CZ241795A3 - Process for preparing a vaccine against malignant tumors and a complex for transfection - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby vakcíny proti zhoubným nádorům a komplexu pro transfekci pro výrobu této vakcíny. Vakcína je určena k léčení zhoubných nádorů.

Dosavadní stav techniky

V posledních dvaceti letech nedošlo k žádnému převratnému vývoji v léčení zhoubných nádorů. Až při zjištění možného použití tak zvaných vakcín proti zhoubným nádorům bylo možno předpokládat podstatný pokrok v tomto oboru.

U nemocných se zhoubnými nádory má imunitní systém velký vliv na vývoj nádorů a na prognózu onemocnění. U nemocných se zhoubným melanomem může imunologická odpověď vést k 0,5 % nemocných až k úplnému vymizení nádoru. U většiny nemocných je však možno pozorovat v časných stádiích vzniku nádoru odpověď imunitního systému, při níž dochází ke zbrzdění vývoje nádoru, avšak nedochází ke zničení všech nádorových buněk. V pokročilých stádiích často dochází k situaci, že nádorové buňky způsobí specifickou inhibici imunitního systému (Hoon a další, 1990). Bylo navrhováno podávat nemocným po chirurgickém odstranění primárního nádoru vakcínu proti nádoru. Vakcína proti nádoru obsahuje geneticky modifikované nádorové buňky nebo nádorové buňky v kombinaci s imunostifliulačními pomocnými prostředky, které u nemocného vyvolají nebo reaktivují imunitní odpověď (např. B. Hoon a další, 1990, Bystryn a další, 1990 a 1992, Berd a další, 1990, Fearon a další, 1990, Lotze a další, 1992, Perdoll, 1992, Rosenberg a další, 1992, Schirrmacher, 1990).

Geny, použité pro transfekci nádorových buněk tak, aby se nádorové buňky staly silněji imunogenními a v důsledku toho méně schopnými vytvořit nádor spadají do tří skupin:

1) Geny, které jsou kódem pro bílkoviny, které v nádorových buňkách chybí (tak zvané cizorodé antigeny nebo neoantigeny). Tím vyvolaná tzv. xenogenizace může být dosažena například expresí syngenetického MHC-I-antigenu v MHC-I-deficientních nádorových buňkách, expresí allogenetického MHC-I- nebo MHC-II-antigenu nebo expresí virových bílkovin, například hemaglutininu (Itaya a další, 1987, Fearon a další, 1988, Plaksin a další, 1988 a Ostrand-Rosenberg a další, 1990).

2) Cytokingeny: exprese těchto genů, například interleukinu-II nebo interferonu nebo CSF, to znamená faktoru pro stimulaci tvorby kolonií slouží k aktivaci imunitního systému, čímž dochází k tomu, že nádorové buňky jsou rozpoznány jako cizorodé a zničeny.

3) Geny, které jsou kódovými geny pro tak zvané pomocné bílkoviny nebo pomocné stimulační molekuly. Poslední výzkumy v imunologii ukázaly, že účinná stimulace T-buněk a také aktivace receptorú T-buněk i aktivace druhého receptorú na T-buňkách vyžaduje určité molekuly na povrchu buněk, prezentujících antigen (Jenkins a Johnson, 1993). Dvojice B7/CD28 představuje takovou jednotku pomocné stimulační molekuly. Exprese B7 na melanomových buňkách stimuluje imunitní odpověď buněk, které za obvyklých podmínek nejsou imunogenní (Basker a další, 1993, Chen a další, 1992, Townsens a Allison, 1993, Schwartz, 1992). Antigen, stálý za tepla HSA k jehož expresi dochází například v dendritických buňkách a v B-buňkách sleziny má rovněž pomocnou stimulační účinnost (Liu a další, 1992a a 1992b) a může spolupůsobit při příznivém ovlivnění růstu T-buněk. Jednou z vlastností pomocných stimulačních molekul, například B7 může být skutečnost, že tyto molekuly mohou přenášet na nádorové buňky vlastnosti buněk, prezentujících antigen

Imunitní odpovědí na základě transfekce nádorových bruněk genem z uvedené skupiny je možno dosáhnout toho, že po odstranění hlavního nádoru dojde k rozrušení mikrometastáz, které až dosud nejsou klinicky prokazatelné a z tohoto důvodu nemohou být chirurgicky odstraněny, čímž se brání výskytu dalších nádorů.

Léčení na bázi uvedeného typu vakcíny představuje na rozdíl od nespecifické stimulace imunitního systému aktivní specifickou imunotherapii očkovacím materiálem z inaktivovaných nádorových buněk nebo jejich částí, s výhodou buněk, odebraných přímo nemocnému, čímž dochází k mobilizaci imunitního systému nemocného cíleně proti antigenů uvedeného nádoru nebo alespoň proti nádorům téhož typu.

Jakmile bylo prokázáno, že inaktivace nádorových buněk může vést ke snížení imunitní odpovědi, byly v poslední době vyvinuty vakcíny proti nádorům, obsahující životaschopné nádorové buňky (Rosenberg a další, 1992). Z bezpečnostních důvodů je vsak žádoucí, aby očkovací materiál neobsahoval buňky, schopné dalšího dělení, nýbrž buňky s omezenou životností.

Kritickým stupněm při výrobě vakcíny proti zhoubným nádorům je přenos genu do buněk, které mají tvořit složku takové vakcíny.

Až dosud se pro přenos genu do buněk, mimo jiné do buněk pro použití ve vakcínách proti nádorům obvykle užívá rekombinantních retrovirových vektorů. Tento postup byl navržen v publikaci Rosenberg a další, 1992. Použití retrovirů je však problematické vzhledem k tomu, že alespoň v malém procentu dochází ke vzniku vedlejších účinků, například k infekci použitým virem. Mimoto je možno přenos uskutečnit pouze do buněk, které se ještě dělí. Dále je možno použít také rekombinantní adenoviry, které představují alternativu k použití retrovirů. I toto použití má svá omezení vzhledem k velikosti a konstrukci DNA, která má být použita pro transfekci.

V poslední době se ve větším počtu publikací navrhuje použití nerekombinantních adenovirů vzhledem k jejich schopnosti uvolnit obsah endosomů, což je vhodné pro přenos genů s obsahem komplexu DNA pomocí endocytozy, zprostředkované přes receptor. Při použití adenovirů dochází ke vzestupu účinnosti přenosu genů vzhledem k tomu, že je možno zabránit odbourání DNA komplexu v buňce uložením do lysosomu (Curiel a další, 1991, Curiel a další, 1992a, Zatloukal a další, 1992, Cotten a další, 1992, Wagner a další, 1992, Curiel a další, 1992b). Mimo jiné se navrhuje modifikovat adenoviry vazbou na polylysin. Konjugáty adenovirů a polylysinu je možno použít spolu s konjugáty transferrinu a polylysinu ke tvorbě komplexu s DNA, čímž vznikají ternární komplexy transferrin/ polylsin/adenovirus-polylysin/DNA (Wagner a další, 1992). Komplexy jsou schopné se vázat na cílové buňky v místě receptoru pro transferin a pro adenovirus. Po endocytose způsobí adenovirus rozrušení endosomů, čímž dojde k uvolnění materiálu z endosomů do cytoplasmy. Tímto způsobem se DNA dostává do buněčného jádra, kde může dojít k expresi genů převážně z episomálně lokalizované DNA. Tato technika má ve srovnání s běžným použitím metod s využitím viru nebo jiných postupů následující výhody:vzhledem k tomu, že v této metodě je adenovirus pouze prostředkem pro uvolnění komplexu pro transfekci z endosomu, je možno virus inaktivovat pomocí genetických a/nebo chemických postupů, popřípadě v kombinaci s fyzikálními metodami, což zvyšuje bezpečnost ve srovnání s běžnými postupy s použitím virů (Cotten a další, 1992). Mimoto nedochází k transportu konstrukce genů na vnější straně viru a neběží tedy o součást genomu viru.

Z tohoto důvodu není zapotřebí vytvořit virové vektory a nedochází tedy k téměř žádnému omezení, pokud jde o velikost a sekvenci transportované DNA.

Další výhodou přenosu genu s využitím receptorů je v šířce použitelnosti, pokud jde o cílové buňky. Je například možno přenášet přes receptory pro transferin a/nebo adenovirus komplexy, obsahující konjugát transferinu a adenoviru. Místo transferinu je možno použít i jiné vazné řetězce, specifické pro určité populace buněk, například v případě buněk melanomu se ukázala jako velmi vhodná buněčná linie LDL. Při použití uvedeného systému je možno dosáhnout vysoké úrovně exprese genu u celé řady buněčných typů, a to 10 až lOOx vyšší exprese než pro buňky po transfekci retrovirem (Lotze a další, 1992 a Rosenberg a další, 1992 ) nebo pro buňky po stálé transfekci s použitím srážení působením fosforečnanu vápenatého (Fearon a další, 1990). Dále je možno do buněk přivést mnohočetné kopie konstrukce genu.

K transfekci je možno použít buněčný materiál, v němž se buňky dělí nebo nedělí. Expresi DNA, transportovaná do buněk je možno pozorovat u buněčných kultur se souvislou vrstvou buněk po zástavě růstu buněk po dobu několika měsíců (Zatloukal a další, 1992).

Kromě adenovirů a dalších virů, popřípadě fragmentů virů mají také určité peptidy schopnost rozrušit endosomy. Takové peptidy se označují jako endosomolytické nebo fusogenní peptidy a používají se k tomu účelu, aby bylo možno zvýšit expresi genu při přenosu genu endocytosou, zprostředkovanou přes receptory. Použití peptidů tohoto typu pro přenos genu bylo popsáno v mezinárodní patentové přihlášce WO 93/07283.

Při pokusech, prováděných s adenovirem dl312 se projevily problémy s toxicitou. Defekt replikace viru způsobený defektem v oblasti E1A mohl být buněčným materiálem po trans fekci částečně překonán. Mimoto nebyl výtěžek viru v buněčných liniích, schopných doplnit defekt Ad5 dl312 zcela dostatečně .

Vynález si klade za úkol navrhnout způsob výroby vakcíny proti zhoubným nádorům na základě zlepšeného systému pro přenos genu.

Podstata vynálezu

Vynález se týká způsobu výroby vakcíny proti zhoubným nádorům s obsahem autologních nádorových buněk. Tento postup spočívá v tom, že se pěstují nádorové buňky nebo fibroblasty a vypěstované buňky se podrobí ex vivo transfekci prostředkem, obsahujícím následující složky:

ai) molekulu DNA s obsahem jednoho nebo většího počtu řetězců, k jejichž expresi může v buněčném materiálu dojít, tyto řetězce jsou kódem pro jeden nebo větší počet stejných nebo různých imunostimulačních polypeptidů, nebo větší počet molekul DNA s obsahem kódových řetězců pro různé imunostimulační polypeptidy, aii) popřípadě další molekulu DNA, prostou kódových řetězců pro funkčně aktivní polypeptidy v buněčném materiálu, užitém pro transfekci, bi) konjugát mezi molekulou, na niž je vázána DNA a adenovirem s mutací alespoň v oblasti Ξ4 nebo bii) konjugát, v němž je iontově vázán peptid s endosomolytickým účinkem na molekulu, na niž je vázána DNA,

c) popřípadě molekulu, na niž je vázána DNA, s výhodou konjugací s internalizačním faktorem, schopným se vázat na molekulu na povrchu buněk při transfekci a tím molekulu DNA internalizovat, přičemž složky b) a c) vytvářejí s DNA, definovanou ve slož ce a) v podstatě elektroneutrální komplex, inaktivující buněčný materiál při transfekci takovým způsobem, že při udržení jejich schopnosti exprese DNA ve složce ai) ztrácejí schopnost dělení, přičemž v případě transfekci fibroblastů se fibroblasty mísí s inaktivovanými nádorovými buňkami bez transfekce a buněčná populace se popřípadě mísí s farmaceutickými pomocnými látkami a nosiči.

Konjugát b) bude dále v průběhu popisu přihlášky ozna čován jako endosomolytický konjugát.

Vakcína proti zhoubným nádorům, získaná způsobem podle vynálezu obsahuje ve srovnání s vakcínou podle publikace Rosenberg a další, 1992 inaktivované nádorové buňky, které jsou zcela neočekávaně plně účinné, pokud jde o vyvolání imunitní odpovědi. Tato skutečnost je pravděpodobně způsobena tím, že vzhledem k vysoké úrovni exprese imunostimulačního genu v buněčném materiálu po transfekci dochází k částečné kompenzaci inaktivace buněk, projevující se ztrátou antigenity.

Jako výchozí materiál pro výrobu vakcíny proti zhoubným nádorům, která je vyráběna individuálně pro každého jednotlivého nemocného se užívají autologní nádorové buňky, popřípadě ve směsi s fibroblasty. Fibroblasty mohou rovněž být autologní, je však také možno použít buněčný materiál z buněčné linie fibriblastů, čímž odpadá nutnost připravit v každém jednotlivém případě kulturu vlastních fibroblastů, což vyžaduje dobu několika týdnů.

Nejprve je zapotřebí izolovat nádorové buňky a/nebo fibroblasty ze vzorků tkáně nemocného. Postupy pro tuto izolaci jsou známé. Primární melanomové buňky je například možno nejsnáze izolovat z metastáz v lymfatických uzlinách tak, že se tyto uzliny chirurgicky odstraní a za sterilných podmínek se mechanicky a popřípadě s použití enzymů zpracovávají k získání nádorových buněk.

Izolace buněk z primárních nádorů je obecně poněkud obtížnější, především v případě nádorů malých rozměrů. Například v případě melanomů se postupuje tak, že se nádory chirurgicky odstraní, mechanicky rozruší a mimoto se zpracují působením enzymů. Při některých známých postupech se používají zejména enzymy kolagenáza, DNA-áza a také hyaluronidáza.

Izolace buněk z jiných typů nádorů se provádí v zásadě obdobným způsobem, ke změnám dochází v závislosti na tkáni, v níž se nádor vyskytuje, z těchto důvodů je často nutno izolační postupy modifikovat. Při izolaci a testováná nádorových buněk je možno postupovat způsoby, uvedenými v literatuře, například podle souhrnné publikace Human Cancer in Primary Culture, John R. W. Masters, 1991.

Při výhodném provedení způsobu podle vynálezu se genové konstrukce nezavádějí do nádorových buněk,nýbrž do primárních fibroblastů, které se pak mísí s ozářenými nádorovými buňkami, které nebyly podrobeny transfekci a které obsahují antigeny nádorů (Fakhrai a další, 1992). Výhodě tohoto provedení spočívá v tom, že fibroblasty je možno od nemocných snadno získat ve velkém množství, což má význam především v tom případě, kdy nádory jsou ještě malé a je tedy možno získat pouze omezený počet nádorových buněk.

Další výhoda spočívá v tom, že přenos genu do autologních primárních fibroblastů je možno snadněji standardizovat než transfekci do izolátů primárních nádorových buněk od různých nemocných. Další výhoda tohoto provedení spočívá v tom, že nádorové buňky není zapotřebí pěstovat po delší časové období, v průběhu nějž je zapotřebí zachovat antigenní spektrum, které může být v průběhu kultivace částečně porušeno. Tímto způsobem je možno překonat ještě další nevýhodu, spojenou s pěstováním nádorových buněk, která spočívá v tom, že jednotlivé buněčné populace, například fibriblasty, které jsou obsaženy v izolátu v malém podílu, nebo některé klony nádorových buněk ve výsledné kultuře převáží ostatní buňky.

Fibroblasty je možno izolovat a pěstovat z kůže známým způsobem. Vhodné postupy jsou uvedeny například v publikacích von Jones, 1989, Freshney, 1987 a Sly a Grubb, 1979.

Po kultivaci se buněčný materiál uvede do styku s prostředím pro transfekci, které obsahuje komplexy složek

a) až c). Obecně je výhodné současně použít konjugát b) a komplex mezi DNA a konjugátem internalizačního faktoru.

Aby bylo možno expresi genu ještě zvýšit, je možno tyto komplexy použít opakovaně.

Po transfekci se buněčný materiál oddělí od přebytečného prostředí s obsahem komplexu pro transfekci, promyjí se čerstvým živným prostředím a dále se pěstují.

Inaktivaci nádorových buněk nebo fibroblastů, které se s výhodou inaktivují stejným způsobem, je možno uskutečnit známými postupy, například fyzikálními metodami, jako ozářením rtg-záření nebo gamma-záření a/nebo chemicky působením látek, brzdících buněčné dělení, jako je například mitomycin C. Vhodné jsou látky, které blokují replika ci DNA, například ve fázi tvorby vřetena, to znamená tak zvané jedy pro fázi vřetena, která tímto způsobem zbrzdí dělení buněk.

Dávku inaktivačního prostředku, jíž je zapotřebí použít, například dávku záření nebo koncentraci chemického inaktivačního prostředku a/nebo dobu zpracování buněk je možno určit podle zabudovávání H-thymidinu do buněčného materiálu nebo na základě rychlosti proliferace buněk a na druhé straně také podle exprese cizorodého genu.

Ozáření buněk, určených pro transfekci a tím omezení doby života těchto buněk je současně možno odstranit také vedlejší účinky, které se vyskytují při dlouhodobém přežívání buněčného materiálu. Dosahuje se dočasné, dávkou genu určené exprese uloženého genu. V průběhu pokusů bylo prokázáno, že dávka gamma-záření až do velikosti 100 Gy nesnižuje expresi konstrukce s obsahem genu po transfekci buněčného materiálu.

S výhodou se postupuje tak, že se fibroblasty, které mají být podrobeny transfekci, rovněž inaktivují. Tímto opatřením je možno zajistit, že nedojde k projevům růstu takto zpracovaných buněk, zejména nedojde k jejich nádorovému růstu.

V průběhu výroby vakcíny proti zhoubným nádorům se s výhodou jako mezistupeň zařazuje zmrazení buněčného ma11 teriálu za řízených podmínek a s přísadou látek, které brání poškození buněk zmrazením (tak zvané kryoprotektivní lát ky), jako jsou dimethylsulfoxid (DMSO). Zmrazení je možno zařadit zásadně v libovolném stupni postupu, například před transfekci vypěstovaných buněk nebo také po transfekci, zmrazení však může být také posledním stupněm po ozáření buněk a bezprostředně před použitím vakcíny. Zmrazením vzni ká zásoba buněk, připravených pro transfekci nebo již zpracovaných transfekci, která pak může být odebírána po jednotlivých podílech, což usnadní přípravu vakcíny proti nádoru. Účelné je využít zmrazených buněk jako meziskladu, přičemž buněčný materiál se před použitím podrobí ještě dal Šímu zpracování, například ozáření.

V každém případě je však zapotřebí před podáním vakcíny proti zhoubným nádorům zbavit buněčný materiál látek pro ochranu proti následkům snížených teplot.

Vakcína proti zhoubným nádorům, připravená způsobem podle vynálezu in vitro se podává nemocným k vyvolání systemické imunitní odpovědi, specifické pro určitý nádor nebo k reaktivaci takové imunitní odpovědi po jejím snížení po určité době od předchozího podání vakcíny.

Množství nádorových buněk, užité pro imunizaci se 5 7 ., .

pohybuje v rozmezí 10 az 10 buněk. V případe provedeni, při němž se pěstují fibroblasty, které se pak použijí pro transfekci se počet přimíšených fibroblastů pohybuje přibližně ve stejném rozmezí, množství buněk je však v tomto případě možno snížit až na setinu svrchu uvedeného počtu použitých buněk.

Při provádění základních pokusů bylo sledováno na myších, po jak dlouhé době po injekci melanomových buněk, které byly geneticky modifikovány je možno v místě podání vakcíny proti zhoubným nádorům tyto buňky ještě prokázat. Dále bylo sledováno, zda dochází k přenosu těchto buněk kr ví do různých orgánů. Toto sledování bylo prováděno na základě polymerázové reakce. Při přípravě vakcíny byl buněčný materiál podroben transfekci plasmidovou DNA pro interleukin-2. Pomocí specifických primerů se pak prokazuje z různých vzorků tkání fragment pro IL-2 a mimoto se prokazuje DNA pro adenovirus jako označení genetickou technologií pozměněných melanomových buněk.

Sledování v místě imunizace prokázala, že podané, genetickou technologií pozměněné melanomové buňky ve formě vakcíny proti zhoubnému nádoru jsou v průběhu několika dnů po injekci odbourány. V akutní fázi odbourání buněk, dva dny po imunizaci bylo prokázáno, že nedošlo k žádnému přenosu rekombinantní DNA pro IL-2 nebo pro adenovirus do krve, do tělesných orgánů nebo do zárodečných buněk.

Podstatu vynálezu tvoří také komplex pro transfekci, tvořený DNA s obsahem kódových řetězců pro jeden nebo větší počet imunostimulačních polypeptidů, dále s obsahem molekuly pro vazbu DNA, s výhodou konjugované s internalizačním faktorem pro nádorové buňky a/nebo pro fibroblasty, zvláště s obsahem polylysinu, dále komplex obsahuje endosomolytický konjugát, tvořený molekulou pro vazbu DNA a svrchu uvedeným adenovirem nebo peptidem, přičemž molekula pro vazbu DNA c) a podíl konjugátu, na nějž je vázána DNA

b) jsou vázány na DNA.

Bylo prokázáno, že při použití komplexu podle vynále zu je možno dosáhnout účinného přenosu genů do primárních buněk lidského melanomu a do primárních lidských fibroblastů. Buňky nižšího melanomu po transfekci produkují až 24 000 jednotek-IL-2 na 1 x 10 buněk za 24 hodin, což je nejméně 30x vyšší množství než množství, které bylo popsáno pro jiné postupy s použitím přenosu genu do virů (Lotze a další, 1992, Rosenberg a další, 1992) nebo nevirových systémů (Fearon a další, 1990),přičemž po ozáření buněčného materiálu až do dávky 100 Gy nedochází ke snížení exprese konstrukce s obsahem genu po transfekci buněk.

V rámci vynálezu bylo na myším modelu při sledování účinnosti vakcíny proti myšímu melanomu prokázáno, že dochází ke vzniku systemické imunitní odpovědi u imunizovaných myší, přičemž tato imunitní odpověď chrání zvířata po podání dávky melanomových buněk, která by jinak vyvolala tvorbu nádorů, před vznikem takového nádoru. Dále bylo možno na pokusných zvířatech prokázat účinek vakcíny proti malenomu v tom smyslu, že vakcína zabránila tvorbě metastáz.

Molekula DNA, definovaná jako složka ai), je plasmid, který obsahuje kódový řetězec pro imunistimulační polypeptid, například pro cytokin ve formě, v níž může dojít k expresi tohoto řetězce. Pod pojmem imunostimulační se v průběhu přihlášky v rámci vynálezu rozumí také vlastnost nebo schopnost, zesilovat imunologickou odpověď v případě tak zvané pomocné stimulační molekuly (co-stimulatory molecules), jako například B7 (Schwartz, 1992, Townsend a Allison, 1993) nebo molekuly, napomáhající adhesi, například HSA (heat stable antigens, Kay a další, 1990) nebo ICAM (Springer a další, 1987). Mimoto je nutno připočítat k imunostimulačním látkám také cizorodé antigeny, tak zvané neoantigeny, například virové antigeny. Sekvence, která je kódem pro imunostimulační polypeptid je spojena s řídícími řetězci, které mohou zajistit co nejvyšší expresi polypeptidu, měnícího imunitní odpověď u cílových buněk. S výhodou se užívají silné promotory, například CMV-promotor (Boshart a další, 1985) nebo beta-aktinový promotor (Gunning a další, 1987). Takto získaná konstrukce se pak vyhodnocuje v průběhu předběžných pokusů tak, aby bylo možno vyhodnotit úroveň exprese.

Ve výhodném provedení vynálezu se k získání konstrukce užije kódový řetězec pro interleukin 2, IL-2.

Je však možno použít také kódové řetězce DNA pro řadu dalších cytokinů, například pro IL-4, IL-12, IFN-gamma, TNF-alfa, GM-CSF a podobně (Pardoll, 1992). Je možno použít také kombinace řetězců pro různé cytokiny pro zesílení imunostimulačního účinku, z možných kombinací je možno uvést například IL-2 + IGN-gamma, IL-2 + IL-4, IL-2 + TNFalfa nebo TNF-alfa + IFN-gamma. S výhodou se nacházejí kódové řetězce pro dva různé cytokiny na odlišných plasmidech. Tímto způsobem je možno způsobem podle vynálezu dosáhnout jemného odstupňování exprese cytokinů, jak je možno prokázat například na pokusech s IL-2 a IFN-gamma. Mimoto je zejména možno měnit poměr použitého množství obou odlišných plasmidů.

V dalším možném provedení vynálezu je možno použít molekulu DNA, která obsahuje jeden nebo větší počet kódových řetězců pro pomocnou stimulační molekulu. V jednom z výhodných provedení se jako pomocná stimulační molekula použije antigen, stálý za tepla (Heat Stable Antigen HSA). DNA, která obsahuje kódový řetězec pro HSA, může být použita jako taková nebo také v kombinaci s kódovou DNA pro některý cytokin, s výhodou IL-2.

V dalším možném provedení vynálezu se užije molekula DNA, která obsahuje jeden nebo větší počet kódových řetězců pro neoantigen. Ve výhodném provedení vynálezu je tímto neoantigenem virová bílkovina nebo její fragment, například glykoprotein viru vztekliny. DNA s kódovým řetězcem pro virovou bílkovinu může být použita jako taková nebo také v kombinaci s DNA s kódovým řetězcem pro cytokin, s výhodou pro IL-2.

Pokud jde o velikost konstrukce, obsahující DNA, neexistuje v tomto smyslu prakticky žádné omezení, systém pro přenos genu může mít například velikost 48 kb podle Cotten a další, 1992.

DNA s obsahem kódu pro imunostimulační polypeptid, to znamená DNA s léčebným účinkem může být použita v kombinaci s molekulou DNA, definovanou v odstavci aii), která je vlastně DNA pro vyplnění konstrukce. Řetězec této DNA proto není kritický, kromě požadavků na čistotu, která musí odpovídat čistotě DNA s léčebným účinkem je pouze zapotřebí, aby tato DNA neobsahovala žádný řetězec pro polypeptid, funkčně aktivní v použitém buněčném materiálu. Velikost této DNA rovněž není kritická, obecně je účelné, aby tato velikost ležela v oblasti molekul DNA, účinných při léčení pomocí genů, nebo byla o něco menší.

Tato DNA, sloužící pro vyplnění konstrukce může nahradit různě velký podíl DNA s léčebným účinkem v závislosti na definovaných poměrech ostatních složek komplexu.

To má tu výhodu, že je možno měnit množství DNA s léčebným účinkem a tím i množství cytokinu, k jehož expresi dochází v použitých buňkách, aniž by bylo nutno měnit ostatní parametry komplexu, což má zásadní význam v rámci standardizace způsobu výroby vakcíny s protinádorovým účinkem.

V rámci vynálezu bylo možno prokázat, že množství genu, k jehož expresi ve zvoleném buněčném materiálu dochází klesá přímo úměrně se zvyšujícím se podílem této DNA, užité pouze pro vyplnění konstrukce.

V dalším výhodném provedení vynálezu je použití DNA plasmidu prostá 1ipopolysacharidů. Bylo neočekávaně zjištěno, že se úroveň exprese podstatně zvýší v případě, že je DNA plasmidu v podstatě prostá těchto látek. Vzhledem k tomu, že lipopolysacharidy představují velmi běžnou nečistotu DNA plasmidu, převážně v případě propagace v Escherichia coli, je toto zjištění velmi důležité. Aby byla uvedená nečistota odstraněna, je možno DNA čistit vhodnými postupy, například kombinací chromatografických metod včetně chromatografie s použitím polymyxinu, nebo je možno přidávat do prostředí pro transfekci reakční činidla, schopná vázat lipopolysacharidy, například polymyxin.

V případě, že cílové buňky mají receptory pro adenovirus, jimiž je možno zajistit internalizaci cizorodé DNA pro účinnou expresi v buňce v dostatečné míře, není nezbytné v případě použití konjugátů adenovirů jako složky b) použít ještě molekulu, na níž je navázána DNA, konjugovaná s dalším internalizaěním faktorem jako složku c). Obecně totiž jde o tutéž složku jako v konjugátu b), s výhodou se užije polylysin. V uvedeném příkladu provedení přebírá adenovirus sám funkci internalizačního faktoru, takže v tomto případě již není zapotřebí konjugovat látku pro vazbu DNA ještě s dalším internalizačním. faktorem.

V tom provedení vynálezu, v němž složka c) je tvořena látkou pro vazbu DNA, která není konjugována se postupuje tak, že se DNA uvádí do komplexu s konjugátem b). Složka

c) má v uvedeném případě v první řadě tu úlohu, aby byl zajištěn usnadněný příjem komplexu do buněk (Wagner a další, 1991a). Pro určité případy použití, například v případě použití malé molekuly DNA může nekonjugovaná molekula pro vaz bu DNA jako složka c) zcela odpadnout.

Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu však je složka pro vazbu DNA, definovaná jako složka c) konjugována s internalizačním faktorem. Toto výhodné provedení způsobu podle vynálezu padá v úvahu především v tom případě, že v případě použití konjugátu adenoviru neobsahuje cílová buňka žádné receptory pro adenovirus nebo obsahuje jen velmi malý počet takových receptorů, například v případě použití viru vzdáleného druhu nebo v případě, že se jako endosomolytický konjugát b) užije konjugát peptidu.

V případě přítomnosti dalšího konjugátu internalizačního faktoru mají konjugáty viru prospěch z internalizační schop nosti konjugátu ve složce c) vzhledem k tomu, že se společně s tímto konjugátem dostávají do komplexu s nukleovou kyselinou a jako složka takto vzniklého komplexu, který bude dále označován jako kombinační komplex nebo jako ternární komplex, se dostávají do buněk. Aniž by měl být způsob podle vynálezu omezen na uvedenou teorii, dostávají se kombinační komplexy do buněk buď vazbou na povrchové receptory, které jsou specifické pro internalizační faktor nebo přes vazbu na receptor pro virus nebo vazbou na oba recepto ry endocytozou, zprostředkovanou těmito typy receptorů. Při uvolnění virů z endosomů se do cytoplasmy uvolní také DNA, která je v komplexu označena a uniká tak odbourání v buněčných lysosomech.

Konjugáty mezi internalizačním faktorem a sloučeninou pro vazbu DNA, které je možno použít s výhodou jako složku c), jsou samy ó sobě známé.

Pod pojmem internalizační faktor se v průběhu přihlášky vynálezu rozumí vazné řetězce nebo fragmenty, které jsou po vazbě na nádorové buňky nebo na fibroblasty internalizovány endocytozou, s výhodou sndocytozou, zprostředkovanou přes receptory nebo také faktory, jejichž vazba a internalizace probíhá fúzí s prvky buněčné membrány.

Jako příklady použitelných internalizačních faktorů je možno uvést transferin (Klausner a další, 1983), asialoglykoproteiny (například asialotransferin, asialomukoid nebo asialofetuin podle Ashwell a další, 1982), lektiny (Goldstein a další, 1980, Sharon, 1987), a také látky, které obsahují galaktozu a jsou schopné internalizace přes receptor asialoglykoproteinů, jako mannosylované glykoproteiny (Stáhl a další, 1978), lysosomální enzymy (Sly a další, 1982), LDL (Goldstein a další, 1982), modifikovaný LDL (Goldstein a další, 1979), dále lipoproteiny, které mohou být přijímány do buněk přes receptory (apo B100/LDL), virové bílkoviny, protilátky (Mellman a další, 1984, Kuhn a další, 1982, Abrahamson a další, 1981) nebo jejich fragmenty, účinné proti antigenům na buněčném povrchu, například protilátky anti-CD4, anti-CD7 nebo anti-CD3, dále cytokiny, jako interleukin-1 (Mizel a další, 1987), interleukin-2 (Smith a další, 1985), TNF (Imamura a další, 1987), interferony (Anderson a další, 1982), CSF (faktor, stimulující tvorbu kolonií podle Walker a další, 1987), další faktory včetně růstových faktorů, jako insulin (Marshall, 1985), EGF (faktor růstu epidermis, Carpenter, 1984), PDGF (růstový faktor, odvozený od krevních destiček, Heldin a další, 1982), TGF-alfa (Massague a další, 1986), a TGF-beta (transformační růstové faktora alfa a beta),

HGF (růstový faktor jaterních buněk, Nakamura a další, 1989), NGF (faktor růstu nervů, Hosang a další, 1987), růstový faktor I, podobný insulinu (Schalch a další, 1986), LH, FSH (Ascoli a další, 1978), růstový hormon (Hizuka a další,

1981), prolaktin (Posner a další, 1982), glukagon (Asada-Kubota a další, 1983), thyroidní hormony (Cheng a další, 1980), alfa-2-makroglobulinproteáza (Kaplan a další, 1979). Dalšími příklady mohou být imunoglobuliny nebo jejich fragmenty, jako vazné řetězce pro Fc-receptor nebo protilátky proti imunoglobulinu, schopné se vázat na povrchové imunoglobuliny slg. Uvedené vazné řetězce mohou být přírodního nebo syntetického původu, jak je uvedeno v publikaci Trends Pharmacol. Sci., 1989 a v publikacích, uvedených v této citaci.

Při provádění způsobu podle vynálezu jsou zvláště výhodnými internalizačními faktory transferin a EGF.

Vhodnými látkami pro vazbu DNA jako složky c) (nekonjugované nebo ve formě složky konjugátu s obsahem internalizačního faktoru), popřípadě jako složky konjugátu b) jsou například homologní organické polykationty, jako. polylysin, polyarginin, polyornithin nebo také heterologní polykationtové látky s obsahem dvou nebo většího počtu různých aminokyselin s kladným nábojem, přičemž uvedené polykationty mohou mít různou délku řetězce, dále může jít o syntetické nepeptidové sloučeniny polykationtové povahy, například polyethylenimin. Vhodnými látkami pro vazbu DNA jsou dále přírodní bílkoviny polykationtové povahy, schopné vázat DNA, jako histony nebo protaminy nebo jejich analogy nebo fragmenty a také spermin nebo spermidin.

Délka polykationtu není kritická, pokud jsou komplexy v podstatě elektroneutrální. V případě, že je DNA tvořena 6 000 bp a obsahuje 12 000 negativních nábojů, může být množství polykationtu na 1 mol DNA například následující:

mol polylysinu 200 nebo mol polylysinu 400 nebo

120 mol polylysinu 100 atd.

Další kombinace délky polykationtového řetězce a molárního množství DNA může pomocí jednoduchých běžných pokusů stanovit každý odborník.

Výhodnou sloučeninou při provádění způsobu podle vynálezu je polylysin, zvláště s délkou řetězce přibližně 200 až 300 zbytků lysinu.

V případě, že je při výrobě konjugátu b) molekula pro vazbu DNA modifikována s ohledem na vazbu na endosomolytický prostředek, zvláště na virus, například v případě, že je polylysin konjugován se streptavidinem, aby mohl být vázán na biotinylovaný adenovirus, může být jako složka c) užita polovina takto modifikované molekuly pro vazbu DNA.

V praksi to znamená, že při výrobě konjugátu polylysin-strep tavidin/biotin-adenovirus se užije přebytek polylysin-streptavidinu, který přebírá funkci složky c).

Konjugáty internalizačního faktoru a polykationtu mohou být vyrobeny chemicky nebo v případě, že polykationtovou složkou je polypeptid, také rekombinantním způsobem, je například možno postupovat způsobem podle evropského patentového spisu č. EP 388 758.

Komjugáty je možno připravit například také podle publikace Wagner a další, 1991b, tak, že se glykoprotein, například transferin a molekula pro vazbu DNA, zvláště polylysin spojí přes jeden nebo větší počet uhlohydrátových řetězců glykoproteinu.

S výhodou obsahuje konjugát adenoviru jako složka b) adenovirus s defektem v oblasti E4. Adenoviry tohoto typu byly popsány v publikaci Bridge a Ketner, 1989. Funkce bílkovin, pro něž je kódem oblast E4, je v současné době objasněna pouze částečně. Až dosud je známo, že oblast E4, například stejně jako oblast Elb, je podstatná pro časnou i opožděnou expresi genu viru a pro syntézu cílové bílkoviny, dále pro replikaci viru a pro stavbu virionu. Existuje 24 mRNA pro oblasti E4, až dosud bylo identifikováno sedm otevřených čtecích rámců, přičemž je pravděpodobné, že čtecí rámce 3 a 5 by mohly být v prvé řadě odpovědné pro fenotyp E4. Velmi důležitou funkci má produkt genu otevřeného čtecího rámce ORF 6/7. Tato bílkovina váže buněčný faktor pro transkripci E2F, jde o vysoce specifický transkripční faktor adenoviru. Bylo neočekávaně prokázáno, že adenovirus, který obsahuje defekt v oblasti E4 v případě, že je užit jako složka systému pro přenos genu na bázi endocytozy, zprostředkované přes receptory, přičemž adenovirus má funkci prostředku pro rozrušení endosomů, má současně při použití pro nádorové buňky nižší toxicitu při vysoké účinnosti na transport genu.

Z adenovirů, popsaných ve svrchu uvedené publikaci Bridge a Ketnera zvolená mutanta dll014, obsahující neporušený ORF 4, avšak defektní ORF 3 a ORF 6 i ORF6/7 na základě té vlastnosti, že je při syntéze virových bílkovin nejsilněji ovlivněna. Vzhledem k tomu, že funkce bílkovin, pro něž je kódem oblase E4, není ještě zcela vyjasněna, není v současnosti také možno definovat, do kterého čtecího rámce je nutno uložit mutace, jimiž by bylo možno zajistit žádoucí účinek. Kromě již uvedené jutanty dll014 je další vhodné mutanty možno nalézt empiricky tak, že se způsobem, popsaným Bridgem a Ketnerem připraví mutanty E4, které se pak podrobí zkouškám ve standardizovaných pokusech na transfekci a toxicitu pro buňky, tak jak jsou popsány v následujících příkladech. Pro orientační pokusy na transfekci je z počátku možno místo genu pro cytokin použít reportérovy gen. Mutanty, které poskytují srovnatelnou expresi genu a toxicitu pro buňky jako dll014 nebo vyšší, jsou vhodné pro použití při provádění způsobu podle vynálezu jako složky komplexu, použitého pro transfekci, pokud splní ještě ten požadavek, že viry, například dll014 v buněčné linii W162, je možno pěstovat v komplementární buněčné linii do vysokého titru.

Kromě adenoviru s defektem v oblasti E4 je možno použít také adenovirus s defektem v oblasti Ela, přičemž tento adenovirus má kromě defektu v oblasti Ela ještě alespoň jeden další defekt genu, zavedený pomocí chemických, chemie kofyzikálních nebo genetických postupů.

Defekty, vyvolanými chemickými nebo fyzikálně-chemickými metodami nejsou cílené efekty, nýbrž defekty, které mohou být uloženy kdekoliv v celém genomu viru.

V rámci vynálezu bylo prokázáno, že pro výrobu vakcíny proti zhoubným nádorům je vhodná například mutanta adeno viru, označená dl312 (Jones a Shenk, 1979), inaktivovanou působením kombinace 8-methoxypsoralenu a ultrafialového světla.

Další použitelné mutanty v oblasti Ela je možno připravit pomocí postupů, známých z literatury, při použití různých inaktivaěních metod, tak jak bylo popsáno svrchu v případě mutanty v oblasti E4, pak se získané mutanty zkouší na svou vhodnost použití pro výrobu vakcíny proti zhoubným nádorům jako složka komplexu pro transfekci.

Kromě 8-methoxypsoralenu je možno použít i jiné psoralenové deriváty, jako ď-aminomethyl-4,5 ,8-trimethylpsoralen, u něhož bylo prokázáno, že je vhodný pro inaktivaci adenovirů při jejich použití pro přenos genu. Psoralenové deriváty mají schopnost navzájem spojovat řetězce DNA a po ozáření ultrafialovým světlem o 365 nm napomáhají vatvářet adiční produkty mezi jednotlivými řetězci DNA viru i uvnitř těchto řetězců (Hanson, 1992). Tyto adiční produkty inaktivují úseky genu a blokují funkci genu, například transkripci a replikaci viru. Bylo prokázáno, že při snížení replikace viru o více než 5 log (stanoveno pomocí zkoušky CPE) a snížení replikace viru o více než 7 log (při stanovení pomocí zkoušky na tvorbu plaků) dochází ke snížení zesílení přenosu genu pouze o 5 % (Cotten a další, 1992).

S ohledem na to, že při výrobě všech léčiv obecně a při výrobě vakcín proti nádorům zvláště je velmi žádoucí postupy co nejvíce standardizovat, což se týká všech složek a také všech parametrů použitých postupů a tím také všech použitých virů je velmi výhodné použití takového viru, který může být inaktivován postupy, které lze standardizovat. Požadavek na vytvoření standardizovaného postupu mohou splnit především chemické inaktivační postupy, které jsou v tomto směru výhodnější než chemicko-fyzikální postupy. Jako příklad pro chemický postup inaktivace je možno uvést inaktivaci působením beta-propiolaktonu (Morgeaux a další, 1993, De Shu a další, 1986, Budowsky a Zalesskaya, 1991). Tento postup má tu výhodu, že vzhledem k nestálosti inaktivačního prostředku ve vodných roztocích není zapotřebí zařadit čisticí stupeň k odstranění nezreagovaného reakčního činidla. Mimoto není zapotřebí při tomto způsobu inaktivace použít ještě ultrafialové světlo, což je z hlediska standardizace celého postupu rovněž výhodné. Při provádění způsobu podle vynálezu bylo prokázáno, že v případě, že se adenovirus zpracovává působením dvou podílů 0,3 % beta-propiolaktonu v průběhu 4 hodin při teplotě místnosti, dojde k poklesu titru viru o 5 log, což je srovnatelné s inaktivaci, kterou je možno dosáhnout působením 8-methoxypsoralenu. Účinnost přenosu DNA zůstává při středních dávkách beta-propiolaktonu (0,3 %) zachována, kdežto při zpracování působení 1 % beta-propiolaktonu je možno již pozorovat podstatný pokles účinnosti přenosu DNA. Analýza exprese genu inaktivovaného viru prokázala, že jak psoralenové deriváty, tak také beta-propiolakton blokují expresi genu viru (Ela a E3) ve stejné míře. Citlivější zkouška na tvorbu plaků však prokázala, že při zpracování viru působením psoralenu je virus inaktivován o více než 7 log, přičemž při nejvyšších dávkách této látky již není možno pozorovat žádnou tvorbu plaků, kdežto při inaktivaci beta-propiolaktonem je možno pozorovat pokles titru viru pouze o 5 log a ani při nejvyšších dávkách nedochází k úplnému vymizení tvorby ρ1aků.

V jednom z dalších možných provedení vynálezu se tedy užívá virus, inaktivovaný výlučně chemickými metodami, s výhodou působením beta-propiolaktonu.

Vhodnost určitého postupu pro inaktivaci virů z hlediska jejich pozdějšího použití pro přenos genu, zvláště při výrobě vakcíny proti zhoubným nádorům podle vynálezu je možno stanovit pomocí předběžných pokusů, tak jak bylo svrchu uvedeno u jednotlivých příkladů inaktivace adenovirů působením kombinace 8-methoxypsoralenu a ultrafialového světla, 4'-aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralenu a ultrafialového světla a beta-propiolaktonu. K tomuto účelu je například možno sledovat účinnost inaktivace viru stanovením titru viru a/nebo použitím citlivější zkoušky na tvorbu plaků. Tímto způsobem je možno odhadnout schopnost viru zesílit přenos genu, zprostředkovaný přes receptory vzhledem k reporterovému genu. Aby bylo možno stanovit místo v genomu viru, které je zasaženo použitým inaktivačním postupem, to znamená stanovit, které úseky byly porušeny, je možno provést hybridizační pokusy při použití sond DNA, s jejíž pomocí je možno sledovat přítomnost odpovídajícího transkriptu ve viru. V rámci vynálezu bylo tímto způsobem zkoušeno větší množství inaktivačních postupů, aby bylo možno prokázat, zda tyto postupy blokují funkce pro replikaci viru nebo pro jeho transkripci. Inaktivační metoda je vhodná v tom případě, že při jejím použití je možno získat částice adenoviru, které si ještě uchovávají endosomolytickou účinnost, nutnou pro transport DNA, která je funkcí kapsidu viru, kdežto schopnost exprese nebo replikace genu viru, který může vyvolat v buňkách nežádoucí změny již chybí.

Bylo prokázáno, že při zpracování adenoviru působením 8-methoxypsoralenu nebo při použití 4 -aminomethyl-4,5 ,8-trimethyIpsoralenu při následném zpracování ultrafialovým světlem po dobz 25 minut a také při zpracování viru působením 2 x 0,3 % beta-propidlaktonu se získají virové částice které si udržují svou schopnost zesílit transport DNA. Pomocí CPE (cytopathický koncový bod) bylo prokázáno, že všechny tři uvedené postupy jsou srovnatelné, pokud jde o pokles titru viru. Po zpracování působením kombinace 8-methoxypsoralenu a ultrafialového světla i po zpracování působením beta-propiolaktonu již nebylo možno pozorovat žádnou transkripci genomu viru. Pomocí citlivějšího postupu sledováním tvorby plaků však bylo prokázáno, že viry, zpracované působením beta-propiolaktonu jsou ještě schopné replikace v případě, že je k disposici dostatečné množství komplementární buněčné linie. Naprotitomu dochází při zpracování viru působením obou psoralenových derivátů k úplnému potlačení replikace, takže po tomto zpracování již není možno pozorovat tvorbu žádných plaků.

Analýza RNA pro průkaz exprese genu byla uskutečněna při použití sondy 5 Ela pro adenovirus, která rozpoznávala tu část genu Ela, který je v mutantš adenoviru dl312 rozrušen, mimoto byla užita sonda 5 E3 pro adenovirus, která rozpoznávala tu část oblasti E3, která je kódovou oblastí pro glykoprotein E3 19K, vyráběný ve velkém množství (Ela slouží jako kontrola, RNA-signál by měl u virové mutanty dl312 chybět, avšak u mutanty dll014 by měl být přítomen vzhledem k tomu, že tato mutanta obsahuje oblast El divokého typu viru). Z exprese E3 je možno předpokládat, že by tato oblast mohla hrát důležitou úlohu při vyvolávání imunitní odpovědi v buněčném materiálu po transfekci vzhledem k tomu, že nejméně dva geny z oblasti E3 jsou schopné modulovat v infikovaných buňkách povrchovou expresi molekul MHC, třída I a molekul receptorů TNF. V případě použití virové mutanty dll014 při léčebných postupech s použitím genu, při nichž jsou vytvářeny imunogenní nádorové buňky by tedy bylo žádoucí vytvořit v oblasti E3 defekt tak, aby exprese této oblasti neinterferovala s imunologickou odpovědí na přítomnost buněk po transfekci.

Endosomolytický prostředek, vázaný na polylysin nebo vázaný iontovou vazbou se užívá s výhodou jako složka ternárního nebo kombinačního komplexu. Vazbu adenoviru na polylysin je možno uskutečnit různým způsobem:

Vazbu viru chemickým postupem je možno uskutečnit postupy pro vazbu peptidů, které jsou samy o sobě v oboru známy, přičemž je v případě potřeby možno jednotlivé složky před vaznou reakcí opatřit látkami, které působí jako vazné řetězce (toto opatření je nezbytné zejména v tom případě, že na samotných vazných složkách nejsou k dispozici žádné funkční skupiny, vhodné pro uskutečnění vazby, například merkaptoskupina nebo alkoholová funkční skupina). V případě látek s funkcí vazných řetězců jde o bifunkční slou čeniny, kte.ré se nejprve uvádějí do reakce s funkčními skupinami jedné z reakčních složek a pak se provádí vazba takto modifikované složky na druhou složku.

Jeden z možných způsobů vazby viru na polylysin probíhá obdobným způsobem, jakým se provádí tvorba konjugátu transferin-polylysin (Wagner a další, 1990). Po modifikaci defektu adenoviru působením heterobifunkčního reakčního činidla. V případě, že virus obsahuje vhodné uhlohydrátové řetězce, je možno jej vázat na látku pro vazbu DNA přes jeden nebo větší počet uhlohydrátových řetězců glykoproteinu (Wagner a další, 1991b).

Dalším možným postupem pro výrobu konjugátu virus-polylysin je enzymatická vazba viru na látku, schopnou vázat DNA, zejména na polyamin působením enzymu transglutaminázy (Zatloukal a další, 1992).

Další postup pro výrobu konjugátu adenovirus-polylysin spočívá v tom, že se virus váže na polykationtovou slou čeninu přes bitoin-proteinový můstek, s výhodou přes bitoin -streptavidinový můstek (Wagner a další, 1992).

Popřípadě je možno vazbu na biotin uskutečnit také přes avidin.

Dále je možné vytvořit vazbu mezi virem a polylysinem tak, že se nejprve virus podrobí biotinylaci a na druhé straně se konjuguje protilátka proti biotinu s polylysinem a pak se provede vazba mezi virem a polylysinem prostřednictvím vazby mezi biotinem a protilátkou proti biotinu.

K tomuto účelu je možno využít běžně dodávané polyklonální nebo monoklonální protilátky proti biotinu.

Vazbu mezi virem a polylysinem je také možno uskutečnit tím způsobem, že se nejprve polylysin naváže na lektin, který má afinitu k povrchovému glykoproteinu viru, přičemž vazba v konjugátu tohoto typu probíhá přes vazbu mezi lektinem a glykoproteinem. V případě, že virus sám o sobě neobsahuje žádné vhodné uhlohydrátové postranní řetězce, je možno virus příslušně modifikovat.

V případě, že virus obsahuje v oblastech svých povrchových bílkovin místa s kyselou povahou, která z tohoto důvodu mohou vázat polykationtové sloučeniny, je možno uskutečnit také iontovou vazbu na molekulu látky, schopné vázat DNA.

Kromě svrchu uvedených mutant adenoviru nebo dalších vhodných vytvořených nebo zvolených mutant může být endosomolytickou složkou konjugátu ve složce b) také peptid, který je vázán na molekulu látky, schopné vázat DNA kovalentní nebo iontovou vazbou. Pokud jde o požadavky, kladené na takové peptidy a pokud jde o uskutečnění vazby na molekulu látky, schopné vázat DNA, je možno odkázat na obsah mezinárodní patentové přihlášky WO 93/07283.

V rámci provádění způsobu podle vynálezu je možno použít syntetický dimerní peptid chřipkového viru (řetězec č. 7), iontově vázaný na polylysin, při jehož použití je možno dosáhnout vysoké úrovně exprese pro IL-2 v melanomových buňkách. Melanomové buňky, podrobené transfekci v přítomnosti tohoto peptidového konjugátu prostřednictvím konjugátů transferin-polylysin při použití IL-2-plasmidové DNA jsou vhodné jako vakcína proti nádorům s profytaktickým ochranným účinkem proti vzniku nádoru.

Při výrobě komplexu pro transfekci buněčného materiálu nejsou jednotlivé stupně kritické, pokud jde o jejich pořadí, je například možno postupovat následujícím způsobem

Vychází se z molekuly DNA a s ohledem na tuto látku se stanoví sloučenina pro vazbu DNA takové povahy a v takovém množství, aby bylo zajištěno uvedení DNA do komplexu a vzniklé komplexy byly s výhodou v podstatě neutrální.

V případě komplexů, které obsahují konjugát viru a mimoto konjugát internalizačního faktoru se volí kationtový podíl obou uvedených konjugátů s ohledem na dosažení elektroneutrality výsledného komplexu.

Při stanovení molárních poměrů jednotlivých použitých složek komplexu, a), b) a c) je nutno brát ohled na to, že po vzniku komplexu s obsahem DNA je tento komplex vázán na buněčný materiál, dostává se do buněk a je z endosomů do vnitrního prostoru buněk uvolněn.

Zvolený poměr mezi konjugátem internalizačního faktoru a DNA se řídí především velikostí molekuly polykationtové sloučeniny a také počtem a rozdělením kladně nabitých skupin. Jde o faktory, které jsou voleny s ohledem na velikost a strukturu přenášené DNA, přičemž je zapotřebí brát v úvahu také konjugát viru. S výhodou se molární poměr mezi internalizačním faktorem a polylysinem pohybuje v rozmezí 10 : 1 až 1 : 10.

V případě použití konjugátu adenoviru a nekonjugované látky, schopné vázat DNA je možno po stanovení pro účinnost transfekce a exprese optimálního poměru mezi konjugátem a DNA titrací stanovit také vhodné množství konjugátu, které je možno nahradit látkou, schopnou vázat DNA.

Jako složka c) se s výhodou užije polylysin, s výhodou konjugovaný s internalizačním faktorem, současně se tato látka s výhodou použije také jako složka konjugátu adenoviru ve složce b) .

Jeden z vhodných postupů pro stanovení poměru složek, obsažených v komplexech spočívá v tom, že se nejprve definuje konstrukce genu, který má být do buněčného materiálu transportován, tak jak je popsáno svrchu a pak se určí virus, který je vhodný pro použití při transfekci. Identifikovaný virus se naváže na polykationtovou sloučeninu a vytvoří se jeho komplex s konstrukcí genu. Na základě stálého množství DNA se pak titrací stanoví optimální poměr mezi konjugátem viru a konjugátem internalizačního faktoru, popřípadě mezi nekojugovanou látkou pro vazbu DNA.

Komplexy je možno vytvořit tím způsobem, že se smísí složky a), b) a c) vždy ve formě svých zředěných roztoků.

Optimální poměr DNA ke konjugátu a k nekonjugované látce pro vazbu DNA je možno stanovit titrací, to znamená, že se uskuteční řada pokusů o transfekci při použití konstantního množství DNA a různých množství konjugátu a polylysinu. Optimální poměr konjugátu a polykationtové sloučeniny ve směsi je možno stanovit pomocí běžných pokusů například při srovnání optimálních poměrů směsí, použitých v titračních pokusech.

Komplexy DNA je možno připravit v roztocích při fyziologické koncentraci solí. Další možnost spočívá v tom, že se použijí vysoké koncentrace solí, například přibližně 2M chloridu sodného a pak se roztok upraví na fyziologické podmínky pomalým ředěním nebo dialýzou.

Nejvhodnější pořadí při míšení jednotlivých složek se v každém případě provádí vždy znovu pomocí předběžných pokusů.

Množství použitého endosomolytického konjugátu se řídí podle typu transfekce, který je zapotřebí uskutečnit.

Je účelné použít nejmenší možné množství endosomolytického konjugátu, při němž je ještě možno dosáhnout internalizace použitého komplexu v převážné části buněk a jeho uvolnění z endosomu. V případě použití konjugátu adenoviru je nutno potřebné množství tohoto konjugátu upravit podle použitého typu buněk, přičemž je zapotřebí brát v úvahu především infekčnost viru pro použitý typ buněk.

Další kriterium spočívá v tom, že konjugát internalizačního faktoru je nutno použít tak, aby internalizační faktor, tohoto konjugátu se mohl vázat na cílových buňkách na definovaný počet receptorů. Mimoto se řídí použité množství endosomolytického konjugátu množstvím DNA, která má být do buněk přenesena. Při zvláštních případech použití je zapotřebí uskutečnit předběžné pokusy s cílovými buňkami pro transfekci a vektorovým systémem pro transfekci a stanovit při těchto pokusech optimální koncentraci endosomolytického konjugátu titrací. Jako DNA se s výhodou užije genová konstrukce, která svou velikostí odpovídá předpokládanému použití a která k usnadnění jednoduchého měření účinnosti přenosu genu obsahuje reporterový gen. V rámci způsobu podle vynálezu se ukázal být jako reporterový gen vhodný gen pro luciferázu.

Způsobem podle vynálezu je možno při použití komplexu podle vynálezu připravit nádorové buňky nebo fibroblasty, modifikované transfekci.

Takto získaný materiál je možno podle vynálezu použít pro výrobu vakcíny proti zhoubným nádorům. Tyto vakcíny jsou farmaceutické prostředky, které obsahují nádorové buňky, modifikované svrchu uvedeným způsobem nebo fibroblasty, modifikované svrchu uvedeným způsobem ve směsi s nádorovými buňkami, přičemž prostředek je zpracován na farmaceuticky přijatelnou formu.

Vakcína proti zhoubným nádorům podle vynálezu má s výhodou formu suspenze, popřípadě připravené při použití trypsinu. Buněčný materiál v této vakcíně je uveden do suspenze ve fyziologickém prostředí, například ve fyziologickém roztoku chloridu sodného nebo v roztoku pufru, toto prostředí může obsahovat živné látky, například aminokyseliny, potřebné pro výživu buněk po krátké období mezi přípravou vakcíny a jejím podáním.

V průběhu pokusů, které byly v rámci vynálezu provedeny, byly použity melanomové buňky v živném prostředí RPMI 1640, do tohoto prostředí bylo přidáno fetální telecí sérum, FCS.

Pro zpracování vakcíny proti zhoubným nádorům podle vynálezu na galenickou lékovou formu byla s ohledem na léčebné použití této vakcíny zkoušena různá nosná prostředí.

Bylo prokázáno, že živné prostředí buněk s dalšími přísadami, jako jsou telecí sérum, lidské sérum, lidský séro vý albumin a/nebo hydroxyethylcelulosa, může zajistit života schopnost dostatečného množství buněk pro vakcinační účely. Aby byla vakcína proti zhoubným nádorům pokud možno nemocnými dobře snášena, je účelné přidávat do vakcíny sérum krev ní skupiny AB, je však možno v nosném prostředí použít také autologní krevní sérum. Jako případné složky může nosné prostředí obsahovat ještě růstové faktory nebo cytokiny, například IFN-gamma nebo GM-CSF pro příznivou presentaci buněčných antigenů ve vakcíně.

Typ vakcíny proti zhoubným nádorům, který je možno připravit způsobem podle vynálezu, představuje nový vývojový stupeň v oblasti léčebných postupů s použitím cytokinů. Vakcína podle vynálezu má tu výhodu, že při jejím použití je možno zabránit závažným vedlejším účinkům, k nimž dochází při systemickém podání cytokinů. Použití vakcíny je totiž omezeno jejím lokálním účinkem. Kromě použití k léčení melanomů a zhoubných nádorů tlustého střeva je uvedeným způsobem možno léčit také jiné typy zhoubných nádorů, například nádory ledvin nebo mléčné žlázy.

Vynález bude nyní osvětlen v souvislosti s přiloženými výkresy.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je znázorněn transport genů do primárních lidských melanomových buněk.

Na obr. 2 je znázorněno stanovení vazných řetězců, které se účastní při příjmu komplexu pro přenos genu, zejména použití nekonjugovaného polylysinu.

Na obr. 3 je znázorněn vliv inaktivace adenoviru komplexním působením psoralenu a ultrafialového světla na expresi genu v primárních lidských melanomových buňkách v průběhu sedmi dnů po transfekci.

Na obr. 4 je znázorněna cytotoxicita adenoviru pro buněčný materiál.

Na obr. 5 je znázorněn vliv ozáření nádorových buněk v závislosti na dávce záření na expresi genu v buňkách po jejich transfekci.

Na obr. 6 je znázorněn vliv koncentrace plasmidu na expresi reporterového genu, kterým je gen pro luciferázu.

Na obr. 7 je znázorněn vliv koncentrace plasmidu na expresi genu pro IL-2 a/nebo genu pro IFN-gamma po transfekci buněk.

Na obr. 8 je znázorněna ztráta schopnosti vyvolat tvorbu nádorů u buněk myšího melanomu v průběhu sedmi týdnů po transfekci buněk.

Na obr. 9 je znázorněno vyvolání systemické imunologické odpovědi proti melanomu u myší při aplikaci ozářených nádorových buněk po transfekci cytokinem.

Na obr. 10 je znázorněno použití GF jako vazného řetězce pro přenos genu do buněčné linie lidského epidermoidního karcinomu. Obr. 10A: plus 2 % FCS, obr. 10B: bez FCS.

Na obr. 11 je znázorněna exprese genu pro IL-2 v buněčné linii myšího melanomu při použití různých vektorů v průběhu 14 dnů po transfekci.

Na obr. 12 je znázorněna exprese genu pro IL-2 ve fibroblastech při použití různých vektorů v průběhu 28 dnů po transfekci.

Na obr. 13 je znázorněna stimulace imunologické odpovědi aplikací melanomových buněk, na jejichž povrchu dochází k expresi genu pro HSA.

Na obr. 14 je znázorněna stimulace imunologické odpovš di aplikací melanomových buněk, na jejichž povrchu dochází k expresi genu pro glykoprotein viru vztekliny.

Na obr. 15 je znázorněna titrace 8-methoxypsoralenu v komplexu pro přenos genu.

Na obr. 16 je znázorněna titrace 4 -aminomethyl-4,5 ,8 -trimethylpsoralenu v komplexu pro přenos genu.

Na obr. 17 je znázorněna titrace beta-propiolaktonu v komplexu pro přenos buněk.

Na obr. 18 je znázorněna účinnost adenovirů dll014 při transportu genu po zpracování 8-methoxypsoralenem nebo po zpracování působením nižších koncentrací beta-propiolaktonu .

Na obr. 19 je znázorněna tvorba plaků mutantou adenoviru dll014, inaktivovanou působením 8-methoxypsoralenu, beta-propiolaktonu nebo 4 -aminomethyl-4,5 ,8-trimethylpsoralenu.

Na obr. 20 je znázorněna tvorba plaků mutantou adenoviru dll014 po inaktivaci viru působením 8-methoxypsoralenu nebo po různém zpracování působením beta-propiolaktonu.

Na obr. 21 je znázorněna exprese genu z oblastí Ela a E3 po inaktivaci viru.

Na obr. 22 je znázorněna PCR-analýza reverzní transkripce DNA viru.

Na obr. 23 je znázorněna lokalizace zásahu 8-methoxypsoralenu v genomu viru.

Na obr. 24 je znázorněna rychlost růstu buněk lidského melanomu v závislosti na dávce gamma-záření při inaktiva ci nádorových buněk.

Na obr. 25 je znázorněn ochranný účinek proti tvorbě metastáz po imunizaci melanomovými buňkami po jejich transfekci při použití cytokinu (transfekce, zprostředkovaná působením adenovirů).

Na obr. 26 je znázorněna účinnost vakcíny proti zhoub ným nádorům v závislosti na použité dávce cytokinu.

Na obr. 27 je znázorněn ochranný účinek vakcíny proti zhoubným nádorům na tvorbu metastáz při imunizaci melanomovými buňkami po transfekci cytokinem (transfekce působením endosomolytického peptidu).

Na obr. 28 je znázorněna exprese interleukinu-2 v buňkách lidského melanomu.

Na obr. 29 je znázorněn vliv obsahu endotoxinu v prostředku s obsahem DNA na expresi interleukinu 2 v buňkách lidského melanomu.

Na obr. 30 je znázorněn vliv různých typů vakcín, získaných s použitím různých komplexů na potlačení nádorového bujení u pokusných zvířat.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následují čími příklady. Pokud není výslovně uvedeno jinak, jsou v průběhu příkladové části použity následující materiály a metody.

a) Konstrukce s obsahem plasmidu

i) Konstrukce plasmidové DNA, obsahující kódové řetězce pro IL-2 myši nebo člověka

V následujících příkladech 6 až 8 byl v průběhu prováděných pokusů použit plasmid BCMGneo-mIL-2, popsaný v publikaci Karasuyama a další, 1989.

Další možností je vytvoření plasmiud s označením pWS2m. Tento plasmid obsahuje gen pro IL-2 myši pod řízením zesilovače transkripce/promotoru z cytomegaloviru. Postup se provádí následujícím způsobem: Plasmid pHbetaPr-1 (gunning a další, 1987) se rozštěpí působením enzymů BamHI a EcoRI. Pomocí čištění na agarazovém gelu se izoluje fragment o velikosti 2,5 kb, který obsahuje gen pro odolnost proti ampicilinu a počátek replikace z plasmidu pBR322 a rovněž signál pro polyadenilaci SV40. Uvedený fragment je navázán na CMV-promotor/zesilovač transkripce, amplifikovaný jako PCR-fragment o velikosti 0,7 kb z vektoru pAD-CMVI (popsaného v EP 393 438) a rozštěpený enzymy EcoRI/BamHI. Takto získaný plasmid se označí pWS. Pak se získá kódová cDNA pro IL-2 myši jako PCR-fragment z plasmidu BMGneo-mIL-2 (Karasuyama a Melchers, 1988). Ve směru 5 -zakončení od prvního kodonu ATG se pro zajištění optimálního počátku translace naváže řetězec GCCGCC. 3 -nekodová oblast se pak odstraní. Takto získaný PCR-fragment se pak uloží do vektoru pWS, otevřeného rozštěpením enzymy Sáli a BamHI.

Pro použití v lidských buňkách se využije vektor pWS2, který se získá obdobným způsobem jako vektor pWS2m s tím tozdílem, že jako předloha pro PCR-amplifikaci místo plasmidu BMGneo-mIL-2 slouží plasmid pIL2-50A (Taniguchi a další, 1983), který obsahuje kódový řetězec cDNA pro lidský interleukin 2.

Místo plasmidu s obsahem genu pro odolnost proti ampicilinu je možno připravit také vektor pGShIL-2tet, který obsahuje gen pro odolnost proti tetracyklinu, vyštěpený z plasmidu pBR327.

Pro plasmid pCM2 se použije řetězec pro IL-2 myši spolu s přilehlými oblastmi ve směru 5 - a 3 -zakončení (štěpná oblast a polyadenylační signál z králičího genu pro beta-globin) jako SalI/BamHI-fragment, vyštěpený z BCMGneo-mIL-2 a uložený do vektoru pAD-CMVI.

ii) Konstrukce plasmidové DNA, obsahující kódový řetězec pro IFN-gamma myši

V tomto případě byl použit plasmid pSVEmuIFN-gamma podle publikace Gray a Goeddel, 1983.

iii) Konstrukce plasmidu pHSA, která obsahuje kódový řetězec DNA pro HSA

Plasmid pHSA, který obsahuje řetězec pro HSA z promotoru CMV se získá tak, že se cDNA pro HSA (Kay a další, 1990) klonuje v místě štěpení enzymem BstXI v plasmidu pCDM8 (Seed, 1987).

iv) Plasmid pWS-RABIES, obsahující kódový řetězec DNA pro glykoprotein viru vztekliny

Kodový řetězec DNA pro glykoprotein viru vztekliny se izoluje z vektoru pKSV-10 (Pharmacia), který obsahuje cDNA pro glykoprotein viru vztekliny (Anilionis a další, 1982), jako fragment po štěpení enzymem Bgl II, plasmid obsahuje místo štěpení Bgl II proti směru translace od promotoru SV40. Vektor pWS2m se rozštěpí působením enzymu Bgl II a BamHI. Fragment s obsahem cDNA pro IL-2 myši se oddělí elektroforézou na agarosovém gelu a fragment, odpovídající vektoru pWS se izoluje a naváže na fragment Rabies Správná orientace fragmentu Rabies se ověří analýzou řetězce. Řetězec pro glykoprotein viru vztekliny je dále uveden jako řetězec č. 1.

v) Plasmid pWS-Gm, obsahující kodový řetězec DNA pro

GM-CSF myši

Vektor pWS2, popsaný v odstavci i) se rozštěpí působením enzymů Sall a BamHI a takto uvolněný kódový fragment pro interleukin 2 se izoluje elektroforézou na agarosovém gelu. Kódová DNA pro GM-CSF myši se vytvoří syntetickým che mickým postupem z dvanácti navzájem se překrývajících oligonukleotidů. Použitý řetězec odpovídá řetězci, který byl popsán v publikaci Miyatake a další, 1985, (kódová oblast od polohy 32 do polohy 457) s tím rozdílem, že došlo k tiché záměně v poloze 178 (A místo G), v poloze 274 (C místo G) a v poloze 355 (C místo G). Mimoto byl nahrazen triplet AGC v polohách 446 až 448 tripletem GTC. 5'-oblast byla opatřena prodlouženým zakončením, kompatibilním s Sáli a 3^-oblast byla opatřena prodlouženým zakončením, kompatibilním s BamHI. 5 -zakončení bylo opatřeno řetězcem GCCGCCobdobně jako řetězec IL-2 v plasmidů pWS2. Syntetický gen GM-CSF byl klonován ve vektoru pWS2 postupem podle publikace Sambrook, 1989 (Shot-gun) a pak se analyzuje jeho řetězec. Chyby, prokázané při analýze řetězce se pak opraví cílenou mutagenesou při použití fosforthioátového postupu (Amersham-Kit).

vi) Plasmid pGShIL-2tet, obsahující kódovou DNA pro lidský interleukin-2

Kazeta pro IL-2, obsahující CMV-zesilovač transkripce/ /promotor, kódový řetězec pro IL-2 a kódový řetězec pro SV40-PolyA se získá pomocí PCR, jako předloha se užije vektor pWS2, popsaný v odstavci i). Produkt PCR reakce se rozštěpí restrikčním enzymem EcoRI a klonuje se v místě působení restrikčních enzymů EcoRI/Smal v plasmidů pUC19 (Pharmacia). Získaný plasmid byl označen pGShIL-2. Jako zdroj pro gen pro odolnost proti tetracyklinu a pro část oblasti genu pro beta-laktamázu (gen pro odolnost proti ampicilinu) byl použit plasmid pBR327 (Soberon a další, 1980), rozštěpený restrikčními enzymy sspi a Aval. Společně s adaptorem pro EcoRI/Aval byl klonován také izolovaný tet-řetězec v místě působení restrikčních enzymů EcoRI/SspI plasmidů pGShIL-2. Pak byl analyzován řetězec kazety pro IL-2 ve výsledném klonu pGShIL-2tet/amp. Pak byl řetězec pro ampicilin spolu s EamllO5I a SspI vyjmut a znovu navázán do plasmidů. Získaný plasmid byl označen pGShIL-2-tet.

vii) Plasmid pCMVL s obsahem reporterového genu

Plasmid pCMV byl připraven tak, že byl odstraněn řetězec, uložený do místa působení BamHI v plasmidu pSTCX556 (Severne a další, 1988), plasmid byl zpracován Klenowovým fragmentem a bylo uloženo místo pro HindlII/SspIa fragment, zpracovaný Klenowovým fragmentem z plasmidu pRSVL, obsahující gen pro luciferázu Photinus pyralis pod řízením LTR-zesilovače transkripce a promotoru viru Rousova sarkomu (Uchida a další, 1977, De Wet a další, 1987). Plasmid s obsahem reporterového genu byl označen pCMVL.

b) Příprava konjugátů transferrin-polylysin

Pro syntézu konjugátů transferrinu a polylysinu s délkou řetězce 290 zbytků lysinu byl použit způsob podle publikace Wagner a další, 1991b.

c) Příprava konjugátů EGF-polylysin mg EGF (Epidermal Growth Factor, Sigma, St. Louis, č. katalogu E-4127), byl čištěn filtrací na gelu Sephadex G-10 při použití HBS jako elučního pufru.

135 nmol, 0,8 mg EGF v 1,5 ml HBS pak bylo zpracováno působením 15 mM ethanolového roztoku s obsahem 1,2 mikromol SPDP. Po 2 hodinách stání při teplotě místnosti byla modifi kovaná bílkovina oddělena filtrací přes sloupec gelu Sephasex G-10, čímž bylo získáno 70 nmol EGF, modifikovaného 50 nmol dithiopyridinového vazného řetězce. Takto modifikovaná bílkovina byla uvedena do reakce s 50 nmol 3-merkaptopropionátem modifikovaného polylysinu (střední délka řetězce 290 monomerů lysinu, modifikace působením 150 nm merkaptopropionátového vazného řetězce) v 1 ml HBS v argonové atmosféře. Konjugáty byly izolovány chromatografií na sloup ci gelu Superdex 75 (Pharmacia), jako pufr se užije 0,5 M chlorid sodný. Frakce pufru obsahuje konjugát, tvořený 20 nmol streptavidinu a 25 nmol polylysinu.

d) Příprava konjugátu streptavidin-polylysin

Vazba streptavidinu a polylysinu byla prováděna podle publikace Wagner a další, 1990 a podle EP-A1 388 758 analogickým způsobem jako příprava konjugátu transferrin-polylysin, která je v těchto publikacích popsána.

Postupuje se tak, že se na roztok 79 nmol, 4,7 mg streptavidinu v 1 ml 200 mM hepes o pH 7,9 a 300 mM NaCl působí 15 mM ethanolovým roztokem SPDP (236 nmol). Směs se nechá stát 1,5 hodiny při teplotě místnosti, modifikovaná bílkovina se podrobí filtraci na gelu Sephadex G-25, čímž se získá 75 nmol streptavidinu, modifikovaného 196 nmol dithiopyridinového vazného řetězce. Takto modifikovaná bílkovina se nechá reagovat s 3-merkaptopropionátem modifikovaným pclylysinem (75 nmol, střední délka řetězce 290 zbytků lysinu, modifikace půsoebním 190 nmol merkaptopropionátového vazného řetězce) ve 2,6 ml 100 mM pufru HEPES o pH 7,9 se 150 mM NaCl v argonové atmosféře. Vzniklé konjugáty se oddělí chromatografií na kationtoměniči, užije se sloupec Mono S HR5 (Pharmacia). K eluci se užije gradient 20 až 100 % pufru. Pufr A: 50 mM HEPES o pH 7,9. Pufr B: pufr A s 3M chloridu sodného. K eluci frakcí s obsahem produktu dochází při koncentraci chloridu sodného v rozmezí 1,2 až 1,7 M.Dialýzou proti HBS (20 mM pufru HEPE o pH 7,3 se 150 mM chloridu sodného) se získá konjugát, kte rý je tvořen ^5 nmol streptavidinu a 53 nmol polylysinu.

e) Výroba biotinylovaného, inaktivovaného adenoviru

i) Adenovirus dl312

Byl použit kmen, popsaný v publikaci Jones a Shenk, 1979, šlo o adenovirus kmene dl312 s delecí v oblasti Ela. Pomnožení viru bylo uskutečněno v Ela-transkomplementární buněčné linii 293, čímž bylo získáno velké množství uvedené mutanty viru způsobem, popsaným v publikaci Davidson a Hassell, 1987. Čištěný virus byl pak uložen v pufru, vhodném pro uchovávání viru (100 mM tris o pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,1 % BSA, 50 % glycerolu) nebo v HBS se 40 % glycerolu a podíly viru byly uloženy při teplotě -70 °C. Stanovení koncentrace virionu bylo uskutečněno spektrofotometrickou analýzou extrahované virové DNA genomu v ultrafialovém světle (jednotka optické hustoty (OD, Α^θθ) odpovídá množstx 10 částic virů v 1 ml, postup byl uveden v publikaci Chardonnet a Dales, 1970) .

ii) Adenovirus dll014

Adenovirus dll014, popsaný v publikaci Bridge a Ketner, 1989 byl pěstován v buněčné linii W152, která je odvozena od buněčné linie Věro, ATCC ě. CCL81 a jejíž příprava byla popsána v publikaci Weinberg a Ketner, 1983. Výroba viru ve velkém měřítku, čištění viru a stanovení koncentrace virionu bylo uskutečněno způsobem, popsaným svrchu pro mutantu dl312.

iii) Biotinylace adenoviru

2,4 ml roztoku adenoviru dl312 po filtraci na gelu Sephadex G-25 PD10 (Pharmacia) s obsahem přibližně ÍO¹¹ částic viru v roztoku s obsahem 150 mM NaCl, 5 mM HEPES o pH 7,9 a 10 % glycerolu bylo smíseno s 10 mikrolitry, mmol 1 mM roztoku NHS-LC-biotinu (Pierce 21335). Po 3 hodinách stáni při teplotě místnosti se virus, modifikovaný biotinem oddělí od přebytku reakční směsi filtrací na gelu stejným způsobem jako svrchu. Roztok se upraví přidáním glycerolu na koncentraci glycerolu 40 % (celkový objem roztoku je 3,2 ml) a pak se uloží při teplotě -25 °C. Biotinylaci viru je možno stanovit kvantitativní zkouškou po nakapání různých ředění roztoku na membránu z dusičnanu celulózy. Po usušení roztoku 2 hodiny při teplotě 80 °C ve vakuu se materiál blokuje působením BSA, inkubuje se se streptavidinem, konjugovaným s alkalickou fosfatázou (BRL), promyje se a pak se 1 hodinu inkubuje s vyvíjecím roztokem NBT/X-fosfát (obsahuje tetrazoliovou sůl nitromodři a toluidinovou sůl 5-brom-4-chlor-3-indolylfosfátu, Boehringer Mannheim), čímž dojde k positivní barevné reakci, jejíž intenzita se vyhodnotí.

Při biotinylaci adenoviru dll014 se vychází z 15 ml 12 - .

roztoku s obsahem adenoviru 1,2 x 10 castic v 1 ml, tento roztok se zpracuje působením 150 mikrolitrů 1 mM NHS-LC-biotinu. Po 3 hodinách při teplotě místnosti se materiál dialýzuje přes noc proti 1 litr HBS se 40 % glycerolu při teplotě 4 °C, pak se pufr nahradí čerstvým pufrem a provede se druhá dialýza. Tímto způsobem se získá roztok viru s ob12 sáhem přibližně 1,2 x 10 částic/ml.

iv) Inaktivace biotinylovaného adenoviru působením 8-methoxypsoralenu

Vždy 200 mikrolitrů biotinylovaného roztoku viru se uloží do dvou vyhloubení plotny pro tkáňové kultury (1,6 cm). Ke každému vzorku se přidají 2 mikrolitry (33 mg/ml) 8-methoxypsoralenu (Sigma, číslo katalogu M-3501, roztok v DMSO), plotna se uloží do ledu a ozařuje 10 minut ultrafialovým světlem o 365 nm, lampa UVP TL-33), přičemž vzdálenost vzorku od filtru je 4 cm. Po ozáření se oba vzorky spojí a podrobí se filtraci na gelu Sephadex G50 (Nick-Sáule, Pharmacia), přičemž se sloupec uvádí do rovnovážného stavu s HBS se 40 % glycerolu.

Inaktivace biotinylovaného adenoviru dll014 se prová12 dí tím způsobem, že se 4 ml roztoku viru s obsahem 1 x 10 částic viru smísí se 40 mikrolitry 8-methoxypsoralenu ve formě roztoku v DMSO s obsahem 33 mikrogramů/mikrolitr uvedené látky. Vzorky se nechají 1 hodinu stát při teplotě míst nosti a pak se uloží do misek pro tkáňové kultury v množství 12 x 300 mikrolitrů, misky se uloží do ledu na 25 minut stej ným způsobem jako svrchu a stejným způsobem se také ozařují ultrafialovým světlem. Nakonec se materiál podrobí ve dvou podílech filtraci na gelu Sephadex G-25 PD10 v rovnovážném stavu v HBS se 40 % glycerolu. Tímto způsobem se získá 4,5 ml roztoku viru s obsahem 9,4 x 10¹¹ částic/ml.

f) Příprava komplexů pro transfekci

Ternární komplexy pro transfekci je možno připravit ve 3 stupních. V prvním stupni se biotinylovaný adenovirus smísí ve 100 mikrolitrech HBS se streptavidinylovaným polylysinem (StreptpL) a pak se směs inkubuje 30 minut při teplotě místnosti. Pak se ke směsi přidá 6 mikrogramů DNA-plasmidu ve 150 mikrolitrech HBS, směs se dobře promíchá a pak se ještě 30 minut inkubuje. Nakonec se přidá polylysinem modifikovaný lidský transferrin (TfpL) ve 150 mikrolitrech HBS, směs se důkladně promíchá a inkubuje 30 minut. Množství adenoviru, StreptpL a TfpL se uvádí v jednotlivých příkladech. Poměr mezi DNA plasmidu a konjugátem polylysinu se propočítává s ohledem na elektroneutralitu jednotlivých výsledných komplexů. Pro transfekci se komplexy nanesou na buněčný materiál v celkovém objemu 2 ml živného prostředí bez obsahu FCS. Po 4 hodinách inkubace při teplotě 37 °C se živné prostředí odstraní a přidá se čerstvé prostředí s obsahem séra.

g) Buněčný materiál a použité prostředí

i) Buňky myšího melanomu

Buněčná linie myšího melanomu Cloudman S91 (klon M3) byla získána ze sbírky kultur ATCC (č. CCL 53.1). Buněčný materiál byl pěstován v miskách z plastické hmoty s průměrem 6 cm nebo v lahvích pro pěstování tkáňových kultur T25 po převrstvení 0,1% želatinou v prostředí Ham F10 s obsahem 12,5 % koňského séra, 2,5 % FCS, 2 mM giutaminu a také s obsahem antibiotik.

ii) Myší fibroblasty

Primární myší fibroblasty byly izolovány z myší kmene DBA/'2 následujícím způsobem: 4 týdny staré myši DBA/2 byly usmrceny zlomením vazu a uloženy do 70% ethanolu. Svaly zad nich končetin byly odděleny za sterilních podmínek a pak byly promyty PBS. Pak byly svaly rozděleny na části menší než 2 mm a přebytečný PBS byl odstraněn. Fragmenty tkáně byly promyty 3x5 ml PBS s obsahem 0,25 % trypsinu za slinivky vepře (Sigma, č. katalogu T-2904), 0,1 % kolagenázy (typ XI, Sigma, č. katalogu C-9407), 0,1 % BSA (frakce V, Boehringer Mannheim, č. katalogu 735 094) a pak byla směs 30 minut inkubována za protřepávání při teplotě 37 °C. Pak se fragmenty tkáně nechaly 5 minut usadit a supernatant s obsahem uvolněných buněk byl smísen s 5 ml prostředí DMEM s obsahem 20 % FCS. Nedisociovaný materiál byl zpracováván působením enzymu ještě 30 minut a supernatant pak byl odebrán stejně jako svrchu. Tento postup byl opakován tak dlouho, až byl rozrušen veškerý materiál. Supernatanty byly spojeny a odstředěny 15 minut při 500 g, usazenina buněk pak byla znovu uvedena do suspenze v prostředí DMEM s obsahem 20 % FCS a buňky byly použity k naočkování živného prostředí v lahvích pro pěstování kultur. Po 30 minutách byly buňky, které nepřilnuly odstraněny odsátím a bylo přidáno čerstvé živné prostředí.

iii) Lidské melanomové buňky

Primární buňky lidského melanomu byly izolovány z chirurgicky odstraněných nádorů. Nádory byly mechanicky rozrušeny pomocí pinsety a chirurgického skalpelu v přítomnosti živného prostředí RPMI 1640 s obsahem 5 % FCS, mM glutaminu a antibiotik na malé fragmenty. Pak byly fragmenty tkáně opatrně protlačeny pístem injekční stříkačky přes kovové síto. Pak byl materiál opakovaně promýván odstředěním a opětným uvedením usazeniny do suspenze a uvolněný buněčný materiál pak byl užit k naočkování lahví T25 pro pěstování buněčných kultur.

iv) Lidské fibroblasty

Vzorky kůže, odebrané při biopsii chirurgicky byly uloženy při teplotě 4 °C do živného prostředí DMEM s obsahem 10 % FCS, 2 mM glutaminu a antibiotik (penicilín a streptomycin nebo v případě lidských fibrobiastů gentamycin) Vzorky, odebrané při biopsii byly rozděleny pomocí pinsety a chirurgického skalpelu v laminárním proudu vzduchu ve sterilních miskách z plastické hmoty s průměrem 6 cm rozloženy na malé částice. Pak byly přidány 3 ml prostředí DMEM s obsa hem 20 % FCS, 2 mM glutaminu a antibiotik a kultura byla uložena při teplotě 37 °C. Po 10 dnech bylo prostředí nahrazeno prostředím DMEM s obsahem 10 % FCS. Pak bylo prostředí měněno vždy 2x týdně. Čtyři týdny od počátku pěstování kultury byly buňky, vymyté z fragmentů tkáně zpracovány působením trypsinu a přeneseny do nových misek pro pěstování kultur pro transfekci.

Další, výhodný postup spočívá v tom, že se fragmenty pokožky po rozdělení na malé částice přenesou do čerstvého prostředí a podle potřeby se jednou nebo dvakrát tímto prostředím promyjí. Pak se uloží 5 až 10 fragmentů tkáně do lahve T25 pro tkáňové kultury s povrchem, smočeným živným prostředím DMEM s 10 % FCS a materiál se rovnoměrně rozprostře a pak se láhev otočí. Tímto způsobem se fragmenty tkání dostanou na spodní stranu horní stěny lahve. Tento postup byl popsán v publikaci Jones, 1989. Lahve se uloží na 1 až 3 hodiny při teplotě 37 °C, pak se opět otočí a přidá se 1 až 2 ml živného prostředí. Po 24 hodinách se v případě přilnutí fragmentů objem živného prostředí doplní na 5 ml, jinak se postup musí opakovat. Po 6 až 10 dnech vyrostou z fragmentů první fibroblasty, po této době se pak živné prostředí nahradí jednou týdně čerstvým živným prostředím. Jakmile se vytvoří souvislá vrstva buněk, je buněčný materiál možno přenést do další lahve T75.

v) KB-buňky

Buněčná linie KB lidského epidermoidního karcinomu byla získána ze sbírky kultur ATCC, ě. CCL 17. Buněčný materiál byl pěstován v miskách z plastické hmoty s průměrem 6 cm v prostředí MEM s obsahem 10 % FCS, 2 mM glutaminu a s obsahem antibiotik.

h) Stanovení exprese genu

i) Zkouška na luciferázu

Příprava buněčných extraktů, standardizace obsahu bil koviny a stanovení aktivity luciferázy byly provedeny způso bem podle publikací Zenke a další, 1990, Cotten a další, 1990 a podle EP 388 758.

ii) Zkouška na IL-2

Exprese interleukinu-2 byla stanovena pomocí biologie ké zkoušky podle publikace Karasuyama a Melchers, 1988. Mimoto byla produkce IL-2 sledována při použití balíčku ELISA pro IL-2 (Becton Dickinson, č. katalogu 30032) podle návodu výrobce.

iii) Zkouška na IFN-gamma

Zkouška na expresi IFN-gamma myši byla prováděna při použití balíčku Intertest.gamma, ELISA pro IFN-gamma, (Genzyme, č. katalogu 1557-00).

iv) Zkouška na GM-CSF

Exprese GM-CSF byla stanovena s použitím běžně dodává ného zkušebního balíčku ELISA (Endogen).

j) Zkoušky na složky komplexu

Aby bylo možno vyzkoušet průkaznost pokusů, týkajících se schopnosti internalizace při použití různých vazných řetězců nebo účinnost konstrukce sobsahem DNA, byly v předběžných pokusech provedeny pokusy na transfekci s použitím různých typů viru. Tyto pokusy prokázaly, že výsledky, získané s použitím dl312 je možno přenést na adenovirus dl213, inaktivovaný kombinací psoralenu a ultrafialového světla a na adenovirus dll014, inaktivovaný rovněž kombinací psoralenu a ultrafialového světla. V jednotlivých pokusech byla proto užita mutanta dl312.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Přenos genu do kultury buněk primárního lidského melanomu

Izoláty primárních buněk lidského melanomu, které byly získány od dvou různých nemocných (HMM-1 a HMM-2), byly po různých časových intervalech od počátku kultury podrobeny transfekci s použitím komplexů s obsahem následujících složek: 1,7 x ΙΟ^θ částic adenovirů dl312, 100 ng StreptpL, 6 mikrogramů pCMVL-DNA a 7 mikrogramů TfpL. Po 24 hodinách po transfekci byla stanovena exprese luciferázy. Tato exprese byla standardizována na základě obsahu bílkovin v lyzátu buněk na 1 x 10 buněk. Výsledky těchto pokusů s transfekci jsou znázorněny na obr. 1.

Příklad 2

Stanovení vazných řetězců, které se účastní příjmu komplexu pro přenos genu do buněk

Primární izoláty buněk lidského melanomu HMM-1 byly podrobeny transfekci při použití 1,7 x ÍO¹^ částic adenoviru dl312, 100 ng StreptpL, 6 mikrogramů pCMVL-DNA, 7 mikrogramů TfpL dva týdny od založení kultury. Současně byla uskutečněna transfekce v přítomnosti 50násobného molárního přebytku volného transferrinu s obsahem železa pro srovnání internalizace komplexu TfpL-DNA-adenovirus. Jako alternativa byly vytvořeny komplexy pro transfekci, v nichž byl TfpL nahrazen nekonjugovaným pL. Výsledky tohoto pokusu jsou znázorněny na obr. 2. Ukázalo se, že přidáním volného transferrinu dochází ke snížení exprese luciferázy, což je patrně způsobeno tím, že komplexy jsou alespoň částečně přijímány také vazbou na receptory pro transferrin. Na druhé straně však stále ještě dobrá úroveň exprese genu, dosažená v přítomnosti volného transferrinu prokazuje, že také vazba na receptory pro adenovirus má velký význam.

Příklad 3

Vliv inaktivace adenoviru dl312 kombinací psoralenu a ultrafialového světla na toxicitu pro primární buňky lidského melanomu po transfekci „ . 5

Primární buňky lidského melanomu v množství 3 x 10

HMM-1 byly v Petriho miskách s průměrem 6 cm podrobeny transfekci při použití komplexů, které obsahovaly 1,2 χ ΙΟ^θ částic adenoviru dl312, 1200 ng StreptpL, 6 mikrogramů pCMVL 9 - .

a 5,6 mikrogramů TfpL nebo s obsahem 7,5 x 10 castic adenoviru dl312, inaktivovaných kombinací 8-methoxypsoralenu a ultrafialového světla (dl312 Pl), 600 ng StreptpL, 6 mikrogramů pCMVL a 6,6 mikrogramů TfpL (optimální množství StreptpL pro jednotlivé typy virů bylo stanoveno v průběhu předběžných pokusů pomocí titrace. Po dni 1, dni 3 a dni 7 5 po transfekci byla změřena exprese luciferázy pro 3 x 10 buněk. Účinek inaktivace adenoviru kombinací 8-methoxypsoralenu a ultrafialového světla na expresi genu je znázorněn na obr. 3. Sedm dnů po transfekci bylo možno pozorovat podstatné snížení exprese genu, spojené se závažnými cytopathickými změnami buněk této kultury. Při transfekci buněk adenovirem inaktivovaným kombinací 8-methoxypsoralenu a ultrafialového světla došlo ke snížení cytopathických změn a po sedmi dnech bylo možno pozorovat lOx vyšší hodnoty exprese než v případě neinaktivovaného viru.

Příklad 4

Stanovení toxicity adenovirů

Fibroblasty, pocházející z maligního melanomu byly podrobeny transfekci působením kombinačních komplexů, které obsahovaly adnovirus dl312 nebo adenovirus dl312, inaktivovaný kombinací 8-methoxypsoralenu a ultrafialového světla nebo adenovirus d!1014.

Buněčný materiál byl podroben transfekci při použití komplexů s obsahem následujících složek: 6 mikrogramů pCMVL-DNA, 0,8 mikrogramů StreptpL, 6,8 mikrogramů TfpL a mikrolitrů roztoku s obsahem adenovirů dl312 (0,25 x 10 částic viru/mi) nebo 40 mikrolitrů roztoku adenovirů dl312, inaktivovaného kombinací 8-methoxypsoralenu a ultrafialového světla (0,13 x 10 částic viru/ml) nebo 3 mikrolitry roztoku adenovirů dll014 (4,1 x 10 částic viru/ml). Podíly 100 mikrolitrů této směsi nebo ředění vždy 1 : 3 této směsi (aby bylo možno získat poměr viru a buněk, uvede4 „ , ný na obr. 4), bylo naneseno na 3 x 10 buněk v každém vyhloubení plotny pro buněčné kultury (24 vyhloubení na plotně) v 500 mikrolitrech prostředí RPMI se 2 % FCS. Po 2 hodinách při teplotě 37 °C bylo prostředí nahrazeno 2 ml RPMI s 10 % FCS. Po osmi dnech bylo prostředí odstraněno, buněčný materiál byl fixován 5 minut 4% formaldehydem se 150 mM NaCl a pak byl 10 minut barven 0,1% roztokem krystalové violeti ve 2% ethanolu. Pak byl buněčný materiál promyt dvěma podíly PBS, lx vodou a pak se fotografuje. Výsledek testu na cytotoxici tu je znázorněn na obr. 4. Při standardním poměru viru a buněk 100 : 1 je adenovirus dl312 cytotoxický. Tato cytotoxicita může být zeslabena působením kombinace psoralenu a ultrafialového světla. Totéž množství adenoviru dll014 nemělo na buněčný materiál žádný cytotoxický účinek.

Příklad 5

Vliv ozáření nádorových buněk na expresi genu χ 10⁵ primárních buněk lidského melanomu s označením HMM-5 nebo buněk buněčné linie myšího melanomu M-3 by9 lo zpracováno s použitím komplexu, který obsahoval 3 xlO částic adenoviru dll014, inaktivovaného kombinací 8-methoxypsoralenu a ultrafialového světla, 600 ng StreptpL, mikrogramů pCMVL a 6,8 mikrogramů TfpL. 6 hodin po transfekci byl buněčný materiál ozářen dávkami v rozmezí 0 až 100 Gy. 48 hodin po ozáření byla měřena exprese genu pro luciferázu. Hodnoty, uvedené na obr. 5 jsou hodnoty pro expresi luciferázy ve světelných jednotkách na mikrogram bílkoviny v rozrušených buňkách.

Příklad 6

Vliv koncentrace plasmidů na expresi genu x 10⁵ buněk myšího melanomu M-3 bylo podrobeno - - 9 transfekci při použití komplexů, obsahujících 8,6 x 10 částic adenoviru dll014, inaktivovaného kombinací 8-methoxypsoralenu a ultrafialového světla, 400 ng StreptpL, 6 mikrogramů DNA a 5,1 mikrogramů TfpL. Uvedené komplexy byly použity k transfekci v kombinacích ve formě plasmidů (pCMVL/pSP = pSP65, Boehringer Mannheim, pSVEmu-IFN-gamma,

IFN-gamma/pBCMGneo-mIL-2) při různých poměrech hmotnostního množství plasmidů. Množství plasmidů a dosažené hodnoty exprese genu jsou shrnuty v tabulce I, na obr. 6 (exprese luciferázy) a na obr. 7 (IFN-gamma/IL-2).

Příklad 7

Ztráta schopnosti vyvolat tvorbu nádoru u myších melanomových buněk po transfekci

Buňky myšího melanomu M-3 (3 x 10 buněk na Petriho misku s průměrem 5 cm) byly podrobeny transfekci při použi, 9 ti 2 x 10 castic adenoviru dl312, 250 ng StreptpL, 6 mikrogramů DNA-plasmidu (s obsahem řetězce pro IL-2 myši nebo pro IFN-gamma myši) a 7,5 mikrogramů TfpL. 4 hodiny po transfekci byl buněčný materiál promyt celkem dvakrát při použití

Hamova živného prostředí F10 bez sera. Pak bylo 1 x 10 buněk vstřiknuto podkožně pod kůži zad šesti anestetizovaným myším kmene DBA/2. Kontrolní skupina byla tvořena šesti zví5 řaty DBA-2 jimž bylo vstřiknuto množství 1 x 10 buněk M-3 bez transfekce. Růst nádoru v místě injekce byl sledován jednou týdně. Na obr. 8 je znázorněn průběh tvorby nádorů v místě injekce.

Příklad 8

Indukce systemické imunitní odpovědi proti melanomu imunizací nádorovými buňkami, ozářenými a po transfekci cytokinem (myší model na profylaktické použití)

a) Buňky myšího melanomu M-3 (3 x 10 buněk na láhev T25 pro pěstování kultur) se podrobí transfekci při použití 9 x 10 částic adenoviru dll014, inaktivovaných kombinaci

8-methoxypsoralenu a ultrafialového světla, 6 ng StreptpL, mikrogramů DNA-plasmidu pro IL-2 nebo DNA-plasmidu pSP, neobsahujícího žádnou uloženou cDNA a proto nevyvolávajícího expresi žádného produktu genu v buňkách po transfekci a 6,8 mikrogramů TfpL. 4 hodiny po transfekci se komplexy pro transfekci odstraní a přidá se čerstvé prostředí s obsahem séra. Pak se buněčný materiál 6 hodin po transfekci ozáří rtg-zářením, užije se dávka 20 Gy a buňky se pěstují dalších 18 hodin. 24 hodin po transfekci se buněčný materiál zpracuje trypsinem, 2x se promyje Earlovým roztokem solí s obsahem pufru (EBSS) a množství buněk v kultuře se upraví c na koncentraci 1 x 10 buněk/ml. Anestetizované myši kmene DBA/2 se imunizují vstřiknutím 1 x 10 buněk podkožně pod kůži zad. Současně se skupina 6 myší imunizuje buňkami M-3 bez transfekce, tyto buňky byly ozářeny a dále zpracovávány stejným způsobem jako buňky po transfekci.

Týden po první imunizaci se myším podá další dávka imunizačního prostředku, stejná jako při první imunizaci.

Po dalším týdnu se zvířatům podá vysoce tumorigenní dávka ,

x 10 buněk M-3, tento materiál se podá na místo, vzdálené od místa předchozí imunizace. Mimoto se nádory naočkují ještě skupině 4 myší, které nebyly imunizovány, a to stejným způsobem jako u imunizovaných myší. Osm týdnů po implantaci nádorových buněk se u všech neimunizovaných zvířat (4/4) vyvinuly nádory, kdežto všechny myši, imunizované buňkami M-3 po ozáření a po transfekci IL-2 byly prosté nádorů (0/5). Myši, které byly imunizovány buněčným materiálem M-3 bez transfekce nebo ozářenými buňkami M-3 po transfekci prázdným plasmidem (pSP), byly chráněny pouze částečně, u čtyř myší ze šesti se vyvinuly nádory (4/6). Vznik nádorů u zvířat je shrnut v tabulce II a znázorněn na obr. 9. Získané výsledky prokazují, že při imunizaci myší ozářenými nádorovými buňkami, které mimoto byly podrobeny transfekci při použití IL-2 dochází k vyvolání systemické imunitní odpovědi, která zvířata ochrání od následujícího vzniku a vývoje nádorů.

b) V další řadě pokusů byly myši stejným způsobem jako svrchu imunizovány při použití ozářených buněk H-3, které byly podrobeny transfekci při použití komplexů, obsahujíg cích 3 x 10 částic adenoviru dll014, inaktivovanych kombinací 8-methoxypsoralenu a ultrafialového světla, 600 ng StreptpL, a) 6 mikrogramů IL-2-plasmidu pBCMGneo-mIL-2 (100 % IL-2), b) 5,4 mikrogramů plasmidu pSP a 0,6 mikrogramů IL-2-plasmidu (10 % IL-2), c) 5,4 mikrogramů IL-2-plasmidu a 0,6 mikrogramů plasmidu IFN-gamma (90 % IL-2 + 10 % IFN-gamma) nebo d) 5,4 mikrogramů plasmidu pSP a 0,6 mikrogramů plasmidu IFN-gamma (10 % IGN-gamma), a 4,7 mikrogramů TfpL. Mimoto byla skupina myší imunizována ozářenými buňkami M-3, které byly mimoto podrobeny transg fekci při použití 3,6 x 10 inaktivovaných částic adenoviru dl312, 600 ng StreptpL, 6 mikrogramů plasmidu IL-2 a 4,7 mikrogramů TfpL (100 % IL-2, dl312). Týden po další injekci byly imunizovaným a pro kontrolu také ne imunizovaným zvířatům implantovány buňky M-3 v množství 1 x 10 . Vznik a vývoj nádorů je shrnut v tabulce III.

c) V další řadě pokusů byly myši stejným způsobem jako svrchu imunizovány při použití ozářených buněk M-3, které byly mimoto podrobeny transfekci s použitím komplexů, obsahujících 3 x 10 částic adenoviru dll014, inaktivovaných kombinací 8-methoxypsoralenu a ultrafialového světla, 600 ng StreptpL, a) 6 mikrogramů plasmidu IL-2 - 100 % IL-2, b) 5,76 mikrogramů plasmidu pSP a 0,24 mikrogramů plasmidu IL-2 = 4 % IL-2 nebo c) 6 mikrogramů plasmidu pSP a 4,7 mikrogramů TfpL. Produkce IL-2 ozářenými buňkami po transfekci byla měřena ve dni, kdy byla provedena imunizace.

Buňky M-3 po transfekci 100% plasmidem IL-2 produkovaly

000 jednotek IL-2 na 1 x 10° buněk za 24 hodin, kdežto buňky M-3 po transfekci 4% plasmidem IL-2 produkovaly 396 g

jednotek IL-2 na 1 x 10 buněk za 24 hodin. Po týdnu po další dávce imunizačního prostředku bylo imunizovaným zví5 řatům i neimunizovaným kontrolám implantováno 1 x 10 buněk M-3. Aby bylo možno získat větší množství informací o velikosti imunitní odpovědi, vyvolané imunizací s použitím různých množství plasmidu IL-2, bylo dalším skupinám myší 5 6 ~ implantováno 3 x 10 buněk M-3 a 1 x 10 buněk M-3. Aby bylo možno prokázat specifičnost imunitní odpovědi pro uvedený nádor, bylo skupině myší, imunizovaných ozářenými buň5 kami M-3 po transfekci 100 % IL-2 implantováno 1 x 10 buněk epitheliálního karcinomu KLN 205 (ATCC č. CRL 1453). Vývoj nádorů je shrnut v tabulce IV.

Příklad 9

Přenos genu do buněk buněčné linie epidermoidního karcinomu

Buňky KB byly pěstovány při hustotě 400 000 buněk v misce s průměrem 6 cm a byly podrobeny transfekci pomocí 9 „ , různých komplexů, které obsahovaly 2,5 x 10 částic adenoviru dl312, 200 ng StreptpL, 6 mikrogramů DNA-plasmidu pCMVL a pak ještě 3,8 mikrogramů polylysinu, 3,8 mikrogramů EGF-pL (množství, je vztaženo na obsah polylysinu) nebo 6 mikrogramů TfpL. Vždy 50 mikrolitrů komplexu bylo smíšeno s 1,5 ml prostředí s obsahem 2 % FCS nebo bez séra.

V pokusech na kompetici bylo ke směsi komplexu a prostředí přidáno ještě množství 1 mikrogram EGF. Komplexy s prostředím byly přidány k buněčnému materiálu. Po 2 hodinách inkubace při teplotě 37 °C bylo prostředí odstraněno a bylo při dáno čerstvé prostředí s obsahem séra.

Při ukončení kultivace po 24 hodinách a zkoušce na luciferázu byly získány následující výsledky (obr. 10A: pokus se 2 % FCS, obr. 10B: pokus bez FCS. Z obr. 10A je zřejmé, že při použití EGFpL bylo získáno 20845000 světelných jednotek. Tato hodnota je podstatně vyšší než v případě použití TfpL (3970000) nebo polylysinu (pLys 10550000).

V kompetičním pokuse s volným EGF bylo oproti pokusům, prováděným s TfpL (TfpL + EGF 12350000 světelných jednotek) nebo s polylysinem (pLys + EGF 14055000) prokázáno očekávané snížení signálu (EGFpL + EGF 14150000). Tyto skutečnosti prokazují, že zesílený přenos genů přes EGF-receptor probíhá specificky vzhledem k vaznému řetězci. V pokusech bez FCS (obr. 10B), byl vliv EGFpL ještě vyjádřenější (EGFpL 15150000, TfpL 2000000, pLys 5100000, EGFpL + EGF 5900000 světelných jednotek. Hodnoty exprese jsou vztaženy na 50 % buněk.

Analogickým způsobem byly podrobeny transfekci buňky 9 - .

KB při použití komplexů, které obsahovaly 5 x 10 castic adenovirů dll014, inaktivovaných kombinací 8-methoxypsoralenu a ultrafialového světla. Byly prokázány srovnatelné hodnoty pro expresi luciferázy.

Příklad 10

Exprese IL-2 při použití různých vektorů

a) Buňky M-3 x 10^ buněk M-3 bylo podrobeno transfekci s použitím různých konstrukcí plasmidů, které jako svou složku obsahovaly ternární komplexy. 3 mikrolitry částic adenovirů dl312, 0,3 mikrolitrů (přibližně 200 ng) StreptpL, 6 mikrogramů TfpL a 6 mikrogramů DNA-plasmidu (BCMGnebo-mIL-2, pWS2m, MBGneo-mIL-2 nebo pCM2) bylo promíseno a pak doplněno HBS na celkový objem 500 mikrolitrů.

Pro pokusy s adenovirem dll014, inaktivovaným kombinací 8-methoxypsoralenu a ultrafialového světla byly použity následující komplexy pro transfekci: 9 mikrolitrů roztoku s obsahem viru, 500 ng StreptpL, 6 mikrogramů TfpL a 6 mikrogramů BCMGneo-mIL-2.

Po časových odstupech, uvedených na obr. 11 byla stanovena aktivita IL-2. V případě BCMGneo-mIL-2 bylo mimoto po 48 hodinách prokázáno 64 000 jednotek a po 28 dnech 7 128 jednotek (na obr. 11 není znázorněno). Pro pCM2 byle po 48 hodinách prokázáno 3227 jednotek a po 28 dnech 950 jednotek, pro BMGneo-mIL-2 bylo po 24 hodinách prokázáno 396 jednotek, po 48 hodinách bylo prokázáno 604 jednotek, po 7 dnech 297 jednotek a po 14 dnech 264 jednotek (na obr. 11 není znázorněno).

b) Fibroblasty

Primární lidské fibroblasty byly podrobeny transfekci při použití IL-2-konstrukcí stejně jako v odstavci a) a exprese IL-2 byla stanovena ve dnech po transfekci, tak jak jsou uvedeny na obr. 12. Složení prostředí pro transfekci bylo pro BCMGneo-mIL-2 stejné jako v případě buněk M-3. Pro BMGneo-mIL-2 byl vytvořen také obdobný komplex pro transfekci.

Příklad 11

Melanomové buňky, na jejichž povrchu dochází k expresi HSA stimulují imunitní odpověď a mají ochranný účinek proti nemodifikovaným nádorovým buňkám

Buňky M-3 byly pěstovány v Hamově prostředí F12, doplněném 12,5 % koňského séra a 2,5 % FCS v miskách z plastic ké hmoty s povlakem želatiny. 24 hodin před transfekcí byl 5 „ buněčný materiál vždy v množství 3 x 10 buněk přenesen do 2 lahví pro kultury s plochou 25 cm . Komplexy pro transfekci tohoto množství buněk byly připraveny tak, že 9 mikrolitrů biotinylovaného adenoviru d!1014, inaktivovaného kombinaci 8-methoxypsoralenu a ultrafialového světla (l·,⁴ x 10 častic/ml), 5,2 mikrogramů transferrin-polylysin, 800 ng streptavidin-polylysin a 6 mikrogramů DNA-plasmidu (pSP, pWS2m v kombinaci se pSP, pHSA v kombinaci s pSP nebo IL-2 v kombinaci s pHSA) se promíchá v celkovém objemu 500 mikrolitrů. Toto množství se pak přidá do každé lahve pro pěstování kultur ve 2 ml Hamova prostředí F12, doplněného 12,5 % koňského séra a 2,5 % FCS. Směs se inkubuje 2 hodiny při teplotě 37 °C, pak se živné prostředí nahradí čerstvým prostředím a buněčný materiál se ozáří 20 Gy. 24 hodin po transfekci se buněčný materiál zpracuje působením trypsinu, dvakrát se promyje HBSS (Hankovo solné prostředí s obsahem pufru), stanoví se počet buněk, který se pak upraví na 100 000 buněk ve 100 mikrolitrech HBSS. Tímto způsobem se získá vakcína, která se v průběhu 50 minut použije ve formě injekce k imunizaci myší.

Myši byly imunizovány stejným způsobem jako v předchozích příkladech. Byly použity dvě injekce vakcíny s obsahem vždy 100 000 buněk, vykcinace byla provedena na dvou odlišných místech pod kůži zad v odstupu 1 týdne. Týden po druhé injekci bylo myším vstřiknuto na třetí místo pod kůži zad množství 300 000 nemodifikovaných neozářených buněk M-3 ve 300 mikrolitrech HBSS. Pak byl po jednotlivých týdnech kontrolován vznik nádorů.

Na obr. 13 jsou znázorněny výsledky těchto pokusů.

Na ose úseček je uveden počet dnů, na ose pořadnic objem nádoru v mm . Čísla vedle koncových bodů uvádějí počet myši s nádory, lomený celkovým počtem myší v každé skupině. pSP:

mikrogramů pSP; 80 IL-2/20 pSP; 4,8 mikrogramů pWS2m plus 1,2 mikrogramů pSP; 20 HSA/80 pSP: 1,2 mikrogramy pHSA plus 4,8 mikrogramů pSP; 80 IL-2/20 HSA: 4,8 mikrogramů pWS2m plus 1,2 mikrogramů pHSA.

Očkování ozářenými buňkami M-3 po transfekci prázdným vektorem pSP nevedlo k ochraně myší proti růstu nádoru. U čtyř ze šesti myší se vytvořily velké nádory. V případě buněk, produkujících IL-2, bylo možno pozorovat mírný ústup nádorů u všech myší ve skupině (3/3), nádory se však vyvíjely. Tento jev je pravděpodobně způsoben tím, že podmínky pokusu byly upraveny s ohledem na zkoušku na účinek HSA a byly použity myši, jimž byla podána trojnásobná dávka buněk při nižší dávce IL-2-DNA. Naprotitomu u myší, které byly očkovány buňkami M-3, u nichž dochází k expresi HSA, bylo možno pozorovat silně potlačený růst nádorů. Myši, které byly očkovány při použití buněk, u nichž docházelo k expresi HSA i IL-2, byly postiženy nádorem daleko méně často (2/6) a vytvořené nádory byly malé ve srovnání s kontrolními nádory (očkování při použití buněk po transfekci prázdným vektorem pSP). Průměrná velikost nádorů v tomto případě by3 3 la 18 mm ve srovnání s 1149 mm .

Příklad 12

Melanomové buňky, na jejichž povrchu dochází k expresi neoantigenu viru vztekliny stimulují imunitní odpověd a mají ochranný účinek proti nemodifikovaným nádorovým buňkám

Buňky M-3 byly zpracovávány a podrobeny transfekci stejným způsobem jako v příkladu 11. Pokud jde o dobu působení komplexů pro transfekci, vyrobených stejným způsobem jako v příkladu 11 (6 mikrogramů DAN-plasmidu), byly komplexy ponechány ve směsi s buňkami 4 hodiny místo 2 hodiny.

Injekce byly myším podávány rovněž analogickým způsobem jako v příkladu 11 s tím rozdílem, že odstup mezi jednotlivými injekcemi byl prodloužen z jednoho týdne na dva týdny a objem, který byl myším vstřiknut byl v každém případě 100 mikrolitrů.

Na obr. 14 jsou znázorněny výsledky těchto pokusů, grafické znázornění je obdobné jako na obr. 13. V případě negativní kontroly s použitím pSP došlo, jak bylo možno očekávat, k velkému růstu nádorů. Pozitivní kontrola, při níž byl použit k transfekci pouze plasmid pWS2m (100 % IL-2) prokázala úplnou ochranu, buněčný materiál po transfekci produkoval 24 hodin po transfekci před injekčním podáním £

000 jednotek IL-2/10 buněk. U těch skupin myší, které byly imunizovány s použitím pouze 50 % pWS2m (50 % tvořil prázdný vektor pSP) bylo možno pozorovat nedostatečnou ochranu. Tuto ochranu bylo možno podstatně zlepšit v případě, že byl místo prázdného vektoru současně k transfekci použit plasmid pWS-RABIES k expresi antigenů viru vztekliny. Došlo ke slabému růstu nádoru mezi druhým a čtvrtým týdnem, avšak od pátého týdne nýdory opět ustupovaly.

Příklad 13

Srovnání různých postupů pro inaktivaci adenoviru

V rámci příkladů byly použity různé postupy, sloužící k inaktivaci virů. Bylo by zapotřebí tyto postupy srovnávat pokud jde o dosažené snížení titru viru a o schopnost inaktivovaného viru zesílit přenos genu endocytosou, zprostředkovanou přes receptory. Dále bylo sledováno, které geny viru jsou touto inaktivaci vyřazeny.

a) Zkoušky na inaktivací adenoviru působením 8-methoxypsoralenu

i) Inaktivace viru

Vzorky biotinylovaného adenoviru dll014 (300 mikrolitrů) ve směsi HBS/40 % glycerolu byly uloženy do čtyř vyhloubení misky pro tkáňové kultury (NUNC, č. katalogu 176740) Podíly po 33 mg 8-methoxypsoralenu/ml DMSO byly přidány ke vzorkům viru k dosažení požadované konečné koncentrace. Pak byla miska s uzavřeným víčkem uložena do ledu a stejně jako v odstavci e) iv) v části, popisující použité metody, byla 25 minut ozařována ultrafialovým světlem, přičemž vždy po 10 minutách byla poloha misky pozměněna. Nezreagovaný psoralen byl odstraněn filtrací na gelu. K tomuto účelu byl vzorek viru s psoralenem v objemu 2 ml nanesen na sloupec gelu Pharmacia PD-10, uvedený do rovnovážného stavu ve 30 ml HBS se 40 % glycerolu. Vzorek byl nanesen na vrchol sloupce v 0,5 ml HBS se 40 % glycerolu a virus byl vymýván tímtéž pufrem, přičemž prvních 400 mikrolitrů eluátu bylo odloženo a následující 4 ml byly odebrány ve frakcích s objemem 0,5 ml. Aby bylo možno frakce viru identifikovat, byla provedena zkouška s ninhydrinem, pozitivní frakce byly spojeny, byla stanovena koncentrace bílkoviny a virus byl po jednotlivých podílech zmrazen na -70 °C.

ii) Titrace 8-methoxypsoralenu (CPE proti přenosu genu)

Titrace byla provedena za účelem zjistit optimální koncentraci psoralenu, která při úplné inaktivací viru neovlivní schopnost transportu DNA viru. Bylo již uváděno, že v některých případech není možno dosáhnout dobré inaktivace při použití psoralenu v koncentraci, blízké nasycení, kdežto lepších výsledků bylo dosaženo při nižší koncentraci uvedené látky. Tento jev by mohl být způsoben buď krystalizačními fenomény, při nichž dochází k odstranění sloučeniny z roztoku nebo filtračním efektem. V případě filtračního efektu pohlcují vysoké koncentrace nenavázané sloučeniny ultrafialové světlo a blokují tak aktivaci materiálu, vázaného na DNA tímto světlem.

Zkouška CPE (zkouška na cytopatický účinek nebo koncový bod podle publikace Precious a Russell, 1985) ke stanovení titru viru byla prováděna při použití buněk W162, které byly naneseny na plotny s 24 vyhloubeními v množství 50 000 buněk/vyhloubení. Sériové ředění vzorků bylo uskuteč něno v prostředí DMEM se 2 % koňského séra, inaktivovaného působením tepla a zředěný virus byl k buněčnému materiálu přidáván v 50 mikrolitrech prostředí DMEM se 2 % koňského séra, inaktivovaného teplem. Směs se inkubuje 2 hodiny při teplotě 37 °C, pak se prostředí nahradí čerstvým prostředím DMEM s 10 % FCS. Po 4 až 5 dnech při teplotě 37 °C se buněčný materiál fixuje formaldehydem a pak se barví krystalo vou violetí.

Vhodnost inaktivačních metod s ohledem na přenos genu byla sledována na transportu genu pro luciferázu do buněk K562 (ATCC č. CCL 243). Transfekce byly provedeny s použitím kombinačních komplexů, tak jak byly popsány v mezinárodní patentové přihlášce W0 93/07283, přičemž bylo po12 užito 9 mikrolitrů adenoviru dll014 (1,4 x 10 částic/ml), popřípadě po inaktivaci beta-propiolaktonem bylo použito 13,5 mikrolitrů materiálu (9,3 x 10¹¹ částic/ml), 800 ng streptavidin-polylysin, 6 mikrogramů pCMVL-DNA a 5,2 mikrogramů transferrin-polylysin v 500 mikrolitrech HBS. Komplexy byly vyrobeny postupem, uvedeným v odstavci f). Mimoto byl stanoven relativní titr viru pomocí CPE-metody na buňkách W162. Výsledek těchto titrací je uveden na obr. 15. Údaje vlevo uvádějí relativní titr viru (plné trojúhelníčky) , údaje vpravo od obrázku uvádějí světelné jednotky pro luciferázu (prázdné čtverečky). Na ose úseček je nanesena koncentrace 8-methoxypsoralenu v mg/ml. Ukázalo se, že v případě, že se virus zpracovává působením 0,11 mg/ml 8-methoxypsoralenu, dojde ke snížení titru, který se neliší od koncentrace, pozorované při předběžných pokusech při použití koncentrace 0,33 mg/ml. Účinnost přenosu DNA je při této koncentraci zachována. Za zvolených podmínek byla použita koncentrace 8-methoxypsoralenu 0,033 mg/ml, tato koncentrace však byla zcela neúčinná. Citlivější analýza pomocí zkoušky na tvorbu plaků, tak jak je znázorněn její výsledek na obr. 19 prokázala, že při koncentracích 0,11 a 0,33 mg/ml 8-methoxypsoralenu dochází ke srovnatelnému poklesu titru viru.

b) Zkoušky na inaktivaci adenovirů působením 4 -aminomethyl-4 ,5' ,8-trimethylpsoralenu

i) Inaktivace viru

Méně hydrofobní psoralenový derivát, 4 -aminomethyl-4,5 ,8-trimethylpsoralen se dostává do interakce a v důsledku toho inaktivuje viry typu RNA s jednoduchým řetězcem a také DNA viry a je rozpustný ve vodném roztoku až do množství 5 mg/ml. Použitý 4 -aminomethyl-4,5 ,8-trimethylpsoralen byl získán od H.R.I. (č. katalogu 6) a byl rozpuštěn v HBS v množství 5 mg/ml. Podíly tohoto materiálu pak byly přidány ke vzorkům viru, načež byla sledována inaktivace viru a materiál byl čištěn obdobným způsobem jako v případě použití 8-methoxypsoralenu.

ii) Titrace 4'-aminmethyl-4,5',8-trimethylpsoralenu (CPB proti přenosu genu)

Titrace byly provedeny postupem, který byl popsán svrchu v odstavci a) ii) v případě použití 8-methoxypsoralenu. Výsledek takto provedené titrace je znázorněn na obr. 16. Čísla, uvedená vlevo od výkresu se vztahují na relativní titr viru (plné trojúhelníčky), čísla, uvedená vpravo od výkresů, se vztahují na světelné jednotky pro luciferázu (prázdné čtverečky). Na ose úseček je naneseno množství 4 -aminomethyl-4,5 ,8-trimethylpsoralenu v mikrogramech/ml. Při množství 0,3 a 1 mg/ml uvedeného derivátu bylo možno nalézt podmínky, při nichž dochází k poklesu titru o nejméně 5 log, kdežto účinnost přenosu DNA ještě zůstává zachována. Při nižších koncentracích 4 -aminomethyl -4,5' ,8-trimethylpsoralenu až do množství 0,1 mg/ml dochází pouze k mírnému poklesu titru viru. Citlivější zkouška na tvorbu plaků, jejíž výsledek je znázorněn na obr. 19 rov něž prokázala, že při použití koncentrace přibližně 1,0 a 0,3 mg/ml 4'-aminomethyl-4,5' ,8-trimethylpsoralenu dochází ke snížení titru viru, který přibližně odpovídá poklesu, který je možno docáhnout při použití 0,11 a 0,33 mg/ml 8-methoxypsoralenu. Schopnost takto inaktivovaného viru napomáhat přenosu genu byla stanovena postupem, uvedeným svrchu v odstavci a) ii). Mimoto byl pomocí zkoušky CPE při použití buněk W162 stanoven relativní titr pro každý roztok s obsahem viru.

c) Zkoušky na inaktivaci adenoviru působením beta-propiolaktonu

i) Inaktivace virů

Vzorky viru byly vytvořeny při použití pufru 0,3 M HEPES o pH 7,9 a pak byly přidány roztoky beta-propiolaktonu s desetinásobnou koncentrací. Koncentrované roztoky beta-propiolaktonu byly připraveny tak, že beta-propiolakton (Sigma, č. katalogu P5648) byl bezprostředně před použitím zředěn svrchu uvedeným pufrem. Mimoto byly provedeny také kontrolní pokusy, aby bylo možno prokázat, zda pufr 0,3 M HEPES o pH 7,9 stačí k udržení pH při působení beta-propiolaktonu v koncentraci 1 %. Podíly beta-propiolaktonu byly přidávány při teplotě místnosti k roztokům viru s obsahem pufru, pak byly vzorky viru inkubovány celkem 4 hodiny při teplotě místnosti, načež byly opět uloženy při teplotě -70 °C nebo byly přímo použity pro pokusy na transfekci.

ii) Titrace beta-propiolaktonu (CPE proti přenosu genu)

Adenoviry byly na 4 hodiny vystaveny při teplotě míst nosti působení různých koncentrací beta-propiolaktonu. Jinak byly pokusy prováděny stejným způsobem jako pokusy s psoralenovými deriváty. Jak je znázorněno na obr. 17, bylo prokázáno, že po působení 0,3% beta-propiolaktonu dochází k poklesu titru viru o téměř 5 log, zatímco schopnost přenášet DNA zůstává zachována. Koncentrace 1 % a vyšší vyvolají ještě větší pokles titru, avšak současně dochází také ke snížení účinku na přenos DNA. Údaje, uvedené vlevo se vztahují na relativní titr viru (plné trojúhelníčky), kdežto čísla vpravo udávají světelné jednotky pro luciferázu (prázdné čtverečky). Na ose úseček je uvedena koncentrace beta-propiolaktonu v procentech.

iii) Schopnost adenoviru napomáhat přenosu genu po vícenásobném zpracování působením beta-propiolaktonu v nižších koncentracích

V odstavci ii) bylo možno pozorovat silný pokles schopnosti přenášet DNA po zpracování koncentrací betapropiolaktonu v rozmezí 0,3 a 1 %. Bylo možno předpokládat, že při použití nižších koncentrací by mohlo dojít k modifikaci virových nukleových kyselin ve výhodném smyslu, kdežto při vyšší koncentraci dochází k modifikaci kapsido67 dových bílkovin a tím také k porušení endosomolytické účinnosti viru. Aby bylo možno vyzkoušet správnost tohoto předpokladu, byly adenoviry zpracovány působením většího počtu podílů s nižší koncentrací beta-propiolaktonu do koncentrace 0,3 %, aby bylo možno prokázat, zda skutečně dojde k výhodné modifikaci virové DNA, aniž by současně došlo k poškození virových bílkovin. K tomuto účelu byly vzorky viru zpracovány jednou dávkou beta-propiolaktonu s koncentrací 0,3 %, dvěma dávkami beta-propiolaktonu v koncentraci 0,3 %, třemi dávkami beta-propiolaktonu v koncentraci 0,2 %, čtyřmi dávkami beta-propiolaktonu v koncentraci 0,15 % nebo jedinou dávkou beta-propiolaktonu v koncentraci 1 %. Pak byla sledována schopnost napomáhat přenosu genu pro takto zpracované viry, zabudované do kombinačních komplexů způsobem uvedený v odstavci f). Schopnost přenosu genu byla zkoumána při použití buněk K562 svrchu uvedeným způsobem. Jak je znázorněno na obr. 18, kromě vzorku s koncentrací 1 % způsobyly všechny typy zpracování pokles schopnosti přenosu genu o méně než 1 log. Působením 1% beta-propiolaktonu došlo k poklesu o více než 2 log.

Vzorek 1

Vzorek 2

Vzorek 3

Vzorek 4

Vzorek 5

Vzorek 6

Vzorek 7 neaktivovaný virus.

inaktivace působením beta-methoxypsoralenu 0,llmg/ml inaktivace 0,3% beta-propiolaktonem. inaktivace 2 x 0,3% beta-propiolaktonem. inaktivace 3 x 0,2% beta-propiolaktonem. inaktivace 4 x 0,15% beta-propiolaktonem. inaktivace 1% beta-propiolaktonem.

Údaje v grafu jsou uvedeny ve světelných jednotkách pro enzym luciferázy.

d) Stanovení schopnosti replikace inaktivovaného adenoviru pomocí zkoušky na tvorbu plaků

i) Srovnání tvorby plaků pro adenovirus dll014, inaktivovaný působením 8-methoxypsoralenu, beta-propiolaktonu nebo 4 -aminomethyl-4,5 ,8-trimethylpsoralenu

Zkouška na tvorbu plaků je citlivá zkouška na schopnost replikace viru. V případě adenoviru 5 je zapotřebí v přítomnosti 10 až 50 částic viru k infekci buňky. Dále uvedená CPE-zkouška je zkouška na schopnost inaktivovaného viru vyvolat cytopatickou infekci virem, k tomuto účinku je však zapotřebí infekce nejméně 10 % buněk, aby bylo možno v průběhu 4 dnů trvání zkoušky zpozorovat účinek. Při této zkoušce tedy musí být přítomno nejméně 50 000 částic viru. Naproti tomu je za optimálních podmínek možno při použití zkoušky na tvorbu plaků prokázat i přítomnost jednotlivých plaků, k jejichž tvorbě dochází při průniku 10 až 50 částic viru. Tato zkouška je tedy přibližně lOOOx citlivější než CPE.

Při zkoušce na tvorbu plaků bylo použito následujícího postupu. Buňky W126 byly 18 hodin před počátkem pokusu uloženy po množství 500 000 buněk na jedno vyhloubení do plotny s obsahem 6 vyhloubení. Pak bylo prostředí odstraněno a nahrazeno čerstvým prostředím DMEM s obsahem 2 % koňského séra a příslušným ředěním viru, přičemž virus byl rovnoměrně rozdělen po obsahu vyhloubení. Pak byly plotny inkubovány 1,5 hodiny při teplotě 37 °C, přičemž každých 20 minut byl obsah vyhloubení opatrně promíchán nakloněním plotny. Mezitím byl připraven roztok agarosy s dvojnásobnou koncentrací (2 %, 2 g/100 ml) byla užita SeaPlague-Agarosa s nižší teplotou tuhnutí (FMC, č. katalogu 5010) v 5 mM HEPES o pH 7,4, hodnota pH byla upravena před sterilizací v autoklávu po dobu 25 minut. Pak byla agarosa zahřáta k rozpuštění na 70 °C a nakonec uvedena do rovno69 vážného stavu při teplotě 37 °C. Obdobným způsobem byl připraven roztok 2x DMEM/10 % FCS (dvojnásobná koncentrace DMEM/dvojnásobná koncentrace penifilin(streptomycin/dvojnásobná koncentrace glutaminu s 10 % FCS, materiál byl inaktivován teplem 30 minut při 56 °C. Buněčný materiál byl inkubován s virem 1,5 hodiny a pak byl připraven materiál v množství 50 ml (25 ml 2x agarosa + 25 ml 2x DMEM/10 % FCS ve Falconově trubici s objemem 50 ml). Roztok prostředí a viru byl z plotny odstraněn a do každého vyhloubení bylo přidáno 3,5 ml svrchu uvedeného materiálu pro převrstvení. Pak byly plotny ponechány nejméně 30 minut stát při teplotě místnosti ke ztuhnutí agarosy a pak byly znovu inkubovány při teplotě 37 °C. Po 6 dnech po přidání viru bylo do každého vyhloubení přidáno ještě množství 2 až 3 ml svrchu uvedeného materiálu pro převrstvení. Při tomto postupu jsou plaky za obvyklých podmínek viditelné po 7 až 10 dnech. Plaky byly spočítány vždy mezi 14 až 18 dnem po infekci.

Zkouškami s různými inaktivovanými viry tímto způsobem bylo možno prokázat, že při zpracování beta-propiolaktonem (2 x 0,3 %) dojde k poklesu titru viru o přibližně 5 log. Výsledky jsou znázorněny na obr. 19.

Vzorek 1: neinaktivovaný virus.

Vzorek 2: inaktivace 0,33 /Ug/ml 8-methoxypsoralenu.

Vzorek 3: inaktivace 0,11 /Ug/ml 8-methoxypsoralenu.

Vzorek 4: inaktivace 2 x 0,3 % beta-propiolaktonu.

Vzorek 5: inaktivace 0,28 mg/ml 4'-aminomethyl-4,5 ,8-trimethylpsoralenu.

Vzorek 6: inaktivace 0,83 mg/ml 4'-aminomethyl-4,5 ,8-trimethylpsoralenu.

Údaje na výkresu jsou uvedeny v jednotkách pro tvorbu plaků/ml (pfu/ml).

Při použití 8-methoxypsoralenu 0,33 nebo 0,11 mg/ml ani při použití 4'-aminomethy1-4,5 ,8-trimethylpsoralenu 0,28 nebo 0,83 mg/ml nebylo možno pozorovat žádné plaky adenoviru. Po zředění při faktoru 6 log mezi neaktivovaným dll014 (1 χ 10θ pfu/ml) a vzorky po inaktivaci psoralenem bylo prokázáno, že po působení psoralenu zbývá méO ně než 10 pfu. Podstatné je, ze viry po inaktivaci beta-propiolaktonem vytvářejí prokazatelně virové plaky. To znamená, že i když při zkoušce CPE se zdá, že oba typy inaktivace mají stejný výsledek, při zkoušce na tvornu plaků je možno pozorovat podstatný rozdíl.

ii) Srovnání tvorby plaků adenovirem dll014 po inakti vaci 8-methoxypsoralenem a beta-propiolaktonem

Adenovirus dll014 byl inaktivován působením beta-propiolaktonu (obr. 20), výsledky byly analyzovány zkouškou na tvorbu plaků a srovnávány s výsledky pro adenoviry, inaktivované 8-methoxypsoralenem 0,11 mg/ml.

Vzorek 1

Vzorek 2

Vzorek 3

Vzorek 4

Vzorek 5

Vzorek 6

Vzorek 7 Údaje na neinaktivovaný virus.

inaktivace 0,11 /Ug/ml 8-methoxypsoralenu. inaktivace 0,3 % beta-propiolaktonu. inaktivace 2 x 0,3 % beta-propiolaktonu. inaktivace 3 x 0,2 % beta-propiolaktonu. inaktivace 4 x 0,15 % beta-propiolaktonu.

inaktivace 1 % beta-propiolaktonu. výkrese jsou uvedeny v pfu/ml.

Také v tomto případě nebylo možno prokázat viry po zpracování psoralenem. Po příslušném ředění mezi neinaktiQ vovaným dll014 (6,7 x 10 pfu/ml) a virem po inaktivaci psoralenem bylo prokázáno, že inaktivovaný virus obsahuje méně než 5,7 x 10¹ pfu. Naprotitomu bylo možno po zpracování beta-propiolaktonem ve všech vzorcích prokázat tvorbu plaků, což odpovídá inaktivaci o 2 log pro 0,3 % beta-propiolaktonu až 5 log pro 2x0,3% beta-propiolaktonu.

I když 1 % beta-propiolaktonu vyvolá silný pokles schopnosti přenosu DNA (obr. 17), dochází k jen mírnému poklesu titru viru, což odpovídá předpokladu, že vysoké koncentrace beta-propiolaktonu vyvolají spíše modifikaci bílkovin než modifikaci DNA a proto silněji ovlivní schopnost viru rozrušit endosomy než replikaci viru.

e) Exprese genu inaktivované viru

Byly vycvořeny různé kombinační komplexy způsobem podle odstavce f) s obsahem optimálního množství adenoviru dl312, 8-methoxypsoralenem inaktivovaného dl312, adenoviru dll014, 8-methoxypsoralenem inaktivovaného dll014 a beta-propiolaktonem inaktivovaného dll014. Komplexy obsaho IP vály 1 x 10 částic viru, 800 ng streptavidin-polylysin, mikrogramů pCMV-DNA a 5,2 mikrogramů transferin-polylysin v koncovém objemu 500 mikrogranů HBS. Komplexy byly naneseny na buňky K552 (24 hodin předem pěstované v 50/UM deferrioxaminu/RPMI/10 % FCS ve vyhloubeních po 250 000 buněk/ml) v množství 2 ml na vyhloubení plotny s obsahem 24 vyhloubení. Po inkubaci 2 hodiny byly buňky promyty čerstvým prostředím bez deferrioxaminu a po 48 hodinách použity pro szanovení aktivity luciferázy nebo pro RNA-analýzu vybraných genů adenovirů, materiál byl pak použit pro tři oddělené pokusy s transfekci.

Měření účinnosti luciferázy prokázalo, že při všech transfekcích došlo k expresi přibližně stejného řádu.

i) Northernová analýza

Northernová analýza RNA byla prováděna způsobem podle publikace Paeratakul a další, 1988. 48 hodin po transfekci byl buněčný materiál promyt celkem třikrát HBS a pak byla sériová ředění, odpovídající množství 30 000, 10 000 nebo 3 000 buněk nanesena na nitrocelulosový filtr při použití zařízení Dot Blot pro 96 vzorků (Schleicher a Schuell). Buněčný materiál byl fixován 1% glutaraldehydem v HBS celkem 60 minut při teplotě 4 °C, pak byl natráven proteinázou K 20 mikrogramů/ml a ponechán 30 minut v HBS/0,1 % SDS při teplotě 37 °C. Filtr pak byl předem hybridizován v Churchově pufru (0,5 M fosforečnan sodný, 7 % SDS, 1 mM EDTA, pH 8) celkem 5 hodin při teplotě 65 °C. Před inkubací (přes noc při teplotě 65 °C) byl pak filtr inkubován se značenými DNA-sondami v minimálním objemu Churchova pufru. Pak byl filtr promyt po dobu 30 minut při teplotě 65 °C celkem dvakrát při použití 2x SSC/0,1 % SDS a pak ještě 30 minut při použití 0,lx SSC/0,1 % SDS.

Radioaktivní vzor byl zviditelněn pomocí fosforu. Radioaktivně značené P-sondy byly připraveny z PCR-produktů řetězce adenoviru dll014. Sonda Ela o 383 bp byla připravena při použití PCR-primerů k Ad5, bp 736 - 751 (Ela.l) a k bp 1119 až 1101 (Ela.2). Uvedený řetězec je částí oblasti, která je ve kmeni dl312 odstraněna. Tato oblast je řídící oblast. PNA-signál má ve vzorcích dl312 chybět, avšak ve vzorcích dll014 má být zachován vzhledem k tomu, že druhý z uvedených virů obsahuje oblast El divokého typu. Sonda E3, 436 bp byla připravena z genu E3, u něhož došlo k nejsilnější expresi, jde o 19 K-glykoproteinový gen (Gooding, 1992) při použití primerů pro Ad5, bp 28722 až 28737 (E3.a) a 29157 až 29142 (E3.b). Exprese E3 by mohla hrát důležitou úlohu při imunitní odpovědi buněk po transfekci vzhledem k tomu, že povrchovou expresi třídy I MHC-molekul a molekul pro receptor TNF na povrchu infikovaných buněk modulují nejméně dva geny E3. Po uskutečnění PCR se reakční produkty čistí na agarosových gelech s nízkou teplotou tání při použití RAE-pufru. Požadovaný fragment DNA se z gelu vyřízne, úsek gelu se zváží a materiál se rozpustí v 1,3 ml vody na 1 g fragmentu gelu. Vodný roztok se pak zahřívá 10 minut na 95 °C a 10 mikrolitrů získaného roztoku se radioaktivně značí 12 hodin při teplotě místnosti metodou s použitím náhodných primerů (Feinberg a Vogelstein, 1984). Nakonec se značená DNA čistí srážením ethanolem v přítomnosti octanu amonného a tRNA.

Na obr. 21 je znázorněn získaný autoradiogram. Bylo prokázáno, že u vzorků dl312 a to u neinaktivovaných vzor ků i u vzorků, inaktivovaných 8-methoxypsoralenem nedochází k žádné expresi Ela. Exprese Ela je u neinaktivovaného viru dll014 silná, avšak úplně chybí u virů po působení 8-methoxypsoralenu a u virů po dvojnásobném působení 0,3% beta-propiolaktonu. Exprese E3 je u neinaktivovaného adenovirů dl312 méně silná než v případě dll014. Toto zjištění je v souladu se znalostmi, týkajícími se funkce Ela jako pozitivního modulátoru exprese E3 a exprese jiných časných genů (Nevins, 1991 a 1992). Ve všech případech blokovala inaktivace působením 8-methoxypsoralenu i beta-propiolaktonu úplně syntézu RNA těchto genů.

ii) PCR-analýza reverzní transkripce

Při těchto pokusech byly použity buňky po transfekci, která byla provedena způsobem, popsaným v předchozích pokusech, přičemž byl použit neinaktivovaný adenovirus dll014 nebo adenovirus dll014, inaktivovaný působením 8-methoxysoralenu. Při obou typech transfekce bylo použito stejné množství uvedených virů. Čištění RNA pak bylo uskutečněno při použití 1 x 10 buněk M3 po transfekci, tyto buňky byly uvedeny 24 hodin po provedení transfekce do suspenze v PBS a pak byly opět usazeny krátkodobým odstředěním při použití Eppendorfovy odstředivky. Získané usazeniny buněčného materiálu byly rozpuštěny v 1 ml roztoku Trisolv (obsahuje fenol/guanidinthiokyanát v jednofázovém roztoku, Biotecx) a směs se krátce promísí míchacím zařízením Vortex. Pak se přidá 500 mikrolitrů chloroformu, čímž dojde k rozdělení směsi na dvě fáze, z nichž vodná fáze obsahuje buněčnou RNA. Tato RNA se pak z vodné fáze vysráží přidáním stejného objemu isopropanolu, sraženina se oddělí odstředěním, usazenina buněk se promyje 80% ethanolem a pak se rozpustí ve 20 mikrolitrech vody, prosté RNA-ázy. DNA, přítomná jako nečistota ve vzorku RNA se pak odstraní působením DNA-ázy, prosté RNA-ázy (Boehringer, Mannheim), působení trvá 60 minut při teplotě 60 °C. Použitý enzym se pak inaktivuje další inkubací 5 minut při teplotě 95 °C.

Směsi pro provedení reverzní transkripce obsahovaly mikrolitrů roztoku RNA, 2 mikrolitry 10 mM roztoku dNTP, mikrolitry 25 mM chloridu hořečnatého, 2 mikrolitry 10 x

RT-pufru (100 mM Tris-HCl, 900 mM KC1, pH 8,3), 1 mikrolitr mikroM oligo d(D)._r, 1 mikrolitr inhibitoru RNA-ázy s io obsahem 20 jednotek/mikrolitr (Perkin Elmer) a 1 mikrolitr MuLV-reverzní transkriptázy (Perkin Elmer). Reakce s reversní transkriptázou byly prováděny 10 minut při teplotě 25 °C a 15 minut při teplotě 42 °C a pak ještě byla směs zahřáta na 5 minut na teplotu 95 °C k dosažení inaktivace reverzní transkriptázy.

Byl použit primer, který odpovídal následujícím úsekům genomu adenoviru 5: Ela směrem vzhůru: bp 1228 - 1248,

Ela směrem dolů: bp 1545 - 1526, E3 směrem vzhůru: bp 28722 - 28737, E3 směrem dolů: 29157 - 291<-0.

Reakční směsi pro uskutečnění PCR-reakce obsahovaly 35 mikrolitrů vody, 5 mikrolitrů PCR-pufru (100 mM tris-HC1 o pH 8,9, 1 M KOI, 15 mM MgCl₂), 1 mikrolitr 10 mM dNTP, 1 mikrolirr primerů směrem vzhůru a směrem dolů (25 mM), 0,5 mikrolitrů Taq-polymerázy (5 jednotek/mikrolitr, Boehringer, Mannheim) a 6,5 mikrolitrů zředěné sondy cDNA (RNA jako kontrolní reakce). Vzorky byly denaturovány 90 sekund při teplotě 95 °C, pak bylo provedeno 35 cyklů vždy 30 sekund při 95 °C, 60 sekund při 60 °C, 30 sekund při 72 °C s konečnou extensí 3 minuty při 72 °C. Amplifikované DNA-produkty pak byly rozděleny na 2% agarosovém TAE-gelu a barveny pomocí ethidiumbromidu. Výsledky, znázor něné na obr. 22 prokazují, že u neinaktivovaného adenoviru je možno pozorovat očekávané produkty PCR-reakce jak pro oblast Ela-, tak pro oblast E3, přičemž signál je prokazatelný ještě při ředění 1 : 1000 cílové nukleové kyseliny (horní část výkresu). Naopak v případě vzorků, připravených z viru, inaktivovaného působením psoralenu není možno prokázat žádný signál. Skutečnost, že PCR-signály chybí v kontrolním vzorku, v němž byla vynechána reakce reverzní trans kriptázy potvrzuje, že pozorované signály jsou způsobeny amplifikací RNA a nikoliv nečistotami, to znamená DNA adeno viru ve vzorku nukleové kyseliny.

f) Analýza vazby 8-methoxypsoralenu na genom adenoviru

i) Kvantitativní stanovení 8-methoxypsoralenu, vázaného na genom adenoviru

0,41 ml 8-methoxypsoralenu, značeného tritiem (0,8 mCi/ml) se odpaří do sucha, rozpustí se ve 20 mikrolitrech DMSO a smísí s 8,7 mikrolitrů neznačeného 8-methoxypsoralenu (33 mikrogramů/mikrolitr v DMSO). Vzniklá směs se přidá k 1,8 ml biotinylovaného adenoviru dll014. Pak se vzorky ozáří ultrafialovým světlem a získaný materiál se čistí chromatografií na PD-1O svrchu popsaným způsobem.

Zabudování značeného H-8-methoxypsoralenu se stanoví tak, že se podíly čištěného viru počítají ve scintilační kapalině. Výpočty na základě naměřené úrovně radioaktivity, zabudované do DNA prokazují, že jedna molekula psoralenu připadá na 800 párů baží viru. Tato zjištění byla doplněna ještě analýzou chromatografií na tenké vrstvě při použití silikagelu a dichlormethanu jako rozpouštědla. Tato analýza prokázala, že ve vzorku nebyl přítomen žádný volný nezreagovaný 8-methoxypsoralen.

ii) Sledování lokalizace, v níž je 8-methoxypsoralen vázán na genom viru

Aby bylo možno stanovit, zda je vázaný 8-methoxypsoralen rovnoměrně rozdělen po celém genomu viru nebo zda je nahromaděn na určitých, například přístupnějších místech DNA viru, byla DNA viru čištěna a pak rozštěpena působením restrikčních enzymů tak, aby bylo získáno 10 nebo 11 fragmentů DNA viru. Postup byl prováděn tak, že z viru, znače3 „ „ ného H-8-methoxypsoralenem byla vyčištěna DNA tak, ze virus byl inkubován 45 minut při teplotě 56 °C spolu se směsí 0,4% SDS a proteinázy K 0,4 mg/ml. Pak byl vzorek dvakrát extrahován směsí fenolu a chloroformu v objemovém poměru 1:1a pak ještě jednou čistým chloroformem, pak byla DNA z vodné fáze vysrážena přidáním 1/10 objemu 3M octanu sodného o pH 5 a 0,54 objemu isopropanolu. Takto vysrážená DNA pak byla oddělena odstředěním, dvakrát promyta 80% ethanolem vychlazeným v ledu, sušena na vzduchu a pak rozpuštěna v TE.

Podíly DNA z neinaktivovaného adenoviru nebo z adenoviru, který byl inaktivován značeným H-8-methoxypsoralenem, byly rozštěpeny pomocí restrikčních enzymů HindlII nebo Asp718 podle návodu výrobce (Boehringer, Mannheim), bylo však použito lOnásobné množství enzymu ve srovnání s doporučeným množstvím, materiál byl čištěn extrakcí směsí fenolu a chloroformu a pak chloroformem, pak byla DNA vysrážena ethanolem a oddělena v přítomnosti ethidiumbromidu (Sambrook a další, 1991) na 0,9% agarosovém gelu s TAE. Gel byl vysušen, impregnován scintilační kapalinou (Enhance, Amersham) a uveden do styku s rtg-filmem. Výsledky jsou znázorněny na obr.

23, kde je možno pozorovat gel, zbarvený ethidiumbromidem a fluorogram. Ze značeného vzorku je zřejmé, že použitý značený H-8-methoxypsoralen je rozdělen po čelem genomu.

S malými výjimkami byly fragmenty, získané po rozštěpení Aso718 nebo KindlII značeny v poměru, který odpovídal délce těchto fragmentů. Dva fragmenty po štěpení enzymem HindlII, uložené v blízkosti konců genomu byly značeny silněji. Na rozdíl od této skutečnosti nebylo možno pozorovat ve fragmentech po štěpení enzymem Asp718 v podobných lokalizacích genomu žádné přednostní značení tohoto typu. Celkem bylo možno pozorovat, že 8-methoxypsoralenové můstky jsou rozděleny rovnoměrně v průběhu genomu viru.

Příklad 14

Stanovení dávky záření, jíž je třeba použít pro inaktivaci nádorových buněk

Pro tyto pokusy bylo použito šest lahví pro pěstová5 ní kultur střední velikosti (T75) vždy s obsahem 6 x 10 buněk lidského melanomu ve 20 ml běžného živného prostředí. Buněčný materiál byl ozářen po jednom dnu dávkami 5,

10, 20, 25, 50, 75 nebo 100 Gy, šest lahví bylo ponecháno bez ozáření. 3ylo použito zařízení Gammacell 40, č. 126, typ B(U), (Ncrdion International INC), vybavené 2 gammazářiči Cs-137, poskytujícími celkem dávku 72,5 Gy/h. Šest dnů po ozáření byl buněčný materiál vždy z jedné lahve z každé skupiny rozrušen působením trypsinu a pak odsnředěn, usazenina byla uvedena do suspenze v živném prostředí, vždy

100 mikrolitrů suspenze buněk bylo uvedeno do styku s trypanovou modří a buňky byly počítány v počítací komůrce. Zbylý buněčný materiál byl přenesen do čerstvého živného prostředí a vložen do nové lahve pro pěstování kultur (1. pasáž). Po týdnu byl postup opakován. Vždy materiál z jedné lahve z každé skupiny byl rozrušen trypsinem, buňky byly počítány a materiál z první pasáže byl použit jako kontrola. Neozářené buňky a buňky, ozářené dávkou 5 Gy dobře rostly. Po dalším týdnu byl postup opakován a celý pokus byl ukončen po celkem šesti týdnech. V případě jednotlivých růstových křivek byl použit vždy nejvyšší zjištěný počet buněk v pokusných i kontrolních lahvích. Po dávce ozáření 20 Gy již nebylo možno pozorovat růst buněk v pokusných ani v kontrolních lahvích. Při dávce 10 Gy bylo možno pozorovat růst v pokusné lahvi. Ze získaných hodnot byly připraveny růstové křivky, které jsou uvedeny na obr. 24. Na základě hodnot, zjištěných pro tři různé kultury melanomových buněk byla zvolena jako bezpečná dávka pro ozáření buněk ve všech pokusech dávka 100 Gy.

Příklad 15

Stanovení DNA plasmidu a adenoviru in vivo při použití PCR-reakce

V průběhu tohoto příkladu byly použity následující postupy:

Injekce vakcíny proti nádorům:

Buněčný materiál melanomu M3 byl podroben transfekci při použití rekombinantního interleukin-2-plasmióu myši při použití postupu s adenovirem a transferrinem, tak jak byl popsán v příkladu 8 c). Po 24 hodinách bylo možno stanovit produkci cytokinu (20 000 až 50 000 jednotek IL-2 za 24 hodin na jeden milion buněk). Buněčný materiál byl rozrušen trypsinem, promyt prostředím, prostým séra a koncentra5 6 ce byla upravena na 3 x 10 nebo 1 x 10 buněk ve 100 mikrolitrech isotonického roztoku chloridu sodného. Vždy 100 mikrolitrů buněčné suspenze bylo vstřiknuto podkožně pomocí kanyly do pravého boku myším DBA/2 (stejně jako v příkladech 7 a 8) .

Čištění vzorků zkáně

V určitých časových intervalech po injekci byly myši usmrceny a místo injekce a některé tkáně byly podroběny analýze. Odebrané vzorky byly mechanicky rozrušeny a pak byly inkubovánv přes noc v 1 ml pufru s proteinázou K (50 mM tris-HCl, 100 mM NaCl, 100 mM EDTA, 1 % SDS, 0,5 mg/ml proteinázy K) při teplotě 55 °C. Nakonec byla DNA extrahována směsí fenolu a chloroformu a vysrážena přidáním 0,5 objemů isopropanolu. Vzorky, které obsahovaly celkovou buněčnou DNA, byly promyty 70% ethanolem a rozpuštěny v TE-pufru.

K čištění periferních mononukleárních krevních buněk (PMBZ) byla provedena srdeční punkce. Krev byla smísena s 10 mM citrátcvého pufru a oddělena gradientem ve Ficollu, načež byly buňky PMBZ rozrušeny pufrem s proteinázou K.

DNA byla pak čištěna svrchu uvedeným způsobem.

PCR- reakce

Reakční směs byla tvořena 1 mikrogramem DNA, 1 x PCR-pufrem (boehringer, Mannheim), 1 mM deoxynukleotidu, 3 jednotkami Taq-pclymerázy (boehringer, Mannheim) a 25 pmol specifického zrimeru. V případě amplifikace plasmidu, obsahujícího gen pro interleukin-2 bylo přidáno ještě 1000 kopií vnitřní kontroly. PCR-cykly byly prováděny nejprve 5 minut při 95 °C pro denaturaci, pak bylo provedeno 40 cyklů vždy 30 sekund 94 °C, 30 sekund 60 °C, 2 minuty 72 °C. Pak byly produkty amplifikace smíseny s pufrem pro vzorky a rozděleny na 2% agarosovém gelu.

Byly užity specifické primery s následujícími řetězci: IL-2 směrem vzhůru, polohy 99 až 122, řetězec č. 3

GTCAACAGCGCACCCACTTCAAGC.

IL-2 směrem dolů, polohy 548 až 526, řetězec č. 4

GCTTGTTGAGATGATGCTTTGACA.

Adeno-směrem vzhůru, polohy 1228 až 1248, řetězec č. 5

GGTCCTGTGTCTGAACCTGAG.

Adeno-směrem dolů, polohy 1545 až 1525, řetězec č. 6

TTATGGCCTGGGGCGTTTACA.

V protokolu byly z důvodu jednoduchosti technického programu uváděny molekuly syntetických oligonukleotidů jednotně jako cDNS, byl použit klíč 5 UTR.

Práh průkazu amplifikačních produktů je podle výsledků těchto pokusů mezi množstvím 200 až 1000 kopií DNA.

a) Aby bylo možno prokázat rekombinantní DNA pro IL-2 a DNA pro adenovirus dll014 v místě injekce v různých časových obdobích po očkování byly myši DBA/2 (9 myší) imunizováno 3 x 10^ melanomových buněk M3 po transfekci plasmidem s obsahem DNA pro IL-2. Po době 1, 2 a 5 dnů byly usmrceny vždy tři myši a místo, v němž byla imunizace provedena, bylo vyjmuto. PCR-analýza prokázala, že již po dvou dnech dochází k silnému odbourávání DNA pro IL-2 a pb 5 dnech již tuto DNA není možno prokázat. V analogickém pokusu bylo možno z místa podání injekce na zvířeti po pěti dnech po injekci prokázat DNA plasmidu pro IL-2. Pomocí PCR-reakce při použití primerů, specifických pro adenovirus bylo možno prokázat DNA adenoviru ve vzorcích po 1 a 2 dnech, avšak nikoliv ve vzorcích,odebraných po 5 dnech a později.

b) Aby bylo možno prokázat DNA pro IL-2 a DNA pro adenovirus dll014 z periferních mononukleárních krevních buněk 24 a 48 hodin po očkování, bylo imunizováno 12 myší DBA/2 β

vždy při použití 1 x 10° melanomových buněk M3 po transfekci plasmidem pro IL-2. Po 24 a 48 hodinách, to znamená v době, v níž v místě podání injekce dochází k msivnímu odbourávání buněk M3 bylo 6 myší usmrceno a byla odebrána krev PCR-analýza prokázala, že v těchto časových intervalech nebylo možno prokázat ani specifickou DNA pro IL-2 ani DNA pro adenovirus v uvedených krvinkách.

c) Aby bylo možno prokázat DNA pro IL-2 a DNA pro adenovirus dll014 ze vzorku tkáně z různých orgánů, bylo imuniβ zováno 6 myší DBA/2 vždy při použití 1 x 10 melanomových buněk M3 po transfekci plasmidem pro IL-2. Po 24 a 48 hodinách byla usmrcena vždy tři zvířata a byly odebrány vzorky tkáně z místa injekce, z příslušných lymfatických uzlin, ze sleziny, ledvin, tlustého střeva a vaječníků. Pouze v místě provedení injekce bylo možno prokázat specifické produkty amplifikace. Vzorky ze všech ostatních tkání byly v tomto smyslu negativní.

d) Aby bylo možno vyloučit přenos rekombinantní DNA pro IL-2 do zárodečných buněk, bylo 6 myších samic a 6 myβ ších samců kmene DBA/2 imunizováno vždy při použití 1 x 10 melanomových buněk M3 po transfekci plasmidem pro IL-2. Po a 48 hodinách bylo usmrceno vždy 6 myší, 3 samice a 3 samci a byly izolovány zárodečné buňky. PCR-analýza prokázala, že nedošlo k žádnému přenosu rekombinantní DNA do zárodečných buněk.

Příklad 16

a) Zkoušky na účinnost vakcíny proti zhoubným nádorům proti tvorbě metastáz na myších

V tomto příkladu byly pokusy prováděny stejným způsobem jako vpříkladu 8, pokud jde o použité komplexy pro transfekci, o pěstování buněk a o uskutečnění transfekce. Jako pokusná zvířata byly použity myši kmene C57BL/6J, vždy 8 zvířat v jedné skupině. Dále byly použity melanomové buňky B16-F10, které jsou syngenní pro použitý kmen myší. (NIH DCT Tumor Depository, Fidler a další, 1975).

Ve dni 1 byly pokusným zvířatům nitrožilně pomocí in5 jekce podány živé buňky B16-F10 v množství 1 x 10 k vyvolaní tvorby metastáz. Ve dnech 4, 11 a 17 byla podkožně podána vakcína k imunizaci zvířat proti vzniku metastáz.

Při imunizaci bylo použito 1 x 10 ozářených buněk, přičemž vakcína obsahovala různý podíl buněk po transfekci plasmidem pro cytokin (buňky po transfekci znamenají v následujícím textu buněčný materiál, podrobený transfekci, hodnoty exprese pro cytokiny jsou udávány vždy pro jednu myš za 24 hodiny, označení odpovídá označení na obr. 25).

1) kontroly:

a) buňky, které byly pouze ozářeny (ozáření) ,

b) ozářené buňky po transfekci vektorem pSP bez specifického řetězce DNA (prázdný vektor).

2) Buňky po transfekci plasmidem IL-2:

a) 100 % buněk po transfekci (exprese: 15 000 jednotek, vysoká),

b) 20 % buněk po transfekci, 80 % buněk bez transfekce (exprese 3000 až 4000 jednotek, střední),

c) 2 % buněk po transfekci, 98 % buněk bez transfekce (exprese 400 jednotek, nízká).

3) Buňky po transfekci plasmidem GM-CSF:

a) 100 % buněk po transfekci (exprese 500 ng, vysoká),

b) 10 % buněk po transfekci, 90 % buněk bez transfekce (exprese 50 ng, střední),

c) 1 % buněk po transfekci, 99 % buněk bez transfekce (exprese 5 ng, nízká).

4) Buňky po transfekci plasmidem IFN-gamma:

a) 100 % buněk po transfekci (exprese 1000 ng, vysoká)

b) 10 % buněk po transfekci, 90 % buněk bez transfekce (exprese 100 ng, střední),

c) 1 % buněk po transfekci, 99 % buněk bez transfekce (exprese 100 ng, nízká).

Ve dni 28 byl analyzován ochranný účinek vakcíny proti tvorbě metastáz tak, že myši byly vizuálně hodnoceny na přítomnost nádorů.

Výsledky těchto pokusů, uvedené na obr. 25 prokazují, že vakcina má účinnost, závislou na úrovni exprese genu a na genu, který byl použit k transfekci.

b) Zkoušky vakcíny podle vynálezu na schopnost, potlačit uměle vytvořené mikrometastázy

Aby bylo možno stanovit dávku buněk M3, která vyvolá tvorbu nádorů, byly nejprve provedeny předběžné pokusy ke stanovení počtu buněk, po jejichž aplikaci dojde u 50 % všech zvířat v průběhu 8 týdnů a u 100 % všech zvířat v průběhu 10 týdnů ke tvorbě místních nádorů, bylo prokázáno, „ 3 že tato dávka patrně leží v rozmezí 1 x 10 až 3 x 10 buněk myšího melanomu M3.

Ve dni 0 bylo vstřiknuto všem pokusným zvířatům 3 podkožně 5 x 10 životaschopných buněk M3. Buňky M3, ktere nemetastazuji, mohou být považovány za mikrometastázy.

U všech pokusných zvířat byla podána vakcína podle vynálezu po 1, 2 a 5 týdnech. Exprese cytokinů po podání vakcíny byla u každé myši pro IL-2 při 1. imunizaci 1020 jednotek, při 2. imunizaci 1870 jednotek a při 3. imunizaci 1400 jednotek. V případě GM-CSF byly odpovídající hodnoty 14, 9 a ng. V každé pokusné skupině bylo 10 zvířat, přičemž prv5 ni skupina zvířat byla imunizována podáním 1 x 10 buněk

M3 po transfekci vektorem pWS2m a po ozáření. Druhé skupině 5 zvířat bylo podáno vždy 1 x 10 buněk M3 po transfekci vektorem pWE-Gm a po ozáření. První kontrolní skupina byla ošetřena podáním 1 x 10 ozářených buněk M3 bez transfekce.

Druhé kontrolní skupině bylo podáno 5 x 10 neporušených buněk M3. Zvířata byla pozorována po dobu delší než 4 měsíce. Bylo prokázáno, že v obou skupinách, jimž byla podána protinádorová vakcína s buňkami, u nichž docházelo k expresi cytokinů, bylo 80 % zvířat chráněno před tvorbou nádorů.

V první kontrolní skupině se u všech zvířat v průběhu 8 týdnů vyvinuly nádory. Ve druhé kontrolní skupině došlo u všech zvířat, s výhimkou jediného zvířete ke tvorbě nádorů.

Příklad 17

Účinnost vakcíny proti nádorům v závislosti na dávce cytogenu při profylaktickém použití vakcíny u myši

V tomto případě bylo postupováno obdobným způsobem jako v příkladu 8 pokud jde o použité komplexy pro transfekci, o pěstování buněk a o uskutečnění transfekce. K pokusům byly použity myši DBA/2 a buněčná linie melanomu M3. Použité plasmidy pro cytokiny byly stejné jako v příkladu

16. Imunizace byla provedena stejným způsobem jako v příkladu 8, oro vyvolání tvorby nádorů bylo na rozdíl od pří5 5 kladu 8 místo 1 x 10 buněk použito 3 x 10 buněk. Poměry míšení buněk po transfekci a buněk, které byly pouze ozáře· ny a hodnoty exprese odpovídaly hodnotám z příkladu 16. Zvířata byla po implantaci nádorů pozorována 8 týdnů na přítomnost nádoru. Výsledky těchto pokusů jsou znázorněny na obr. 26.

Příklad 18

Použití ensomolytických peptidů pro výrobu vakcíny proti nádorům

a) Příprava peptidů INF5

Peptid s označením INF5 (řetězec č. 7) byl syntetizován pomocí KBTU-aktivační metody (Knorr a další, 1989, reakční složky byly použity v řádových množstvích 1 mmol), jako pevná fáze bylo použito 230 mg pryskyřice Tentagel S-PHB (Rapp Polymere, 0,27 mmol/g). První navázanou aminokyselinou byl N-alfa-N-epsilon-di-Fmoc-lysin. Tímto způsobem byly získány dimery s obsahem C-terminálního lysinu ja ko vazné aminokyseliny.

Byly použity následující ochranné skupiny na postranních řetězcích: (Trt)Asn, (Trt)Cys nebo (t-Bu)Cys, (t-Bu)Glu (Trt)His, (t-Bu)Ser. Peptidy byly odštěpeny od pryskyřice a ochranné skupiny na postranních řetězcích s výjimkou (t-Bu)Cys byly odštěpeny působením 1 ml směsi kyseliny trifluoroctové, vody, fenolu, thioanisolu a ethandithiolu v poměru 10 : o,5 : 0,75 : 0,5 : 0,25 celkem 1,5 hodiny při teplotě místnosti na 20 až 10 mg pryskyřice s navázaným peptidem.

Pro následující vysrážení peptidu byla směs po odštěpení peptidu za míchání pipetou po kapkách přidána ke 40 ml etheru a pak byla ponechána 1 hodinu stát. Surový peptid byl oddělen odstředěním, promyt etherem a sušen nejprve pod argonem a pak ve vysokém vakuu.

b) Přenos genu do lidských melanomových buněk při použití INF5

i) Exprese reporterového genu pro luciferázu

Nejprve byly provedeny předběžné pokusy při použití konstrukce s obsahem reporterového genu, pCMVL, přičemž pro konstrukci komplexu pro transfekci bylo použito 1,5 mikrogramů TfpL290, 5 mikrogramů pL290, 40 mikrogramů IFN5 a 3 mikrogramy pCMVL. V komplexech byl peptid iontově vázán na polylysin. Komplexy s obsahem DNA byly smíseny s 0,5 ml prostředí RPKL 1640 (Gibco), které obsahovalo 10 % FCS, a směs byla přidána k melanomovým buňkám M3 v množství x 10 buněk v plotně s sesti vyhloubeními. Po 4 hodinách bylo prostředí nahrazeno čerstvým prostředím. 24 hodin po transfekci byl buněčný materiál izolován a zkoumán na přítomnost luciferázy. Byla stanovena exprese, odpovídající množství 12 866 000 světelných jednotek.

ii) Exprese lidského IL-2

Komplexy pro transfekci s obsahem 3 mikrogramy plasmidu pGShIL-2tet, 1,5 mikrogramů TfpL290, 5 mikrogramů pL29O a 40 mikrogramů INF5 byly přidány k melanomovým buňkám stejně jako v odstavci i). Jeden a dva dny po transfekci bylo změřeno množství, které vylučuje buněčný materiál po transfekci v průběhu 24 hodin do živného prostředí. Toto množství IL-2 bylo stanoveno zkouškou ELISA (zkušební balíček Biokine IL-2, T Cell Diagnostics). Byly zjištěny hodnoty 5500 jednotek BRMP první den a 11 500 jednotek BRMP druhý den, jedna jednotka odpovídá 40 pg IL-2.

c) Zkoušky s použitím nádorových buněk po transfekci

INF5 jako vakcíny proti melanomu u myši při profylaktickém použití

K pokusu byly použity myši kmene C58BL/5J a buňky

B15-F10. Byly uskutečněny dvě imunizace v odstupu 7 dnu vždy při ooužití 1 x 10 buněk. 7 dnů po poslední imuniza„ 5 ci byly aplikovány nádorové buňky v množství 1 x 10 . Vakcína byla vyrobena při použití komplexu pro transfekci s obsahem 5 mikrogramů DNA pWS-Gm, 3 mikrogramy TfpL, 10 mikrogramů pL a 40 mikrogramů INF5. Byly použity vakcíny s obsahem různých množství buněk s obsahem plasmidu GM-CSF, přičemž poměry míšení ozářených buněk po transfekci a buněk, které byly pouze ozářeny, odpovídaly poměrům, uvedeným v příkladu 15. Výsledky při použití protinádorové vakcíny, obsahující buňky po transfekci s použitím INF-5 jsou znázorněny na obr. 27. Je zřejmé, že v případě vysoké a střední dávky GM-CSF, bylo dosaženo ochranného účinku proti tvorbě nádoru.

Příklad 19

Exprese interleukinu v buňkách lidského melanomů x 10 malanomových buněk bylo podrobeno transfekci týden po operativním vyjmutí nádoru v miskách pro pěstování kultur s průměrem 6 cm při použití 2 ml komplexu pro transfekci, krerý obsahoval 0,5 ml výchozího roztoku s ob12 sáhem 0,54 x 10 částic/ml biotinylovaného adenoviru, inaktivovaného kombinací 8-methoxypsoralenu a ultrafialového záření, 100 ng/mikrolitr streptavidin-polylysin, 6 mikrogramů DNA plasmidu pGShIL-2tet, 1 mikrogram/mikrolitr TfpL v H3S po zředění 1,5 ml živného prostředí. Pokusy byly prováděny s ozářenými buňkami (100 Gy) as neozářenými buňkami. Hodnoty pro IL-2 byly měřeny v odstupech, uvedených na obr.

β a vztahují se na 10 buněk za 24 hodin.

Příklad 20

Galenická léková forma pro protinádorovou vakcínu

Jako výchozí materiál byly použity melanomové buňky MM3 po transfekci plasmidem pGShIL-2tet a po ozáření dávkou 100 Gy. Po inkubaci 20 hodin při teplotě 37 °C byl buněčný materiál zpracován působením trypsinu a byl stanoven počet buněk a jejich životaschopnost barvením trypanovou modří.

Pak byl buněčný materiál rozdělen na čtyři stejné části, aby bylo možno zkoušku provádět k vyhodnocení čtyř různých prostředí pro zmrazení. Čtyři vzorky byly před smísením s prostředím pro zmražení odstředěny v prostředí RPMI 1640 při 80C ot/min (120g), buněčné usazeniny pak byly vloženy do 1 ml prostředí po zmrazení. Byl stanoven počet buněk a jejich životnost a pak byly vzorky zmrazený šetrným způsobem při teplotním gradientu -1 °C/min až na -100 °C a přeneseny do kapalného dusíku. Byla použita následující prostředí:

Prostředí	1	: 70 %	RPMI, 20 % FCS, 10 % DMSO
Prostředí	2	: 20 %	lidského sérového albuminu, 10	% DMSO
Prostředí	3	: 12 %	HES (hydroxyethylovaný škrob),	Ringerův
		roztok (Leopold Pharma, č. 2870), 5	% DMSO
Prostředí	4	: 12 %	HES v Ringerově roztoku.
Po	38	dnech	byl buněčný materiál rozmražen	a bezpro
středně po	rozmražení byly buňky spočítány a trypanovou

modří byla stanovena jejich životnost. Pak byly vzorky promyty odpovídajícím prostředím pro zmrazení bez DMSO a pak byly promyty ještě podruhé a potřetí Ringerovým roztokem, odstředěny a uvedeny do suspenze v Ringerově roztoku. Pak byly buňky znovu spočítány a znovu byla stanovena jejich životnost. Pak byly tytéž hodnoty stanoveny ještě po 24 a 48 hodinách při teplotě 4 °C. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny v tabulce V.

Z každé skupiny (prostředí 1 až 4) bylo mimoto vždy 300 mikrolitrů vloženo do 3 ml úplného živného prostředí v lahvích T25 a materiál byl inkubován při teplotě 37 °C, po 24 až 48 hodinách byl supernatant odebrán pro stanovení exprese IL-2 (prostředí 1) a pro stanovení podílu buněk v supernatantu. Z dalších vzorků, které byly nejprve ponechány stát v Ringerově roztoku při teplotě 4 °C, byl po 24 a 48 hodinách rovněž odebrán vzorek 300 mikrolitrů a materiál byl pěstován svrchu uvedeným způsobem při teplotě 37 °C. Pak byla stanovena exprese IL-2 stejně jako v prostředí 1. Výsledky těchto pokusů (označení 4° Galenik) jsou uvedeny v tabulce VI.

Příklad 21

Vliv obsahu endotoxinu DNA na expresi IL-2 v primárních lidských melanomových buňkách

V tomto příkladu byly použity následující materiály a metody:

a) Preparát DNA

Plasmid pGShIL-2tet byl získán z kultur E. coli, pěstovaných přes noc v přítomnosti 5 mikrogramů/ml tetracyklinu v živném prostředí LB.

b) Čištění DNA plsmidu k odstranění endotoxinu (lipopolysacharidu)

i) Extrakce tritonem X-114

Aby bylo možno získat homogenní přípravek smáčedla, byl triton X-114 (Sigma) zpracován třemi cykly 0 °C/30 °C způsobem podle publikace Bordier, 1981. Extrakce lipopolysacharidu ze vzorku DNA byla provedena na rozdíl od publikovaných postupů (Aida a Pabst, 1990, Manthorpe a další, 1993) následujícím způsobem: vzorek DNA (0,5 až 1,5 mg/ml v 10 mM tris a 0,1 mM EDTA o pH 7,4 (TE)), byl upraven přidáním 0,3M octanu sodného na pH 7,5. Pak bylo přidáno množství 3 mikrolitry tritonu X-114 na 100 mikrolitrů roztoku DNA, vzorky byly energicky promíchány míchacím zařízením Vortex a inkubovány 10 minut v ledu. Aby bylo možno obě fáze oddělit, byly vzorky uloženy na 5 minut při 30 °C a pak odstředěny v předehřáté Eppendorfově odstředivce 2 minuty při teplotě 2000 ot/min a vodná fáze pak byla přenesena do čerstvé Eppendorfovy zkumavky. Tato extrakce byla ještě dvakrát opakována, získaná vodná fáze byla srážena přidáním

0,6 objemů isopropanolu při teplotě místnosti, sraženina byla oddělena odstředěním, dvakrát promyta 80% ethanolem, usušena na vzduchu, znovu rozpuštěna v TE a bylo stanoveno její množství. K tomuto účelu byl vzorek zpracován působením RNA-ázy A, proteinázy K, směsí fenolu a chloroformu a chloroformem, pak bylo znovu provedeno srážení a výsledná usazenina DNA byla uvedena do suspenze v TE a byla stanovena absorpce při 260 nm, přičemž přístroj byl nastaven tak, že koncentrace 0,5 mg/ml DNA vykazovala hodnotu absorpce 1.

ii) Chromatografie s použitím polymyxinu

Objem suspenze polymyxinové pryskyřice (Affi-Prep-Polymyxin, Biorad), odpovídající objemu vzorku DNA byl smísen na krátkou dobu se třemi objemy 0,1 N NaOH a pak byl třikrát promyt TE v množství 5 objemů pryskyřice. Po odstředění byla pryskyřice smísena se vzorky DNA v TE s obsahem 0,8 až 1,2 mg/ml a směs byla míchána přes noc při teplotě 4 °C. Pak byl vzorek nanesen na sloupec, předem zpracovaný 0,1 M NaOH a sloupec byl promyt TE. Byl odebírán eluát, pryskyřice byla promyta dalším objemem TE a eluát byl spojen s promývací kapalinou. DNA pak byla vysrážena přidáním 1/10 objemu 3 M octanu sodného o pH 5 a dvěma objemy ethanolu. Další zpracování sraž-eniny a stanovení DNA bylo uskutečněno stejně jako svrchu.

c) Buněčná kultura

Buňky primárního lidského melanomu byly izolovány a pěstovány v prostředí RPMI 1640 (Gibco/BRL), doplněném 100 mezinárodními jednotkami/ml penicilinu, 100 mikrogramu/ml streptomycinu, 2 mM L-glutaminu, 1 % pyrohroznanu sodného a 10 % FCS po inaktivaci teplem.

d) Zkouška na endotoxin

Obsah lipopolysacharidu byl stanoven chromogenní zkouš kou srážením (limulus), v podstatě jde o srážení ambebocytů (Iwanaga, 1993, BioWhittaker QCL-lOOO). Před provedením pokusu byly všechny biologické materiály a reakční činidla zkoušeny na čistotu, zejména na nepřítomnost 1ipopolysacharidů (méně než 0,1 jednotka endotoxinu (EU) na 50 mikrolitrů roztoku).

e) Příprava komplexů pro transfekci

Byly připraveny ternární komplexy při použití transferrin-polylysin, streptavidin-polylysin a biotinylovaného adenovirů dll014, inaktivovaného kombinací 8-methoxypsoralénu a UV-záření (8 mikrolitrů, 1 x 10 částic/ml) a DNA plasmidu (6 mikrogramů, ředění na 100 mikrolitrů, vždy je uveden obsah lipopolysacharidu), příprava byla uskutečněna podle předchozích příkladů.

Primární buňky lidského melanomu H225 (2 x 10 buněk/ /plotna s průměrem 6 cm) bylo podrobeno transfekci při použití 6 mikrogramů plasmidu, čištěného různými postupy, tak jak je uvedeno na obr. 29. Obsah endotoxinu v plasmidu před čištěním je výkrese udán vždy jako tmavě vyšrafované sloupce. Po čištění pryskyřicí s obsahem polymyxinu nebo extrakcí tritonem X-114 obsahoval všechny prostředky méně než 0,1 EU lipopolysacharidu/6 mikrogramů DNA. Obsah IL-2 byl stanoven zkouškou ELISA (T Cell Diagnostics lne., Cambridge, MA USA) v supernatantu, hodnoty, udané na výkresu znamenají jednotky/10 buněk za 24 hodin.

V rámci tohoto příkladu byly mimoto provedeny ještě pokusy, které prokázaly, že pokles exprese po přidání LPS k čištěné DNA je možno alespoň částečně vyrovnat v případě, že se do prostředí přidá polymyxin.

Příklad 22

Indukce systemické imunitní odpovědi imunizací s použitím buněk karcinomu tlustého střeva po ozáření a po transfekci s použitím DNA pro cytokiny

V tomto příkladu bylo postupováno obdobným způsobem jako v příkladu 8, pokud jde o použité komplexy pro transfekci, o pěstování buněk a o uskutečnění tnansfekce. DNA pro cytokiny, její dávkování a kontroly (prázdný vektor a pouze ozářené buňky) odpovídaly příkladu 16. Označení, uvedené na obr. 30 odpovídá označení na obr. 25 a v příkladu

16. Byly použity buňky buněčné linie karcinomu tlustého stře va CT 26 (Brattain a další, 1988). Jako pokusná zvířata byly použity myši kmene BALB/c. Pro každou imunizaci bylo použito vždy 1 x 10^ buněk, tvorba nádorů byla vyvolána aplikací 3 χ 10⁵ buněk. V tabulce VII jsou uvedeny hodnoty pro expresi za 24 hodin pro IL-2 (jednotky/myš), pro IFN-gamma a GM-CSF (vždy ng/myš), jde o expresi mezi ozářením buněk a jejich vstřiknutím (1.imunizace/2.imunizace). Na obr. 30 je znázorněn ochranný účinek proti tvorbě nádorů při použití uvedené protinádorové vakcíny.

Tabulka I

Poměr plasmidu Exprese genu (na 10θ buněk/24 h.)

IFN-gamma IL-2 ng jednotky

ΙΓΝ-γ	ιοα	i %/ZL-2	, 0	%	369.5	-
IFN-γ	75	%/ZL-2	25	%	290.4	7920
ZFN-γ	50	%/ZL-2	50	%	204.6	11380
IFN-γ	25	%/ZL-2	l 3	%	83.3	14520
IFN-Y	10	%/Zl-2	90	%	42.9	18150

světelné jednotky luciferázy/ /Ug bílkoviny

pCMVL	100 %/pS? 0 %	1531438
pCMVL	75 %/?S? 25 %	1191650
pCMVL	50 %/?S? 50 %	700052
pCMVL	25 %/pS? 75 %	209914
pCMVL	12.5 %/pS? 87.5 %	43352
pCMVL	6.3 %/pS? 93.7 %	14532
pCMVL	3.1 %/pS? 95.9 %	7324

vo cn

CO <31

III tú £

(8 &24 ><u c

£ £

U '>!

>

O ίο

Ό '«0 c

so t

CS un es

	3 <3	un es	3	3 un	m es
3	3	un	3	3	un
—»
Ό	O	es	3	un	—
3	3	un	3	3	cn
-
3	3	es	3	un	—
3	'β	un	3	3	un

p- o ca	un	3	3	es	3	un
	-i
	c		3	3	cn	VO	3	ur,
	ca				—		—	—
	c.	τ	3	3	es	3	un
	ε
	•rt		3	3	un	VO	vo	tr,
	0		~—	—		—.
04	C·	m	3	3	es	3	un	—
	>>
< Q	3 C		3	3	un	VO	vO	V,
uu c	'>,			~-	—	~~
	ε-	r<	3	3	es	3	un	w·
0
c
OJ			3	3	un	vo	vo	tr,
s v				—			~~~
rt·			3	3	3	3	TT

>03 >» ε

□ n

i s

ε o

c ca <u ε

•n

O >

'>>

>

><U c

υ

X '>> CM 3

4) >3 '<a 4) N <J o ca

N ifl •H O 3 r->

X 8 r-l <u o

ca

N •rt s

ε •H

N <U

CB

es

I _3 u 1 k a IV

Vývoj nádorů u myší DBA/2

Týdny po implantaci nádorových buněk

Imunižace · (2 x)

(i x IQ3 M-3 buněk)	1	2	3	4
		1 x	105 M	>2
bez imunizace	0/6	2/6	6/6	6/6
oS? (dU014)	0/6	1/6	3/5	4/6
IL-2 100 % (dI1014)	0/6	0/5	0/5	0/5
IL-2 4 % (Č11014)	0/3	0/5	1/3	1/3
		3 x	10- M-	• J
IL-2 100 % (dilQ14)	0/5	0/5	0/5	2/3
IL-2 4 % (dll014)	0/5	2/5	3/5	4/3
		1 x	1OS M-	Λ
IL-2 100 % (dII014)	0/4	0/4	1/4	1/3
IL-2 4 % (dllQ14)	1/5	3/3	4/3	4/3
		1 x	105 KLN 205
IL-2 100 % (dllC14)	0/6	2/5	6/6	6/6

>

cd

Jtf fI I

CO σ> c i cd

E-i

co	o	0
	η	0			AA
				•H
	o			>N
	a			>>
	»l-i	£		JC '	a
	c			>c	o
	<u	co		3	rH
	N	v		JO	X
	ce
	ι-
	έ
	N
	0			•
	í-			P
		υ		0
	·*	0		>
	CJ			P	AA
	2			>N
	Ή	·*		>»
	c	£		JC	a
	<u			>C	o
	N	xr		3	rH
	cC	CJ		JO	X
	í-
	ε
	N			•
		ce	•	P
	-	ε	£	0
	>>	ί-		>
	O	Ο	O	Ή	*
		a		>N
	O		A
	o	'CO	ί-	>>
	r“4	>	ο	J4	a
		0	60	>C	o
	srl	JC	c	3	l—i
	c	Ό	•H	JO	X
Ή	<D	rH	es
c	>í-			•
0	'ce			P
N	N		Ή	0
ce	O		c	>	*
í-		0	o	•H
ε	·»	a	N	>N
N	CJ		ce
	1	>o	c-	>»
0	£	c	ε	JC	a
a	H	cn	N	>c	o
	><u	0	3	rM
jc	ε	P	SJ	JO	X
>O	'>>
C	x.
3	cn			•
JO	Ό			P
	P			o
ε	p	Ό	ε	>	*
P		<U	Ή	•rl
P	P	>C-	c	>N
•H	O	a	cu
>N	X		N
3	<U	>0	ce	>1
0	a	c	í-	JC	a
a	cn	cn	ε	>C	o
	c	>o	N	3	rH
cn	ce	P		JO	X
ce	P
ε
í—	0			0
0	a			í-
a	CO			a
'(O	x	>-J	Srí
jc	X	c		O Ή
o		CD		CD c
•H	.	>	)í- 0
c	>1	0		Ρ N
cu	JC	c		cn ce
rM		3		o fc.
ce	§	P		«- ε
u	ca	cn		a n

o		O		a	Ό
a		a		a	c
		«Τ		a
·*				·*	13
rH		O		o	C
c*		r—l		o	Ό
		a		a	C
				CJ
		a		a
*				A	T3
r—H		O		O	C
o		CJ		o	Ρ»
co		a		a	T
a		a		a	a
·«		*		·»	A
r-1		o		o	O
a		a		a	o
σι		a		a	'T
a		a		o
«*		-		·»	·*
CJ		CJ		CJ	o
a		O		a	^r
a		o		a	a
		P
P		O		a	a
		A		-	·»
a		a		CJ	a
+
+	+
H CD		o	·»		*t
xaa	<	a	a	+ O	a
a a x	a	X	w	a	S ,
es a o	—	o	=	S- X	χ ί-
				<u c	ο
AAAAAA	AA	*	AA	ao	^R 00
				C 'SR	C
O O O	O	o	CJ	•H	a p
> CJ P	CJ	rH	rM	os a	P os

nd = nebylo provedeno

I σ>

cn i

ti xx □

xo ti

El

CU

W <u x cu CL I x 2 CU — o

o sr ><u >x co

CX ti o

ΪΑ sr

CD cn o

x cu α i o X 2 o <u —

ST >X a x ><1) sz co ti sr xo cu

OT' ωχ o <ux

O X oj sr cx i

X 2 •H CU í—' >x cx

O X ><D c

ti xo

o
0		o
sr		ί-
1		α
« ti
CO CO		'l—<
2		n	>—
2 O	c	CU	r~
Cl	'ti	>í-	ΰ
řo	>	+j	s
XX ti	o	cn	ti
>c xo	XX	o	X
3 O	>o	x	Ξ
X3 Ό	o	a.	M

o	sr σι
sr	l>
σι	co
L.0	2
2 sr	co
cu	sr

		o o
o	o	o o	O	o
LO	CX)	r—1 t—t		>
2	2	£. 2	x:	2
sr	co	sr co		co
OJ	sr	cu sr	C\J	sr

(X) sr cD sr 2	Od co co sr £.
sr	00
cu	sr
				ΐΑ
o	o	uo m	o	o
in	1X0	cn cn	CX)	CD
				*
2	sz	2 2	2	2
sr	00	sr co	sr	00
cu	sr	ou sr	OJ	sr
m	cn
cn	uo
í-1	o
1	o
1-i
·.	r.
2	2
sr	00
cu	sr

o	o	o o	o o	o o
rH	rd	t> co	CU CJ	sr sr
		_ -	. -
2	2	2 2	xo 2	xo xo
sr	00	sr oo	sr oo	sr oo
cu	sr	cu sr	cu sr	ou sr

+

+	+
)—1	o	o	*		*
2	CD CD	< CD	CD	+ o	CD
CX	O 2	CD 2	CD	CD	w
2	a a	x a	2	X 2	2 X
				cu a	<u
			OO	bO
			C Ϊ&	C
o o o	o o	cu	*rď	CU 2
o	C\J rd	OU 2	i—4	2 ď>	2 2

jednotkách/24 h/lxlO buněk ti 4->

c ti +J ti c X cu cx ti cn > >

xx <u >cu cn c o

X xo a

X

CU

100

Tabulka VII

Vakcína exprese imun./2.imun.

GM-CSF (vysoká)

GM CSF (střední) GM-CSF (nízká)

IL-2 (vysoká)

IL-2 (střední)

IL-2 (nízká) IFN-gamma (vysoká) IFN-gamma (střední) IFN-gamma (nízká)

241/184

24/18

2,4/1,8

4302/4624

860/925

86/93

129/63

13/6

1,3/0,6

101

Literatura

Abrahamson, 2.R. et al., 1981, J. Cell. Bioi. 91, 270280.

Aida, Y. und Pabsr, M.J., 1990, J. Immunol. Merhods 132, 191-195.

Anderson, P. er al., 1982, J. Bioi. Chem. 257, 1130111304.

Anilionis, A., Wunner, W.K., Curris, P.J., 1982, Comp. Immunol. Microbiol. Iníect. Dis. 5, 27-32.

Asada-Kubota, M. er al., 1983, Exp. Parhci. 23, 95-101. Ascoli, M. er al., 1978, J. Bioi. Chem. 253, 7332-7838. Ashwell, G. er al., 1982, Annu. Rev. 3iochem. 51, 531554.

Baskar, S., Osrrand-Rcsenberg, S., Nabavi, N., Nadler,

L., Freeman, G. und Glimcher, L., 1993,

Proč.Nati.Acad.Sci. USA 90, 5687-5690.

Berd, D., Maguire, K.C., McCue, ?. und Masrrangelo, M.J. 1990, J. Ciin. Onccl. 8, 1853-1867.

3crdier, C., 1981, J. Bioi. Chem. 255, 1504-1507. 3osharr, M. er al., 1985, Cell 41, 521-530.

Brarrain, M.G., Strobei-Stavens, J., Fine, S., Webb M.

und Sarrif, A.M., 1980, Cancer Res. 40, 2142-2145.

Bridge, Ξ. und Kerner, G., 1989, J. Viroi. 63, 631-638. Budowsky, E. und Zalesskaya, M., 1991, Vaccir.e 9, 319. Bysrryn, J.C., 1990, Cancer Merasrasis Rev. 9, 81091. Bysrryn, J.C., Oratz, R., Roses, D., Harris, M., Henn, M und Lew, R., 1992, Cancer 69, 1157-1164.

Carpenter, G., 1934. Cell 37, 337-358.

Chardonner, Y. und Dales, S., 1970, Viology 40, 462-477. Chen, L., Ashe, S., Brady, W.A., Heiisrrcm, I.,

Heiisrrcm, Κ.Ξ., Ledberrer, J.A., McGowan, ?. und Linslev, P.S., 1992, Cell 71, 1093-1102.

Cheng, S-Y. er al., 1980, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 77, 3425-3429.

102

Cotten, M., Laengle-Rouault, F., Klriappos, H., Wagner,

3., Mechtier, K., Zenke, M., Beug, K. und 3irnstiel.,

M.L., 1530, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 37, 4033-4037.

Cotten, M., Wagner, Ε., Zatloukal, K., Phillips, S., Curiel, D.T. und Birnstiel, M.L., 1992,

Proč.Nati.Acad.Sci. USA 89, S094-6093.

Curiel, D.T., Agarwal, S., Wagner, E. und Cotten, Μ., 1991, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 83, 8850-8854.

Curiel, D.T., Agarwal, S., Panter, M.U., Wagner, Ε.,

Cotten, Μ., Birnstiel, M.L. und Boucher, R.C., 1992a, Am.J.Resoir.Cell and Mol.Biol. 6, 247-252.

Curiel, D.T., Wagner, Ξ., Cotten, M., 3irnstiei, M.L., Agarwal, S., Li, Ch.-M., Loechei, S. und Hu, P.-H., 1992b, Huraan Gene Therapie 3, 147-154.

Davidson, D. und Hasseli, J.A., 1987, J. Virci. 61, 12261239.

De	Shu,	J·,	Pye, D., und Cox, J., 1986, J. Biol. Stand
	14,	103.
De	wet.	J · ,	Wood, K., DeLuca, M., Helsinkí, D. und
	Subr	•araan	•i, S., 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 725-737.

Fakhrai, H., Gjerset, R., Shawler, D.L., Naviaux, R., Royston, Z. und Sobol, R., 1992, J. Cell. Biochem. Suppl. I6F, 47.

Fearon, E.R., Itaya, T., Hunt, B., Vogelstein, B. und Frost, P., 1988, Cancer Res. 48, 2973-2980.

Fearon, E.R., Pardoll, D.M., Itaya, T., Golumbek, ?., Levitzky, H.I., Simons, J.W., Karasuyama, H., Vcgelstein, 3. und Frost, P., 1990, Cell 60, 397-403.

Feinberg, A. und Vogelstein, 3., 1984, Anal. 3ioche 137, 266-267.

Fidler et al., 1975, Cancer Res. 35, 218-234.

Freshney, R.Z., 1937, Disaggragation of the Tissue and Primary Culture, Culture of Aniraai Ceils.

Goldstein, J.L. et al., 1979, Proč.Nati Acad.Sci. USA 75, 333-337.

Goldstein, L.J. et al., 1980, Nátuře 285, 66.

103

Goldstein, J.l. ez al.. 1982, Clin. Res., 30, 417-426

Gooding, L.R., 1992, Cell Grav, P.W. und Goeddel, D USA 30, =342-5346. Gunning, P., Leavizz, J.,

Kedes, 1., 1937, Proč 4835.

71, 5-7.

v., 1983, Proč.Nazí.Acad.Sci.

Muscaz, G., Ng, S.-Y. und Nazí.Acad.Sci. USA 84, 4831Hanson, C.V., 1992, Slood Cells 18, 7-25.

Heldin, C-H. ez al., 1982, J. Biol. Chem. 257, 4216-4221. Hizuka, N. ez al., 1981, J. Biol. Chem. 256, 4591-4597. Hoon, D.S.3, Foshag, L.J., Nizze, A.S., Bohman, R. und

Morzon, O.L., 1990, Cancer Res. 50, 5358-5364.

Hasang, m. ez al., 1987, EM30 J. 6, 1197-1202.

Imamura, X. ez al., 1987, J. Immunol. 139, 2989-2992. Izava, 7., Yamagiwa, S., Okada, F., Oikawa, 7., Kuzumaki,

N., Takeiohi, N., Hosokawa, M. und Kooayashi, Η., 1937, Cancer Research 47, 3136-3140.

Iwanaga, Ξ., 1993, Curr. Opin. Immunol. 5, 74-32.

Jenkins, M.K. und Johnson, J.G., 1993, Currenz Opinion in

Immunol. 5, 361-367.

Jones, G.E., 1989, Sszahlishmenz, Mainxenance and Cloning of Human Primary Cell Szrains, Mexhods in Molecular Biology, Vol. 5.

Jones, N. und Shenk, T., 1979, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 76, 3665-3669.

Kaplan, J. ez al., 1979, J. Biol. Chem. 254, 7323-7328. Karasuyama, H. und Melchers, F., 1988, Eur. J. Immunol.

18, 97-104.

Karasuyama, H., Tohyama, N. und Tada, T., 1989, J. Exp. Med. 169. 13.

Kay, R., Takei, F. und Humphries, R.K., 1990, J. Immunolcgy 145, 1952-1959.

Klausner, R.2. ez al., 1983, J. 3iol. Chem. 253, 47154724.

Klausner, R.2. ez al., 1983, Prcc.Nazí.Acad.Sci. USA 80, 2263-2266.

104

Knorr, R., 7rzeciak, A., Bannwarth, W. und Gillessen, D., 1939, 7etrahedrcn Letters 30, 1927-1930.

Kuhn, L.C. ar ai., 1932, Trends Biochem. Sci. 7, 299-302. Lim, K. und Chee, C.3., 1939, BioTechniques 7, 576-379. Liu, Y., Jor.es, 3., Brady, W., Janeway, C.A. und Linsiey,

P.S., 1992a, Eur. J. Immunoi. 22, 2855-2359.

Liu, Y., Jcr.as, 3., Aruffo, A., Suiiivan, K.M., Linsiey, P.S. und Janeway, C.A., 1992b, J. Exp. Med. 175, 437445.

Lotze, M.T.. Zeh, H.J., Elder, Ξ.Μ., Cai, Q., Pippin, B.A., Rosenstain, M.M., Whiteside, T.L. und Herbannan, R., 1992, J. Immunotherapie 12, 212-217.

Ma.nthorpe, Ccrnefert-Jensen, F., Hartikka, J.,

Feigner, J. Rundeil, A., Margaiith, M. und Dwarki,

V., 1993, Human Gane Therapy 4, 419-431.

Marshaii, S., 1983, J 3iol. Chem. 250, 4133-4144. Massague, J. ar ai., 1986, J. Cell. Physiol. 123, 216222.

Meilmar., I.S. et al., 1934, J. Caii. 3ici. 98, 1170-1177. Miyataka, S., Otsuka, 7., Yokota, 7., Lee, F. und Arai,

K., 1983, ΞΜ30 J. 4, 2561-2368.

Mizel, S.3. et al., 1937, J. Immunoi. 138, 2906-2912. Morgeaux, S., 7ordo, N., Gontier, C. und Perrin, ?.,

1993, Vaocine 11, 32-90.

Nakamura, T. et ai., 1989, Nátuře 342, 440-443.

Nevins, J.R., 1991, TI3S 16, 435-439.

Nevins, J.R., 1992, Science 258, 424-429.

Ostrand-Roser.berg, S., Thakur, A. und Clements, V., 1990, J. Immunoi. 144, 4068-4071.

Paeratakul, V., De Stasio, ?. und Tavlor, Μ., 1938, J. Virol. 62, 1132-1135.

Pardoll, 1992, Curr. Opin. Immunoi. 4, 619-623.

Plaksin, Gelber, C., Feldma.n, M. und Eisenbach, L.,

1933, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 83, 4463-4467.

Posner, 3.1. et al., 1982, J. Cell. Biol. 93, 560-567.

105

Precious, Ξ. und Russell, W.C., 1985, Virology, ed. Mahy,

3.W.J., ZRL Press, Oxford, Washington, DC, 193-205.

Rosenberg, S.A. et al., 1992, Human Gene Therapy 3, 7590.

Sambrook, J., Fritsch, S.F. and Maniatis, T., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2.Auflage).

Schalch, D.S. et al., 1986, Endocrinology 118, 1590-1597. Schirrmacher, V., 1990, Spektrum der Wissenschaft, Januar

90, 38-50.

Schwartz, R.H., 1992, Cell 71, 1065-1063.

Seed, 3., 1987, Nátuře 329, 840-842.

Severne, Y., Wieland, S., Schaffner, W. und Rusconi, S., 1983, ΞΜ30 J. 7, 2503-2508.

Sharon, N., 1987, Cell Separation: Methods and Seiected Applications, Vol. 5, Academie Press lne., pp.13-44.

Sly, W.S. und Grubb, J., 1979, Isolation of Fibroblasts from Patients, Methods in Enzymology, Vol. LVIII.

Sly, W. et al., 1982, J. Cell. 3iochem. 18, 67-85.

Smith, K.A. et al., 1985, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 82,

864-367.

Scberon, X., Covarrubias, L. und Boliviar, F., 1930, Gene 9, 237.

Springer, T.A., Dustin, M.L., Kishimoto, T.K. und Mariin,

S.D., 1987, Annu. Rev. Immunol. 5, 223.

Stáhl, P.D. et al., 1978, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 75, 1399-1403.

Taniguchi, T., Matsui, Η., Fujita, T., Takaoka, C., Kashima, N., Yoshimoto, R. und Hamuro, J., 1933, Nátuře 302, 305-310.

Townsend, S.E. und Allison, J.P., 1993, Science 259, 363370.

Uchida, Y., Tsukada, U. und Sugimori, T., 1977, J. 3iochem. 82, 1425-1433.

Wagner, Ξ., Zenke, M., Cotten, M., Beug, H. und

3irnstiel, M.L., 1990, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 87, 3410-3414.

106

Waaner, Ξ., Ca třen, Μ., Faisner, R. und Birnstiel, M.L., 1991a, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 88, 4255-4259.

Wagner, Ξ., Cotten, M., Mechtler, K., Kirlappos, H. und Birnstiel, M.L., 1991b, 3ioconjugats Chem. 2, 226231.

Wagner, Ξ., Zatloukal, K., Cotten, Μ., Kirlappos, H.,

Mechtler, K., Curiel, D.T. und Birnstiel, M.L., 1992, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 89, 6099-6103.

Waiker, F. et al., 1987, J. Cell. Phvsiol. 130, 255-261. Weinberg, D.K. und Ketner, G., 1983, Proč.Nati.Acad. Sci.

USA 80, 5333-5386.

Zatloukal, K., Wagner, Ξ., Cotten, Μ., Phillips, S., Plank, C., Steinlein, P., Curiel, D. und Birnstiel, M.L., 1992, Ann.New York Acad.Sci. 660, 136-153.

Zenke, Μ., Steinlein, ?., Wagner, E., Cotten, Μ., Beug,

H. und Birnstiel, M.L., 1990, Proč.Natí.Acad.Sci. USA 37, 3655-3659.

Trends Pharmacol. Sci. 10, 1989, 453-462.

Human Cancer in Primary Culture, 1991, Hsg. John R.W. Masters, Kluwer Academie Publishers, Dordrecht3oston-landon.

107

Údaje o řetězcích

1) Všeobecné informace

i) přihlašovatel

A) jméno: Boehringer Ingelheim International GmbH

B) ulice: Binger Strasse 173

C) město: Ingelheim am Rhein

E) stát: SRN

F) poštovní směrové číslo: D-55216

G) telefon: 06132/772822

H) telefax: 06132/774377

I) telex: 4187910 bi d ii) Název přihlášky: Způsob výroby vakcíny proti zhoubným nádorům a komplex pro transfekci iii) Počet řetězců: 7 iv) Počítačové zpracování:

A) nosič: Floppy disk

B) počítač: IBM PC-kompatibilní

C) systém: PC-DOS/MS-DOS

D) Software: Patentln Release 1,0, verse 1,25 (EPA)

2) Informace o řetězci č. 1:

i) Vlastnosti řetězce:

A) délka: 1664 párů baží

B) typ sloučeniny: nukleová kyselina

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNS, odpovídající mRNS iii) hypoteticky: 0 vi) původ:

A) organismus: virus vztekliny

108 ix) vlastnosti:

A) název/klíč: 5 UTR

B) póloha:l až 6 ix) vlastnosti:

A) název/klíč: CDS

B) poloha: 7 až 1581 ix) vlastnosti:

A) název/klíč: sig.peptid

B) poloha: 7 až 63 ix) vlastnosti:

a( název/klíč: mat.peptid B) poloha: 64 až 1578.

xi) Popis řetězce č. 1:

TCTAAT ATG GIT CCT CAC GCT CTC CTG TTT CTA CTC CTT CTG GCT TTT 48

Mer Val Pro Gin. Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe -13 -15 -10

CCA

TTG TGT

TTT

GTG AAA

TTC

CCT

ATT

TAC

ACG ATC CCA GAC

» * r* rvu

CTT

96

Pro

Γ ia»’

Cys

Phe

Gly Lys

Phe

Pro

Ile

Tyr

Thr Ile Pro Asp

Lvs

Leu

-5

1

1

5

10

GCT

CTC

TŮG

AGC

CTG ATT

GAC

ATA

CAT

CAC

CTC ACC TGC CTA

AAC

AAT

.4 Λ

Glv

Pro

Trp

Ser

Pro Zle

Asp

Ile

His

His

Leu Ser Cvs Pro

Asn

Asn

15

20

25

TTG

GTA

CTG

GAC

GAC GAA

GGA

TGC

ACC

AAC

CTG TCA GGG CTC

CTC

TAC

192

Leu

Val

Val

Glu

Asp Glu

Glv Cys

Thr

Asn

Leu Ser Gly Fhe

Ser

Tyr

35 40

ATG

GAA

CTT

AAA

CTT

GGA

TAC

ATC

TTA

GCT

ATA

AAA

ATG

AAC

GGG

240

Mer

Glu

Leu

Lys

Val

Gly

Tvr

Ile

Leu

Ala

Ile

Lvs

Mer

Asn

Gly

Phe

45

30

55

ACT

TGC

ACA

GGC

GCT

ACG

GAG

GCT

GAA

ACC

TAC

ACT

AAC

• ·-—»

GTT

2Ξ3

Thr

Cys

Thr

Gly

val

Val

Thr

Glu

Ala

Glu

Tyr

Thr

Asn

Phe

Val

60

65

70

75

GGT

TAT

CTC

ACA

«

AAA

AGA

AAC

CAT

TTC

CGC

CCA

ACA

CCA

335

Gly

Tyr

Val

Thr

Thr

T^t·

Phe

Lys

Arg

Lvs

His

Phe

Arg

Pro

Thr

PT2

so

85

90

109

GAT

GCA

TCT

AGA GCC GGG TAC

AAC

TGG AAC ATG GTC GGT GAC

CTC AGA

384

ASO

Ala

Cys

Arr Ala Ala Tyr

Asn

Tro

Lys

Mac Ala Glv Aso

Pro

95

100

105

TAT

GAA

GAG

TCT CTA CAG

AAT

CCG

TAC

CCT

GAC TAC CGC TGG

C3k

432

Tyr

Glu

Glu

Ser

Leu His

Asn

Pro

Tyr

Pro

Aso Tyr Arg Tro

Leu

Arg

110

115

120

ACT

vxn

AAA

AGC ACC AAG

GAC

TCT

CTC

GTT

ATC ATA TCT CCA

rui

ViA

480

Thr

Val

Lys

Thr Lys

Glu

Ser

Leu

Val

He Ile Ser Pro

Ser

Val

125

130

135

GCA

GAT

TTG

GAC

CCA. TAT

GAC

AGA

TCC

CTT

CAC TCG AGG GTC

TTC

CCT

523

Ala

Asp

Lau

Asp

Prc Tvr Aso

Arg

Ser

Leu

His Ser Arr Val

Phe

Pro

140

145

150

153

AGC

GGG

AAG

TGC

TCA GCA GTA

GCG

Z“*TY^

TCT

TCT ACC TAC TGC

TCC

ACT

576

Ser

Gly

Lys

Cys

Ser Gly

Val

Ala

Val

Ser

Ser Thr Tyr Cys

Ser

160 163 170 i/***· * —*· tt**** *«-r* <<*«* z·*-*“· *<** z-*·^ z-—*-» r* ítj ·—-ri- i,-*· (jtv. λ-i.. ΧνΛί (jtí/ .-v\i CL-j nLatn \--λ λ-<7 3Z4

Asn His Asp Tyr Thr lie Tro Mer Prc Glu Asn Prc Are Leu Glv Mac 175 ' ISO ' 123

ΙΎ’ ·” IF*··· z** z· .^· ksrí»

Λ* -

T77

ACZ

AAT

AGÍ*

ACA GGG

AAG AGA

GCA TGC

AAA GGG

572

Ser Cvs Aso

Tle

Phe

Thr

Asn

Ser

Arg

Gly

Lvs Arg

Ale Ser

Lys Gly

ISO

195

2CQ

AGT GAG ACT

TGC

GGC

• f 'pp

GTA

GAT

GAA ACA

GGC CTA

TAT AAC

720

Ser Glu Thr

Cys

Gly

Phe

Val

Asp

Glu Arg

Glv Leu

Tvr Lvs

Ser Leu

205

210

215

.AAA GCA GCA

TGC

* *

CTC

AAC

TTA

TGT

GGA GTT CTA

GGA GTT

763

Lvs Glv Ala

Cys

Lys

Leu

Lys

Leu

Cys

Gly Val

Leu

Gly Leu

Arg Leu

220

225

220

235

ATG GAT GGA

ACA

TGG

GTC

GCG

ATG

CAA

ACA

AAT

GAA ACC

AAA TGG

315

Mec Aso Gly Thr

iro

Val

Ala

Mec

Gin

Thr

Ser

Asn

Glu Thr

Lvs Tro

2-á

245

250

TGC CCT CCC

GAT

CAG

TTG

GTG

AAC

CTG CAC

GAC

TTT

CGC TCA

z··* «*· z*^ » \«3ΡΛΛ

854

Cys Pro Pro

Asp

Gin

Leu

Val

Asn

Leu

His

Asp

Phe

Arr Ser

Asp Glu

255

260

' 255

ATT GAC CAC

(J Η1 ·

GTT

GTA GAG

GAC

TTG

GTC

AGG

AAC

AGA GAC

GAC TGT

912

Tle Glu His

Lau

Val

Val Glu

Glu

Leu

Val

Arg

Lvs

Arg Glu

Glu Cys

270

275

280

CTG GAT GCA CTA GG

TCC ATC

ATG

* z*^ »/**>*

* «z·»

TCA

* Z*»· mjk

TTC ACA

960

Lau Aso Ala

Leu Glu

Ser

Z^a

Mec

Thr

Thr

Lys

Ser

val Ser

Phe Arg

283

290

295

110

CGT CTC AGT

CAT TTA AGA AAA CTT

GTC CCT GGG TTT GGA AAA GCA TAT

1003

Arg 2CQ

Leu

Ser

His Leu Arg 305

Lys Leu

Val Pm

Giv 310

Phe Gly

Lys

Ala

Tvr 315

ao:

ATA

TTC

AAG AAG ACC

TTG ATG

GAA GCC GAT

GCT

CAC

TAC

AAG

TCA

1056

Thr

7 2,<a

Phe

Asn Lvs Thr

Leu

Mer

Glu

Ala

As?

Ala

His

Tyr

Lvs

Ser

220

325

330

GTC

AGA

ACT

TGG AA.T GAG

ATC

crc

CCT

TCA

AAA

GGG

TGT

»**·* rwn

GTT

HC4

Val

Arg

Thr

Tm Asn Glu

Ile

Leu

Pm

Ser

Lvs

Giv Cys

Leu

Arg

Val

335

340

345

GGG

GGG

AGG

TGT CAT CCT

CAT

GTG

AAC

GGG GTG

TTT

TTC AAT

GGT ATA

1152

Giv Giv

Arg

Cys His Pm

His

Val

Asn

Gly Val

Phe

Phe

Asn

Giv

He

250

355

360

Α·Α

x ·.%

GGA

CCT GAC GGC

AAT

GTC

TTA

ATC CCA

ATG

·—Λ

TCO

1200

ZLs

Leu

Gly

Pm As? Gly

Asn

Val

Leu

Z2.S

Pm

Glu

Mer

Gin

Ser

Ser

366

370

375

CTC

CTC

CAG

CAA CAT ATG

GAG

TTG

TTG

GAA

?CC

TCG

GTT

ATC

CCC

CTT

1243

Leu

Leu

Gin

Gin His Mer

Glu

Leu

Leu

Glu

Ser

Ser

Val

LLb

Pm

Leu

230

335

390

395

GTG

CAC

CCC

CTG GCA GAC

CCG

TCT

ACC

GTT

•

AAG

GAC

GGT

GAC

GAG

1296

Val

His

O·’*·* • * w

Leu Ala Ass

Pm

Ser

Thr

Val

Phe

Lys

As?

Gly

As?

Glu

400

405

410

gct

GAG

GAT

TTT GTT GAA GTT

CAC

CTT

CCC

GAT

GTG

CAC

t * m

CAG GTC

1244

Ala

Glu

As?

Phe Val Glu

Val

His

Leu

Pm

As?

Val

His

Asn

Gin

Val

415

420

425

TCA

GGA

GIT

GAC TTG GGT

cn:

CCG

AAC

TGG

GGG AAG

TAT

GTA

TTA CTG

1292

Ser

Gly

Val

As? Leu Gly

Leu

Pm

Asn

Tm Giv

Lys

Tyr

Val

Leu

Leu

430

435

440

AGT

GGA

GGG

GCC CTG ACT

GCC

TTG

ATG

TTG

ATA

ATT

TTC CTG

ATG

ACA

1440

Ser Ala Gly Ala úau Thr Ala

Leu

Mas

Leu

He

He

Phe

Leu

Mer

Thr

445

450

455

TGT TGT

AGA

AGA GTC AAT

CGA

TCA

GAA

CCT

AC3

CAA

CAC

CTC

AGA

1433

Cvs Cvs

Arg

Arg Val Asn

Arg

Ser

Glu

Pm

ΤΪ”

Gin

His

Asn

Leu

Arg

460

465

470

475

GGG

ACA

GGG

AGG GAG GTG

TCA GTC

ACT

CCC

CAA

AGC

GGG

AAG

ATC

ATA

1536

Gly

Gly

Arg Glu Val

Ser val

Thr

Pm

Gin

Ser

Gly

Lys

Ha

He

450

435

490

TCT

TCA

TGG

GAA TCA CAC

AAG AGT

UkÁJ Ijkjl

GAG

ACC

AGA CTG

TGAGGACTGG 1533

Ser

Ser

Tr?

Glu Ser His

Lys Ser Giv Giv Glu

Thr

Arg Leu

495

SCO

505

GTCCTGAAGA TCACCI

TTGGGGGGTT CTTTTTGAAA 1543 ccstccitic aacga:

AAAAAAAAAA MAAAn

1664

111

2) Informace o řetězci č. 2: i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 524 zbytků aminokyselin

B) typ sloučeniny: řetězec aminokyselin

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: bílkovina xi) popis řetězce č. 2:

Mst

Val

Pra

Gin

Ala

Leu

Leu

Phe

val

Pra

Leu

Leu

Val

Phe

Pra Leu

-19

-15

-10

-5

Cys

Pbe

Gly

Lys

Phe

Pra

ΖΣβ

Tyr

Thr

He

Pra

As?

Lvs

Leu

Gly Pra

1

5

10

Ts?

Ser

Pra

Ile

AS?

Hs

His

HiS

Leu

Ser

Cys

Pra

Asn

Asn

Leu Val

20

25

Val

Glu

As?

Glu

Gly Cys

Thr

Asn

Leu

Ser

Gly Phe

Ser

Tyr

Met Glu

20

25

40

45

Leu

Lys

Val

Gly

Ile

Leu

Ala

Ile

Lys

Met

Asn Glv

Phe

Thr Cys

50

55

60

Gly

Val

Val

Glu

Ala Glu

Thr

Tyr

Thr

Asn

Phe

Val

Gly Tyr

65

70

75

Val

Thr

Thr

Thr

Phe

Lys

Ar? Lvs

His

Phe

As?

Pra

Thr

Pra

As? Alar

80

85

90

Cys

As?

Ala Ala

Tyr

Asn

Tra Lys

Met

Ala

Gly

Aso

Pra

As?

Tyr Glu

95

ICO

105

Glu

Ser

Leu

His

Asn

Pra

Tyr

Pra

AS?

Tyr

As?

Tt?

Leu

As?

Thr Val

110

115

120

125

Lys

Thr

Thr

Lys

Glu

Ser

Leu

Val

He

He

Ser

Pra

Ser

Val

Ala As?

120

125

140

Leu

As?

Pra

Tyr Asa

As?

Ser

Leu

HiS

Ser

As?

Val

Phe

Pra

Ser Gly

145

150

155

Lys Cys

Ser

Glv Val

Ala

Val

Ser

Ser

Thr

Tyr

Cys

Ser

Thr Asn His

160

165

170

As? Tyr Thr He Tra Met Pra Glu Asn Pra As? Leu Gly Met Ser Cvs 172 ’ 130 135

112

Asp Zla Phe Thr Asn Ser	Arg	Gly
ISO	195
	Cvs Glv Phe Val Aso 210	Glu	Arg
Ala Cvs Lvs Leu Lvs Leu 225	Cys	Gly
Glv Thr Tho Val Ala Met 240	Gin	Thr 245
Pro	Aso Gin Leu Val Asn 255	Leu 250	His
His 270	Leu Val Val Glu Glu 275	Leu	Val
Ala	Leu Glu Ser Zla Met 293	Thr	Thr
Ser	His Leu Arg Lvs Leu 305	Val
Phe	Asn Lvs Thr Leu Met 320	Glu	Ala 325
TU—	Tro Asn Glu Zle Leu 335	Pro 340	Ser
350	Cvs His Pro His Val 355	Asn	Gly
Gly	Pro Aso Gly Asi Val 370	Leu	Zle
Gin Gin His Met Glu Leu 385	Leu Glu
Pro	Leu Ala Aso Pro Ser Thr Val 400 ' 405
Asp	Phe Val Glu Val His 415	Leu 420	Pro
Val 430	Aso Leu Gly Lsu Pro 435	Asn	Tr?
Glv	Ala Leu Thr Ala Leu 450	Met	Leu
Arg	Arg Val Asn Arg Ser Glu	Pro

Lvs Arg Ala Ser Lvs Glv Ser Glu 2C0 205

Glv Isu Tvr Lvs Ser Leu Lvs Glv * 215 220 *

Val 230	Leu	Glv	Leu Arg Leu Met Aso 235
Ser Asn Glu	Thr Lvs Tro Cvs 250	Pro
Aso	Phe	Arg	Ser 265	Asp	Glu	Zle	Glu
Arg Lys	Arg 280	Glu	Glu Cys	Leu	Aso 285
Lys	Ser 295	Val	Ser	Phe	Arg	Arg 2C0	Leu
Gly 310	Phe	Gly	Lys	Ala	Tyr 315	—	Zla
Asp	Ala	His	Tyr	Lys	Ser	Val	Arg

330

Lys	Glv	Cys	Leu	Arg	Val	Glv	Gly
	345
Val	Phe	Phe	Asn	Gly	Zla	^a	Leu
		360					365
Pro	Glu	Met	Gin	Ser	Ser	Leu	Leu
	375					380
Ser	Ser	Val	Ile	Pro	Lei	Val	His
390					395
Phe	Lys	Asp	Gly	Aso	Glu	Ala	Glu
	410
Asp	Val	His	Asn	Gin	Val	Ser	Glv
		425
Gly	Lys	Tyr	Val	Leu	Leu	Ser	Ala
	440					445
Ile	Tjo	Phe	Leu	Met		Cvs	Cys
	455					460
Thr	Gin	His	Asn	Leu	Aí3	Gly	Thr
470					475

465

113

Gly Arg Glu Val Ser Val Th- Pro Gin Ser Glv Lvs Ha Ile Ser Ser 480 485 * 490

Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu 493 SCO * 305

2) Informace o řetězci š. 3: i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 24 párů baží

B) typ sloučeniny: nukleová kyselina

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNS ix) vlastnosti:

A) název/klíč: 5’UTR

B) poloha: 1 až 24 xi) popis řetězce č. 3:

GTCAACAGCG CACCCACTTC AAGC

2) Informace o řetězci č. 4: i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 24 párů baží

B) typ sloučeniny: nukleová kyselina

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly cDNS ix) vlastnosti:

A) název/klíč: 5'UTR

B) poloha: 1 až 24

114 xi) popis řetězce č. 4:

GCTTGTTGAG ATGATGCTTT GACA

2) Informace o řetězci č. 5:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 21 párů baží

B) typ sloučeniny: nukleová kyselina

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNS ix) vlastnosti:

A) název/klíč: 5UTR

B) poloha: 1 až 21 xi) popis řetězce ě. 5:

GGTCCTGTGT CTGAACCTGA G

2) Informace o řetězci č. 5:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 21 párů baží

B) typ sloučeniny: nukleová kyselina

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNS ix) vlastnosti:

A) název/klíč: 5'UTR

B) poloha: 1 až 21

115 xi) popis řetězce č. 6:

TTATGGCCTG GGGCGTTTAC A

2) Informace o řetězci č. 7: i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 41 zbytků aminokyselin

B) typ sloučeniny: řetězec aminokyselin D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid ix) vlastnosti:

A) název/klíč: peptid

B) poloha: 1 až 41 ix) vlastnosti:

A) název/klíč: modified-site (modifikovaná poloha)

B) poloha: 17

D) zvláštní údaje: Xaa znamená Nle ' ix) vlastnosti:

A) název/klíč: modified-site

B) poloha: 25

D) zvláštní údaje: Xaa znamená Nle

popis

řetěze

e č

. 7:

Glv

Leu

Phe Glu

Ala

Ile

Glu

Gly

Phe

Ile

Glu

Asn

Gly

Trp

Glu Gly

1 *

3

10

15

Xaa

Ile

Asn Glv

Lys

Gly

Asp

Ile

Xaa

Gly

Glu

Ί±ρ

Gly

Asn

Glu Ile

20

25

30

Fhe

Gly

Glu Ile

Ala

Glu

Phe

Leu

Gly

Claims (52)

1. Způsob výroby vakcíny proti zhoubným nádorům s obsahem autologních nádorových buněk, vyznačuj ící se t i m , že se pěstují nádorové buňky nebo fibroblasty a vypěstované buňky se podrobí ex vivo transfekci prostředkem, obsahujícím následující složky ai) molekulu DNA s obsahem jednoho nebo většího počtu řetězců, k jejichž expresi může v buněčném materiálu dojít, tyto řetězce jsou kódem pro jeden nebo větší počet stejných nebo různých imunostimulačních polypeptidů, nebo větší počet molekul DNA s obsahem kódových řetězců pro různé imunostimulační polypeptidy, aii) popřípadě další molekulu DNA, prostou kódových řetězců pro polypeptidy, funkčně aktivní v buněčném materiálu, použitém pro transfekci, bi) konjugát mezi molekulou, na níž je vázána DNA a adenovirem s mutací alespoň v oblasti E4 nebo bii) konjugát, v němž je iontově vázán peptid s endosomolytickým účinkem na molekulu, na níž je vázána DNA,

c) popřípadě molekulu, na níž je vázána DNA, s výhodou konjugací s internalizačním faktorem, schopným se vázat na molekulu na povrchu buněk při transfekci a tím molekulu DNA internalizovat, přičemž složky b) a c) vytvářejí s DNA, definovanou ve složce a) v podstatě elektroneutrální komplex, buňky po transfekci se inaktivují takovým způsobem, že při udržení jejich schopnosti exprese DNA ve složce ai) ztrácejí schopnost se dělit, přičemž v případě transfekce fibroblastů se fibroblasty mísí s inaktivovanými nádorovými buňkami bez transfekce a buněčná populace se pak popřípadě mísí s farmaceutickými pomocnými látkami a nosiči.

117

2. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že se jako DNA ve složce ai) užije plasmid pro expresi s obsahem alespoň jednoho kodového řetězce pro cytokin

3. Způsob podle nároku 2, vyznačuj íc i se t i m , že se jako DNA ve složce ai) užije kódový řetězec pro lidský interleukin 2.

4. Způsob podle nároku 2, vyznačuj íc i se t i m , že se jako DNA ve složce ai) užije DNA, obsahující kódový řetězec pro lidský IFN-gamma.

5. Způsob podle nároku 2, vyznačující se t i m , že se jako DNA ve složce ai) užijí dva plasmidy, z nichž jeden obsahuje kódový řetězec pro lidský interleukin 2 a druhý obsahuje kodový řetězec pro lidský IFN-gamma.

6. Způsob podle nároku 2, vyznačuj íc i se t i m , že se jako DNA ve složce ai) užije DNA, obsahující kódový řetězec pro lidský faktor pro stimulaci kolonií granulocytů a makrofágů, GM-CSF.

7. Způsob podle nároku 1, vyznačuj íc i s e t i m , že se jako DNA ve složce ai) užije plasmid pro expresi s obsahem kódových řetězců pro alespoň jednu pomocnou stimulační molekulu.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačuj íc i se t i m , že DNA obsahuje kódový řetězec pro antigen, stálý za tepla, HSA.

9. Způsob podle nároku 1, vyznačuj íc i se t i m, že se jako DNA ve složce ai) užije plasmid pro expresi s obsahem kodového řetězce pro alespoň jeden neoantigen.

118

10. Způsob podle nároku 9, vyznačuj íc í se t í m , že se jako kódový řetězec pro neoantigen užije kódový řetězec pro virovou bílkovinu nebo její fragment.

11. Způsob podle nároku 10, vyznačuj íc í se t í m , že se užije kódový řetězec pro glykoprotein viru vztekliny.

12. Způsob podle některého z nároků 2 až 11, v y značující se tím, že se navíc jako složka aii) užije plasmid, prostý kódových řetězců pro polypeptid, funkčně aktivní v buňkách po transfekci.

13. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m , že se jako molekula pro vazbu DNA ve složce b) a popřípadě ve složce c) užije polylysin, s výhodou s délkou řetězce 200 až 300 lysinových zbytků.

14. Způsob podle nároku 13, vyznačuj íc í se t í m , že ve složce c) je polylysin konjugován s lidským transferinem jako internalizačním faktorem.

15. Způsob podle nároku 13, vyznačuj íc í se t í m , že se ve složce c) použije polylysin, konjugovaný s lidským EGF jako intrnalizačním faktorem.

15. Způsob podle nároku 1, vyznačuj íc í se t í m , že se jako složka b) použije konjugát, obsahující adenovirus s defektem alespoň v oblasti E4.

17. Způsob podle nároku 16, vyznačuj íc í se t í m , že se jako mutanta adenoviru v oblasti E4 užije adenovirus dll014.

119

18. Způsob podle nároku 1, vyznačuj íc í se t í m , že se jako složka b) užije konjugát s obsahem adenoviru, inaktivovaného beta-propiolaktonem.

19. Způsob podle nároku 1, vyznačuj íc í se t í m , že se jako složka b) užije konjugát, v němž je peptid s řetězcem č. 7 iontově vázán na polylysin.

20. Způsob podle nároku 1, vyznačuj íc í se t í m , že se buňky po transfekci inaktivují působením rtg-záření nebo gamma-záření.

21. Způsob podle nároku 1, vyznačuj íc í se t í m , že se jako nádorové buňky užijí buňky melanomu .

22. Způsob podle nároku 1, vyznačuj íc í se t í m , že se jako nádorové buňky užijí buňky karcinomu tlustéhostřeva.

23. Způsob podle nároku 1, vyznačuj íc í se t í m , že se jako buňky pro transfekci a inaktivaci užijí fibroblasty.

24. Způsob podle nároku 23, vyznačuj íc í se t í m , že se jako fibroblasty použijí autologní fibroblasty.

25. Způsob podle nároku 22, vyznačuj íc i se t í m, že se jako fibroblasty použijí buňky z buněčné linie fibroblastů.

26. Způsob podle některého z nároků 23 až 25, vyznačující se tím, že se fibroblasty po

120 transfekci a inaktivaci smísí s autologními inaktivovanými nádorovými buňkami.

27. Způsob podle nároku 26, vyznačuj íc í se t í m, že se jako nádorové buňky použijí melanomové buňky.

28. Způsob podle nároku 26, vyznačuj íc i se t i m, že se jako nádorové buňky použijí buňky karcinomu tlustého scřeva.

29. Vakcina proti zhoubným nádorům, získatelná způsobem podle někceréno z nároků 1 až 28.

30. Komplex pro transfekci prc výrobu vakcíny proti zhoubným nádorům, vyznačující se tím, že obsahuje následující složky ai) molekulu ONA s obsahem jednoho nebo věcsího počtu řecšzců, k jejichž expresi může v buněčném materiálu dojíc, Cyco řetězce jsou kódem pro jeden nebo věcsí počec stejných nebo různých imunostimuiačrích polycepcidů, nebo větší počet molekul DNA s obsahem kódových řetězců pro různé imunoscimulačr.í polypeptidy, aii) popřípadě další molekulu DNA, prostou kódových řetězců prc polypeptidy, funkčně aktivní v buněčném materiálu, použitém pro transfekci, bi) konjugát mezi molekulou, na niž je vázána DNA a ader.ovirem s mutací alespoň v oblasti Ξ- nebo bii) konjugát, v němž je iontově vázán peccid s endosomolytickým účinkem na molekulu, na níž je vázána DNA,

c) popřípadě molekulu, na níž je vázána DNA, s výhodou konjugací s internalizačním faktorem, schopným se vázac na molekulu na povrchu buněk při transfekci a tím molekulu DNA internalizovat, přičemž složky b) a c) vytvářejí s DNA, definovanou ve složce a) v podstatě elektroneutrální komplex.

121

31. Komplex podle nároku 30, vyznačuj í c í se t í m , že jako DNA ve složce ai) obsahuje plasmid pro expresi s obsahem alespoň jednoho kódového řetězce pro cytokin.

32. Komplex podle nároku 31, vyznačuj í c í se t í m , že jako DNA ve složce ai) obsahuje DNA s kódovým řetězcem pro lidský interleukin 2.

33. Komplex podle nároku 31, vyznačuj íc í se t í m , že jako DNA ve složce ai) obsahuje DNA s kódovým řetězcem pro lidský IFN-gamma.

34. Komplex podle nároku 31, vyznačuj í c í se t í m , že jako DNA ve složce ai) obsahuje DNA s kódovým řetězcem pro lidský GM-CSF.

35. Komplex podle nároku 31, vyznačuj í c í se t í m , že jako DNA ve složce ai) obsahuje dva plasmi dy, z nichž jeden obsahuje kódový řetězec pro lidský interleukin 2 a druhý obsahuje kódový řetězec pro lidský IFN-gamma.

36. Komplex podle nároku 30, vyznačuj ící se t í m , že jako DNA ve složce ai) obsahuje plasmid pro expresi s kódovým řetězcem pro alespoň jednu pomocnou stimulační molekulu.

37. Komplex podle nároku 36, vyznačuj í c í se t í m , že DNA ve složce ai) obsahuje kódový řetězec pro antigen, stálý za tepla, HSA.

38. Komplex podle nároku 30, vyznačuj í c í se t í m, že jako DNA ve složce ai) obsahuje plasmid pro expresi s alespoň jedním kodovým řetězcem pro neoantigen.

122

39. Komplex podle nároku 38, vyznačující se t í m , že jako kódový řetězec pro neoantigen obsahuje kódový řetězec pro virovou bílkovinu nebo její fragment.

40. Komplex podle nároku 39, vyznačuj íc í se t í m , že jako kódový řetězec pro virovou bílkovinu obsahuje kódový řetězec pro glykoprotein viru vztekliny.

41. Komplex podle některého z nároků 30 až 40, vyznačující se tím, že navíc jako molekulu ve složce aii) obsahuje plasmid, prostý kódových řetězců pro polypeptidy, funkčně aktivní v buněčném materiálu po transfekc i.

42. Komplex podle některého z nároků 30 až 41, vyznačující se tím, že DNA ve složce aii) je prostá kódových řetězců pro lipopolysacnaridy.

43. Komplex podle nároku 30, vyznačující se t í m , že jako molekulu pro vazbu DNA ve složce b) a popřípadě ve složce c) obsahuje polylysin, s výhodou s délkou řetězce 200 až 300 lysinových zbytků.

44. Komplex podle nároku 43, vyznačuj ící se t í m , že se ve složce c) užije polylysin, konjugovaný s lidským transferrinem jako internalizačním faktorem .

45. Komplex podle nároku 43, vyznačující se t í m , že se užije polylysin, konjugovaný s lidským EGF jako internalizačním faktorem.

46. Komplex podle nároku 30, vyznačuj í c í se t í m, že jako složku b) obsahuje konjugát s obsahem adenovirů s defektem alespoň v oblasti E4.

123

47. Komplex podle nároku 46, vyznačuj íc i se t í m , že jako mutantu adenoviru v oblasti E4 obsahuje adenovirus dll014.

48. Komplex podle nároku 30, vyznačuj íc i se t i m , že jako složku b) obsahuje konjugát s obsahem adenoviru, inaktivovaného beta-propiolaktonem.

49. Komplex podle nároku 30, vyznačuj íc i se t i m, že jako složku b) obsahuje konjugát, v němž je peptid s řetězcem č. 7 iontově vázán na polylysin.

50. Lidské nádorové buňky, transformované komplexem podle některého z nároků 30 až 49.

51. Lidské fibroblasty, transformované komplexem podle některého z nároků 30 až 49.

52. Fibroblasty podle nároku 51 ve směsi s lidskými nádorovými buňkami.

53. Farmaceutický prostředek, vyznačuj i c i se t i m, že obsahuje buňky podle nároku 50 nebo 52 a farmaceuticky přijatelné živné a pomocné látky.