JP2003501040A - アデノウイルスベクターおよびトランスジーン生成物に対する耐性誘導の方法 - Google Patents
アデノウイルスベクターおよびトランスジーン生成物に対する耐性誘導の方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、宿主にアデノウイルスベクターおよび／またはトランスジーン生成物に対する耐性誘導の方法に関するものであって、かかる方法により宿主が持続的にトランスジーンを発現し、宿主免疫反応を最小にするかまたは除去して、宿主に反復してベクターを投与することができる。該方法は、宿主にアデノウイルスベクター感染抗原提示細胞を投与することを含み、ここで先のアデノウイルスベクターは免疫修飾分子およびトランスジーンをコードする異種核酸を含み、先のアデノウイルスベクター感染抗原提示細胞はリンパ器官および／またはリンパ節に遊走し、耐性を誘導する。該方法はさらに、先のトランスジーンをコードする異種核酸を含むアデノウイルスベクターの宿主にその後の投与を提供し、ここで、先のアデノウイルスベクターは反復投与しても、先のアデノウイルスベクターおよび先のトランスジーンに対する宿主免疫反応は軽減または除去される。
Description
【０００１】
本発明は宿主にトランスジーンおよび／またはトランスジーン生成物を含むア
デノウイルスベクター（およびそのアデノウイルス抗原）に対する耐性誘導に関
するもので、それにより宿主の免疫反応を最小化または除去して、宿主が持続的
にトランスジーンを発現し、宿主に反復してベクターを投与できる。本発明は、
トランスジーンをコードする異種核酸および免疫修飾分子をコードする異種核酸
を含むアデノウイルスベクターを感染させた樹状細胞または他の抗原提示細胞の
静脈内投与による宿主の前処理を提供する。本発明のアデノウイルスベクター感
染樹状細胞はおもに脾臓のようなリンパ器官に遊走し、ここでそれらの細胞はＴ
細胞と相互作用し、そこにトランスジーンおよび免疫修飾分子を高レベルで発現
する。本発明はまた、トランスジーンおよび免疫修飾分子をコードする異種核酸
を含むアデノウイルスの皮内注射による、ｉｎ ｖｉｖｏでの樹状細胞の感染を
提供する。このようにして感染させた樹状細胞は局所リンパ節に遊走し、そこで
Ｔ細胞と相互作用するであろう。さらに、本発明はＴ細胞のアポトーシスを媒介
するｆａｓ／ｆａｓＬによるＴ細胞の特定クローン欠失を提供する。前記方法は
さらに前記トランスジーンを含むアデノウイルスベクターの宿主にその後の投与
を提供し、ここで前記アデノウイルスベクターは反復投与しても、前記アデノウ
イルスベクターおよび前記トランスジーンに対する宿主免疫反応は軽減または除
去される。
デノウイルスベクター（およびそのアデノウイルス抗原）に対する耐性誘導に関
するもので、それにより宿主の免疫反応を最小化または除去して、宿主が持続的
にトランスジーンを発現し、宿主に反復してベクターを投与できる。本発明は、
トランスジーンをコードする異種核酸および免疫修飾分子をコードする異種核酸
を含むアデノウイルスベクターを感染させた樹状細胞または他の抗原提示細胞の
静脈内投与による宿主の前処理を提供する。本発明のアデノウイルスベクター感
染樹状細胞はおもに脾臓のようなリンパ器官に遊走し、ここでそれらの細胞はＴ
細胞と相互作用し、そこにトランスジーンおよび免疫修飾分子を高レベルで発現
する。本発明はまた、トランスジーンおよび免疫修飾分子をコードする異種核酸
を含むアデノウイルスの皮内注射による、ｉｎ ｖｉｖｏでの樹状細胞の感染を
提供する。このようにして感染させた樹状細胞は局所リンパ節に遊走し、そこで
Ｔ細胞と相互作用するであろう。さらに、本発明はＴ細胞のアポトーシスを媒介
するｆａｓ／ｆａｓＬによるＴ細胞の特定クローン欠失を提供する。前記方法は
さらに前記トランスジーンを含むアデノウイルスベクターの宿主にその後の投与
を提供し、ここで前記アデノウイルスベクターは反復投与しても、前記アデノウ
イルスベクターおよび前記トランスジーンに対する宿主免疫反応は軽減または除
去される。
【０００２】
トランスジーンを標的細胞または組織に送達し、そこに所望する表現型の効果
を引き起こすためにそれを発現させる能力は、受容細胞に外因性核酸（トランス
ジーン）を安全で効率的に送達できる遺伝子導入ベヒクルの開発に依存する。
を引き起こすためにそれを発現させる能力は、受容細胞に外因性核酸（トランス
ジーン）を安全で効率的に送達できる遺伝子導入ベヒクルの開発に依存する。
【０００３】
初期の遺伝子導入法はレトロウイルスベクターに焦点が置かれ、かかるベクタ
ーは細胞ゲノムへの組み込みが可能なため、遺伝子療法用の生物学的に活性な分
子をコードするトランスジーンの送達に好まれてきたベクターである。しかし、
レトロウイルスベクターの欠点が明らかになった。それらには、分裂細胞のみに
対する指向性、宿主細胞ゲノムにベクター核酸を組み込むときに宿主ゲノムに挿
入変異が誘発される可能性、次第にトランスジーンの発現が減少すること、血清
補体系によるレトロウイルスの急速な不活性化、および複製−コンピテントレト
ロウイルス発生の可能性が挙げられる（Ｊｏｌｌｙ，Ｄ．，Ｃａｎｓｅｒ Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｉ：５１−６４，１９９４；Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｃ．Ｐ．
，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３：２２２−２２５、１９９５）。
ーは細胞ゲノムへの組み込みが可能なため、遺伝子療法用の生物学的に活性な分
子をコードするトランスジーンの送達に好まれてきたベクターである。しかし、
レトロウイルスベクターの欠点が明らかになった。それらには、分裂細胞のみに
対する指向性、宿主細胞ゲノムにベクター核酸を組み込むときに宿主ゲノムに挿
入変異が誘発される可能性、次第にトランスジーンの発現が減少すること、血清
補体系によるレトロウイルスの急速な不活性化、および複製−コンピテントレト
ロウイルス発生の可能性が挙げられる（Ｊｏｌｌｙ，Ｄ．，Ｃａｎｓｅｒ Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｉ：５１−６４，１９９４；Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｃ．Ｐ．
，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３：２２２−２２５、１９９５）。
【０００４】
約３６ｋｂのゲノムをもった核の２本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルス
については、古典的および分子生物学における研究（Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．，Ｓ
．，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎ"ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２版，Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，
Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９０）でよく性状が調べられ
ている。アデノウイルスゲノムは、２種のウイルス蛋白の時間的クラスの発生に
関連して、初期（Ｅ１−Ｅ４として知られる）および後期（Ｌ１−Ｌ５として知
られる）転写単位に分類する。これらの事象を境界づけるのはウイルス複製段階
である。
については、古典的および分子生物学における研究（Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．，Ｓ
．，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎ"ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２版，Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，
Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９０）でよく性状が調べられ
ている。アデノウイルスゲノムは、２種のウイルス蛋白の時間的クラスの発生に
関連して、初期（Ｅ１−Ｅ４として知られる）および後期（Ｌ１−Ｌ５として知
られる）転写単位に分類する。これらの事象を境界づけるのはウイルス複製段階
である。
【０００５】
アデノウイルスベクターのクローニング能はベクターに存在するアデノウイル
スゲノムのサイズに比例する。たとえば、約８ｋｂのクローニング能を創製する
ために、ウイルス成長に必ずしも必要でない、たとえばＥ３のようなウイルスゲ
ノムのある領域を欠失させたり、およびトランスで２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ，
Ｆ．Ｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２，１９７７）またはＡ５
４９細胞（Ｉｍｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：７５−
８４，１９９６）から取り戻せる機能に関与しているＥ１のようなゲノム領域を
欠失させることができる。そのようなＥ１欠失ベクターは複製欠損性である。ベ
クターＤＮＡの最適運搬能力の上限は野生型ゲノム長の約１０５％−１０８％で
ある。特定の細胞株を使用してアデノウイルスゲノムを修飾したさらなるベクタ
ーデザインが可能である。そのような細胞株とはたとえば、Ｅ２ａの相補性（Ｚ
ｈｏｕ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：７０３０−７０３８，１９９６）
、Ｅ４の相補性（Ｋｒｏｕｇｌｉａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ，Ｇｅｎｅ Ｔｈ
ｅｒ．６：１５７５−１５８６，１９９５；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．２：７７５−７８３，１９９５）または蛋白ＩＸの相補性（Ｃａｒ
ａｖｏｋｙｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：６６２７−６６３３，
１９９５；Ｋｒｏｕｇｌｉａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．
６：１５７５−１５８６，１９９５）などを他のウイルス生成物にトランスで供
給するものである。
スゲノムのサイズに比例する。たとえば、約８ｋｂのクローニング能を創製する
ために、ウイルス成長に必ずしも必要でない、たとえばＥ３のようなウイルスゲ
ノムのある領域を欠失させたり、およびトランスで２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ，
Ｆ．Ｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２，１９７７）またはＡ５
４９細胞（Ｉｍｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：７５−
８４，１９９６）から取り戻せる機能に関与しているＥ１のようなゲノム領域を
欠失させることができる。そのようなＥ１欠失ベクターは複製欠損性である。ベ
クターＤＮＡの最適運搬能力の上限は野生型ゲノム長の約１０５％−１０８％で
ある。特定の細胞株を使用してアデノウイルスゲノムを修飾したさらなるベクタ
ーデザインが可能である。そのような細胞株とはたとえば、Ｅ２ａの相補性（Ｚ
ｈｏｕ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：７０３０−７０３８，１９９６）
、Ｅ４の相補性（Ｋｒｏｕｇｌｉａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ，Ｇｅｎｅ Ｔｈ
ｅｒ．６：１５７５−１５８６，１９９５；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．２：７７５−７８３，１９９５）または蛋白ＩＸの相補性（Ｃａｒ
ａｖｏｋｙｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：６６２７−６６３３，
１９９５；Ｋｒｏｕｇｌｉａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．
６：１５７５−１５８６，１９９５）などを他のウイルス生成物にトランスで供
給するものである。
【０００６】
アデノウイルス由来ベクターはいくつかの利点を持ち、それらには、分裂およ
び非分裂細胞両方への指向性、病原性の低さ、ベクター貯蔵物をつくるための高
力価の複製能、および大きなＤＮＡ挿入物を運ぶ能力（Ｂｅｒｋｅｒ，Ｋ．Ｌ．
，Ｃｕｒｒ，Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３９−６６，１９
９２；Ｊｏｌｌｙ，Ｄ．，Ｃａｎｓｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｉ：５１
−６４，１９９４）が挙げられる。アデノウイルスベクターのクローニング能を
決定する要因は、ウイルス成長に必ずしも必要でない、たとえばＥ３のようなウ
イルスゲノムのある領域の欠失、またはその機能をパッケージング細胞株からト
ランスで取り戻せる領域の欠失である（たとえば、Ｅ１；２９３細胞によるＥ１
機能の相補）（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９
−７２，１９７７）。最適パッケージングの上限はベクター運搬能力を増大させ
るために野生型アデノウイルスゲノム長の約１０５％−１０８％に拡張可能であ
る。
び非分裂細胞両方への指向性、病原性の低さ、ベクター貯蔵物をつくるための高
力価の複製能、および大きなＤＮＡ挿入物を運ぶ能力（Ｂｅｒｋｅｒ，Ｋ．Ｌ．
，Ｃｕｒｒ，Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３９−６６，１９
９２；Ｊｏｌｌｙ，Ｄ．，Ｃａｎｓｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｉ：５１
−６４，１９９４）が挙げられる。アデノウイルスベクターのクローニング能を
決定する要因は、ウイルス成長に必ずしも必要でない、たとえばＥ３のようなウ
イルスゲノムのある領域の欠失、またはその機能をパッケージング細胞株からト
ランスで取り戻せる領域の欠失である（たとえば、Ｅ１；２９３細胞によるＥ１
機能の相補）（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９
−７２，１９７７）。最適パッケージングの上限はベクター運搬能力を増大させ
るために野生型アデノウイルスゲノム長の約１０５％−１０８％に拡張可能であ
る。
【０００７】
アデノウイルスベクターにより今まで発現された遺伝子には、ｐ５３（Ｗｉｌ
ｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：１０７９−
１８８，１９９４）；ジストロフィン（Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕ
ｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５：１３０−１３４，１９９３）、エリスロポイエチ
ン（Ｄｅｓｃａｍｐｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
５：９７９−９８５，１９９４）、オルニチントランスカルバミラーゼ（Ｓｔ
ｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ
ｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：２４１−２５６，１９９０；本発明者ら，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３６３９−３６４６，１９９６）；アデノシンデアミナ
ーゼ（Ｍｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：９４１−９４８，１９９４）、インターロイキン−２（Ｈａｄｄａｄａ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：７０３−７１１，１
９９３）；アル−アンチトリプシン（Ｊａｆｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １：３７２−３７８，１９９２）；トロンボポイエチン（
Ｏｈｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８８：７７８−７８４，１９９６）
；シトシンデアミナーゼ（Ｏｈｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１５６７−１５７６，１９９６）；ヒトα−ガラクトシ
ダーゼＡ（ＰＣＴＮｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９８／２２８８６）、ヒトβ−ガラクトシ
ダーゼ（Ａｒｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ４：１７−２５，１９９７）；インターロイキン−７（Ａｒｔｈｕｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１７−２５，１９９
７）；単純ヘルペスウイルス チミジンキナーゼ遺伝子（米国特許第５，７６３
，４１５号）および嚢胞性線維症経膜コンダクタンスレギュレータ（ＣＦＴＲ）
（米国特許第５，６７０，４８８号および５，８８２，８７７号；Ｚａｂｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１５０４−１５１１，１
９９６）が挙げられる。
ｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：１０７９−
１８８，１９９４）；ジストロフィン（Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕ
ｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５：１３０−１３４，１９９３）、エリスロポイエチ
ン（Ｄｅｓｃａｍｐｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
５：９７９−９８５，１９９４）、オルニチントランスカルバミラーゼ（Ｓｔ
ｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ
ｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：２４１−２５６，１９９０；本発明者ら，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３６３９−３６４６，１９９６）；アデノシンデアミナ
ーゼ（Ｍｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：９４１−９４８，１９９４）、インターロイキン−２（Ｈａｄｄａｄａ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：７０３−７１１，１
９９３）；アル−アンチトリプシン（Ｊａｆｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １：３７２−３７８，１９９２）；トロンボポイエチン（
Ｏｈｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８８：７７８−７８４，１９９６）
；シトシンデアミナーゼ（Ｏｈｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１５６７−１５７６，１９９６）；ヒトα−ガラクトシ
ダーゼＡ（ＰＣＴＮｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９８／２２８８６）、ヒトβ−ガラクトシ
ダーゼ（Ａｒｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ４：１７−２５，１９９７）；インターロイキン−７（Ａｒｔｈｕｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１７−２５，１９９
７）；単純ヘルペスウイルス チミジンキナーゼ遺伝子（米国特許第５，７６３
，４１５号）および嚢胞性線維症経膜コンダクタンスレギュレータ（ＣＦＴＲ）
（米国特許第５，６７０，４８８号および５，８８２，８７７号；Ｚａｂｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１５０４−１５１１，１
９９６）が挙げられる。
【０００８】
アデノウイルスの気道細胞への指向性は、嚢胞性線維症（ＣＦ）の療法にアデ
ノウイルスベクターを使用することにおいて特に妥当性がある。前記ＣＰは白人
に最も普通にみられる常染色体劣性疾患である。ＣＦ患者は経膜コンダクタンス
レギュレータ（ＣＦＴＲ）遺伝子の変異に由来する肺機能障害がみられ、前記変
異は気道上皮のｃＡＭＰに制御されるＣｌ-チャネルの正常な機能を妨害する（
Ｚａｈｂｎｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７
５−８３，１９９４）。ＣＦＴＲ遺伝子を運ぶアデノウイルスベクターが開発さ
れ（Ｒｉｃｈ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４
：４６１−４７６，１９９３）、研究はこれらのベクターがＣＦＴＲを以下の部
位に送達することを示した。それらの部位には、ＣＦ患者の気道上皮（Ｚａｂｎ
ｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６，１９９３；Ｚａｂ
ｎｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１５０４−１
５１１，１９９６）、コトンラット及び霊長類の気道上皮（Ｚａｂｎｅｒ，Ｊ．
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７５−８３，１９９４）
およびＣＦ患者の気道上皮（Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕ
ｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：４２−５１，１９９４）が挙げられる。最近の研
究は、ＣＦＴＲをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスベクターをＣＦ患者の
気道に投与すると、処置した上皮細胞の塩素イオンチャネルの機能が復活するこ
とを示している（Ｚａｂｎｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．９７：１５０４−１５１１，１９９６）。
ノウイルスベクターを使用することにおいて特に妥当性がある。前記ＣＰは白人
に最も普通にみられる常染色体劣性疾患である。ＣＦ患者は経膜コンダクタンス
レギュレータ（ＣＦＴＲ）遺伝子の変異に由来する肺機能障害がみられ、前記変
異は気道上皮のｃＡＭＰに制御されるＣｌ-チャネルの正常な機能を妨害する（
Ｚａｈｂｎｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７
５−８３，１９９４）。ＣＦＴＲ遺伝子を運ぶアデノウイルスベクターが開発さ
れ（Ｒｉｃｈ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４
：４６１−４７６，１９９３）、研究はこれらのベクターがＣＦＴＲを以下の部
位に送達することを示した。それらの部位には、ＣＦ患者の気道上皮（Ｚａｂｎ
ｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６，１９９３；Ｚａｂ
ｎｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１５０４−１
５１１，１９９６）、コトンラット及び霊長類の気道上皮（Ｚａｂｎｅｒ，Ｊ．
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７５−８３，１９９４）
およびＣＦ患者の気道上皮（Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕ
ｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：４２−５１，１９９４）が挙げられる。最近の研
究は、ＣＦＴＲをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスベクターをＣＦ患者の
気道に投与すると、処置した上皮細胞の塩素イオンチャネルの機能が復活するこ
とを示している（Ｚａｂｎｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．９７：１５０４−１５１１，１９９６）。
【０００９】
遺伝子療法にアデノウイルスベクターを使用して行われたいままでの前臨床試
験および臨床試験は、しかし、これらのベクターの投与が陽性の結果を制限する
抗ウイルス宿主免疫反応を伴うことを示唆している。免疫系は異物である高分子
の存在を検出することにより、感染から身体を保護することにより機能している
。これらの異物分子はウイルスまたは他の寄生蛋白であってもよい；これらの蛋
白は体内循環系に存在してもよく、または体内のある細胞だけに存在していても
よい。免疫のこの形式は異物を認識し、いわゆる体液性免疫と呼ぶ抗体、または
いわゆる細胞性免疫と呼ぶ殺作用をもつリンパ球の産生により反応する身体の能
力に基づく。体液性および細胞性免疫のエフェクターは高度の特異性および免疫
的記憶を持つ。さらに、以前の異物の暴露に依存しない、より一般的な防御機構
も存在する；これは生得免疫と呼ばれる。粒子を包み込むマクロファージの能力
、炎症反応の一部としてのサイトカイン反応および細菌ＤＮＡのメチル化パター
ンの認識はすべて生得免疫の例として挙げられる。
験および臨床試験は、しかし、これらのベクターの投与が陽性の結果を制限する
抗ウイルス宿主免疫反応を伴うことを示唆している。免疫系は異物である高分子
の存在を検出することにより、感染から身体を保護することにより機能している
。これらの異物分子はウイルスまたは他の寄生蛋白であってもよい；これらの蛋
白は体内循環系に存在してもよく、または体内のある細胞だけに存在していても
よい。免疫のこの形式は異物を認識し、いわゆる体液性免疫と呼ぶ抗体、または
いわゆる細胞性免疫と呼ぶ殺作用をもつリンパ球の産生により反応する身体の能
力に基づく。体液性および細胞性免疫のエフェクターは高度の特異性および免疫
的記憶を持つ。さらに、以前の異物の暴露に依存しない、より一般的な防御機構
も存在する；これは生得免疫と呼ばれる。粒子を包み込むマクロファージの能力
、炎症反応の一部としてのサイトカイン反応および細菌ＤＮＡのメチル化パター
ンの認識はすべて生得免疫の例として挙げられる。
【００１０】
ウイルスは身体が生得および特異免疫により反応する感染因子の例として挙げ
られる。ウイルス構造蛋白はウイルス感染性を中和することができる抗体反応を
刺激することができ、細胞内で合成されたウイルス蛋白は、ウイルスに感染した
細胞を破壊のために標的とすることができる細胞性免疫反応を刺激することがで
きる。さらに、ウイルスは非特異的免疫反応も引き起こすことができる。ウイル
スに基づいたベクターは、理論的には、ウイルス遺伝子がベクター内に保持され
るか否か、およびウイルス遺伝子が免疫反応を引き起こすのに十分なレベルで発
現されるか否かに依存して、特異的および生得的免疫反応により影響を受けるで
あろう。ウイルス遺伝子が発現されるレベルは潜在的に非常に重要である。なぜ
なら、炎症および免疫反応は投与量に依存するからである。抗原が低用量の場合
、身体に認識されないが、大量の場合は認識されて反応を引き起こす可能性が高
い。いくつかのウイルス由来のベクターは免疫学的問題にならない程度に存在し
ていると信じられている。ＡＡＶおよびレトロウイルスベクターは、たとえば、
多くの場合、ウイルス遺伝子のすべてが欠失しているため、細胞免疫反応がウイ
ルス遺伝子生成物に対して発生する可能性がない。それにもかかわらず、もし十
分な量のベクターが体内に導入されれば、これらのベクターはビリオン被覆蛋白
に対する抗体反応を刺激することがありうる。
られる。ウイルス構造蛋白はウイルス感染性を中和することができる抗体反応を
刺激することができ、細胞内で合成されたウイルス蛋白は、ウイルスに感染した
細胞を破壊のために標的とすることができる細胞性免疫反応を刺激することがで
きる。さらに、ウイルスは非特異的免疫反応も引き起こすことができる。ウイル
スに基づいたベクターは、理論的には、ウイルス遺伝子がベクター内に保持され
るか否か、およびウイルス遺伝子が免疫反応を引き起こすのに十分なレベルで発
現されるか否かに依存して、特異的および生得的免疫反応により影響を受けるで
あろう。ウイルス遺伝子が発現されるレベルは潜在的に非常に重要である。なぜ
なら、炎症および免疫反応は投与量に依存するからである。抗原が低用量の場合
、身体に認識されないが、大量の場合は認識されて反応を引き起こす可能性が高
い。いくつかのウイルス由来のベクターは免疫学的問題にならない程度に存在し
ていると信じられている。ＡＡＶおよびレトロウイルスベクターは、たとえば、
多くの場合、ウイルス遺伝子のすべてが欠失しているため、細胞免疫反応がウイ
ルス遺伝子生成物に対して発生する可能性がない。それにもかかわらず、もし十
分な量のベクターが体内に導入されれば、これらのベクターはビリオン被覆蛋白
に対する抗体反応を刺激することがありうる。
【００１１】
先に説明したように、Ｅ１を欠失した複製欠損アデノウイルス（Ａｄ）ベクタ
ーは宿主細胞への遺伝子導入に魅力的なベヒクルである。なぜなら、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでそれらは広い範囲の分裂および非分裂細胞の形質導入ができるからであ
る（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇ ｅｎｅＴＨｅｒ ．１：２４１−２５６（１９９０）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ
ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６，（１９９３）；Ｃｒｙｓｔａｌ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８：４２−５１（１９９４）；Ｚａ
ｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７５−８３，１９９
４））。そのようなベクターは正常ヒト嚢胞性線維症経膜コンダクタンスレギュ
レータ（ＣＦＴＲ）をコードする遺伝子を実験動物（たとえば、マウス、コトン
ラット、サル）の気道上皮細胞および嚢胞性線維症（ＣＦ）患者の気道上皮に導
入するために使用されてきた（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ
６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ
７５：２０７−２１６，（１９９３）；Ｃｒｙｓｔａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ，８：４２−５１（１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ
．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７５−８３，１９９４）。そのようなベク
ターは一時的にＣＦ患者気道上皮細胞の正常塩素イオンチャネルを産生してきた
。
ーは宿主細胞への遺伝子導入に魅力的なベヒクルである。なぜなら、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでそれらは広い範囲の分裂および非分裂細胞の形質導入ができるからであ
る（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇ ｅｎｅＴＨｅｒ ．１：２４１−２５６（１９９０）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ
ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６，（１９９３）；Ｃｒｙｓｔａｌ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８：４２−５１（１９９４）；Ｚａ
ｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７５−８３，１９９
４））。そのようなベクターは正常ヒト嚢胞性線維症経膜コンダクタンスレギュ
レータ（ＣＦＴＲ）をコードする遺伝子を実験動物（たとえば、マウス、コトン
ラット、サル）の気道上皮細胞および嚢胞性線維症（ＣＦ）患者の気道上皮に導
入するために使用されてきた（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ
６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ
７５：２０７−２１６，（１９９３）；Ｃｒｙｓｔａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ，８：４２−５１（１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ
．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７５−８３，１９９４）。そのようなベク
ターは一時的にＣＦ患者気道上皮細胞の正常塩素イオンチャネルを産生してきた
。
【００１２】
しかし、多くの研究は、そのような第１世代（Ｅ１欠失）Ａｄベクターの高用
量投与は、少なくとも部分的に、Ａｄウイルス蛋白および／または免疫原性トラ
ンスジーン生成物に対する宿主細胞性免疫反応（おもにＣＤ８+細胞毒性Ｔ細胞
）によるベクター導入細胞の破壊による、肺での一時的なＣＦＴＲ遺伝子発現を
引き起こすだけであることを示唆している（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．６９．２００４−２０１５（１９９５）；Ｋａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．
，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１１７−１２７（１９９６）；Ｔｒｉｐａｔｈｙｅ
ｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：５４５−５５０（１９９６）；Ｙ
ａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１３７−１４４（１９９６）
）。ウイルス遺伝子発現が低下した第２世代ベクターの使用（Ｙａｎｇ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：３６２−３６９（１９９４）；Ｅｎｇ
ｅｌｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ ９１：６１９６−６２００（１９９４））、および異種蛋白よりもむしろ自
己をコードしたトランスジーン（Ｔｒｉｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍ ｅｄｉｃｉｎｅ ２：５４５−５５０（１９９６））による前記のような有害免
疫反応の軽減についての報告がある。
量投与は、少なくとも部分的に、Ａｄウイルス蛋白および／または免疫原性トラ
ンスジーン生成物に対する宿主細胞性免疫反応（おもにＣＤ８+細胞毒性Ｔ細胞
）によるベクター導入細胞の破壊による、肺での一時的なＣＦＴＲ遺伝子発現を
引き起こすだけであることを示唆している（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．６９．２００４−２０１５（１９９５）；Ｋａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．
，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１１７−１２７（１９９６）；Ｔｒｉｐａｔｈｙｅ
ｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：５４５−５５０（１９９６）；Ｙ
ａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１３７−１４４（１９９６）
）。ウイルス遺伝子発現が低下した第２世代ベクターの使用（Ｙａｎｇ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：３６２−３６９（１９９４）；Ｅｎｇ
ｅｌｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ ９１：６１９６−６２００（１９９４））、および異種蛋白よりもむしろ自
己をコードしたトランスジーン（Ｔｒｉｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍ ｅｄｉｃｉｎｅ ２：５４５−５５０（１９９６））による前記のような有害免
疫反応の軽減についての報告がある。
【００１３】
ＡｄベクターによるＣＦのような慢性疾患の治療には、おそらく患者の生涯に
わたるＣＦＴＲ遺伝子を含むＡｄベクターの反復投与が必要であろう。しかし、
説明したように、有害な免疫反応のために同じＡｄ血清型のベクターを使用して
患者に首尾よく再投与することができないことにより、現在のＡｄベクターの有
効性は限定される。強い用量依存的な体液性免疫反応がＡｄベクターにより誘導
され、Ａｄ−特異的中和抗体の発生を促し、そのことが再投与したベクターの宿
主による不活性化を導くということを各種のグループが示している（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９．２００４−２０１５（１９９５）；Ｋａ
ｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１１７−１２７（１９９６
）、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：３９７−４０２（１
９９３）、Ｙｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１９２−２００（
１９９４）、Ｖａｎ Ｇｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔ ｈｅｒ ．６：８９５−９０３（１９９５）；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：７９−８７（１９９６）。
わたるＣＦＴＲ遺伝子を含むＡｄベクターの反復投与が必要であろう。しかし、
説明したように、有害な免疫反応のために同じＡｄ血清型のベクターを使用して
患者に首尾よく再投与することができないことにより、現在のＡｄベクターの有
効性は限定される。強い用量依存的な体液性免疫反応がＡｄベクターにより誘導
され、Ａｄ−特異的中和抗体の発生を促し、そのことが再投与したベクターの宿
主による不活性化を導くということを各種のグループが示している（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９．２００４−２０１５（１９９５）；Ｋａ
ｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１１７−１２７（１９９６
）、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：３９７−４０２（１
９９３）、Ｙｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１９２−２００（
１９９４）、Ｖａｎ Ｇｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔ ｈｅｒ ．６：８９５−９０３（１９９５）；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：７９−８７（１９９６）。
【００１４】
免疫欠損マウスを使用した研究は、この過程が接種ウイルス蛋白のＭＨＣクラ
スＩＩ提示およびＣＤ４+Ｔ（ヘルパー）細胞の活性化に依存していること、お
よび活性なウイルス粒子だけでなく、不活性なものによっても誘導できることを
示している（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９．２００４−２０
１５（１９９５））。
スＩＩ提示およびＣＤ４+Ｔ（ヘルパー）細胞の活性化に依存していること、お
よび活性なウイルス粒子だけでなく、不活性なものによっても誘導できることを
示している（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９．２００４−２０
１５（１９９５））。
【００１５】
免疫反応問題の１解決法は、偽アデノウイルスベクターまたはＰＡＶと呼ばれ
るベクターであり、それらはベクターゲノムの複製およびパッケージングに必要
な最小シス作用ヌクレオチド配列を含むアデノウイルスのゲノムに由来するアデ
ノウイルスベクターであって、そして１以上のトランスジーンを含んでいてもよ
い（米国特許第５，８８２，８７７号を参照されたい。この特許はＰＡＶベクタ
ーとＰＡＶを産生する方法を包含し、参照として本明細書に援用する）。そのよ
うなＰＡＶベクターは、異種核酸の３６ｋｂにまで適応することができるもので
あり、ベクターの運搬能力が最適化されていて、ベクターに対する宿主免疫反応
の可能性、または複製−コンピテントウイルスの発生が軽減されているという利
点をもつ。ＰＡＶベクターは、複製の起源、およびＰＡＶゲノムのパッケージン
グに必要なシス作用ヌクレオチド配列を含む、５′−末端逆転反復配列（invert
ed termial repeats; ＩＴＲ）および３′ＩＴＲヌクレオチド配列を含み、適切
な制御エレメントを持つ１以上のトランスジーンに適応することができる。
るベクターであり、それらはベクターゲノムの複製およびパッケージングに必要
な最小シス作用ヌクレオチド配列を含むアデノウイルスのゲノムに由来するアデ
ノウイルスベクターであって、そして１以上のトランスジーンを含んでいてもよ
い（米国特許第５，８８２，８７７号を参照されたい。この特許はＰＡＶベクタ
ーとＰＡＶを産生する方法を包含し、参照として本明細書に援用する）。そのよ
うなＰＡＶベクターは、異種核酸の３６ｋｂにまで適応することができるもので
あり、ベクターの運搬能力が最適化されていて、ベクターに対する宿主免疫反応
の可能性、または複製−コンピテントウイルスの発生が軽減されているという利
点をもつ。ＰＡＶベクターは、複製の起源、およびＰＡＶゲノムのパッケージン
グに必要なシス作用ヌクレオチド配列を含む、５′−末端逆転反復配列（invert
ed termial repeats; ＩＴＲ）および３′ＩＴＲヌクレオチド配列を含み、適切
な制御エレメントを持つ１以上のトランスジーンに適応することができる。
【００１６】
Ａｄベクターの反復投与に関連した免疫学的問題に打ち勝つための他の解決法
は、広域免疫抑制剤（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：６１９６−６２００（１９９４））、およ
び細胞融除剤（Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ ９２：１４０１−１４０５（１９９５））の使用である。非免疫原性ト
ランスジーン生成物（ヒトα−アンチ−トリプシン）を発現するＡｄベクターの
静脈内注射とイムノグロブリンＣＴＬＡ４−Ｉｇの一時的な共投与により、マウ
ス肝で持続的にトランスジーンを発現することが示された（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ
．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１：１９１−１９７（１９９５））。ＣＴＬ
Ａ４−ＩｇはＴ細胞の最適な活性化にとって必要なＴ細胞共刺激のＢ７−ＣＤ２
８経路を阻害する（Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：４
４３−４４６（１９９４）；Ｌｅｎｓｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ ．Ｉｍｍｕｎ ．１４：２３３−２５８（１９９６））。Ａｄ−特異的抗体レベル
はＣＴＬＡ４−Ｉｇ処理マウスでは低下したけれど、その阻害は試験した条件下
でベクターの反復投与を介した二度目の遺伝子導入をするには十分ではなかった
（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１：１９１−１９７（
１９９５））。
は、広域免疫抑制剤（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：６１９６−６２００（１９９４））、およ
び細胞融除剤（Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ ９２：１４０１−１４０５（１９９５））の使用である。非免疫原性ト
ランスジーン生成物（ヒトα−アンチ−トリプシン）を発現するＡｄベクターの
静脈内注射とイムノグロブリンＣＴＬＡ４−Ｉｇの一時的な共投与により、マウ
ス肝で持続的にトランスジーンを発現することが示された（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ
．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１：１９１−１９７（１９９５））。ＣＴＬ
Ａ４−ＩｇはＴ細胞の最適な活性化にとって必要なＴ細胞共刺激のＢ７−ＣＤ２
８経路を阻害する（Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：４
４３−４４６（１９９４）；Ｌｅｎｓｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ ．Ｉｍｍｕｎ ．１４：２３３−２５８（１９９６））。Ａｄ−特異的抗体レベル
はＣＴＬＡ４−Ｉｇ処理マウスでは低下したけれど、その阻害は試験した条件下
でベクターの反復投与を介した二度目の遺伝子導入をするには十分ではなかった
（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１：１９１−１９７（
１９９５））。
【００１７】
インターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）またはインターロイキン−１２（ＩＬ−
１２）と組み換えＡｄベクターとの共投与により、Ａｄ−特異的中和抗体の形成
が軽減することが示され、マウス気道にベクターが再投与できるようになった（
Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １：８９０−８９３（１
９９５））。しかし、ＩＬ−１２はＴh1−型ＣＤ４+Ｔ細胞反応に影響を与える
強力なメディエーターであり、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞刺激および細胞毒
性Ｔ細胞（ＣＴＬｓ）の分化促進に関与する（Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌ ｌ ７６：２４１−２５１（１９９４）；Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，Ｇ．，Ｂｌｏ ｏｄ ８４：４００８−４０２７（１９９４）；Ｂｌｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．１５６：８８７−８９４（１９９６））。ＩＮＦ−γは抗原
提示細胞のＭＨＣクラスＩをアップレギュレートすることが知られている（Ｙａ
ｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：７
２５７−７２６１（１９９５））。したがって、ＩＮＦ−γおよびＩＬ−１２は
共に体液性免疫を阻害できるものの、ＣＴＬＳによるＡｄベクター導入細胞の除
去も促進するであろう（促進されたＴh1反応）。
１２）と組み換えＡｄベクターとの共投与により、Ａｄ−特異的中和抗体の形成
が軽減することが示され、マウス気道にベクターが再投与できるようになった（
Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １：８９０−８９３（１
９９５））。しかし、ＩＬ−１２はＴh1−型ＣＤ４+Ｔ細胞反応に影響を与える
強力なメディエーターであり、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞刺激および細胞毒
性Ｔ細胞（ＣＴＬｓ）の分化促進に関与する（Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌ ｌ ７６：２４１−２５１（１９９４）；Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，Ｇ．，Ｂｌｏ ｏｄ ８４：４００８−４０２７（１９９４）；Ｂｌｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．１５６：８８７−８９４（１９９６））。ＩＮＦ−γは抗原
提示細胞のＭＨＣクラスＩをアップレギュレートすることが知られている（Ｙａ
ｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：７
２５７−７２６１（１９９５））。したがって、ＩＮＦ−γおよびＩＬ−１２は
共に体液性免疫を阻害できるものの、ＣＴＬＳによるＡｄベクター導入細胞の除
去も促進するであろう（促進されたＴh1反応）。
【００１８】
インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の免疫抑制作用についてもよく研究さ
れてきた。いくつかの研究は、ＩＬ−１０が抗原提示細胞およびＴ細胞の機能を
共に阻害することができることを示している（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１６５−１９０，１９９３；ｄｅ Ｗａａ
ｌ Ｍａｌｅｆｙｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ１７４：９１５，１９
９１；Ｅｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２３９０，１９９
３）。腫瘍細胞によるＩＬ−１０の産生は、それにより腫瘍が保護的免疫反応を
免れる機序であろう。エブスタイン−バーウイルスの生成物であるウイルスＩＬ
−１０（ｖＩＬ−１０）はマウスおよびヒトＩＬ−１０に相同性であり、そして
ｖＩＬ−１０は多くの生物学的性質をマウスおよびヒトＩＬ−１０と共有するが
、細胞ＩＬ−１０の免疫刺激活性の一部を所有しない（ｄｅ Ｗａａｌ Ｍａｌ
ｅｆｙｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ１７４：９１５）。
れてきた。いくつかの研究は、ＩＬ−１０が抗原提示細胞およびＴ細胞の機能を
共に阻害することができることを示している（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１６５−１９０，１９９３；ｄｅ Ｗａａ
ｌ Ｍａｌｅｆｙｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ１７４：９１５，１９
９１；Ｅｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２３９０，１９９
３）。腫瘍細胞によるＩＬ−１０の産生は、それにより腫瘍が保護的免疫反応を
免れる機序であろう。エブスタイン−バーウイルスの生成物であるウイルスＩＬ
−１０（ｖＩＬ−１０）はマウスおよびヒトＩＬ−１０に相同性であり、そして
ｖＩＬ−１０は多くの生物学的性質をマウスおよびヒトＩＬ−１０と共有するが
、細胞ＩＬ−１０の免疫刺激活性の一部を所有しない（ｄｅ Ｗａａｌ Ｍａｌ
ｅｆｙｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ１７４：９１５）。
【００１９】
さらに、形質転換成長因子−β（ＴＧＦβ）もＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞およ
びマクロファージに作用する非常に強力な免疫抑制剤であることが知られている
（Ｆｏｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３２３０，１
９９５；Ｂｅｌｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１３６
，１９９７；Ｂｒｉｇｈｔ ａｎｄ Ｓｒｉｒａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６ １ ：１７７２−１７７７，１９９８；Ｐａｒｄｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，９３：１
４４８−１４４５）。ＴＧＦβは非腫瘍性線維芽細胞の可逆的表現型形質転換を
促進し、最初はインターロイキン２（ＩＬ２）に誘導された同種ＣＴＬの発生お
よびＴ細胞増殖を阻害することが報告された（Ｆｏｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：１８３７，１９８４）。さらに最近では、ＴＧＦ
βはウイルス感染マウスの細胞毒性Ｔ細胞の発生を阻害することが示されている
（Ｆｏｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３２３０，１
９９５）。
びマクロファージに作用する非常に強力な免疫抑制剤であることが知られている
（Ｆｏｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３２３０，１
９９５；Ｂｅｌｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１３６
，１９９７；Ｂｒｉｇｈｔ ａｎｄ Ｓｒｉｒａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６ １ ：１７７２−１７７７，１９９８；Ｐａｒｄｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，９３：１
４４８−１４４５）。ＴＧＦβは非腫瘍性線維芽細胞の可逆的表現型形質転換を
促進し、最初はインターロイキン２（ＩＬ２）に誘導された同種ＣＴＬの発生お
よびＴ細胞増殖を阻害することが報告された（Ｆｏｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：１８３７，１９８４）。さらに最近では、ＴＧＦ
βはウイルス感染マウスの細胞毒性Ｔ細胞の発生を阻害することが示されている
（Ｆｏｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３２３０，１
９９５）。
【００２０】
アデノウイルスベクター蛋白およびトランスジーン生成物に対する免疫反応に
打ち勝つために使用するさらに別の研究法は、アデノウイルスベクターおよびト
ランスジーン生成物の両方に末梢Ｔ−細胞耐性を誘導することであり、前記方法
は多くの場合、患者の新生抗原であってもよい。Ｔ細胞のアポトーシスがｆａｓ
およびｆａｓリガンド（ｆａｓＬ）のアップレギュレーションにより媒介される
、Ｔ細胞の活性化誘発細胞死は、Ｔ−細胞反応およびＴ細胞ホメオスタシスのダ
ウンレギュレーションの原因であることが知られている（Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆ
ｕｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４−３１７，１９９２；Ｚ
ｈｏｕ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１０６３−１０７２，１９
９２；Ｎａｇａｔａ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１２９−１４４，１９９
４およびＤｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７３：４３８−４４１，
１９９５）。最近、アデノウイルスベクターを予め接種したラットでさえ、バル
ーン−損傷ラット頸動脈におけるアデノウイル媒介ｆａｓＬ発現は、Ａｄ／ｆａ
ｓＬ感染細胞の免疫破壊からの保護だけでなく、新動脈内膜形成を効果的に阻害
することが示された（Ｓａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１２１３−１２１７，１９９８）。
打ち勝つために使用するさらに別の研究法は、アデノウイルスベクターおよびト
ランスジーン生成物の両方に末梢Ｔ−細胞耐性を誘導することであり、前記方法
は多くの場合、患者の新生抗原であってもよい。Ｔ細胞のアポトーシスがｆａｓ
およびｆａｓリガンド（ｆａｓＬ）のアップレギュレーションにより媒介される
、Ｔ細胞の活性化誘発細胞死は、Ｔ−細胞反応およびＴ細胞ホメオスタシスのダ
ウンレギュレーションの原因であることが知られている（Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆ
ｕｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４−３１７，１９９２；Ｚ
ｈｏｕ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１０６３−１０７２，１９
９２；Ｎａｇａｔａ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１２９−１４４，１９９
４およびＤｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７３：４３８−４４１，
１９９５）。最近、アデノウイルスベクターを予め接種したラットでさえ、バル
ーン−損傷ラット頸動脈におけるアデノウイル媒介ｆａｓＬ発現は、Ａｄ／ｆａ
ｓＬ感染細胞の免疫破壊からの保護だけでなく、新動脈内膜形成を効果的に阻害
することが示された（Ｓａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１２１３−１２１７，１９９８）。
【００２１】
哺乳動物ｆａｓ／ＣＤ９５リガンド（ｆａｓＬ）細胞表面蛋白は、移植におけ
る異種抗原に反応するＴ細胞のアポトーシスを誘導する（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１１８９−１１９２，１９９５）。
る異種抗原に反応するＴ細胞のアポトーシスを誘導する（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１１８９−１１９２，１９９５）。
【００２２】
バキュロウイルスのｐ３５はバキュロウイルス感染細胞のアポトーシスを阻害
する蛋白をコードする（Ｃｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１
３８８−１３８９，１９９１；Ｈｅｒｓｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．６８：３４６７−３４７７，１９９４；Ｂｕｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２６９：１８８５−１８８８，１９９５；Ｘｕｅ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ ３７７：２４８−２５１，１９９５）。耐性の一機序は免疫特権
部位の自然な発生によるものである。ｆａｓ−ｆａｓＬ経路を介したＴ細胞のア
ポトーシスにより媒介される、抗原−特異的Ｔ細胞の特定クローン欠失は、末梢
耐性の維持、および拒絶反応の予防だけでなく免疫特権部位の創設においても重
要な機序であることが示されている（Ｎａｇａｔａ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
５７：１２９−１４４，１９９４；Ｄｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７３：４３８−４４１，１９９５；Ｂｅｌｌｇｒａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３７７：６３０−６３２，１９９５；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１１８９−１１９２，１９９５およびＬａｕ ｅｔ
ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１０９−１１２，１９９６）。これらの部
位にアデノウイルスを挿入すると、アデノウイルスおよびそのトランスジーン生
成物に対して耐性となる。Ｅ１欠失アデノウイルスを網膜下空間に注射すると細
胞性および体液性免疫反応が最小になる（Ｂｅｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ
．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．８：１６２５−１６３４，１９９６）。
する蛋白をコードする（Ｃｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１
３８８−１３８９，１９９１；Ｈｅｒｓｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．６８：３４６７−３４７７，１９９４；Ｂｕｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２６９：１８８５−１８８８，１９９５；Ｘｕｅ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ ３７７：２４８−２５１，１９９５）。耐性の一機序は免疫特権
部位の自然な発生によるものである。ｆａｓ−ｆａｓＬ経路を介したＴ細胞のア
ポトーシスにより媒介される、抗原−特異的Ｔ細胞の特定クローン欠失は、末梢
耐性の維持、および拒絶反応の予防だけでなく免疫特権部位の創設においても重
要な機序であることが示されている（Ｎａｇａｔａ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
５７：１２９−１４４，１９９４；Ｄｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７３：４３８−４４１，１９９５；Ｂｅｌｌｇｒａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３７７：６３０−６３２，１９９５；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１１８９−１１９２，１９９５およびＬａｕ ｅｔ
ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１０９−１１２，１９９６）。これらの部
位にアデノウイルスを挿入すると、アデノウイルスおよびそのトランスジーン生
成物に対して耐性となる。Ｅ１欠失アデノウイルスを網膜下空間に注射すると細
胞性および体液性免疫反応が最小になる（Ｂｅｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ
．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．８：１６２５−１６３４，１９９６）。
【００２３】
最近、Ａｄ／ｆａｓＬを発現する抗原提示細胞株によるマウスの前処理がＡｄ
−特異的Ｔ細胞耐性を誘導することができるという発明が開示されている（ＷＯ
９８／５２６１５，ＷＯ９８／５１３４０およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：１０４５−１０４９）。その
後にＡｄ／ｌａｃＺベクターを静脈内投与すると、肝においてｌａｃＺ遺伝子が
５０日間持続的に発現した。しかし、前記方法には２つの大きな欠点がある。第
１に、抗原提示細胞でのｆａｓＬ遺伝子の発現に使用する方法には２種の異なる
アデノウイルスベクター、ＡｄＬｏｘｐｆａｓＬ（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｖｉｏｌ．７２：２４８３−２４９０，１９９８）およびＡｘＣＡＮＣｒｅ
（Ｋａｎｅｇａｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３８
１６−３８２１，１９９５）が含まれることである。前記方法において、ＡｘＣ
ＡＮＣｒｅはＣｒｅレコンビナーゼを発現し、ＡｄＬｏｘｐｆａｓＬベクターか
らｆａｓＬ遺伝子を発現させることを要求する。したがって、効果的な送達のた
めにはｆａｓ遺伝子を含むベクター以外の特別な要素が必要である。構成的にｆ
ａｓＬを発現するＡｄベクターは高力価で増殖することはできない。なぜならｆ
ａｓＬはＡｄベクターを増殖させるために使用する２９３細胞のアポトーシスを
誘導するからである（Ｌａｒｒｅｇｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ
．５：５６３−５６８，１９９８）。第２に、使用する抗原提示細胞株はｆａｓ
−変異体Ｂ６−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスに由来することである。なぜならｆａｓＬ
発現はｆａｓ受容体を発現している正常細胞を殺す可能性があるからである（Ｍ
ｕｒｕｖｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：９５５−９６２
，１９９７；Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．Ｍｅｄ．３：７３８−７
４３，１９９７およびＬａｒｒｅｇｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ
．５：５６３−５６８，１９９８）したがって、正常な個体に由来する細胞でｆ
ａｓＬを発現させることは非常に困難であろう。
−特異的Ｔ細胞耐性を誘導することができるという発明が開示されている（ＷＯ
９８／５２６１５，ＷＯ９８／５１３４０およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：１０４５−１０４９）。その
後にＡｄ／ｌａｃＺベクターを静脈内投与すると、肝においてｌａｃＺ遺伝子が
５０日間持続的に発現した。しかし、前記方法には２つの大きな欠点がある。第
１に、抗原提示細胞でのｆａｓＬ遺伝子の発現に使用する方法には２種の異なる
アデノウイルスベクター、ＡｄＬｏｘｐｆａｓＬ（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｖｉｏｌ．７２：２４８３−２４９０，１９９８）およびＡｘＣＡＮＣｒｅ
（Ｋａｎｅｇａｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３８
１６−３８２１，１９９５）が含まれることである。前記方法において、ＡｘＣ
ＡＮＣｒｅはＣｒｅレコンビナーゼを発現し、ＡｄＬｏｘｐｆａｓＬベクターか
らｆａｓＬ遺伝子を発現させることを要求する。したがって、効果的な送達のた
めにはｆａｓ遺伝子を含むベクター以外の特別な要素が必要である。構成的にｆ
ａｓＬを発現するＡｄベクターは高力価で増殖することはできない。なぜならｆ
ａｓＬはＡｄベクターを増殖させるために使用する２９３細胞のアポトーシスを
誘導するからである（Ｌａｒｒｅｇｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ
．５：５６３−５６８，１９９８）。第２に、使用する抗原提示細胞株はｆａｓ
−変異体Ｂ６−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスに由来することである。なぜならｆａｓＬ
発現はｆａｓ受容体を発現している正常細胞を殺す可能性があるからである（Ｍ
ｕｒｕｖｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：９５５−９６２
，１９９７；Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．Ｍｅｄ．３：７３８−７
４３，１９９７およびＬａｒｒｅｇｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ
．５：５６３−５６８，１９９８）したがって、正常な個体に由来する細胞でｆ
ａｓＬを発現させることは非常に困難であろう。
【００２４】
樹状細胞（ＤＣｓ）のような抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）、マクロファージおよ
びＢ細胞は病原体、同種抗原および腫瘍に対する最適な免疫反応の発生に関与す
る。樹状細胞は免疫系の高度に特殊化されたＡＰＣｓである（Ｓｔｅｉｎｍａｎ
，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１，１９９１）。ＤＣｓが非リ
ンパ組織に計画的に配置されており、そして抗原刺激後にリンパ器官に血液およ
びリンパを介して循環する能力は、侵入する病原体に対する免疫反応誘導におけ
るそれらの重要な役割を示している（Ｈｏｅｆｓｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍ
ｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １６１：２５５，１９８２；Ａｕｓｔｙｎ ｅｔ ａｌ
．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：６４６，１９９８）。そのような遊走中に、
ランゲルハンス細胞（ＬＣｓ）のようなＤＣｓは機能と表現型の特徴的な修飾を
受けると考えられる（Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７ ２ ：１４８３，１９９０；Ｓｃｈｕｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１ ６１ ：５２６，１９８５）。局所的に産生される炎症性サイトカインおよび抗原
との遭遇は、ＤＣｓの成熟とリンパ節への遊走を促進する。この過程の間に、共
促進分子の発現、サイトカイン産生および典型的な形態学により特徴づけられる
ように、ＤＣｓはプロセシングから提示機能細胞型に分化をする（Ｓｃｈｕｌｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６１：５２６，１９８５；Ｓｔｅｉｎｍ
ａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：３６１，１９
９１；Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：２２９
，１９９２）。ＡＰＣｓの他の型とは対照的に、完全に成熟したＤＣｓはナイー
ブＴ細胞の強力な活性化剤であり、一次特異的免疫反応の重要なイニシエーター
であると見なされている（Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．９：２７１，１９９１）。
びＢ細胞は病原体、同種抗原および腫瘍に対する最適な免疫反応の発生に関与す
る。樹状細胞は免疫系の高度に特殊化されたＡＰＣｓである（Ｓｔｅｉｎｍａｎ
，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１，１９９１）。ＤＣｓが非リ
ンパ組織に計画的に配置されており、そして抗原刺激後にリンパ器官に血液およ
びリンパを介して循環する能力は、侵入する病原体に対する免疫反応誘導におけ
るそれらの重要な役割を示している（Ｈｏｅｆｓｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍ
ｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １６１：２５５，１９８２；Ａｕｓｔｙｎ ｅｔ ａｌ
．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：６４６，１９９８）。そのような遊走中に、
ランゲルハンス細胞（ＬＣｓ）のようなＤＣｓは機能と表現型の特徴的な修飾を
受けると考えられる（Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７ ２ ：１４８３，１９９０；Ｓｃｈｕｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１ ６１ ：５２６，１９８５）。局所的に産生される炎症性サイトカインおよび抗原
との遭遇は、ＤＣｓの成熟とリンパ節への遊走を促進する。この過程の間に、共
促進分子の発現、サイトカイン産生および典型的な形態学により特徴づけられる
ように、ＤＣｓはプロセシングから提示機能細胞型に分化をする（Ｓｃｈｕｌｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６１：５２６，１９８５；Ｓｔｅｉｎｍ
ａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：３６１，１９
９１；Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：２２９
，１９９２）。ＡＰＣｓの他の型とは対照的に、完全に成熟したＤＣｓはナイー
ブＴ細胞の強力な活性化剤であり、一次特異的免疫反応の重要なイニシエーター
であると見なされている（Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．９：２７１，１９９１）。
【００２５】
最近、ヒト樹状細胞で処理したＩＬ−１０はＣＤ８＋細胞に腫瘍抗原特異的ア
ネルギーを誘導できることが示されている（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：４７７−４８６，１９９５；Ｓｔｅｉｎｂｒｉｎｇｋ
ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９３：１６３４−１６４２）。最近また、末梢血
から発生した、ＩＬ−１０処理ヒトＤＣｓがＣＤ４＋細胞の各種集団に抗原特異
的アネルギー状態を誘導することが示されている（Ｓｔｅｉｎｂｒｉｎｋ ｅｔ
ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７７２，１９９７）。
ネルギーを誘導できることが示されている（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：４７７−４８６，１９９５；Ｓｔｅｉｎｂｒｉｎｇｋ
ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９３：１６３４−１６４２）。最近また、末梢血
から発生した、ＩＬ−１０処理ヒトＤＣｓがＣＤ４＋細胞の各種集団に抗原特異
的アネルギー状態を誘導することが示されている（Ｓｔｅｉｎｂｒｉｎｋ ｅｔ
ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７７２，１９９７）。
【００２６】
本発明は、投与したアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、前記ベクターは生物学
的に活性な分子をコードするトランスジーンを運ぶものであるが、そのベクター
に対する宿主の免疫反応を軽減することに関する。それにより、宿主に有害な免
疫反応を起こさないで（または最小にして、）前記ベクターを反復投与すること
が可能になる。
的に活性な分子をコードするトランスジーンを運ぶものであるが、そのベクター
に対する宿主の免疫反応を軽減することに関する。それにより、宿主に有害な免
疫反応を起こさないで（または最小にして、）前記ベクターを反復投与すること
が可能になる。
【００２７】
本発明はまた、宿主中でのトランスジーンの治療効果の効力を高めるために、
有害な免疫反応を起こさない（または最小にした）トランスジーンによりコード
された免疫原性ポリペプチドに対する宿主の免疫反応を軽減することに関する。 Ａｄベクターに対する免疫反応は、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を
誘導するウイルス抗原によるＣＤ４＋細胞の活性化、およびＡｄベクターに対す
る体液性免疫反応により媒介されると思われる。ＩＬ−１０処理ヒト樹状細胞は
ＣＤ８＋細胞およびＣＤ４＋細胞に腫瘍−抗原特異的アネルギーを誘導すること
ができる。さらに、ＴＧＦβも強力な免疫抑制剤である。
有害な免疫反応を起こさない（または最小にした）トランスジーンによりコード
された免疫原性ポリペプチドに対する宿主の免疫反応を軽減することに関する。 Ａｄベクターに対する免疫反応は、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を
誘導するウイルス抗原によるＣＤ４＋細胞の活性化、およびＡｄベクターに対す
る体液性免疫反応により媒介されると思われる。ＩＬ−１０処理ヒト樹状細胞は
ＣＤ８＋細胞およびＣＤ４＋細胞に腫瘍−抗原特異的アネルギーを誘導すること
ができる。さらに、ＴＧＦβも強力な免疫抑制剤である。
【００２８】
本発明は、Ａｄベクターを感染させたＤＣｓまたは他の抗原提示細胞の静脈内
投与による宿主への前処理を提供するものであって、前記Ａｄベクターは生物学
的に活性な分子をコードするトランスジーンおよびＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０お
よび／またはＴＧＦβのような免疫抑制分子をコードする異種核酸を含む。樹状
細胞は脾臓などのリンパ器官におもに遊走し、そこでＴ細胞と相互作用し、ＩＬ
−１０、ｖＩＬ−１０および／またはＴＧＦβを発現する。ＩＬ−１０はＤＣｓ
に作用してそれらを免疫寛容原性にし、ＴＧＦβは脾臓Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマ
クロファージに作用する。
投与による宿主への前処理を提供するものであって、前記Ａｄベクターは生物学
的に活性な分子をコードするトランスジーンおよびＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０お
よび／またはＴＧＦβのような免疫抑制分子をコードする異種核酸を含む。樹状
細胞は脾臓などのリンパ器官におもに遊走し、そこでＴ細胞と相互作用し、ＩＬ
−１０、ｖＩＬ−１０および／またはＴＧＦβを発現する。ＩＬ−１０はＤＣｓ
に作用してそれらを免疫寛容原性にし、ＴＧＦβは脾臓Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマ
クロファージに作用する。
【００２９】
宿主にアデノウイルスベクターおよび／またはトランスジーン生成物に対する
耐性を誘導する別の方法は、ｆａｓ−ｆａｓＬ経路を介してＴ細胞のアポトーシ
スにより媒介される抗原特異的Ｔ細胞の特定クローン欠失を伴う。
耐性を誘導する別の方法は、ｆａｓ−ｆａｓＬ経路を介してＴ細胞のアポトーシ
スにより媒介される抗原特異的Ｔ細胞の特定クローン欠失を伴う。
【００３０】
したがって、本発明はまたＡｄベクターを感染させたＤＣｓまたは他の抗原提
示細胞の静脈内投与による宿主の前処理を提供するものであって、前記Ａｄベク
ターはｐ３５のような、アポトーシスの阻害剤だけでなく、ｆａｓＬをコードす
る核酸を含む。樹状細胞が脾臓などのリンパ器官に遊走してＴ細胞と相互作用す
るとき、樹状細胞表面のｆａｓＬの発現がｆａｓ／ｆａｓＬ経路を介したＴ細胞
のアポトーシスを誘発するが、一方樹状細胞内のアポトーシス阻害剤の発現が樹
状細胞をアポトーシスから保護する。
示細胞の静脈内投与による宿主の前処理を提供するものであって、前記Ａｄベク
ターはｐ３５のような、アポトーシスの阻害剤だけでなく、ｆａｓＬをコードす
る核酸を含む。樹状細胞が脾臓などのリンパ器官に遊走してＴ細胞と相互作用す
るとき、樹状細胞表面のｆａｓＬの発現がｆａｓ／ｆａｓＬ経路を介したＴ細胞
のアポトーシスを誘発するが、一方樹状細胞内のアポトーシス阻害剤の発現が樹
状細胞をアポトーシスから保護する。
【００３１】
本発明はさらにＡｄベクターの皮内注射によるｉｎ ｖｉｖｏでのＤＣｓの感
染を提供するものであって、前記Ａｄベクターは生物学的に活性な分子をコード
するトランスジーンおよびＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０および／またはＴＧＦβの
ような免疫抑制分子をコードする、またはｐ３５のようなアポトーシス阻害剤だ
けでなく、ｆａｓＬをコードする異種核酸を含む。感染したＤＣｓはこのように
局所リンパ節を遊走し、Ｔ細胞と相互作用するであろう。
染を提供するものであって、前記Ａｄベクターは生物学的に活性な分子をコード
するトランスジーンおよびＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０および／またはＴＧＦβの
ような免疫抑制分子をコードする、またはｐ３５のようなアポトーシス阻害剤だ
けでなく、ｆａｓＬをコードする異種核酸を含む。感染したＤＣｓはこのように
局所リンパ節を遊走し、Ｔ細胞と相互作用するであろう。
【００３２】
本発明は、生物学的に活性な分子をコードするトランスジーンを含む投与され
たＡｄベクターに対する宿主患者の有害な免疫反応を軽減または阻害することに
関する。本発明はＡｄベクターを感染させた樹状細胞または抗原提示細胞の静脈
内注射による宿主の前処理に関連するものであって、前記Ａｄベクターは免疫抑
制分子またはＴ細胞のアポトーシスを媒介することができる分子をコードする異
種核酸、および生物学的に活性な分子をコードするトランスジーンを含む。その
ようなＡｄベクターに感染した樹状細胞の投与により、同じトランスジーンを含
むＡｄベクターを宿主に反復投与することが可能になり、処理した宿主細胞にお
ける有害な免疫反応は最小化され、持続的にトランスジーンが発現される。
たＡｄベクターに対する宿主患者の有害な免疫反応を軽減または阻害することに
関する。本発明はＡｄベクターを感染させた樹状細胞または抗原提示細胞の静脈
内注射による宿主の前処理に関連するものであって、前記Ａｄベクターは免疫抑
制分子またはＴ細胞のアポトーシスを媒介することができる分子をコードする異
種核酸、および生物学的に活性な分子をコードするトランスジーンを含む。その
ようなＡｄベクターに感染した樹状細胞の投与により、同じトランスジーンを含
むＡｄベクターを宿主に反復投与することが可能になり、処理した宿主細胞にお
ける有害な免疫反応は最小化され、持続的にトランスジーンが発現される。
【００３３】
免疫抑制分子またはＴ細胞のアポトーシスを媒介できる分子をコードする異種
核酸およびトランスジーンは、受容細胞への所望する核酸の送達に適した任意の
組み換えアデノウイルスベクターにクローニングしてよい。
核酸およびトランスジーンは、受容細胞への所望する核酸の送達に適した任意の
組み換えアデノウイルスベクターにクローニングしてよい。
【００３４】
本発明の好ましい態様において、アデノウイルス（Ａｄ）ベクターはアデノウ
イルス血清型２（Ａｄ２）に由来し、実質上欠失したＥ１およびＥ３領域を持つ
。他のアデノウイルス血清型、とりわけ、Ａｄ５、Ａｄ６、Ａｄ９、Ａｄ１２、
Ａｄ１５、Ａｄ１７、Ａｄ１９、Ａｄ２０、Ａｄ２２、Ａｄ２６、Ａｄ２７、Ａ
ｄ２８、Ａｄ３０およびＡｄ３９もアデノウイルスベクターのバックボーンとし
て使用することができる。先に列挙したアデノウイルス血清型のうち、Ａｄ２、
Ａｄ５、Ａｄ６およびＡｄ１７が好ましい。
イルス血清型２（Ａｄ２）に由来し、実質上欠失したＥ１およびＥ３領域を持つ
。他のアデノウイルス血清型、とりわけ、Ａｄ５、Ａｄ６、Ａｄ９、Ａｄ１２、
Ａｄ１５、Ａｄ１７、Ａｄ１９、Ａｄ２０、Ａｄ２２、Ａｄ２６、Ａｄ２７、Ａ
ｄ２８、Ａｄ３０およびＡｄ３９もアデノウイルスベクターのバックボーンとし
て使用することができる。先に列挙したアデノウイルス血清型のうち、Ａｄ２、
Ａｄ５、Ａｄ６およびＡｄ１７が好ましい。
【００３５】
本発明の一態様において、アデノウイルスベクターはアデノウイルスゲノムを
含み、本発明に参照として援用した米国特許出願第０８／８３９，５５３号に開
示されているように、アデノウイルスゲノムのＥ１領域およびヌクレオチド２９
２９２−３０８４０までのＥ３領域の１．６ｋｂ部分は欠失している。本発明の
具体的な態様において、アデノウイルスベクターはＡｄ２／ＣＭＶ／Ｅ３Δ１．
６である。
含み、本発明に参照として援用した米国特許出願第０８／８３９，５５３号に開
示されているように、アデノウイルスゲノムのＥ１領域およびヌクレオチド２９
２９２−３０８４０までのＥ３領域の１．６ｋｂ部分は欠失している。本発明の
具体的な態様において、アデノウイルスベクターはＡｄ２／ＣＭＶ／Ｅ３Δ１．
６である。
【００３６】
本発明の他の態様において、ベクターは部分的に欠失したアデノウイルス（Ｄ
ｅＡｄ）であり、ウイルス複製に必要なアデノウイルス初期遺伝子（Ｅ１−Ｅ４
）の大部分は前記ベクターから欠失している。ＤｅＡｄベクターは同時係属中の
仮出願６０／０８３，８４１（１９９８年５月１日に出願）および６０／１１８
，１１８（１９９９年２月１日に出願）およびそれらに対応する１９９９年４月
３０日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９５９０（これらは本発
明に参照として援用した）に記載されている。複製に必要でないＥ３の可能な例
外をもつ欠失したアデノウイルス遺伝子は、ベクター産生を促進するために、条
件プロモーターの制御下で、プロデューサー細胞クロモソームに挿入される。好
ましいプロデューサー細胞はヒト２９３細胞株であり、かかる細胞株はＡｄ５ゲ
ノムフラグメントをヒト胚腎細胞にトランスフェクトし、形質転換表現型のため
に選択することにより確立した（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇ
ｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２，１９９７）。さらに、Ａ５４９細胞株お
よびＫＢ細胞株も使用してもよい（それらのすべてはＡＴＣＣから入手できる）
。
ｅＡｄ）であり、ウイルス複製に必要なアデノウイルス初期遺伝子（Ｅ１−Ｅ４
）の大部分は前記ベクターから欠失している。ＤｅＡｄベクターは同時係属中の
仮出願６０／０８３，８４１（１９９８年５月１日に出願）および６０／１１８
，１１８（１９９９年２月１日に出願）およびそれらに対応する１９９９年４月
３０日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９５９０（これらは本発
明に参照として援用した）に記載されている。複製に必要でないＥ３の可能な例
外をもつ欠失したアデノウイルス遺伝子は、ベクター産生を促進するために、条
件プロモーターの制御下で、プロデューサー細胞クロモソームに挿入される。好
ましいプロデューサー細胞はヒト２９３細胞株であり、かかる細胞株はＡｄ５ゲ
ノムフラグメントをヒト胚腎細胞にトランスフェクトし、形質転換表現型のため
に選択することにより確立した（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇ
ｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２，１９９７）。さらに、Ａ５４９細胞株お
よびＫＢ細胞株も使用してもよい（それらのすべてはＡＴＣＣから入手できる）
。
【００３７】
本発明の別の態様において、アデノウイルスベクターは偽アデノウイルスベク
ター（ＰＡＶ）であり、かかるベクターはベクターゲノムの複製およびパッケー
ジングに必要な最小シス作用ヌクレオチド配列を含み、１以上のトランスジーン
を含んでいてもよいアデノウイルスゲノムに由来する（ＰＡＶベクターおよびＰ
ＡＶを産生する方法を包含する、米国特許第５，８８２，８７７号（参照として
本発明に援用する）を参照されたい）。そのようなＰＡＶベクターは３６ｋｂま
での異種核酸を受け入れる。
ター（ＰＡＶ）であり、かかるベクターはベクターゲノムの複製およびパッケー
ジングに必要な最小シス作用ヌクレオチド配列を含み、１以上のトランスジーン
を含んでいてもよいアデノウイルスゲノムに由来する（ＰＡＶベクターおよびＰ
ＡＶを産生する方法を包含する、米国特許第５，８８２，８７７号（参照として
本発明に援用する）を参照されたい）。そのようなＰＡＶベクターは３６ｋｂま
での異種核酸を受け入れる。
【００３８】
さらに、免疫抑制分子、たとえば、ＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０およびＴＧＦβ
をコードする異種核酸、生物学的に活性な分子をコードするトランスジーン、お
よびｆａｓ、ｆａｓＬおよびｐ３５をコードする核酸は、発現制御配列、たとえ
ば、トランスジーンまたは免疫調節分子の発現に関するプロモーターに機能的に
連結していてもよい。本発明で使用したような、“機能的な連結"という句は、
プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位、および他のシグナル配
列のようなヌクレオチドの調節およびエフェクター配列を持つポリヌクレオチド
／トランスジーンの機能的関連を表す。たとえば、プロモーターへの核酸の機能
的な連結は、ポリヌクレオチドおよびプロモーター間の物理的および機能的関連
を表し、それでプロモーターを特異的に認識し、それに結合するＲＮＡポリメラ
ーゼによりＤＮＡの転写がプロモーターから開始し、ここで前記プロモーターは
ポリヌクレオチドからＲＮＡの転写を指図する。
をコードする異種核酸、生物学的に活性な分子をコードするトランスジーン、お
よびｆａｓ、ｆａｓＬおよびｐ３５をコードする核酸は、発現制御配列、たとえ
ば、トランスジーンまたは免疫調節分子の発現に関するプロモーターに機能的に
連結していてもよい。本発明で使用したような、“機能的な連結"という句は、
プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位、および他のシグナル配
列のようなヌクレオチドの調節およびエフェクター配列を持つポリヌクレオチド
／トランスジーンの機能的関連を表す。たとえば、プロモーターへの核酸の機能
的な連結は、ポリヌクレオチドおよびプロモーター間の物理的および機能的関連
を表し、それでプロモーターを特異的に認識し、それに結合するＲＮＡポリメラ
ーゼによりＤＮＡの転写がプロモーターから開始し、ここで前記プロモーターは
ポリヌクレオチドからＲＮＡの転写を指図する。
【００３９】
プロモーター領域はＲＮＡポリメラーゼ認識、結合および転写開始に十分な特
定の配列を含む。さらに、プロモーター領域はＲＮＡポリメラーゼの認識、結合
および転写開始活性を調節する配列を含む。そのような配列はシス作用性であっ
てもよく、またはトランス作用因子に反応性であってもよい。制御の性質に依存
して、プロモーターは構成性または調節性であってもよい。プロモーターの例と
しては、ＳＰ６、Ｔ４、Ｔ７、ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）プロモーターおよびＣＭＶ由来プロモーター、マウス乳がんウイル
ス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘導性プロモーター、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウ
イルス（ＭＭＬＶ）プロモーター、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルス長反復配列（ＲＳＶ−
ＬＴＲ）ウイルスプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモ
ーターなどが挙げられる。あるいは、前記プロモーターは内因性アデノウイルス
プロモーター、たとえば、Ｅ１ａプロモーターまたはＡｄ２主要後期プロモータ
ー（ＭＬＰ）であってもよい。かかるプロモーターはまた、ＣＭＶ由来プロモー
ターエレメントのように、持続的にトランスジーンを発現させることが可能で、
このことについては、本発明に参照として援用した、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ
９９／００９１５中でＡｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，により記載されてい
る。同様に、当業者は内因性または外因性ポリＡアデニル化シグナル、たとえば
ＳＶ４０、ＢＧＨ、アデノウイルスまたは天然のポリＡシグナルを使用して、ア
デノウイルスベクターを構築することができる。
定の配列を含む。さらに、プロモーター領域はＲＮＡポリメラーゼの認識、結合
および転写開始活性を調節する配列を含む。そのような配列はシス作用性であっ
てもよく、またはトランス作用因子に反応性であってもよい。制御の性質に依存
して、プロモーターは構成性または調節性であってもよい。プロモーターの例と
しては、ＳＰ６、Ｔ４、Ｔ７、ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）プロモーターおよびＣＭＶ由来プロモーター、マウス乳がんウイル
ス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘導性プロモーター、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウ
イルス（ＭＭＬＶ）プロモーター、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルス長反復配列（ＲＳＶ−
ＬＴＲ）ウイルスプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモ
ーターなどが挙げられる。あるいは、前記プロモーターは内因性アデノウイルス
プロモーター、たとえば、Ｅ１ａプロモーターまたはＡｄ２主要後期プロモータ
ー（ＭＬＰ）であってもよい。かかるプロモーターはまた、ＣＭＶ由来プロモー
ターエレメントのように、持続的にトランスジーンを発現させることが可能で、
このことについては、本発明に参照として援用した、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ
９９／００９１５中でＡｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，により記載されてい
る。同様に、当業者は内因性または外因性ポリＡアデニル化シグナル、たとえば
ＳＶ４０、ＢＧＨ、アデノウイルスまたは天然のポリＡシグナルを使用して、ア
デノウイルスベクターを構築することができる。
【００４０】
ベクターが複数の異種核酸分子を含む場合は、かかる核酸分子は遺伝子のそれ
ぞれの型の最適化された特定発現をするために、異なるプロモーターから発現さ
れてもよい。たとえば、トランスジーンは構成性プロモーターの制御下にあって
もよく、免疫抑制分子は誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。あるいは
、同じプロモーターの複数のコピーを複数の核酸の発現に使用してもよく、また
は単一プロモーターを、同時発現ができるように隣接して配列された異種核酸に
機能的に連結させてもよい。
ぞれの型の最適化された特定発現をするために、異なるプロモーターから発現さ
れてもよい。たとえば、トランスジーンは構成性プロモーターの制御下にあって
もよく、免疫抑制分子は誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。あるいは
、同じプロモーターの複数のコピーを複数の核酸の発現に使用してもよく、また
は単一プロモーターを、同時発現ができるように隣接して配列された異種核酸に
機能的に連結させてもよい。
【００４１】
ポリヌクレオチド／トランスジーンは当技術分野で既知の方法を使用してＡｄ
ベクターに挿入される。トランスジーンは特定のポリペプチドもしくは蛋白、ま
たはリボザイムもしくはアンチセンスＲＮＡなどをコードする核酸分子または構
造遺伝子として本発明では定義する。ポリペプチドもしくは蛋白をコードするト
ランスジーンには、とりわけ、たとえば、α−ガラクトシダーゼＡまたはβ−ガ
ラクトシダーゼのようなヒトリソソーム酵素、ホルモン、成長因子、サイトカイ
ン、抗原、およびＣＦＴＲ、α１−アンチトリプシン、可溶性ＣＤ４，アデノシ
ンデアミナーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、腫瘍抗原ｇｐ１００
、ＭＡＲＴ−１およびＴＲＰ−２のような特異的蛋白；およびＶＩＩＩ因子、Ｉ
Ｘ因子、ＶＩＩ因子およびＶｏｎ Ｗｉｌｌｅｎｂｒａｎｄ因子のような凝固因
子をコードするものが挙げられる。本発明に関連する代表的なヒトリソソーム酵
素を表Ｉに示す。リソソーム酵素および表Ｉの前記酵素をコ−ドする核酸分子（
トランスジーン）の単離および性状決定に関連する参照文献は、Ｓｃｒｉｖｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒ
ｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ、７版、ＩＩ巻、ｐｐ．２４２７−２８７９，ＭｃＧ
ｒａｗ Ｈｉｌｌ，１９９５に見られ、それらは参照として本明細書に援用する
。
ベクターに挿入される。トランスジーンは特定のポリペプチドもしくは蛋白、ま
たはリボザイムもしくはアンチセンスＲＮＡなどをコードする核酸分子または構
造遺伝子として本発明では定義する。ポリペプチドもしくは蛋白をコードするト
ランスジーンには、とりわけ、たとえば、α−ガラクトシダーゼＡまたはβ−ガ
ラクトシダーゼのようなヒトリソソーム酵素、ホルモン、成長因子、サイトカイ
ン、抗原、およびＣＦＴＲ、α１−アンチトリプシン、可溶性ＣＤ４，アデノシ
ンデアミナーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、腫瘍抗原ｇｐ１００
、ＭＡＲＴ−１およびＴＲＰ−２のような特異的蛋白；およびＶＩＩＩ因子、Ｉ
Ｘ因子、ＶＩＩ因子およびＶｏｎ Ｗｉｌｌｅｎｂｒａｎｄ因子のような凝固因
子をコードするものが挙げられる。本発明に関連する代表的なヒトリソソーム酵
素を表Ｉに示す。リソソーム酵素および表Ｉの前記酵素をコ−ドする核酸分子（
トランスジーン）の単離および性状決定に関連する参照文献は、Ｓｃｒｉｖｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒ
ｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ、７版、ＩＩ巻、ｐｐ．２４２７−２８７９，ＭｃＧ
ｒａｗ Ｈｉｌｌ，１９９５に見られ、それらは参照として本明細書に援用する
。
【００４２】
【表１】
【００４３】
免疫抑制分子をコードするポリヌクレオチドには、とりわけ、ＩＬ−１０、ｖ
ＩＬ−１０およびＴＧＦβをコードするものが挙げられる。本発明の他のポリヌ
クレオチドには、バキュロウイルス感染細胞のアポトーシスを阻害する蛋白をコ
ードするバキュロウイルスのｐ３５遺伝子（Ｃｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２５４：１３８８−１３８９，１９９１；Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３４６７−３４７７，１９９４；Ｂｕｍｐ
ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１８８５−１８８８，１９９５；Ｘ
ｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７７：２４８−２５１，１９９５）およ
び移植において異種抗原に反応してＴ細胞のアポトーシスを誘発する細胞表面蛋
白をコードする哺乳動物ｆａｓ／ＣＤ９５リガンド（ｆａｓＬ）遺伝子が挙げら
れる（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１１８９−
１１９２，１９９５）。
ＩＬ−１０およびＴＧＦβをコードするものが挙げられる。本発明の他のポリヌ
クレオチドには、バキュロウイルス感染細胞のアポトーシスを阻害する蛋白をコ
ードするバキュロウイルスのｐ３５遺伝子（Ｃｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２５４：１３８８−１３８９，１９９１；Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３４６７−３４７７，１９９４；Ｂｕｍｐ
ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１８８５−１８８８，１９９５；Ｘ
ｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７７：２４８−２５１，１９９５）およ
び移植において異種抗原に反応してＴ細胞のアポトーシスを誘発する細胞表面蛋
白をコードする哺乳動物ｆａｓ／ＣＤ９５リガンド（ｆａｓＬ）遺伝子が挙げら
れる（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１１８９−
１１９２，１９９５）。
【００４４】
例としては、ベクターにポリヌクレオチド／トランスジーンを挿入するために
、ポリヌクレオチド／トランスジーンおよびベクター核酸は、適切な条件下で、
お互いに対になって、リガーゼにより連結される各分子の相補型末端を作るため
に制限酵素と接触することができる。あるいは、合成核酸リンカーは制限ポリヌ
クレオチドの末端に連結することができる。これらの合成核酸リンカーはベクタ
ー核酸の特定の制限部位に相当する核酸配列を含む。さらに、終止コドンおよび
適切な制限部位を含むオリゴヌクレオチドを、たとえば、以下のいくつかまたは
すべてを含むベクターへの挿入のために連結することができる：選択可能なマー
カー遺伝子、たとえば哺乳動物における安定または一時的トランスフェクタント
の選択のためのネオマイシン遺伝子、高レベルの転写のためのヒトＣＭＶの即時
早期遺伝子由来のエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡ安定性のためのＳ
Ｖ４０由来の転写終止およびＲＮＡプロセシングシグナル；複製のＳＶ４０ポリ
オーマ起源および適切なエピゾーム複製のためのＣｏｌＥ１；多目的な複数のク
ローニング部位；およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのセンスおよびアンチセンスＲＮＡ
転写のためのＴ７およびＳＰ６ＲＮＡプロモーター。他の方法は当技術分野で既
知であり、利用可能である。
、ポリヌクレオチド／トランスジーンおよびベクター核酸は、適切な条件下で、
お互いに対になって、リガーゼにより連結される各分子の相補型末端を作るため
に制限酵素と接触することができる。あるいは、合成核酸リンカーは制限ポリヌ
クレオチドの末端に連結することができる。これらの合成核酸リンカーはベクタ
ー核酸の特定の制限部位に相当する核酸配列を含む。さらに、終止コドンおよび
適切な制限部位を含むオリゴヌクレオチドを、たとえば、以下のいくつかまたは
すべてを含むベクターへの挿入のために連結することができる：選択可能なマー
カー遺伝子、たとえば哺乳動物における安定または一時的トランスフェクタント
の選択のためのネオマイシン遺伝子、高レベルの転写のためのヒトＣＭＶの即時
早期遺伝子由来のエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡ安定性のためのＳ
Ｖ４０由来の転写終止およびＲＮＡプロセシングシグナル；複製のＳＶ４０ポリ
オーマ起源および適切なエピゾーム複製のためのＣｏｌＥ１；多目的な複数のク
ローニング部位；およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのセンスおよびアンチセンスＲＮＡ
転写のためのＴ７およびＳＰ６ＲＮＡプロモーター。他の方法は当技術分野で既
知であり、利用可能である。
【００４５】
本発明の好ましい態様において（実施例１で説明したように）、免疫抑制分子
をコードする核酸分子はアデノウイルスベクターのＥ３欠失領域に挿入する（図
１、および図４）あるいは、免疫抑制分子をコードする核酸はアデノウイルスベ
クターのＥ３欠失領域に挿入し、第２の分子（別の免疫抑制分子またはトランス
ジーン）はアデノウイルスベクターのＥ１欠失領域に挿入する（図２、図３、図
５および図６）。本発明の他の代わりの態様において、ｐ３５をコードする核酸
はアデノウイルスベクターのＥ３欠失領域に挿入し、ｆａｓＬをコードする核酸
はＥ１欠失領域に挿入する（図７）。これらは、１９９９年、４月２１日に出願
された同時係属中の仮出願第６０／１３０，４１５号に記載され、これを参照と
して本明細書に援用する。
をコードする核酸分子はアデノウイルスベクターのＥ３欠失領域に挿入する（図
１、および図４）あるいは、免疫抑制分子をコードする核酸はアデノウイルスベ
クターのＥ３欠失領域に挿入し、第２の分子（別の免疫抑制分子またはトランス
ジーン）はアデノウイルスベクターのＥ１欠失領域に挿入する（図２、図３、図
５および図６）。本発明の他の代わりの態様において、ｐ３５をコードする核酸
はアデノウイルスベクターのＥ３欠失領域に挿入し、ｆａｓＬをコードする核酸
はＥ１欠失領域に挿入する（図７）。これらは、１９９９年、４月２１日に出願
された同時係属中の仮出願第６０／１３０，４１５号に記載され、これを参照と
して本明細書に援用する。
【００４６】
本明細書は本明細書のベクターの使用法に関連する。かかる方法は、ベクター
を投与する患者の抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）のアデノウイルスベクターに含まれ
るアデノウイルス抗原および／またはトランスジーンに対する耐性を誘導するた
めの方法で、前記アデノウイルス抗原をコードする核酸を含むアデノウイルスゲ
ノムを含むベクターの量を前記ＡＰＣｓに導入することを含み、前記アデノウイ
ルスゲノムはＥ１領域の欠失および第２の領域の欠失をも含み、ここで第１の核
酸分子は１つの欠失領域に挿入され、第２の核酸分子は他の欠失領域に挿入され
ており、ここでベクターは細胞に取り込まれ、ここで第１および第２の核酸はＡ
ＰＣｓに発現される蛋白をコードする。蛋白を発現する第１および第２の核酸に
は、とりわけ、ｖＩＬ−１０、ＴＧＦβ、ｆａｓＬ、ｐ３５およびトランスジー
ンが挙げられる。好ましい態様において、第１の核酸はトランスジーンを含み、
第２の核酸はＴＧＦβまたはＩＬ−１０もしくはｖＩＬ−１０をコードする。本
明細書の他の好ましい態様において、第１の核酸はトランスジーンをコードし、
第２の核酸はｆａｓＬをコードし、第３の核酸はｐ３５をコードする。適切なＡ
ＰＣｓ源としては樹状細胞またはマクロファージのような全細胞、およびフォス
ター抗原提示細胞が挙げられるが、これに限定されない。
を投与する患者の抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）のアデノウイルスベクターに含まれ
るアデノウイルス抗原および／またはトランスジーンに対する耐性を誘導するた
めの方法で、前記アデノウイルス抗原をコードする核酸を含むアデノウイルスゲ
ノムを含むベクターの量を前記ＡＰＣｓに導入することを含み、前記アデノウイ
ルスゲノムはＥ１領域の欠失および第２の領域の欠失をも含み、ここで第１の核
酸分子は１つの欠失領域に挿入され、第２の核酸分子は他の欠失領域に挿入され
ており、ここでベクターは細胞に取り込まれ、ここで第１および第２の核酸はＡ
ＰＣｓに発現される蛋白をコードする。蛋白を発現する第１および第２の核酸に
は、とりわけ、ｖＩＬ−１０、ＴＧＦβ、ｆａｓＬ、ｐ３５およびトランスジー
ンが挙げられる。好ましい態様において、第１の核酸はトランスジーンを含み、
第２の核酸はＴＧＦβまたはＩＬ−１０もしくはｖＩＬ−１０をコードする。本
明細書の他の好ましい態様において、第１の核酸はトランスジーンをコードし、
第２の核酸はｆａｓＬをコードし、第３の核酸はｐ３５をコードする。適切なＡ
ＰＣｓ源としては樹状細胞またはマクロファージのような全細胞、およびフォス
ター抗原提示細胞が挙げられるが、これに限定されない。
【００４７】
ＡＰＣｓ、好ましくは樹状細胞（ＤＣｓ）はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖ
ｉｖｏで感染してもよい。ＤＣｓは、抗原特異的免疫反応の主要なイニシエータ
ーであるが、それらは表面にいくつかの分子を持ち、それらはＴ細胞活性化に重
要である（ｖａｎ Ｓｃｈｏｏｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ Ｔｏｄａｙ，ｐｐ２５４−２６０，１９９７に総説がある）。
ｉｖｏで感染してもよい。ＤＣｓは、抗原特異的免疫反応の主要なイニシエータ
ーであるが、それらは表面にいくつかの分子を持ち、それらはＴ細胞活性化に重
要である（ｖａｎ Ｓｃｈｏｏｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ Ｔｏｄａｙ，ｐｐ２５４−２６０，１９９７に総説がある）。
【００４８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの感染のために、ＤＣｓは血液の骨髄前駆体細胞（ＣＤ３
４＋）を単離し、それらをＤＣｓに分化させるために刺激することにより、骨髄
から精製してもよい。末梢血中で循環するＣＤ３４＋幹細胞の数を増やすために
ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインで患者を処置しなければならない。Ｉｎａｂ
ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３。ＤＣｓを単離する
ための第２の方法は、すでに血液中を循環している、予め投与した比較的大量の
ＤＣｓを集めることである。ヒト末梢血から成熟したＤＣｓを調製するための既
知の方法にはメトリサミドグラジエントおよび付着／非付着段階（Ｆｒｅｕｄｅ
ｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ
．Ａ．８７：７６９８−７７０２，１９９０）；パーコールグラジエント分離（
Ｍｅｈｔａ−Ｄａｒｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：６
８４０−６８５２，１９９３）のような物理的方法の組み合わせが挙げられる。
ＤＣｓの単離および培養の好ましい方法は、Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．１９６：１３７−１５１，１９９６に記載され、これ
を参照として本明細書に援用する。
４＋）を単離し、それらをＤＣｓに分化させるために刺激することにより、骨髄
から精製してもよい。末梢血中で循環するＣＤ３４＋幹細胞の数を増やすために
ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインで患者を処置しなければならない。Ｉｎａｂ
ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３。ＤＣｓを単離する
ための第２の方法は、すでに血液中を循環している、予め投与した比較的大量の
ＤＣｓを集めることである。ヒト末梢血から成熟したＤＣｓを調製するための既
知の方法にはメトリサミドグラジエントおよび付着／非付着段階（Ｆｒｅｕｄｅ
ｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ
．Ａ．８７：７６９８−７７０２，１９９０）；パーコールグラジエント分離（
Ｍｅｈｔａ−Ｄａｒｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：６
８４０−６８５２，１９９３）のような物理的方法の組み合わせが挙げられる。
ＤＣｓの単離および培養の好ましい方法は、Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．１９６：１３７−１５１，１９９６に記載され、これ
を参照として本明細書に援用する。
【００４９】
回収したＤＣｓはつぎにｉｎ ｖｉｔｒｏで、免疫抑制分子（ＩＬ−１０、ｖ
ＩＬ−１０および／またはＴＧＦβ）をコードする核酸および先に記載したよう
な、トランスジーン、またはｆａｓＬ遺伝子およびｐ３５遺伝子のいずれかを含
むＡｄベクターに感染しもよい。感染したＤＣｓは静脈内注射により、宿主に感
染したＤＣｓを多重投与することにより、宿主を前処理するために使用してもよ
い。感染したＤＣｓを宿主に投与後、ＤＣｓは脾臓のようなリンパ節に遊走し、
Ｔ細胞と相互作用する。そのような相互作用はＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０および
／またはＴＧＦβを発現するＴ細胞の免疫反応を抑制するか、またはｆａｓＬを
発現するＴ細胞のアポトーシスを誘発するであろう。ｐ３５はｆａｓ／ｆａｓＬ
媒介経路による溶解からＤＣｓを保護するために作用するであろう。
ＩＬ−１０および／またはＴＧＦβ）をコードする核酸および先に記載したよう
な、トランスジーン、またはｆａｓＬ遺伝子およびｐ３５遺伝子のいずれかを含
むＡｄベクターに感染しもよい。感染したＤＣｓは静脈内注射により、宿主に感
染したＤＣｓを多重投与することにより、宿主を前処理するために使用してもよ
い。感染したＤＣｓを宿主に投与後、ＤＣｓは脾臓のようなリンパ節に遊走し、
Ｔ細胞と相互作用する。そのような相互作用はＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０および
／またはＴＧＦβを発現するＴ細胞の免疫反応を抑制するか、またはｆａｓＬを
発現するＴ細胞のアポトーシスを誘発するであろう。ｐ３５はｆａｓ／ｆａｓＬ
媒介経路による溶解からＤＣｓを保護するために作用するであろう。
【００５０】
前処理後、アデノウイルスベクター感染ＤＣｓにより導入されたものと同じト
ランスジーンを含むＡｄベクターは任意の投与法により宿主に導入してもよく、
たとえば静脈内、鼻腔内、筋肉内などの投与法がある。こうして生物学的に活性
な分子をコードするトランスジーンを免疫反応を起こさずに、または最小の免疫
反応により、発現することができる。免疫反応がないことまたは軽減されること
により、最小化または除去された宿主免疫反応を伴って、Ａｄベクターの反復投
与および生物学的に活性な分子をコードするトランスジーンの持続的発現が可能
になる。
ランスジーンを含むＡｄベクターは任意の投与法により宿主に導入してもよく、
たとえば静脈内、鼻腔内、筋肉内などの投与法がある。こうして生物学的に活性
な分子をコードするトランスジーンを免疫反応を起こさずに、または最小の免疫
反応により、発現することができる。免疫反応がないことまたは軽減されること
により、最小化または除去された宿主免疫反応を伴って、Ａｄベクターの反復投
与および生物学的に活性な分子をコードするトランスジーンの持続的発現が可能
になる。
【００５１】
あるいは、免疫抑制分子（ＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０および／またはＴＧＦβ
）をコードする核酸および先に開示したトランスジーン、またはｆａｓＬ遺伝子
およびｐ３５遺伝子のいずれかを含むＡｄベクターを、ｉｎ ｖｉｖｏでＡｄベ
クターの皮内注射、または当技術分野で既知の投与法によりＤＣｓを感染させる
ために使用してもよい。そのように導入したＤＣｓは局所リンパ節を遊走して、
Ｔ細胞と相互作用するであろう。ｉｎ ｖｉｖｏで宿主にＤＣｓを投与後、アデ
ノウイルスベクター感染ＤＣｓにより導入されるものと同じ生物学的に活性な分
子をコードする同じトランスジーンを含むＡｄベクターを、静脈内、鼻腔内、筋
肉内などの任意の投与経路により導入してもよい。先に述べたように、生物学的
に活性な分子をコードするトランスジーンを免疫反応の非存在下または最小化し
た免疫反応により発現し、反復して投与することができる。
）をコードする核酸および先に開示したトランスジーン、またはｆａｓＬ遺伝子
およびｐ３５遺伝子のいずれかを含むＡｄベクターを、ｉｎ ｖｉｖｏでＡｄベ
クターの皮内注射、または当技術分野で既知の投与法によりＤＣｓを感染させる
ために使用してもよい。そのように導入したＤＣｓは局所リンパ節を遊走して、
Ｔ細胞と相互作用するであろう。ｉｎ ｖｉｖｏで宿主にＤＣｓを投与後、アデ
ノウイルスベクター感染ＤＣｓにより導入されるものと同じ生物学的に活性な分
子をコードする同じトランスジーンを含むＡｄベクターを、静脈内、鼻腔内、筋
肉内などの任意の投与経路により導入してもよい。先に述べたように、生物学的
に活性な分子をコードするトランスジーンを免疫反応の非存在下または最小化し
た免疫反応により発現し、反復して投与することができる。
【００５２】
生物学的に活性な分子をコードするトランスジーンを含むＡｄベクターの他の
投与経路には、標的細胞、組織または組織への直接送達、鼻腔内、静脈内、筋肉
内、皮下、皮内、経口および他の非経口投与などの慣用で、生理的に受容できる
経路が挙げられる。かかるＡｄベクターはまた、液体または乾燥粉末エアゾール
により投与してもよい（たとえば、１９９８年、１２月４日に出願された、米国
仮出願第６０／１１０，８９９号に開示され、これを参照として本明細書に援用
する）。
投与経路には、標的細胞、組織または組織への直接送達、鼻腔内、静脈内、筋肉
内、皮下、皮内、経口および他の非経口投与などの慣用で、生理的に受容できる
経路が挙げられる。かかるＡｄベクターはまた、液体または乾燥粉末エアゾール
により投与してもよい（たとえば、１９９８年、１２月４日に出願された、米国
仮出願第６０／１１０，８９９号に開示され、これを参照として本明細書に援用
する）。
【００５３】
患者に投与するＡｄベクターの投与量は、患者の体調、年齢、体重および臨床
状態などを含む、各種パラメーター、および生物学的に活性な蛋白の供給を必要
とする特定分子の欠失に関連して決定する。投与量は、好ましくは先に記載した
分子アッセイまたは臨床マーカーにより測定したように、投与が特定の表現型を
引き起こすように選択する。本発明のＡｄベクターは、たとえば、トランスジー
ンによりコードされる生物学的に活性な蛋白の持続的な発現のために、患者にベ
クターに含まれるトランスジーンを提供し、特定の表現型を得るために利用でき
るものであるが、その投与量はヒトでは約１０8感染単位（Ｉ．Ｕ．）から１０1 1 Ｉ．Ｕ．である。
状態などを含む、各種パラメーター、および生物学的に活性な蛋白の供給を必要
とする特定分子の欠失に関連して決定する。投与量は、好ましくは先に記載した
分子アッセイまたは臨床マーカーにより測定したように、投与が特定の表現型を
引き起こすように選択する。本発明のＡｄベクターは、たとえば、トランスジー
ンによりコードされる生物学的に活性な蛋白の持続的な発現のために、患者にベ
クターに含まれるトランスジーンを提供し、特定の表現型を得るために利用でき
るものであるが、その投与量はヒトでは約１０8感染単位（Ｉ．Ｕ．）から１０1 1 Ｉ．Ｕ．である。
【００５４】
投与を簡便にし、投与量を均一にするためには、単位剤型において非経口組成
物を製剤することが特に好都合である。本明細書で使用する単位剤型という語は
、処置する患者への、単一投与量として適切な、物理的に不連続な単位を表す。
各単位は、特定の表現型効果を生むために計算した、予め決めた活性成分の量と
必要な生理的キャリアを含む。本発明の新規投与単位剤型の明細は、製剤に使用
したアデノウイルスベクターの独特な性質および調剤の技術に固有の限定により
要求され、直接依存する。おもな活性成分（前記アデノウイルスベクター）は先
に説明した投与単位剤型において、生理的に受容できるキャリアとともに好都合
で効果的な投与のために調剤する。
物を製剤することが特に好都合である。本明細書で使用する単位剤型という語は
、処置する患者への、単一投与量として適切な、物理的に不連続な単位を表す。
各単位は、特定の表現型効果を生むために計算した、予め決めた活性成分の量と
必要な生理的キャリアを含む。本発明の新規投与単位剤型の明細は、製剤に使用
したアデノウイルスベクターの独特な性質および調剤の技術に固有の限定により
要求され、直接依存する。おもな活性成分（前記アデノウイルスベクター）は先
に説明した投与単位剤型において、生理的に受容できるキャリアとともに好都合
で効果的な投与のために調剤する。
【００５５】
耐性を誘導するためにＡｄ感染ＤＣｓで前処理した後投与したＡｄベクターは
、ベクターにターゲティング分子を連結することにより、特定の細胞に標的を定
めることができる。このことは、たとえば１９９９年、２月８日に出願された国
際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０２６８０に開示され、これを参照として本明細
書に援用する。ターゲティング分子は関心のある細胞または組織型に特定の任意
の物質でよく、たとえば、リガンド、抗体、糖、受容体または他の結合分子など
が挙げられる。ターゲティング分子が連結したベクターはリソソーム病に特に有
用である。たとえば、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体の抗体のような、ターゲテ
ィング分子を含むものはファブリー病患者の血管内皮細胞へのターゲティングを
提供する。
、ベクターにターゲティング分子を連結することにより、特定の細胞に標的を定
めることができる。このことは、たとえば１９９９年、２月８日に出願された国
際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０２６８０に開示され、これを参照として本明細
書に援用する。ターゲティング分子は関心のある細胞または組織型に特定の任意
の物質でよく、たとえば、リガンド、抗体、糖、受容体または他の結合分子など
が挙げられる。ターゲティング分子が連結したベクターはリソソーム病に特に有
用である。たとえば、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体の抗体のような、ターゲテ
ィング分子を含むものはファブリー病患者の血管内皮細胞へのターゲティングを
提供する。
【００５６】
さらに、感染ＤＣｓで前処理した後投与したＡｄベクターは、カチオン性両性
物質、たとえばカチオン性脂質、ポリＬ−リジン（ＰＬＬ）、およびジエチルア
ミノジエチルデキストラン（ＤＥＡＥ−デキストラン）と複合体を形成し、標的
細胞のウイルス感染の効率を増加させる（たとえば、参照として本明細書に援用
した、ＷＯ９８／２２１４４を参照されたい）。代表的なカチオン性脂質には、
たとえば、米国特許第５，２３８，１８５号および第５，７６７，０９９号に開
示されたものが挙げられ、好ましい脂質としてはＧＬ−６７（Ｎ4−スペルミン
コレステリルカーバメート）、ＧＬ−５３（Ｎ4−スペルミンコレステリルカー
バメート）およびＧＬ−８９（１−（Ｎ4−スペルミン）−２，３−ジラウリル
グリセロールカーバメート）がある。
物質、たとえばカチオン性脂質、ポリＬ−リジン（ＰＬＬ）、およびジエチルア
ミノジエチルデキストラン（ＤＥＡＥ−デキストラン）と複合体を形成し、標的
細胞のウイルス感染の効率を増加させる（たとえば、参照として本明細書に援用
した、ＷＯ９８／２２１４４を参照されたい）。代表的なカチオン性脂質には、
たとえば、米国特許第５，２３８，１８５号および第５，７６７，０９９号に開
示されたものが挙げられ、好ましい脂質としてはＧＬ−６７（Ｎ4−スペルミン
コレステリルカーバメート）、ＧＬ−５３（Ｎ4−スペルミンコレステリルカー
バメート）およびＧＬ−８９（１−（Ｎ4−スペルミン）−２，３−ジラウリル
グリセロールカーバメート）がある。
【００５７】
ＤＥＡＥ−デキストランと複合体を形成したＡｄベクターは特に好ましい。さ
らに、ウイルスベクターの反復投与により起こる免疫反応をさらに除去するため
に、アデノウイルスおよび他のウイルスベクターを、たとえば、ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）と複合体を形成することにより、ポリマー修飾して、ウイル
ス免疫原性を軽減し、反復投与を可能にしてもよい（参照として本明細書に援用
した、ＷＯ９８／４４１４３を参照されたい）。また、１９９８年８月２４日に
出願された米国仮出願第６０／０９７，６５３号に開示されているように、カチ
オン性分子、好ましくはＤＥＡＥ、およびポリアルキレングリコールポリマー、
たとえば、ＰＥＧと複合体を形成したＡｄベクターも本明細書に企図する。
らに、ウイルスベクターの反復投与により起こる免疫反応をさらに除去するため
に、アデノウイルスおよび他のウイルスベクターを、たとえば、ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）と複合体を形成することにより、ポリマー修飾して、ウイル
ス免疫原性を軽減し、反復投与を可能にしてもよい（参照として本明細書に援用
した、ＷＯ９８／４４１４３を参照されたい）。また、１９９８年８月２４日に
出願された米国仮出願第６０／０９７，６５３号に開示されているように、カチ
オン性分子、好ましくはＤＥＡＥ、およびポリアルキレングリコールポリマー、
たとえば、ＰＥＧと複合体を形成したＡｄベクターも本明細書に企図する。
【００５８】
本発明のＡｄベクターによる、標的細胞へのトランスジーンの移入は、標的細
胞中のトランスジーン生成物のレベルを測定し、トランスジーン発現と関連した
表現型変化を関連付けることにより評価することができる。たとえば、嚢胞性線
維症患者の標的細胞におけるＣＦＴＲトランスジーンの発現は、かかる細胞にお
ける機能的塩素イオンチャネルの産生と関連し、当技術分野で既知の技術により
測定できる。標的細胞におけるトランスジーン生成物のレベルは、Ａｄベクター
によるトランスジーンの移入の効率と直接関連する。当技術分野で既知の任意の
方法をトランスジーン生成物のレベルを測定するために使用することができる。
それらの方法にはＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、蛍光および化学発光酵素
基質を使用したアッセイが挙げられる。
胞中のトランスジーン生成物のレベルを測定し、トランスジーン発現と関連した
表現型変化を関連付けることにより評価することができる。たとえば、嚢胞性線
維症患者の標的細胞におけるＣＦＴＲトランスジーンの発現は、かかる細胞にお
ける機能的塩素イオンチャネルの産生と関連し、当技術分野で既知の技術により
測定できる。標的細胞におけるトランスジーン生成物のレベルは、Ａｄベクター
によるトランスジーンの移入の効率と直接関連する。当技術分野で既知の任意の
方法をトランスジーン生成物のレベルを測定するために使用することができる。
それらの方法にはＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、蛍光および化学発光酵素
基質を使用したアッセイが挙げられる。
【００５９】
トランスジーンの発現は当技術分野で既知の各種方法によりモニターできる。
とりわけ、免疫学的、組織化学的および活性試験などが挙げられる。標本のトラ
ンスジーン生成物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出に有効な免疫学的方法には、検出
可能な抗体を使用したイムノアッセイが挙げられる。そのようなイムノアッセイ
には、当技術分野で既知の、たとえば、ＥＬＩＳＡ、Ｐａｎｄｅｘ微小蛍光アッ
セイ、凝集アッセイ、フローサイトメトリー、血清診断アッセイおよび免疫組織
化学的染色法が挙げられる。抗体は当技術分野で既知の各種方法により検出する
ことができる。たとえば、検出可能なマーカーは直接、または間接的に抗体に付
着することができる。有用なマーカーにはたとえば、放射性核種、酵素、発蛍光
団、色素源および化学発光標識が挙げられる。
とりわけ、免疫学的、組織化学的および活性試験などが挙げられる。標本のトラ
ンスジーン生成物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出に有効な免疫学的方法には、検出
可能な抗体を使用したイムノアッセイが挙げられる。そのようなイムノアッセイ
には、当技術分野で既知の、たとえば、ＥＬＩＳＡ、Ｐａｎｄｅｘ微小蛍光アッ
セイ、凝集アッセイ、フローサイトメトリー、血清診断アッセイおよび免疫組織
化学的染色法が挙げられる。抗体は当技術分野で既知の各種方法により検出する
ことができる。たとえば、検出可能なマーカーは直接、または間接的に抗体に付
着することができる。有用なマーカーにはたとえば、放射性核種、酵素、発蛍光
団、色素源および化学発光標識が挙げられる。
【００６０】
ｉｎ ｖｉｖｏイメージング法のために、検出可能な抗体を患者に投与し、ト
ランスジーン生成物への抗体の結合を当技術分野で既知のイメージング法により
検出することができる。適切なイメージング剤は既知であり、たとえば常磁性金
属イオンだけでなく、111Ｉｎ、99mＴｃ、51Ｃｒのようなガンマ線放出放射性核
種が挙げられ、それらは米国特許第４，６４７，４４７号に記載されている。放
射性核種はガンマシンチレーション測光法、ポジトロンエミッショントモグラフ
ィー、単一光子放射コンピュータトモグラフィーおよびガンマカメラ全身イメー
ジングによる組織のイメージングを可能にし、常磁性金属イオンは磁気共鳴イメ
ージングにより、可視化を可能にする。
ランスジーン生成物への抗体の結合を当技術分野で既知のイメージング法により
検出することができる。適切なイメージング剤は既知であり、たとえば常磁性金
属イオンだけでなく、111Ｉｎ、99mＴｃ、51Ｃｒのようなガンマ線放出放射性核
種が挙げられ、それらは米国特許第４，６４７，４４７号に記載されている。放
射性核種はガンマシンチレーション測光法、ポジトロンエミッショントモグラフ
ィー、単一光子放射コンピュータトモグラフィーおよびガンマカメラ全身イメー
ジングによる組織のイメージングを可能にし、常磁性金属イオンは磁気共鳴イメ
ージングにより、可視化を可能にする。
【００６１】
Ａｄベクター遺伝子生成物およびトランスジーン生成物に対する耐性を誘導す
る本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｖｏでの持続的トランスジーンの発現を提供する
ための方法の能力を分析することができる。かかる方法は、動物モデル系で評価
してもよく、そのために動物のＤＣｓを当技術分野で既知の方法により回収して
、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫抑制分子およびトランスジーンを含むＡｄベクターを
感染させ、耐性を誘導するために動物を前処理に使用してもよく、または先に記
載した方法で、皮内注射によりｉｎ ｖｉｖｏでＤＣｓにアデノウイルスベクタ
ーを感染させてもよい。前処理後、同じトランスジーンをコードするＡｄベクタ
ーは受容できる経路により動物に反復投与してもよい。かかるモデルは、送達の
容易性、トランスジーンの同一性、適切な分子アッセイおよび臨床状態の評価の
ようなパラメーターに関連して選択してもよい。その欠如が特定の疾患状態と関
連するような蛋白をトランスジーンがコードする場合、たとえばファブリーノッ
クアウトマウス（１９９８年１０月２９日に出願された国際特許ＰＣＴ／ＵＳ９
８／２２８８６に開示）のような、疾患状態を表す動物モデルは、最適には、生
物学的に活性なトランスジーン生成物の存在と関連した特定の表現型効果を評価
するために使用してもよく、そのようなマウスのＧＬ−３レベルを軽減するため
のα−ガラクトシダーゼＡトランスジーンを含むＡｄベクターの能力を評価する
ために使用してもよい。かかる動物モデル系において、免疫反応を分析してもよ
い。持続した遺伝子発現、および軽減あるいは除去した免疫反応を伴う生物学的
に活性な分子をコードするトランスジーンを含むＡｄベクターを反復投与する能
力も評価してよい。
る本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｖｏでの持続的トランスジーンの発現を提供する
ための方法の能力を分析することができる。かかる方法は、動物モデル系で評価
してもよく、そのために動物のＤＣｓを当技術分野で既知の方法により回収して
、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫抑制分子およびトランスジーンを含むＡｄベクターを
感染させ、耐性を誘導するために動物を前処理に使用してもよく、または先に記
載した方法で、皮内注射によりｉｎ ｖｉｖｏでＤＣｓにアデノウイルスベクタ
ーを感染させてもよい。前処理後、同じトランスジーンをコードするＡｄベクタ
ーは受容できる経路により動物に反復投与してもよい。かかるモデルは、送達の
容易性、トランスジーンの同一性、適切な分子アッセイおよび臨床状態の評価の
ようなパラメーターに関連して選択してもよい。その欠如が特定の疾患状態と関
連するような蛋白をトランスジーンがコードする場合、たとえばファブリーノッ
クアウトマウス（１９９８年１０月２９日に出願された国際特許ＰＣＴ／ＵＳ９
８／２２８８６に開示）のような、疾患状態を表す動物モデルは、最適には、生
物学的に活性なトランスジーン生成物の存在と関連した特定の表現型効果を評価
するために使用してもよく、そのようなマウスのＧＬ−３レベルを軽減するため
のα−ガラクトシダーゼＡトランスジーンを含むＡｄベクターの能力を評価する
ために使用してもよい。かかる動物モデル系において、免疫反応を分析してもよ
い。持続した遺伝子発現、および軽減あるいは除去した免疫反応を伴う生物学的
に活性な分子をコードするトランスジーンを含むＡｄベクターを反復投与する能
力も評価してよい。
【００６２】
トランスジーン発現系をアッセイしてもよい適切な動物には、マウス、ラット
、サルおよびウサギがあげられるが、これに限定されない。トランスジーン発現
系をアッセイしてもよい適切なマウス系統には、Ｃ３Ｈ、Ｃ５７Ｂ１／６（野生
型およびヌード）およびＢａｌｂ／ｃ（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ，Ｇｅｒｍ
ａｎｔｏｗｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋから入手）が挙げられるが、これに限定されな
い。
、サルおよびウサギがあげられるが、これに限定されない。トランスジーン発現
系をアッセイしてもよい適切なマウス系統には、Ｃ３Ｈ、Ｃ５７Ｂ１／６（野生
型およびヌード）およびＢａｌｂ／ｃ（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ，Ｇｅｒｍ
ａｎｔｏｗｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋから入手）が挙げられるが、これに限定されな
い。
【００６３】
Ａｄベクター投与に対する宿主免疫反応を評価することを所望する場合は、免
疫系により発生した特定の有害反応を定義するために、免疫−コンピテントおよ
び免疫−欠落動物における試験を比較してもよい。ヌードマウスのような免疫欠
落動物を、獲得した宿主反応とは独立して、ベクターの挙動およびトランスジー
ン発現の持続性を調べるため、およびトランスジーン持続性の他の測定因子を同
定するために使用してもよい。
疫系により発生した特定の有害反応を定義するために、免疫−コンピテントおよ
び免疫−欠落動物における試験を比較してもよい。ヌードマウスのような免疫欠
落動物を、獲得した宿主反応とは独立して、ベクターの挙動およびトランスジー
ン発現の持続性を調べるため、およびトランスジーン持続性の他の測定因子を同
定するために使用してもよい。
【００６４】
宿主におけるＡｄベクターの持続性を測定するために、当業者はトランスジー
ン（およびその発現）を同定する任意の方法により、これらのベクターの存在を
アッセイしてもよく、そのような方法にはたとえば、トランスジーンまたは免疫
調節性分子をコードする核酸ｍＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット法ま
たはＳ１分析によりアッセイするか、またはウェスタンブロット法、免役沈降法
、またはラジオイムノアッセイによりトランスジーン蛋白発現をアッセイする方
法がある。あるいは、宿主におけるＡｄベクターの存在または所望するトランス
ジーンＤＮＡ配列自体は、ＤＮＡ配列を同定する任意の方法で測定することがで
き、それらの方法にはサザンブロット法もしくはスロットブロット法、または当
業者に既知の他の方法がある。ベクターが大腸菌、β−ガラクトシダーゼをコー
ドするｌａｃＺなどのマーカー遺伝子を含むとき、ベクターの存在はこれらと同
じアッセイ、またはマーカー蛋白（たとえばＸ−ｇａｌ）をスクリーニングする
特異的機能アッセイにより測定してもよい。宿主における本発明のベクターの持
続性も、トランスジーンを含むＡｄベクターの投与により起きた表現型の変化の
継続した観察により測定することができ、それらの変化にはたとえば嚢胞性線維
症患者にＣＦＴＲ遺伝子を含むベクターの投与に続く肺機能の改善もしくは安定
化、またはファブリー病患者の蓄積されたＧＬ３脂質の減少が挙げられる。肺活
量はＣＦ患者の肺機能試験（ＰＦＴ）に使用することができる。ＣＦ患者のベク
ター処理細胞における塩素イオンチャネルの回復の証明もトランスジーンＣＦＴ
Ｒの持続性を評価するために使用できる（Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１５０４−１５１１，１９９６）。
ン（およびその発現）を同定する任意の方法により、これらのベクターの存在を
アッセイしてもよく、そのような方法にはたとえば、トランスジーンまたは免疫
調節性分子をコードする核酸ｍＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット法ま
たはＳ１分析によりアッセイするか、またはウェスタンブロット法、免役沈降法
、またはラジオイムノアッセイによりトランスジーン蛋白発現をアッセイする方
法がある。あるいは、宿主におけるＡｄベクターの存在または所望するトランス
ジーンＤＮＡ配列自体は、ＤＮＡ配列を同定する任意の方法で測定することがで
き、それらの方法にはサザンブロット法もしくはスロットブロット法、または当
業者に既知の他の方法がある。ベクターが大腸菌、β−ガラクトシダーゼをコー
ドするｌａｃＺなどのマーカー遺伝子を含むとき、ベクターの存在はこれらと同
じアッセイ、またはマーカー蛋白（たとえばＸ−ｇａｌ）をスクリーニングする
特異的機能アッセイにより測定してもよい。宿主における本発明のベクターの持
続性も、トランスジーンを含むＡｄベクターの投与により起きた表現型の変化の
継続した観察により測定することができ、それらの変化にはたとえば嚢胞性線維
症患者にＣＦＴＲ遺伝子を含むベクターの投与に続く肺機能の改善もしくは安定
化、またはファブリー病患者の蓄積されたＧＬ３脂質の減少が挙げられる。肺活
量はＣＦ患者の肺機能試験（ＰＦＴ）に使用することができる。ＣＦ患者のベク
ター処理細胞における塩素イオンチャネルの回復の証明もトランスジーンＣＦＴ
Ｒの持続性を評価するために使用できる（Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１５０４−１５１１，１９９６）。
【００６５】
特記しない限り、本発明の実施には、慣用の組み換えＤＮＡ技術、蛋白化学、
微生物学およびウイルス学の方法を使用し、それらは当技術分野の技術の範囲内
である。かかる技術は文献で十分に説明されている。たとえば、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕ
ｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５を参照されたい。
微生物学およびウイルス学の方法を使用し、それらは当技術分野の技術の範囲内
である。かかる技術は文献で十分に説明されている。たとえば、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕ
ｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５を参照されたい。
【００６６】
本発明を以下の実施例により、さらに詳しく説明する。
【００６７】
実施例１：ｖＩＬ−１０、ＴＧＦβ、ＣＦＴＲおよびβｇａｌを含むＥ１／Ｅ ３欠失Ａｄベクター
ＡｄベクターはすべてＥ１欠失（Ａｄ２ヌクレオチド３５８−３３２８欠失）
およびＥ３欠失（Ａｄ２ヌクレオチド２７９７１−３０９３７欠失）である。ト
ランスジーン（ＣＦＴＲ、β−ガラクトシダーゼ（βｇａｌ））、α−ガラクト
シダーゼ、など）はＥ１欠失領域に挿入し、ＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０およびＴ
ＧＦβはＥ３−欠失領域に挿入する。両遺伝子はＣＭＶプロモーターにより駆動
する。図１から図６を参照されたい。すべてのベクターは野生型Ｅ２およびＥ４
領域を含むが、またＥ４欠失ももつ。
およびＥ３欠失（Ａｄ２ヌクレオチド２７９７１−３０９３７欠失）である。ト
ランスジーン（ＣＦＴＲ、β−ガラクトシダーゼ（βｇａｌ））、α−ガラクト
シダーゼ、など）はＥ１欠失領域に挿入し、ＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０およびＴ
ＧＦβはＥ３−欠失領域に挿入する。両遺伝子はＣＭＶプロモーターにより駆動
する。図１から図６を参照されたい。すべてのベクターは野生型Ｅ２およびＥ４
領域を含むが、またＥ４欠失ももつ。
【００６８】
プロモーター（たとえばＣＭＶまたはＣＭＶ由来プロモーター）に機能的な連
結をしたトランスジーン（たとえばＣＦＴＲまたはβｇａｌ）を含むトランスジ
ーン発現カセットにはポリＡシグナルが続く；かかるカセットを、Ｅ１領域の大
部分が欠失し、野生型Ｅ２およびＥ３領域並びにＥ４のオープンリーディングフ
レーム６（ＯＲＦ６）を保持したＡｄ２を基礎にしたベクターにクローニングす
る。トランスジーン発現カセットはＡｄ２ベクターのＥ１領域と置き換わる。こ
のベクターをＡｄ２／トランスジーンと呼ぶ。たとえば、Ｓｃａｒｉａ ｅｔ ａｌ．，、１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：７３０２−７３０９および米国仮
出願第６０／１３０，４１５号（これらを本明細書に参照として援用する）のＡ
ｄ２／ＣＦＴＲ−２およびＡｄ２／ＣＦＴＲ−５を参照されたい。
結をしたトランスジーン（たとえばＣＦＴＲまたはβｇａｌ）を含むトランスジ
ーン発現カセットにはポリＡシグナルが続く；かかるカセットを、Ｅ１領域の大
部分が欠失し、野生型Ｅ２およびＥ３領域並びにＥ４のオープンリーディングフ
レーム６（ＯＲＦ６）を保持したＡｄ２を基礎にしたベクターにクローニングす
る。トランスジーン発現カセットはＡｄ２ベクターのＥ１領域と置き換わる。こ
のベクターをＡｄ２／トランスジーンと呼ぶ。たとえば、Ｓｃａｒｉａ ｅｔ ａｌ．，、１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：７３０２−７３０９および米国仮
出願第６０／１３０，４１５号（これらを本明細書に参照として援用する）のＡ
ｄ２／ＣＦＴＲ−２およびＡｄ２／ＣＦＴＲ−５を参照されたい。
【００６９】
免疫調節遺伝子（ＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０またはＴＧＦβのいずれか）はＰ
ＣＲによりクローニングし、ＸｈｏｌおよびＮｏｔＩ制限部位を使用して発現カ
セットプラスミドｐＣＭＶ（図１０参照）に挿入する。それで免疫調節遺伝子は
ＣＭＶプロモーターのうしろにクローニングされ、ＳＶ４０ポリＡ配列を使用す
る。完全な発現カセットは、ユニークなＲｓｒＩＩ部位を使用してカセットの両
末端で切断し、Ａｄ２の右末端を含むアデノウイルスプラスミド、ｐＡｄ／Ｅ４
＋／Ｅ３Δ２．９（図１１参照）のＥ３Δ２．９欠失にクローニングする。この
プラスミドをつづいてＡｄ２／トランスジーン由来の消化したＤＮＡとコトラン
スフェクトすると、プラスミドとベクター間に相同組み換えが起き、トランスジ
ーンおよび免疫調節遺伝子をそれぞれのプロモーターから発現することができる
Ａｄ／トランスジーン／ＣＭＶ免疫調節遺伝子が得られる。
ＣＲによりクローニングし、ＸｈｏｌおよびＮｏｔＩ制限部位を使用して発現カ
セットプラスミドｐＣＭＶ（図１０参照）に挿入する。それで免疫調節遺伝子は
ＣＭＶプロモーターのうしろにクローニングされ、ＳＶ４０ポリＡ配列を使用す
る。完全な発現カセットは、ユニークなＲｓｒＩＩ部位を使用してカセットの両
末端で切断し、Ａｄ２の右末端を含むアデノウイルスプラスミド、ｐＡｄ／Ｅ４
＋／Ｅ３Δ２．９（図１１参照）のＥ３Δ２．９欠失にクローニングする。この
プラスミドをつづいてＡｄ２／トランスジーン由来の消化したＤＮＡとコトラン
スフェクトすると、プラスミドとベクター間に相同組み換えが起き、トランスジ
ーンおよび免疫調節遺伝子をそれぞれのプロモーターから発現することができる
Ａｄ／トランスジーン／ＣＭＶ免疫調節遺伝子が得られる。
【００７０】
実施例２：ｆａｓＬおよびｐ３５を含むＡｄベクター
マウスｆａｓリガンド（ｆａｓＬ）ｃＤＮＡはマウス精巣ｑｕｉｃｋ−ｃｌｏ
ｎｅ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）からＰＣＲによりクローニングし、ＸｈｏｌおよびＮｏｔＩ制限部位を使
用して、発現プラスミド、ｐＣＭＶに挿入する（図７）。それでｃＤＮＡはＣＭ
Ｖプロモーターのうしろにクローニングされて、ＳＶ４０ポリＡ部位を使用する
ようになる。完全発現カセットは、ユニークなＲｓｒＩＩ部位を使用してカセッ
トの両末端で切断し、ｐＡｄＥ１−Ｒと呼ばれる、Ｅ１欠失（Ａｄ２ヌクレオチ
ド３５８−３３２８欠失）、プレ−アデノウイルスプラスミドのＲｓｒＩＩ部位
にクローニングする。前記プレ−アデノウイルスプラスミドは蛋白ＩＸ遺伝子お
よびＥ２Ｂ配列を含むＡｄ２の左末端を含む。このプラスミドはその後Ａｄ２／
ＣＦＴＲ／ｐ３５（たとえば先に記載したベクター）ベクター由来の制限酵素切
断されたＤＮＡとコトランスフェクトすると、プラスミドとＡｄベクター間に相
同組み換えが起き、Ｅ１領域由来のｆａｓおよびＥ３領域由来のｐ３５を発現す
るＡｄ／ｆａｓＬ／ｐ３５が得られ、両遺伝子はＣＭＶプロモーターにより駆動
される（図７）。
ｎｅ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）からＰＣＲによりクローニングし、ＸｈｏｌおよびＮｏｔＩ制限部位を使
用して、発現プラスミド、ｐＣＭＶに挿入する（図７）。それでｃＤＮＡはＣＭ
Ｖプロモーターのうしろにクローニングされて、ＳＶ４０ポリＡ部位を使用する
ようになる。完全発現カセットは、ユニークなＲｓｒＩＩ部位を使用してカセッ
トの両末端で切断し、ｐＡｄＥ１−Ｒと呼ばれる、Ｅ１欠失（Ａｄ２ヌクレオチ
ド３５８−３３２８欠失）、プレ−アデノウイルスプラスミドのＲｓｒＩＩ部位
にクローニングする。前記プレ−アデノウイルスプラスミドは蛋白ＩＸ遺伝子お
よびＥ２Ｂ配列を含むＡｄ２の左末端を含む。このプラスミドはその後Ａｄ２／
ＣＦＴＲ／ｐ３５（たとえば先に記載したベクター）ベクター由来の制限酵素切
断されたＤＮＡとコトランスフェクトすると、プラスミドとＡｄベクター間に相
同組み換えが起き、Ｅ１領域由来のｆａｓおよびＥ３領域由来のｐ３５を発現す
るＡｄ／ｆａｓＬ／ｐ３５が得られ、両遺伝子はＣＭＶプロモーターにより駆動
される（図７）。
【００７１】
あるいは、トランスジーンは実施例１で記載したように、Ｅ１欠失領域に挿入
し、ｆａｓＬおよびｐ３５をコードする核酸は、トランスジーン、ｆａｓＬおよ
びｐ３５の３つをすべて同じＡｄベクター内に含むような、単一発現カセットと
してＥ３欠失領域に挿入する（図１２参照）。
し、ｆａｓＬおよびｐ３５をコードする核酸は、トランスジーン、ｆａｓＬおよ
びｐ３５の３つをすべて同じＡｄベクター内に含むような、単一発現カセットと
してＥ３欠失領域に挿入する（図１２参照）。
【００７２】
Ａｄ／ｆａｓＬ／ｐ３５またはＡｄ／トランスジーン／ｆａｓＬ／ｐ３５ベク
ターは、Ｅ１欠失Ａｄベクターを生成するために使用される通常の２９３細胞中
にて１０11Ｉ．Ｕ．／ｍｌの高い力価で産生される。
ターは、Ｅ１欠失Ａｄベクターを生成するために使用される通常の２９３細胞中
にて１０11Ｉ．Ｕ．／ｍｌの高い力価で産生される。
【００７３】
Ａｄ／ｆａｓＬ／ｐ３５またはＡｄ／トランスジーン／ｆａｓＬ／ｐ３５ベク
ターが感染細胞を殺すかどうかを測定するために、Ｐｒｏｍｅｇａから購入した
ＬＤＨキットを使用して、細胞致死アッセイを、ＣＶ−１細胞で行う。結果は図
８に示し、Ａｄ／ｆａｓＬ／ｐ３５ベクターは対照Ａｄ／ｆａｓＬベクターのよ
うに感染細胞を殺さないことを示す。
ターが感染細胞を殺すかどうかを測定するために、Ｐｒｏｍｅｇａから購入した
ＬＤＨキットを使用して、細胞致死アッセイを、ＣＶ−１細胞で行う。結果は図
８に示し、Ａｄ／ｆａｓＬ／ｐ３５ベクターは対照Ａｄ／ｆａｓＬベクターのよ
うに感染細胞を殺さないことを示す。
【００７４】
実施例３：Ａｄベクターに対する宿主耐性の誘導
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの感染のために、血液から骨髄前駆体細胞（ＣＤ３４＋）
を単離し、それらをＤＣｓに分化するように刺激することにより、ＤＣｓを骨髄
から精製してもよい。ＤＣｓは個体から単離し、Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１９６：１２１−１３５，１９９６およびＲｏ
ｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１９６：１３７−１
５１，１９９６に記載されたように培養する。
を単離し、それらをＤＣｓに分化するように刺激することにより、ＤＣｓを骨髄
から精製してもよい。ＤＣｓは個体から単離し、Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１９６：１２１−１３５，１９９６およびＲｏ
ｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１９６：１３７−１
５１，１９９６に記載されたように培養する。
【００７５】
回収したＤＣｓは次にｉｎ ｖｉｔｒｏで実施例１（図１から図６）で記載し
たような免疫抑制分子（ＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０および／またはＴＧＦβ）を
コードする核酸およびトランスジーン、または実施例２（図７）で記載したよう
なｆａｓＬ遺伝子およびｐ３５遺伝子のいずれかを含むＡｄベクターに感染して
もよい。
たような免疫抑制分子（ＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０および／またはＴＧＦβ）を
コードする核酸およびトランスジーン、または実施例２（図７）で記載したよう
なｆａｓＬ遺伝子およびｐ３５遺伝子のいずれかを含むＡｄベクターに感染して
もよい。
【００７６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＣｓにＡｄベクターを感染させるために、ＤＣｓはＡｄ
ベクターに対する５００の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）で１８から２４時間イン
キュベートする。感染したＤＣｓは、静脈内注射による感染宿主へのＤＣｓ複数
回投与による宿主の前処理のために使用できる。感染したＤＣｓを宿主に投与後
、ＤＣｓは脾臓のようなリンパ節に遊走し、Ｔ細胞と相互作用する。そのような
相互作用はＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０および／またはＴＧＦβを発現するＴ細胞
の免疫原性反応を抑制するか、またはｆａｓＬを発現するＴ細胞のアポトーシス
を誘発するであろう。ｐ３５はｆａｓ／ｆａｓＬ媒介経路による溶解からＤＣｓ
を保護するであろう。
ベクターに対する５００の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）で１８から２４時間イン
キュベートする。感染したＤＣｓは、静脈内注射による感染宿主へのＤＣｓ複数
回投与による宿主の前処理のために使用できる。感染したＤＣｓを宿主に投与後
、ＤＣｓは脾臓のようなリンパ節に遊走し、Ｔ細胞と相互作用する。そのような
相互作用はＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０および／またはＴＧＦβを発現するＴ細胞
の免疫原性反応を抑制するか、またはｆａｓＬを発現するＴ細胞のアポトーシス
を誘発するであろう。ｐ３５はｆａｓ／ｆａｓＬ媒介経路による溶解からＤＣｓ
を保護するであろう。
【００７７】
前処理後、生物学的に活性な分子をコードする同じトランスジーンを含むＡｄ
ベクターを任意の投与法により宿主に導入してもよく、投与法には、たとえば静
脈内、鼻腔内、筋肉内などがある。こうして生物学的に活性な分子をコードする
トランスジーンは免疫反応を起こさずに、または最小の免疫反応により、発現さ
れる。免疫反応を除去または軽減すると、最小化または除去された免疫反応によ
り、Ａｄベクターの反復投与および生物学的に活性な分子をコードするトランス
ジーンの持続的発現が可能になる。
ベクターを任意の投与法により宿主に導入してもよく、投与法には、たとえば静
脈内、鼻腔内、筋肉内などがある。こうして生物学的に活性な分子をコードする
トランスジーンは免疫反応を起こさずに、または最小の免疫反応により、発現さ
れる。免疫反応を除去または軽減すると、最小化または除去された免疫反応によ
り、Ａｄベクターの反復投与および生物学的に活性な分子をコードするトランス
ジーンの持続的発現が可能になる。
【００７８】
あるいは、免疫抑制分子（ＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０および／またはＴＧＦβ
）をコードする核酸、および先に記載した生物学的に活性な分子をコードするト
ランスジーン、またはｆａｓＬ遺伝子およびｐ３５遺伝子のいずれかを含むＡｄ
ベクターを、Ａｄベクターの皮内注射、または当技術分野で既知の投与法により
ＤＣｓをｉｎ ｖｉｖｏで感染させるために使用してもよい。そのように導入し
たＤＣｓは局所リンパ節へ遊走して、Ｔ細胞と相互作用する。同じトランスジー
ンをコードするＡｄベクターのその後の投与は先に記載したように行う。
）をコードする核酸、および先に記載した生物学的に活性な分子をコードするト
ランスジーン、またはｆａｓＬ遺伝子およびｐ３５遺伝子のいずれかを含むＡｄ
ベクターを、Ａｄベクターの皮内注射、または当技術分野で既知の投与法により
ＤＣｓをｉｎ ｖｉｖｏで感染させるために使用してもよい。そのように導入し
たＤＣｓは局所リンパ節へ遊走して、Ｔ細胞と相互作用する。同じトランスジー
ンをコードするＡｄベクターのその後の投与は先に記載したように行う。
【００７９】
実施例４：ＤｅＡｄベクター
本発明は、トランスジーンおよび免疫抑制分子（ＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０お
よび／またはＴＧＦβ）をコードする核酸を挿入する部分的に欠失したアデノウ
イルス（ＤｅＡｄ）ベクターの使用法も包含し、血清型２アデノウイルス（Ａｄ
２）由来のＤｅＡｄベクターの構築に関してさらに詳しく説明する。Ａｄ２Ｄｅ
Ａｄゲノムは、図１に示すような特色をもつベクターを得るために、慣用の分子
クローニング法（たとえば、本明細書に参照として援用した、Ａｕｓｕｂｅｌ，
Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７−１９９６，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ
．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（編），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．Ｏｘｆｏｒｄ
，Ｕ．Ｋ．Ｉ，ＩＩ巻 １９８５を参照されたい）を使用して修飾する。アデノ
ウイルスゲノムの３５８と６０３８間のヌクレオチド（ＧｅｎＢａｎｋから入手
できるＡｄ２のナンバリングと配列）はＥ１コード領域、ｐＩＸ遺伝子、ｐＩＶ
ａ２遺伝子、およびＭＬＰプロモーターを除去するために欠失させる。Ｅ２Ａコ
ード領域はヌクレオチド２２６６６から２３９６０を除去することにより欠失さ
せる；これはウイルスの対向鎖によりコードされた遺伝子に影響を与えずに、蛋
白コード領域の大部分だけでなく、Ｅ２Ａ蛋白コード配列の初めのＡＴＧを除去
する。Ｅ３領域はヌクレオチド２７９７１から３０９３７の除去により欠失させ
る；これはＥ３コード領域をすべて除去する。Ｅ４領域はヌクレオチド３２８１
５から３５９７７の除去により欠失させる；これはＥ４コード領域をすべて除去
する。これらの欠失により、ベクターのトランスジーンパッケージングサイズは
約１２ｋｂに増加する。ＤｅＡｄベクターゲノムは、ＭＬＰのかわりに、すなわ
ち、位置６０３８からほんの少し上流において、ダイマライザー制御プロモータ
ー、エクダイソン制御プロモーター、またはテトラサイクリン ドキシサイクリ
ン制御プロモーター（Ｆｏｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１ ４３ ：３２３０，１９９５）を配置することによりさらに修飾される（図９）。 実施例５：免疫調節分子およびＣＦＴＲトランスジーンをコードする核酸分子 、ヒトα−ガラクトシダーゼＡトランスジーン、ＥＰＯトランスジーン、ＩＸ因 子トランスジーン、ＶＩＩＩ因子トランスジーン、またはｌａｃＺリポーター遺 伝子を含むＤｅＡｄベクターの構築および受容細胞への遺伝子の移入 ＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０、ＴＧＦβおよびｆａｓＬをもつバキュロウイルス
ｐ３５のような免疫調節分子をコードする核酸、および嚢胞性線維症患者の細胞
に機能的ＣＦＴＲコード配列（Ｒｉｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４５：１０６６−１０７３，１９８９；米国特許第５，８７６，９７４号）
を移入するためのトランスジーンをコードする機能的ＣＦＴＲ、ヒトα−ガラク
トシダーゼＡ（たとえば、米国特許第５，５６８，５６７号；１９９８年１０月
２９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９８／２２８８６）をコードする核酸、エリス
ロポイエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸（米国特許第４，７０３，００８号）
、ＩＸ因子コード配列（米国特許第４，９９４，３７１号）、またはＢ鎖を持つ
、または持たないＶＩＩＩ因子コード配列（Ｔｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡ
Ｓ ＵＳＡ ８３：５９３９，１９８６）を含むＤｅＡｄベクターは、プロモー
ター、たとえば、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶ−由来プロモーター、ＰＧＫプロ
モーター、α−１アンチトリプシンプロモーター、Ｋ１９プロモーター、または
他の核酸（トランスジーンまたは免疫調節分子）発現に適したプロモーター、好
ましくはＣＭＶプロモーターに機能的な連結をした、適切な核酸（ＣＦＴＲ−を
コードするトランスジーン、α−ガラクトシダーゼＡ ＥＰＯ、ＩＸ因子または
ＶＩＩＩ因子）を、本明細書に参照として援用した、１９９９年４月３０日に出
願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９５９０に開示されているように、
ＤｅＡｄベクターの位置３５８の下流領域、または任意の他の適切なクローニン
グ部位に、慣用のクローニング法（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ｅ
ｄｓ．，１９８７−１９９６，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ
．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２版，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ
．Ｍ．（編），１９８５，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．Ｉ，
ＩＩ巻 ；または米国特許第５，６７０，４８８号，Ａｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２４０８−２４１６，１９９７，Ｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．４：４６１−４７６，１９９３，こ
れらのすべてを参照として本明細書に援用する）を使用してクローニングするこ
とにより構築する。
よび／またはＴＧＦβ）をコードする核酸を挿入する部分的に欠失したアデノウ
イルス（ＤｅＡｄ）ベクターの使用法も包含し、血清型２アデノウイルス（Ａｄ
２）由来のＤｅＡｄベクターの構築に関してさらに詳しく説明する。Ａｄ２Ｄｅ
Ａｄゲノムは、図１に示すような特色をもつベクターを得るために、慣用の分子
クローニング法（たとえば、本明細書に参照として援用した、Ａｕｓｕｂｅｌ，
Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７−１９９６，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ
．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（編），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．Ｏｘｆｏｒｄ
，Ｕ．Ｋ．Ｉ，ＩＩ巻 １９８５を参照されたい）を使用して修飾する。アデノ
ウイルスゲノムの３５８と６０３８間のヌクレオチド（ＧｅｎＢａｎｋから入手
できるＡｄ２のナンバリングと配列）はＥ１コード領域、ｐＩＸ遺伝子、ｐＩＶ
ａ２遺伝子、およびＭＬＰプロモーターを除去するために欠失させる。Ｅ２Ａコ
ード領域はヌクレオチド２２６６６から２３９６０を除去することにより欠失さ
せる；これはウイルスの対向鎖によりコードされた遺伝子に影響を与えずに、蛋
白コード領域の大部分だけでなく、Ｅ２Ａ蛋白コード配列の初めのＡＴＧを除去
する。Ｅ３領域はヌクレオチド２７９７１から３０９３７の除去により欠失させ
る；これはＥ３コード領域をすべて除去する。Ｅ４領域はヌクレオチド３２８１
５から３５９７７の除去により欠失させる；これはＥ４コード領域をすべて除去
する。これらの欠失により、ベクターのトランスジーンパッケージングサイズは
約１２ｋｂに増加する。ＤｅＡｄベクターゲノムは、ＭＬＰのかわりに、すなわ
ち、位置６０３８からほんの少し上流において、ダイマライザー制御プロモータ
ー、エクダイソン制御プロモーター、またはテトラサイクリン ドキシサイクリ
ン制御プロモーター（Ｆｏｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１ ４３ ：３２３０，１９９５）を配置することによりさらに修飾される（図９）。 実施例５：免疫調節分子およびＣＦＴＲトランスジーンをコードする核酸分子 、ヒトα−ガラクトシダーゼＡトランスジーン、ＥＰＯトランスジーン、ＩＸ因 子トランスジーン、ＶＩＩＩ因子トランスジーン、またはｌａｃＺリポーター遺 伝子を含むＤｅＡｄベクターの構築および受容細胞への遺伝子の移入 ＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０、ＴＧＦβおよびｆａｓＬをもつバキュロウイルス
ｐ３５のような免疫調節分子をコードする核酸、および嚢胞性線維症患者の細胞
に機能的ＣＦＴＲコード配列（Ｒｉｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４５：１０６６−１０７３，１９８９；米国特許第５，８７６，９７４号）
を移入するためのトランスジーンをコードする機能的ＣＦＴＲ、ヒトα−ガラク
トシダーゼＡ（たとえば、米国特許第５，５６８，５６７号；１９９８年１０月
２９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９８／２２８８６）をコードする核酸、エリス
ロポイエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸（米国特許第４，７０３，００８号）
、ＩＸ因子コード配列（米国特許第４，９９４，３７１号）、またはＢ鎖を持つ
、または持たないＶＩＩＩ因子コード配列（Ｔｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡ
Ｓ ＵＳＡ ８３：５９３９，１９８６）を含むＤｅＡｄベクターは、プロモー
ター、たとえば、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶ−由来プロモーター、ＰＧＫプロ
モーター、α−１アンチトリプシンプロモーター、Ｋ１９プロモーター、または
他の核酸（トランスジーンまたは免疫調節分子）発現に適したプロモーター、好
ましくはＣＭＶプロモーターに機能的な連結をした、適切な核酸（ＣＦＴＲ−を
コードするトランスジーン、α−ガラクトシダーゼＡ ＥＰＯ、ＩＸ因子または
ＶＩＩＩ因子）を、本明細書に参照として援用した、１９９９年４月３０日に出
願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９５９０に開示されているように、
ＤｅＡｄベクターの位置３５８の下流領域、または任意の他の適切なクローニン
グ部位に、慣用のクローニング法（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ｅ
ｄｓ．，１９８７−１９９６，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ
．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２版，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ
．Ｍ．（編），１９８５，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．Ｉ，
ＩＩ巻 ；または米国特許第５，６７０，４８８号，Ａｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２４０８−２４１６，１９９７，Ｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．４：４６１−４７６，１９９３，こ
れらのすべてを参照として本明細書に援用する）を使用してクローニングするこ
とにより構築する。
【００８０】
ＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０、ＴＧＦβおよびｆａｓＬをもつｐ３５のような、
免疫調節分子をコードする核酸、およびＣＦＴＲトランスジーンを含むＤｅＡｄ
ベクターは、本明細書に参照として援用した、１９９９年４月３０日に出願され
た国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９５９０に開示されているように、任意の
プロデューサー細胞株中で増殖させ、溶菌のような適切な方法により、細胞から
放出させ、本明細書に参照として援用した、Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７５−８３，１９９４に記載されているよう
に、ＣｓＣｌグラジエントにより精製する。ＤｅＡｄ／ＣＦＴＲベクターは宿主
を前処理するためにＤＣｓにより投与し、実施例３に記載したように前処理につ
づいて投与する。ｉｎ ｖｉｖｏ投与のためには、ＤｅＡｄ／ＣＦＴＲベクター
はエアゾールまたは他の局所投与法により適切な動物（たとえばコトンラット、
霊長類）または嚢胞性線維症患者の気道上皮細胞に投与する（たとえば、本明細
書に参照として援用した、米国特許第５，６７０，４８８号およびＺａｂｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｓｔ．９７：１５０４−１５１１，１９
９６を参照されたい）。
免疫調節分子をコードする核酸、およびＣＦＴＲトランスジーンを含むＤｅＡｄ
ベクターは、本明細書に参照として援用した、１９９９年４月３０日に出願され
た国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９５９０に開示されているように、任意の
プロデューサー細胞株中で増殖させ、溶菌のような適切な方法により、細胞から
放出させ、本明細書に参照として援用した、Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７５−８３，１９９４に記載されているよう
に、ＣｓＣｌグラジエントにより精製する。ＤｅＡｄ／ＣＦＴＲベクターは宿主
を前処理するためにＤＣｓにより投与し、実施例３に記載したように前処理につ
づいて投与する。ｉｎ ｖｉｖｏ投与のためには、ＤｅＡｄ／ＣＦＴＲベクター
はエアゾールまたは他の局所投与法により適切な動物（たとえばコトンラット、
霊長類）または嚢胞性線維症患者の気道上皮細胞に投与する（たとえば、本明細
書に参照として援用した、米国特許第５，６７０，４８８号およびＺａｂｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｓｔ．９７：１５０４−１５１１，１９
９６を参照されたい）。
【００８１】
処理細胞、動物および患者におけるＣＦＴＲトランスジーンの発現は、受容細
胞におけるベクター特異的ＣＦＴＲｍＲＮＡ転写物（たとえば、本明細書に参照
として援用した、Ｋａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．
８：４５−５６，１９９７を参照されたい）または表現型変化（機能的ＣＦＴＲ
により産生された機能的塩素イオンチャネルの存在によりモニターする）の測定
により検出する（米国特許第５，６７０，４８８号およびＺａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ｓｕｐｒａ，Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．８：６７１−６８０，１９９７，これらを本明細書に参照として援
用する）。
胞におけるベクター特異的ＣＦＴＲｍＲＮＡ転写物（たとえば、本明細書に参照
として援用した、Ｋａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．
８：４５−５６，１９９７を参照されたい）または表現型変化（機能的ＣＦＴＲ
により産生された機能的塩素イオンチャネルの存在によりモニターする）の測定
により検出する（米国特許第５，６７０，４８８号およびＺａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ｓｕｐｒａ，Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．８：６７１−６８０，１９９７，これらを本明細書に参照として援
用する）。
【００８２】
前記トランスジーンおよびＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０、ＴＧＦβおよびｆａｓ
Ｌをもつｐ３５のような免疫調節分子を含むＤｅＡｄベクターをトランスフェク
トした宿主細胞における、ＥＰＯ、ＩＸ因子およびＶＩＩＩ因子トランスジーン
の発現は、ＲＮＡ転写物および蛋白産生の検出を含む、当業者に既知の任意の方
法により検出してもよい。適切なトランスジーンの発現と関連した表現型の変化
を評価してもよい。たとえば、ＥＰＯの発現は患者におけるＲＢＣ産生の増大に
より測定する。ＩＸおよびＶＩＩＩ因子の発現は、患者の凝固性を測定すること
によりモニターする。
Ｌをもつｐ３５のような免疫調節分子を含むＤｅＡｄベクターをトランスフェク
トした宿主細胞における、ＥＰＯ、ＩＸ因子およびＶＩＩＩ因子トランスジーン
の発現は、ＲＮＡ転写物および蛋白産生の検出を含む、当業者に既知の任意の方
法により検出してもよい。適切なトランスジーンの発現と関連した表現型の変化
を評価してもよい。たとえば、ＥＰＯの発現は患者におけるＲＢＣ産生の増大に
より測定する。ＩＸおよびＶＩＩＩ因子の発現は、患者の凝固性を測定すること
によりモニターする。
【００８３】
同様に、免疫調節分子をコードする核酸およびβ−ガラクトシダーゼをコード
するｌａｃＺ遺伝子を含むＤｅＡｄベクターを作製する。標的細胞または組織へ
のＤｅＡｄ／ｌａｃＺベクター由来のｌａｃＺ遺伝子の効果的な遺伝子移入発現
は、本明細書に参照として援用した、Ａｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．７１：２４０８−２４１６，１９９７，Ｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，
Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．４：４６１−４７６，１９９３；米国特許第５，６
７０，４８８号に開示されているような、Ｘ−ｇａｌアッセイを使用して検出す
る。
するｌａｃＺ遺伝子を含むＤｅＡｄベクターを作製する。標的細胞または組織へ
のＤｅＡｄ／ｌａｃＺベクター由来のｌａｃＺ遺伝子の効果的な遺伝子移入発現
は、本明細書に参照として援用した、Ａｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．７１：２４０８−２４１６，１９９７，Ｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，
Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．４：４６１−４７６，１９９３；米国特許第５，６
７０，４８８号に開示されているような、Ｘ−ｇａｌアッセイを使用して検出す
る。
【００８４】
ＤｅＡｄ／αｇａｌＡベクターは、本明細書に参照として援用した、１９９９
年４月３０日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９５９０に開示さ
れているように、プロモーターに機能的に連結したヒトα−ガラクトシダーゼＡ
をコードするトランスジーンをＤｅＡｄベクターに挿入すること、およびプロモ
ーター（本明細書に記載した任意のプロモーターまたは他の適切なプロモーター
を任意の核酸の発現を駆動するために使用してもよい）に機能的に連結したＩＬ
−１０、ｖＩＬ−１０、ＴＧＦβおよびｆａｓＬをもつバキュロウイルスｐ３５
のような免疫調節分子をコードする異種核酸を挿入することにより構築する。酵
素的に活性なα−ガラクトシダーゼＡを産生するＤｅＡｄ／αｇａｌＡベクター
を感染させた、健常者およびファブリー病患者由来の線維芽細胞は、蛍光基質、
４−メチルウンベリフェリル（ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｎｅｌｌｉｆｅｒｙｌ）―α
―Ｄ−ガラクトピラノシド（４−ｍｕ−α−ｇａｌ）を使用して、細胞溶解産物
および消費した培地を分析してもよい。
年４月３０日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９５９０に開示さ
れているように、プロモーターに機能的に連結したヒトα−ガラクトシダーゼＡ
をコードするトランスジーンをＤｅＡｄベクターに挿入すること、およびプロモ
ーター（本明細書に記載した任意のプロモーターまたは他の適切なプロモーター
を任意の核酸の発現を駆動するために使用してもよい）に機能的に連結したＩＬ
−１０、ｖＩＬ−１０、ＴＧＦβおよびｆａｓＬをもつバキュロウイルスｐ３５
のような免疫調節分子をコードする異種核酸を挿入することにより構築する。酵
素的に活性なα−ガラクトシダーゼＡを産生するＤｅＡｄ／αｇａｌＡベクター
を感染させた、健常者およびファブリー病患者由来の線維芽細胞は、蛍光基質、
４−メチルウンベリフェリル（ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｎｅｌｌｉｆｅｒｙｌ）―α
―Ｄ−ガラクトピラノシド（４−ｍｕ−α−ｇａｌ）を使用して、細胞溶解産物
および消費した培地を分析してもよい。
【００８５】
本明細書に記載し、特許請求した本発明は本明細書に開示した特定の態様の適
用範囲に限定されない。なぜなら、これらの態様は本発明のいくつかの側面の説
明に関するものであるである。任意の同等の態様も本発明の適用範囲内にある。
実際、本明細書に示し、記載した修正に加え、本発明の各種修正は先の記載から
当業者には明らかになるであろう。かかる修正も付加した主張の適用範囲内に入
る。
用範囲に限定されない。なぜなら、これらの態様は本発明のいくつかの側面の説
明に関するものであるである。任意の同等の態様も本発明の適用範囲内にある。
実際、本明細書に示し、記載した修正に加え、本発明の各種修正は先の記載から
当業者には明らかになるであろう。かかる修正も付加した主張の適用範囲内に入
る。
【００８６】
本明細書には、各種参考文献を引用し、それらの開示をそのまま参照として援
用する。 本発明は添付した図面を参照することにより、さらによく理解できる。
用する。 本発明は添付した図面を参照することにより、さらによく理解できる。
【図１】 図１はＴＧＦβをコードするＡｄ２ベクターを示す。
【図２】 図２はＴＧＦβおよびＣＦＴＲをコードするＡｄ２ベクターを示す
。
。
【図３】 図３はＴＧＦβおよびｖＩＬ−１０をコードするＡｄ２ベクターを
示す。
示す。
【図４】 図４はｖＩＬ−１０をコードするＡｄ２ベクターを示す。
【図５】 図５はｖＩＬ−１０およびＣＦＴＲをコードするＡｄ２ベクターを
示す。
示す。
【図６】 図６はｖＩＬ−１０およびβｇａｌをコードするＡｄ２ベクターを
示す。
示す。
【図７】 図７はｆａｓＬおよびｐ３５をコードするＡｄ２ベクターを示す。
【図８】 図８はＬＤＨアッセイの結果を示す。
【図９】 図９はＤｅＡｄベクターゲノムを示す。
【図１０】 図１０はプラスミドｐＣＭＶのマップを示す。
【図１１】 図１１はプラスミドｐＡｄ／Ｅ４＋／Ｅ３Δ２．９のマップを示
す。
す。
【図１２】 図１２はトランスジーン、ｆａｓＬおよびｐ３５をコードするＡ
ｄ２ベクターを示す。
ｄ２ベクターを示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ａ６１Ｋ 37/48
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA01 BA07 BA21
BA31 CA01 DA02 EA02 FA02
FA15 FA20 GA11 HA17
4C084 AA02 AA13 BA44 DA01 DB01
DB52 DC01 DC14 DC15 DC16
MA01 MA17 MA66 NA06 NA13
NA14 ZB212
4C087 BC83 CA12 MA01 NA06 NA13
NA14 ZB21
Claims (18)
- 【請求項１】 少なくともアデノウイルスＥ１領域が欠失しているアデノウイ
ルスゲノムを含む組み換えアデノウイルスベクターであって、前記欠失に免疫修
飾分子をコードする少なくとも１つの異種核酸が挿入されており、この免疫修飾
分子をコードする異種核酸を抗原提示細胞に送達し、そこに免疫修飾分子をコー
ドする異種核酸を発現し、そして、前記患者の細胞由来の宿主免疫反応を軽減ま
たは除去する前記ベクター。 - 【請求項２】 免疫修飾分子をコードする異種核酸がバキュロウイルスｐ３５
，ｆａｓＬ／ＣＤ９５リガンド、ウイルスインターロイキン１０およびＴＧＦβ
の遺伝子からなる群から選択される請求項１に記載のベクター。 - 【請求項３】 生物学的に活性な分子をコードするトランスジーンをコードす
る異種核酸をさらに含む請求項１に記載のベクター。 - 【請求項４】 生物学的に活性な分子をコードするトランスジーンは、リソソ
ーム酵素、ホルモン、成長因子、サイトカイン、抗原、ＣＦＴＲ、α１−アンチ
トリプシン、アデノシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ、ｇｐ１００、ＭＡＲ
Ｔ−１およびＴＲＰ−２、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、ＶＩＩ因子およびＶｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の遺伝子からなる群から選択される、請求項３に記載
のベクター。 - 【請求項５】 免疫修飾分子をコードする異種核酸が発現制御配列に機能的に
連結している請求項１に記載のベクター。 - 【請求項６】 トランスジーンが発現制御配列に機能的に連結している請求項
３に記載のベクター。 - 【請求項７】 発現制御配列がサイトメガロウイルス即時早期プロモーターお
よびサイトメガロウイルス即時早期−由来プロモーターを含む請求項５または請
求項６に記載のベクター。 - 【請求項８】 アデノウイルスＥ３領域が欠失している請求項１に記載のベク
ター。 - 【請求項９】 免疫修飾分子をコードする２つの異種核酸を含み、１つはＥ１
領域の欠失に挿入され、他の１つはＥ３領域の欠失に挿入されている、請求項８
に記載のベクター。 - 【請求項１０】 Ｅ１領域の欠失に挿入されたｆａｓＬをコードする異種核酸
、およびＥ３領域の欠失に挿入されたバキュロウイルスｐ３５をコードする異種
核酸を含む請求項９に記載のベクター。 - 【請求項１１】 免疫修飾分子をコードする異種核酸およびトランスジーンを
含む請求項８に記載のベクター。 - 【請求項１２】 トランスジーン、ｆａｓＬをコードする異種核酸を含み、そ
してさらにバキュロウイルスｐ３５をコードする第３番目の異種核酸を含む請求
項１１に記載のベクター。 - 【請求項１３】 トランスジーンがＥ１領域の欠失に挿入され、そして免疫修
飾分子をコードする異種核酸がＥ３領域の欠失に挿入されている請求項１１に記
載のベクター。 - 【請求項１４】 抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項１に記載のベクター
。 - 【請求項１５】 少なくとも１つのアデノウイルス抗原および／またはトラン
スジーン生成物に対する耐性を宿主に誘導するための方法であって、（ａ）抗原
提示細胞に異種核酸を含む第１アデノウイルスベクターを感染させること（ここ
で前記異種核酸の遺伝子生成物は前記抗原提示細胞に接触したＴ細胞を抑制また
は溶解する）、（ｂ）宿主を前記アデノウイルスベクターに感染した抗原提示細
胞で前処理すること、および（ｃ）前記アデノウイルスベクターに感染した抗原
提示細胞で前処理した前記宿主に、生物学的に活性な分子をコードするトランス
ジーンを含む第２アデノウイルスベクターを投与し、前記第２アデノウイルスベ
クターに対する宿主免疫反応を最小化または除去することを含む前記方法。 - 【請求項１６】 請求項１４に記載の第１アデノウイルスベクターであって、
前記第１アデノウイルスベクターが請求項２−１３のベクターからなる群から選
択されるベクターである前記ベクター。 - 【請求項１７】 請求項１４に記載の第２アデノウイルスベクターであって、
前記第２アデノウイルスベクターが請求項１４に記載の第１アデノウイルスベク
ターに含まれるトランスジーンを含む前記ベクター。 - 【請求項１８】 ベクターのバックボーンがＤｅＡｄベクター、Ｅ１／Ｅ３欠
失アデノウイルスベクター、Ｅ１／Ｅ３／Ｅ４−欠失アデノウイルスベクターお
よびＰＡＶベクターからなる群から選択される、請求項１−１６に記載のベクタ
ー。
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|---|---|---|---|
| US13627899P | 1999-05-27 | 1999-05-27 | |
| US60/136,278 | 1999-05-27 | ||
| PCT/US2000/014344 WO2000073477A1 (en) | 1999-05-27 | 2000-05-25 | Methods for induction of tolerance to adenoviral vectors and transgene products |
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|---|---|
| JP2003501040A true JP2003501040A (ja) | 2003-01-14 |
Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001500789A Pending JP2003501040A (ja) | 1999-05-27 | 2000-05-25 | アデノウイルスベクターおよびトランスジーン生成物に対する耐性誘導の方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP2003501040A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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-
2000
- 2000-05-25 WO PCT/US2000/014344 patent/WO2000073477A1/en active Search and Examination
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- 2000-05-25 AU AU51616/00A patent/AU5161600A/en not_active Abandoned
Also Published As
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