay" or
  • Fig. 15 The numbers on the left in the figure refer to the relative virus titer (filled triangles), the numbers on the right in the figure refer to luciferase light units (open
  • the concentration of 8-methoxypsoralen in mg / ml is plotted on the abscissa. It was shown that treatment of the virus with 0.11 mg / ml 8-methoxypsoralen causes a reduction in the titer which is no different from that caused in preliminary tests with a concentration of 0.33 mg / ml.
  • the DNA transport activity is at this concentration
  • RNA viruses as well as DNA viruses and is 5 mg / ml soluble in aqueous solutions. The used
  • Luciferase light units (open squares). The concentration of 4'-aminomethyl-4,5 ', 8-trimethylpsoralen in ⁇ g / ml is plotted on the abscissa.
  • the virus samples were adjusted to 0.3 M HEPES, pH 7.9
  • ⁇ -propiolactone solutions were added. Concentrated ⁇ -propiolactone solutions were prepared by
  • ⁇ -propiolactone (Sigma, Catalog No. P5648) was diluted with HBS immediately before use. There were
  • virus samples were incubated for 4 hours at room temperature before either being stored at -70 ° C or for the
  • the adenoviruses were exposed to various concentrations of ⁇ -propiolactone at room temperature for 4 hours
  • ß-propiolactone suggested that a modification of viral nucleic acids occurs preferentially at the lower concentration, whereas the agent admits the capsid proteins at the higher concentrations modify and begin to damage the endosomolytic activity of the virus.
  • the adenoviruses were treated with several aliquots of lower ( ⁇ 0.3%) ß-propiolactone concentrations in the hope that one would be preferred
  • Sample 3 Inactivation with 0.3% ⁇ -propiolactone.
  • Sample 4 Inactivation with 2 x 0.3% ß-propiolactone.
  • Sample 5 Inactivation with 3 x 0.2% ⁇ -propiolactone.
  • Sample 6 Inactivation with 4 x 0.15% ß-propiolactone.
  • Sample 7 Inactivation with 1%
  • Luciferase light units D) Determination of the replication ability of inactivated adenoviruses by means of a plaque assay i) Comparison of the plaque assays of adenovirus d11014, inactivated with 8-methoxypsoralen, ⁇ -propiolactone or 4'-aminomethyl-4, 5 ', 8-trimethylpsoralen The plaque assay is used for a more sensitive determination of the replication ability of the virus: Adenovirus 5 requires the penetration of 10 to 50 virus particles in order to generate an infected cell.
  • the CPE assay shown below measures the ability of chemically inactivated viruses to trigger a cytopathic viral infection, but this requires infection of at least 10% of the target population to be detected during the four days that the assay lasts.
  • This assay thus allows the detection of
  • the plaque assay can be used to detect a single plaque that has arisen as a result of the penetration of 10 to 50 viruses; the test is therefore approximately 1,000 times more sensitive than the CPE assay.
  • Virus preparations by means of a plaque assay showed that the ⁇ -propiolactone treatment (2 x 0.3%) caused a decrease in the virus titer by about 5 log (FIG. 19: sample 1: non-activated virus, sample 2: inactivation with 0.33 ⁇ g / ml 8-methoxypsoralen, sample 3: inactivation with 0.11 ⁇ g / ml 8-methoxypsoralen, sample 4: inactivation with 2 x 0.3% ß-propiolactone, sample 5: inactivation with 0.28 mg / ml 4'-aminomethyl-4,5 ' , 8-trimethylpsoralen, sample 6:
  • Psoralen inactivated samples show that less than 10 2 plaque forming units (pfu's) are present in the psoralen inactivated samples.
  • the An important observation is that ß-propiolactone-inactivated viruses form plaques with a demonstrable frequency. So if the ß-propiolactone inactivation in the CPE assay appears to be equivalent to the inactivation of psoralen - in the plaque assay there is a clear one
  • the adenovirus d11014 preparations were made with
  • Example 1 non-activated virus
  • Sample 2 inactivation with 0.11 ⁇ g / ml 8-methoxypsoralen
  • Sample 3 inactivation with 0.3% ß-propiolactone
  • Sample 4 inactivation with 2 x 0.3% ß-propiolactone
  • Sample 5 inactivation with 3 x 0.2% ß-propiolactone
  • sample 6 inactivation with 4 x 0.15% ß-propiolactone
  • sample 7 inactivation with 1%
  • the complexes contained approx. 1 x 10 10 virus particles, 800 ng streptavidin-polylysine, 6 ⁇ g pCMV-DNA and 5.2 ⁇ g
  • the complexes were applied to K562 cells (24 h pre-grown in 50 ⁇ M deferrioxamine / RPMI / 10% FCS, plated at 250,000 cells / ml) at 2 ml per well of a 24-well plate. After two hours
  • RNA Northern analysis was carried out according to the method described by Paeratakul et al., 1988: 48 hours after the transfection, the cells were washed 3 times in HBS and serial dilutions corresponding to 30,000, 10,000 or 3,000 cells were applied to a nitrocellulose filter using a 96 Samples of dot blot device
  • the filters were then washed twice in 2X SSC / 0.1% SDS for 30 minutes at 65 ° C, each followed by 30 minutes in 0.1X SSC, 0.1% SDS.
  • the radioactive pattern was visualized by phosphor imaging.
  • the radioactively labeled ( 32 P) probes were prepared from PCR products from adenovirus d11014 sequences.
  • An Ela probe (383 bp) was prepared using PCR primers for Ad5, bp 736-751 (Ela.l) and for bp 1119-1101 (E1a.2). (This sequence is part of the region deleted in d1312. It serves as
  • RNA signal should be missing in the d1312 samples, but should be contained in the d11014 samples because the latter virus has a wild-type El region.
  • An E3 probe (436 bp) was derived from the most expressed E3 gene, the 19 K glycoprotein gene (Gooding, 1992) using primers made to Ad5, bp 28722-28737 (E3.a) and 29157-29142 (E3.b) (Die
  • E3 should play an important role in the immune response to transfected cells, because at least two of the E3 genes modulate the surface expression of MHC class I molecules and TNF receptor molecules on the surface of infected cells.
  • the gel fragment was then heated to 95 ° C for 10 minutes and 10 ⁇ l of the resulting solution was added for 12 hours
  • Fig. 21 shows the autoradiogram: it was found that there was no Ela expression in the d1312 samples, both in the non-inactivated and in the 8-methoxypsoralen inactivated.
  • d11014 viruses strong, but completely absent both in the 8-methoxypsoralen-treated and in the viruses inactivated twice with 0.3% ß-propiolactone.
  • E3 is less expressed in non-inactivated d1312 adenoviruses than in d11014. This finding is in line with the knowledge of Ela's role as positive
  • RNA sample washed once with 80% ethanol and dissolved in 20 ⁇ l RNase-free water. Contaminating DNA contained in the RNA sample was removed by digestion with RNase-free DNase (Boehringer Mannheim; 60 min at 37 ° C). The DNase was then inactivated by further incubation at 95 ° C for 5 minutes.
  • RNase-free DNase Boehringer Mannheim
  • the reverse transcription reaction mixtures contained 10 ⁇ l RNA solution, 2 ⁇ l 10 mM dNTPs, 4 ⁇ l 25 mM MgCl 2 , 2 ⁇ l 10 X RT buffer (100 mM Tris-HCl, 900 mM KCl, pH 8.3), 1 ⁇ l 50 ⁇ M oligo d (D) 16 .
  • Reverse transcriptase reactions were carried out at 25 ° C for 10 minutes and at 42 ° C for 15 minutes, followed by 5 minutes at 95 ° C to inactivate the reverse transcriptase.
  • 3H 8-methoxypsoralen was determined by counting aliquots of the purified virus in scintillation fluid. Calculations based on the measured
  • Radioactivity built into the DNA showed that there was one psoralen molecule per 800 base pairs of the virus.
  • the virus DNA was purified and cleaved using restriction enzymes in order to obtain ten or eleven DNA fragments: from the 3 H 8-methoxypsoralen-labeled virus the DNA was purified by incubating the virus with 0.4% SDS / 0.4 mg / ml Proteinase K at 56 ° C for 45 min. The sample was taken twice
  • the DNA from the aqueous phase was precipitated with 0.54 volumes of isopropanol after addition of 1/10 volume of 3M sodium acetate, pH 5.
  • the precipitated DNA was centrifuged, washed twice with ice-cold 80% ethanol, air-dried and dissolved in TE.
  • DNA aliquots of non-inactivated adenovirus or of 3 H 8-methoxypsoralen-labeled adenovirus were with the restriction enzymes Hindill or Asp718 according to the manufacturer's instructions (Boehringer Mannheim), but with 10fafh digested higher amounts of enzyme, purified by phenol / chloroform and chloroform extraction, with ethanol
  • the cells were trypsinized, one bottle from each group, centrifuged, the pellet recorded, 100 ⁇ l of cell suspension mixed with trypan blue and counted in the counting chamber. The remaining cells were mixed with new medium and placed in a new culture bottle (1st passage). The process was repeated a week later; One bottle from each group was trypsinized, counted and the 1st passage was counted as a control. The non-irradiated and 5 Gy irradiated cells showed a clear one
  • Melanoma cell cultures were chosen as the safe radiation dose for all experiments with a dose of 100 Gy.
  • PCR polymerase chain reaction
  • M3 melanoma cells were transfected with recombinant mouse interleukin-2 plasmid using the adenovirus transferrin method as described in Example 8 c). After 24 h the cytokine production was determined (20,000-50,000 units of IL-2 in 24 h per
  • the cells were trypsinized in washed serum-free medium and adjusted to a concentration of 3 x 10 5 or 1 x 10 6 cells per 100 ⁇ l isotonic saline solution. 100 ⁇ l of cell suspension were injected subcutaneously into the right flank of DBA / 2 mice using a cannula (see also Examples 7 and 8).
  • PMBZs peripheral mononuclear blood cells
  • the blood mixed with citrate buffer (10 mM) was then separated by a Ficoll gradient and the PMBZs were digested with Proteinase K buffer. DNA purification was done as described above.
  • the reaction mixture was composed of 1 ⁇ g DNA, 1 ⁇ PCR buffer (Boehringer Mannheim), 1 mM
  • PCR reaction times were: 5 minutes at 95 ° C for denaturation, then 40 cycles of 30 seconds 94 ° C, 30 seconds 60 ° C, 2 minutes 72 ° C. After that, the Amplification products mixed with sample buffer and separated in a 2% agarose gel.
  • the specific primers had the following sequences:
  • IL-2 up position 99-122 (SEQ ID NO: 3)
  • Adeno up position 1228-1248 (SEQ ID NO: 5)
  • the detection limit of the amplification products is between 200 and 1,000 copies of DNA.
  • nine DBA / 2 mice were each immunized with 3 ⁇ 10 5 IL-2 plasmid-transfected M3 melanoma cells. After 1, 2 and 5 days, 3 mice were sacrificed and the immunization sites were cut out. The PCR analysis showed that after 2 days the IL-2 DNA began to degrade strongly and after 5 days this DNA was no longer detectable. In an analog experiment, IL-2 plasmid DNA could be detected from the injection site of an animal on day 5 after the injection. In PCR reactions with the adenovirus-specific
  • Injection site the draining lymph nodes, spleen, kidney, liver, colon and the gonads (ovaries)
  • Example 16 a Testing the effectiveness of the cancer vaccine for its protective action against metastasis
  • Therapeutic Mouse Model "Therapeutic Mouse Model"
  • the transfection complexes used, the cultivation of the cells and the implementation of the transfections were carried out as described in Example 8.
  • C57BL / 6J strain mice were used as test animals, 8 animals per group being used.
  • the melanoma cells used were the B16-F10 cells syngeneic for the mouse strain used (NIH DCT tumor depository; Fidler et al., 1975)
  • B16-F10 cells injected intravenously to cause metastasis.
  • the cancer vaccine was administered subcutaneously to immunize against the metastases.
  • transfected cells in the following means cells that have been subjected to transfection treatment; the expression values for the cytokines are given per mouse in 24 hours; the names correspond to those in Fig. 25):
  • the animals of the second group were each immunized with 1 ⁇ 10 5 M3 cells which had been transfected and irradiated with the vector pWE-Gm.
  • the first control group was treated with 1 x 10 5 irradiated but not transfected M3 cells.
  • the second control group received as
  • Tumor development control 5 x 10 3 M3 cells. The animals were observed over a period of more than 4 months. It was found that in the two groups which had received cells expressing a cytokine as tumor vaccine, 80% of the animals before one
  • Control group all tumors developed within 8 weeks. In the second control group, all but one of the animals developed.
  • Example 17 Efficacy of tumor vaccines depending on the cytokine dose in the prophylactic mouse model
  • M3 melanoma cells used were the same as in Example 16.
  • the cytokine plasmids used were the same as in Example 16. The
  • Example 8 Immunization was carried out as described in Example 8, for setting of the tumor ( "Challenge") was in contrast to Example 8 instead of 1 x 10 5 cells 3 x 10 5 cells.
  • the peptide with the designation INF5 (SEQ ID NO: 7) was synthesized using the HBTU activation method (Knorr et al., 1989; 1 mmol scale), 230 mg of TentaGel S-PHB resin (Rapp polymers; 0.27 mmol / g) as the solid phase was used.
  • the first amino acid that was coupled was N- ⁇ -N- ⁇ -di-Fmoc-lysine. This resulted in a head-to-head dimer, with a C-terminal lysine as
  • the stirring mixture is pipetted dropwise into 40 ml of ether and the mixture is left to stand for 1 h.
  • the crude peptide was obtained by centrifugation
  • the peptide was complexed ionically to polylysine.
  • the DNA complexes were mixed with 0.5 ml RPMI 1640 (Gibco), containing 10% FCS, and applied to M3 melanoma cells (1 ⁇ 10 5 cells in 6-well plates). After 4 hours the medium was replaced by fresh medium. The cells were harvested 24 h after the transfection and examined for luciferase activity. Expression corresponding to 12,866,000 light units was detected.
  • Transfection complexes consisting of 3 ⁇ g pGShIL-2tet, 1.5 ⁇ g TfpL290, 5 ⁇ g pL290 and 40 ⁇ g INF5 were, as in i) described, applied to melanoma cells.
  • the amounts of IL-2 secreted into the culture medium within 24 h were measured by means of an ELISA assay (Biokine IL-2 test kit, T Cell Diagnostics). The values were 6,500 BRMP units on the first day and 11,500 BRMP units on the second day, one unit corresponding to 40 pg IL-2.
  • C57BL / 6J strain and B16-F10 cells were used in this experiment. There were two immunizations, each with 1 x 10 5 cells at an interval of 7 days
  • the challenge (1 ⁇ 10 5 cells) was set 7 days after the last immunization.
  • the cancer vaccines were prepared using a transfection complex consisting of 6 ⁇ g pWS-Gm-DNA, 3 ⁇ g TfpL, 10 ⁇ g pL and 40 ⁇ g INF5. There were tumor vaccines
  • the starting material was plasmid pGShIL-2tet and MM3 melanoma cells irradiated with 100 Gy; after 20 h incubation at 37 ° C, the cells were trypsinized and cell number as well
  • Viability determined with trypan blue The cells were then divided into four equal groups to test four different freezing media. The four
  • Sample groups were centrifuged in RPMI 1640 at 800 rpm (120 g) before adding freezing medium, and the cell pellets were placed in 1 ml freezing medium. After this
  • the plasmid pGShIL-2tet was obtained from E. coli overnight cultures (grown in the presence of 5 ⁇ g / ml tetracycline in LB medium). b) Purification of the plasmid DNA from endotoxin
  • Triton X-114 (Sigma) was subjected to three 0 ° C / 30 ° C temperature cycles as described by Bordier, 1981.
  • the extraction of the lipopolysaccharides from the DNA sample was carried out as follows, using modified methods (Aida and Pabst, 1990; Manthorpe et al., 1993): The DNA sample (0.5-1.5 mg / ml in 10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 (TE)) was on
  • a volume of polymyxin resin sludge (Affi-Prep-Polymyxin, Biorad), which corresponded to the volume of the DNA sample, was briefly mixed with three volumes of 0.1 N NaOH, then it was washed three times with five resin volumes of TE. The pelleted resin was taken up again with the DNA samples (in TE 0.8-1.2 mg / ml) and the mixture was stirred at 4 ° C. overnight. Then the sample was put on one
  • Lipopolysaccharide content was determined using the Limulus chromogenic assay based on the Limulus coagulation reaction of Amoebocyte-based (Iwanaga, 1993; available from
  • Particles / ml) and plasmid DNA (6 ⁇ g, diluted in 100 ⁇ l with the lipopolysaccharide content indicated in each case) were prepared as described in the preceding examples.
  • H225 Primary human melanoma cells
  • transfection complexes used the culturing of the cells and the implementation of the transfections were carried out as described in Example 8, with regard to the
  • Colon carcinoma cell line called CT 26 used, the establishment of which was described by Brattain et al., 1988.
  • BALB / c strain mice were used as test animals. 1 ⁇ 10 5 cells were used for each of the two immunizations, the challenge was set with 3 ⁇ 10 5 cells, n Table VII shows the expression values in 24 h for IL-2 (units / mouse), IFN-gamma and GM-CSF (each ng / mouse), secreted between

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Abstract

Krebsvakzine werden erhalten durch Behandlung von Tumorzellen oder Fibroblasten mit einem Komplex aus DNA, kodierend für ein immunstimulierendes Polypeptid, und einer DNA-bindenden Substanz, z.B. Polylysin, die vorzugsweise mit Transferrin konjugiert ist. Der Komplex enthält ferner ein Konjugat aus DNA-bindender Substanz und einem endosomolytischen Peptid oder einem Adenovirus, das zumindest einen E4-Defekt oder einen E1a-Defekt in Kombination mit weiteren Gendefekten aufweist.

Description

Verfahren zur Herstellung von Krebsvakzinen
Die Erfindung bezieht sich auf die Gentherapie,
insbesondere auf ihre Anwendung im Rahmen der
Krebstherapie.
In den letzten 20 Jahren hat es keinen entscheidenden Durchbruch bei der Behandlung von Krebserkrankungen gegeben, erst der kürzlich entwickelte Ansatz der sog. "Krebsvakzine" hat die Hoffnung auf einen Fortschritt in der Krebstherapie geweckt.
In Krebspatienten hat das Immunsystem einen großen
Einfluß auf die Entwicklung des Tumors und auf die
Prognose der Krankheit. Im Patienten mit malignem Melanom kann die Immunantwort zu einer vollständigen Rückbildung des Tumors in 0.5 % der Patienten führen. In den meisten Patienten wird hingegen eine Immunantwort, die die
Tumorentwicklung kontrolliert, jedoch nicht alle
Krebszellen ausschalten kann, in frühen Stadien des Tumors beobachtet. In fortgeschrittenen Stadien findet man oft die Situation, daß die Krebszellen der
Immunerkennung entkommen oder das Immunsystem spezifisch unterdrückt wird (Hoon et al., 1990). Es wurde
vorgeschlagen, nach der chirurgischen Entfernung des Primärtumors dem Patienten Krebsvakzine zu verabreichen. Krebsvakzine enthalten Krebszellen, die genetisch modifiziert sind, oder Krebszellen in Kombination mit immunstimulierenden Adjuvantien, die im Patienten eine krebsspezifische Immunantwort induzieren oder
reaktivieren (s. z.B. Hoon et al., 1990; Bystryn et al., 1990 und 1992; Berd et al., 1990; Fearon et al., 1990; Lotze et al., 1992; Pardoll, 1992; Rosenberg et al., 1992, Schirrmacher, 1990). Die Gene, mit denen Tumorzellen transfiziert werden, um sie stärker immunogen und als Folge davon weniger tumorigen zu machen, fallen in drei Kategorien:
1) Gene, die für Proteine kodieren, die den Tumorzellen fehlen (sog. Fremd- oder Neoantigene): Die dadurch hervorgerufene sog. "Xenogenisierung" kann z.B. durch Expression syngenetischer MHC-I-Antigene in MHC-I- defizienten Tumorzellen, durch Expression von
allogenetischen MHC-I- oder MHC-II-Antigenen oder durch Expression von viralen Proteinen wie Hämagglutinin ( Itaya et al., 1987; Fearon et al., 1988; Plaksin et al., 1988 und Ostrand-Rosenberg et al., 1990).
2) Zytokingene: Die Expression dieser Gene (z.B.
Interleukin-2, CSF = "Colony stimulating factor",
Interferone) dient der Aktivierung des Immunsystems, damit dieses die Tumorzellen als fremd erkennt und sie abstößt.
3) Gene, die für sog. "Hilfsproteine" oder "costimulatorische Moleküle" kodieren: Jüngste Erkenntnisse der Immunologie haben gezeigt, daß eine effiziente
Stimulierung von T-Zellen sowohl die Aktivierung des T-Zellrezeptors als auch die Aktivierung eines zweiten Rezeptors auf der T-Zelle durch ein Molekül auf der Oberfläche der Antigen präsentierenden Zelle erfordert (Jenkins und Johnson, 1993). Das Paar B7/CD28 stellt eine solche Einheit co-stimulierender Moleküle dar. Die
Expression von B7 auf Melanomzellen stimuliert eine Immunabwehr von normalerweise nicht immunogenen Zellen (Baskar et al., 1993; Chen et al., 1992; Townsend und
Allison, 1993, Schwartz, 1992). Das "Hitzestabile
Antigen" HSA ( "heat stable antigen"), das u. a. von dendritischen Zellen und von Milz-B-Zellen exprimiert wird, zeigt ebenfalls co-stimulierende Aktivität (Liu et al., 1992a und 1992b) und dürfte bei der Förderung des T-Zellwachstums mit B7 zusammenwirken. Eine der
Eigenschaften von co-stimulatorischen Molekülen wie B7 dürfte darin bestehen, daß sie den Tumorzellen
Eigenschaften von Antigen präsentierenden Zellen
verleihen.
Mit der durch die Transfektion der Tumorzellen mit einem Gen aus einer dieser Gruppen bewirkten krebsspezifischen Immunantwort soll erreicht werden, daß nach Entfernung des Tumors Mikrometastasen, die bis heute klinisch nicht nachweisbar sind und chirurgisch nicht entfernt werden können, zerstört werden, um ein späteres Wiederauftreten von Krebs zu verhindern.
Eine Therapie auf Basis von Krebsvakzinen stellt - im Gegensatz zur unspezifischen Stimulation des Immunsystems - eine aktiv-spezifische Immuntherapie mit Impfstoffen aus inaktivierten, möglichst patienteneigenen Tumorzellen oder Teilen davon dar, wodurch das Immunsystem des
Patienten gezielt gegen Antigene des individuellen Tumors oder zumindest desselben Tumortyps mobilisiert wird.
Nachdem sich gezeigt hatte, daß eine Inaktivierung der Tumorzellen eine Verminderung der Immunantwort bewirken kann, wurden in jüngster Zeit Krebsvakzine entwickelt, die aus lebensfähigen Tumorzellen bestehen (Rosenberg et al., 1992). Es ist jedoch aus Sicherheitsgründen ein Impfstoff auf der Grundlage nicht mehr teilungsfähiger Zellen erstrebenswert, die eine begrenzte Lebensdauer haben.
Einer der kritischen Schritte bei der Herstellung von Krebsvakzinen ist der Gentransfer in die Zellen, die das Vakzin bzw. einen Bestandteil davon darstellen.
Die bisher für den Transfer von Genen in die Zelle, u.a. im Rahmen der Anwendung von Krebsvakzinen, am weitesten fortgeschrittene Technik benutzt rekombinante retrovirale Vektoren; eine solche Methode wurde kürzlich von
Rosenberg er al., 1992, vorgeschlagen. Die Verwendung von Retroviren ist jedoch problematisch, weil sie, zumindest zu einem geringen Prozentsatz, die Gefahr von
Nebenwirkungen, wie Infektion mit dem Virus, in sich birgt. Darüber hinaus können Retroviren nur sich teilende Zellen transduzieren. Außerdem sind diese Vektoren, wie auch die als Alternative zum retroviralen System
vorgeschlagenen rekombinanten Adenoviren, Beschränkungen, und zwar hinsichtlich der Größe und Konstruktion der zu transferierenden DNA, unterworfen.
Kürzlich wurde in mehreren Arbeiten der Einsatz von nicht-rekombinanten Adenoviren aufgrund der Fähigkeit dieser Viren, den Inhalt von Endosomen freisetzen zu können, für den Gentransfer mit DNA-Komplexen mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose vorgeschlagen. Der Einsatz von Adenoviren bewirkt eine Steigerung der
Effizienz des Gentransfers, indem der Abbau der in die Zelle internalisierten DNA-Komplexe in den Lysosomen vermieden wird (Curiel et al., 1991; Curiel et al., 1992a; Zatloukal et al., 1992; Cotten et al., 1992;
Wagner et al., 1992; Curiel et al., 1992b). U.a. wurde vorgeschlagen, die Adenoviren durch Bindung an Polylysin zu modifizieren. Die Adenovirus-Polylysin-Konjugate können zusammen mit Konjugaten aus Transferrin-Polylysin mit DNA komplexiert werden, wobei ternäre Transferrin- Polylysin/Adenovirus-Polylysin/DNA-Komplexe entstehen (Wagner et al., 1992). Die Komplexe binden an
Transferrin- und Adenovirusrezeptoren auf den Zielzellen. Nach der Endozytose bewirkt das Adenovirus den Aufbruch von Endosomen, das hat die Freisetzung des Materials vom Endosom ins Zytoplasma zur Folge. Die DNA kann daraufhin in den Zellkern eintreten, wo das Gen exprimiert wird, überwiegend von episomal lokalisierter DNA. Diese Technik hat gegenüber den konventionellen viralen und nicht- viralen Gentransfermethoden folgende Vorteile: Da in diesem Zusammenhang das Adenovirus nur als Mittel für die Freisetzung der Transfektionskomplexe aus dem Endosom fungiert, kann das Virus mit Hilfe von genetischen und/oder chemischen, gegebenenfalls in Kombination mit physikalischen Methoden inaktiviert werden, was die Sicherheit gegenüber konventionellen viralen Techniken erhöht (Cotten et al., 1992). Ferner wird das
Genkonstrukt an der Außenseite des Virus transportiert; es ist nicht Teil des Virusgenoms. Daher müssen keine viralen Vektoren hergestellt werden, und es gibt nahezu keine Beschränkungen hinsichtlich Größe und Sequenz der transportierten DNA.
Ein weiterer Vorteil des rezeptorvermittelten
Gentransfers liegt in der Breite der Anwendbarkeit hinsichtlich der Zielzellen. So könnnen Komplexe, enthaltend Transferrin- und Adenoviruskonjugate über Transferrin- und/oder Adenovirusrezeptoren aufgenommen werden können. Statt Transferrin können auch andere Liganden, spezifisch für bestimmte Zellpopulationen, verwendet werden, für Melanomzellen hat sich z.B. LDL als sehr geeignet erwiesen. Es können mit Hilfe dieses
Systems hohe Werte für die Genexpression in vielen
Zelltypen erhalten werden (10 - 100fach höher als für retroviral transfizierte Zellen (Lotze et al., 1992;
Rosenberg et al., 1992) oder für mittels CaPO4 Co- Präzipitation erhaltene stabil transfizierte Zellen
(Fearon et al., 1990)). Ferner können Vielfachkopien des Genkonstrukts in die Zellen transportiert werden. Es können teilende und nicht-teilende Zellen transfiziert werden. Die Expression der in die Zelle transportierten DNA hält über mehrere Monate in konfluenten
(wachstumsarretierten) Zellkulturen an ( Zatloukal et al., 1992). Neben Adeno- und anderen Viren bzw. Virusfragmenten besitzen auch bestimmte Peptide die Eigenschaft,
Endosomen aufbrechen zu können. Derartige Peptide, die auch als "endosomolytische" oder "fusogene" Peptide bezeichnet werden, wurden ebenfalls eingesetzt, um beim Gentransfer mittels rezeptorvermittelter Endozytose eine Steigerung der Genexpression herbeizuführen. Der Einsatz solcher Peptide für den Gentransfer ist in der
WO 93/07283 beschrieben.
Die mit dem Adenovirus d1312 durchgeführten Versuche haben Toxizitätsprobleme aufgezeigt; der
Replikationsdefekt des Virus, der auf einen Defekt in der E1A-Region zurückzuführen ist, konnte von den
transfizierten Zellen teilweise umgangen werden, der Defekt ist also "undicht". Darüberhinaus war die Ausbeute an Virus in den Verpackungszellinien, die verfügbar sind, um die Defekte von Ad5 dl312 zu komplementieren, nicht befriedigend.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Krebsvakzinen auf der
Grundlage eines verbesserten Gentransfersystems
bereitzustellen.
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur
Herstellung von Krebsvakzinen, die autologe Tumorzellen enthalten. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man Tumorzellen oder Fibroblasten kultiviert und die kultivierten Zellen ex vivo mit einer Zusammensetzung transfiziert, die folgende Komponenten enthält: ai) ein DNA-Molekül, das eine oder mehrere in der Zelle exprimierbare Sequenzen enthält, die für ein oder mehrere, gleiche oder verschiedene,
immunstimulierende Polypeptide kodieren, oder mehrere DNA-Moleküle, enthaltend für verschiedene immunstimulierende Polypeptide kodierende Sequenzen, aii) gegebenenfalls ein weiteres DNA-Molekül, das frei ist von Sequenzen, die für ein in der zu
transfizierenden Zelle funktioneil aktives
Polypeptid kodiert; b) ein Konjugat zwischen einem DNA-bindenden Molekül und einem endosomolytisch wirkenden Mittel,
ausgewählt aus der Gruppe
i) Adenovirus, das eine Mutation zumindest in der E4-Region aufweist,
ii) Adenovirus, das neben einem Effekt in der E1A- Region einen oder mehrere weitere genetische Defekte aufweist, oder
iii) endosomolytisch wirkendes Peptid; gegebenfalls
c) ein DNA-bindendes Molekül, vorzugsweise
konjugiert mit einem Internalisierungsfaktor, der an ein Oberflächenmolekül der zu transfizierenden
Zellen bindet und in diese internalisiert wird, wobei die Komponenten b) und c) mit der in a) definierten DNA einen im wesentlichen elektroneutralen Komplex bilden, daß man die transfizierten Zellen derart
inaktiviert, daß sie unter Beibehaltung ihrer Fähigkeit zur Expression der in ai) definierten DNA ihre Fähigkeit zur Teilung verlieren, wobei man im Falle der
Transfektion von Fibroblasten diese mit nicht- transfizierten sowie inaktivierten Tumorzellen mischt, und daß man die Zellpopulation gegebenenfalls mit
pharmazeutisch annehmbaren Hilfs- und Trägerstoffen mischt. Das in b) definierte Konjugat wird im folgenden als "endosomolytisches Konjugat" bezeichnet.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Krebsvakzine enthalten gegenüber den von Rosenberg et al., 1992, vorgeschlagenen Krebsvakzinen inaktivierte Tumorzellen, die überraschenderweise trotz der
Bestrahlung hinsichtlich der von ihnen ausgelösten
Immunantwort voll wirksam sind. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, daß aufgrund der hohen
Expressionsraten der immunstimulierenden Gene in den transfizierten Zellen eine durch die Inaktivierung der Zellen bewirkte Verminderung bzw. einen Verlust der Antigenizität zumindest teilweise kompensiert wird.
Als Ausgangsmaterial für Tumorvakzine, die individuell für jeden einzelnen Patienten hergestellt werden, dienen autologe Tumorzellen, gegebenenfalls in Mischung mit Fibroblasten. Die Fibroblasten können ebenfalls autologe Zellen sein, es ist aber auch möglich, Zellen einer Fibroblastenzellinie einzusetzen, wodurch die
Notwendigkeit wegfällt, in jedem einzelnen Fall eine individuelle Fibroblastenkultur herstellen zu müssen, was mehrere Wochen erfordert.
Zunächst werden Tumorzellen und/oder Fibroblasten aus Gewebsproben des zu behandelnden Individuums isoliert. Die Methoden dazu sind dem Fachmann bekannt. Primäre Melanomzellen können z. B. am einfachsten aus
Lymphknotenmetastasen isoliert werden, indem die
Metastasen chirurgisch entfernt und unter sterilen
Bedingungen mechanisch und gegebenenfalls zusätzlich enzymatisch dissoziiert werden.
Die Isolierung aus Primärtumoren ist im allgemeinen schwieriger, vor allem im Fall von kleineren Tumoren. Dabei wird beispielsweise im Fall von Melanomen so vorgegangen, daß die Tumore chirurgisch entfernt, mechanisch zerkleinert und zusätzlich enzymatisch dissoziiert werden. Bekannte Vorschriften für die
Dissoziierung, nach denen vorgegangen werden kann, wenden Collagenase, DNAse und Hyaluronidase an.
Die Isolierung aus anderen Tumoren kann nach demselben Prinzip erfolgen, in Abhängigkeit vom umgebenden Gewebe werden die Methoden zur Isolierung und Dissoziierung variiert. Für Isolierung und Kultur von Tumorzellen können literaturbekannte Methoden angewendet werden, wie sie z.B. dem Fachbuch "Human Cancer in Primary Culture", Hsg. John R.W. Masters, 1991, entnehmbar sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Genkonstrukte statt in Krebszellen in primäre
Fibroblasten eingebracht, die dann mit den nicht- transfizierten bestrahlten Krebszellen, die Tumorantigene tragen, vermischt werden (Fakhrai et al., 1992). Der Vorteil dieser Ausführungsform besteht darin, daß
Fibroblasten leicht und in großen Mengen vom Patienten erhalten werden können, was vor allem von Bedeutung ist, wenn kleinere Tumore vorliegen und damit eine geringere Zahl von Tumorzellen vorhanden ist, und daß der
Gentransfer in autologe primäre Fibroblasten leichter standardisiert werden kann als die Transfektion in primäre Krebszellisolate von verschiedenen Patienten. Ein weiterer Vorteil dieser Ausführungsform besteht darin, daß die Tumorzellen nicht über längere Zeit kultiviert werden müssen, womit ihr antigenes Spektrum, das durch die Kultivierung teilweise verloren gehen kann, erhalten bleibt. Damit wird außerdem der mit der Kultivierung von Tumorzellen verbundene Nachteil vermieden, daß einzelne Populationen, z.B. Fibroblasten, die im Tumorisolat zu einem geringen Anteil enthalten sind, oder Tumorzellklone die Kultur überwachsen.
Fibroblasten werden nach bekannten Methoden aus
Hautbiopsien isoliert und kultiviert. Derartige Methoden wurden z.B. von Jones, 1989; Freshney, 1987; und Sly und Grubb, 1979, beschrieben
Nach der Kultivierung werden die Zellen mit dem
Transfektionsmedium, das die Komplexe mit den Komponenten a) bis c) enthält, behandelt. Im allgemeinen wird eine gleichzeitige Verabreichung von Konjugat b) und dem Komplex zwischen DNA und Internalisierungsfaktor-Konjugat bevorzugt. Um die Genexpression zu verstärken, können die Komplexe auch wiederholt angewendet werden.
Nach der Transfektion werden die Zellen von
überschüssigem Medium, das Transfektionskomplexe
beinhaltet, befreit, mit frischem Kulturmedium gewaschen und beliebig weiter kultiviert.
Die Inaktivierung der Tumorzellen bzw. der Fibroblasten, die vorzugsweise in gleicher Weise wie die transfizierten Fibroblasten inaktiviert werden, kann mit an sich bekannten Methoden, z.B. physikalischen Methoden, wie Behandlung mittels Röntgen- oder Gammastrahlung, und/oder mittels chemischer Behandlung mit Mitosehemmern, z.B. mit Mitomycin C, erfolgen. Geeignet sind Substanzen, die die DNA-Replikation blockieren oder sog. "Spindelgifte", das sind Substanzen, die die Mitosespindel hemmen.
Die geeignete Inaktivierungsdosis kann ermittelt werden, indem z.B. bei verschiedenen Strahlendosierungen bzw. Konzentrationen des chemischen Inaktivierungsmittels und/oder unterschiedlicher Behandlungsdauer einerseits der 3H-Thymidineinbau in die Zellen oder ihre Proliferationsrate und andererseits die Expression des Fremdgens bestimmt wird.
Durch die Bestrahlung der transfizierten Zellen und ihrer damit begrenzten Lebenszeit werden etwaige
Langzeitnebenwirkungen vermindert. Es wird eine
temporäre, durch die Gendosis festgelegte, zeitlich begrenzte Genexpression erzielt. Im Zuge der
durchgeführten Versuche wurde festgestellt, daß eine Gammastrahlendosis bis zu 100 Gy die Expression der transfizierten Genkonstrukte nicht vermindert.
Vorzugsweise werden die transfizierten Fibroblasten ebenfalls inaktiviert. Mit dieser Maßnahme wird eine bei der Transfektion und/oder Kultur etwa erworbene
Tumorigenität ausgeschaltet.
In dem Verfahren zur Herstellung der Krebsvakzine wird bevorzugt ein Einfrieren der Zellen unter kontrollierten Bedingungen und unter Zusatz von Substanzen, die
Gefrierschäden an den Zellen vermeiden
("kryoprotectants"), z.B. Dimethylsulfoxid (DMSO), als Zwischenschritt eingeschaltet. Der Gefrierschritt kann prinzipiell an beliebiger Stelle des Verfahrens
vorgesehen sein, z.B. vor der Transfektion der
kultivierten Zellen, oder auch nach der Transfektion, ein Einfrieren ist aber auch als letzter Schritt, also nach der Bestrahlung der Zellen und unmittelbar vor der
Verabreichung des Vakzins, möglich. Durch das Einfrieren wird ein Vorrat an für die Transfektion bereiten bzw. bereits transfizierten Zellen verfügbar, der dann in Aliquots die Fertigstellung der Tumorvakzine erleichtert. Zweckmäßig ist ein Gefrierpräparat, das zwischengelagert werden kann und vor der Anwendung nur noch einer
Aufbereitung, gegebenenfalls einschließlich Bestrahlung, unterzogen werden muß. Es ist in jedem Fall erforderlich, vor der Verabreichung der Tumorvakzine die Zellen von Gefrierschutzzusätzen zu reinigen.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in vitro hergestellten Krebsvakzine werden dem Patienten
verabreicht, um eine systemische, tumorspezifische
Immunantwort auszulösen oder zu reaktivieren.
Die Menge an Tumorzellen pro Immunisierung liegt im Größenordnungsbereich von 105 - 107 Zellen. Für die Ausführungsform, in der Fibroblasten kultiviert und transfiziert werden, liegt die Zahl an beigemischten Fibroblasten etwa in demselben Bereich, kann jedoch gegebenenfalls bis zu ca. 1/100 der Zellzahl verringert werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde in einem Mausmodell untersucht, wie lange nach der Injektion von gentechnisch veränderten Melanomzellen, den
Krebsvakzinen, diese Zellen an der Injektionsstelle nachweisbar sind. Ferner wurde untersucht, ob es zu einer Verteilung dieser Zellen im Blut oder in verschiedenen Organen kommt. Der Nachweis wurde anhand von Polymerase Ketten Reaktionen durchgeführt. Bei der Aufbereitung der Krebsvakzine wurden die Zellen mit Interleukin-2 Plasmid- DNA transfiziert. Mit spezifischen Primern wurden IL-2- und Adenovirus-DNA Fragmente als Marker für die
gentechnisch veränderten Melanomzellen aus den
verschiedenen Gewebeproben detektiert.
Die Untersuchungen an der Immunisierungsstelle zeigten, daß die verabreichten, aus gentechnisch veränderten Melanomzellen bestehenden Krebsvakzine nach der Injektion innerhalb weniger Tage eliminiert wurden. In der akuten Phase des Zellabbaus, 2 Tage nach der Immunisierung, wurde gezeigt, daß keine Übertragung der rekombinanten IL-2 DNA oder Adenovirus DNA auf das Blut, Körperorgane oder in die Keimzellen erfolgte.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt
Transfektionskomplexe, bestehend aus DNA, enthaltend eine oder mehrere für ein immunstimulierendes Polypeptid kodierende Sequenzen, einem DNA-bindenden Molekül, das vorzugsweise mit einem Internalisierungsfaktor für
Tumorzellen und/oder Fibroblasten konjugiert ist, insbesondere Polylysin, und einem endosomolytischen Konjugat aus einem DNA-bindenden Molekül und dem oben definierten Adenovirus oder einem Peptid, wobei das DNA- bindende Molekül c) und der DNA-bindende Anteil des Konjugats b) an die DNA gebunden sind.
Es wurde festgestellt, daß mit Hilfe der
erfindungsgemäßen Komplexe ein effizienter Gentransfer in primäre humane Melanomzellen und primäre humane
Fibroblasten möglich ist, daß transfizierte
Mausmelanomzellen bis zu 24.000 Einheiten IL-2 pro
1 x 106 Zellen pro 24 h produzierten, was mindestens 30 x mehr ist als die Werte, die mit anderen viralen (Lotze et al., 1992; Rosenberg et al., 1992) oder nicht- viralen (Fearon et al., 1990) Gentransfertechniken erhalten wurden, daß eine Bestrahlung von bis zu 100 Gy die Expression der transfizierten Genkonstrukte nicht vermindert. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde in einem Mausmodell die Wirkung eines Maus-Melanomvakzins gezeigt, das eine systemische Immunantwort in
immunisierten Mäusen induziert und die Tiere nach
Verabreichung von tumorigenen Dosen von Melanomzellen vor einer Entwicklung von Tumoren schützt. Ferner konnte im Tiermodell die Wirksamkeit eines Melanomvakzins gegen Metastasenbildung gezeigt werden. Das DNA-Molekül, definiert als Komponente ai), ist ein Plasmid, das eine für ein immunstimulierendes Polypeptid, beispielsweise ein Zytokin, kodierende Sequenz in exprimierbarer Form enthält. Unter "immunstimulierend" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch die die Immunantwort verstärkende Eigenschaft der sog. co- stimulierenden Moleküle ("co-stimulatory molecules"), wie B7 (Schwartz, 1992; Townsend und Allison, 1993) oder Adhäsionsmoleküle, z.B. HSAs ( "heat stable antigens", Kay et al., 1990) oder ICAM (Springer et al., 1987) verstanden; ferner zählen zu immunstimulierenden
Substanzen auch Fremdantigene (sog. "Neo-Antigene"), z.B. virale Antigene. Die für das immunstimulierende Polypeptid kodierende Sequenz steht in Verbindung mit regulatorischen Sequenzen, die eine möglichst hohe
Expression des immunmodulatorisehen Polypeptids in den Zielzellen ermöglichen. Vorzugsweise werden starke
Promotoren wie der CMV-Promotor (Boshart et al., 1985) oder der ß-Aktin-Promotor (Gunning et al., 1987)
verwendet. Das geeignete Konstrukt kann in Vorversuchen durch Vergleich der Expressionswerte ermittelt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die für Interleukin 2 (IL-2) kodierende Sequenz
verwendet.
Es können jedoch auch für andere Zytokine wie IL-4, IL-12, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF kodierende DNA-Sequenzen eingesetzt werden (Pardoll, 1992). Es können auch
Kombinationen von Zytokinsequenzen eingesetzt werden, um die immunstimulierende Wirkung zu verstärken, z.B. IL-2 + IFN-γ , IL-2 + IL-4, IL-2 + TNF-α oder TNF-α + IFN-γ.
Vorzugsweise liegen die für zwei verschiedene Zytokine kodierenden Sequenzen auf getrennten Plasmiden vor. Damit kann, wie z.B. in den erfindungsgemäß durchgeführten Experimenten anhand von IL-2 und IFN-γ gezeigt wurde, eine Feinabstufung der Zytokinexpression erhalten werden, indem die Mengenverhältnisse der beiden Plasmide variiert werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein DNA-Molekül eingesetzt, das eine oder mehrere für ein co- stimulatorisches Molekül kodierende Sequenz(en) enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das co- stimulatorische Molekül das Hitzestabile Antigen (Heat Stahle Antigen HSA). Eine die für HSA kodierende Sequenz enthaltende DNA kann sowohl allein als auch in
Kombination mit einer für ein Zytokin, vorzugsweise
IL-2, kodierenden DNA eingesetzt werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein DNA-Molekül eingesetzt, das eine oder mehrere für ein Neoantigen kodierende Sequenz(en) enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Neoantigen ein
Virusprotein oder ein Fragment davon, beispielsweise das Rabies-Glykoprotein. Eine die für das Virusprotein kodierende Sequenz enthaltende DNA kann sowohl allein als auch in Kombination mit einer für ein Zytokin,
vorzugsweise IL-2, kodierenden DNA eingesetzt werden.
Hinsichtlich der Größe des DNA-Konstrukts gibt es
praktisch keine Limitierung, das zur Anwendung kommende GentransferSystem hat sich für Konstrukte einer Größe von 48 kb als geeignet erwiesen (Cotten et al., 1992).
Gegebenenfalls liegt die für ein immunstimulierendes Polypeptid kodierende DNA, also die therapeutisch
wirksame DNA, in Mischung mit einem in aii) definierten DNA-Molekül vor, das als "Füll-DNA" dient. Die Sequenz dieser DNA ist nicht kritisch, sie muß - neben den
Anforderungen an die Reinheit, hinsichtlich derer sie der therapeutisch wirksamen DNA entsprechen muß - lediglich die Bedingung erfüllen, daß sie keine Sequenz enthält, die für ein in der Zelle funktioneil aktives Polypeptid kodiert. Die Größe dieser DNA ist ebenfalls nicht kritisch, im allgemeinen ist es zweckmäßig, daß sie im Bereich der Größenordnung des gentherapeutisch wirksamen DNA-Moleküls liegt bzw. kleiner ist als diese.
Diese Füll-DNA kann, ausgehend von einer konstanten DNA- Menge im Hinblick auf ein definiertes Verhältnis der übrigen Komplexpartner, verschieden große Anteile der therapeutisch wirksamen DNA ersetzen. Dies hat den
Vorteil, daß man die therapeutische DNA-Dosis und damit die in der Zelle exprimierte Zytokinmenge variieren kann, ohne die anderen Parameter verändern zu müssen, was im Rahmen eines standardisierten
Turmorvakzinherstellungsprozesses von großem Interesse ist. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, daß die Menge des in der Zelle exprimierten Gens proportional zum Anteil an Füll-DNA abnimmt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die verwendete Plasmid-DNA frei von Lipopolysacchariden. Es wurde überraschend festgestellt, daß die Expressionswerte beträchtlich erhöht sind, wenn die Plasmid-DNA weitestgehend frei ist von Lipopolysacchariden. Diese stellen eine häufige
Verunreinigung von Plasmid-DNA dar, die im allgemeinen in E.coli propagiert wird. Um eine Entfernung von
Lipopolysacchariden zu erzielen, kann entweder die DNA mit geeigneten Methoden gereinigt werden, z.B durch eine Kombination chromatographischer Methoden einschließlilch Polymyxin-Chromatographie, oder es können, um auch
Lipopolysaccharide zu erfassen, die gegebenenfalls aus dem Medium stammen, dem Transfektionsmedium Lipopolysaccharid-bindende Reagentien wie Polymyxin zugesetzt werden.
Wenn die Zielzelle Rezeptoren für das Adenovirus
aufweist, durch die eine Internalisierung in einem für die effiziente Expression der Fremd-DNA in der Zelle ausreichendem Maß gewährleistet, kann es im Fall der Verwendung von Adenoviruskonjugaten als Komponente b) genügen, als Komponente c) ein nicht mit einem weiteren Internalisierungsfaktor konjugiertes DNA-bindendes
Molekül einzusetzen; im allgemeinen handelt es sich dabei um dasselbe Molekül wie das im Konjugat b) enthaltene, vorzugsweise wird Polylysin verwendet. Für diese
Ausführungsform der Erfindung hat das Adenovirus selbst die Funktion des Internalisierungsfaktors, es ist in diesem Fall nicht erforderlich, die DNA-bindende Substanz mit einem weiteren Internalisierungsfaktor zu
konjugieren.
Die DNA ist in der Ausführungsform der Erfindung, in der c) eine nicht-konjugierte DNA-bindende Substanz ist, mit dem Konjugat b) komplexiert; die Komponente c) hat in diesem Fall in erster Linie die Funktion, eine
Kompaktierung und damit eine erleichterte Aufnahme der Komplexe in die Zelle zu bewirken (Wagner et al., 1991a). Für bestimmte Anwendungsfälle, z. B. bei Verwendung kleiner DNA-Moleküle, kann ein nicht-konjugiertes DNA- bindendes Molekül als Komponente c) gänzlich entfallen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die als Komponente c) definierte DNA-bindende Substanz mit einem Internalisierungsfaktor konjugiert. Diese
Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kommt vor allem dann zur Anwendung, wenn, im Fall der Verwenduung eines Adenoviruskonjugats, die Zielzelle keine oder nur wenige Rezeptoren für das Adenovirus aufweist, z.B. bei Verwendung eines Virus einer entfernten Spezies, oder wenn als endosomolytisches Konjugat b) ein Peptidkonjugat eingesetzt wird. In Gegenwart eines weiteren
Internalisierungsfaktor-Konjugats profitieren die Virus- Konjugate von der Internalisierungsfähigkeit des
Konjugats c), indem sie gemeinsam mit diesem an die Nukleinsäure komplexiert werden und als Bestandteil des so entstandenen Komplexes, im folgenden als
"Kombinations-Komplex" oder "ternärer Komplex"
bezeichnet, in die Zelle aufgenommen werden. Ohne auf diese Theorie festgelegt sein zu wollen, werden die
Kombinations-Komplexe von Zellen entweder durch Bindung an den für den Internalisierungsfaktor spezifischen
Oberflächenrezeptor oder durch Bindung an den
Virusrezeptor oder durch Bindung an beide Rezeptoren über den Weg der Rezeptor-vermittelten Endozytose aufgenommen. Bei der Freisetzung der Viren aus den Endosomen wird auch die in den Komplexen enthaltene DNA in das Zytoplasma freigesetzt und entkommt dadurch dem lysosomalen Abbau.
Die als c) bevorzugt enthaltenen Konjugate zwischen einem Internalisierungsfaktor und einer DNA-bindenden Substanz sind an sich bekannt.
Unter Internalisierungsfaktor sind im Rahmen der
vorliegenden Erfindung Liganden oder Fragmente davon zu verstehen, die nach Bindung an eine Tumorzelle oder einen Fibroblasten über Endozytose, vorzugsweise Rezeptorvermittelte Endozytose, internalisiert werden, oder
Faktoren, deren Bindung/Internalisierung über Fusion mit Zellmembranelementen erfolgt.
Beispiele für Internalisierungsfaktoren sind die Liganden Transferrin (Klausner et al., 1983), Asialoglykoproteine (wie Asialotransferrin, Asialorosomucoid oder
Asialofetuin), (Ashwell et al., 1982), Lectine (Goldstein et al., 1980; Sharon, 1987), bzw.
Substanzen, die Galaktose enthalten und über den
Asialoglykoproteinrezeptor internalisiert werden;
mannosylierte Glykoproteine (Stahl et al., 1978), lysosomale Enzyme (Sly et al., 1982), LDL (Goldstein et al., 1982), modifizierter LDL (Goldstein et al., 1979), Lipoproteine, die über Rezeptoren in die Zelle aufgenommen werden (apo B100/LDL); virale Proteine;
Antikörper (Mellman et al., 1984; Kuhn et al., 1982;
Abrahamson et al., 1981) bzw. Fragmente davon gegen Zelloberflächenantigene, z.B. anti-CD4, anti-CD7, anti-CD3; Zytokine wie Interleukin-1 (Mizel et al., 1987), Interleukin-2 (Smith et al., 1985), TNF
( Imamura et al., 1987), Interferone (Anderson et al., 1982); CSF ("Colony-stimulating Factor"), (Walker et al., 1987), Faktoren und Wachstumsfaktoren wie Insulin
(Marshall, 1985), EGF ("Epidermal Growth Factor"),
(Carpenter, 1984); PDGF ( "Platelet-Derived Growth
Factor"), (Heldin et al., 1982), TGFα (Massague et al., 1986) und TGFß ( "Transforming Growth Factors" α, ß), HGF (Hepatocyte Growth Factor (Nakamura et al., 1989), Nervenwachstumsfaktor (Hosang et al., 1987), Insulinähnlicher Wachstumsfaktor I ( "Insulin-like Growth
Factor"), (Schalch et al., 1986), LH, FSH (Ascoli et al., 1978), Wachstumshormon (Hizuka et al., 1981), Prolactin (Posner et al., 1982), Glucagon (Asada-Kubota et al., 1983), Thyroidhormone (Cheng et al., 1980), α-2-Makroglobulin-Protease (Kaplan et al., 1979). Weitere Beispiele sind Immunglobuline oder Fragmente davon als Liganden für den Fc-Rezeptor oder Anti-Immunglobulin- Antikörper, die an slgs ("Surface Immunoglobulins") binden. Die Liganden können natürlichen oder
synthetischen Ursprungs sein (siehe Trends Pharmacol. Sei., 1989, und die darin zitierten Referenzen). Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind als Internalisierungsfaktor Transferrin und EGF.
Geeignete DNA-bindende Substanzen als Komponente c) (nicht-konjugiert oder als Konjugatbestandteil eines Internalisierungsfaktorkonjugats) bzw. als Bestandteil des Konjugats b) sind z.B. homologe organische
Polykationen wie Polylysin, Polyarginin, Polyornithin oder heterologe Polykationen mit zwei oder mehr
unterschiedlichen positiv geladenen Aminosäuren, wobei diese Polykationen verschiedene Kettenlänge aufweisen können, ferner nicht-peptidische synthetische
Polykationen wie Polyethylenimin. Geeignete DNA-bindende Substanzen sind ferner natürliche DNA-bindende Proteine polykationischen Charakters wie Histone oder Protamine bzw. Analoge oder Fragmente davon, sowie Spermin oder Spermidine.
Die Länge des Polykations ist nicht kritisch, sofern die Komplexe im wesentlichen elektroneutral sind. Wenn die DNA aus 6.000 bp und 12.000 negativen Ladungen besteht, kann die Menge an Polykation pro Mol DNA z.B. sein:
60 Mol Polylysin 200 oder
30 Mol Polylysin 400 oder
120 Mol Polylysin 100, etc.
Der Durchschnittsfachmann kann mittels einfacher
Routineversuche andere Kombinationen von Polykationlänge und molarer Menge auswählen.
Bevorzugt wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung Polylysin eingesetzt, insbesondere mit einer Kettenlänge von ca. 200 bis 300 Lysinen.
Wenn zur Herstellung der Konjugate b) das DNA-bindende Molekül im Hinblick auf die Kopplung an das endosomolytische Mittel, insbesondere das Virus,
modifiziert wird, z.B. wenn Polylysin mit Streptavidin konjugiert wird, um an biotinyliertes Adenovirus gebunden zu werden, kann der Einfachheit halber das derart modifizierte DNA-bindende Molekül als Komponente c) eingesetzt werden. Das bedeutet in der Praxis, daß bei der Herstellung von Polylysin-Streptavidin/Biotin- Adenovirus-Konjugaten ein Überschuß an Polylysin- Streptavidin eingesetzt wird, der die Funktion der
Komponente c) übernimmt.
Die Internalisierungsfaktor-Polykation-Konjugate können auf chemischem oder, falls das Polykation ein Polypeptid ist, auf rekombinantem Weg hergestellt werden, bezüglich der Herstellungsmethoden wird auf die Offenbarung der EP 388 758 Bezug genommen.
Die Konjugate können auch nach der von Wagner et al., 1991b, beschriebenen Methode hergestellt werden, indem ein Glykoprotein, z.B. Transferrin, und das DNA-bindende Molekül, insbesondere Polylysin, über eine oder mehrere Kohlenhydratketten des Glykoproteins miteinander
verbunden werden.
Bevorzugt enthält ein Adenoviruskonjugat b) ein
Adenovirus mit einem Defekt in der E4-Region. Derartige Adenoviren wurden von Bridge und Ketner, 1989,
beschrieben. Die Funktion der in der komplexen E4-Region kodierten Proteine ist erst teilweise aufgeklärt. Bisher ist bekannt, daß die E4-Region, wie die E1b-Region, für den Übergang zwischen dem frühen und dem späten
Genexpressionsprogramm des Virus und für das Abschalten der Wirtsproteinsynthese wesentlich ist, ferner für die Virusreplikation und den Virionzusammenbau. Es gibt 24 E4-mRNAs, bisher wurden sieben offene Leserahmen identifiziert, wobei angenommen wird, daß ie Leserahmen 3 und 6 in erster Linie für den E4-Phänotyp
verantwortlich sein dürften. Eine sehr wichtige Funktion hat das Genprodukt des offenen Leserahmens ORF 6/7.
Dieses Protein bindet wahrscheinlich den zellulären Transkriptionsfaktor E2F, womit er zum hochspezifischen adenoviralen Transkriptionsfaktor wird. Es wurde
überraschend festgestellt, daß ein Adenovirus, das einen Defekt in der E4-Region hat, als Bestandteil eines
Gentransfersystems auf der Grundlage der Rezeptorvermittelten Endozytose, bei dem das Adenovirus die Funktion eines die Endosomen aufbrechenden Mittels hat, bei der Anwendung auf Tumorzellen geringe Toxizität bei gleichzeitig hoher Gentransporteffizienz aufweist.
Aus den von Bridge und Ketner beschriebenen Adenoviren wurde die Mutante d11014, die einen intakten ORF 4 besitzt, in der jedoch ORF 3 und ORF 6 sowie ORF 6/7 defekt sind, aufgrund ihrer Eigenschaft ausgewählt, daß sie in der Synthese viraler Proteine am stärksten beeinträchtigt ist. Da die Funktionen der in E4 kodierten Virusproteine noch nicht zur Gänze aufgeklärt sind, kann zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht definiert werden, in welchen Leserahmen die Mutationen gesetzt werden müssen, um den gewünschten Effekt zu erzielen. Weitere außer der Mutante d11014 geeignete Mutanten können empirisch ermittelt werden, indem E4-Mutanten, wie von Bridge und Ketner beschrieben, hergestellt und in standardisierten Transfektions- und Zytotoxizitätsexperimenten, wie sie in den Beispielen beschrieben sind, getestet werden. Für die orientierenden Transfektionstests kann zunächst statt des Zytokingens ein Reportergen verwendet werden. Mutanten, die vergleichbare Genexpressions- und Zytotoxizitätswerte bringen wie d11014 bzw. d11014 sogar überlegen sind, sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Bestandteile des Transfektionskomplexes geeignet, sofern sie ferner die Anforderung erfüllen, daß die Viren, wie z.B. d11014 in der Zellinie W162, in einer den E4-Defekt
komplementierenden Zellinie zu hohen Titern gezüchtet werden können.
Alternativ zum Adenovirus mit einem E4-Defekt kann auch ein Adenovirus mit einem Defekt in der E1a-Region eingesetzt werden, das zusätzlich zu dem Ela-Defekt einen oder mehrere weitere Gendefekte aufweist, der/die mit chemischen, chemisch/physikalischen oder genetischen Methoden gesetzt wurde(n).
Die mit Hilfe von chemischen oder physikalisch/chemischen Methoden gesetzten Defekte sind keine gezielten Defekte, sondern können über das ganze Virusgenom verstreut sein.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat sich u.a. eine Adenovirus-Mutante der Bezeichnung dl312 (Jones und Shenk, 1979), die mit 8-Methoxypsoralen/UV inaktiviert worden war, als für die Herstellung von Krebsvakzinen geeignet gezeigt.
Andere geeignete Ela-Mutanten können nach
literaturbekannten Methoden hergestellt, zusätzlich mit verschiedenen Inaktivierungsmethoden und/oder -dosen behandelt und, wie für E4-Mutanten beschrieben, ihre Eignung zur Herstellung von Tumorvakzinen als Bestandteil der Transfektionskomplexe getestet werden.
Alternativ zu 8-Methoxypsoralen können andere
Psoralenderivate eingesetzt werden, z.B. 4'-Aminomethyl- 4, 5', 8-trimethylpsoralen, von dem festgestellt wurde, daß es sich für die Inaktivierung von Adenoviren im Hinblick auf deren Anwendung für den Gentransfer eignet.
(Psoralenderivate haben die Fähigkeit, in die DNA interkalieren zu können und nach Bestrahlung mit UV von 365 nm kovalente Interstrang- und Intrastrang-Addukte mit der Virus-DNA zu bilden (Hanson, 1992). Diese Addukte inaktivieren die betroffenen Genabschnitte und blockieren dadurch die Genfunktionen, z.B. die Virustranskription und -replikation.) Es wurde festgestellt, daß einer Reduktion der Virusreplikation um mehr als 5 log
(bestimmt mittels CPE-Assay) und einer Reduktion der Virusreplikation um mehr als 7 log (bestimmt mittels Plaque-Assay) einer Reduktion der Gentransferverstärkung um nur eine halbe Zehnerpotenz gegenübersteht (Cotten et al., 1992).
Im Hinblick auf die bei der Herstellung von Arzneimitteln generell und bei der Herstellung von Tumorvakzinen im besonderen angestrebte größtmögliche
Standardisierbarkeit, die sich auf alle Komponenten bzw. Verfahrensparameter erstreckt, also auch auf die
eingesetzten Viren, wird vorteilhafterweise ein Virus eingesetzt, das möglichst nach einer standardisierbaren Methode inaktiviert wurde. Die Anforderung an die
Standardisierbarkeit wird vor allem von chemischen
Inaktivierungsmethoden erfüllt, die diesbezüglich den chemisch/physikalischen Methoden überlegen sind. Ein Beispiel für eine chemische Inaktivierungsmethode ist die Inaktivierung mit ß-Propiolacton (Morgeaux et al., 1993; De Shu et al., 1986; Budowsky und Zalesskaya, 1991).
Diese Methode hat den Vorteil, daß aufgrund der
Instabilität des Inaktivierungsmittels in wässerigen Lösungen eine Reinigung von nicht-reagiertem Reagens entfällt. Außerdem erfordert diese Inaktivierungsmethode keine UV-Behandlung, was im Hinblick auf
Standardisierbarkeit ebenfalls vorteilhaft ist. Es wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß die Behandlung von Adenovirus mit zwei Aliquots
0.3 % ß-Propiolacton während 4 h bei Raumtemperatur einen Abfall des Virustiters um 5 log hervorruft, was mit der mittels 8-Methoxypsoralen erzielten Inaktivierung vergleichbar ist. Die DNA-Transportaktivität wird bei mittleren Dosen von ß-Propiolacton (0.3 %) beibehalten, während die Behandlung mit 1 % ß-Propiolacton einen beträchtlichen Rückgang dieser Fähigkeit hervorruft. Die Analyse der Genexpression vom inaktivierten Virus zeigte, daß sowohl die Psoralenderivate als auch ß-Propiolacton die Virusgenexpression (E1a und E3) im selben Ausmaß blockieren. Der empfindlichere Plaque-Assay erwies jedoch, daß die Psoralenbehandlung das Virus um mehr als 7 log inaktiviert, wobei bei den höchsten Virusdosen keine Plaques beobachtet wurden. Im Gegensatz dazu rief ß-Propiolacton-Inaktivierung nur einen Abfall im
Virustiter um 5 log hervor, wobei bei höheren Virusdosen Plaques beobachtbar waren.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird somit ein Virus eingesetzt, das mittels ausschließlich chemischer Methoden inaktiviert ist, vorzugsweise mittels ß-Propiolacton.
Die Eignung einer Methode zur Inaktivierung von Viren im Hinblick deren Verwendung für den Gentransfer,
insbesondere für die erfindungsgemäßen Tumorvakzine, kann in Vorversuchen, wie sie in den Beispielen für die
Inaktivierung von Adenoviren mit 8-Methoxypsoralen/UV, 4'-Aminomethyl-4, 5', 8-trimethylpsoralen/UV und
ß-Propiolacton illustriert sind, ermittelt werden. Dabei wird z.B. die Effizienz der Virusinaktivierung durch Bestimmung des Virustiters und/oder mittels des
empfindlicheren Plaque-Assays bestimmt und darüberhinaus die Fähigkeit des Virus zur Verstärkung des Rezeptorvermittelten Gentransfers anhand eines Reportergens getestet. Um festzustellen, wo am Virusgenom die
Inaktivierungsmethode greift, d.h. welche Abschnitte zerstört werden, können mit DNA-Sonden
Hybridisierungsversuche durchgeführt werden, mit denen die Viren auf das Vorhandensein der entsprechenden
Transkripte untersucht werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden nach diesem Prinzip mehrere
Inaktivierungsmethoden daraufhin getestet, ob sie die Virusreplikations- und Transkriptionsfunktionen zu blockieren vermögen. Geeignet ist eine
Inaktivierungsmethode dann, wenn sie Adenoviruspartikel liefert, die die für die DNA-Transportfunktion nützliche endosomolytische Aktivität, die eine Funktion des
Viruskapsids ist, noch besitzen, während ihnen die
Fähigkeit zur Virusgenexpression oder Replikation, welche unerwünschte Veränderungen in der Zelle hervorrufen könnten, fehlt. Es wurde festgestellt, daß die Behandlung von Adenovirus mit 8-Methoxypsoralen oder mit
4'-Aminomethyl-4, 5',8-trimethylpsoralen, jeweils gefolgt von einer 25 minütigen UVA-Bestrahlung, ebenso wie die Behandlung mit 2 x 0.3 % ß-Propiolacton Viruspartikel liefert, die die Fähigkeit zur Verstärkung des
effizienten DNA-Transports beibehalten. Mittels CPE (Zytopathischer Endpunktassay) wurde festgestellt, daß die drei Behandlungsmethoden hinsichtlich der Abnahme des Virustiters vergleichbar sind. Sowohl nach Behandlung mit 8-Methoxypsoralen/UV als auch mit ß-Propiolacton war keine Transkription vom Virusgenom nachweisbar. Mittels des empfindlicheren Plaque-Assays wurde jedoch
festgestellt, daß ß-Propiolacton-behandelte Viren replizieren können, wenn ausreichende Mengen der
komplementierenden Zellinie vorhanden sind. Im Gegensatz dazu blockiert die Behandlung des Virus mit beiden
Psoralenderivaten die Virusreplikation komplett, sodaß mittels dieses Tests keine Plaques nachweisbar waren.
Die RNA-Analyse zum Nachweis der Genexpression wurde entweder mit einer Adenovirus 5 Ela-Sonde durchgeführt, die einen Teil des Ela-Gens erkennt, der im Adenovirus d1312 deletiert ist, oder eine Adenovirus 5 E3-Sonde, die einen Teil der E3-Region erkennt, die für das abundante E3 19K Glykoprotein kodiert (E1a dient als Kontrolle; ein RNA-Signal sollte beim Virus dl312 fehlen, jedoch bei d11014 nachweisbar sein, da dieses eine Wildtyp E1-Region besitzt). Von der Expression von E3 wird angenommen, daß sie eine wichtige Rolle bei der Immunantwort auf
transfizierte Zellen spielen könnte, da zumindest zwei der E3-Gene die Oberflächenexpression von MHC Klasse I- Molekülen und TNF-Rezeptor-Molekülen an- der Oberfläche der infizierten Zellen modulieren. Für die Anwendung des Virus dll014 in gentherapeutischen Anwendungen, bei denen immunogene Tumorzellen hergestellt werden, ist daher ein Defekt in der E3-Region erwünscht, da die Expression dieser Region in diesem Kontext mit der Immunantwort auf transfizierte Zellen interferieren könnte.
Das Polylysin-gekoppelte (oder ionisch gebundene) endosomolytische Mittel wird bevorzugt als Bestandteil eines ternären oder Kombinationskomplexes eingesetzt. Die Kopplung von Adenovirus an Polylysin kann auf
verschiedene Arten erfolgen:
Die Kopplung von Virus auf chemischem Weg kann in für die Kopplung von Peptiden an sich bekannter Weise erfolgen, wobei, falls erforderlich, die Einzelkomponenten vor der Kopplungsreaktion mit Linkersubstanzen versehen werden (diese Maßnahme ist dann erforderlich, wenn von
vornherein keine für die Kopplung geeignete funktionelle Gruppe, z.B. eine Mercapto- oder Alkoholgruppe, verfügbar ist). Bei den Linkersubstanzen handelt es sich um bifunktionelle Verbindungen, die zunächst mit
funktioneilen Gruppen der Einzelkomponenten zur Reaktion gebracht werden, worauf die Kopplung der modifizierten Einzelkomponenten durchgeführt wird. Eine mögliche Art der Kopplung des Virus an Polylysin erfolgt in ähnlicher Weise wie bei der Herstellung von Transferrin-Polylysinkonjugaten (Wagner et al., 1990) nach Modifizierung des defekten Adenovirus mittels eines heterobifunktionellen Reagens. Falls ein Virus geeignete Kohlenhydratketten aufweist, kann es mit der DNA- bindenden Substanz über eine oder mehrere
Kohlenhydratketten des Glykoproteins verbunden werden (Wagner et al., 1991b).
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung der Virus- Polylysin-Konjugate ist die enzymatische Kopplung des Virus an eine DNA-bindende Substanz, insbesondere ein Polyamin, durch eine Transglutaminase (Zatloukal et al., 1992).
Eine weitere Methode zur Herstellung der Adenovirus- Polylysin-Konjugate besteht darin, das Virus über eine Biotin-Protein-Brücke, vorzugsweise eine Biotin- Streptavidin Brücke, an das Polykation zu koppeln
(Wagner et al., 1992).
Gegebenenfalls kann die Bindung an Biotin auch über Avidin erfolgen.
Ferner ist es möglich, die Bindung zwischen Virus und Polylysin herzustellen, indem einerseits das Virus biotinyliert wird und andererseits ein anti-Biotin- Antikörper mit Polylysin konjugiert und die Bindung zwischen Virus und Polylysin über die Biotin/Antikörper- Bindung hergestellt wird, wobei handelsübliche
polyklonale oder monoklonale Antikörper gegen Biotin eingesetzt werden können.
Die Bindung zwischen dem Virus und Polylysin kann auch hergestellt werden, indem Polylysin mit einem Lectin gekoppelt wird, das Affinität zu einem Virus- Oberflächenglykoprotein hat, wobei die Bindung in einem solchen Konjugat über die Bindung zwischen dem Lectin und dem Glykoprotein erfolgt. Weist das Virus von sich aus keine geeigneten Kohlenhydratseitenketten auf, kann es entsprechend modifiziert werden.
Das Virus kann für den Fall, daß es auf seinen
Oberflächenproteinen Regionen aufweist, die sauer sind und daher an ein Polykation binden können, auch ionisch an das DNA-bindende Molekül gebunden sein.
Neben ausgewählten Adenovirusmutanten kann die
endosomolytische Komponente der in b) definierten
Konjugate auch ein Peptid sein, das kovalent oder mittels ionischer Bindung an ein DNA-bindendes Molekül gebunden ist. Bezüglich der Anforderungen, die an derartige
Peptide gestellt werden sowie deren Kopplung an das DNA- bindende Molekül wird auf die WO 93/07283 verwiesen.
Bevorzugt wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein synthetisches dimeres Influenza-Peptid, ionisch an
Polylysin gebunden, verwendet, mit dem hohe
Expressionswerte für IL-2 in Melanomzellen erzielt werden. Melanomzellen, die in Gegenwart dieses
Peptidkonjugats mittels Transferrin-Polylysin-Konjugaten mit IL-2-Plasmid-DNA transfiziert waren, erwiesen sich als Krebsvakzine mit prophylaktischer Schutzwirkung gegen Tumorbildung.
Bezüglich der Herstellung der Transfektionskomplexe ist die Reihenfolge der Schritte nicht kritisch, es kann zweckmäßig wie folgt vorgegangen werden:
Ausgehend von den DNA-Molekülen wird die DNA-bindende Substanz nach Art und Menge bestimmt, die die Komplexierung der DNA gewährleistet, die erhaltenen Komplexe sind vorzugsweise im wesentlichen
elektroneutral. Für die Komplexe, die das Virus-Konjugat und ein Internalisierungsfaktor-Konjugat enthalten, wird der Kationenanteil beider Konjugate hinsichtlich des Aspekts der Elektroneutralität in Betracht gezogen.
Bei der Bestimmung des molaren Verhältnisses der
Komponenten a), b) und c) ist zu berücksichtigen, daß Komplexierung der DNA stattfindet und gewährleistet ist, daß der gebildete Komplex an die Zelle gebunden, in die Zelle befördert und daß er aus den Endosomen freigesetzt wird.
Das jeweils gewählte Verhältnis Internalisierungsfaktor- Konjugat/DNA richtet sich vor allem nach der Größe der Polykationmoleküle sowie nach der Anzahl und Verteilung der positiv geladenen Gruppierungen, Kriterien, die auf Größe und Struktur der zu transportierenden DNA
abgestimmt werden, wobei auch das Viruskonjugat in
Rechnung zu stellen ist. Vorzugsweise beträgt das molare Verhältnis Internalisierungsfaktor:Polylysin ca. 10:1 bis ca. 1:10.
Im Falle der Verwendung von Adenovirus-Konjugat und nicht-konjugierter DNA-bindender Substanz kann nach der Bestimmung des für die Effizienz der Transfektion und der Expression optimalen Verhältnisses Konjugat:DNA mit Hilfe von Titrationen die Menge des Konjugat-Anteils bestimmt werden, der durch DNA-bindende Substanz ersetzbar ist.
Bevorzugt wird Polylysin sowohl als Komponente c), vorzugsweise konjugiert mit einem
Internalisierungsfaktor, als auch als Bestandteil des Adenvoviruskonjugats b) eingesetzt. Eine geeignere Methode zur Bestimmung des Verhältnisses der in den Komplexen enthaltenen Komponenten besteht darin, zuerst das in die Zelle zu importierende
Genkonstrukt zu definieren und, wie oben beschrieben, ein Virus zu finden, das für die Transfektion geeignet ist. Dann wird das Virus an das Polykation gebunden und mit dem Genkonstrukt komplexiert. Ausgehend von einer konstanten DNA-Menge wird durch Titrationen das optimale Verhältnis zwischen Virus-Konjugat und
Internalisierungsfaktor-Konjugat bzw. nicht-konjugierter DNA-bindender Substanz bestimmt.
Die Komplexe können hergestellt werden, indem die
Komponenten a), b) und c), die jeweils in Form verdünnter Lösungen vorliegen, gemischt werden.
Das optimale Verhältnis von DNA zu Konjugat und nicht- konjugierter DNA-bindender Substanz wird durch
Titrationen, d.h. in einer Reihe von
Transfektionsexperimenten mit konstanter DNA-Menge und variabler Menge an Konjugat/Polylysin, bestimmt. Das optimale Verhältnis von Konjugat: Polykation in der
Mischung kann mit Hilfe von Routineexperimenten bzw. aus dem Vergleich der optimalen Verhältnisse der in den
Titrationsexperimenten eingesetzten Mischungen erhalten werden.
Die Herstellung der DNA-Komplexe kann bei physiologischen Salzkonzentrationen erfolgen. Eine weitere Möglichkeit besteht im Einsatz hoher Salzkonzentrationen (etwa 2 M NaCl) und anschließender Einstellung auf physiologische Bedingungen durch langsames Verdünnen bzw. Dialyse.
Die jeweils am besten geeignete Reihenfolge für die
Mischung der Komponenten wird im einzelnen in
Vorversuchen bestimmt. Die Menge an eingesetztem endosomolytischen Konjugat richtet sich nach der im einzelnen vorgenommenen
Transfektion. Es ist zweckmäßig, die Mindestmenge an endosomolytischem Konjugat einzusetzen, die erforderlich ist, um die Internalisierung des Komplexes in einen
Großteil der Zellen und seine Freisetzung aus den
Endosomen zu gewährleisten. Im Falle der Verwendung von Adenovirus-Konjugat wird die Menge an Konjugat auf den jeweiligen Zeiltyp abgestimmt, dabei vor allem die
Infektiosität des Virus für diesen Zelltyp zu
berücksichtigen ist. Ein weiteres Kriterium ist das jeweilige Internalisierungsfaktor-Konjugat, insbesondere hinsichtlich des Internalisierungsfaktors, für den die Zielzelle eine definierte Anzahl von Rezeptoren aufweist. Außerdem richtet sich die Menge an endosomolytischem Konjugat nach der Menge der zu importierenden DNA. Für eine spezielle Anwendung wird in Vorversuchen mit den jeweils für die Transfektion vorgesehenen Zielzellen und dem für die Transfektion vorgesehenen Vektorsystem die optimale Konzentration an endosomolytischen Konjugat durch Titrieren ermittelt, wobei zweckmäßigerweise als DNA ein Genkonstrukt eingesetzt wird, das hinsichtlich der Größe mit dem für die konkrete Anwendung vorgesehenen weitgehend übereinstimmt und das zwecks einfacherer
Messung der Effizienz des Gentransfers ein Reportergen enthält. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde die Eignung des Luciferasegens als Reportergen für derartige Versuche gezeigt.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt die mit den erfindungsgemäßen Komplexen transfizierten
Tumorzellen bzw. Fibroblasten.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende
Erfindung Krebsvakzine, erhältlich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren. Diese Vakzine sind
pharmazeutische Zubereitungen, enthaltend die
transfizierten Tumorzellen oder die transfizierten
Fibroblasten in Mischung mit Tumorzellen in einer pharmazeutisch annehmbaren Formulierung.
Die gebrauchsfertigen Krebsvakzine liegen vorzugsweise als Suspension vor, die gegebenenfalls durch
Trypsinierung erhalten wird. Die Zellen befinden sich suspendiert in einem physiologischen Medium
(physiologischer Kochsalz- oder Pufferlösung), das gegebenenfalls diejenigen Nährstoffe, insbesondere
Aminosäuren, enthält, die die Zellen für die
Aufrechterhaltung ihres Metabolismus für die kurze Zeit zwischen Fertigstellung des Vakzins und dessen
Verabreichung benötigen.
In den Versuchen, die im Rahmen der vorliegenden
Erfindung durchgeführt wurden, befanden sich die
Melanomzellen in RPMI 1640 Medium mit einem Zusatz von fötalem Kälberserum (FCS).
Für die galenische Formulierung der erfindungsgemäßen Tumorvakzine wurden im Hinblick auf deren therapeutische Anwendung verschiedene Medien getestet.
Es zeigte sich, daß Zellkulturmedien mit Zusätzen wie Kälberserum, Humanserum, Humanserumalbumin und/oder Hydroxyethylcellulose die Lebensfähigkeit einer für das Vakzin ausreichenden Anzahl von Zellen gewährleisten. Im Hinblick auf eine möglichst gute Verträglichkeit befinden sich die Tumorvakzine zweckmäßig in Serum der Blutgruppe AB, als Medium kann auch autologes Serum verwendet werden. Gegebenenfalls enthält das Medium Zusätze von Wachstumsfaktoren oder Zytokinen wie IFN-gamma oder GM- CSF, um die Antigenpräsentation der Zellen günstig zu beeinflussen.
Der Typ von Krebsvakzinen, der mit Hilfe der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden kann, stellt eine neue Entwicklung auf dem Gebiet der Zytokintherapie dar. Sie hat den Vorteil, daß die schweren Nebenwirkungen
systemisch verabreichter Zytokine aufgrund der lokal beschränkten Produktion und Wirkung des Zytokins
vermieden werden können. Außer für die Behandlung von Melanomen und Colonkarzinomen können auch andere
Krebsarten mit Hilfe der erfindungsgemäßen Krebsvakzine behandelt werden, z.B. Nierenkrebs oder Brustkrebs.
Figurenübersicht
Fig. 1: Gentransport in primäre humane
Melanomzellkulturen
Fig. 2: Bestimmung der Liganden, die bei der Aufnahme von Gentransferkomplexen beteiligt sind.
Verwendung von nicht-konjugiertem Polylysin Fig. 3: Effekt der Inaktivierung von Adenoviren durch
Psoralen/UV auf die Genexpression in primären humanen Melanomzellen
Fig. 4: Bestimmung der Langzeitzytotoxizität von
Adenoviren
Fig. 5: Wirkung der Bestrahlung von Tumorzellen auf die
Expression transfizierter Gene
Fig. 6: Einfluß der Plasmidkonzentration auf die
Expression des Luciferase-Reportergens Fig. 7: Einfluß der Plasmidkonzentration auf die
Expression von IL-2 und/oder IFN-γ
Fig. 8: Verlust der Tumorigenizität transfizierter
Maus-Melanomzellen Fig. 9: Induktion einer systemischen Immunantwort gegen
Melanom in Mäusen durch Immunisierung mit zytokintransfizierten, bestrahlten Tumorzellen
Fig. 10: EGF als Ligand für den Gentransfer in Zellen einer humanen epidermoiden Karzinomzellinie (A: plus 2 % FCS, B: ohne FCS)
Fig. 11: IL-2 Expression in Maus-Melanomzellen unter
Verwendung verschiedener Vektoren
Fig. 12: IL-2 Expression in Fibroblasten unter
Verwendung verschiedener Vektoren
Fig. 13: Stimulierung einer Immunantwort durch
Melanomzellen, die auf ihrer Oberfläche HSA exprimieren
Fig. 14 Stimulierung einer Immunantwort durch
Melanomzellen, die auf ihrer Oberfläche das
Rabies-Glykoprotein exprimieren
Fig. 15: Titration von 8-Methoxypsoralen
Fig. 16: Titration von 4'-Aminomethyl-4, 5', 8- trimethylpsoralen
Fig. 17: Titration von ß-Propiolacton
Fig. 18: Gentransportaktivität von Adenovirus d11014
nach Behandlung mit 8-Methoxypsoralen oder nach
Behandlung mit niedrigen Konzentrationen von ß-
Propiolacton
Fig. 19: Plaque-Assays von Adenovirus d11014,
inaktiviert mit 8-Methoxypsoralen, ß-
Propiolacton oder 4'-Aminomethyl-4, 5', 8- trimethylpsoralen
Fig. 20: Plaque-Assays von Adenovirus d10014,
inaktiviert mit 8-Methoxypsoralen oder verschiedenen ß-Propiolacton-Behandlungen
Fig. 21 Genexpression vom inaktivierten Virus
Fig. 22 Reverse Transkriptions-PCR-Analyse
Fig. 23 Lokalisierung der Einlagerung von 8-
Methoxypsoralen im Virusgenom Fig. 24: Wachstum humaner Melanomzellen in Abhängigkeit von der gamma-Strahlendosis
Fig. 25: Schutzwirkung gegen Metastasenbildung durch
Immunisierung mit zytokintransfizierten
Melanomzellen (Transfektion mittels Adenovirus) Fig. 26: Wirksamkeit der Krebsvakzine in Abhängikeit von der Zytokindosis
Fig. 27: Schutzwirkung gegen Metastasenbildung durch
Immunisierung mit zytokintransfizierten
Melanomzellen (Transfektion mittels
endosomolytischem Peptid)
Fig. 28: Interleukin-2-Exression in humanen
Melanomzellen
Fig. 29: Einfluß des Endotoxingehaltes der DNA auf die
Expression von IL-2 in humanen Melanomzellen
In den folgenden Beispielen, die die vorliegende
Erfindung illustrieren, wurden, sofern nicht anders angegeben, die folgenden Materialien und Methoden verwendet: a) Plasmid-Konstrukte i) DNA-Plasmid-Konstrukte, enthaltend die für humanes oder Maus-IL-2 kodierende Sequenz
Für die in den Beispielen 6 bis 8 durchgeführten Versuche wurde das von Karasuyama et al., 1989, beschriebene
Plasmid BCMGneo-mIL-2 verwendet.
Alternativ wurde ein Plasmid der Bezeichnung pWS2m hergestellt, das das Maus-IL-2-Gen unter Kontrolle des Zytomegalovirus Enhancer/Promotors enthält: Das Plasmid pHßAPr-1 (Gunning et al., 1987) wurde mit BamHI und EcoRI geschnitten. Mittels Agarosegel-Reinigung wurde ein 2.5 kb Fragment isoliert, das das Ampicillin- Restistenzgen und den Replikationsursprung von pBR322 sowie das SV40-Polyadenylsierungssignal enthält. Dieses Fragment wurde mit dem CMV-Promotor/Enhancer ligiert, das als ein 0.7 kb PCR-Fragment vom Vektor pAD-CMVI
(beschrieben in der EP-A 393 438) amplifiziert und
EcoRI/BamHI verdaut worden war. Das erhaltene Plasmid wurde pWS genannt. Die für Maus-IL-2 kodierende cDNA wurde als PCR-Fragment vom Plasmid BMGneo-mIL-2
(Karasuyama und Melchers, 1988) erhalten. In Richtung des 5' Endes vom ersten ATG Codon wurde die Sequenz GCCGCC zwecks optimaler Translationsinitiation angehängt. Die 3'-nicht-kodierende Region wurde entfernt. Das PCR- Fragment wurde in den mittels Sall/BamHI-Verdau
geöffneten Vektor pWS ligiert.
Für die Anwendung in Humanzellen wird der Vektor pWS2 eingesetzt, der in ähnlicher Weise wie der Vektor pWS2m erhalten wird, mit dem Unterschied, daß als Vorlage für die PCR-Amplifikation statt dem Plasmid BMGneo-mIL-2 das Plasmid pIL2-50A (Taniguchi et al., 1983), der die für humanes IL-2 kodierende cDNA enthält, dient.
Als Alternative zu einem Plasmid mit dem Ampicillin- Resistenzgen wurde der Vektor pGShIL-2tet hergestellt, das das Tetracyclin-Resistenzgen, herausgeschnitten aus pBR327, enthält.
Für das Plasmid pCM2 wurde die Maus-IL-2 Sequenz zusammen mit den 5'- und 3' flankierenden Regionen ( Spalt- und Poly(A)-Signale vom Kaninchen-ß-Globingen) als
Sall/BamHI-Fragment aus BCMGneo-mIL-2 herausgeschnitten und in den Vektor pAD-CMVI eingesetzt. ii) DNA-Plasmid-Konstrukt, enthaltend die für Maus-IFN-γ kodierende Sequenz Es wurde das von Gray und Goeddel, 1983, beschriebene Plasmid pSVEmuIFN-γ verwendet. iii) DNA-Plasmid-Konstrukt pHSA, enthaltend die für HSA kodierende Sequenz
Das Plasmid pHSA, das die vom CMV-Promotor getriebene HSA-Sequenz enthält, wurde erhalten, indem die HSA-cDNA (Kay et al., 1990) in die BstXI-Stelle des Plasmids pCDM8 (Seed, 1987) kloniert wurde. iv) DNA-Plasmid-Konstrukt pWS-RABIES, enthaltend die für das Rabies-Glykoprotein kodierende Sequenz
Die für das Rabies-Glykoprotein kodierende Sequenz wurde aus dem Vektor pKSV-10 (Pharmacia), der die Rabies- Glykoprotein cDNA (Anilionis et al., 1982) in die Bgl II- Stelle abwärts vom SV40-Promotor hineinkloniert enthält, als Bgl II-Fragment isoliert. Der Vektor pWS2m wurde mit Bgl II und BamHI geschnitten. Das die murine IL-2 cDNA tragende Fragment wurde über Agarosegel-Elektrophorese abgetrennt und das dem Vektor pWS entsprechende Fragment isoliert und mit dem Rabies-Fragment ligiert. Die richtige Rabies-Orientierung wurde durch Sequenzierung bestätigt. Die Rabies-Glykoprotein-Sequenz ist als
SEQ ID N0:1 dargestellt. v) DNA-Plasmid-Konstrukt pWS-Gm, enthaltend die für murinen GM-CSF kodierende Sequenz
Der in i) beschriebene Vektor pWS2 wurde mit Sall und BamHI geschnitten und das dadurch freigesetzte, für IL-2 kodierende Fragment durch Agarosegelelektrophorese abgetrennt. Die für murinen GM-CSF kodierende DNA wurde vollsynthetisch aus 12 sich gegenseitig überlappenden Oligonukleotiden hergestellt. Die verwendete Sequenz entsprach der von Miyatake et al., 1985, beschriebenen Sequenz (kodierender Bereich von Position 32 bis Position 457), mit dem Unterschied von stillen Austauschen in Position 178 (A statt G), Position 274 (C statt G) und Position 355 (C statt G). Außerdem wurde das Triplet AGC (Position 446 bis 448) durch GTC ersetzt. Der 5 ' -Bereich wurde mit einem Sall-kompatiblen, der 3'-Bereich mit einem BamHI-kompatiblen Überhang versehen. Das 5 ' -Ende wurde analog zur IL-2-Sequenz in pWS2 mit einer GCCGCC- Sequenz versehen. Das synthetische GM-CSF-Gen wurde nach dem "Shot-gun"-Verfahren (Sambrook, 1989) in den Vektor pWS2 einkloniert und sequenziert. Die mittels
Sequenzanalyse aufgezeigten Fehler in der Sequenz wurden durch gezielte Mutagenese nach der Phosphorothioat- Methode (Amersham-Kit) korrigiert. vi) DNA-Plasmid-Konstrukt pGShIL-2tet, enthaltend die für humanes IL-2 kodierende Sequenz
Eine IL-2-Kassette, enthaltend den CMV-Enhancer/Promotor, die für IL-2 kodierende Sequenz und die SV40-PolyA- Sequenz, wurde mittels PCR unter Vorlage des in i) beschriebenen Vektors pWS2 erhalten. Das PCR-Produkt wurde einem Restriktionsenzymverdau mit EcoRI unterworfen und in die EcoRI/Smal-Stelle des Plasmids pUC19
(Pharmacia) hineinkloniert. Das erhaltene Plasmid wurde pGShIL-2 genannt. Als Quelle für das Tetracyclin- Resistenz-Gen und Teile der "upstream" Region des ß- Lactanase-Gens (Ampicillin-Resistenz-Gen) diente das Plasmid pBR327 (Soberon et al., 1980), das mit Sspl und Aval verdaut worden war. Zusammen mit einem EcoRI/Aval- Adaptor wurde die isolierte tet-Sequenz in die
EcoRI/SspI-Stelle von pGShIL-2 kloniert. Die IL-2- Kassette des resultierenden Klons pGShIL-2tet/amp wurde sequenziert; daraufhin wurde die amp-Sequenz mit Eamll05I und Sspl herausgeschnitten und das Plasmid religiert. Das erhaltene Plasmid wurde mit pGShIL-2tet bezeichnet. vii) Reporterplasmid-Konstrukt pCMVL
Das Plasmid pCMV wurde hergestellt, indem das BamHI- Insert des Plasmids pSTCX556 (Severne et al., 1988) entfernt, das Plasmid mit Klenow-Fragment behandelt und das HindiII/Sspl sowie Klenow-behandelte Fragment aus dem Plasmid pRSVL (enthaltend das Photinus pyralis
Luciferasegen unter der Kontrolle des Rous Sarcoma Virus LTR Enhancer/Promoters (Uchida et al., 1977,
De Wet et al., 1987) eingesetzt wurde. Das Reporter- Plasmid wurde pCMVL bezeichnet. b) Herstellung von Transferrin-Polylysin-Konjugaten
Zur Synthese von Konjugaten aus Transferrin und Polylysin mit einer Kettenlänge von 290 Lysinresten wurde die
Wagner et al., 1991b, beschriebene Methode eingesetzt. c) Herstellung von EGF-Polylysin-Konjugaten
1 mg EGF (Epidermal Growth Factor, Sigma, St. Louis, Cat. No. E-4127) wurde durch Gelfiltration (Sephadex G-10) mit HBS als Elutionspuffer gereinigt.
135 nmol (0.8 mg) Epidermal Growth Factor (EGF) in
1.5 ml HBS wurden mit einer 15 mM ethanolischer Lösung von SPDP (1.2 μmol ) behandelt. Nach 2 h bei
Raumtemperatur wurde das modifizierte Protein über eine Sephadex G-10 Säule gelfiltriert, wobei 70 nmol EGF, modifiziert mit 50 nmol Dithiopyridinlinker, erhalten wurde. Das modifizierte Protein wurde mit 3- Mercaptopropionat-modifiziertem Polylysin (50 nmol, durchschnittliche Kettenlänge 290 Lysinmonomere,
modifiziert mit 150 nmol Mercaptopropionat-Linker) in insgesamt 1 ml HBS unter Argonatmosphäre reagieren gelassen. Konjugate wurden mittels
Gelpermeationschromatographie auf einer Superdex 75 Säule (Pharmacia) isoliert (Puffer: 0.5 M Natriumchlorid). Die Produktfraktion enthielt ein Konjugat, bestehend aus 20 nmol Streptavidin und 25 nmol Polylysin. d) Herstellung von Streptavidin-Polylysin-Konjugaten
Die Kopplung von Streptavidin mit Polylysin wurde nach der von Wagner et al., 1990, und in der EP-AI 388 758 für die Herstellung von Transferrin-Polylysin-Konjugaten beschriebenen Methode durchgeführt.
79 nmol (4.7 mg) Streptavidin in 1 ml 200 mM HEPES pH 7.9 und 300 mM NaCl wurden mit einer 15 mM
ethanolischen Lösung von SPDP (236 nmol) behandelt. Nach 1.5 h bei Raumtemperatur wurde das modifizierte Protein über eine Sephadex G-25 Säule gelfiltriert, wobei 75 nmol Streptavidin, modifiziert mit 196 nmol
Dithiopyridinlinker, erhalten wurde. Das modifizierte Protein wurde mit 3-Mercaptopropionat-modifiziertem
Polylysin (75 nmol, durchschnittliche Kettenlänge
290 Lysinmonomere, modifiziert mit 190 nmol
Mercaptopropionat-Linker) in 2.6 ml 100 mM HEPES
pH 7.9, 150 mM NaCl unter Argonatmosphäre reagieren gelassen. Konjugate wurden mittels
Kationenaustauschchromatographie auf einer Mono S HR5- Säule (Pharmacia) isoliert. (Gradient: 20 - 100 % Puffer. Puffer A: 50 mM HEPES pH 7.9; Puffer B: Puffer A plus 3 M Natriumchlorid. Die Produktfraktion eluierte bei einer Salzkonzentration zwischen 1.2 M und 1.7 M. Dialyse gegen HBS (20 mM HEPES pH 7.3, 150 mM NaCl) ergab ein Konjugat, bestehend aus 45 nmol Streptavidin und 53 nmol Polylysin. e) Herstellung von biotinyliertem, inaktiviertem
Adenovirus i) Adenovirus d1312-Präparationen
Es wurde der von Jones und Shenk, 1979, beschriebene Adenovirus-Stamm d1312, der eine Deletion in der Ela- Region aufweist, verwendet. Die Vermehrung des Virus wurde in der Ela-trans-komplementierenden Zellinie 293 durchgeführt, wobei die Herstellung in großem Maßstab durchgeführt wurde, wie von Davidson und Hasseil, 1987, beschrieben. Das gereinigte Virus wurde in Lagerpuffer (100 mM Tris, pH 8.0, 100 mM NaCl, 0.1 % BSA, 50 %
Glyzerin) oder in HBS/40 % Glyzerin aufgenommen und Aliquots bei -70º C aufbewahrt. Die Bestimmung der
Virion-Konzentration wurde mittels UV- spektrophotometrischer Analyse der extrahierten
genomischen Virus-DNA durchgeführt (Formel: eine
optische Dichteeinheit (OD, A260) entspricht 1012
Viruspartikeln/ml; (Chardonnet und Dales, 1970)). ii) Adenovirus d11014-Präparation
Das Adenovirus d11014, beschrieben von Bridge und Ketner, 1989, wurde in der Zellinie W162, die von der Zellinie Vero (ATCC No. CCL81 ) abgeleitet ist und deren
Herstellung von Weinberg und Ketner, 1983, beschrieben wurde, propagiert. Die Herstellung in größerem Maßstab, Reinigung und Virionkonzentrationsbestimmung wurden durchgeführt, wie für d1312 beschrieben. iii) Biotinylierung von Adenovirus
2.4 ml einer gelfiltrierten (Sephadex G-25 PD10,
Pharmacia) Lösung von Adenovirus d1312 (ca. 10H
Partikel) in 150 mM NaCl / 5 mM HEPES, pH 7.9 / 10 % Glycerin, wurde mit 10 μl (10 nmol) einer 1 mM Lösung von NHS-LC-Biotin (Pierce 21335) versetzt. Nach 3 h bei Raumtemperatur wurde der Biotin-modifizierte Virus durch Gelfiltration (wie oben) vom überschüssigen Reagens abgetrennt. Die Lösung wurde durch Zugabe von Glycerin auf eine Glycerinkonzentration von 40 % gebracht
(Gesamtvolumen 3.2 ml) und bei -25ºC gelagert.
Die Biotinylierung des Virus konnte in einem qualitativem Nachweis nach Tropfen von verschiedenen Verdünnungen auf Cellulose-Nitrat Membran nachgewiesen werden: nach
Trocknen bei 80ºC / 2 h im Vakuumtrockenschrank, Blocken mit BSA, Inkubieren mit Streptavidin-konjugierter
Alkalischer Phosphatase (BRL), Waschen und 1 h Inkubation mit der Entwicklungslösung NBT/X-Phosphat (Nitroblau- Tetrazolium Salz/5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat,
Toluidin-Salz; Boehringer Mannheim) wurde eine positive Farbreaktion gefunden.
Bei der Biotinylierung von Adenovirus d11014 wurde von 15 ml Adenoviruspräparation (1.2 x 1012 Partikel pro ml) ausgegangen, die mit 150 μl, 1 mM NHS-LC-Biotin behandelt wurden. Nach 3 h bei Raumtemperatur wurde gegen 1 1 HBS plus 40 % Glyzerin bei 4ºC über Nacht dialysiert, dann wurde der Puffer durch frischen ersetzt und eine zweite Dialyse durchgeführt. Es wurde eine Viruspräparation mit einem Titer von ca. 1.2 x 1012 Partikeln pro ml erhalten. iv) Inaktivierung von biotinyliertem Adenovirus mit 8-Methoxypsoralen
Je 200 μl biotinylierte Viruspräparation wurden in zwei Vertiefungen einer 1.6 cm Gewebskulturplatte gegeben. Zu jeder Probe wurden 2 μl (33 mg/ml) 8-Methoxypsoralen (Sigma, Katalog Nr. M-3501, gelöst in DMSO ) gegeben, die Schale auf Eis gestellt und 10 min lang mit einer UV- Lampe (365 nm; UVP TL-33 Lampe) bestrahlt, wobei der Abstand der Probe vom Filter 4 cm betrug. Nach der
Bestrahlung wurden die zwei Proben vereinigt und
gelfiltriert (G50, Nick-Säule, Pharmacia), wobei die Säule mit 40 % Glycerin in HBS vorequilibriert worden war.
Die Inaktivierung von biotinyliertem Adenovirus d11014 wurde durchgeführt, indem 4 ml Viruspräparation
(1 x 1012 Viruspartikel) mit 40 μl 8-Methoxypsoralen (33 μg/μl, in DMSO) versetzt wurden. Die Proben wurden eine Stunde lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und in 12 x 300 μl Kulturschalen gegeben, auf Eis gestellt und 25 min lang, wie oben beschrieben, UV-bestrahlt.
Anschließend wurde eine Gelfiltration (in zwei Portionen) über eine G-25 PD10 Säule, mit HBS/40 % Glyzerin, durchgeführt. Es wurden 4.5 ml Viruspräparation mit einem Titer von 9.4 x 1011 Partikel pro ml erhalten. f) Herstellung von Transfektionskomplexen
Die ternären Komplexe wurden in drei Schritten
hergestellt. Im ersten Schritt wurde biotinyliertes
Adenovirus in 100 μl HBS mit streptavidinyliertem
Polylysin (StreptpL) in 100 μl HBS gemischt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Daraufhin wurden 6 μg
Plasmid-DNA in 150 μl HBS beigegeben, gut gemischt und weitere 30 min inkubiert. Abschließend wurde Polylysinmodifizimrtes humanes Transferrin (TfpL) in 150 μl HBS beigegeben, gründlich gemischt und 30 min inkubiert. (Die Mengen für Adenovirus, StreptpL und TfpL werden jeweils bei den einzelnen Beispielen angegeben.) Das Verhältnis zwischen Plasmid DNA und Polylysin-Konjugaten wurde im Hinblick auf Elektroneutralität in den endgültigen
Komplexen berechnet. Für die Transfektionen wurden die Komplexe auf die Zellen in einem Gesamtvolumen von 2 ml Kulturmedium ohne FCS aufgebracht. Nach 4 h Inkubation bei 37ºC wurde das Medium entfernt und frisches, Serum enthaltendes Kulturmedium beigegeben. g) Zellen und Kulturmedien i) Maus-Melanomzellen
Die Maus-Melanomzellinie Cloudman S91 (Klon M3 ) wurde von ATCC (No. CCL 53.1) erworben. Die Zellen wurden in 6 cm Plastikschalen oder T25 Kulturflaschen, beschichtet mit 0.1 % Gelatine, in Ham's F10 Medium, enthaltend 12.5 % Pferdeserum, 2.5 % FCS, 2 mM Glutamin und Antibiotika, gezüchtet. ii) Mausfibroblasten
Primäre Mausfibroblasten wurden wie folgt aus DBA/2 Mäusen isoliert: 4 Wochen alte DBA/2 Mäuse wurden durch zervikale Dislokation getötet und in 70 % Ethanol getaucht. Die Muskeln wurden unter sterilen Bedingungen von den hinteren Gliedmaßen entfernt und mit PBS
gewaschen. Die Proben wurden in Stücke kleiner als 2 mm zerteilt und überschüssiges PBS entfernt. Dann wurden die Gewebsfragmente 3 x mit 5 ml PBS, enthaltend 0.25 % Trypsin (aus Schweinepankreas, Sigma, Katalog Nr.
T-2904), 0.1 % Collagenase (Typ XI, Sigma, Katalog
Nr. C-9407), 0.1 % BSA (Fraktion V, Boehringer Mannheim, Katalog Nr. 735 094), gewaschen und 30 min unter
Schwenken bei 37ºC inkubiert. Daraufhin wurden die
Gewebsfragmente 5 min lang absetzen gelassen, und der Überstand, der die freigesetzten Zellen enthielt, wurde mit 5 ml DMEM, enthaltend 20 % FCS, vermischt. Das nicht- dissoziierte Material wurde weitere 30 min lang verdaut und der Überstand, wie oben beschrieben, gesammelt.
Dieser Vorgang wurde wiederholt, bis das gesamte Material dissoziiert war. Die vereinigten Überstände wurden 15 min bei 500 x g zentrifugiert, das Zellpellet in DMEM, enthaltend 20 % FCS, resuspendiert und die Zeilen in Kulturflaschen ausgesät. Nach 30 min wurden die nicht adhäsierten Zellen abgesaugt und frisches Medium
zugegeben. iii) Humane Melanomzellen
Primäre humane Melanomzellen wurden aus chirurgisch entfernten Melanomen isoliert. Die Tumore wurden
mechanisch (mit Pinzette und chirurgischem Messer) in Gegenwart von RPMI 1640 Kulturmedium, enthaltend 5 % FCS,
2 mM Glutamin und Antibiotika, in kleine Fragmente zerteilt. Dann wurden die Gewebsfragmente vorsichtig mit dem Kolben einer Spritze durch ein Metallsieb gedrückt. Daraufhin wurde das Material mehrere Male durch
Zentrifugation und Resuspension gewaschen, und die freigesetzten Zellen wurden in T25 Kulturflaschen ausgesät. iv) Humanfibroblasten
Nach der chirurgischen Entfernung wurden Hautbiopsien in 4ºC DMEM, enthaltend 10 % FCS, 2 mM Glutamin und
Antibiotika (Penicillin/Streptamycin oder, im Fall von Humanfibroblasten, Gentamycin), gegeben. Die Biopsien wurden in einer Gewebekultureinrichtung ausgiebig mit Pinzette und chirurgischem Messer im laminaren Luftstrom in sterilen 6 cm Plastikschalen zerkleinert. Dann wurden
3 ml DMEM, enthaltend 20 % FCS, 2 mM Glutamin und
Antibiotika beigegeben, und die Kultur in einen 37ºC Brutschrank gegeben. Nach 10 Tagen wurde das Medium durch DMEM, enthaltend 10 % FCS, ausgetauscht. Dann wurde das Medium weiter 2 x wöchentlich gewechselt. 4 Wochen nach Beginn der Kultur wurden die Zellen, die aus den Gewebsfragmenten herausgewachsen waren, trypsinisiert und für die Transfektion in neue Kulturschalen ausplattiert.
Eine alternative, bevorzugte Methode bestand darin, die Hautstücke nach der Zerkleinerung in frisches Medium zu überführen und nach Bedarf 1 bis 2 x mit Medium zu waschen. 5 bis 10 Gewebestücke wurden in eine T25- Gewebekulturflasche, deren Oberfläche mit DMEM plus 10 % FCS benetzt worden war, gegeben und gleichmäßig verteilt, worauf die Flasche umgedreht wurde. Dies bewirkte, daß die Biopsien herunterhängen ("hanging drop
configuration"; diese Methode wurde von Jones, 1989, beschrieben). Nach 1 bis 3 h im Brutschrank wurden die Flaschen wieder umgedreht und mit 1 bis 2 ml Medium befüllt. Festsitzende Biopsien wurden nach 24 h auf 5 ml aufgefüllt; andernfalls wurde der Vorgang wiederholt. Nach 6 bis 10 Tagen wuchsen die ersten Fibroblasten aus, von diesem Zeitpunkt an wurde einmal wöchentlich das Medium gewechselt. Sobald die Zellen konfluent waren, wurden sie in eine T75-Flasche passagiert. v) KB-Zellen
Die humane epidermoide Karzinomzellinie KB wurde von ATCC (No. CCL 17) erworben. Die Zellen wurden in 6 cm
Plastikschalen in MEM, 10 % FCS, 2 mM Glutamin und
Antibiotika, gezüchtet. h) Bestimmung der Genexpression i) Luciferase-Assay
Die Herstellung von Zellextrakten, die Standardisierung des Proteingehalts sowie die Bestimmung der
Luciferaseaktivität wurden durchgeführt, wie von Zenke et al., 1990, Cotten et al., 1990, bzw. in der EP 388 758 beschrieben. ii) IL-2 Assay
Die Expression von Interleukin-2 wurde mit Hilfe eines Bioassays bestimmt, wie von Karasuyama und Melchers, 1988, beschrieben. Zusätzlich wurde die IL-2 Produktion unter Verwendung des IL-2 ELISA-Kits von Becton Dickinson (Katalog Nr. 30032) nach Vorschrift des Herstellers durchgeführt. iii) IFN-γ-Assay
Die Expression von Maus-IFN-γ wurde unter Verwendung des IFN-γ ELISA "Intertest-γ" (Genzyme, Katalog Nr. 1557-00) durchgeführt. iv) GM-CSF-Assay
Die Expressionswerte für GM-CSF wurden mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen ELISAs (Endogen) bestimmt. j) Testung von Komplex-Komponenten
Um die Aussagekraft von Experimenten hinsichtlich
Internalisierungsfähigkeit von Liganden oder Effizienz von DNA-Konstrukten zu testen, wurden in Vorversuchen Transfektionsversuche mit verschiedenen
Viruspräparationen durchgeführt. Diese Versuche haben gezeigt, daß die diesbezüglich mit d1312 erhaltenen Ergebnisse auf Psoralen/UV-inaktiviertes Adenovirus d1312 und auf (Psoralen/UV-inaktiviertes) Adenovirus d11014 übertragen werden können. In einigen Versuchen wurde daher stellvertretend d1312 verwendet. Beispiel 1
Gentransport in primäre humane Melanomzellkulturen
Primäre humane Melanomzell-Isolate, die von zwei
verschiedenen Patienten erhalten worden waren (HMM-1 und HMM-2), wurden nach verschiedenen Zeitintervallen ab Kulturbeginn mit Komplexen transfiziert, die folgende Komponenten enthielten: 1.7 x 1010 Adenoviruspartikel d1312, 100 ng StreptpL, 6 μg pCMVL-DNA, 7 μg TfpL. 24 h nach der Transfektion wurde die Luciferaseexpression bestimmt. Die Expression wurde auf der Grundlage des Proteingehalts der Zellysate auf 1 x 106 Zellen
standardisiert. Das Ergebnis dieser Transfektionsversuche ist in Fig. 1 dargestellt.
Beispiel 2
Bestimmung der Liganden, die bei der Aufnahme von
Gentransferkomplexen beteiligt sind
Primäre humane Melanomzell-Isolate der Bezeichnung HMM-1 wurden mit 1.7 x 1010 Adenoviruspartikeln d1312,
100 ng StreptpL, 6 μg pCMVL-DNA, 7 μg TfpL, 2 Wochen nach Beginn der Kultur transfiziert. Parallel dazu wurde die Transfektion in Gegenwart eines 50 molaren Überschusses von freiem, eisenbeladenem Transferrin als Konkurrent um die Internalisierung der TfpL-DNA-Adenovirus-Komplexe durchgeführt. Als Alternative wurden
Transfektionskomplexe hergestellt, in denen das TfpL durch nicht konjugiertes pL ersetzt wurde (pL). Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 2 dargestellt. Es zeigte sich, daß der Zusatz von freiem Transferrin die Menge der Luciferaseexpression verringert, was darauf hindeutet, daß die Komplexe einerseits, zumindest teilweise, durch Bindung an den Transferrinrezeptor aufgenommen werden. Andererseits deutet jedoch die noch immer beträchtliche Genexpression, die in Gegenwart von freiem Transferrin gesehen wird, darauf hin, daß auch die Bindung an die Adenovirusrezeptoren einen größeren
Beitrag leistet.
Beispiel 3
Einfluß der Inaktivierung von Adenovirus d1312 mit
Psoralen/UV auf die Langzeit-Toxizität in transfizierten primären Humanmelanomzellen
3 x 105 HMM-1 primäre humane Melanomzellen pro 6 cm Petrischale wurden mit Komplexen transfiziert, die bestanden aus 1.2 x 1010 Adenoviruspartikeln d1312, 1.200 ng StreptpL, 6 μg pCMVL und 6.6 μg TfpL oder
7.5 x 109 8-Methoxypsoralen/UV-inaktivierten
Adenoviruspartikeln d1312 (d1312 PI), 600 ng StreptpL, 6 μg pCMVL und 6.6 μg TfpL ( die optimale Menge von
StreptpL für die verschiedenen Viren war in Vorversuchen mittels Titration ermittelt worden). Nach Tag 1, Tag 3 und Tag 7 nach der Transfektion wurde die
Luciferaseexpression pro 3 x 105 Zellen gemessen. Der Effekt der 8-Methoxypsoralen/UV-Inaktivierung auf die Genexpression ist in Fig. 3 dargestellt. 7 Tage nach der Transfektion war eine starke Verringerung der
Genexpression zu beobachten, die auch mit schweren zytopathischen Veränderungen in dieser Kultur
korrelierte. Die Transfektion der Zellen mit
8-Methoxypsoralen/UV-inaktiviertem Adenovirus verringerte die zytopathischen Veränderungen signifikant und führte am 7. Tag zu lOfach höheren Expressionswerten als das nicht-inaktivierte Virus. Beispiel 4
Bestimmung der Langzeitzytotoxizität von Adenoviren
Fibroblasten, die aus einem malignen Melanom stammen, wurden mit Kombinationskomplexen, die entweder Adenovirus d1312, 8-Methoxypsoralen/UV-inaktiviertes Adenovirus d1312 oder Adenovirus d11014 enthielten, transfiziert.
Die Zellen wurden mit Komplexen transfiziert, die folgende Komponenten enthielten: 6 μg pCMVL-DNA,
0.8 μg StreptpL, 6.8 μg TfpL und 20 μl Adenovirus d1312- Präparation (0.25 x 1012 Viruspartikel pro ml) oder 40 μl 8-Methoxypsoralen/UV-inaktivierter Adenovirus d1312-Präparation (0.13 x 1012 Viruspartikel pro ml) oder 3 μl Adenovirus d11014-Präparation (4.1 x 1012
Viruspartikel pro ml). 100 μl Aliquots dieser Mischung bzw., um die in Fig. 4 angegebenen Virus:Zell- Verhältnisse zu erhalten, eine 1:3 Serienverdünnung dieser Mischung wurden auf 3 x 104 Zellen pro Vertiefung einer Zellkulturplatte (24 Vertiefungen pro Platte) in 500 μl RPMI + 2 % FCS aufgebracht. Nach 2 h bei 37ºC wurde das Medium durch 2 ml RPMI + 10 % FCS ersetzt. Nach 8 Tagen wurde das Medium entfernt und die Zellen 5 min lang mit 4 % Formaldehyd und 150 mM NaCl fixiert und dann 10 min lang mit 0.1 % Kristallviolett in 2 % Ethanol gefärbt. Daraufhin wurden die Zellen 2 x mit PBS, 1 x mit Wasser gewaschen und photographiert. Das Ergebnis des Zytotoxizitätstests ist in Fig. 4 gezeigt: Bei einem Standardverhältnis von Virus: Zellen von 10.000:1 ist Adenovirus dl312 zytotoxisch; diese Zytotoxizität wird durch Psoralen/UV-Behandlung des Virus abgeschwächt.
Dieselbe Menge Adenovirus d11014 zeigte keine
zytotoxische Wirkung auf die Zellen. Beispiel 5
Wirkung der Bestrahlung der Tumorzellen auf die
Genexpression
3 x 105 primäre humane Melanomzellen der Bezeichnung HMM-5 bzw. der Maus-Melanomzellinie M-3 wurden mit
Komplexen behandelt, die 3 x 109 8-Methoxypsoralen/UV- inaktivierte Adenoviruspartikel d11014, 600 ng StreptpL, 6 μg pCMVL und 6.8 μg TfpL enthielten. 6 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit Dosen im Bereich von 0 - 100 Gy bestrahlt. 48 h nach der Bestrahlung wurde die Expression des transfizierten Luciferasegens gemessen. Die in Fig. 5 angegebenen Werte stellen die
Luciferaseexpression in Lichteinheiten pro μg Protein im Zellysat dar.
Beispiel 6
Einfluß der Plasmidkonzentration auf die Genexpression
3 x 105 M-3 Maus-Melanomzellen wurden mit Komplexen, bestehend aus 8.6 x 109 8-Methoxypsoralen/UV- inaktivierten Adenoviruspartikeln d11014, 400 ng
StreptpL, 6 μg DNA und 5.1 μg TfpL transfiziert. Die Komplexe wurden mit Plasmidkombinationen (pCMVL/pSP = pSP65 Boehringer Mannheim; pSVEmu-IFN-γ; IFN-γ/pBCMGneo- mIL-2) bei verschiedenen Mengenverhältnissen der Plasmide transfiziert. Die Mengenverhältnisse der Plasmide sowie die erhaltenen Genexpressionswerte sind Tabelle I sowie Fig. 6 (Luciferaseexpression) und Fig. 7 (IFN-γ/IL-2) entnehmbar. Beispiel 7
Verlust der Tumorigenizität transfizierter Maus- Melanomzellen
M-3 Maus-Melanomzellen (3 x 105 Zellen pro 6 cm
Petrischale) wurden mit 2 x 109 Adenoviruspartikeln d1312, 250 ng StreptpL, 6 μg Plasmid-DNA (enthaltend die Maus-IL-2- oder die Maus-IFN-γ-Sequenz) und 7.5 μg TfpL transfiziert. 4 h nach der Transfektion wurden die Zellen 2 x mit Ham 's F10 Kulturmedium ohne Serum gewaschen.
Anschließend wurden je 1 x 105 Zellen subkutan in den Rücken von 6 anästhesierten DBA/2 Mäusen verabreicht. Zur Kontrolle erhielt eine weitere Gruppe von 6 DBA/2 Mäusen 1 x 105 M-3 Zellen, die nicht transfiziert worden waren. Das Tumorwachstum an der Injektionsstelle wurde
wöchentlich kontrolliert. Fig. 8 zeigt den Verlauf der Tumorbildung.
Beispiel 8
Induktion einer systemischen Immunantwort gegen Melanom durch Immunisierung mit zytokintransfizierten,
bestrahlten Tumorzellen ("Prophylaktisches Mausmodell") a) M-3 Melanomzellen (3 x 105 Zellen pro T25
Kulturflasche) wurden mit 3 x 109 8-Methoxypsoralen/UV aktivierten Adenoviruspartikeln d11014, 6 ng StreptpL, 6 μg IL-2 Plasmid-DNA oder pSP Plasmid-DNA, die kein cDNA Insert enthält und daher nicht zur Expression eines Genproduktes in den transfizierten Zellen führt, und 6.8 μg TfpL transfiziert. 4 h nach der Transfektion wurden die Transfektionskomplexe entfernt und frisches, Serum enthaltendes Medium hinzugefügt. Dann wurden die Zellen 6 h nach der Transfektion mit Röntgenstrahlen einer Dosis von 20 Gy bestrahlt und weitere 18 h
kultiviert. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisierr und 2 x mit Earl's gepufferter Salzlösung (EBSS) gewaschen und die Kultur auf eine Konzentration von 1 x 106 Zellen pro ml eingestellt. Anästhesierte DBA/2 Mäuse wurden mit 1 x 105 Zellen, die subkutan in den Rücken verabreicht wurden, immunisiert. Parallel dazu wurde eine Gruppe von 6 Mäusen mit nicht-transfizierten M-3 Zellen immunisiert, die bestrahlt und weiter
behandelt worden waren wie die transfizierten Zellen. Eine Woche nach den ersten Immunisierungen erhielten die Mäuse Boosterimmunisierungen mit Zellzubereitungen, wie sie für die ersten Immunisierungen verwendet worden waren. Nach einer weiteren Woche wurden die Tiere der hochtumorigenen Dosis von 1 x 105 M-3 Zellen ausgesetzt, die an einer Stelle appliziert wurde, die von den früheren Immunisierungsstellen entfernt lag. Zusätzlich wurden 4 Mäuse, die nicht immunisiert worden waren, auf gleiche Art den tumorigenen Zellen ausgesetzt. 8 Wochen nach der Tumorzellimplantation hatten alle (4/4) nicht immunisierten Tiere Tumore entwickelt, während alle Mäuse, die mit den bestrahlten, IL-2 transfizierten M-3 Zellen immunisiert worden waren, frei von Tumoren waren (0 Tumore in 5 Tieren). Die Mäuse, die mit
bestrahlten, nicht transfizierten M-3 Zellen und mit bestrahlten M-3 Zellen, die mit einem "leeren" Plasmid (pSP) transfiziert worden waren, waren nur teilweise geschützt (4 von 6 Mäusen entwickelten Tumore). Die Entwicklung der Tumore in den Tieren ist in Tabelle II und in Fig. 9 zusammengefaßt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die Immunisierung von Mäusen mit IL-2 transfizierten, bestrahlten Tumorzellen eine systemische Immunantwort induziert, die die Tiere vor weiterer
Tumorentwicklung schützt. b) In einer weiteren Versuchsreihe wurden die Mäuse nach demselben Immunisierungsprotokoll mit bestrahlten M-3 Zellen behandelt, die mit Komplexen transfiziert worden waren, die 3 x 109 8-Methoxypsoralen/UV- inaktivierte Adenoviruspartikel d11014, 600 ng StreptpL, a) 6 μg IL-2 Plasmid pBCMGneo-mIL-2 (IL-2 100 %), b) 5.4 μg pSP Plasmid und 0.6 μg IL-2 Plasmid (IL-2 10 %), c) 5.4 μg IL-2 Plasmid und 0.6 μg IFN-γ Plasmid
(IL-2 90 % + IFN-γ 10 %) oder d) 5.4 μg pSP Plasmid und 0.6 μg IFN-γ Plasmid (IFN-γ 10 %), und 4.7 μg TfpL enthielten. Darüberhinaus wurde eine Gruppe von Mäusen mit bestrahlten M-3 Zellen immunisiert, die transfiziert worden waren mit 3.6 x 109 inaktivierten
Adenoviruspartikeln d1312, 600 ng StreptpL, 6 μg IL-2 Plasmid und 4.7 μg TfpL (IL-2 100 % d1312). Eine Woche nach der Boosterinjektion wurden den immunisierten Tieren und, zur Kontrolle, auch den nicht-immunisierten Tieren 1 x 105 M-3 Zellen implantiert. Die Entwicklung der Tumore ist in Tabelle III zusammengefaßt. c) Nach demselben Immunisierungsprotokoll wie in den vorangegangenen Versuchen wurden die Mäuse mit bestrahlten M-3 Zellen behandelt, die transfiziert worden waren mit Komplexen, enthaltend 3 x 109
8-Methoxypsoralen/UV-inaktivierte Adenoviruspartikel d11014, 600 ng StreptpL, a) 6 μg IL-2 Plasmid = 100 % IL-2, b) 5.76 μg pSP Plasmid und 0.24 μg IL-2 Plasmid = 4 % IL-2, oder c) 6 μg pSP Plasmid und 4.7 μg TfpL. Die Produktion von IL-2 durch die transfizierten, bestrahlten Zellen wurde am Tag der Immunisierung gemessen:
M-3 Zellen, die mit 100 % IL-2 Plasmid transfiziert worden waren, produzierten 33.000 Einheiten IL-2 pro 1 x 106 Zellen und 24 h, während M-3 Zellen, transfiziert mit 4 % IL-2 Plasmid, 396 Einheiten IL-2 pro 1 x 106 Zellen und 24 h produzierten. Eine Woche nach der
Boosterinjektion wurden in die immunisierten Tiere und, zur Kontrolle auch in die nicht-immunisierten Tiere 1 x 10^ M-3 Zellen implantiert. Um mehr Information über das Ausmaß der Immunantwort zu bekommen, die durch die Immunisierungen bei Verwendung verschiedener Mengen IL-2 Plasmid induziert wird, wurden weiteren Gruppen von Mäusen 3 x 105 M-3 Zellen bzw. 1 x 106 M-3 Zellen implantiert. Um zu zeigen, daß die Immunantwort
tumorspezifisch ist, wurden einer Gruppe von Mäusen die mit 100 % IL-2 transfizierten, bestrahlten M-3 Zellen immunisiert worden war, 1 x 105 syngenetische
Plattenepithelkarzinomzellen KLN 205 (ATCC No. CRL 1453) implantiert. Die Entwicklung der Tumore ist in Tabelle IV gezeigt.
Beispiel 9
Gentransfer in Zellen einer epidermoiden Karzinomzellinie
KB-Zellen wurden in einer Dichte von 400000 Zellen pro 6 cm Schalen gezüchtet und mit verschiedenen Komplexen transfiziert, die 2.5 x 109 Adenoviruspartikel d1312, 200 ng StreptpL, 6 μg pCMVL-DNA und wahlweise 3.8 μg Polylysin, 3.8 μ EGF-pL (Menge auf Polylysingehalt bezogen), oder 6 μg TfpL enthielten. Die Komplexe
(je 500 μl) wurden mit 1.5 ml Medium entweder mit oder ohne 2 % FCS gemischt. In Kompetitionsexperimenten wurden noch je 1 μg EGF zu der Mischung aus Komplexen und Medium zugegeben. Die Komplexe mit Medium wurden zu den Zellen zugegeben. Nach 2 h Inkubation bei 37ºC wurde das Medium entfernt und frisches, Serum enthaltendes Medium
beigegeben.
Ernten der Zellen nach 24 h und Luciferaseassay gab folgendes Ergebnis (Fig. 10A: Experiment mit 2 % FCS, Fig. 10B: Experiment ohne FCS): Fig. 10A: Mit EGFpL wurde ein Wert von 20845000 Lichteinheiten erhalten; dieser Wert war erheblich höher als mit TfpL (3970000) oder Polylysin (plys 10550000). Im Kompetitionsversuch mit freiem EGF wurde im Gegensatz zu den Experimenten mit TfpL (TfpL+EGF 12350000 Lichteinheiten) oder Polylysin (pLys+EGF 14055000) die erwartete Verringerung des
Signals (EGFpL+EGF 14150000) gefunden. Dies zeigt, daß der verstärkte Gentransfer Liganden-spezifisch über den EGF-Rezeptor verläuft. Im Experiment ohne FCS (Fig. 10B) war der Effekt von EGFpL noch ausgeprägter (EGFpL
15150000 , TfpL 2000000, pLys 5100000, EGFpL+EGF 5900000 Lichteinheiten). Die Expressionswerte beziehen sich auf 50 % der Zellen.
Analog wurden KB-Zellen mit Komplexen transfiziert, die 5 x 109 8-Methoxypsoralen/UV-inaktivierte
Adenoviruspartikel d11014 enthielten; es wurden
vergleichbare Luciferaseexpressionswerte erhalten.
Beispiel 10
IL-2 Expression unter Verwendung verschiedener Vektoren a) M-3 Zellen
3 x 105 M-3 Zellen wurden mit verschiedenen
Plasmidkonstrukten, die als Bestandteil ternärer Komplexe vorlagen, transfiziert. 3 μl Adenovirus d1312
Präparation, 0.3 μl (ca. 200 ng) StreptpL, 6 μg TfpL und
6 μg Plasmid-DNA (BCMGneo-mIL-2, pWS2m, BMGneo-mIL-2 oder pCM2) wurden mit HBS auf ein Gesamtvolumen von 500 μl gebracht.
Für die Versuche mit 8-Methoxypsoralen/UV-inaktiviertem Adenovirus d11014 wurden folgende Transfektionskomplexe eingesetzt: 9 μl Viruspräparation, 600 ng StreptpL, 6 μg TfpL, 6 μg BCMGneo-mIL-2.
Nach den in der Fig. 11 angegebenen Zeitabständen wurde die IL-2 Aktivität bestimmt. Für BCMGneo-mIL-2 wurden außerdem nach 48 Stunden 64.000 Einheiten und nach
28 Tagen 7.128 Einheiten erhalten (nicht in der Fig.
gezeigt). Für pCM2 wurden nach 48 Stunden 3.227 Einheiten und nach 28 Tagen 950 Einheiten erhalten, für BMGneo-mlL- 2 nach 24 Stunden 396 Einheiten, nach 48 Stunden
604 Einheiten, nach 7 Tagen 297 Einheiten und nach
14 Tagen 264 Einheiten (nicht in der Fig. gezeigt). b) Fibroblasten
Primäre humane Fibroblasten wurden wie in a) mit IL-2 Konstrukten transfiziert und die IL-2 Expression an den in der Fig. 12 angegebenen Tagen nach der Transfektion bestimmt. Die Zusammensetzung des Transfektionsmediums war für BCMGneo-mIL-2 dieselbe wie für M-3 Zellen; ein identischer Transfektionskomplex wurde für BMGneo-mIL-2 hergestellt.
Beispiel 11
Melanomzellen, die auf ihrer Oberfläche HSA exprimieren, stimulieren eine Immunantwort mit Schutzwirkung gegen nicht-modifizierte Tumorzellen
M3-Zellen wurden in Ham's F12-Medium plus
12.5 % Pferdeserum, 2.5 % FCS auf Gelatine-überzogenen Plastikschalen gezüchtet. 24 h vor der Transfektion wurden die Zellen zu 3 x 105 in eine 25 cm2 Kulturflasche plattiert. Die Transfektionskσmplexe für diese Zellmenge wurden hergestellt, indem 9 μl biotinyliertes. 8-Methoxypsoralen/UV-inaktiviertes Adenovirus d11014 (1.4 x 1012 Partikel/ml), 5.2 μg Transferrin-Polylysin, 800 ng Streptavidin-Polylysin und 6 μg der jeweiligen Plasmid-DNA (pSP, pWS2m in Kombination mit pSP, pHSA in Kombination mit pSP bzw. IL-2 in Kombination mit pHSA) in einem Gesamtvolumen von 500 μl vereinigt wurden. Dieses Volumen wurde jeder Kulturflasche in 2 ml Ham's F12 Medium plus 12.5 % Pferdeserum/2.5 % FCS zugegeben. Nach einer zweistündigen Inkubation bei 37ºC wurden das Medium durch frisches Medium ersetzt und die Zellen bestrahlt (20 Gy). 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert, 2 x mit HBSS (Hank's Buffered Saline Salts) gewaschen, gezählt und zu 100.000 Zellen in 100 μl HBSS wieder aufgenommen. Diese Zellen bildeten das
Vakzin, das innerhalb von 60 min für die Injektion in die Empfängermäuse verwendet wurde.
Die Mäuse wurden injiziert, wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben. Es wurden im Abstand von einer Woche zwei getrennte Vakzininjektionen mit je
100.000 Zellen an zwei verschiedenen Stellen des Rückens durchgeführt. Eine Woche nach der zweiten Injektion wurden die Mäuse mit 300.000 nicht-modifizierten, nicht- bestrahlten M3-Zellen in 300 μl HBSS an einer dritten Stelle des Rückens injiziert. Die Entwicklung der Tumore wurde in einwöchigen Abständen kontrolliert.
Fig. 13 zeigt das Ergebnis dieser Versuche (auf der Abszisse ist die Anzahl der Tage angegeben, auf der Ordinate die Tumorgröße in mmX Die Zahlen neben den Endpunkten bedeuten die Anzahl der Mäuse mit Tumoren im Vergleich zur Gesamtzahl der Mäuse in jeder Gruppe.
pSP: 6 μg pSP; 80 IL-2/20 pSP: 4.8 μg pWS2m plus
1.2 μg pSP; 20 HSA/80 pSP: 1.2 μg pHSA plus 4.8 μg pSP; 80 IL-2/20 HSA: 4.8 μg pWS2m plus 1.2 μg pHSA): Die Impfung mit bestrahlten, mit dem Leervektor pSP transfizierten M3-Zellen schützte nicht gegen
Tumorwachsturn; in 4 von 6 Mäusen wurden beträchtliche Tumormassen gebildet. Die IL-2 produzierenden Zellen bewirkten einen nur mäßigen Rückgang der Tumore bei allen Mäusen in der Gruppe (3/3), die Tumore entwickelte.
(Dieser Effekt ist darauf zurückzuführen, daß die
Versuchsbedingungen im Hinblick auf die Testung der vorteilhaften Wirkung von HSA gewählt wurden, indem Mäuse eingesetzt wurden, denen die dreifache Dosis von
Tumorzellen bei einer verringerten Dosis von IL-2-DNA verabreicht wurde.) Im Gegensatz dazu zeigten die Mäuse, die mit HSA exprimierenden M3-Zellen geimpft worden waren, ein stark unterdrücktes Tumorwachstum. Die Mäuse, die eine Impfung mit sowohl HSA als auch IL-2
exprimierenden M3-Zellen erhalten hatten, entwickelten mit stark verminderter Häufigkeit Tumore (2 von 6), und die gebildeten Tumore waren klein im Vergleich zu den Kontrolltumoren (Impfung mit pSP-transfizierten Zellen); die durchschnittliche Größe betrug 18 mm3 im Vergleich zu 1149 mm3.
Beispiel 12
Melanomzellen, die auf ihrer Oberfläche das Rabies- Neoantigen exprimieren, stimulieren eine Immunantwort mit Schutzwirkung gegen nicht modifizierte Tumorzellen.
M3-Zellen wurden, wie im Beispiel 11 beschrieben, behandelt und transfiziert. Lediglich die Einwirkungszeit der Transfektionskomplexe, die genauso wie im Beispiel 11 hergestellt wurden (6 μg Plasmid-DNA) auf die Zellen betrug vier anstelle von zwei Stunden. Die Injektionen in die Mäuse wurden ebenfalls analog zu Beispiel 11
durchgeführt, mit dem Unterschied, daß der Abstand zwischen den Injektionen von einer auf zwei Wochen verlängert wurde und das Injektionsvolumen immer 100 μl betrug.
Fig. 14 zeigt das Ergebnis der Versuche, der Aufbau der Graphik ist analog zu Fig. 13 gehalten. Die
pSP-Negativkontrolle zeigt das erwartete, beträchtliche Tumorwachstum. Die Positivkontrolle, bei der nur pWS2m (=100 % IL-2) transfiziert wurde, zeigt vollständigen Schutz; die transfizierten Zellen produzierten in den 24 h nach der Transfektion und vor der Injektion
45.000 IL-2 Einheiten/106 Zellen. Bei der Gruppe Mäuse, die nur 50 % pWS2m erhalten hatten (mit 50 % Leervektor pSP) war ein unvollständiger Schutz zu beobachten. Dieser wurde signifikant verbessert, wenn anstelle des
Leervektors das Rabiesexpressionsplasmid pWS-RABIES co-transfiziert wurde. Ein schwaches Tumorwachstum zwischen Woche 2 und 4 ging ab Woche 5 zurück.
Beispiel 13
Vergleich verschiedener Methoden zur Inaktivierung von Adenoviren
Es wurden im Rahmen dieses Beispiels verschiedene
Methoden angewendet und hinsichtlich der Reduktion des Virustiters und der Fähigkeit der inaktivierten Viren, den Gentransfer über Rezeptor-vermittelte Endozytose zu verstärken, verglichen. Ferner wurde untersucht, welche Virusgene durch die Inaktivierung ausgeschaltet werden. a) Testung der Inaktivierung von Adenoviren mit
8-Methoxypsoralen i) Inaktivierung der Viren Proben von biotinyliertem Adenovirus d11014 (300 μl) in HBS/40 % Glycerin wurden in die 4 Vertiefungen einer Zellkulturschale (NUNC, Katalog Nr. 176740) gegeben.
Aliquots von 33 mg/ml 8-Methoxypsoralen in DMSO wurden den Viren beigegeben, so daß die gewünschten
Endkonzentrationen erhalten wurden. Die Proben wurden mit geschlossenem Deckel auf Eis gegeben und wie unter e) iv) bei den Methoden beschrieben, 25 min lang UV bestrahlt, wobei die Position der Probenplatte alle 10 min verändert wurde, um Schatten zu vermeiden. Nicht reagiertes
Psoralen wurde mittels Gelfiltration entfernt: dazu wurde die Virus/Psoralenprobe (2 ml) auf eine Pharmacia
PD-10-Gelfiltrationssäule ( vorequilibriert mit
30 ml HBS/40 % Glycerin) aufgebracht. Die Probe mit
0.5 ml HBS/40 % Glycerin in die Säule gewaschen und das Virus mit HBS/40 % Glycerin eluiert, wobei die ersten 400 μl verworfen und die folgenden 4 ml in 0.5 ml
Fraktionen gesammelt wurden. Um die Virusfraktionen zu identifizieren, wurde ein Ninhydrinassay durchgeführt, die positiven Fraktionen vereinigt, die
Proteinkonzentration gemessen und das Virus in Aliquots bei -70ºC tiefgefroren. ii) Titration von 8-Methoxypsoralen (CPE gegenüber
Gentransfer)
Die Titrationen wurden durchgeführt, um die optimale Psoralenkonzentration festzustellen, die bei
vollständiger Virusinaktivierung die DNA- Transportkapazität des Virus nicht beeinträchtigt.
(Es gibt Berichte, wonach eine schlechte
Inaktivierungsleistung erzielt wird, wenn Psoralene in Konzentrationen nahe der Sättigung eingesetzt werden, während wesentlich bessere Leistungen bei niedrigeren Konzentrationen erzielt werden. Dies könnte entweder auf ein Kristallisationsphänomen, welches die Verbindung aus der Lösung entfernt, oder auf einen Filtereffekt
zurückgeführt werden, letzteres weil hohe Konzentrationen von nicht-gebundenen Verbindungen die UV-Strahlung absorbieren und somit die Aktivierung von DNA-gebundenem Material durch UV blockieren.)
Der CPE-Assay ("Zytopathischer Endpunktassay" oder
"Cytopathic Effect Assay"; Precious und Russell, 1985) zur Bestimmung des Virustiters wurde unter Verwendung von W162-Zellen, die zu 50.000 Zellen/Vertiefung auf Platten mit 24 Vertiefungen ausgebracht wurden, durchgeführt. Die Serienverdünnungen der Proben wurden in DMEM/2 % hitzeinaktiviertes Pferdeserum vorgenommen und das verdünnte Virus in 500 μl DMEM/2 % hitzeinaktiviertes Pferdeserum auf die Zellen aufgebracht. Nach einer zweistündigen Inkubation bei 37ºC wurde das Medium durch frisches DMEM/10 % FCS ersetzt. Nach 4 bis 5 Tagen bei 37ºC wurden die Zellen mit Formaldehyd fixiert und mit Kristallviolett gefärbt.
Die Eignung der Inaktivierungsmethode im Hinblick auf den Gentransfer wurde anhand des Imports des Luciferasegens in K562-Zellen (ATCC No. CCL 243) getestet. Die
Transfektionen mit Hilfe von Kombinationskomplexen wurden durchgeführt, wie in der WO 93/07283 beschrieben, wobei 9 μl Adenovirus d11014 (1.4 x 1012 Partikel/ml) bzw. bei Inaktivierung mit ß-Propiolacton 13.5 μl (9.3 x 1011 Partikel/ml), 800 ng Streptavidin-Polylysin, 6 μg pCMVL- DNA und 5.2 μg Transferrin-Polylysin in 500 μl HBS verwendet wurden (die Komplexe wurden hergestellt, wie bei den Methoden unter f) beschrieben). Außerdem wurde der relative Titer jeder Viruszubereitung mittels CPE- Assay auf W162-Zellen bestimmt. Das Ergebnis dieser
Titrationen ist in Fig . 15 dargestellt : die Ziffern links in der Figur beziehen sich auf den relativen Virustiter (gefüllte Dreiecke), die Ziffern rechts in der Figur beziehen sich auf Luciferaselichteinheiten (offene
Quadrate). Auf der Abszisse ist die Konzentration von 8-Methoxypsoralen in mg/ml aufgetragen. Es zeigte sich, daß eine Behandlung des Virus mit 0.11 mg/ml 8- Methoxypsoralen eine Verringerung des Titers hervorruft, die sich von der in Vorversuchen mit einer Konzentration von 0.33 mg/ml verursachten nicht unterscheidet. Die DNA- Transportaktivität wird bei dieser Konzentration
beibehalten. Unter den gewählten Bedingungen war eine 8-Methoxypsoralen-Konzentration von 0.033 mg unwirksam. (Die empfindlichere Analyse mittels Plaque-Assay, s. Fig. 19, ergab, daß Konzentrationen von 0.11 und 0.33 mg/ml 8-Methoxypsoralen vergleichbare Abnahmen im Virustiter hervorrufen.) b) Testung der Inaktivierung von Adenoviren mit
4'-Aminomethyl-4, 5', 8-trimethylpsoralen i) Inaktivierung der Viren
Das weniger hydrophobe Psoralenderivat 4'-Aminomethyl- 4, 5', 8-trimethylpsoralen ist geladen; es interagiert mit und inaktiviert in der Folge davon einzelsträngige
RNA-Viren ebenso wie DNA-Viren und ist zu 5 mg/ml in wässrigen Lösungen lösbar. Das eingesetzte
4'-Aminomethyl-4, 5', 8-trimethylpsoralen wurde von H.R.I. (Katalog Nr. 6) bezogen und zu 5 mg/ml in HBS aufgelöst. Nachdem Aliquots davon den Virusproben beigegeben worden waren, wurden die Inaktivierung des Virus und die
Reinigung analog wie für 8-Methoxypsoralen durchgeführt. ii) Titration von 4'-Aminomethyl-4, 5',
8-trimethylpsoralen (CPE gegenüber Gentransfer)
Die Titrationen wurden durchgeführt, genau wie unter a) ii) für 8-Methoxypsoralen beschrieben. Das Ergebnis dieser Titrationen ist in Fig. 16 dargestellt: die
Ziffern links in der Figur beziehen sich auf den
relativen Virustiter (gefüllte Dreiecke), die Ziffern rechts in der Figur beziehen sich auf
Luciferaselichteinheiten (offene Quadrate). Auf der Abszisse ist die Konzentration von 4'-Aminomethyl-4,5',8- trimethylpsoralen in μg/ml aufgetragen. Mit
0.3 und 1 mg/ml 4'-Aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen wurden Bedingungen gefunden, die einen Titerabfall von mindestens 5 log hervorrufen, während die Effizienz des DNA-Transfers beibehalten wird. Niedrigere
Konzentrationen von 4'-Aminomethyl-4, 5',
8-trimethylpsoralen (<0.1 mg/ml) rufen einen nur mäßigen Abfall des Virustiters hervor. Der Plaque-Assay
(s. Fig. 19) zeigte ebenfalls, daß Konzentrationen von ca. 1.0 und 0.3 mg/ml 4'-Aminomethyl-4,5',
8-trimethylpsoralen Verringerungen des Virustiters hervorrufen, die von den mit 0.11 und 0.33 mg/ml
8-Methoxypsoralen bewirkten nicht unterscheidbar sind. Die Gentransferkapazität des inaktivierten Virus wurde bestimmt, wie unter a) ii) beschrieben. Außerdem wurde der relative Titer jeder Viruszubereitung mittels
CPE-Assay auf W162-Zellen bestimmt. c) Testung der Inaktivierung von Adenoviren mit
ß-Propiolacton i) Inaktivierung der Viren
Die Virusproben wurden auf 0.3 M HEPES, pH 7.9
eingestellt, bevor die 10fach konzentrierten
ß-Propiolacton-Lösungen zugegeben wurden. Konzentrierte ß-Propiolacton-Lösungen wurden hergestellt, indem
ß-Propiolacton (Sigma, Katalog Nr. P5648) unmittelbar vor dem Gebrauch mit HBS verdünnt wurde. Es wurden
Kontrollversuche durchgeführt, um zu zeige,, daß 0.3 M HEPES, pH 7.9 ausreichend war, um die
ß-Propiolacton-Behandlung bei 1 % abzupuffern. Aliquots von ß-Propiolacton wurden bei Raumtemperatur den
gepufferten Viruslösungen beigegeben, dann wurden die Virusproben 4 h lang bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie entweder bei -70ºC gelagert oder für die
Transfektionsexperimente verwendet wurden. ii) Titration von ß-Propiolacton (CPE gegenüber
Gentransfer)
Die Adenoviren wurden 4 h lang bei Raumtemperatur verschiedenen Konzentrationen von ß-Propiolacton
ausgesetzt. Im übrigen wurden die Versuche durchgeführt, wie für die Psoralenderivate beschrieben. Es zeigte sich (Fig. 17), daß die Behandlung mit 0.3 % ß-Propiolacton einen Abfall des Virustiters um beinahe 5 log herruft, während die DNA-Transportaktivität beibehalten wird.
Konzentrationen von 1 % und höher bewirken einen noch stärkeren Titerabfall, wobei sich jedoch auch der DNA- Transport verschlechtert. (Die Ziffern links in der Figur beziehen sich auf den relativen Virustiter (gefüllte Dreiecke), die Ziffern rechts in der Figur beziehen sich auf Luciferaselichteinheiten (offene Quadrate). Auf der Abszisse ist die Konzentration von ß-Propiolacton in % aufgetragen.) iii) Gentransferkapazität des Adenovirus nach mehreren ß-Propiolacton-Behandlungen bei niedriger Konzentration
Die in ii) beobachtete starke Abnahme der DNA- Transferaktivität mit Konzentrationen zwischen
0.3 % und 1 % ß-Propiolacton ließ vermuten, daß bei der niedrigeren Konzentration eine Modifikation bevorzugt von viralen Nukleinsäuren auftritt, während das Mittel bei den höheren Konzentrationen die Kapsidproteine zu modifizieren und die endosomolytische Aktivität des Virus zu schädigen beginnt. Um die Richtigkeit dieser Vermutung zu prüfen, wurden die Adenoviren mit mehreren Aliquots von niedrigeren (<0.3 %) ß-Propiolacton-Konzentrationen behandelt, in der Hoffnung, dadurch bevorzugt eine
Modifikation der Virus-DNA zu bewirken, ohne das
Virusprotein zu schädigen. Dazu wurden Virusproben mit einer Gabe ß-Propiolacton zu 0.3 %, zwei Gaben
ß-Propiolacton zu 0.3 %, drei Gaben von ß-Propiolacton zu 0.2 %, vier Gaben von ß-Propiolacton zu 0.15 % oder mit einer Gabe von ß-Propiolacton zu 1 % behandelt. Die
Gentransferaktivität dieser Viruspräparationen, die in Kombinationskomplexe eingebaut wurden, wie unter f) beschrieben, wurde mit K562-Zellen getestet, wie oben beschrieben. Wie in Fig. 18 gezeigt ist, verursachten außer der 1 % Probe alle Behandlungen einen Abfall der Gentransferkapazität von weniger als 1 log. Die
Behandlung mit 1 % ß-Propiolacton verursachte einen
Abfall von mehr als 2 log. (Probe 1: nicht-inaktiviertes Virus. Probe 2: Inaktivierung mit 0.11 mg/ml
8-Methoxypsoralen. Probe 3: Inaktivierung mit 0.3 % ß-Propiolacton. Probe 4: Inaktivierung mit 2 x 0.3 % ß-Propiolacton. Probe 5: Inaktivierung mit 3 x 0.2 % ß-Propiolacton. Probe 6: Inaktivierung mit 4 x 0.15 % ß-Propiolacton. Probe 7: Inaktivierung mit 1 %
ß-Propiolacton. Die Zahlen bei den Balken bedeuten
Luciferaselichteinheiten.) d) Bestimmung der Replikationsfähigkeit inaktivierter Adenoviren mittels Plaque-Assay i) Vergleich der Plaque-Assays von Adenovirus d11014, inaktiviert mit 8-Methoxypsoralen, ß-Propiolacton oder 4'-Aminomethyl-4, 5', 8-trimethylpsoralen Der Plaque-Assay dient einer empfindlicheren Bestimmung der Replikationsfähigkeit des Virus: Adenovirus 5 benötigt das Eindringen von 10 bis 50 Viruspartikeln, um eine infizierte Zelle zu erzeugen. Der im folgenden dargestellte CPE-Assay mißt die Fähigkeit chemisch inaktivierter Viren, eine zytopathische Virusinfektion auszulösen, was aber die Infektion von mindestens 10 % der Zielpopulation erfordert, um während der vier Tage, die der Assay dauert, nachgewiesen werden zu können.
Dieser Assay erlaubt somit den Nachweis von
50.000 Viruspartikeln. Demgegenüber kann unter optimalen Bedingungen mit Hilfe des Plaque-Assays ein einzelner Plaque nachgewiesen werden, der als Folge des Eindringens von 10 bis 50 Viren entstanden ist; der Test ist also ca. 1.000 x empfindlicher als der CPE-Assay.
Für die im Rahmen der vorliegenden Erfindung
durchgeführten Plaque-Assays wurde die folgende Methode angewendet: W126-Zellen wurden 18 h vor Beginn des Assays zu 500.000 Zellen pro Vertiefung einer Platte mit
6 Vertiefungen ausplattiert. Dann wurde das Medium entfernt und durch frisches Medium (2 % Pferdeserum/DMEM) plus die jeweilige Virusverdünnung ersetzt, wobei das Virus gleichmäßig auf alle Zellen verteilt wurde.
Daraufhin wurden die Platten 1.5 h lang bei 37ºC
inkubiert, wobei die Platte alle 20 min vorsichtig geschwenkt wurde. Inzwischen wurde eine 2X Agaroselösung (2 % (2 g/100 ml) SeaPlaque-Agarose niedriger
Geliertemperatur (FMC Katalog Nr. 5010), in 5 mM HEPES pH 7.4, vor dem 25 minütigen Autoklavieren pH- eingestellt) auf 70ºC erhitzt, um die Agarose zu
schmelzen und anschließend bei 37ºC equilibriert. Auf ähnliche Weise wurde eine 2X DMEM/10 % FCS-Lösung
hergestellt (doppelte Konzentration DMEM/doppelte
Konzentration Penicillin/Streptomycin/doppelte
Konzentration Glutamin/10 % FCS (hitzeinaktiviert bei 56ºC, 30 min)). Am Ende der 1.5 stündigen Inkubation der Zellen mit den Virus wurde ein 50 ml Batch einer
Überschichtung (25 ml 2X Agarose + 25 ml 2X DMEM/10 % FCS in einem 50 ml Falcon-Röhrchen) hergestellt. Die
Medium/Virus-Lösung wurde von einer Platte entfernt und je 3.5 ml ÜberSchichtung in jede Vertiefung gegeben. Dann wurden die Platten mindestens 30 min lang ungestört bei Raumtemperatur stehengelassen, um die Agarose zu härten, bevor sie wieder bei 37ºC inkubiert wurden. Am sechsten Tag nach der Viruszugabe wurde jede Vertiefung mit weiteren 2-3 ml der Überschichtungslösung überschichtet. Bei dieser Vorgangsweise werden die Plaques normalerweise am siebenten bis zehnten Tag sichtbar. Die Plaques wurden jeweils am vierzehnten bis achtzehnten Tag nach der
Infektion gezählt.
Die Testung verschiedener inaktivierter
Viruspräparationen mittels Plaque-Assay ergab, daß die ß-Propiolacton-Behandlung (2 x 0.3 %) einen Abfall im Virustiter um ca. 5 log bewirkt (Fig. 19: Probe 1: nicht- aktiviertes Virus, Probe 2: Inaktivierung mit 0.33 μg/ml 8-Methoxypsoralen, Probe 3: Inaktivierung mit 0.11 μg/ml 8-Methoxypsoralen, Probe 4: Inaktivierung mit 2 x 0.3 % ß-Propiolacton, Probe 5: Inaktivierung mit 0.28 mg/ml 4'-Aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen, Probe 6:
Inaktivierung mit 0.83 mg/ml 4'-Aminomethyl-4,5', 8- trimethylpsoralen. Die Zahlen bei den Balken bedeuten pfu's/ml). Keine Plaques wurden sowohl bei den 8- Methoxypsoralen-behandelten (0.33 oder 0.11 mg/ml) als auch bei den 4'-Aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralenbehandelten (0.28 oder 0.83 mg/ml) Adenoviren beobachtet. Bei einem Verdünnungsfaktor von 6 log zwischen den nicht- inaktivierten d11014 (mit 1 x 108 pfu/ml) und den
Psoralen-inaktivierten Proben zeigt dies, daß in den Psoralen-inaktivierten Proben weniger als 102 Plaquebildende Einheiten (pfu's) vorhanden sind. Die wesentliche Beobachtung dabei ist, daß ß-Propiolactoninaktivierte Viren Plaques mit nachweisbarer Häufigkeit bilden. Wenn also auch die ß-Propiolacton-Inaktivierung im CPE-Assay der Psoralen-Inaktivierung ebenbürtig erscheint - im Plaque-Assay kommt ein deutlicher
Unterschied zwischen den zwei Verbindungstypen zu Tage. ii) Vergleich der Plaque-Assays von Adenovirus d11014, inaktiviert mit 8-Methoxypsoralen oder verschiedenen ß-Propiolacton-Behandlungen
Die Adenovirus d11014-Präparationen wurden mit
verschiedenen Mehrfachzugaben von ß-Propiolacton
(s. Fig. 20) inaktiviert, mittels Plaque-Assay analysiert und mit Adenoviren, die mit 0.11 mg/ml 8-Methoxypsoralen inaktiviert worden waren, verglichen. (Probe 1: nicht- aktiviertes Virus, Probe 2: Inaktivierung mit 0.11 μg/ml 8-Methoxypsoralen, Probe 3: Inaktivierung mit 0.3 % ß-Propiolacton, Probe 4: Inaktivierung mit 2 x 0.3 % ß-Propiolacton, Probe 5: Inaktivierung mit 3 x 0.2 % ß-Propiolacton, Probe 6: Inaktivierung mit 4 x 0.15 % ß-Propiolacton, Probe 7: Inaktivierung mit 1 %
ß-Propiolacton. Die Zahlen bei den Balken bedeuten pfu's/ml.) Auch dieser Versuch, dargestellt in Fig. 20, ergab keinen Nachweis von Viren in der Psoralen- behandelten Probe. Der Verdünnungsfaktor von 7 log zwischen nicht-inaktiviertem d11014 von 6.7 x 10^ pfu/ml und dem Psoralen-inaktivierten Virus ergibt, daß in der Psoralen-inaktivierten Probe weniger als 6.7 x 101 pfu's vorhanden sein müssen. Im Gegensatz dazu wurden in allen ß-Propiolacton-behandelten Proben Plaques nachgewiesen, was einer Inaktivierung von ca. 2 log (0.3 %
ß-Propiolacton) bis 5 log (2 x 0.3 % ß-Propiolacton) entspricht. Obwohl 1 % ß-Propiolacton einen starken Abfall in der DNA-Transportaktivität hervorrief (vgl. Fig. 17), bewirkte es nur einen mäßigen Abfall des Virustiters, was für die Annahme spricht, daß die höhere ß-Propiolacton-Konzentration die Prcteinmodifikation gegenüber der DNA-Modifikation bevorzugt und daher stärker die Fähigkeit des Virus, Endosome aufzubrechen (und somit den Viruseintritt) beeinträchtigt, als die Virusreplikation. e) Genexpression vom inaktivierten Virus
Es wurden verschiedene Kombinationskomplexe entsprechend der bei den Methoden unter f) beschriebenen Vorschrift, enthaltend optimale Mengen von Adenovirus d1312,
8-Methoxypsoralen-inaktiviertem d1312, Adenovirus d11014, 8-Methoxypsoralen-inaktiviertem d11014 und
ß-Propiolacton-inaktiviertem d11014, hergestellt. Die Komplexe enthielten ca. 1 x 1010 Viruspartikel, 800 ng Streptavidin-Polylysin, 6 μg pCMV-DNA und 5.2 μg
Transferrin-Polylysin in einem Endvolumen von 500 μl HBS. Die Komplexe wurden auf K562-Zellen (24 h vorgezüchtet in 50 μM Deferrioxamin/RPMI/10 % FCS, ausplattiert zu 250.000 Zellen/ml) zu 2 ml pro Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen aufgebracht. Nach zweistündiger
Inkubation wurden die Zellen in frisches Medium ohne Deferrioxamin gewaschen und 48 h später für die
Bestimmung der Luciferaseaktivität geerntet oder einer RNA-Analyse auf ausgewählte Adenovirusgene unterworfen, wobei das vereinigte Material drei getrennter
Transfektionen verwendet wurde.
Die Messungen der Luciferaseaktivität zeigten, daß alle Transfektionen eine Expression lieferten, die innerhalb einer Größenordnung lag. i) Northern-Analyse Die RNA-Northern-Analyse wurde nach der von Paeratakul et al., 1988, beschriebenen Methode durchgeführt: 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen 3 x in HBS gewaschen und Serienverdünnungen entsprechend 30.000, 10.000 oder 3.000 Zellen auf ein Nitrozellulosefilter unter Verwendung eines 96 Proben Dot Blot Geräts
(Schleicher & Schuell) aufgebracht. Daraufhin wurden die Zellen mit 1 % Glutaraldehyd in HBS 60 min lang bei 4ºC fixiert, gefolgt von Proteinase K-Verdau (20 μg/ml) und 30 min in HBS/0.1 % SDS bei 37ºC. Das Filter wurde dann in Church-Puffer (0.5 M Natriumphosphat, 7 % SDS, 1 mM EDTA pH 8) bei 65ºC 5 h lang prähybridisiert, gefolgt von der Inkubation (über Nacht bei 65ºC) mit den markierten DNA-Sonden in einem Minimalvolumen Church-Puffer.
Anschließend wurden die Filter zweimal in 2X SSC/0.1 % SDS 30 min lang bei 65ºC gewaschen, gefolgt jeweils von 30 min in 0.1X SSC, 0.1 % SDS. Das radioaktive Muster wurde durch Phosphorimaging sichtbar gemacht. Die radioaktiv markierten (32P) Sonden wurden aus PCR- Produkten von Adenovirus d11014-Sequenzen hergestellt. Eine Ela-Sonde (383 bp) wurde unter Verwendung von PCR- Primern zu Ad5, bp 736 - 751 (Ela.l) und zu bp 1119 - 1101 (E1a.2) hergestellt. (Diese Sequenz ist ein Teil der Region, die in d1312 deletiert ist. Sie dient als
Kontrolle; das RNA-Signal sollte in den d1312-Proben fehlen, jedoch in den d11014-Proben enthalten sein, weil letzteres Virus eine Wildtyp El-Region besitzt.) Eine E3-Sonde (436 bp) wurde vom am stärksten exprimierten E3-Gen, dem 19 K Glykoprotein-Gen (Gooding, 1992) unter Verwendung von Primern, die zu Ad5, bp 28722 - 28737 (E3.a) und 29157 - 29142 (E3.b) hergestellt (Die
Expression von E3 dürfte eine wichtige Rolle bei der Immunantwort auf transfizierte Zellen spielen, weil mindestens zwei der E3-Gene die Oberflächenexpression von MHC Klasse I-Molekülen und TNF-Rezeptor-Molekülen auf der Oberfläche von infizierten Zellen modulieren.) Im Anschluß an die PCR wurden die Reaktionsprodukte auf niedrigschmelzenden Agarosegelen in TAE-Puffer gereinigt, das gewünschte DNA-Fragment aus dem Gel
herausgeschnitten, gewogen und in 1.3 ml Wasser/g
Gelfragment aufgenommen. Das in Wasser aufgenommene
Gelfragment wurde dann 10 min lang auf 95ºC erhitzt und 10 μl der entstandenen Lösung 12 h lang bei
Raumtemperatur mittels der Random Primer Methode
(Feinberg und Vogelstein, 1984) radioaktiv markiert. Im Anschluß daran wurde die markierte DNA durch
Ethanolfällung in Gegenwart von Ammoniumacetat und tRNA gereinigt.
Fig. 21 zeigt das Autoradiogramm: es wurde gefunden, daß bei den d1312-Proben, und zwar sowohl bei den nicht- inaktivierten als auch bei den 8-Methoxypsoralen- inaktivierten, keine Ela-Expression auftrat. Die
Expression von Ela ist in den nicht-inaktivierten
d11014-Viren stark, fehlt jedoch komplett sowohl in den 8-Methoxypsoralen-behandelten als auch in den zweimal mit 0.3 % ß-Propiolacton inaktivierten Viren. E3 ist in nicht-inaktivierten d1312-Adenoviren weniger stark exprimiert, als in d11014. Dieser Befund ist in Einklang mit der Kenntnis der Funktion von Ela als positiver
Modulator der E3-Expression und der Expression anderer früher Gene (Nevins, 1991 und 1992). In allen Fällen blockierte die Inaktivierung mit 8-Methoxypsoralen bzw. mit ß-Propiolacton die RNA-Synthese von diesen Genen vollständig. ii) Reverse Transkriptions-PCR-Analyse
Es wurde von Zellen ausgegangen, die, wie in den
vorangegangenen Versuchen beschrieben, transfiziert worden waren, wobei entweder nicht-aktiviertes Adenovirus d11014 oder 8-Methσxypsoralen-inaktiviertes d11014 eingesetzt wurde. In beiden Transfektionen wurden identische Mengen von Virus eingesetzt. Die RNA-Reinigung wurde mit 1 x 106 transfizierten M3-Zellen, geerntet 24 h nach der Transfektion durch Einbringen in PBS und kurzes Pelletieren in einer Eppendorf-Zentrifuge, durchgeführt. Die Zellpellets wurden in 1 ml Trisolv (=
Phenol/Guanidinthiozyanat in einer Monophasenlösung;
Biotecx) gelöst und kurz in einem Vortex gemischt. Darauf wurde Chloroform zugefügt (500 μl), worauf zwei Phasen entstanden, von denen die wässerige die zelluläre RNA enthielt. Die RNA wurde aus der wässerigen Phase durch Zugabe eines gleichen Volumens Isopropanol ausgefällt, das Präzipitat durch Zentrifugation gesammelt, das
Zellpellet mit 80 % Ethanol 1 x gewaschen und in 20 μl RNase-freiem Wasser gelöst. In der RNA-Probe enthaltene kontaminierende DNA wurde durch Verdau mit RNase-freier DNase (Boehringer Mannheim; 60 min bei 37ºC) entfernt. Die DNase wurde anschließend durch weitere Inkubation bei 95ºC 5 min lang inaktiviert.
Die Reverse Transkriptions-Reaktionsansätze enthielten 10 μl RNA-Lösung, 2 μl 10 mM dNTPs, 4 μl 25 mM MgCl2, 2 μl 10 X RT Puffer (100 mM Tris-HCl, 900 mM KCl, pH 8.3), 1 μl 50 μM oligo d(D)16. 1 U1 20 Einheiten/μl RNase-Inhibitor (Perkin Eimer) und 1 μl MuLV Reverse Transkriptase (Perkin Eimer). Reverse Transkriptase- Reaktionen wurden durchgeführt 10 min lang bei 25ºC und 15 min bei 42ºC, gefolgt von 5 min bei 95ºC, um die Reverse Transkriptase zu inaktivieren.
Es wurden Primer verwendet, die den folgenden Abschnitten des Adenovirus 5 Genoms entsprechen: E1a up: bp 1228- 1248, E1a down: bp 1545-1526, E3 up: bp 28722-28737, E3 down: 29157-29140. Die Polymerase-Kettenreaktionsansätze enthielten
35 μl Wasser, 5 μl PCR-Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 8.9, 1 M KCl, 15 πM MgCl2), 1 μl 10 mM dNTPs, 1 μl up- und down-Primer (25 mM), 0.5 μl Taq-Polymerase (5
Einheiten/μl, Boehringer Mannheim) und 6.5 μl der verdünnten cDNA-Sonden (RNA als Kontrollreaktion). Die Proben wurden 90 sek lang bei 95ºC denaturiert, gefolgt von 35 Zyklen von 30 sek bei 95ºC, 60 sek bei 60ºC, 30 sek bei 72ºC mit einer abschließenden Extension von 3 min bei 72ºC. Die amplifizierten DNA-Produkte wurden auf einem 2 %igen Agarose TAE-Gel aufgetrennt und mittels Ethidiumbromidfärbung sichtbar gemacht. Fig. 22 zeigt, daß beim nicht-inaktivierten Adenovirus die erwarteten PCR-Produkte von sowohl der Ela- als auch der E3-Region sichtbar sind, wobei das Signal bei einer Verdünnung von 1:1.000 der Zielnukleinsäure nachweisbar ist (obere
Tafeln in der Figur). Im Gegensatz dazu war in den
Proben, die vom Psoralen-inaktivierten Virus stammten, kein Signal nachweisbar. Das Fehlen des PCR-Signals in einer Kontrollprobe, in der die Reverse
Transkriptasereaktion ausgelassen worden war, bestätigt, daß die beobachteten Signale auf die Amplifizierung der RNA zurückzuführen sind und nicht von einer
Verunreinigung der Adenovirus-DNA in der
Nukleinsäurepräparation. f) Analyse der Bindung von 8-Methoxypsoralen an das
Adenovirusgenom i) Quantitative Bestimmung von an das Adenovirusgenom gebundenem 8-Methoxypsoralen
0.41 ml Tritium-markiertes 8-Methoxypsoralen (0.8 mCi/ml) wurden getrocknet, in 20 μl DMSO gelöst und mit 8.7 μl unmarkiertem 8-Methoxypsoralen (33 μg/μl in DMSO) gemischt. Diese Mischung wurde 1.8 ml biotinyliertem Adenovirus d11014 beigegeben. UV-Bestrahlung und
Reinigung mittels PD-10 Chromatographie wurden
durchgeführt, wie oben beschrieben. Der Einbau von
3H 8-Methoxypsoralen wurde bestimmt, indem Aliquots des gereinigten Virus in Szintillationsflüssigkeit gezählt wurden. Berechnungen aufgrund der gemessenen
Radioaktivität, die in die DNA eingebaut worden war, zeigten, daß ein Psoralenmolekül pro 800 Basenpaaren des Virus vorlag. Ergänzend wurde mittels
dünnschichtchromatographischer Analyse (Silicagel,
Dichlormethan als Lösungsmittel) festgestellt, daß kein freies, nicht-reagiertes 8-Methoxypsoralen in der Probe blieb. ii) Untersuchung der Lokalisierung der 8-Methoxypsoralen- Einlagerung im Virusgenom
Um zu bestimmen, ob die Einlagerungen von
8-Methoxypsoralen über das gesamte Virusgenom verteilt oder an bestimmten zugänglichen Stellen der Virus-DNA konzentriert sind, wurde die Virus-DNA gereinigt und mittels Restriktionsenzymen gespalten, um zehn oder elf DNA-Fragmente zu erhalten: Vom 3H 8-Methoxypsoralen- markierten Virus wurde die DNA gereinigt, indem das Virus 45 min lang bei 56ºC mit 0.4 % SDS/0.4 mg/ml Proteinase K inkubiert wurde. Die Probe wurde 2 x mit
Phenol/Chloroform (1:1) und 1 x mit Chloroform
extrahiert, die DNA aus der wässerigen Phase wurde nach Zugabe von 1/10 Volumen 3M Natriumacetat, pH 5, mit 0.54 Volumina Isopropanol präzipitiert. Die präzipitierte DNA wurde zentrifugiert, 2 x mit eiskaltem 80 %igen Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in TE gelöst.
DNA-Aliquots von nicht-inaktiviertem Adenovirus oder von 3H 8-Methoxypsoralen-markiertem Adenovirus wurden mit den Restriktionsenzymen Hindill oder Asp718 nach Vorschrift des Herstellers (Boehringer Mannheim), aber mit 10fafh höheren Enzymmengen verdaut, mittels Phenol/Chloroform- und Chloroformextraktion gereinigt, mit Ethanol
präzipitiert und in Gegenwart von Ethidiumbromid
(Sambrook et al., 1991) auf einem 0.9 % Agarose/TAE-Gel aufgetrennt. Das Gel wurde getrocknet, imprägniert mit Szintillationsfluor (Enhance, Amersham) und mit einem Röntgenfilm in Kontakt gebracht. Fig. 23 zeigt das
Ethidiumbromid-gefärbte Gel und das Fluorogramm; aus dem Markierungsmuster ist ersichtlich, daß 3H 8- Methoxypsoralen über das Genom verteilt ist. Mit wenigen Ausnahmen waren die Fragmente, erhalten aus dem Asp718- oder dem HindiII-Verdau, in einem Ausmaß markiert, das ihrer Länge proportional war. Zwei der HindiII-Fragmente, die nahe den Enden des Genoms lokalisiert sind, schienen eine verstärkte Markierung aufzuweisen. Im Gegensatz dazu wiesen Asp718-Fragmente aus ähnlichen Lagen im Genom eine solche präferentielle Markierung nicht auf. Insgesamt waren die 8-Methoxypsoralen-Vernetzungen gleichmäßig über das Virusgenom verteilt.
Beispiel 14
Ermittlung der für die Inaktivierung von Tumorzellen erforderlichen Strahlendosis
Dazu wurden je 6 mittlere Gewebekulturflaschen (T75) mit je 6 x 105 humane Melanomzellen in 20 ml
Normalkulturmedium nach einem Tag mit 5, 10, 20, 25, 50, 75 oder 100 Gy bestrahlt; 6 Flaschen blieben unbestrahlt. Es wurde ein Bestrahlungsgerät der Bezeichnung Gammacell 40, No. 126, Type B(U), (Fa. Nordion International INC) verwendet, das 2 Gammazellen aus Cs-137 besitzt, die zusammen ca. 72.5 Gy/h liefern. 6 Tage nach der
Bestrahlung wurden die Zellen je eine Flasche aus jeder Gruppe trypsiniert, zentrifugiert, das Pellet aufgenommen, 100 μl Zellsuspension mit Trypanblau versetzt und in der Zählkammer gezählt. Die restlichen Zellen wurden mit neuem Medium versetzt und in eine neue Kulturflasche gegeben (1. Passage). Eine Woche später wurde der Vorgang wiederholt; je eine Flasche aus jeder Gruppe wurde trypsinisiert, gezählt und die 1. Passage wurde als Kontrolle mitgezählt. Die nicht-bestrahlten und mit 5 Gy bestrahlten Zellen zeigten ein deutliches
Wachstum. Nach weiteren einwöchigen Abständen wurde der Vorgang wiederholt, der Versuch wurde nach insgesamt 6 Wochen abgeschlossen. Für die Wachstumskurven wurde jeweils die höchste gezählte Zellzahl (in Original- oder Kontrollflaschen) verwendet. Ab einer Bestrahlungsdosis von 20 Gy zeigten weder die Originalflaschen noch die Kontrollflaschen Zellwachstum. Bei 10 Gy wurde ein
Wachstum in den Originalflaschen beobachtet. Die
Wachstumskurven sind in Fig. 24 dargestellt. Aufgrund der ermittelten Werte von drei verschiedenen
Melanomzellkulturen wurde als sichere Strahlendosis für alle Experimente eine Dosis von 100 Gy gewählt.
Beispiel 15
Nachweis von Plasmid- und Adenovirus-DNA in vivo mittels Polymerase Ketten Reaktion (PCR)
In diesem Beispiel wurden folgende Methoden verwendet:
Injektion der Krebsvakzine:
M3 Melanomzellen wurden mit rekombinantem Maus- Interleukin-2 Plasmid unter Anwendung der Adenovirus- Transferrin-Methode, wie in Beispiel 8 c) beschrieben, transfiziert. Nach 24 h wurde die Zytokinproduktion bestimmt (20.000-50.000 Einheiten IL-2 in 24 h pro
1 Million Zellen). Die Zellen wurden trypsiniert, in serumfreiem Medium gewaschen und auf eine Konzentration von 3 x 105 bzw. 1 x 106 Zellen pro 100 μl isotonische Salzlösung eingestellt. Je 100 μl Zellsuspension wurden mit Hilfe einer Kanüle subkutan in die rechte Flanke von DBA/2 Mäusen injiziert (siehe auch die Beispiele 7 und 8).
Aufreinigung der Gewebeproben:
Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion wurden die Mäuse getötet und die Injektionsstelle sowie
verschiedene Gewebeproben entnommen. Diese Proben wurden mechanisch verkleinert und über Nacht in 1 ml Proteinase K Puffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 100 mM EDTA, 1 % SDS, 0.5 mg/ml Proteinase K) bei 55ºC inkubiert.
Anschließend wurde die DNA mit Phenol/Chloroform
extrahiert und mit 0.5 Volumen Isopropanol präzipitiert. Die Proben, welche nun die gesamte zelluläre DNA
enthielten, wurden mit 70 % Ethanol gewaschen und in TE-Puffer aufgenommen.
Zur Aufreinigung von peripheren mononukleären Blutzellen (PMBZs) wurde eine Herzpunktation durchgeführt. Das mit Citratpuffer (10 mM) versetzte Blut wurde anschließend durch einen Ficoll-Gradienten separiert und die PMBZs mit Proteinase K Puffer verdaut. DNA Reinigung erfolgte wie oben beschrieben.
Polymerase Kettenreaktion:
Die Reaktionsmischung setzte sich zusammen aus 1 μg DNA, 1 x PCR-Puffer (Boehringer Mannheim), 1 mM
Endkonzentration desoxy-Nukleotide, 3 Einheiten Taq- Polymerase (Boehringer Mannheim) und 25 pmol der
spezifischen Primer. Im Falle der Interleukin-2 Plasmid Amplifikation wurden zusätzlich 1.000 Kopien der internen Kontrolle zugefügt. PCR-Reaktionzeiten waren: 5 min bei 95ºC zur Denaturierung, danach 40 Zyklen mit je 30 sek 94ºC, 30 sek 60ºC, 2 min 72ºC. Danach wurden die Amplifikationsprodukte mit Probenpuffer versetzt und in einem 2 % Agarosegel aufgetrennt.
Die spezifischen Primer wiesen die folgenden Sequenzen auf:
IL-2 up (Position 99-122) (SEQ ID NO: 3)
GTCAACAGCGCACCCACTTCAAGC.
IL-2 down (Position 548-526) (SEQ ID NO: 4)
GCTTGTTGAGATGATGCTTTGACA.
Adeno up (Position 1228-1248) (SEQ ID NO: 5)
GGTCCTGTGTCTGAACCTGAG.
Adeno down ( Position 1545-1525) (SEQ ID NO: 6)
TTATGGCCTGGGGCGTTTACA.
(Im Sequenzprotokoll wurde aus programmtechnischen
Gründen für die synthetischen Oligonukleotide einheitlich als Art des Moleküls "cDNS" und als Schlüssel "5'UTR" angegeben.)
Die Nachweisgrenze der Amplifikationsprodukte liegt je nach Test zwischen 200 und 1.000 Kopien DNA. a) Um rekombinante IL-2 DNA und Adenovirus d11014 DNA an der Injektionsstelle zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Impfung nachzuweisen, wurden neun DBA/2 Mäuse mit je 3 x 105 IL-2-Plasmid-transfizierten M3 Melanomzellen immunisiert. Nach 1, 2 und 5 Tagen wurden jeweils 3 Mäuse getötet und die Immunisierungsstellen ausgeschnitten. Die PCR-Analyse zeigte, daß schon nach 2 Tagen ein starker Abbau der IL-2 DNA einsetzt und nach 5 Tagen diese DNA nicht mehr nachweisbar ist. In einem analogen Experiment konnte aus der Injektionsstelle von einem Tier am Tag 5 nach der Injektion IL-2 Plasmid DNA nachgewiesen werden. Bei PCR-Reaktionen mit den Adenovirus-spezifischen
Primern konnte Adenovirus-DNA in Proben von Tag 1 und Tag 2 nachgewiesen werden, jedoch nicht in Proben von Tag 5. b) Um IL-2 DNA und Adenovirus d11014 DNA aus peripheren mononukleären Blutzellen 24 und 48 h nach der Impfung nachzuweisen, wurden zwölf DBA/2 Mäuse mit je 1 x 106 IL-2-Plasmid-transfizierten M3 Melanomzellen immunisiert. Nach 24 und 48 h, einem Zeitraum, indem an der
Injektionsstelle ein massiver Abbau der M3 Zellen stattfindet, wurden je 6 Mäuse getötet und Blut
entnommen. Die PCR-Analyse zeigte, daß zu beiden
Zeitpunkten weder spezifische IL-2 DNA noch Adenovirus- DNA im Blut nachweisbar ist. c) Um IL-2 DNA und Adenovirus d11014 DNA aus Gewebeproben von verschiedenen Organen nachzuweisen, wurden sechs DBA/2 Mäuse mit je 1 x 106 IL-2-Plasmid-transfizierten
M3 Melanomzellen immunisiert. Nach 24 und 48 h wurden je 3 Tiere getötet und Gewebeproben aus der
Injektionsstelle, den ableitenden Lymphknoten, Milz, Niere, Leber, Colon und den Keimdrüsen (Ovarien)
entnommen. Es konnten nur an den Injektionsstellen spezifische Amplifikationsprodukte nachgewiesen werden. Alle überprüften Gewebeproben waren negativ. d) Um auszuschließen, daß ein Transfer von rekombinanter IL-2 DNA in die Keimzellen stattfindet, wurden sechs weibliche und sechs männliche DBA/2 Mäuse mit je 1 x 10^ IL-2-Plasmid-transfizierten M3 Melanomzellen immunisiert. Nach 24 und 48 h wurden je 3 weibliche und 3 männliche Tiere getötet und die Keimzellen isoliert. Die PCR- Analyse zeigte, daß kein Transfer in die Keimzellen stattgefunden hatte.
Beispiel 16 a ) Testung der Wirksamkeit der Krebsvakzine auf ihre Schutzwirkung gegen Metastasenbildung
( "Therapeutisches Mausmodell " ) In diesem Beispiel wurde hinsichtlich der verwendeten Transfektionskomplexe, der Züchtung der Zellen und der Durchführung der Transfektionen vorgegangen, wie in Beispiel 8 beschrieben. Als Versuchstiere wurden Mäuse vom Stamm C57BL/6J verwendet, wobei jeweils 8 Tiere pro Gruppe eingesetzt wurden. Als Melanomzellen wurden die für den verwendeten Mausstamm syngenen Zellen B16-F10 (NIH DCT Tumor Depository; Fidler et al., 1975)
verwendet.
Am Tag 1 wurden den Versuchstieren 1 x 105 lebende
B16-F10-Zellen intravenös injiziert, um die Ausbildung von Metastasen hervorzurufen. An den Tagen 4, 11 und 17 wurde die Krebsvakzine subkutan verabreicht, um eine Immunisierung gegen die Metastasen zu bewirken.
Pro Immunisierung wurden 1 x 105 bestrahlte Zellen injiziert, wobei die Vakzine unterschiedliche Anteile von Zellen enthielten, die mit Zytokin-Plasmid transfiziert worden waren ("transfizierte Zellen" steht im folgenden für Zellen, die einer Transfektionsbehandlung unterzogen wurden; die Expressionswerte für die Zytokine sind jeweils pro Maus in 24 h angegeben; die Bezeichnungen entsprechen denen in Fig. 25):
1) Kontrollen:
a) Zellen, die nur bestrahlt wurden ("bestrahlt") b) bestrahlte Zellen, transfiziert mit dem Leervektor pSP ("Leervektor")
2) Mit dem IL-2-Plasmid transfizierte Zellen:
a) 100 % transfizierte Zellen (Expression: 15.000
Einheiten; "11,-2 hoch")
b) 20 % transfizierte Zellen, 80 % nicht-transfizierte Zellen (Expression: 3.000 - 4.000 Einheiten; "IL-2 mittel") c) 2 % transfizierte Zellen, 98 % nicht-transfizierte Zellen (Expression: 400 Einheiten; "IL-2 niedrig")
3) Mit dem GM-CSF-Plasmid transfizierte Zellen:
a) 100 % transfizierte Zellen (Expression:
500 ng; "GM-CSF hoch")
b) 10 % transfizierte Zellen, 90 % nicht-transfizierte Zellen (Expression: 50 ng; "GM-CSF mittel")
c) 1 % transfizierte Zellen, 99 % nicht-transfizierte Zellen (Expression: 5 ng; "GM-CSF niedrig")
4) Mit dem IFN-γ-Plasmid transfizierte Zellen:
a) 100 % transfizierte Zellen (Expression: 1.000 ng;
"IFN-γ hoch")
b) 10 % transfizierte Zellen, 90 % nicht-transfizierte Zellen (Expression: 100 ng; "IFN-γ mittel")
c) 1 % transfizierte Zellen, 99 % nicht-transfizierte Zellen (Expression: 10 ng; "IFN-γ niedrig")
Am Tag 28 wurde die Schutzwirkung der Krebsvakzine gegen Metastasenbildung analysiert, indem die Mäuse visuell auf das Vorhandensein von Tumoren untersucht wurden.
Die in Fig. 25 dargestellten Versuchsergebnisse zeigen, daß die Krebsvakzine in Abhängigkeit des transfizierten Gens und in Abhängigkeit von der Expressionshöhe des Gens wirken. b) Testung der Krebsvakzine auf ihre Fähigkeit,
künstlich gesetzte "Mikrometastasen" zu eliminieren
Um die tumorigene Dosis von M3-Zellen zu finden, wurde zunächst in einem Vorversuch die Zellzahl, die bei
50 % aller Tiere innerhalb von 8 Wochen und die bei 100 % aller Tiere innerhalb von 10 Wochen zu einer lokalen Tumorentwicklung führt, mit 1 x 103 bzw.
3 x 103 M3-Melanomzellen ermittelt.
Am Tag 0 wurde allen Versuchstieren 5 x 103 viable
M3-Zellen subkutan injiziert; die M3-Zellen, die nicht metastasieren, können als "Mikrometastase" angesehen werden. Die Verabreichung der Tumorvakzine wurde bei allen Versuchstieren nach einer, zwei und nach fünf Wochen vorgenommen. Die Zytokinexpression der
verabreichten Tumorvakzine betrug, jeweils pro Maus, für IL-2 bei der 1. Immunisierung 1.020 Einheiten, bei der
2. Immunisierung 1.870 Einheiten und bei der
3. Immunisierung 1.400 Einheiten. Für GM-CSF lagen die Werte pro Vakzine und Maus bei 14 ng, 9 ng und 22 ng. Die Versuchsgruppen setzten sich aus je 10 Tieren zusammen, wobei die Tiere der ersten Gruppe mit je 1 x 105
M3-Zellen, die mit dem Vektor pWS2m transfiziert und bestrahlt waren, immunisiert wurden. Die Tiere der zweiten Gruppe wurden mit je 1 x 105 M3-Zellen, die mit dem Vektor pWE-Gm transfiziert und bestrahlt waren, immunisiert. Die erste Kontrollgruppe wurde mit 1 x 105 bestrahlten, jedoch nicht transfizierten, M3-Zellen behandelt. Die zweite Kontrollgruppe erhielt als
Kontrolle zur Tumorentwicklung 5 x 103 M3-Zellen. Die Tiere wurden über einen Zeitraum von mehr als 4 Monaten beobachtet. Es zeigte sich, daß in den beiden Gruppen, die als Tumorvakzin ein Zytokin exprimierende Zellen erhalten hatten, 80 % der Tiere vor einer
Tumorentwicklung geschützt waren. In der ersten
Kontrollgruppe entwickelten alle Tiere innerhalb von 8 Wochen Tumore. In der zweiten Kontrollgruppe entwickelten alle Tiere bis auf eines Tumore.
Beispiel 17 Wirksamkeit der Tumorvakzine in Abhängigkeit von der Zytokindosis im prophylaktischen Mausmodell
In diesem Beispiel wurde hinsichtlich der verwendeten Transfektionskomplexe, der Züchtung der Zellen und der Durchführung der Transfektionen vorgegangen, wie in Beispiel 8 beschrieben. Es wurden DBA/2 Mäuse und
M3 Melanomzellen verwendet. Die verwendeten Zytokin- Plasmide waren dieselben wie in Beispiel 16. Die
Immunisierung wurde vorgenommen, wie in Beispiel 8 beschrieben, für das Setzen des Tumors ("Challenge") wurden im Unterschied zu Beispiel 8 statt 1 x 105 Zellen 3 x 105 Zellen verwendet. Die Mischungsverhältnisse von transfizierten Zellen und von Zellen, die lediglich bestrahlt waren, sowie die Expressionswerte entsprachen denen von Beispiel 16. Die Tiere wurden nach der
Challenge 8 Wochen lang auf das Vorhandensein von Tumoren untersucht; das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 26 dargestellt.
Beispiel 18
Verwendung von endosomolytischen Peptiden zur Herstellung von Krebsvakzinen a) Synthese des Peptids INF5
Das Peptid der Bezeichnung INF5 (SEQ ID NO: 7) wurde mittels HBTU-Aktivierungsmethode synthetisiert (Knorr et al., 1989; 1 mmol Maßstab), wobei 230 mg TentaGel S-PHB Harz (Rapp Polymere; 0.27 mmol/g) als Festphase verwendet wurde. Die erste Aminosäure, die gekoppelt wurde, war N-α-N-ε-di-Fmoc-Lysin. Das ergab ein Kopf-anKopf-Dimeres, mit einem C-terminalen Lysin als
verbindende Aminosäure. (Es wurden die folgenden Seitenkettenschutzgruppen verwendet: (Trt)Asn, (Trt)Cys oder (t-Bu)Cys,
(t-Bu)Glu, (Trt)His, (t-Bu)Ser. Die Peptide wurden vom Harz gespalten und die Seitenschutzgruppen außer
(t-Bu)Cys durch Behandlung von 10 - 20 mg Peptid- beladenem Harz mit 1 ml einer Mischung
Trifloressigsäure/Wasser/Phenol/Thioanisol/ Ethanedithiol (10:0.5:0.75:0.5:0.25) 1.5 h bei Raumtemperatur
entfernt.) Für die Fällung des Peptids wurde die
Spaltmischung unter Rühren tropfenweise in 40 ml Ether pipettiert und die Mischung 1 h stehengelassen. Das rohe Peptid wurde mittels Zentrifugation erhalten,
anschließend wurde mit Ether gewaschen und unter Argon und abschließend im Hochvakuum getrocknet. b) Gentransfer in humane Melanomzellen mittels INF5 i) Expression des Luciferase-Reportergens
Zunächst wurden Vorversuche mit dem Reportergenkonstrukt pCMVL durchgeführt, wobei 1.5 μg TfpL290, 5 μg pL290, 40 μg INF5 und 3 μg pCMVL zur Herstellung von
Transfektionskomplexen verwendet wurden. In diesen
Komplexen war das Peptid ionisch an Polylysin gebunden. Die DNA-Komplexe wurden mit 0.5 ml RPMI 1640 (Gibco), enthaltend 10 % FCS, gemischt und auf M3-Melanomzellen aufgebracht (1 x 105 Zellen in 6-Well-Platten). Nach 4 h wurde das Medium durch frisches Medium ersetzt. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und auf Luciferaseaktivität untersucht. Es wurde eine Expression entsprechend 12,866.000 Lichteinheiten nachgewiesen. ii) Expression von humanem IL-2
Transfektionskomplexe, bestehend aus 3 μg pGShIL-2tet, 1.5 μg TfpL290, 5 μg pL290 und 40 μg INF5, wurden, wie in i) beschrieben, auf Melanomzellen aufgebracht. Einen und zwei Tage nach der Transfektion wurden die innerhalb von 24 h ins Kulturmedium sekretierten Mengen an IL-2 mittels ELISA-Assay (Biokine IL-2 Testkit, T Cell Diagnostics) gemessen. Die Werte betrugen am ersten Tag 6.500 BRMP- Einheiten, am zweiten Tag 11.500 BRMP-Einheiten, wobei eine Einheit 40 pg IL-2 entspricht. c) Testung von mittels INF5 transfizierten Tumorzellen als Tumorvakzine im prophylaktischen Melanom- Mausmodell
In diesem Versuch wurden Mäuse des Stammes C57BL/6J sowie B16-F10-Zellen verwendet. Es wurden zwei Immunisierungen mit je 1 x 105 Zellen im Abstand von 7 Tagen
durchgeführt; 7 Tage nach der letzten Immunisierung wurde die Challenge (1 x 105 Zellen) gesetzt. Die Krebsvakzine wurden unter Verwendung eines Transfektionskomplexes, bestehend aus 6 μg pWS-Gm-DNA, 3 μg TfpL, 10 μg pL und 40 μg INF5 hergestellt. Es wurden Tumorvakzine
eingesetzt, die unterschiedliche Mengen von GM-CSF- Plasmid tragenden Zellen enthielten, wobei die
Mischungsverhältnisse von bestrahlten, transfizierten Zellen und von Zellen, die lediglich bestrahlt waren, dieselben waren, wie in Beispiel 16 beschrieben. Das Ergebis mit Tumorvakzinen, die mittels INF-5
transfizierte Zellen enthielten, ist in Fig. 27
dargestellt. Es zeigte sich eine Schutzwirkung gegen Tumorbildung bei der hohen und mittleren GM-CSF- Dosierung.
Beispiel 19
Interleukin-Expression in humanen Melanomzellen 3 x 105 Melanomzellen wurden eine Woche nach ihrer operativen Entnahme in 6 cm Zellkulturschalen mit
2 ml Transfektionskomplex (0.5 ml Ausgangslösung, enthaltend biotinyliertes 8-Methoxypsoralen/UV- inaktiviertes Adenovirus (0.54 x 1012 Partikel/ml), 100 ng/μl Streptavidin-Polylysin, 6 μg Plasmid-DNA pGShIL-2tet, 1 μg/μl TfpL, in HBS, verdünnt mit 1.5 ml Medium) transfiziert. Die Versuche wurden mit bestrahlten (100 Gy) und nicht-bestrahlten Zellen durchgeführt. Die IL-2-Werte wurden nach den in Fig. 28 angegebenen Zeiten gemessen; die IL-2-Werte beziehen sich auf 106 Zellen und 24 h.
Beispiel 20
Entwicklung einer galenischen Formulierung für die
Krebsvakzine
Ausgangsmaterial waren mit dem Plasmid pGShIL-2tet transfizierte und mit 100 Gy bestrahlte MM3- Melanomzellen; nach einer Inkubation von 20 h bei 37ºC wurden die Zellen trypsiniert und Zellzahl sowie
Viabilität mit Trypanblau bestimmt. Dann wurden die Zellen auf vier gleiche Gruppen aufgeteilt, um vier verschiedene Gefriermedien zu testen. Die vier
Probengruppen wurden vor dem Versetzen mit Gefriermedium in RPMI 1640 bei 800 rpm (120 g) zentrifugiert, die Zellpellets in 1 ml Gefriermedium gegeben. Nachdem
Aliquots für Bestimmung der Zellzahl und Viabilität entnommen worden waren, wurden die Proben sofort in das Gefriergerät gegeben und schonend unter Verwendung eines Temperaturgradientenprogramms (-1ºC/min) auf -100ºC eingefroren und in flüssigen Stickstoff transferiert. Als Gefriermedien wurden getestet: Medium 1 : 70 %% RPMI, 20 % FCS, 10 % DMSO; Medium 2: 20 % Humanserumalbumin, 10 % DMSO; Medium 3: 12 % HES (Hydroxyethylstärke), Ringerlösung (Leopold Pharma, Nr. 2870), 5 % DMSO;
Medium 4: 12 % HES in Ringerlösung.
Nach 38 Tagen wurden die Zellen aufgetaut und unmittelbar danach Zellzahl und Viabilität der Zellen mittels
Trypanblau bestimmt. Dann wurden die Proben in einem ersten Waschschritt mit dem entsprechenden Medium
(Gefriermedium ohne DMSO) sowie in einem zweiten und dritten Waschschritt mit Ringerlösung gewaschen,
zentrifugiert und in Ringerlösung resuspendiert. Dann wurden abermals Zellzahl und Viabilität der Zellen bestimmt. Des weiteren wurden Zellzahl und Viabilität nach 24 und nach 48 h bei 4ºC bestimmt. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Tabelle V dargestellt.
Von jeder Probengruppe (Medium 1 - 4) wurden außerdem je 300 μl mit 3 ml Komplettmedium in T25-Kulturflaschen gegeben und bei 37 ºC inkubiert; nach 24 und 48 h wurde Überstand für die Bestimmung der IL-2-Expression
(Probengruppe Medium 1) und die Bestimmung des Anteils der Zellen im Überstand entnommen. Von den weiteren
Proben, die zunächst in Ringerlösung bei 4ºC
stehengelassen worden waren, wurde nach 24 und 48 h ebenfalls jeweils ein Aliquot von 300 μl entnommen und, wie oben beschrieben, bei 37ºC bebrütet (IL-2-Bestimmung für Probengruppe Medium 1). Das Ergebnis dieser Versuche ("4º Galenik") ist in Tabelle VI dargestellt.
Beispiel 21
Einfluß des Endotoxingehaltes der DNA auf die Expression von IL-2 in primären humanen Melanomzellen In diesem Beispiel wurden die folgenden Materialien und Methoden verwendet: a) DNA-Präparation
Das Plasmid pGShIL-2tet wurde aus E.coli- Übernachtkulturen (gezüchtet in Gegenwart von 5 μg/ml Tetracyclin in LB-Medium) erhalten. b) Reinigung der Plasmid-DNA von Endotoxin
(Lipopolysaccarid) i) Triton X-114-Extraktion
Um ein homogenes Präparat des Detergens zu erhalten, wurde Triton X-114 (Sigma) drei 0ºC/30ºC- Temperaturzyklen, wie von Bordier, 1981, beschrieben, unterworfen. Die Extraktion der Lipopolysaccaride von der DNA-Probe wurde, in Abwandlung publizierter Methoden (Aida und Pabst, 1990; Manthorpe et al., 1993) wie folgt durchgeführt: Die DNA-Probe (0.5 - 1.5 mg/ml in 10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 (TE)) wurde auf
0.3 M Natriumacetat (pH 7.5) gebracht. Dann wurde
3 μl Triton X-114 pro 100 μl DNA-Lösung beigegeben, die Proben in einem Vortex kräftig gemischt und 10 min auf Eis inkubiert. Damit sich die beiden Phasen trennen können, wurden die Proben 5 min bei 30ºC aufbewahrt, in einer vorgewärmten Eppendorf-Zentrifuge 2 min bei
2.000 rpm zentrifugiert und die wässerige Phase in ein frisches Eppendorf-Röhrchen gegeben. Diese Extraktion wurde noch zweimal durchgeführt und die schließlich erhaltene wässerige Phase mit 0.6 Volumina Isopropanol bei Raumtemperatur gefällt, das Präzipitat mittels
Zentrifugation gewonnen, zweimal mit 80 % Ethanol gewaschen, luftgetrocknet, in TE wieder aufgenommen und die Menge bestimmt. Dazu wurde die Probe mit RNase A, Proteinase K, Phenol/Chloroform und Chloroform behandelt, wieder gefällt und das endgültige DNA-Pellet in TE suspendiert und die Absorption bei 260 nm bestimmt, wobei von der Annahme ausgegangen wurde, daß eine Konzentration von 0.05 mg/ml DNA den Absorptionswert 1 hat. ii) Polymyxin-Chromatographie
Ein Volumen Polymyxinharzschlamm (Affi-Prep-Polymyxin, Biorad), das dem Volumen der DNA-Probe entsprach, wurde kurz mit drei Volumina 0.1 N NaOH versetzt, anschließend wurde dreimal mit fünf Harzvolumina TE gewaschen. Das pelletierte Harz wurde mit den DNA-Proben (in TE 0.8 - 1.2 mg/ml ) wieder aufgenommen und die Mischung über Nacht bei 4ºC gerührt. Dann wurde die Probe auf eine mit
0.1 NaOH vorbehandelte Wegwerfsäule gegeben und mit TE gewaschen. Das Eluat wurde gesammelt, das Harz mit einem weiteren Volumen TE gewaschen und das Eluat mit der
Waschflüssigkeit vereinigt. Die DNA dieser gepoolten Probe wurde mit 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5 und 2 Volumen Ethanol gefällt. Die Weiterbehandlung des
Präzipitats und die DNA-Bestimmung wurden durchgeführt, wie oben beschrieben. c) Zellkultur
Primäre humane Melanomzellen wurden isoliert und in RPMI 1640-Medium (Gibco/BRL), ergänzt mit 100 I.U./ml
Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 1 % Natriumpyruvat und 10 % hitzeinaktiviertem FCS, kultiviert. d) Endotoxin-Assay
Der Lipopolysaccaridgehalt wurde mit dem chromogenen Limulus-Assay, der auf der Limulus-Gerinnungsreaktion von Amöbozyten beruht (Iwanaga, 1993; erhältlich bei
BioWhittaker QCL-1000), durchgeführt. Vor der
Versuchsdurchführung wurden alle verwendeten biologischen Materialien und Reagenzien auf Lipopolysaccarid-Freiheit (<0.1 Endotoxineinheiten (EU)/50 μl Lösung) getestet. e) Herstellung von Transfektionkomplexen
Ternäre Komplexe aus Transferrin-Polylysin, Streptavidin- Polylysin und biotinyliertem, 8-Methoxypsoralen/UV- inaktiviertem Adenovirus d11014 (8 μl, 1 x 1012
Partikel/ml), sowie Plasmid-DNA (6 μg, verdünnt in 100 μl mit dem jeweils angegebenen Lipopolysaccaridgehalt) wurden hergestellt, wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben.
Primäre humane Melanomzellen der Bezeichnung H225
(2 x 105 Zellen/6 cm Kulturschale) wurden mit 6 μg des nach verschiedenen Methoden gereinigten Plasmids, entsprechend den Angaben in Fig. 29, transfiziert. Der Endotoxingehalt der Plasmidpräparation vor der Reinigung ist in der Fig. jeweils als dunkel schraffierter Balken dargestellt. Nach der Reinigung mittels Polymyxinharz oder Extraktion mit Triton X-114 enthielten alle
Präparate weniger als 0.1 EU Lipopolysaccarid/6 μg DNA. Der IL-2-Gehalt wurde mittels ELISA (T Cell Diagnostics Inc., Cambridge, MA USA) im Zeilüberstand gemessen, die in der Fig. angegebenen Werte bedeuten Einheiten/106 Zellen und 24 h.
Im Rahmen dieses Beispiels wurden außerdem Versuche durchgeführt, die zeigten, daß der durch Zusatz von LPS zu gereinigter DNA bedingte Expressionsabfall zumindest teilweise aufgehoben werden kann, wenn dem Medium
Polymyxin beigefügt wurde. Beispiel 22
Induktion einer systemischen Immunantwort durch
Immunisierung mit zytokintransfizierten, bestrahlten Colonkarzinomzellen ("Prophylaktisches
Colonkarzinommodell")
In diesem Beispiel wurde hinsichtlich der verwendeten Transfektionskomplexe, der Züchtung der Zellen der Durchführung der Transfektionen vorgegangen, wie in Beispiel 8 beschrieben, wobei hinsichtlich der
eingesetzten Zytokin-DNA und deren Dosierung sowie der Kontrollen (Leervektor, nur bestrahlte Zellen) dem
Protokoll von Beispiel 16 gefolgt wurde; die in Fig.30 verwendeten Bezeichnungen entsprechen denen von Beispiel 16 und Fig. 25. Es wurden Zellen einer
Colonkarzinomzellinie der Bezeichnung CT 26 verwendet, deren Etablierung von Brattain et al., 1988, beschrieben wurde. Als Versuchstiere dienten Mäuse vom Stamm BALB/c. Für die beiden Immunisierungen wurden jeweils 1 x 105 Zellen verwendet, die Challenge wurde mit 3 x 105 Zellen gesetzt, n Tabelle VII sind die Expressionswerte in 24 h für IL-2 (Einheiten/Maus), IFN-gamma und GM-CSF (jeweils ng/Maus) angegeben, sekretiert zwischen
Bestrahlung der Zellen und Injektion
(1.Immunisierung/2.Immunisierung). Fig. 30 zeigt die Schutzwirkung der Colonkarzinom-Tumorvakzine vor
Tumorbildung.
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SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Boehringer Ingelheim International GmbH
(B) STRASSE: Binger Strasse 173
(C) ORT: Ingelheim am Rhein
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: D-55216
(G) TELEPHON: 06132/772822
(H) TELEFAX: 06132/774377
(I) TELEX: 4187910 bi d
(ii) ANMELDETITEL: Verfahren zur Herstellung von krebsvakzinen
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 7
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 1664 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRAMGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Rabies virus
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: 5'UTR
(B) LAGE: 1..6
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 7..1581
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: sig_peptide
(B) LAGE: 7..63 ( ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_peptide
(B) LAGE: 64. .1578
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
TCTAAT ATG GTT CCT CAG GCT CTC CTG TTT GTA CCC CTT CTG GTT TTT 48 Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phs Val Pro Leu Leu Val Phe
-19 -15 -10
CCA TTG TGT TTT GGG AAA TTC CCT ATT TAC ACG ATC CCA GAC AAG CTT 96
Pro Leu Cys Pte Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu -5 1 5 10
GGT CCC TGG AGC CCG ATT GAC ATA CAT CAC CTC AGC TGC CCA AAC AAT 144 Gly Pro Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn
15 20 25
TTG GTA GTG GAG GAC GAA GGA TGC ACC AAC CTG TCA GGG TTC TCC TAC 192 Leu Val Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr
30 35 40
ATG GAA CTT AAA GTT GGA TAC ATC TTA GCC ATA AAA ATG AAC GGG TTC 240 Met Glu Leu Lys Val Gly Tyr Ile Leu Ala Ile Lys Met Asn Gly Phe
45 50 55
ACT TGC ACA GGC GTT GTG ACG GAG GCT GAA ACC TAC ACT AAC TTC GTT 288 Thr Cys Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val 60 65 70 75
GGT TAT GTC ACA ACC ACG TTC AAA AGA AAG CAT TTC CGC CCA ACA CCA 336 Gly Tyr Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro
80 85 90
GAT GCA TGT AGA GCC GGG TAC AAC TGG AAG ATG GCC GGT GAC CCC AGA 384 Asp Ala Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg
95 100 105
TAT GAA GAG TCT CTA CAC AAT CCG TAC CCT GAC TAC CGC TGG CTT CGA 432 Tyr Glu Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr Arg Trp Leu Arg
110 115 120
ACT GTA AAA ACC ACC AAG GAG TCT CTC GTT ATC ATA TCT CCA AGT GTA 480 Thr Val Lys Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val
125 130 135
GCA GAT TTG GAC CCA TAT GAC AGA TCC CTT CAC TCG AGG GTC TTC CCT 528 Ala Asp Leu Asp Pro Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro 140 145 150 155
AGC GGG AAG TGC TCA GGA GTA GCG GTG TCT TCT ACC TAC TGC TCC ACT 576 Ser Gly Lys Cys Ser Gly Val Ala Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr
160 165 170 AAC CAC GAT TAC ACC ATT TGG ATG CCC GAG AAT CCG AGA CTA GGG ATG 624 Asn His Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met
175 180 185
TCT TCT GAC ATT TTT ACC AAT AGT AGA GGG AAG AGA GCA TCC AAA GGG 672 Ser Cys Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly
190 195 200
AGT GAG ACT TGC GGC TTT GTA GAT GAA AGA GGC CTA TAT AAG TCT TTA 720 Ser Glu Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu
205 210 215
AAA GGA GCA TGC AAA CTC AAG TTA TGT GGA GTT CTA GGA CTT AGA CTT 768 Lys Gly Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu 220 225 230 235
ATG GAT GGA ACA TGG GTC GCG ATG CAA ACA TCA AAT GAA ACC AAA TGG 816 Met Asp Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp
240 245 250
TGC CCT CCC GAT CAG TTG GTG AAC CTG CAC GAC TTT CGC TCA GAC GAA 864
Cys Pro Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu
255 260 265
ATT GAG CAC CTT GTT GTA GAG GAG TTG GTC AGG AAG AGA GAG GAG TGT 912 Ile Glu His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Arg Lys Arg Glu Glu Cys
270 275 280
CTG GAT GCA CTA GAG TCC ATC ATG ACA ACC AAG TCA GTG AGT TTC AGA 960 Leu Asp Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg
285 290 295
CGT CTC ACT CAT TTA AGA AAA CTT GTC CCT GGG TTT GGA AAA GCA TAT 1008 Arg Leu Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr 300 305 310 315
ACC ATA TTC AAC AAG ACC TTG ATG GAA GCC GAT GCT CAC TAC AAG TCA 1056 Thr Ile Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser
320 325 330
GTC AGA ACT TGG AAT GAG ATC CTC CCT TCA AAA GGG TGT TTA AGA GTT 1104 Val Arg Thr Trp Asn Glu Ile Leu Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val
335 340 345
GGG GGG AGG TGT CAT CCT CAT CTG AAC GGG GTG TTT TTC AAT GCT ATA 1152 Gly Gly Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile
350 355 360
ATA TTA GGA CTT GAC GGC AAT GTC TTA ATC CCA GAG ATG CAA TCA TCC 1200 Ile Leu Gly Pro Asp Gly Asn Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser
365 370 375
CTC CTC CAG CAA CAT ATG GAG TTG TTG GAA TCC TCG GTT ATC CCC CTT 1248 Leu Leu Gln Gln His Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu 380 385 390 395 GTG CAC CCC CTG GCA GAC CCG TCT ACC GTT TTC AAG GAC GGT GAC GAG 1296
Val His Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp Glu
400 405 410
GCT GAG GAT TTT GIT GAA GTT CAC CTT CCC GAT GTG CAC AAT CAG GTC 1344
Ala Glu Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Asn Gln Val
415 420 425
TCA GGA GTT GAC TTG GGT CTC CCG AAC TGG GGG AAG TA T GTA TTA CTG 1392
Ser Gly Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu
430 435 440
AGT GCA GGG GCT CTG ACT GCC TTG ATG TTG ATA ATT TTC CTG ATG ACA 1440 Ser Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr
445 450 455
TGT TGT AGA AGA GTC AAT CGA TCA GAA CCT ACG CAA CAC AAT CTC AGE 1488 Cys Cys Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg
460 465 470 475
GGG ACA GGG AGG GAG GTG TCAGTC ACT CCC CAA AGC GGG AAG ATC ATA 1536 Gly Thr Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile
480 485 490
TCT TCA TGG GAA TCA CAC AAG AGT GGG GCT GAG ACC AGA CTG TGAGGACTGG 1588 Ser Ser Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu
495 500 505
CCGTCCTTTC AACGATCCAA GTCCTGAAGA TCACCTCCCC TTGGGGGGTT CTTTTTGAAA 1648
AAAAAAAAAA AAAAAA 1664
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 524 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPODOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu
-19 -15 -10 -5
Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro
1 5 10
Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val
15 20 25
Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu 30 35 40 45
Leu Lys Val Gly Tyr Ile Leu Ala Ile Lys Met Asn Gly Phe Thr Cys
50 55 60
Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr
65 70 75
Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala
80 85 90
Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu 95 100 105
Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr Arg Trp Leu Arg Thr Val 110 115 120 125
Lys Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp
130 135 140
Leu Asp Pro Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Ser Gly
145 150 155
Lys Cys Ser Gly Val Ala Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His
160 165 170
Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met Ser Cys 175 180 185
Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Ser Glu 190 195 200 205
Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly
210 215 220
Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp
225 230 235
Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp Cys Pro
240 245 250
Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu 255 260 265
His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Arg Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp 270 275 280 285
Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu
290 295 300
Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile
305 310 315
Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg
320 325 330 Thr Trp Asn Glu Ile Leu Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly 335 340 345
Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu 350 355 360 365
Gly Pro Asp Gly Asn Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu
370 375 380
Gln Gln His Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu Val His
385 390 395
Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp Glu Ala Glu
400 405 410
Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Asn Gln Val Ser Gly
415 420 425
Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu Ser Ala 430 435 440 445
Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Cys
450 455 460
Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr
465 470 475
Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser
480 485 490
Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu
495 500 505
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM.: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: 5'UTR
(B) LAGE: 1..24
( xi ) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
GTCAACAGOG CACCC ACTTC AAGC 24 .2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nuklein säure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: 5'UTR
(B) LAGE: 1..24
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
GCTTGTTGAG ATGATGCTTT GACA 24
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: 5'UTR
(B) LAGE: 1..21
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
GGTCCTGTGT CTGAACCTGA G 21
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: CDNS
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: 5'UTR
(B) LAGE: 1..21 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
TTATGGCCTG GGGCGTTTAC A 21
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 41 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptide
(B) LAGE: 1..41
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 17
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note= "Xaa ist Nie"
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 25
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note= "Xaa ist Nie"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15
Xaa Ile Asp Gly Lys Gly Asp Ile Xaa Gly Glu Trp Gly Asn Glu Ile
20 25 30
Phe Gly Glu Ile Ala Glu Phe Leu Gly
35 40

Claims

Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung von Krebsvakzinen, die autologe Tumorzellen enthalten, dadurch
gekennzeichnet, daß man Tumorzellen oder
Fibroblasten kultiviert und die kultivierten Zellen ex vivo mit einer Zusammensetzung transfiziert, die folgende Komponenten enthält: ai) ein DNA-Molekül, das eine oder mehrere in der Zelle exprimierbare Sequenzen enthält, die für ein oder mehrere, gleiche oder verschiedene,
immunstimulierende Polypeptide kodieren, oder mehrere DNA-Moleküle, enthaltend für verschiedene immunstimulierende Polypeptide kodierende Sequenzen; aii) gegebenenfalls ein weiteres DNA-Molekül, das frei ist von Sequenzen, kodierend für ein in der zu transfizierenden Zelle funktioneil aktives
Polypeptid; b) ein Konjugat zwischen einem DNA-bindenden
Molekül und einem endosomolytisch wirkenden Mittel, ausgewählt aus der Gruppe
i) Adenovirus, das eine Mutation zumindest in der
E4-Region aufweist,
ii) Adenovirus, das neben einem Effekt in der E1A-
Region einen oder mehrere weitere genetische
Defekte aufweist, oder
iii) endosomolytisch wirkendes Peptid; gegebenenfalls
c) ein DNA-bindendes Molekül, vorzugsweise
konjugiert mit einem Internalisierungsfaktor, der an ein Oberflächenmolekül der zu transfizierenden
Zellen bindet und in diese internalisiert wird; wobei die Komponenten b) und c) mit der in a) definierten DNA einen im wesentlichen
elektroneutralen Komplex bilden, daß man die transfizierten Zellen derart
inaktiviert, daß sie unter Beibehaltung ihrer Fähigkeit zur Expression der in ai) definierten DNA ihre Fähigkeit zur Teilung verlieren, wobei man im Falle der Transfektion von Fibroblasten diese mit nichttransfizierten sowie inaktivierten Tumorzellen mischt, und daß man die Zellpopulation gegebenenfalls mit pharmazeutisch annehmbaren Hilfs- und Trägerstoffen mischt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA ein
Expresssionsplasmid ist, das eine oder mehrere für ein Zytokin kodierende Sequenz(en) enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA die für humanes Interleukin 2 kodierende Sequenz enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA die für humanes IFN-γ kodierende Sequenz enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als in ai) definierte DNA zwei Plasmide eingesetzt werden, von denen eines die für humanes Interleukin 2 und eines die für IFN-γ kodierende Sequenz enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA die für humanen
Granulozyten-Makrophagen-Kolonien-stimulierenden Faktor (GM-CSF) kodierende Sequenz enthält.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA ein Expressionsplasmid ist, das eine oder mehrere für ein co-stimulierendes Molekül kodierende Sequenz(en) enthält.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eine für das Heat Stable Antigen kodierende Sequenz enthält.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA ein Expressionsplasmid ist, das eine oder mehrere für ein Neoantigen kodierende Sequenz(en) enthält.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Neoantigen ein Virusprotein oder ein
Fragment davon ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Virusprotein das Rabies-Glykoprotein ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich als in aii)
definiertes DNA-Molekül ein Plasmid eingesetzt wird, das frei ist von Sequenzen, kodierend für ein in der zu transfizierenden Zelle funktioneil aktives
Polypeptid.
13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als DNA-bindendes Molekül b) und
gegebenenfalls c) ein Polylysin, vorzugsweise einer Kettenlänge von ca. 200 bis 300 Lysinresten, eingesetzt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Polylysin in c) mit humanem Transferrin als Internalisierungsfaktor konjugiert ist.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Polylysin in c) mit humanem EGF als
Internalisierungsfaktor konjugiert ist.
16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Komponente b) ein Konjugat eingesetzt wird, das ein Adenovirus mit einem Defekt zumindest in der E4-Region enthält.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß als E4-Mutante das Adenovirus der Bezeichnung d11014 eingesetzt wird.
18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Komponente b) ein Konjugat eingesetzt wird, das ein Adenovirus mit einem Defekt in der E1a- Region, das zusätzlich mittels Psoralen/UV
inaktiviert wurde, enthält.
19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Komponente b) ein Konjugat eingesetzt wird, das ein Adenovirus enthält, das mittels
ß-Propiolacton inaktiviert wurde.
20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Komponente b) ein Konjugat eingesetzt wird, in dem das Peptid der Sequenz SEQ ID NO: 7 ionisch an Polylysin gebunden ist.
21. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die transfizierten Zellen mit Röntgen- oder Gammastrahlen inaktiviert werden.
22. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen Melanomzellen sind.
23. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen Colonkarzinomzellen sind.
24. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Fibroblasten transfiziert und inaktiviert werden.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Fibroblasten autologe Fibroblasten sind.
26. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Fibroblasten Zellen einer
Fibroblastenzellinie sind.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26,
dadurch gekennzeichnet, daß die transfizierten und inaktivierten Fibroblasten mit autologen
inaktivierten Tumorzellen gemischt werden.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen Melanomzellen sind.
29. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen Colonkarzinomzellen sind.
30. Krebsvakzine, erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 29.
31. Transfektionskomplex zuer Herstellung von
Krebsvakzinen, dadurch gekennzeichnet, daß er folgende Komponenten enthält: ai) ein DNA-Molekül, das eine oder mehrere in der Zelle exprimierbare Sequenzen enthält, die für ein oder mehrere, gleiche oder verschiedene,
immunstimulierende Polypeptide kodieren, oder mehrere DNA-Moleküle, enthaltend für verschiedene immunstimulierende Polypeptide kodierende Sequenzen; aii) gegebenenfalls ein weiteres DNA-Molekül, das frei ist von Sequenzen, kodierend für ein in der zu transfizierenden Zelle funktioneil aktives
Polypeptid; b) ein Konjugat zwischen einem DNA-bindenden
Molekül und einem endosomolytisch wirkenden Mittel, ausgewählt aus der Gruppe i) Adenovirus, das eine Mutation zumindest in der
E4-Region aufweist,
ii) Adenovirus, das neben einem Effekt in der E1A-
Region einen oder mehrere weitere genetische
Defekte aufweist, oder
iii) endosomolytisch wirkendes Peptid; gegebenenfalls
c) ein DNA-bindendes Molekül, vorzugsweise
konjugiert mit einem Internalisierungsfaktor, der an ein Oberflächenmolekül der zu transfizierenden
Zellen bindet und in diese internalisiert wird, wobei die Komponenten b) und c) mit der in a) definierten DNA einen im wesentlichen
elektroneutralen Komplex bilden.
32. Komplex nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA ein Expressionsplasmid ist, das eine oder mehrere für ein Zytokin
kodierende Sequenz(en) enthält.
33. Komplex nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA die für humanes
Interleukin 2 kodierende Sequenz enthält.
34. Komplex nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA die für humanes IFN-γ kodierende Sequenz enthält.
35. Komplex nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA die für humanen GM-CSF kodierende Sequenz enthält.
36. Komplex nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA aus zwei Plasmiden besteht, von denen eines die für humanes Interleukin 2 und eines die für IFN-γ kodierende Sequenz
enthält.
37. Komplex nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA ein Expressionsplasmid ist, das eine oder mehrere für ein co-stimulierendes Molekül kodierende Sequenz(en) enthält.
38. Komplex nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eine für das Heat Stable Antigen kodierende Sequenz enthält.
39. Komplex nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA ein Expressionsplasmid ist, das eine oder mehrere für ein Neoantigen kodierende Sequenz(en) enthält.
40. Komplex nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß das Neoantigen ein Virusprotein oder ein
Fragment davon ist.
41. Komplex nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß das Virusprotein das Rabies-Glykoprotein ist.
42. Komplex nach einem der Ansprüche 31 bis 41, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich als in aii) definiertes DNA-Molekül ein Plasmid enthält, das frei ist von Sequenzen, kodierend für ein in der zu transfizierenden Zelle funktioneil aktives
Polypeptid.
43. Komplex nach einem der Ansprüche 31 bis 42, dadurch gekennzeichnet, daß die in ihm enthaltene DNA weitestgehend frei ist von Lipopolysacchariden.
44. Komplex nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß er als DNA-bindendes Molekül b) und
gegebenenfalls c) ein Polylysin, vorzugsweise einer Kettenlänge von ca. 200 bis 300 Lysinen, enthält.
45. Komplex nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß das Polylysin in c) mit humanem Transferrin als Internalisierungsfaktor konjugiert ist.
46. Komplex nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß das Polylysin mit humanem EGF als
Internalisierungsfaktor konjugiert ist.
47. Komplex nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß er als Komponente b) ein Konjugat enthält, das ein Adenovirus mit einem Defekt zumindest in der E4- Region aufweist.
48. Komplex nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß er als E4-Mutante das Adenovirus der Bezeichnung d11014 enthält.
49. Komplex nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß er als Komponente b) ein Konjugat enthält, das ein Adenovirus enthält, das mittels ß-Propiolacton inaktiviert wurde.
50. Komplex nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß er als Komponente b) ein Konjugat enthält, das ein Adenovirus mit einem Defekt in der E1a-Region, das zusätzlich mittels Psoralen/UV inaktiviert wurde, enthält.
51. Komplex nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß er als Komponente b) ein Konjugat enthält, in dem das Peptid der Sequenz SEQ ID NO: 7 ionisch an Polylysin gebunden ist.
52. Humane Tumorzellen, transformiert mit einem der in einem der Ansprüche 31 bis 51 definierten Komplexe.
53. Humane Fibroblasten, transformiert mit einem der in einem der Ansprüche 31 bis 51 definierten Komplexe.
54. Fibroblasten nach Anspruch 53 in Mischung mit
humanen Tumorzellen.
55. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend Zellen nach Anspruch 52 oder 54 und pharmazeutisch annehmbare Nähr- und Hilfsstoffe.
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