JPH11500736A - 遺伝子治療ベクターを投与するための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 反復投与の際に、中和抗体の形成及び／またはベクターのＣＴＬ除去を抑制することのできる、治療導入遺伝子を保有しているウイルスベクター及び選択した免疫調節剤の共投与に関する、遺伝子治療中の免疫反応を減少させる方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子治療ベクターを投与するための方法及び組成物 本発明は、国立保険研究所助成番号ＤＫ４７７５７−０２及びＡＩ３４４１２ −０２により援助された。米国政府は、本発明におけるある種の権利を有する。発明の分野 本発明は、一般的に、遺伝子治療、及びより明確には、遺伝子治療において用 いられるウイルスベクターを投与する方法に関する。発明の背景 組み換えアデノウイルスは、多種多様な細胞型へのインビボ遺伝子導入のため の魅力的な媒体として現れた。即時型初期遺伝子Ｅ１ａ及びＥ１ｂの欠失により 複製能力を欠くようにされる第一世代ベクターは、非分裂の標的細胞に非常に効 率のよいインビボ遺伝子導入ができる［Ｍ．Ｋａｙ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 、９１：２３５３−２３５７（１９９４）；Ｓ．Ｉｓｈ ｉｂａｓｈi等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９２：８８３−８９３（１９ ９３）；Ｂ．Ｑｕａｎｔｉｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ 、８９：２５８１−２５８４（１９９２）；Ｍ．Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ等、Ｃｅ ｌｌ 、６８：１４３（１９９２）；Ｒ．Ｓｉｍｏｎ等、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈ ｅｒａ ．、４：７７１（１９９３）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２ ：４３１−４３４（１９９１）；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕ ｄｅｔ等、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１：２４１−２５６（１９９０）］ 。 ウイルスベクター、ベクターにより保有される導入遺伝子（ｔｒａｎ ｓｇｅｎｅ）、及びウイルスが感染した細胞に対するレシピエントの免疫反応は 、動物及びヒトへのこの技術の初期の応用において繰り返し起こる問題として生 じた［Ｙａｎｇ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６９：２００４−２０１５（１９９５） （Ｙａｎｇ Ｉ）］。肺へのそして肝臓への遺伝子治療を含む実質的に全てのモ デルにおいて、導入遺伝子の発現は、一時的あり、そして遺伝子導入部位での異 常の発生に関係する。 組み換えアデノウイルスからの導入遺伝子の発現の一時的な性質は、一つには 、ウイルスが感染した細胞に対して抗原特異的な細胞性免疫反応が起こり、そし てそれに続いて宿主がこれらを排除するためである。特に、第一世代ベクターは 、ベクターのＥ１ａ領域において欠失しているけれども、導入遺伝子に加えてウ イルスタンパク質を発現する。これらのウイルスタンパク質は、細胞障害性Ｔリ ンパ細胞（ＣＴＬ）を活性化する［Ｙ．Ｄａｉ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 、９２：１４０１−１４０５（１９９５）；Ｙ．Ｙａｎｇ等 、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：４４０７−４４１１ （１９９４）（Ｙａｎｇ II）；及びＹ．Ｙａｎｇ等、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１： ４３３−４４２（１９９４）（Ｙａｎｇ III）］。新しく合成されたウイルスタ ンパク質に対して誘導されたＣＴＬ及びウイルス特異的Ｔヘルパー細胞の協力［ Ｚａｂｎｅｒ等、Ｃｅｌｌ、７５：２０７−２１６（１９９３）；Ｃｒｙｓｔａ ｌ等、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、８：４２−５１（１９９４）］は、ウイルスが感 染した細胞の破壊を引き起こす。 導入遺伝子が、処理した宿主に対して異物であるタンパク質を発現する場合、 免疫がもたらすウイルスが感染した細胞の排除の他の抗原標的 は、導入遺伝子の産物であることができる。従って、ＣＴＬは、両方ともＭＨＣ クラスＩ分子により提示される導入遺伝子産物またはウイルスの合成したタンパ ク質に関連していくつかの場合において生じる活性化を伴う、標的細胞の破壊に おける重要なエフェクターである。これらの免疫反応はまた、最初の治療の２− ３週以内に、インビボの肝臓への遺伝子治療のレシピエントにおいて起こる、関 連した肝炎の発生を引き起こすことが示されている。 遺伝子治療に対する組み換えアデノウイルスの他の制限は、ウイルスの二回目 の投与の際に検出できる遺伝子導入を得ることの難しさであった。この制限は、 生涯にわたる遺伝的再構成を獲得するために反復治療が必要である、単一遺伝子 の先天性疾患または嚢胞性繊維症（ＣＦ）のような慢性的な疾病の治療において 特に問題がある。二回目の治療の後の減少した遺伝子導入は、ウイルスの静脈内 または気管内運搬の後の多種多様な動物モデルにおいて示されてきた［Ｔ．Ｓｍ ｉｔｈ等、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａ．、５：３９７（１９９３）；Ｓ．Ｙｅｉ等、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａ ．、１：１９２−２００（１９９４）；Ｋ．Ｋｏｚａｒｓ ｋｙ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：１３６９５（１９９４）］。各場 合において、反復遺伝子治療に対する耐性は、ウイルスの二回目の投与の後の成 功した遺伝子導入を妨げる中和抗アデノウイルス抗体の発生に関係する。 これらの問題に対する可能性のある解決法は、ＣＴＬの活性化を防ぐために、 新しく合成されるウイルスタンパク質の発現を減少させるように設計された第二 世代の組み換えウイルスの開発［Ｙ．Ｙａｎｇ等、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、７： ３６２−３６９（１９９４）（Ｙａｎｇ IV） ；及びＪ．Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ等、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａ．、５：１ ２１７（１９９４）］及び非免疫原性の導入遺伝子の使用に対して向けられてい る。 従って、ウイルス遺伝子治療における反復投与の間の遺伝子導入の効率を向上 するための方法及び組成物に対する当該技術分野におけ必要性が残っている。発明の要約 本発明は、治療を成し遂げるために用いられる組み換えウイルスベクターに対 する減少した免疫反応をもたらす、遺伝子治療法及びその際に使用するための組 成物を提供する。この方法は、ベクターがコードする抗原に対して誘導される中 和抗体反応の発生及び／またはウイルスタンパク質を含んでいる細胞の細胞溶解 性Ｔ細胞排除をかなり減少させる、選択された免疫調節剤を遺伝子治療ウイルス ベクターと共投与することに関する。この方法は、組み換えウイルスの再投与が 所望される場合に特に有用である。この方法により、免疫調節剤は、運ばれる導 入遺伝子を保有している組み換えウイルスベクターの前またはと同時に投与され ることができる。 本発明の他の特徴及び利点は、その好ましい態様の以下の詳細な説明において さらに記述される。図面の簡単な説明 図１Ａは、実施例２において記述されるように、０日にアデノウイルスを感染 させ、そして２８日に検死解剖したＣ５７ＢＬ−６マウスの気管支肺胞洗浄液（ ＢＡＬ）サンプル中に存在する中和抗体価を要約しているグラフである。コント ロールは、正常なマウス（「コントロール」） を表し、ＣＤ４ ｍＡＢは、ＣＤ４⁺細胞を枯渇させたマウスを表し、ＩＬ−１２ は、０及び＋１日にＩＬ−１２で処理したマウスを表し、そしてＩＦＮ−γは、 ０及び＋１日にＩＦＮ−γで処理したマウスを表す。データは、３回の独立した 実験に対する平均±１標準偏差として示される。 図１Ｂは、ＢＡＬサンプル中に存在するＩｇＧの相対量（ＯＤ₄₀₅）を要約し ているグラフである。記号は、図１Ａにおいて記述されたようである。 図１Ｃは、ＢＡＬサンプル中に存在するＩｇＡの相対量（ＯＤ₄₀₅）を要約し ているグラフである。記号は、図１Ａにおいて記述されたようである。 図２は、実施例４の動物に対して血清サンプルの逆数希釈として表される中和 抗体価を要約しているグラフである。マウスを表している記号は以下、すなわち 、０日にＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺでそして２８日でＨ５．０１０ＣＢＡＬＰ で感染させたＣ５７ＢＬ−６マウス（「Ｂ６マウス」）、０日にＵＶで不活性化 したＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺでそして２８日でＨ５．０１０ＣＢＡＬＰで感 染させたＣ５７ＢＬ−６マウス（「Ｂ６−ＵＶマウス」）、０日でＨ５．０１０ ＣＭＶｌａｃＺでそして２８日にＨ５．０１０ＣＢＡＬＰで感染させたＭＨＣク ラスII欠失マウス（「クラスII^-マウス」）、０日でＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃ Ｚ でそして２８日でＨ５．０１０ＣＢＡＬＰで感染させたβ２マイクログロブリ ン欠失マウス（「β２ｍ^-マウス」）、及びＧＫ１．５（抗−ＣＤ４）ｍＡｂで 処理し、そして０日でＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺでそして２８日でＨ５．０１ ０ＣＢＡＬＰで感染させたＣ５７ＢＬ−６マ ウス（「ＣＤ４Ａｂマウス」）のように記述される。 図３Ａは、０日にＨ５．０１０ＣＭＶＬＤＬＲをそして２１日にＨ５．０１０ ＣＭＶｌａｃＺを、そして４２日にＨ５．０１０ＣＢＡＬＰを尾の静脈中に注入 し、そして−３、０、及び３日に食塩水を投与したＣ５７ＢＬ／６マウスに対し て血清サンプルの逆数希釈として表される中和抗体価を要約しているグラフであ る。力値は、感染後の日数の関数として報告される。 図３Ｂは、０日にＨ５．０１０ＣＭＶＬＤＬＲをそして２１日にＨ５．０１０ ＣＭＶｌａｃＺを、そして４２日にＨ５．０１０ＣＢＡＬＰを尾の静脈中に注入 し、そして−３、０、及び３日に抗ＣＤ４ ｍＡｂ ＧＫ１．５を投与したＣ５７ ＢＬ／６マウスに対する図３Ａのものと同様のグラフである。 図３Ｃは、０日にＨ５．０１０ＣＭＶＬＤＬＲをそして２１日にＨ５．０１０ ＣＭＶｌａｃＺを、そして４２日にＨ５．０１０ＣＢＡＬＰを尾の静脈中に注入 し、そして−３、０、３、１８、２１、及び２４日に抗ＣＤ４ ｍＡｂ ＧＫ１． ５を投与したＣ５７ＢＬ／６マウスに対する図３Ａのものと同様のグラフである 。 図３Ｄは、２１日にＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺを、そして４２日にＨ５．０ １０ＣＢＡＬＰを尾の静脈中に注入し、そして−３、０、及び３日に抗ＣＤ４ ｍＡｂ ＧＫ１．５を投与したＣ５７ＢＬ／６マウスに対する図３Ａのものと同 様のグラフである。 図４Ａは、実施例６において記述されるように、サンプル希釈の関数として血 清サンプル中に存在するＩｇＧ１の相対量（ＯＤ₄₀₅）を要約しているグラフで ある。 図４Ｂは、実施例６において記述されるように、サンプル希釈の関数として血 清サンプル中に存在するＩｇＧ２ａの相対量（ＯＤ₄₀₅）を要約しているグラフ である。 図５は、実施例６Ｂの⁵¹Ｃｒ放出アッセイに対してエフェクター対標的比の関 数として、擬似感染させた（「ｍｏｃｋ」）そしてＨ５．０１０ＣＢＡＬＰ（「ＡＬＰ 」）で感染させたＣ５７ＳＶ細胞における特異的な溶解のパーセントを示 しているグラフである。Ｈ５．０１０ＣＢＡＬＰの投与後１０日目のＣ５７ＢＬ ／６マウス（「Ｂ６」）及びＩＬ−１２で処理したＣ５７ＢＬ／６（「Ｂ６＋Ｉ Ｌ１２」）マウスからの脾臓細胞を、５日間Ｈ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺでイン ビトロで再刺激した。 図６Ａは、実施例７のＢＡＬ（肺実験）において得られたＡｄ５に対する中和 抗体を与えている棒グラフである。列１における結果はＣ５７ＢＬ／６マウス（ コントロール）からであり、列２の結果は、ＣＤ４０Ｌ欠失ノックアウトマウス （ＣＤ４０Ｌ−ＫＯ）からであり、そして列３の結果は、ＣＤ４０Ｌ抗体（ＣＤ ４０Ｌ Ａｂ）で処理したＣ５７ＢＬ／６マウスからである。データは、３サン プルの平均中和抗体価＋／−１Ｓ．Ｄ．として示される。 図６Ｂは、実施例７の肝臓実験に対する血清から得られたデータを有する、図 ６Ａにおいて記述されたような棒グラフである。 図７Ａは、コントロールＣ５７ＢＬ／６マウス（開いた丸）及びＣＤ４０Ｌに 対する抗体で処理したＣ５７ＢＬ／６マウス（詰まった丸）から集められたリン パ細胞における特異的な溶解のパーセントを比較している折れ線グラフである。 ウイルスの投与後７日目に、リンパ細胞を５ 日間インビトロで再刺激し、そして６時間の⁵¹Ｃｒ放出アッセイにおいて擬似感 染させたＣ５７ＳＶ細胞における特異的な溶解に関して試験した。特異的な溶解 のパーセントは、異なるエフェクター対標的比（６：１、１２：１、２５：１、 及び５０：１）の関数として表される。脾臓細胞をこの肺実験のために用いた。 図７Ｂは、ウイルスを感染させたＣ５７ＳＶ細胞を用いた、図７Ａにおいて記 述されたような折れ線グラフである。 図７Ｃは、擬似感染させた細胞を用いた、図７Ａにおいて記述されたような折 れ線グラフである。縦隔リンパ節（ＭＬＮ）細胞をこれらの肝臓実験のために用 いた。 図７Ｄは、ウイルスを感染させた細胞を用いた、図７Ａにおいて記述されたよ うな折れ線グラフである。ＭＬＮ細胞をこれらの肝臓実験のために用いた。発明の詳細な記述 本発明は、動物またはヒトの遺伝子治療ウイルスベクターの投与に耐える能力 を向上するための方法及び組成物を提供する。本発明は、遺伝子治療に対する細 胞性及び体液性の両方の免疫防御に関与するＣＤ４⁺Ｔ細胞の活性化を一時的に 防ぐ方法を提供する。これらの方法は、遺伝子治療ベクターを与えられている個 体に対して、適当な量の好ましくは短時間作用形の免疫調節剤を投与することに 関する。この免疫調節剤は、好ましくは、遺伝子治療のために所望される治療導 入遺伝子を運ぶために用いられる遺伝子治療ベクター、すなわち、組み換えウイ ルスの投与と同時に投与される。免疫調節剤はまた、ベクターの投与の前または 後に投与されることもできる。 遺伝子治療ウイルスベクターに対する不都合な細胞性及び体液性免疫反応の発 生を防ぐ本発明の方法は、Ｔヘルパー細胞、特にＣＤ４機能、及びＢ細胞の活性 化を妨げるための免疫抑制に基づく。非特異的な免疫抑制剤の連続的な投与によ る長い間続く免疫抑制に関した従来の技術と対照的に、本発明は、免疫抑制に対 する一時的な方法を用いる。理論により縛られることを望まずに、発明者等は、 免疫活性化の主要な刺激物は組み換えベクターからのウイルスキャプシドタンパ ク質であると理論上想定する。そのような仮定において、長い間続く免疫抑制は 必要ない。特に、本発明による組み換えウイルスの投与時またはその近くでのＣ Ｄ４機能の一時的な除去は、中和抗体の形成を防ぎ、それにより、遺伝子治療ウ イルスベクターの少なくとも２回の次の投与後の効率のよい遺伝子導入を可能に する。 以下に示すように、本発明の方法による免疫調節剤の投与は、好ましくは、ウ イルスの投与時にのみ行われる。しかしながら、異なる遺伝子治療プロトコルに おいて抗原が提示される方法により、以下のマウスの肝臓及び／または肺への遺 伝子導入の実施例において必要であるより延長した免疫制御が必要とされ得る。 従って、本発明の一時的な免疫制御の方法は、ある状況において、長期間の免疫 抑制または他の免疫制御治療と組み合わされることができる。 Ｉ．免疫調節剤 本明細書において、選択される免疫調節剤は、組み換えウイルスベクターに対 して誘導される中和抗体の活性化Ｂ細胞による形成を妨げることができ、そして ／またはベクターの細胞溶解性Ｔリンパ細胞（ＣＴＬ）除去を防ぐことができる 試剤として定義される。免疫調節剤は、中和抗 体形成を防ぐためにＴヘルパーサブセット（Ｔ_H1またはＴ_H2）及びＢ細胞間の相 互作用を妨げるように選択されることができる。代わりに、免疫調節剤は、ベク ターのＣＴＬ除去の発生を減少させるためにＴ_H1細胞及びＣＴＬ間の相互作用を 妨げるように選択されることができる。より明確には、免疫調節剤は、望ましく は、ＣＤ４ Ｔ細胞の機能を妨げるまたは阻止する。 本発明による中和抗体形成を防ぐことにおける使用のための免疫調節剤は、ウ イルスベクターに対する反応において生産されるあらゆる中和抗体の免疫グロブ リンサブタイプの決定に基づいて選択されることができる。遺伝子治療ウイルス ベクターの投与に対する反応において生じる中和抗体は、しばしば、ウイルスの 正体、導入遺伝子の正体、ベクターを運ぶために何の媒体が用いられるか、及び ／またはウイルスベクター運搬のための標的位置または組織型による。 例えば、Ｔ_H2細胞は、通常、遺伝子治療中に投与された遺伝子の効率よい導入 を妨げる原因である。このことは、ウイルスベクターがアデノウイルスに基づい たものである場合に特に該当する。より詳細には、発明者等は、Ｔ_H2細胞及びＢ 細胞間の相互作用に依存するサブタイプＩｇＧ₁及びＩｇＡの中和抗体が、アデ ノウイルスベクターに対する主要な中和抗体の主なもとであるようであると決定 した。 特定の遺伝子治療組み換えウイルスベクターを投与することにより誘導される 中和抗体の正体は、動物実験において容易に決定される。例えば、実施例６を参 照。例えば、肺を経由したアデノウイルスベクターの投与は、通常、ＩｇＡ中和 抗体の生産を誘導し、一方、血液を経由したアデノウイルスベクターの投与は、 通常、ＩｇＧ₁中和抗体を誘導する。 これらの場合において、Ｔ_H2依存性免疫反応は、治療導入遺伝子を保有している アデノウイルスに基づいたウイルスベクターの導入を妨げる。 ウイルスベクターの投与により誘導される中和抗体が、ＩｇＡまたはＩｇＧ₁ のようなＴ_H2が仲介する抗体である場合、本法おける使用のために選択される免 疫調節剤は、望ましくは、Ｂ細胞とＴ_H2細胞の相互作用を抑制または防害する。 代わりに、誘導される中和抗体がＩｇＧ_2AのようなＴ_H1が仲介する抗体であると 見いだされる場合、免疫調節剤は、望ましくは、Ｂ細胞とＴ_H1細胞の相互作用を 抑制または防害する。ウイルスベクターのＣＴＬ除去の減少並びに中和抗体形成 の阻止が所望される場合、免疫調節剤は、インビトロでのウイルスベクターの延 長した耐性を可能にするためにＣＤ４⁺Ｔ_H1細胞を抑制または阻止する能力に関 して選択される。 免疫調節剤は、サイトカイン及びモノクローナル抗体を含む、可溶性または天 然に生じるタンパク質を含んでなることができる。免疫調節剤は、他の製薬を含 んでなることができる。加えて、本発明の免疫調節剤は、単独または互いに組み 合わせて用いられることができる。例えば、シクロホスファミド及びより特異的 な免疫調節剤抗ＣＤ４モノクローナル抗体が、共に投与されることができる。そ のような場合、シクロホスファミドは、Ｔ_H1活性化を阻止し、そして抗ＣＤ４ ＭＡｂ処理により誘導される一時的な免疫遮断の期間を越えて導入遺伝子発現を 安定させる試剤として働く。 選択した免疫調節剤の適した量または服用量は、主に、調節剤の正体、患者に 最初に投与される導入遺伝子を保有している組み換えベクターの量、並びにべク ターの運搬の方法及び／または部位による。これらの因 子は、本明細書において記述される方法を用いて、当該技術分野において熟練し た者により実験的に評価されることができる。患者の治療される状態、年齢、体 重、一般的な健康、及び免疫状態のような他の二次的な因子もまた、本発明によ る遺伝子治療ベクターと共に患者に与えられる免疫調節剤の服用量を決定する際 に医師により考慮されることができる。 通常、例えば、治療的に有効なヒト服用量のタンパク質免疫調節剤、例えば、 ＩＬ−１２またはＩＦＮ−γが、約１ ｘ １０⁷ｐｆｕ／ｍｌウイルスベクター 当たり約０．５μｇから約５ｍｇまでの範囲において投与される。様々な服用量 が、あらゆる不都合な副作用と治療利点を比較検討するために、当該技術分野に おいて熟練した者により決定されることができる。 Ａ．モノクローナル抗体及び可溶性タンパク質 好ましくは、遺伝子治療ベクターに対する不都合な免疫反応を防ぐ方法は、Ｃ Ｄ４⁺細胞の非特異的な不活性化に関する。一つのそのような方法は、適当なモ ノクローナル抗体を投与することを含んでなる。好ましくは、そのような阻止抗 体は、レシピエントが阻止抗体に対する免疫反応を高めるのを防ぐように「ヒト 化」される。「ヒト化抗体」は、非ヒトドナーの免疫グロブリン由来の相補性決 定領域（ＣＤＲｓ）、並びに／あるいはＬ及び／またはＨ可変領域構成部の他の 部分を有し、分子の残りの免疫グロブリン由来の部分が、一つまたはそれより多 いヒト免疫グロブリンに由来する抗体をいう。そのような抗体はまた、ドナーま たはアクセプターの被修飾Ｌ鎖またはキメラのＬ鎖と結合したヒト化したＨ鎖、 あるいはその逆により特徴づけられた抗体も含むことができる。 そのような「ヒト化」は、当該技術分野において既知の方法により達成されるこ とができる。例えば、本明細書の参考文献により含まれる、Ｇ．Ｅ．Ｍａｒｋ及 びＥ．Ａ．Ｐａｄｌａｎ、「第４章 Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎ ｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、第１１３巻、Ｓｐｒｉ ｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、１０５−１３３頁を 参照。 他の適当な抗体は、細胞表面のＣＤ４に対して誘導された抗体のようなＣＤ４⁺ 細胞を特異的に阻害または枯渇させるものを含む。ＣＤ４⁺細胞の枯渇は、ウイ ルスベクターのＣＴＬ除去を防ぐことが発明者等により示されている。そのよう な調節剤は、抗−ＯＫＴ３＋［例えば、米国特許番号第４，６５８，０１９号； 欧州特許出願番号第５０１，２３３号、１９９２年９月２日公表、を参照］のよ うな抗Ｔ細胞抗体を含むが、これらに制限されない。ＣＤ４⁺細胞を枯渇させる ために市販されている抗体ＧＫ１．５（ＡＴＣＣ受託番号ＴＩＢ２０７）を用い る、以下の実施例２を参照。 代わりに、Ｔ_H細胞によるＢ細胞の活性化のために必要な相互作用、従って中 和抗体の生産を妨げるまたは阻止するあらゆる薬剤が、本発明の方法の免疫調節 剤として有用である。例えば、Ｔ細胞によるＢ細胞の活性化は、Ｂ細胞上のＣＤ ４０抗原へのＴヘルパー細胞上のＣＤ４０リガンドの結合、並びにＢ細胞上のＢ ７抗原へのＴ細胞上のＣＤ２８及び／またはＣＴＬＡ４リガンドの結合のような ある種の相互作用が起こることを必要とする［Ｆ．Ｈ．Ｄｕｒｉｅ等、Ｉｍｍｕ ｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ 、１５（９）：４０６−４１０（１９９４）］。両方の相互 作用なし に、Ｂ細胞は、中和抗体の生産を誘導するように活性化されることはできない。 ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）−ＣＤ４０相互作用は、Ｔヘルパー細胞の活 性化及び機能の両方におけるその広い活性、並びにそのシグナリング経路におけ る重複がないために、遺伝子治療ベクターに対する免疫反応を阻止するための望 ましい地点である。従って、本発明の一般に好ましい方法は、アデノウイルスベ クターの投与時にＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの相互作用を一時的に阻止することに関 する。このことは、Ｔ_H細胞上のＣＤ４０リガンドをふさぎ、Ｂ細胞上のＣＤ４ ０抗原とＴヘルパー細胞上のＣＤ４０リガンドの正常な結合を妨げる試剤で処理 することにより達成されることがてきる。ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０の相互作用を阻 止することは、導入遺伝子の安定性及び再投与に関する問題に寄与するＴヘルパ ー細胞の活性化を防ぐ。 従って、ＣＤ４０リガンドに対する抗体（抗ＣＤ４０Ｌ）［Ｂｒｉｓｔｏｌ− Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏから入手できる；例えば、欧州特許出願第５５ ５，８８０号、１９９３年８月１８日公表を参照］または可溶性のＣＤ４０分子 が、本発明の方法において選択される免疫調節剤であることができる。 代わりに、Ｔヘルパー細胞上に存在するＣＤ２８及び／またはＣＴＬＡ４リガ ンドをふさぐ試剤は、Ｂ細胞上の抗原Ｂ７とこれらのリガンドの正常な結合を妨 げる。従って、Ｂ７の可溶性型またはＣＤ２８もしくはＣＴＬＡ４に対する抗体 、例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ［Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃ ｏから入手できる；例えば、欧州特許出願第６０６，２１７号、１９９４年７月 ２０日公表を参照］］が、 本発明の方法において選択される免疫調節剤であることができる。この方法は、 異種抗原に対する細胞性及び体液性の両方の免疫反応に向けられるので、以下に 記述されるＴ_H2活性化を防ぐためのサイトカインの投与より優れた利点を有する 。 Ｂ．サイトカイン Ｔ_H細胞機能を阻害するさらに他の免疫調節剤が、本発明の方法において用い られることができる。 従って、一つの態様において、ＣＤ４⁺Ｔヘルパー細胞のＴ_H1サブセットの機 能を選択的に阻害する本法における使用のための免疫調節剤が、ウイルスベクタ ーの最初の投与時に投与されることができる。一つのそのような免疫調節剤は、 インターロイキンー４（ＩＬ−４）である。IＬ−４は、Ｔ_H1細胞機能を犠牲に して、Ｔ_H2細胞の抗原特異的活性を増大する［例えば、Ｙｏｋｏｔａ等、Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ 、８３：５８９４−５８９８（１９ ８６）；米国特許番号第５，０１７，６９１号を参照］。Ｔ_H1細胞機能を阻害で きる他の免疫調節剤もまた、本発明の方法において有用であることが予見される 。 他の態様において、免疫調節剤は、Ｔヘルパー細胞のＴ_H2サブセットの活性化 を防ぐサイトカインであることができる。この方法の成功は、Ｔ_H2依存性Ｉｇイ ソタイプがウイルス中和において果たす相対的な寄与により決まり、そしてその 概要は、株、動物の種類、並びにウイルス運搬の方法及び標的器官により影響さ れ得る。 ウイルスベクターの最初の投与時にＣＤ４⁺Ｔ細胞サブセットＴ_H2機能を選択 的に阻害する本法における使用のための望ましい免疫調節剤は、インターロイキ ン−１２（ＩＬ−１２）を含む。ＩＬ−１２は、Ｔ_H2細 胞機能を犠牲にして、Ｔ_H1細胞の抗原特異的活性を増大する［例えば、欧州特許 出願番号第４４１，９００号；Ｐ．Ｓｃｏｔｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０：４９ ６−４９７（１９９３）；Ｒ．Ｍａｎｅｔｔｉ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７ ７ ：１１９９（１９９３）；Ａ．Ｄ’Ａｎｄｒｅａ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７６ ：１３８７（１９９２）を参照］。本発明における使用のためのＩＬ−１ ２は、好ましくは、タンパク質の形態にある。ヒトＩＬ−１２は、既知の技術を 用いて組み換え体として作られることができ、または購入されることができる。 代わりに、ＩＬ−１２は、（場合によっては、導入遺伝子を発現するために用い られるものと同じであることができる）ウイルスベクター中に設計され、インビ ボまたはエクスビボで標的細胞中において発現されることができる。 ＩＬ−１２でのＴ_H2特異的除去は、ＩｇＡが中和抗体の主な源である肺への遺 伝子治療において特に効果的である。肝臓への遺伝子治療においては、Ｔ_H1及び Ｔ_H2細胞の両方がウイルス特異的抗体の生産に寄与する。しかしながら、中和抗 体の全量は、ＩＬ−１２で減少されることができる。 同様の機能を果たす他の選択される免疫調節剤は、γ−インターフェロン（Ｉ ＦＮ−γ）である［Ｓ．Ｃ．Ｍｏｒｒｉｓ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２： １０４７−１０５６（１９９４）；Ｆ．Ｐ．Ｈｅｉｎｚｅｌ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ ｅｄ ．、１７７：１５０５（１９９３）］。ＩＦＮ−γは、活性化マクロファー ジ及びＴヘルパー細胞の分泌を介して、多数のＩＬ−１２の生物学的効果をもた らすと思われている。ＩＦＮ−γはまた、ＩＬ−４が刺激するＴ_H2の活性化を部 分的に阻害する。ＩＦＮ−γはまた、様々な市販品から得られることができる。 代わりに、ＩＦＮ−γは、既知の遺伝子工学技術を用いて、ウイルスベクター 中に設計され、インビボまたはエクスビボで標的細胞中において発現されること ができる。 好ましくは、そのようなサイトカイン免疫調節剤は、ヒト組み換えタンパク質 の形態にある。これらのタンパク質は、当該技術分野において存在する方法によ り作られることができる。中和抗体がＴ_H2によりもたらされる場合、これらのタ ンパク質のＴ_H2阻害機能を共有する、ＩＬ−１２またはγ−インターフェロンの ような、本明細書において記述された既知の免疫調節剤の活性ペプチド、フラグ メント、サブユニット、または類似体もまた、本法において有用である。 以下の実施例において示されるように、（ＩＦＮ−γを分泌するようにＴ_H1細 胞を活性化する）サイトカインＩＬ−１２及びＩＦＮ−γは、体液性免疫のみを 除去する（すなわち、これらはＴ_H2分化を阻害する）ことが示される。ウイルス 注入時にいずれかのサイトカインを共に投与することは、ＩｇＡの形成を防ぎ、 そしてウイルスの効率よい再投与を可能にする。 肝臓への遺伝子治療における効率よいウイルスの二回目の投与を可能にするた めに、本法は、好ましくは、一つ以上のサイトカインの投与、特定の投薬計画、 及び／または一つもしくはそれより多い上に説明した抗体のような付加的な免疫 調節剤の共投与を含んでなる。サイトカインは天然の生産物であり、従って、そ れらが投与される患者においていかなる不都合な免疫反応も生じないと思われる ので、サイトカインの使用は有益である。 Ｃ．他の製薬 免疫機能を非特異的に阻害する他の免疫調節剤または試剤、すなわち、サイク ロスポリンＡまたはシクロホスファミドもまた、本発明の方法において用いられ ることができる。例えば、短いクールのシクロホスファミドは、肝臓へのウイル ス運搬時のアデノウイルスキャプシドタンパク質に対するＣＤ４及びＣＤ８の両 方のＴヘルパー細胞の活性化をうまく妨げることが示されている。その結果、導 入遺伝子の発現は引き延ばされ、そしてより多い服用量で中和抗体の形成が防が れ、成功したベクターの再投与が可能であった。肺においては、シクロホスファ ミドは、全ての服用量で中和抗体の形成を防ぎ、多い服用量て導入遺伝子の発現 を安定化した。 II．ウイルスベクター 遺伝子治療において有用である適当なウイルスベクターは、よく知られており 、特に、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノウイ ルス、及びアデノ関連ウイルスを含む。本発明の方法は、遺伝子治療ベクターの 基礎を形成するあらゆるウイルスで有用であると期待される。しかしながら、本 発明の方法における使用のための典型的なウイルスベクターは、アデノウイルス ベクター［例えば、Ｍ．Ｓ．Ｈｏｒｗｉｔｚ等、「Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、 １７１２頁、ｅｄ．Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ等、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）；Ｍ．Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ等、Ｃｅｌｌ、６ ８ ：１４３−１５５（１９９２）；Ｊ．Ｆ．Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ等、Ｈｕｍａ ｎ Ｇｅｎｅｔ．Ｔｈｅｒ ．、４：７５９−７６９（１９９３）；Ｙａｎｇ IV ；Ｊ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：６９１− ６９２（１９９３年、１０月）；Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ」中、ｅｄ．Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ、ＣＲＣ Ｐ ｒｅｓｓ、１５５−１６８頁（１９９０）参照］である。 特に望ましいのは、Ｅ１ａ及びＥ１ｂをコードする初期遺伝子座を欠失するこ とにより遺伝子治療のために複製能力を欠くようにされた、血清型Ａｄ２及びＡ ｄ５を含むヒトＣ型アデノウイルス（Ａｄ）である。遺伝子治療におけるＥ１欠 失アデノウイルスの使用に関して多数発表されている。Ｋ．Ｆ．Ｋｏｚａｒｓｋ ｙ及びＪ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．、３ ：４９９−５０３（１９９３）を参照。Ａｄ５型［ジーンバンク登録番号Ｍ７３ ２６０］を含む、多数のアデノウイルス型のＤＮＡ配列が、ジーンバンクから入 手できる。アデノウイルスの配列は、現在同定された４１のヒト型［Ｈｏｒｗｉ ｔｚ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｒａｖｅｎ Ｐｒ ｅｓｓ、Ｌｔｄ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）］を含む、あらゆる既知のア デノウイルス型から得られることができる。様々なアデノウイルス株が、Ａｍｅ ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉ ｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄから入手でき、または様々な市販及び研究所の供給者 から請求により入手できる。以下の態様において、アデノウイルス５型（Ａｄ５ ）が便宜上用いられる。 ウイルスの型、例えば、アデノウイルス、及び株を含む、組み換えベクターを 設計するために有用なウイルスの選択は、以下の発明を制限すると予想されない 。 同様に、ウイルスベクター内に含まれる導入遺伝子の選択は、本発明の制限で はない。本法は、あらゆる導入遺伝子で有用であると期待される。遺伝子治療の ためのウイルスベクター中の患者への運搬のために適した導入遺伝子は、当該技 術分野において熟練した者により選択されることができる。これらの治療核酸配 列は、典型的には、先天性のまたは非先天性の遺伝的欠陥を置き換えまたは修正 するか、あるいは後成疾患または疾病を治療するための、インビボまたはエクス ビボでの患者における投与及び発現のための産物をコードする。遺伝子治療の遂 行のために望ましいそのような治療遺伝子は、制限なしに、家族性高コレステロ ール血症または家族性複合（ｃｏｍｂｉｎｅｄ）高脂肪血症の治療のための超低 密度リポタンパク質レセプター遺伝子（ＶＬＤＬ−Ｒ）、嚢胞性繊維症の治療の ための嚢胞性繊維症膜貫通調節遺伝子（ＣＦＴＲ）、デュシェンヌ型筋ジストロ フィーの治療のためのＤＭＤベッカー対立遺伝子、及び特定の疾患または疾病を 治療するために当該技術分野において熟練した者により容易に選択されることが できる多数の他の遺伝子を含む。従って、そのような選択は当該技術分野におい て熟練した者の知識内であるので、導入遺伝子の選択は本発明の制限であると考 えられない。 治療遺伝子を保有しているウイルスベクターは、好ましくは、生物学的に適合 する溶液または製薬学的に受容しうる運搬媒体中に懸濁されて患者に投与される ことができる。適当な媒体は、滅菌した食塩水を含む。製薬学的に受容しうる担 体であると知られた、そして当該技術分野において熟練した者によく知られた他 の水性及び非水性の等張の滅菌注入溶液、並びに水性及び非水性の滅菌懸濁液が 、この目的のために用いられ ることができる。 ウイルスベクターは、医学の当該技術分野において熟練した者により決定され ることのできる過度に不都合でないかまたは医学的に受容しうる生理学的効果を 有する治療利益を提供するために、所望する細胞をトランスフェクトし、そして 選択した導入遺伝子の十分なレベルの形質導入及び発現を与えるために十分な量 において投与される。通常のそして製薬学的に受容しうる投与経路は、標的器官 、組織、または部位への直接運搬、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経口、 及び他の非経口投与経路を含む。所望される場合、投与経路は、組み合わされる ことができる。 ウイルスベクターの服用量は、主に、治療される状態、選択される遺伝子、患 者の年齢、体重、及び健康のような因子により決まり、従って、患者間で変わり 得る。例えば、ウイルスベクターの治療的に有効なヒト服用量は、通常、約１ ｘ １０⁷から１ ｘ １０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌまでのウイルス濃度を含む約２０から約 ５０ｍｌまでの食塩水溶液の範囲である。好ましい成人ヒト服用量は、上の濃度 で約２０ｍｌの食塩水溶液である。服用量は、あらゆる副作用と治療利益を比較 検討して調整される。選択した遺伝子の発現レベルは、服用量投与の選択、調整 、または頻度を決定するためにモニターされることができる。 III．本発明の方法 本発明の方法は、選択した組み換えウイルスベクターと選択した免疫調節剤の 共投与に関する。この共投与は、免疫調節剤及びベクターが互いにごく接近した 時間内に投与されるように起こる。現在、ベクターの投与と同時に、またはその 前１ないし３日以内に調節剤を投与すること が好ましい。免疫調節剤は、組み換えベクターと別個に投与されることができ、 または所望される場合、組み換えベクターと混合して投与されることができる。 以下の実施例において示されるように、免疫調節剤は、それが抗ＣＤ４０Ｌ抗 体、抗ＣＤ４抗体、またはサイトカインであろうと、望ましくは、遺伝子治療の ために用いられるウイルスベクターの投与にごく接近した時において投与される 。特に、ＩＬ−１２またはＩＦＮ−γの投与は、約２−３日間Ｔ_H2細胞レベルの 減少を引き起こす。それ故、ＩＬ−１２及び／またはＩＦＮ−γは、望ましくは 、運ばれる遺伝子を保有しているウイルスベクターの投与の日のうちに投与され る。しかしながら、好ましくは、ＩＬ−１２及び／またはＩＦＮ−γは、本質的 に、ウイルスベクターと同時に投与される。 免疫調節剤は、食塩水のような製薬学的に受容しうる担体または希釈剤中にお いて投与されることができる。例えば、ウイルスベクターと別個に処方される場 合、免疫調節剤は、望ましくは、食塩水溶液中に懸濁される。そのような溶液は 、通常の成分、例えば、ｐＨ調整剤、防腐剤などを含むことができる。そのよう な成分は既知であり、そして当該技術分野において熟練した者により容易に選択 されることができる。 代わりに、免疫調節剤は、ベクターと別個にまたは導入遺伝子を保有している 組み換えベクターと混合して、ＤＮＡとしてそれ自体投与されることができる。 タンパク質としてまたはＤＮＡとしての調節剤の製薬学的調製方法は、当該技術 分野において存在する［例えば、ＤＮＡワクチンに関するＪ．Ｃｏｈｅｎ、Ｓｃ ｉｅｎｃｅ 、２５９：１６９１−１６９２（１９９３）を参照］。望ましくは、 免疫調節剤は、組み換えベ クターと同じ経路により投与される。 免疫調節剤は、患者に投与されるウイルスベクターを含んでいる組成物中に直 接処方されることができる。代わりに、免疫調節剤は、別個に、好ましくは、ウ イルスベクターの投与のすぐ前または後に投与されることができる。他の可能な 選択において、投与される免疫調節剤の数により、ＩＬ−１２のような一つの免 疫調節剤を含んでいる組成物が、抗ＣＤ４０Ｌ抗体のような２つ目の免疫調節剤 を含んでいる組成物と別個に投与されることができるなどである。これらの投与 は、独立して、ウイルスベクターの投与の前、と同時、または後であることがで きる。 選択した免疫調節剤の投与は、（導入遺伝子発現またはその意図された効果を 検出するアッセイによりモニターされるように）導入遺伝子が発現される期間の 間、導入遺伝子を保有している組み換えウイルスベクターでの治療中、または組 み換えベクターのあらゆるブースターと共に繰り返されることができる。代わり に、同じウイルスベクターの各再注入が、異なる免疫調節剤を用いることができ る。 本発明の方法の一つの利点は、それが遺伝子治療ベクターの投与時にのみ必要 な一時的な操作を表すことである。この方法は、レシピエントのウイルス感染に 対して反応する能力を永久的に損ない得る耐性の誘導に基づく方法より安全であ ると期待される。 さらに、一時的な免疫制御は選択的である（すなわち、体液性反応はＴ_H1機能 に依存するので、ＣＴＬが介在する反応は保持される）ので、上記のサイトカイ ンまたは抗体のような免疫調節剤の好ましい使用は、（全般的な免疫抑制を引き 起こす）サイクロスポリンまたはシクロホスファミドのような試剤の使用より安 全であると期待される。 本発明の方法による効率よい遺伝子導入の一つの例において、選択される免疫 調節剤は、T_H1細胞の選択的な誘導を引き起こすＩＬ−１２及び／またはＴ_H2細 胞の誘導を抑制するＩＦＮ−γである。他の好ましい免疫調節剤は、Ｔ_H1細胞を 枯渇させ、ベクターのＣＴＬ除去を減少させる抗ＣＤ４⁺抗体、ＧＫ１．５であ る。さらに他の好ましい免疫調節剤は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから入手できる、抗 ＣＤ４０リガンドモノクローナル抗体、ＭＲ１である。 以下に例示されるように、上に同定した免疫調節剤の使用は、効率よい遺伝子 導入並びに同じウイルスベクターの繰り返された使用を可能にした。アルカリホ スファターゼ（「ＡＬＰ」）導入遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（「ｌａｃＺ」 ）導入遺伝子、または低密度リポタンパク質レセプター（「ＬＤＬＲ」）導入遺 伝子のいずれかを含んでいるアデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療に関連 して。 以下の実施例は、本発明の遺伝子治療法において有用である適当なウイルスベ クターの好ましい調製方法を示す。これらの実施例は、例証であるだけであり、 本発明の範囲を制限しない。実施例１−典型的な組み換えアデノウイルスベクターの構築及び精製 組み換えアデノウイルスＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺを以下のように構築した 。アデノウイルスの地図単位０−１、及びそれに続くサイトメガロウイルスのエ ンハンサー／プロモーター［Ｂｏｓｈａｒｔ等、Ｃｅｌｌ、４１：５２１−５３ ０（１９８５）］、大腸菌のβ−カラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、ポリＡ シグナル（ｐＡ）、アデノウイルス５の地図単位９．２−１６（Ａｄ ９．２− １６）、並びに複製起点及 びアンピシリン耐性遺伝子を含む一般的なプラスミド配列を含む［Ｋｏｚａｒｓ ｋｙ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９（１８）：１３６９５−１３７０２ （１９９４）において記述された］プラスミドｐＡｄ．ＣＭＶｌａｃＺを用いた 。ｐＡＤ．ＣＭＶｌａｃＺをＮｈｅＩで直鎖状にし、以前記述された［Ｋ．Ｆ． Ｋｏｚａｒｓｋｙ、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１９： ４４９−４５８（１９９３）及び上に引用されたＫｏｚａｒｓｋｙ（１９９４） ］ようにＸｂａＩ及びＣｌａＩで消化した（アデノウイルス５型由来の）ｓｕｂ ３６０ ＤＮＡと共に２９３細胞［ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３］に同時にトランス フェクトした。得られた組み換えウイルス、Ｈ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺは、Ａ ｄ５ ｓｕｂ３６０バックボーンから７８．５ないし８４．３ｍｕでＥ３遺伝子 において小さな欠失を有して、アデノウイルス地図単位０−１、及びそれに続く ＣＭＶエンハンサー／プロモーター、ｌａｃＺ遺伝子、ポリＡシグナル（ｐＡ） 、アデノウイルス地図単位９．２−１００を含む。組み換えアデノウイルスＨ５ ．０１０ＣＢＡＬＰは、Ａｄ５ ｓｕｂ３６０バックボーンから７８．５ないし ８４．３ｍｕでＥ３遺伝子において小さな欠失を有して、アデノウイルス地図単 位０−１、及びそれに続くＣＭＶがエンハンスするチキン細胞質β−アクチンプ ロモーター［Ｔ．Ａ．Ｋｏｓｔ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１１（２ ３）：８２８７（１９８３）］、ヒト胎盤ＡＬＰ遺伝子、ポリＡシグナル（ｐＡ ）、及びアデノウイルス５型地図単位９−１００を含む。この組み換えアデノウ イルスは、上記のＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺと実質的に同様に構築された。上 に引用したＫｏｚａｒｓｋｙ（１９９４）も参照。 これらの組み換えアデノウイルス、Ｈ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺ及びＨ５．０ １０ＣＢＡＬＰをトランスフェクション［Ｇｒａｈａｍ、Ｖｉｒｏｌ．、５２： ４５６−４６７（１９７４）］後に単離し、２回のプラーク精製に供した。以前 に記述された［Ｅｎｇｌｅｈａｒｄｔ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ 、８８：１１１９２−１１１９６（１９９１）］ように、ライセート を２連続の塩化セシウム密度勾配上で精製した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を 用いてＢｉｏＲａｄ ＤＧ１０ゲル濾過カラム上にウイルスを通すことにより、 塩化セシウムを除いた。 マウス実験のためには、ウイルスを得たばかりで使用するか、またはカラム精 製後に、グリセロールを１０％（ｖ／ｖ）の最終濃度に加え、そしてウイルスを 使用するまで−７０℃で保存した。実施例２−マウス肺におけるＩＬ−１２及びＩＦＮ−γによる２回目の投与の際 のアデノウイルスが媒介する遺伝子導入の向上 組み換えアデノウイルスＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺ及びＨ５．０１０ＣＢＡ ＬＰ をこの実施例において用いた。各ウイルスは、異なるレポーター導入遺伝子 を発現し、その発現は、最初のレポーター導入遺伝子のものと識別することがで きる。 メスのＣ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週年齢）を０日に気管を通してＨ５．０ １０ＣＢＡＬＰの懸濁液（５０μｌのＰＢＳ中１ ｘ １０⁹ｐｆｕ）で、そして ２８日にＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺで同様に感染させた。そのようなマウスの 一群をコントロールとして用いた。別の群のマウスは、最初の遺伝子治療時（− ３、０、及び＋３日）に、ＣＤ４⁺細胞に対する抗体（ＧＫ１．５；ＡＴＣＣ番 号ＴＩＢ２０７、腹水の１ ：１０希釈）のｉ．ｐ．注射によりＣＤ４⁺細胞を急激に枯渇させた。第三の群 のマウスには、ウイルスの１回目の投与時（０及び＋１日）に、ＩＬ−１２（１ μｇの気管内または２μｇのｉ．ｐ．注射）を注入した。第四の群のマウスには 、ウイルスの１回目の投与時（０及び＋１日）に、γ−インターフェロン（１μ ｇの気管内または２μｇのｉ．ｐ．注射）を注入した。 続いて、３、２８、または３１日でマウスを安楽死させ、検死解剖した時、肺 組織を凍結切片用に調製し、一方、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）及び縦隔リンパ節 （ＭＬＮ）を免疫学的アッセイのために集めた。 Ａ．凍結切片 上に引用したＹａｎｇ Ｉの方法に従った組織化学染色により、３日目及び２ ８日目に、ＡＬＰ発現に関して肺組織を評価した。β−ガラクトシダーゼ発現を 、Ｘ−ｇａｌ組織化学染色により３１日目にアッセイした。以下に記述する結果 を、アルカリホスファターゼ組織化学染色（倍率ｘ１００）またはβ−ガラクト シダーゼＸ−ｇａｌ染色（倍率ｘ１００）から得た。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスの全ての群の気道へのＡＬＰウイルス（１０⁹ｐｆｕ） の注入は、２８日までに検出できないレベルまで減少する伝達（ｃｏｎｄｕｃｔ ｉｎｇ）気道の大部分における高いレベルの導入遺伝子発現をもたらした。導入 遺伝子発現の喪失は、遺伝子的に修飾された肝細胞のＣＴＬがもたらす除去のた めであることが示された［上に引用したＹａｎｇ Ｉ］。 コントロールマウスにおいては、ウイルスの２回目の投与後３日目、すなわち 、３１日目で、何の組み換え遺伝子発現も検出されなかった。 ＣＤ４⁺を枯渇させた動物へのウイルスの投与は、１カ月間安定である高いレ ベルの組み換え導入遺伝子発現と関係した。第二のウイルスの発現は、３１日に 検出できた。従って、ＣＤ４⁺細胞の枯渇は、即時のＣＴＬ除去なしにベクター の再投与を効果的に可能にする。 最初の高いレベルの遺伝子導入は、ＩＬ−１２処理したマウスにおいて約１カ 月後に減少した。しかしながら、コントロールと対照的に、３１日の結果におい て見られるように、２８日目にＩＬ−１２で処理した動物へウイルスを再投与し た時、気道の上皮細胞への高いレベルの遺伝子導入が得られた。 γ−インターフェロン処理した動物は、ウイルスの２回目の投与の際に効率よ い遺伝子導入が達成された点において、ＩＬ−１２で処理した動物と実質的に区 別できなかった。 従って、免疫調節剤としてのこれらのサイトカインの使用は、中和抗体による 即時の除去なしにベクターの繰り返された投与を可能にした。他の実験において 、Ｔ_H2細胞は、増加したＴ_H1活性化を犠牲にして阻害されなかった。非経口でＡ ＬＰ ウイルスでそしてｉ．ｐ．でＩＬ−１２で処理したマウスにおいて、ＩＬ− １２は、クロム放出アッセイにより示されるように、アデノウイルス特異的なＣ ＴＬ活性を増加しなかった。より重要なことには、ウイルスの気管内注入時のＩ Ｌ−１２での動物の処理は、ウイルスの２回目の投与後に、炎症の度合いを高め たり、または導入遺伝子の持続性を減少したりしなかった。 Ｂ．免疫学的アッセイ−ＭＬＮ Ｃ５７ＢＬ／６マウスのコントロール群及びＩＬ−１２処理群のＭＬＮからの リンパ細胞を、Ｈ５．０１０ＣＢＡＬＰの投与後２８日目に集 め、そして１０粒子／細胞でＵＶで不活性化したＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺで インビトロで２４時間再刺激した。無細胞上清を、ＨＴ−２細胞（ＩＬ−２また はＩＬ−４依存性細胞系）においてＩＬ−２またはＩＬ−４の存在に関してアッ セイした［上に引用したＹａｎｇ Ｉ］。同じリンパ細胞培養上清中のＩＦＮ− γの存在を記述された［上に引用したＹａｎｇ Ｉ］ようにＬ９２９細胞におい て測定した。ウイルスで再刺激したリンパ細胞の上清中で培養したＨＴ−２細胞 へ取り込まれた³Ｈ−チミジンｃｐｍを抗原を含まない培地中でインキュベート したリンパ細胞の上清中で培養したＨＴ−２細胞へ取り込まれた³Ｈ−チミジン ｃｐｍで割ることにより、刺激指標（Ｓ．Ｉ．）を計算した。 これらの結果を以下の表Ｉに示す。 両組み換えアデノウイルスでの局在リンパ節からのリンパ細胞の刺激は、Ｔヘ ルパー細胞のＴ_H1（すなわち、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γ）及び Ｔ_H2（すなわち、ＩＬ−４）サブセットの両方の活性化に特異的なサイトカイン の分泌をもたらした（表Ｉ）。 ウイルスでインビトロで刺激したＩＬ−１２処理した動物からのリンパ細胞の 分析は、ＩＬ−１２を与えられなかった動物と比較した場合、ＩＬ−４の生産に 対して増加したＩＬ−２及びＩＦＮ−γの分泌を示した（すなわち、ＩＬ−１２ を用いた場合、ＩＬ−２／ＩＬ−４の割合は３から６まで増加した；表Ｉ）。 Ｃ．免疫学的アッセイ−ＢＡＬ 組み換えウイルスを最初に受けた後２８日目の動物から得たＢＡＬサンプルを 、以下のようにアデノウイルスに対する中和抗体及び抗アデノウイルス抗体のイ ソタイプに関して評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの同じ４群、すなわち、コン トロール、ＣＤ４⁺枯渇、ＩＬ−１２処理、及びＩＦＮ−γ処理をＨ５．０１０ ＣＢＡＬＰで感染させた。Ｈ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺ（２０μｌ中に１ ｘ １ ０⁶ｐｆｕ）と混合し、３７℃で１時間インキュベートし、そして９６穴プレー ト中８０％融合したＨｅｌａ細胞（ウェル当たり２ ｘ １０⁴細胞）に添加した 、連続希釈したＢＡＬサンプル（１００μｌ）において中和抗体を測定した。３ ７℃で６０分のインキュベーション後、２０％ＦＢＳを含んでいる１００μｌの ＤＭＥＭを各ウェルに加えた。細胞を固定し、次の日にβ−ガラクトシダーゼ発 現に対して染色した。 抗アデノウイルス抗体の非存在下で、全ての細胞がｌａｃＺ陽性であった。 酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、アデノウイルス特異的抗体のイ ソタイプをＢＡＬにおいて決定した。簡潔に言えば、９６穴プ レートを５ ｘ １０⁹粒子のＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺを含んでいる１００μ ｌのＰＢＳで４℃で１８時間被覆した。これらのウェルをＰＢＳで５回洗浄した 。ＰＢＳ中２％のＢＳＡ２００μｌでブロッキングした後、プレートをＰＢＳで １回すすぎ、そして１：１０希釈したＢＡＬサンプルと共に４℃で９０分間イン キュベートした。その後、ウェルをよく洗浄し、１００μｌの１：１０００希釈 したＡＬＰを結合した抗マウスＩｇＧまたはＩｇＡ（Ｓｉｇｍａ）で再び満たし た。プレートをインキュベートし、続いて５回洗浄し、そして１００μｌの基質 溶液（ｐ−ニトロフェニルリン酸塩、ＰＮＰＰ）を各ウェルに加えた。５０μｌ の０．１Ｍ ＥＤＴＡの添加により基質の転換を停止し、反応物を４０５ｎｍで 読み取った。 これらの結果を、中和抗体価、並びにＢＡＬサンプル中に存在するＩｇＧ及び ＩｇＡの相対量（ＯＤ₄₀₅）を要約する、図１Ａから１Ｃまでに図式的に示す。 各サンプルに対する中和抗体の力価を、５０％未満の細胞が青色に染色される最 も高い希釈として報告した。 図１Ａから１Ｃまでの第一の棒において示されるように、上の表１において同 定されたサイトカインは、１：８００希釈までのインビトロアッセイにおいてヒ トＡｄ５組み換えベクターを中和することのできるＩｇＧ及びＩｇＡの両方のイ ソタイプのＢＡＬ中のアデノウイルスタンパク質に対する抗体の出現にコントロ ールマウスにおいて関係した。 図１Ａから１Ｃまでのグラフの第二の棒において示されるように、一時的なＣ Ｄ４⁺細胞の枯渇は、中和抗体（図１Ａ）及びウイルス特異的なＩｇＡ抗体（図 １Ｃ）の形成を８０倍まで抑制し、それによりウイルスの２回目の投与後に効率 よい遺伝子導入が起こることを可能にした。 図１Ｂは、同様にＩｇＧのわずかな抑制を示す。 ３つのグラフの第３の棒において示されるように、ＩＬ−１２は、ＩｇＧの形 成に対して著しく影響を与えずに（図１Ｂ）、抗原特異的なＩｇＡの分泌を選択 的に阻止した（図１Ｃ）。このことは、ウイルス特異的な中和抗体の２０倍の減 少（図１Ａ）と同時に起こった。 γ−インターフェロンで処理した動物（図１Ａ及び１Ｂの第４の棒）は、ウイ ルス特異的なＩｇＡ（図１Ｃ）及び中和抗体（図１Ａ）がサイトカインで処理さ れなかったコントロール動物に比べて減少する点においてＩＬ−１２で処理した 動物と実質的に区別できないが、ＩＬ−１２で処理したもので得られたほどでは なかった。 これらの研究は、ベクターを最初に受けた時またはその頃に遺伝子治療組み換 えウイルスベクターのレシピエントへ選択した免疫調節剤を投与することが、ウ イルスベクターを最初にそして繰り返して受けた時の両方で、阻止抗体の形成及 び／またはベクターのＣＴＬ除去を防ぐことができることを示す。抗ウイルスＩ ｇＡと中和抗体の一致した減少は、ＩｇＡサブタイプの免疫グロブリンが、主に 、遺伝子導入に対する妨害の原因であることを示唆する。実施例３−マウス肝臓におけるＩＬ−１２及びＩＦＮ−γによる２回目の投与の 際のアデノウイルスが媒介する遺伝子導入の向上 上の実施例２において記述されたものと実質的に同一である実験を行い、この 中で、肝臓への導入遺伝子の導入のために、ウイルスベクターを（肺への気管内 運搬よりむしろ）血液中に投与した。 組み換えアデノウイルスＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺ及びＨ５．０１０ＣＢＡ ＬＰ をこの実施例において用いた。 ０日にＨ５．０１０ＣＢＡＬＰ（５０μｌのＰＢＳ中１ ｘ １０⁹ｐｆｕ）の 懸濁液をｉ．ｐ．で、そして２８日にＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺを同様に、メ スのＣ５７ＢＬ／６マウス（６−８週年齢）に注入した。そのようなマウスの一 群をコントロールとして用いた。別の群のマウスは、最初の遺伝子治療時（−３ 、０、及び＋３日）に、ＣＤ４⁺細胞に対する抗体（ＧＫ１．５；ＡＴＣＣ番号 ＴＩＢ２０７、腹水の１：１０希釈）のｉ．ｐ．注射によりＣＤ４⁺細胞を急激 に枯渇させた。第三群のマウスには、ウイルスの一回目の投与時（０及び＋１日 ）に、ＩＬ−１２（２μｇ、Ｉ．ｐ．注射）を注入した。第四群のマウスには、 ウイルスの一回目の投与時（０及び＋１日）に、γ−インターフェロン（２μｇ 、Ｉ．ｐ．注射）を注入した。 続いて、３、２８、または３１日でマウスを安楽死させ、検死解剖した時に、 実施例２において肺組織に対して上に用いた方法により、肝臓組織を凍結切片用 に調製した。 本発明による肝臓への遺伝子治療に対する凍結切片の結果は、上の実施例２の 肺への治療に対するものと実質的に同様であった。アルカリホスファターゼ組織 化学染色（倍率ｘ１００）またはβ−ガラクトシダーゼＸ−ｇａｌ染色（倍率ｘ １００）から、以下に記述される結果を得た。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスの全ての群の静脈へのＡＬＰウイルス（１０⁹ｐｆｕ） の投与は、２８日までに検出できないレベルまで減少する肝臓組織中での高いレ ベルの導入遺伝子の発現をもたらした。導入遺伝子発現の喪失は、遺伝子的に修 飾された肝細胞のＣＴＬがもたらす除去のためであることが示された［上に引用 したＹａｎｇ Ｉも参照］。 コントロールマウスにおいては、ウイルスの２回目の投与後３日目、 すなわち、３１日目で、何の組み換え遺伝子発現も検出されなかった。 ＣＤ４⁺を枯渇させた動物へのウイルスの投与は、かなり少ない中和抗体及び １カ月間安定である高いレベルの組み換え導入遺伝子の発現と関係した。第二の ウイルスの発現は、３１日に検出できた。 最初の高いレベルの遺伝子導入は、ＩＬ−１２で処理したマウスにおいて約１ か月後に減少したが、しかしながら、コントロールと対照的に、２８日目にＩＬ −１２で処理した動物へウイルスを再投与し、中和抗体のレベルを減少させた時 、血液を通した肝臓へのいくつかの遺伝子導入が得られた。 γ−インターフェロン処理した動物は、ウイルスの２回目の投与の際に効率よ い遺伝子導入が達成された点において、ＩＬ−１２で処理した動物と実質的に区 別できなかった。 従って、これらのサイトカイン及び抗ＣＤ４⁺抗体の免疫調節剤としての使用 は、中和抗体による即時の除去なしにベクターの繰り返された肝臓への投与を可 能にした。実施例４−マウス肝臓におけるアデノウイルスが媒介する遺伝子導入 異なる系統のマウスを用いて、組み換えウイルスの最初の投与に対する免疫反 応をさらに特徴づける。 組み換えウイルス（Ｈ５．０１０ＣＭＶＬａｃＺまたはＨ５．０１０ＣＢＡＬ Ｐ ）を８−メトキシソラレンの存在下で紫外線で不活性化した。簡潔に言えば、 精製したウイルスを０．３３ｍｇ／ｍｌの８−メトキシソラレン溶液中に再懸濁 し、ランプフィルターから４ｃｍで氷上で３６５ｎｍ ＵＶ光源に３０分間さら した。次に、これらのウイルスを、ＰＢＳで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ− ５０カラム上に通した。ウイ ルスの不活性化したストックの限界希釈形質導入アッセイは、１０⁵粒子の不活 性化ウイルス当たり１未満の機能的ウイルスを示した。ウイルスの懸濁液（１０ ０μｌのＰＢＳ中２ ｘ １０⁹ｐｆｕ）を以下の実験において詳しく述べられる ように、６ないし８週年齢のメスのマウスの尾の静脈に注入した。導入遺伝子の 発現を各５裂片（ｌｏｂｅ）の切片において定量化する各実験を、少なくとも３ 匹のマウスで行った。最少の分析は、実験条件当たり１５切片であった。 ａ．Ｃ５７ＢＬ／６マウス［Ｈ−２^b；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ］に０日でＨ５．０１０ＣＭＶＬａｃＺの 懸濁液を、そして２８日でＨ５．０１０ＣＢＡＬＰを同様に注入し（「Ｂ６マウ ス」）； ｂ．Ｃ５７ＢＬ／６マウスに０日でＵＶで不活性化したＨ５．０１０ＣＭＶＬ ａｃＺ を、そして２８日でＨ５．０１０ＣＢＡＬＰを注入し（「Ｂ６−ＵＶマウ ス」）； ｃ．Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド（５−１０世代の間）に掛け合わせ、そ してＨ−２^bハプロタイプを保有するＭＨＣクラスIIを欠失した（II^-）マウス［ ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ 、ＣＡ］は、Ｉ−Ａ^b決定基を発現できず、そしてＣＤ４⁺Ｔ細胞が仲介する反応 を起こすことができない［Ｇｒｕｓｂｙ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３：１４１７ −１４２０（１９９１）］。これらのマウスに０日でＨ５．０１０ＣＢＡＬＰを そして２８日でＨ５．０１０ＣＭＶＬａｃＺを感染させ（「クラスII^-マウス」 ）； ｄ．Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド（５−１０世代の間）に掛け合わせ、そ してＨ−２^bハプロタイプを保有するβ２マイクログロブリン を欠失した（β２ｍ^-）マウス［ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ ｌ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ］は、ＭＨＣクラスＩが関係した反応を 起こすことができない。これらのマウスに０日でＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺを そして２８日でＨ５．０１０ＣＢＡＬＰを感染させ（「β２ｍ^-マウス」）； ｅ．実施例２において記述したように、−３、０、及び＋３日でＧＫ１．５（ 抗ＣＤ４ ＭＡｂ、ＡＴＣＣ ＴＩＢ２０７）を含んでいるマウス腹水液の１：１ ０希釈の０．５ｍｌアリコートを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにｉ．ｐ．接種した。 これは、注射当たり１００μｇの精製したモノクローナル抗体と同等であった。 これらのＣＤ４⁺細胞を枯渇させたマウスに０日でＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺ をそして２８日でＨ５．０１０ＣＢＡＬＰを注入し（「ＣＤ４Ａｂマウス」）； そして ｆ．実施例２において記述したように、０日及び＋１日にＩＬ−１２（２００ μｌのＰＢＳ中２μｇ）でｉ．ｐ．処理したＣ５７ＢＬ／６マウスに、０日でＨ ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺをそして２８日でＨ５．０１０ＣＢＡＬＰを感染させ た（「ＩＬ−１２マウス」）。 続いて、各群からのマウスを安楽死させ、そして肝臓組織を、３日及び２８日 目にＸ−ｇａｌ組織化学（倍率ｘ１００）によりｌａｃＺ発現に関して、そして ３１日目に組織化学染色（倍率ｘ１００）によりＡＬＰ発現に関して評価した。 各群のマウスにおけるアデノウイルスに対する中和抗体の発生を、２８日目に得 られた血清サンプル中において調べた。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのｌａｃＺウイルスの注入は、レポーター遺伝子の高 いレベルであるが一時的な発現、及びアデノウイルス抗原に対 して誘導された中和抗体の最終的な発生に関係した（図２）。これらの動物にＡ ＬＰ ウイルスを続いて注入すると、何の遺伝子導入も検出されなかった。それに 反して、クラスII^-マウスは、中和抗体を生産せず（図２）、ウイルスの２回目 の投与からの高いレベルの遺伝子導入に受容力があった。同様に、ＣＤ４を一時 的に枯渇させた動物は、ＬａｃＺ発現をある程度安定化し、そして中和抗体を発 生せず、ウイルスの効率よい再投与を可能にした。 ＵＶで不活性化した組み換えウイルスを与えられたＢ６−ＵＶマウスにおいて 、不活性化ウイルスは、次の遺伝子導入を完全に妨げる完全な中和抗体反応を生 じた（図２）。この結果は、投入したウイルスのキャプシドタンパク質が、阻害 Ｔヘルパー細胞及びＢ細胞がもたらす体液性免疫反応を活性化するのに十分であ ることを示す。 ウイルスに対する一次応答におけるＣＤ８細胞及びクラスＩ ＭＨＣ発現の役 割を評価するために、β２ｍ^-マウスでの実験を行った［Ｚｉｊｌｓｔｒａ等、Ｎａｔｕｒｅ 、３４４：７４２−７４６（１９９０）］。前に報告されたデータ ［上に引用したＹａｎｇ III］と一致して、これらの動物において導入遺伝子の 発現は安定であった。しかしながら、ウイルスの再投与の状態において、かなり のレベルで遺伝子導入が起こった。この系統のマウスは、中和抗体を生産するた めに必要な免疫反応の全ての成分（すなわち、ＣＤ４細胞、ＭＨＣクラスII発現 、及びＢ細胞）を有するはずなので、このことは意外であった。これらの動物は 、アデノウイルス抗原に対する著しい中和抗体反応を高めることができなかった 。これらの結果は、Ｔヘルパー細胞及び／またはＢ細胞の活性化の調節異常を示 唆する（図２）。 β２ｍ^-動物からのリンパ細胞の分析は、おそらく、ウイルスが感染した細胞 の持続及びＴ_H1細胞の慢性的な活性化のために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて 測定されたものより多い、抗原が活性化したＩＦＮ−γの分泌を示した。β２ｍ^- マウスにおける増幅されたＴ_H1反応は、Ｔ_H2細胞の阻害を引き起こすことがで き、抗ウイルス抗体の減少した生産をもたらした。 生殖細胞系β２ｍ^-中断に基づき、導入遺伝子の発現は、ＣＤ８細胞及びＭＨ ＣクラスＩを欠失した動物において安定化されることが見いだされた。細胞溶解 をもたらすＣＴＬ及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上の分子、パーホリンの特 異的な除去は、同様に、導入遺伝子の発現を引き延ばす（データは示さない）。実施例５−繰り返された投与の際のＡｄが媒介する遺伝子導入に対するＣＤ４抗 体の効果 異なる導入遺伝子を発現している組み換えアデノウイルスの懸濁液を２１日間 隔でＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２^b）マウスの尾の静脈に注入した。Ｈ５．０１０Ｃ ＭＶＬＤＬＲは、Ｅ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子の欠失したアデノウイルスであり、Ｅ １欠失の場所にＬＤＬレセプター遺伝子を有し、Ａｄ５ ｓｕｂ３６０バックボ ーンから７８．５ないし８４．３ｍｕでＥ３遺伝子に欠失を有する［Ｋｏｚａｒ ｓｋｙ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：１−８（１９９４）において記 述される］。 ０日でＨ５．０１０ＣＭＶＬＤＬＲを、２１日でＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺ を、そして４２日でＨ５．０１０ＣＢＡＬＰを投与した。コントロール群のマウ スには、ウイルスの各注入に関して、−３、０、及び３日に生理食塩水のｉ．ｐ ．注射を与えた。第二群のマウスには、同じ プロトコルにおいて、Ｔヘルパー細胞の活性化を防ぐためにＣＤ４を枯渇する抗 体（ＧＫ１．５ ｍＡｂ）のｉ．ｐ．注射を与えた。第三群のマウスには、−３ 、０、３、１８、２１、及び２４日にＧＫ１．５ ｍＡｂのｉ．ｐ．注射を与え た。Ｈ５．０１０ＣＭＶＬＤＬＲの最初の投与を受けなかった第四群のマウスを 、−３、０、及び３日にＧＫ１．５ｍＡｂで処理した。 続いて、これらのマウスを安楽死させ、そして肝臓組織を３日目に免疫組織化 学によりＬＤＬＲ発現に関して、２４日目にＸ−ｇａｌ組織化学によりｌａｃＺ 発現に関して、そして４５日目に組織化学染色によりＡＬＰ発現に関して評価し た。これらのアッセイは、以下のように行った。 Ａ．ＬＤＬＲ発現に対する免疫蛍光染色を以下のように行った。すなわち、凍 結切片（６μｍ）を上に引用したＭｏｒｒｉｓ等において記述されたようにメタ ノール中で固定した。ＰＢＳ中１０％のヤギ血清（ＧＳ／ＰＢＳ）でブロッキン グ後、切片を、ＬＤＬＲに対するポリクローナル抗体（１：２００）と共に６０ 分間、次にヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣと共に３０分間インキュベートした。 切片を洗浄し、Ｃｉｔｉｆｌｏｕｒ（Ｃｉｔｉｆｌｏｕｒ、ＵＫ）で顕鏡用に作 った（ｍｏｕｎｔｅｄ）。 Ｂ．Ｘ−ｇａｌ組織化学を以下のように行った。すなわち、新しい凍結組織の 切片（６μｍ）を０．５％グルタルアルデヒド中で１０分間固定し、１ｍＭ Ｍ ｇＣｌ₂を含んでいるＰＢＳ中で１０分間２回すすぎ、そしてＰＢＳ中１ｍｇ／ ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ Ｘ−ｇａｌ）、５ｍＭ Ｋ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆ 、５ｍＭ Ｋ₄Ｆｅ（ＣＮ）₆、及び１ｍＭ ＭｇＣｌ₂中で３時間インキュベー トした。 Ｃ．ＡＬＰ組織化学を以下のように行った。すなわち、凍結切片（６μｍ）を ０．５％グルタルアルデヒド中で１０分間固定し、ＰＢＳ中ですすぎ、内因性のＡＬＰ 活性を不活性化するために６５℃で３０分間インキュベートし、１００ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ９．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、及び５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 中で洗浄し、そして０．１６５ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−イン ドリルリン酸塩（ＢＣＩＰ）及び０．３３ｍｇ／ｍｌのニトロブルーテトラゾリ ウム（ＮＢＴ）を含んでいる同じバッファー中で３７℃で３０分間染色した。 ０日のＬＤＬＲウイルス、２１日のｌａｃＺウイルス、及び４２日のＡＬＰウ イルス を含む、各ウイルス注入後３日目の肝臓組織の細胞化学染色の分析から、 以下に説明する結果を得た（倍率ｘ１５０）。 血清サンプルもまた、各群の動物から０、３、７、１４、２１、２８、３５、 及び４２日に集め、中和抗体価に関してアッセイした。血清サンプルを５６℃で ３０分間インキュベートし、次にＤＭＥＭ中に１：２０から始める２倍段階で希 釈した。各血清希釈（１００μｌ）をＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺ（２０μｌ中 に２ ｘ １０⁶ｐｆｕ）と混合し、３７℃で１時間インキュベートし、そして９ ６穴プレート中の８０％融合したＨｅｌａ細胞（ウェル当たり２ ｘ １０⁴細胞 ）に添加した。３７℃で６０分間インキュベーション後、２０％ＦＢＳを含んで いる１００μｌのＤＭＥＭを各ウェルに加えた。細胞を固定し、次の日にβ−ガ ラクトシダーゼ発現に対して染色した。血清サンプルの非存在下で、全ての細胞 が青色に染色された。各サンプルに対する中和抗体の力価を、５ ０％未満の細胞が青色に染色される最も高い希釈として報告した。図３Ａ−３Ｄ は、感染後の日数の関数として表された抗体価を報告する。 これらの実験は、ＣＤ４抗体を与えられていないマウスの群において、第一の ウイルスの後に効率よい遺伝子導入が起こることを示した。しかしながら、中和 抗体の発生は、その後に続く２つのウイルスでの遺伝子導入を妨げた。ＣＤ４抗 体を共に投与しなかった場合、中和抗体は、第二のウイルスの後に血清中に迅速 に現れた（図３Ｂ）。これらの動物において第三のウイルスは効果的ではなかっ た。それに反して、ウイルスの一回目の注入時のＣＤ４抗体の投与は、中和抗体 の形成を防ぎ（図３Ｂ）、第二のウイルスでの高いレベルの遺伝子導入を可能に した。第二のウイルスの後の中和抗体の出現は早められ（図３Ａにおける一次応 答の時間経過に比較した図３Ｂ）、このことは、細胞性免疫のあるレベルの活性 化は、ＣＤ４抗体の存在下でさえ起こることを示唆している。第二のウイルスと ＣＤ４抗体の投与は、ＣＤ４抗体及び両ウイルスを与えられているマウスの群に おいて再び中和抗体を阻止し、第三のウイルスでの遺伝子導入を可能にした。 これらの実験は、長い間続く免疫抑制と反対に、ウイルス運搬時の一次的な免 疫遮断が効率よい遺伝子導入に必要な全てであることを示す。 第四群の動物は、Ｈ５．０１０ＣＭＶＬＤＬＲ投与なしに−３日、すなわち、 ウイルスの最初の投与前２１日にＣＤ４抗体を与えられた。ウイルスの最初の攻 撃に続いて起こる中和抗体は、ＣＤ４抗体で前処理しなかった無処置（ｎａｉｖ ｅ）動物において観察されたもの（図３Ａ）と区別できないように２１日後の遺 伝子導入を阻止した（図３Ｄ）。この結果はＣＤ４枯渇の一次的な性質を裏づけ る。実施例６−Ａｄ特異的抗体イソタイプ及びＣＴＬ反応に対するＩＬ−１２の効果 Ａ．実施例５のＣ５７ＢＬ／６マウス（「Ｂ６」）及びＩＬ−１２で処理した Ｃ５７ＢＬ／６（「Ｂ６＋ＩＬ１２」）マウスから得た血清サンプルを、感染後 ２８日目に、アデノウイルス特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体イソタイプに関 して試験した。 抗原として精製したＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺウイルスを用いた固相酵素結 合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を行った。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ−２−Ｕマイクロタ イタープレート（Ｆｉｓｈｅｒ）を１００ｍｌのＰＢＳ中２００ｎｇ／ウェルの ウイルス抗原で３７℃で６時間被覆し、ＰＢＳ中で３回洗浄し、そしてＰＢＳ／ １％ＢＳＡ中で４℃で一晩ブロックした。次の日に、抗原を被覆したプレートに ４倍で連続希釈した血清サンプルを加え、３７℃で４時間インキュベートした。 プレートをＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で３回洗浄し、１：５０００希釈でヤギ抗マウ スＩｇＧ１−ビオチンまたはヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ−ビオチン（ＣＡＬＴＡＧ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）と共に３７ ℃で２時間インキュベートした。プレートを上のように洗浄し、アビジン−ＡＬ Ｐ （Ｓｉｇｍａ）を１：５０００希釈で各ウェルに３７℃で１時間加えた。ウェ ルを上のように再び洗浄し、ＰＮＰＰ基質を加えた。光学密度をＢｉｏｒａｄモ デル４５０マイクロプレートリーダー上で読み取った。 図４Ａ及び４Ｂは、サンプルの希釈の関数として血清サンプル中に存在する、 それぞれ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの相対量（ＯＤ₄₀₅）を要約する。血清のＥ ＬＩＳＡアッセイは、それぞれ、Ｔ_H1及びＴ_H2サブセッ トの両方の活性化と一致するＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａサブタイプの両方の抗ウイ ルス抗体を示した。ＩＬ−１２を与えられている動物は、増加したＩｇＧ２ａの 生産を犠牲にしてより少量の抗ウイルスＩｇＧ１を生産した。 Ｂ．実施例５のＣ５７ＢＬ／６マウス（「Ｂ６」）及びＩＬ−１２で処理した Ｃ５７ＢＬ／６マウス（「Ｂ６＋ＩＬ１２」）から集めた脾臓細胞を、Ｈ５．０ １０ＣＢＡＬＰの投与後１０日目に、５％ＦＢＳ及び５０ｍＭ２−メルカプトエ タノールで補足したＤＭＥＭ中、Ｈ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺで５日間インビト ロで再刺激した。Ｖ底９６穴プレート中で１０％ＦＢＳを含む２００μｌのＤＭ ＥＭ中、以下の比のエフェクター対標的細胞（Ｃ５７ＳＶ、Ｈ−２^b）（Ｅ：Ｔ ＝５０：１、２５：１、１２：１、６：１、５：１、及び３：１）を用いて続い て行われる６時間の⁵¹Ｃｒ放出アッセイにおいて、擬似感染させた（「ｍｏｃｋ 」）及びＨ５．０１０ＣＢＡＬＰ（「ＡＬＰ」）を感染させたＣ５７ＳＶ細胞に おける特異的な溶解に関して、これらの細胞を試験した。 エフェクター細胞との混合前に、５０のｍｏｉでＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺ で２４時間感染後に、標的細胞（１ ｘ １０⁶）を１００μＣｉの⁵¹Ｃｒで標識 し、そして５ ｘ １０³細胞／ウェルで用いた。６時間インキュベーション後、 ガンマカウンターにおける計数のために、１００μｌの上清のアリコートを取り 除いた。特異的な⁵¹Ｃｒ放出のパーセントを［（サンプルのｃｐｍ−自然放出の ｃｐｍ）／（最大の放出のｃｐｍ−自然放出のｃｐｍ）］ｘ１００として計算し た。異なるエフェクター対標的細胞比の関数として特異的な溶解のパーセントと して報告されたこれらの結果（図５）は、ウイルスが感染した標的細胞に対する ＣＴＬ活性がＩＬ−１２処理により影響されなかったことを示す。 最終的な結果は、中和抗体の３倍の減少であり、この大きさは、ウイルスの再 投与の際に効率よい遺伝子導入を可能にするのには不十分であった。β２ｍ^-マ ウス及びＩＬ−１２処理したＣ５７ＢＬ／６マウス間のウイルスの再投与の効率 における違いは、ＩＬ−１２のｉ．ｐ．注射後の不十分なサイトカインがもたら す抑制、またはＴ_H2活性化の阻害以外の機構を反映しているのかもしれない。実施例７−ＣＤ４０Ｌを欠失したマウスは、アデノウイルスベクターに対する宿 主の反応におけるＴ細胞活性化の必要な役割を示す アデノウイルスベクターに対する細胞性及び体液性免疫反応においてＣＤ４０ ＬがもたらすＴ細胞のシグナリングの役割を、ＣＤ４０Ｌを遺伝子的に欠いたマ ウスにおいて調べた。以前の研究は、これらのマウスにおける胸腺依存性Ｂ細胞 反応の異常を示している［Ｊ．Ｘｕ等、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１：４２３−４３１ （１９９４）及びＢ．Ｒｅｎｓｈａｗ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８０：１８ ８９−１９００（１９９４）］。ＣＤ４０Ｌを欠失したマウス（ＣＤ４０Ｌ Ｋ Ｏ）及びＣ５７ＢＬ／６−１２９キメラバックグラウンドにおけるこれらの正常 な同腹子［上に引用したＪ．Ｘｕ等］に、肺への遺伝子導入をもたらすために気 管へ（５０μｌのＰＢＳ中に１ ｘ １０⁹）、そして肝臓への遺伝子導入をもた らすために尾の静脈を通って抹消循環へ（１００μｌのＰＢＳ中に２ ｘ １０⁹ ）、０日に、Ｅ１を欠失したアデノウイルスを含んでいるｌａｃＺ（Ｈ５．０１ ０ＣＭＶｌａｃＺ）を投与した。２８日に、異なるレポーター遺伝子（アルカリ ホスファターゼ、ＡＬＰ）を含んでいるアデノウイルスベクター、Ｈ５．０１０ ＣＢＡＬＰで動物を再処理した。 第二のベクター投与の前に中和抗体に関して血液を分析し、そして３日後（すな わち、３１日）にレポーター遺伝子の発現の分析のために組織を集めた。導入遺 伝子の発現の効率及び安定性をそれぞれ評価するために、３及び２８日後に動物 を殺した。表IIは、これらの組織の外形計測分析を要約する。 ベクターを投与した正常な同腹のマウスは、肺及び肝臓において３日目で、（ 無処置のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて見られるのと同様に；表II）２８日まで に検出できないレベルまで減少する高いレベルの導入遺伝子の発現を示した。Ｙ ．Ｄａｉ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 、９２：１４０１−１４０５（１９９５）において記述されたよ うに、ヒトＡｄ５に対する中和抗体に関して血清及び気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ） を分析した。気管内にベクターを与えられた動物のＢＡＬ液または静脈循環内に ベクターを与えられた動物の血液中のいずれかにおいて、２８日までにアデノウ イルスキャプシドタンパク質に対してかなりの中和抗体が発生した（図６）。（ Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて見られるのと同様に、表II）３日後の標的器官に おける導入遺伝子の発現の欠如により明らかなように、２８日のベクターの再投 与はうまくいかなかった。ＣＤ４０Ｌを欠失したマウスにおいては、かなり異な る結果を得た。導入遺伝子の発現は、肺及び肝臓の両方において２８日間、少し の減少を伴って安定であった（表II）。加えて、中和抗体は発生できず（図６） 、ウイルスの２回目の投与の後に非常に効率よい導入遺伝子発現をもたらした（ 表Ｉ）。実施例８−抗体でのＣＤ４０リガンドの一時的な遮断は、一次Ｔ細胞活性化を防 ぎ、そして導入遺伝子の発現を引き延ばす 以下の実施例は、抗体でのＣＤ４０Ｌの一次的な阻害が、遺伝子治療の肺モデ ルにおいてＣＤ４⁺Ｔ細胞のプライミングを阻止し、そしてＣＤ４⁺Ｔ及びＢ細胞 エフェクター反応を効率よく除去したことを示す。ＣＤ４０Ｌ抗体で一次的に阻 害されたものに比べて（以下を参照）、ＣＤ４０Ｌを遺伝子的に欠失した動物（ 上の実施例７）における持続した導入遺伝子発現及び肺へのベクター再投与の効 率は、本質的に同一であった。 上の実施例７において示されるようなＣＤ４０Ｌを欠失したマウスにおいて得 られた奨励する結果は、ＣＤ４０Ｌシグナリングの薬理学的阻 害に基づくアデノウイルスベクターでの補助遺伝子治療を開発するための基礎を 提供した。この治療は、投入ウイルスのキャプシドタンパク質がＣＤ４⁺Ｔ細胞 活性化に対する抗原の主な源であるという発見に基づき、それにより、コステム ラトリー（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）遮断の時間をベクターが投与される短 い間隔に制限する。 抗体で処理されなかった、またはイソタイプコントロール抗体で処置されたＣ ５７ＢＬ／６マウス（６週年齢、メス）における実験は、３日目に、２８日まで に検出できないレベルまで減少する、肺（表II）及び肝臓（表II）における高い レベルの導入遺伝子の発現を示した。遺伝子導入実験を、最初のベクター投与に 対して−３、０、＋３、及び＋６日に１００μｇのＣＤ４０Ｌに対するｍＡｂ（ ＭＲ１、ＡＴＣＣハイブリドーマＨＢ１１０４８）または等量のコントロールハ ムスターモノクローナル抗体をｉ．ｐ．注入したＣ５７ＢＬ／６動物においても 行った。ネズミ肺における研究は、ＣＤ４０Ｌ ｍＡｂで処理した動物における 導入遺伝子の発現の安定化を示し、すなわち、上皮細胞の＞２５％において導入 遺伝子を示している気道の数は、３日の７２％から２８日の４２％への最小の減 少を示した（表II）。導入遺伝子の発現はまた、ＣＤ４０Ｌ ｍＡｂで処理した 動物の肝臓においても安定化され、導入遺伝子を発現している肝細胞は、２８日 間にわたって８９％から４７％までわずかに減少した（表II）。導入遺伝子の発 現は、ＣＤ４０Ｌ抗体で処理した動物において少なくとも６週間安定化され、こ れは評価された最も長い時点である（データは示さない）。 インビトロ及びインビボアッセイの両方を用いて、ＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞 の抗原特異的な活性化に関して、レシピエント動物を分析し た。ＣＤ４⁺Ｔ細胞に対するＣＤ４０Ｌ遮断の効果を、本質的に以下に記述され るようにＵＶで不活性化したアデノウイルスで刺激したリンパ細胞の増殖アッセ イにおいて調べた（表III）。簡潔に言えば、ウイルスの投与後１０日目のマウ スからの（肺実験に対する）縦隔リンパ節のリンパ細胞または（肝臓実験に対す る）脾臓細胞を、ＵＶで不活性化したウイルスで２４時間再刺激した。上清をサ イトカイン分泌に関してＨＴ−２細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ １８４１）において 試験し、そして³Ｈ−チミジンの取り込みを測定することにより７２時間後に増 殖を評価した。刺激指標により定量化されるように、アデノウイルス特異的なＴ 細胞の活性化が、肺または肝臓にベクターを介して投与された非抗体処置の動物 において最初７日目に実証された。アデノウイルス特異的なＴ細胞の活性化は、 その後に続く１４日にわたって漸進的に増加した。抗原の存在下の³Ｈカウント を抗原の非存在下のもので割ることにより、刺激指標を計算した。ＣＤ４０Ｌ抗 体の共投与により、両モデルにおいてＴ細胞の活性化がかなり阻害された。肺へ ベクターを投与された動物において、最も大きい阻害が観察された。 ウイルスを感染させた細胞によるＣＤ８⁺Ｔ細胞の活性化を、アデノウイルス ベクターを感染させたＭＨＣＨ−２適合標的細胞を用いたクロム放出アッセイに おいて分析した。先に示したように、アデノウイルスを感染させた抗原提示細胞 でインビトロで刺激し、そしてアデノウイルスを感染させた標的と共にインキュ ベートした、Ｃ５７ＢＬ／６レシピエントから７日に集めたリンパ細胞で特異的 な溶解が示された（図７）。疑似感染させた標的に対しては、何の溶解も示され なかった。 ＣＤ４０Ｌ抗体で処理した動物から集めたリンパ細胞もまた、アデノウイルス を感染させた細胞に対してＣＴＬ活性を示した。しかしながら、溶解の程度は、 免疫を排除した動物から得られたものより一貫して低かった。細胞溶解アッセイ 前のインビトロ刺激によりＣＴＬを増幅する必要性は、インビボでの最初の提示 に続いて起こるＣＴＬ活性化におけるより著しい違いをわかりにくくし得る。 アデノウイルス特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞の活性化に対するＣＤ４０Ｌ阻害の主要 な効果を、免疫細胞科学の技術を用いてインビボでさらに評価した。これらの実 験は、肺切片における免疫蛍光の技術的制限のために、 肝臓への遺伝子導入のモデルに制限される。肝臓組織を１４日に二重免疫蛍光に よりＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞の浸潤に関して分析した。非抗体処理の動物は、 ＣＤ４⁺Ｔ細胞により占められ、そして肝細胞の基部側部表面上のＭＨＣクラス Ｉのかなりのアップレギュレーションに関係する典型的な混合リンパ細胞の浸潤 を示した。以前の研究は、Ｔ_H1活性化ＣＤ４⁺Ｔ細胞からのＩＦＮ−γの分泌が 、肝細胞をＣＴＬがもたらす除去に対して敏感にすることができる、ＭＨＣクラ スＩの増加に寄与することを示唆している。ＣＤ４０Ｌに対する抗体で処理した 動物は、やはり混合リンパ細胞の浸潤を集める。しかしながら、ＣＤ４⁺Ｔ細胞 の割合はかなり下げられ、ＭＨＣクラスＩの増加はかなり弱められる。免疫蛍光 アッセイの特異性は、疑似感染させた動物において示された。実施例９−ＣＤ４０Ｌ抗体は、肺への遺伝子導入における阻害抗体の形成を防ぐ 中和抗体の生産及び繰り返されるベクター投与の効率に対するベクター投与時 のＣＤ４０Ｌシグナリングの一次的な遮断の影響を、本実験において評価した。 ｍＡＢと共にまたはそれなしに０日にベクターを与えられた動物を、２８日に異 なるレポーター遺伝子を含んでいるアデノウイルスベクターで再処理した。第二 のベクターの投与前に中和抗体に関して血液を分析し、３日後（すなわち、３１ 日）にレポーター遺伝子の発現の分析のために組織を集めた。 肺への遺伝子治療のモデルにおいて、最も印象的な結果を得た。ベクターの肺 への遺伝子導入後のＢＡＬ中の中和抗体の発生は、ＣＤ４０Ｌ抗体を投与された 動物において２０倍抑制された（図７）。ベクターの再投与後３日目に導入遺伝 子の発現が全くないことにより明白に示され るように、第二のベクターでの遺伝子導入は、非抗体処理の動物またはイソタイ プコントロールｍＡｂで処理した動物においてはうまくいかなかった（データは 示さない）。このことは、ベクターの２回目の投与後に遺伝子導入が達成される 、第一のベクター投与中にＣＤ４０Ｌ抗体で処理した動物と対照的である。導入 遺伝子の発現は、第二のベクター後に３０％の気道の＞２５％の気道上皮細胞に おいて検出され、これは、ベクターで処理された無処理動物において導入遺伝子 を発現する気道の数（すなわち、７５％；表II）よりほんのわずかに低い。ＣＤ ４０Ｌに対する抗体は、ウイルスの静脈内注入後の血清中の中和抗体の生産を部 分的に阻止した（図７）。このことは、第二のベクターでの肝臓へのいくらかの 遺伝子導入（肝細胞の８％）を可能にするのに十分であり、このことは、抗体の 非存在下では起こらないが、無処理動物におけるベクターの最初の投与後に得ら れるもの（８９％）よりかなり低い。実施例１０−短クールのシクロホスファミドは、マウスの肺及び肝臓における有 害な免疫反応を防ぐ 肝臓への遺伝子導入を調べるために血液へ、そして肺への遺伝子導入を調べる ために気管へＥ１を欠失したｌａｃＺウイルスを投与した時に、Ｃ５７ＢＬ／６ マウスに様々な投与計画においてシクロホスファミドを与えた。アルカリホスフ ァターゼレポーター遺伝子を発現している２つ目のＥ１を欠失したウイルスを、 最初のベクターを与えられた同じ器官に再投与する。局部（ｒｅｇｉｏｎａｌ ｓｉｔｅ）からリンパ細胞を単離し、ベクター特異的なＴ細胞活性化に関してイ ンビトロで評価した。炎症及びその結果、並びにｌａｃＺ及びＡＬＰの両方のレ ポーター遺伝子の発現の分析のために、様々な時に組織を集めた。 Ａ．動物研究 Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスに、０日に、気管（肺研究）または尾の静脈（肝臓 研究）を通して１ ｘ １０⁹ｐｆｕＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺを感染させた。 シクロホスファミド（２００ｍｌ ＰＢＳ中）注入を示したようにｉｖで与えた 。Ｈ５．０１０ＣＢＡＬＰを２８日に上記のように注入した。導入遺伝子の発現 の分析のために、３、２８、３１、及び５０日に動物を殺した。検死解剖を行っ た時に、肺及び肝臓組織を凍結切片用に調製し、一方、脾臓、気管支肺胞洗浄（ ＢＡＬ）、及び縦隔リンパ節（ＭＬＮ）を免疫学的アッセイのために集めた。 Ｂ．形態学的分析 免疫細胞化学分析のために、冷凍肝臓組織を凍結切片にし、一方、肺をＰＢＳ ／ＯＴＣの１：１混合物で膨張させ、冷凍し、そしてｂｌｏｃｋｓ凍結切片にし た。Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガクトピラ ノシド）組織化学のために、冷凍した６ｍｍ組織切片を０．５％グルタルアルデ ヒド中で１０分間固定し、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含んでいるＰＢＳで２回洗浄し、 そしてＰＢＳ中ｍｌ当たり１ｍｇのＸ−Ｇａｌ、５ｍＭ Ｋ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆、５ ｍＭ Ｋ₄Ｆｅ（ＣＮ）₆、及び１ｍＭ ＭｇＣｌ₂中で４時間インキュベートした 。アルカリホスファターゼ染色のために、凍結切片を０．５％グルタルアルデヒ ド中で１０分間固定し、ＰＢＳ中で２回洗浄した。これらの切片を、内因性のア ルカリホスファターゼ活性を不活性化するために６５℃で３０分間インキュベー トし、ＰＢＳ中で１回洗浄し、そしてｍｌ当たり０．１６５ｍｇのＢＣＩＰ（５ −ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩）及び０．３３ｍｇのニトロブ ルーテトラゾリウムを含んでいる１ ００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂中で３７℃で３０分間染色した。 Ｃ．免疫蛍光 凍結切片を−２０℃のメタノール中で１０分間固定し、空気乾燥させ、そして ＰＢＳ中で２回再水和させ、そして非特異的な結合を１０％ヤギ血清／ＰＢＳ中 で３０分間ブロックした。切片を、ラット−抗マウスＣＤ４抗体（抗Ｌ３Ｔ４、 ＧｉｂｃｏＢＲＬ、２％ヤギ血清中に１：１００希釈）と共に１時間インキュベ ートし、次に、５ｍｇのヤギ抗ラット免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）−フルオレセ インまたはラット抗マウスＣＤ８ａ−フルオレセインイソチオシアナート（抗Ｌ ｙ−２、ＧｉｂｃｏＢＲＬ、２％ヤギ血清中に１：１００希釈）と共に３０分間 インキュベートした。ＭＨＣクラスＩ染色のために、切片をＨ−２Ｋ^bＤ^b（２０ −８−４Ｓ）に対する１：５０希釈したマウスハイブリドーマ上清と共に６０分 間インキュベートし、次に、５ｍｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ結合フルオレセ インイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）と共に３０分間インキュベートした。切片 を２回洗浄し、ａｎｔｉｆａｄｅｎｔ Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ（Ｃａｎｔｅｒｂｕ ｒｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌａｂ．、Ｃａｎｔｅｒｂｕｒｙ、ＵＫ）で顕鏡用に 作った（ｍｏｕｎｔｅｄ）。 Ｄ．ＣＴＬアッセイ ＣＴＬアッセイのために、３匹のマウスからの脾臓細胞または１０匹のマウス からのリンパ細胞を集めた。細胞をＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺ（ＭＯＩ ０． ５）で５日間インビトロで再刺激し、前もってＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺを感 染させ、そして⁵¹Ｃｒを負荷したＭＨＣ適合標的細胞において、異なるエフェク ター／標的細胞比を用いてアッセイ した。特異的な⁵¹Ｃｒ放出のパーセントを、［サンプルのｃｐｍ−自然放出のｃ ｐｍ）／（最大放出のｃｐｍ−自然放出のｃｐｍ）］ｘ１００として計算した。 自然放出は、培地中にエフェクター細胞を含まずに標的細胞をアッセイすること により測定し、一方、最大放出は、６時間のインキュベーション時間の間、標的 細胞に５％ＳＤＳを加えることにより概算した。 Ｅ．サイトカイン放出アッセイ ６ ｘ １０⁶の脾臓細胞を、２４穴プレート中で、抗原（すなわち、１０のＭ ＯＩでＵＶで不活性化したＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺ）と共にまたはそれなし に２４時間培養した。１００ｍｌの無細胞上清を、丸底の９６穴プレート中の２ ｘ １０³のＨＴ−２細胞（ＩＬ−２及びＩＬ−４依存性細胞系）上へ移した。 培地及び１０％ラットコンカナバリンＡ上清を陰性及び陽性コントロールとして 用いた。６時間の［³Ｈ］チミジン（０．３５ｍＣｉ／ウェル）パルスにより４ ８時間後に増殖を測定した。 Ｆ．中和抗体アッセイ 補体を不活性化するために、血清及びＢＡＬを５６℃で３０分間インキュベー トした。ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ中の血清及びＢＡＬの連続希釈（５０ｍｌ、 １：２０で始まる）を１ ｘ １０⁶ｐｆｕのＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺと６０ 分間インキュベートし、９６穴プレート中の２ ｘ １０⁴のＨｅｌａ細胞（８０ ％融合）上に添加した。６０分のインキュベーション後、２０％ＦＢＳを含んで いる１００ｍｌのＤＭＥＭを加えた。これらの細胞を１６−１８時間後に固定し 、β−ガラクトシダーゼ活性に対して染色した。血清またはＢＡＬの代わりに培 地を加え た場合、全ての細胞が青色に染色された。５０％未満の細胞が青色に染色される 最も高い希釈により、中和抗体価を測定した。 本明細書に関係する全ての論文は、参考文献により含まれる。本発明の多数の 修正及び変形が上に同定された明細書中に含まれ、そしてこれらは当該技術分野 において熟練した者にとって明らかであると思われる。選択される特定の免疫調 節剤、投与方法、選択される組み換えベクター及び導入遺伝子、投与経路などを 含むそのような修正及び改変は、本明細書に付加した請求の範囲の中に含まれる と考えられる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年２月１４日 【補正内容】 請求の範囲 １． 同時に投与される組み換えウイルスに対する免疫反応を抑制するための 薬剤で、該ウイルスに対して誘導される中和抗体の機能を阻害し、そしてウイル スが感染した細胞のＣＴＬ除去を減少させる薬剤の製造のための免疫調節剤の使 用。 ２． 該免疫調節剤が、 ａ）サイトカイン、 ｂ）ＣＤ４⁺細胞を枯渇または阻害する剤、 ｃ）抗Ｔ細胞抗体、 ｄ）Ｔ細胞上のＣＤ４０リガンド及びＢ細胞上のＣＤ４０間の相互作用を阻止す る剤、 ｅ）Ｔ細胞上のＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンド及びＢ細胞上のＢ７間の相互 作用を阻止する剤、 ｆ）シクロホスファミド、 からなる群から選択される剤を含んでなる、請求の範囲１に記載の使用。 ３． サイトカインが、インターロイキン−４、インターロイキン−１２、及 びγ−インターフェロンからなる群から選択される、請求の範囲２ａに記載の使 用。 ４． 該剤が抗ＣＤ４抗体を含んでなる、請求の範囲２ｂに記載の使用。 ５． 該剤がＴ細胞上のＣＤ４０リガンドに結合する、請求の範囲２ｄに記載 の使用。 ６． 該剤が、可溶性のＣＤ４０分子及び抗ＣＤ４０リガンド抗体からなる群 から選択される、請求の範囲５に記載の使用。 ７． 該剤がＴ細胞上のＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドに結合する、請求 の範囲２ｅに記載の使用。 ８． 該剤が、可溶性のＣＤ２８、可溶性のＣＴＬＡ４、抗ＣＤ２８抗体、及 び抗ＣＴＬＡ４抗体からなる群から選択される、請求の範囲７に記載の使用。 ９． 該免疫調節剤がＤＮＡ分子を含んでなる、請求の範囲１−８のいずれか に記載の使用。 １０． 該免疫調節剤がタンパク質を含んでなる、請求の範囲１−８のいずれ かに記載の使用。 １１． 該組み換えウイルスがアデノウイルスである、請求の範囲１に記載の 使用。 １２． 薬剤が、該組み換えウイルスと同時に投与されることを特徴とする、 請求の範囲１−１１のいずれかに記載の使用。 １３． 薬剤が該組み換えウイルスをさらに含んでなる、請求の範囲１１に記 載の使用。 １４． 薬剤が、該組み換えウイルスの投与前に投与されることを特徴とする 、請求の範囲１−１１のいずれかに記載の使用。 １５． 薬剤が、該組み換えウイルスの投与後に投与されることを特徴とする 、請求の範囲１−１１のいずれかに記載の使用。 １６． 免疫調節剤及び組み換えウイルスを含んでなる製薬学的組成物。 １７． 該免疫調節剤が、 ａ）サイトカイン、 ｂ）ＣＤ４⁺細胞を枯渇または阻害する剤、 ｃ）抗Ｔ細胞抗体、 ｄ）Ｔ細胞上のＣＤ４０リガンド及びＢ細胞上のＣＤ４０間の相互作用を阻止す る剤、 ｅ）Ｔ細胞上のＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンド及びＢ細胞上のＢ７間の相互 作用を阻止する剤、 ｆ）シクロホスファミド、 からなる群から選択される剤を含んでなる、請求の範囲１６に記載の製薬学的組 成物。 １８． サイトカインが、インターロイキン−４、インターロイキン−１２、 及びγ−インターフェロンからなる群から選択される、請求の範囲１７ａに記載 の組成物。 １９． 該剤が抗ＣＤ４抗体を含んでなる、請求の範囲１７ｂに記載の組成物 。 ２０． 該剤がＴ細胞上のＣＤ４０リガンドに結合する、請求の範囲１７ｄに 記載の組成物。 ２１． 該剤が、可溶性のＣＤ４０分子及び抗ＣＤ４０リガンド抗体からなる 群から選択される、請求の範囲２０に記載の組成物。 ２２． 該剤がＴ細胞上のＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドに結合する、請 求の範囲１７ｅに記載の組成物。 ２３． 該剤が、可溶性のＣＤ２８、可溶性のＣＴＬＡ４、抗ＣＤ２８抗体、 及び抗ＣＴＬＡ４抗体からなる群から選択される、請求の範囲２２に記載の組成 物。 ２４． 該免疫調節剤がＤＮＡ分子を含んでなる、請求の範囲１７−２３のい ずれかに記載の組成物。 ２５． 該免疫調節剤がタンパク質を含んでなる、請求の範囲１７−２３のい ずれかに記載の組成物。 ２６． 該組み換えウイルスがアデノウイルスである、請求の範囲１６に記載 の組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/235 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 39/395 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＡ Ｃ１２Ｎ 15/09 37/66 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ， ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ウイルソン，ジエイムズ・エム アメリカ合衆国ペンシルベニア州19035グ ラツドウイン・ノースアビニヨンドライブ 1350 (72)発明者 ヤング，イツピング アメリカ合衆国ペンシルベニア州19104フ イラデルフイア・スプルースストリート 3817 (72)発明者 トリンキエリ，ジヨルジヨ アメリカ合衆国ペンシルベニア州19096ウ インウツド・ウイスターロード355

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 治療導入遺伝子を含んでいる組み換えウイルスで治療される患者におい て該ウイルスに対する免疫反応を減少させるための薬剤で、その有効量の投与が 該ウイルスの反復投与を可能にする薬剤の製造のための免疫調節剤の使用。 ２． 該免疫調節剤が、 ａ）サイトカイン、 ｂ）ＣＤ４⁺細胞を枯渇または阻害することができる剤、 ｃ）抗Ｔ細胞抗体 ｄ）Ｔ細胞上のＣＤ４０リガンド及びＢ細胞上のＣＤ４０間の相互作用を阻止す ることができる剤、 ｅ）Ｔ細胞上のＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンド及びＢ細胞上のＢ７間の相互 作用を阻止することのできる剤、 ｆ）シクロホスファミド からなる群から選択される剤を含んでなる、請求の範囲１に記載の使用。 ３． 該サイトカインが、Ｔ_H1がもたらす中和抗体またはＴ_H2がもたらす中和 抗体を抑制する、請求の範囲２ａに記載の使用。 ４． サイトカインが、インターロイキン−４、インターロイキン−１２、及 びγ−インターフェロンからなる群から選択される、請求の範囲３に記載の使用 。 ５． 該試剤が抗ＣＤ４抗体を含んでなる、請求の範囲２ｂに記載の使用。 ６． 該試剤がＴ細胞上のＣＤ４０リガンドに結合する、請求の範囲２ｄに記 載の使用。 ７． 該試剤が、可溶性のＣＤ４０分子及び抗ＣＤ４０リガンド抗体からなる 群から選択される、請求の範囲６に記載の使用。 ８． 該試剤がＴ細胞上のＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドに結合する、請 求の範囲２ｅに記載の使用。 ９． 該試剤が、可溶性のＣＤ２８、可溶性のＣＴＬＡ４、抗ＣＤ２８抗体、 及び抗ＣＴＬＡ４抗体からなる群から選択される、請求の範囲８に記載の使用。 １０． 該免疫調節剤がＤＮＡ分子を含んでなる、請求の範囲１−９のいずれ かに記載の使用。 １１． 該免疫調節剤がタンパク質を含んでなる、請求の範囲１−９のいずれ かに記載の使用。 １２． 該組み換えウイルスが組み換えアデノウイルスである、請求の範囲１ に記載の使用。 １３． 薬剤が、該組み換えウイルスと同時に投与されることを特徴とする、 請求の範囲１−１１のいずれかのに記載の使用。 １４． 薬剤が、該組み換えウイルスをさらに含んでなる、請求の範囲１３に 記載の使用。 １５． 薬剤が、該組み換えウイルスの投与前に投与されることを特徴とする 、請求の範囲１−１１のいずれかに記載の使用。 １６． 薬剤が、該組み換えウイルスの投与後に投与されることを特徴とする 、請求の範囲１−１１のいずれかに記載の使用。 １７． 免疫調節剤及び治療導入遺伝子を含んでいる組み換えウイルスを含ん でなる製薬学的組成物。 １８． 該免疫調節剤が、 ａ）サイトカイン、 ｂ）ＣＤ４⁺細胞を枯渇または阻害することができる剤、 ｃ）抗Ｔ細胞抗体、 ｄ）Ｔ細胞上のＣＤ４０リガンド及びＢ細胞上のＣＤ４０間の相互作用を阻止す ることができる剤、 ｅ）Ｔ細胞上のＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンド及びＢ細胞上のＢ７間の相互 作用を阻止することができる剤、 ｆ）シクロホスファミド、 からなる群から選択される試剤を含んでなる、請求の範囲１７に記載の製薬学的 組成物。 １９． 該サイトカインが、Ｔ_H1がもたらす中和抗体またはＴ_H2がもたらす中 和抗体を抑制する、請求の範囲１８ａに記載の組成物。 ２０． サイトカインが、インターロイキン−４、インターロイキン−１２、 及びγ−インターフェロンからなる群から選択される、請求の範囲１９に記載の 組成物。 ２１． 該剤が抗ＣＤ４抗体を含んでなる、請求の範囲１８ｂに記載の組成物 。 ２２． 該剤がＴ細胞上のＣＤ４０リガンドに結合する、請求の範囲１８ｄに 記載の組成物。 ２３． 該剤が、可溶性のＣＤ４０分子及び抗ＣＤ４０リガンド抗体からなる 群から選択される、請求の範囲２２に記載の組成物。 ２４． 該剤がＴ細胞上のＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドに結合する、請 求の範囲１８ｅに記載の組成物。 ２５． 該剤が、可溶性のＣＤ２８、可溶性のＣＴＬＡ４、抗ＣＤ２ ８抗体、及び抗ＣＴＬＡ４抗体からなる群から選択される、請求の範囲２４に記 載の組成物。 ２６． 該免疫調節剤がＤＮＡ分子を含んでなる、請求の範囲１７−２５のい ずれかに記載の組成物。 ２７． 該免疫調節剤がタンパク質を含んでなる、請求の範囲１７−２５のい ずれかに記載の組成物。 ２８． 該組み換えウイルスが組み換えアデノウイルスである、請求の範囲１ ８に記載の組成物。