JP3868489B2 - リポタンパク質の代謝における欠陥の治療のための遺伝子治療の方法及び組成物 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、体細胞遺伝子治療の分野及びリポタンパク質の代謝に関する遺伝的疾患の治療に関する。
発明の背景
脂質、特に、コレステロールの代謝は、多数のリポタンパク質及びアポリポタンパク質の相互作用を伴う。超低密度リポタンパク質(VLDL)及びアポリポタンパク質E(apoE)は、低密度リポタンパク質(LDL)の生産における、そしてコレステロールを含む全般的な脂質の代謝における重要な前駆体分子である。LDLは、ヒト血漿における主要なコレステロール輸送リポタンパク質である。
VLDL/apoEレセプターは、心臓、骨格筋、及び脂肪組織[F.M.Wittmaack等、Endocrinol.、136(1):340−348(1995)]において、そして腎臓、胎盤、膵臓、及び脳においてより低いレベルの発現で発現される。このレセプターは、特定の器官によるトリグリセリドに富んだリポタンパク質粒子の取り込みにおいて役割を果たすことが示唆されている。ヒトVLDLレセプターと考えられるものをコードしているcDNAが、最近、クローン化された[引用することにより本明細書に取り込まれるM.E.Gafvels等、Som.Cell Mol.Genet.、19:557−569(1993)]。LDLに対するレセプターは、肝臓及び他の器官において細胞表面上の被服小窩に位置する。
図1Aにおいて描かれるように、正常な健康なヒトにおいて、分子、アポリポタンパク質B48(Apo−B48)、アポリポタンパク質C−II(Apo−C−II)、及びApoEは、腸へ向かう血漿においてキロミクロン粒子を形成し、これは肝臓においてキロミクロン残存(remnant)レセプターと相互作用する。残存レセプターにより取り込まれたキロミクロンの代謝後、肝臓は、Apo−E、Apo−C−II、及びアポリポタンパク質B100(Apo B100)を含む一次リポタンパク質、VLDLを生産する。VLDLは、Apo B100を介して肝臓のLDLレセプターに結合するLDLに代謝される。肝臓のLDLレセプターは、レセプター依存性エンドサイトーシスによるLDLの取り込みを促進する。LDLは、リソソームにおいて分解され、そのコレステロールは、代謝用途のために放出される。
そのようなリポタンパク質及び/またはレセプターの代謝における欠陥は、いくつかの重い代謝異常をもたらす。ヒト疾病の家族性高コレステロール血症(FH)は、主に、LDLレセプターをコードしている遺伝子中の一つまたはそれより多い突然変異により引き起こされる。FHは、(1)LDLの高い濃度、(2)腱及び皮膚(黄色腫)における、そして動脈(アテローム)におけるLDL由来のコレステロールの沈着、及び(3)遺伝子量効果を有する常染色体優性形質としての遺伝により臨床的に特徴づけられる。FHの個体は、通常、幼年期に、早期冠動脈性心疾患にかかる。ヘテロ接合体は500人に約1人であり、FHを最も一般的な先天的な代謝の誤りの中に位置づける。ヘテロ接合体は、出生から血漿コレステロールの2倍の上昇(350ないし550mg/dl)を有し、20歳より後に、腱黄色腫及び冠状動脈アテローム硬化症にかかりやすい。ホモ接合体は、百万人に1人であり、重い高コレステロール血症(650ないし1000mg/dl)、生涯の最初の4年以内に現れる皮膚黄色腫、及び幼少期に始まり、20歳前にしばしば死をもたらす冠動脈性心疾患により特徴づけられる。[J.Goldstein等、「Familial Hypercholesterolemia」、第48章、The Metabolic Basis of Inherited Disease中、第6版、C.R.Scrivers等(eds)、McGraw−Hill Information Services Co.、NY、NY、(1989)1215−1250頁]。
他の代謝異常は、心筋梗塞の生存者及びその親戚における高脂血症と最初関係した家族性複合(combined)高脂血症(FCH)である。FCH患者は、通常、3つの表現型、すなわち、(1)高いレベルのVLDL、(2)高いレベルのLDL、または(3)血漿中の両リポタンパク質のレベルの増加の一つを有する。FHと異なり、FCHは、通常、高トリグリセリド血症の形態(hypertriglyceridemia)において、幼少期における患者の10ないし20%のみに現れる。この形質に対するホモ接合性は、重い高トリグリセリド血症をもたらすことができる。[J.Goldstein等、「Disorders of the Biogenesis and Secretion of Lipoproteins」、The Metabolic Basis of Inherited Diseaseの第44B章、第6版、C.R.Scrivers等(eds)、McGraw−Hill Information Services Co.、NY、NY、(1989)1155−1156頁]。この疾患はまた、多数の個体において、グルコース過敏症及び肥満の出現と関係する。
FCHの最も顕著な異常は、血漿のVLDL含有量の著しい上昇である。VLDLの増加した生産は、ある個体においてはVLDLの膨らんだ血漿プールをもたらすが、より効率よい脂質分解を有する個体においては、増加したレベルのLDLをもたらす。FCHは、LDLレセプターの遺伝的欠陥よりむしろLDLの過剰生産により特徴づけられる。培養した繊維芽細胞のLDLレセプターは、FCH患者において正常であるようにみえる。
臨床経験は、FCHが、北アメリカ人口の約1%に生じ、FHより少なくとも5倍一般的であることを示す。この疾患にかかった患者の間の冠動脈性心疾患への偏向は、それを早期アテローム硬化症の最も顕著な既知の代謝原因にする[上に引用したJ.Goldstein等]。
FHにおけるようにLDLレセプターに欠陥がある(図1B参照)か、またはFCHにおけるように過剰のVLDLのために過剰のLDLが生産される場合、肝臓による血漿からのLDLの効率よい除去が減少し、LDLのレベルが、レセプター数に逆比例して上昇する。過剰の血漿LDLは、結合組織においてそして清掃細胞において沈着され、いずれかの疾患の症状をもたらす。
現在、FH及びFCHの治療は、薬剤の投与、すなわち、FHの治療のための胆汁酸結合樹脂及び3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoA還元酵素の複合投与、並びにFCHの治療のためのナイアシンによりLDLの血漿レベルを下げることに向けられている。しかしながら、2つの非機能遺伝子を有するFHホモ接合体は、LDLレセプターを刺激することにより働く薬剤に耐性である。同様に、そのような薬剤は、FCHにおいて特に効果がない。FHホモ接合体において、血漿LDLレベルは、物理的または外科的手段によってのみ下げられることができる。
アデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療による正常なLDLレセプター遺伝子の投与が、FHの治療に対して意図されている。アデノウイルスベクターは、分裂状態にかかわらず、実質的に全ての細胞型への非常に高いレベルの導入遺伝子の運搬を提供することができる。遺伝的不均衡を補う治療導入遺伝子をインビボで運搬することにおけるこの系の効率は、様々な疾患の動物モデルにおいて示されている[K.F.Kozarsky等、Somatic Cell Mol.Genet.、19:449−458(1993)(「Kozarsky I」);K.F.Kozarsky等、J.Biol.Chem.、269:13695−13702(1994)(「Kozarsky II」);Y.Watanabe、Atherosclerosis、36:261−268(1986);K.Tanzawa等、FEBS Letters、118(1):81−84(1980);J.L.Golasten等、New Engl.J.Med.、309:288−296(1983);S.Ishibashi等、J.Clin.Invest.、92:883−893(1993);及びS.Ishibashi等、J.Clin.Invest.、93:1885−1893(1994)]。インビボで肝細胞へ遺伝子を形質導入することにおけるアデノウイルスベクターの使用は、齧歯類動物及びウサギにおいて以前示されている[例えば、上に引用したKozarsky II及びS.Ishibashi等、J.Clin.Invest.、92:883−893(1993)を参照]。
最近の研究は、FHの状態によく似たLDLレセプターに欠陥のあるワタナベ遺伝性高脂血症(WHHL)ウサギの肝臓へのヒトLDLレセプター(「LDLR」)cDNAをコードしている組み換えアデノウイルスの導入が、血漿コレステロールにおける大きい一時的な減少をもたらすことを示している。大部分の状態における組み換えアデノウイルスの効果の一時的な性質は、ウイルスが感染した細胞に対する細胞性免疫の発生及びそれに続くこれらの除去のためであると考えられる。免疫がもたらす除去の抗原標的は、組み換えウイルスゲノムから発現されるウイルスタンパク質及び/または導入遺伝子の産物、この場合、LDLレセプタータンパク質である[Y.Yang等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、91:4407−4411(1994年5月);Y.Yang等、Immun.、1:433−442(1994年8月)]。
さらに、LDLR遺伝子を含んでいるアデノウイルスの繰り返された再注入は、中和抗アデノウイルス抗体の発生のために、同様の続いて起こるコレステロールの減少を生じなかった[引用することにより全て本明細書に取り込まれる、上に引用したKozarsky I及びKozarsky II;Y.Yang等、Immun.、1:433−442(1994年8月)も参照]。
当該技術分野において、FH及びFCH、並びにリポタンパク質の代謝における他の欠陥の効果的な治療及び/または予防を可能にする治療組成物及び遺伝子治療法に対する必要性が残っている。
発明の要約
一つの態様において、本発明は、アデノウイルスのゲノムの少なくとも一部で、肝細胞に感染することのできる部分のDNAまたはそれに対応するDNA、及び発現を誘導する調節配列に適切に連結されたヒトVLDLレセプター(「VLDLR」)遺伝子を含んでなる組み換えウイルスベクターを提供し、このベクターは、インビボまたはインビトロで肝細胞においてVLDLR遺伝子産物を発現することができる。
他の態様において、本発明は、上記のウイルスベクターで感染させた哺乳類細胞を提供する。
さらなる態様において、本発明は、上記の組み換えウイルスベクターの有効量を哺乳類の肝細胞に導入することを含んでなる、VLDLR遺伝子を運搬し、そして該細胞の染色体に安定に組み込むための方法を提供する。
本発明の他の態様は、正常なVLDLR遺伝子を含んでいる上記のベクターの有効量を適当な経路により患者に投与することを含んでなる、代謝異常にかかっている患者を治療するための方法であり、その際、該VLDLR遺伝子は、該患者の肝細胞の染色体に組み込まれ、そして該レセプターは、通常発現されない体内の位置でインビボで安定に発現される。
本発明の他の態様及び利点は、その好ましい態様の以下の詳細な説明においてさらに記述される。
【図面の簡単な説明】
図1Aは、正常なヒト及びウサギのリポタンパク質の代謝の概略図である。アポリポタンパク質は、B48、B100、C−II、及びEとして表される。LDL及びVLDLが識別される。
図1Bは、FH患者及びWHHLウサギにおけるリポタンパク質の代謝の概略図である。省略形は、図1Aにおいて記述されたようである。
図1Cは、本発明による組み換えVLDLR遺伝子を注入されたウサギにおけるリポタンパク質の代謝の概略図である。
図2は、アデノウイルス地図単位0−1(Ad 0−1)、及びそれに続くサイトメガロウイウスのエンハンサー/プロモーター(CMV enh/prom)、ヒトVLDLR遺伝子、ポリAシグナル(pA)、アデノウイルス地図単位9−16(Ad 9−16)、並びに複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドpAT153からのプラスミド配列を含むプラスミドpAd.CMVVLDLRの概略図である。
図3は、0ないし100がアデノウイルス5型(ジーンバンク登録番号M73260)の地図単位を表し、そしてpAd.CMVVLDLRのCMV/VLDLR/pAミニカセットがアデノウイルス地図単位1及び9の間に挿入され、残りのAd5地図単位9−100が地図単位約78.5及び約84.3の間に部分的なE3遺伝子の欠失を有する、組み換えアデノウイルスH5.010CMVVLDLRの概略図である。
図4Aは、組み換えアデノウイルスH5.010CMVlacZを与えられる前後の日数の関数として、WHHLウサギに対してmg/dl単位で血漿コレステロールレベルにおける変化を表しているグラフである。記号は個々の動物を表す。実施例3を参照。
図4Bは、組み換えアデノウイルスH5.010CMVVLDLRを与えられる前後の日数の関数として、WHHLウサギに対してmg/dl単位で血漿コレステロールレベルにおける変化を表しているグラフである。記号は4匹の個々の動物の反応を表す。実施例3を参照。
図5は、組み換えアデノウイルスH5.010CMVlacZ(lacZ)、組み換えアデノウイルスH5.010CMVVLDLR、及び組み換えアデノウイルスH5.010CBhLDLRを注入したマウスにおける(注入前%として測定された)コレステロールレベルを表している棒グラフである。点々を打った棒は、注入前のレベルを表し、詰まった棒は、注入後のレベルを表す。実施例4を参照。
図6は、組み換えアデノウイルスH5.010CMVlacZ(lacZ)、組み換えアデノウイルスH5.010CMVVLDLR、及び組み換えアデノウイルスH5.010CBhLDLRを注入したマウスにおけるコレステロールレベル、特に(mg/フラクションとして測定された)血漿リポタンパク質のフラクションのレベルを表している棒グラフである。詰まった棒は、密度(d)>1.21以内に当たるタンパク質またはフラグメントを表し、密に網目線を描いた棒はHDLを表し、緊密に網目線を描いた棒はLDLを表し、間隔を離した斜め線を引いた棒は中間密度リポタンパク質(IDL)を表し、そして白い棒は、VLDLレベルを表す。実施例4を参照。
図7Aは、H5.010CMVLacZを注入したLDLレセプターノツクアウトマウスに対して注入前後の日数の関数として、(mg/dl単位で測定された)コレステロールレベルにおける変化を表しているグラフである。記号は、個々の動物の反応を表す。実施例5を参照。
図7Bは、H5.010CBhLDLRを注入したLDLレセプターノツクアウトマウスに対して注入前後の日数の関数として、(mg/dl単位で測定された)コレステロールレベルにおける変化を表しているグラフである。記号は、図7Aに対するものと同じである。実施例5を参照。
図7Cは、H5.010CMVVLDLRを注入したLDLレセプターノツクアウトマウスに対して(mg/dl単位で測定された)コレステロールレベル対注入前後の日数における変化を表しているグラフである。記号は、図7Aに対するものと同じである。実施例5を参照。
図7Dは、H5.010CMVlacZ(n=9)またはH5.010CMVVLDLR(n=10)を注入したLDLレセプターノツクアウトマウスに対して、2回の実験からの平均結果±標準偏差を与えているグラフである。平均の注入前コレステロールレベルは、それぞれ870mg/dl及び946mg/dlであった。アステリスクは、p<0.05を示す。
図8A−8Fは、上に引用したGafvels等により報告された、ヒトVLDLレセプター遺伝子のコードされるアミノ酸配列[配列番号2]を含むDNA配列[配列番号1]である。
図9A−9Iは、Ad 0−1がヌクレオチド12−364にわたり、CMV enh/promがヌクレオチド381−862にわたり、ヌクレオチド966−4107がVLDLRをコードし、pAがヌクレオチド4192−4390にわたり、Ad 9.2−16.1がヌクレオチド4417−6880にわたり、そしてヌクレオチド6881−9592がpAT153配列である、pAd.CMVVLDLR[配列番号3]のDNA配列である。
図10Aは、25:1のエフェクター:標的細胞比で測定されたCTL活性(平均±標準偏差)を示している棒グラフである。**=p<0.005;*=P<0.05。
図10Bは、様々なエフェクター:標的比に対して測定されたCTL活性を示している折れ線グラフである。
図11Aは、実施例9において記述されるように、0日にアデノウイルスを感染させ、そして28日に壊死させたC57BL/6マウスのBALサンプル中に存在する中和抗体価を要約しているグラフである。コントロールは、正常なマウスを表し(「コントロール」)、CD4 mABは、CD4+細胞を枯渇させたマウスを表し、IL−12は、IL−12で処理したマウスを表し、IFN−γは、IFN−γで処理したマウスを表す。
図11Bは、BALサンプル中に存在するIgGの相対量(OD405)を要約しているグラフである。記号は、図11Aにおいて記述されたようである。
図11Cは、BALサンプル中に存在するIgAの相対量(OD405)を要約しているグラフである。記号は、図11Aにおいて記述されたようである。
発明の詳細な記述
本発明は、ヒト血漿中のLDLの蓄積により特徴づけられる、FH及びFCHのような代謝異常の治療処置を可能にする新規の組成物及び方法を提供する。本発明は、哺乳類において通常発現される遺伝子、すなわち、超低密度リポタンパク質に対する正常なレセプターをコードしている遺伝子(VLDLR)を、その遺伝子が本来存在しない体内の位置、すなわち、肝臓に導入し、そして安定に発現するためのウイルスベクターの使用を提供する。
本発明の方法及び組成物は、LDLレセプターに欠陥のある個体の遺伝子治療処置において以前同定された問題を克服する。以下に詳細に記述されるように、肝臓の細胞を標的とすることができるウイルスベクターの使用により、VLDLレセプターが肝臓細胞に導入され、そこで安定に発現される。本発明は、VLDLレセプタータンパク質が、LDLレセプターに欠陥のある個体、例えば、マクロファージにおいて正常に発現される点において、直接的な遺伝子置換と異なる。従って、VLDLR遺伝子を保有している肝臓へのウイルスベクターを用いた遺伝子治療は、新しい遺伝子産物の発現をもたらすのではなく、むしろ、その遺伝子産物をさもなければ発現しない器官における新規発現をもたらす。重要なことには、ベクターが運ぶVLDLR遺伝子は、異種抗原として認識されず、トランスフェクトされた細胞のCTLがもたらす除去の誘導がないので、患者は、肝臓において発現されたVLDLR遺伝子産物に対して免疫反応を高めない。それに反して、LDLR遺伝子がFHにかかったLDLRに欠陥のある個体に投与される場合、ウイルスベクターのCTLがもたらす除去は問題である[例えば、上に引用したKozarsky I及びIIを参照]。
患者の免疫系によるVLDLR遺伝子の既知の遺伝子としてのこの認識のために、そして肝細胞が循環において長い寿命を有する傾向のために、VLDLR遺伝子を発現する本発明のベクターでトランスフェクトした肝細胞は安定である傾向にあり、そしてVLDLR発現は一時的ではない。トランスフェクトされた肝細胞におけるVLDLR遺伝子の発現は、肝細胞の寿命の期間中起こる。リポタンパク質の代謝異常は、ウイルスベクターを再注入する必要なしにより長期間治療されることができ、従って、ウイルスの提示回数及びベクターにコードされるウイルスタンパク質に対する免疫反応を制限する。
本発明のベクター及び方法は、リポタンパク質代謝異常を治療するそして/またはこれらに対する現在の治療を補足するために有用な遺伝子治療を提供することができる。本発明によるトランスフェクトされた肝細胞におけるVLDLレセプター遺伝子の存在は、肝臓の部位での血漿からのLDLの前駆物質、VLDLの結合を可能にし、それにより、血漿中のVLDLの量を減少させる。血漿中のVLDLの減少は、結果として、血漿LDLの生産を減少させる。
例えば、FHにおいて、この血漿LDLの減少は、肝臓における欠陥のあるLDLレセプターを埋め合わせることができる。FCHにおいて、このVLDLからの血漿LDLの減少した生産は、肝臓における正常なLDLレセプターが、過剰なLDLにより負担をかけすぎられるようになることを防ぎ、そしてこの疾患に寄与する過剰のVLDLを減少させる。例えば、脂質の代謝の正常な作用の概略図(図1A)をFHにより引き起こされる異常な代謝(図1B)と、そして次に、本発明の方法(図1C)と比較。
I.遺伝子治療ベクターとしての組み換えウイルス粒子
本発明の組成物は、肝細胞へ機能的な正常VLDLレセプター遺伝子を運びそして安定に組み込むことができる、望ましい遺伝子治療ベクターの構築に関する。そのような遺伝子治療ベクターは、望ましくは一つまたはそれより多いウイルス遺伝子において欠失した、選択したウイルスベクター、調節配列の制御下にVLDLR遺伝子を含んでいるミニ遺伝子、及び場合によってはヘルパーウイルス、及び/または欠失したウイルス遺伝子のあらゆる必要な産物をウイルスベクターに供給するパッケージング細胞系含む。
ベクターに用いられるウイルス配列、必要な場合、ヘルパーウイルス、及び組み換えウイルス粒子、及び本明細書において記述されるベクターの構築において用いられる他のベクター成分及び配列は、以前に発表され、記述された配列に基づいて、市販または学術の供給者から得られる。これらのウイルス成分はまた、個々の患者から得られることもできる。ウイルス配列及びベクター成分は、当該技術分野において熟練した者により既知であり行われる標準的な組み換え分子クローニング技術と一緒に、本明細書に含まれる教示及び参考文献の方法を用いることにより作られることができる。本明細書により教示される配列の欠失、挿入、及び他の突然変異を含む、ベクターを形成する存在している核酸配列の修正は、標準的な技術を用いて作られることができる。
ベクター、VLDLR「ミニ遺伝子」のクローニング及び構築、及び所望されるウイルスベクターへのその挿入において有用なウイルス配列の選択、並びにヘルパーウイルス等の使用による組み換え感染性ウイルス粒子の生産のために用いられる方法は、本明細書において提供される教示を考慮すると当該技術分野における技術の範囲内である。
A.「ミニ遺伝子」の構築
「ミニ遺伝子」は、VLDLR遺伝子、及びインビボで遺伝子を転写し、遺伝子産物を発現するために必要な他の調節成分の組み合わせを意味する。ヒトVLDLレセプター配列は提供されている[上にした引用Gafvels等;配列番号1及び2]。通常、このレセプター配列の全コーディング領域がミニ遺伝子において用いられ、すなわち、配列番号1の5’及び3’非翻訳配列はミニ遺伝子に必須ではない。他の哺乳類の起原、例えば、ウサギ、サルなどのVLDLレセプター遺伝子も、本発明において有用であることができる。
VLDLレセプター遺伝子(VLDLR)は、その転写を可能にするように調節成分に適切に連結される。そのような成分は、ウイルスベクターでトランスフェクトした細胞においてVLDL導入遺伝子の発現を誘導するのに必要な通常の調節成分を含む。従って、ミニ遺伝子はまた、導入遺伝子に連結され、そして他の調節成分と共に、組み換えベクターの選択したウイルス配列内に位置される選択したプロモーターも含む。
プロモーターの選択は、慣例になっていることで、本発明の制限ではない。有用なプロモーターは、発現される導入遺伝子の量を制御できる、構成的プロモーターまたは調節的(誘導性)プロモーターであることができる。例えば、望ましいプロモーターは、サイトメガロウイルスの即時型初期プロモーター/エンハンサー[例えば、Boshart等、Cell、41:521−530(1985)を参照]のものである。他の望ましいプロモーターは、ラウス肉腫ウイルスのLTRプロモーター/エンハンサーを含む。さらに他のプロモーター/エンハンサー配列は、ニワトリ細胞質β−アクチンプロモーター[T.A.Kost等、Nucl.Acids Res.、11(23):8287(1983)]である。他の適当なプロモーターは、当該技術分野において熟練した者により選択されることができる。
ミニ遺伝子はまた、望ましくは、転写物の効率よいポリA付加のために必要なシグナルを与える配列(ポリAまたはpA)並びに機能的なスプライスドナー及びアクセプター部位を有するイントロンを含むウイルスベクター配列に非相同の核酸配列を含む。本発明の典型的なベクターにおいて用いられる一般的なポリA配列は、パポバウイルスSV40由来のものである。ポリA配列は、通常、導入遺伝子配列の後、そしてウイルスベクター配列の前でミニ遺伝子に挿入される。一般的なイントロン配列もまた、SV40由来であり、SV40 Tイントロン配列と言われる。本発明のミニ遺伝子はまた、望ましくはプロモーター/エンハンサー配列及び導入遺伝子の間に位置されたそのようなイントロンを含むこともできる。これら及び他の一般的なベクター成分の選択は慣例であり[例えば、Sambrook等、「Molecular Cloning.A Laboratory Manual.」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、New York(1989)及び本明細書において引用した参考文献を参照]、多数のそのような配列が、市販及び産業の供給者から、並びにジーンバンクから入手できる。
上に述べたように、ミニ遺伝子は、ウイルスベクターにおけるあらゆる選択した欠失の部位に位置される。以下の実施例1を参照。
B.ウイルスプラスミドベクターの構築
多数のウイルスベクターが遺伝子治療のために提案されているけれども、本発明の目的のために最も望ましいベクターは、組み換えアデノウイルスベクターまたはアデノ関連ベクターである。以下に記述されるように、アデノウイルスベクターは、大量に精製され、そして非常に濃縮されることができ、そしてこのウイルスは非分裂細胞へ遺伝子を形質導入することができるので、アデノウイルスベクターが好ましい。しかしながら、他のアデノウイルス、またはレトロウイルス、ワクシニア、または他のウイルスベクターでさえが同様に構築されることは、当該技術分野の技術の範囲内である。
アデノウイルスは、様々な細胞型へ治療またはレポーター導入遺伝子を効率よく運ぶように修飾されることができる真核生物のDNAウイルスである。ヒトアデノウイルスは、各360bpの長さである100の地図単位(m.u.)に分割される、直鎖状の約36kbの二本鎖DNAゲノムを含んでなる。このDNAは、ウイルスDNAの複製のために必要である短い逆末端反復(ITR)をゲノムの各末端に含む。遺伝子産物は、ウイルスDNA合成の開始前または後の発現に基づき、初期(E1からE4まで)及び後期(L1からL5まで)領域にまとめられる[例えば、Horwitz、Virology、第2版、ed.B.N.Fields、Raven Press、Ltd.、New York(1990)を参照]。一般的なアデノウイルス2及び5型(それぞれ、Ad2及びAd5)はヒトの悪性腫瘍と関係しない。
遺伝治療において有用である適当なアデノウイルスベクターは、よく知られている[例えば、M.S.Horwitz等、「Adenoviridae and Their Replication」、Virology、第2版、1712頁、ed.B.N.Fields等、Raven Press Ltd.、New York(1990);M.Rosenfeld等、Cell、68:143−155(1992);J.F.Engelharndt等、Human Genet.Ther.、4:759−769(1993);Y.Yang等、Nature Genet.、7:362−269(1994);J.Wilson、Nature、365:691−692(1993年10月);B.J.Carter、「Handbook of Parvoviruses」中、ed.P.Tijsser、CRC Press、155−168頁(1990)を参照]。アデノウイルス型の選択は、以下の発明を制限すると思われない。
本発明において有用なアデノウイルスベクターは、多数のアデノウイルス型のDNA配列を含む。本明細書において記述されるベクターにおいて有用なアデノウイルスの配列は、現在同定された41のヒト型[例えば、上に引用したHorwitzを参照]を含むあらゆる既知のアデノウイルス型から得られることができる。アデノウイルス5型の株の配列は、ジーンバンク登録番号M73260から容易に得られることができる。同様に、他の動物に感染することが知られているアデノウイルスもまた本発明のベクター構築物において用いられることができる。様々なアデノウイルス株が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)Rockville、Marylandから入手でき、または様々な市販及び研究所の供給者から請求により入手できる。
本発明において有用なアデノウイルスベクターは、場合によっては他の突然変異、例えば、温度感受性突然変異、欠失を保有している組み換え欠損アデノウイルス、及びアデノウイルス/アデノ関連ウイルス配列で形成されたハイブリッドベクターを含む。適当なベクターは、発表された文献において記述されている[例えば、上に引用したKozarsky I及びII、並びに本明細書において引用された参考文献、米国特許番号第5,240,846号、及び以下の引用することにより本明細書に取り込まれる同時出願中の明細書を参照]。
肝臓へのVLDLR遺伝子の運搬のために有用なアデノウイルスベクター、最小のアデノウイルス核酸配列がベクターを作製するために用いられることができ、その場合、ハイブリッドウイルス粒子を作るためのヘルペーウイルスの使用が必要とされる。代わりに、一つまたはそれより多いアデノウイルス遺伝子の選択した欠失のみが、ウイルスベクターの構築のために用いられることができる。欠失した遺伝子産物は、失われた遺伝子産物を供給する選択したパッケージング細胞系を用いることにより供給されることができる。
1.組み換え最小アデノウイルス
本発明において有用な望ましいアデノウイルス(Ad)ベクターは、これらのベクターを記述する目的のために、引用することにより本明細書に取り込まれる、同時係属中で共同所有する米国特許出願Serial番号第08/331,381号において詳細に記述される。
簡潔に要約すると、最小Adウイルスは、複製及びビリオンをキャプシドで包むために必要なアデノウイルスのシス成分のみを含んでいるが、そうでなければ、全てのアデノウイルス遺伝子を欠失したウイルス粒子である。すなわち、このベクターは、(複製起点として機能する)シスに作用するアデノウイルスの5’及び3’逆末端反復(ITR)配列、並びに直鎖状のAdゲノムをパッケージングするために必要な配列及びE1プロモーターのためのエンハンサー成分を含む天然の5’パッケージング/エンハンサー領域のみを含む。これは、通常の公表されたAd5アデノウイルスゲノムのbp1ないし約360にわたり、ウイルスゲノムの地図単位0−1とも呼ばれるAd5ゲノムの末端(5’)配列を残し、通常約353から約360までのヌクレオチドの長さである。この配列は、5’ITR(アデノウイルスゲノムのbp1ないし約103)及びパッケージング/エンハンサー領域(アデノウイルスゲノムのbp約194ないし約358)を含む。アデノウイルスベクターの最小3’アデノウイルス配列は、アデノウイルスゲノムのbp約35,353ないし末端、または地図単位〜98.4−100にわたるアデノウイルスゲノムの右末端(3’)ITR配列を含むことができる。この配列は、通常、約580ヌクレオチドの長さである。上記のように、そのような配列の間に、VLDLRミニ遺伝子が挿入される。
この最小Adウイルスベクターからの感染性粒子の生産は、以下に説明するように、ヘルパーウイルスの補助を伴う。上に含まれた参考文献においても開示された第二の型の最小ベクターは、3’末端配列に対して5’Ad末端配列を同じ向きに配置する。ヘルパーウイルス及び/またはパッケージング細胞系と共感染させた最小Adベクターは、VLDLRミニ遺伝子を含んでいる感染性の組み換えウイルス粒子を生産するために必要なウイルス遺伝子産物の全てを提供する。代わりに、このベクターは、次にヘルパーウイルスにより供給されることが必要とされない、付加的なアデノウイルス遺伝子配列を含むことができる。
2.他の欠損アデノウイルス
本発明の遺伝子治療のために有用な組み換えの複製能力を欠いたアデノウイルスは、上に定義した最小アデノウイルス配列以上を含んでいることにより特徴づけられることができる。これらの他のAdベクターは、ウイルスの遺伝子領域の様々な部分の欠失、並びに場合によってはヘルパーウイルス及び/またはパッケージング細胞系の使用により形成される感染性のウイルス粒子により特徴づけられることができる。適当な欠損アデノウイルスは、引用することにより本明細書に全て取り込まれる、Kozarsky及びWilson、Curr.Opin.Genet.Devel.、3:499−503(1993);上に引用したKozarsky I及びII、及び本明細書に引用された参考文献においてより詳細に記述される。
一つの例として、適当なベクターは、正常な生物学的機能を除去するように、アデノウイルスの(mu1.3ないし4.5にわたる)初期即時型初期遺伝子E1a及び(mu4.6ないし11.2にわたる)遅延型初期遺伝子E1bの全てまたは十分な部分を欠失させることにより形成されることができる。これらの複製能力を欠きE1を欠失したウイルスは、トランスに対応する遺伝子産物を提供する機能的なアデノウイルスE1a及びE1b遺伝子を含んでいる、アデノウイルスで形質転換された相補性ヒト胚腎臓細胞系、293細胞[ATCC CRL1573]において生育されると、複製し、そして感染性のウイルスを生産することができる。得られたウイルスは、多数の細胞型に感染することができ、そして導入遺伝子(すなわち、VLDLR遺伝子)を発現することができるが、非常に高い感染多重度で細胞が感染されなければ、E1領域DNAを保有しない大部分の細胞において複製できない。動物における詳細な経験は、有害な細胞性免疫反応を引き起こす低いレベルのウイルスタンパク質が発現されるので、E1を欠失したベクターは遺伝子治療のために特に望ましいものではないことを示す。
好ましい例として、(mu76.6ないし86.2にわたる)アデノウイルス遅延型初期遺伝子E3の全てまたは一部が、ハイブリッド構築物の一部を形成するアデノウイルス配列から除かれることができる。E3の機能は、組み換えウイルス粒子の機能及び生産に関係がない。例えば、Adベクターは、既知の突然変異体Ad5 sub360バックボーン[J.Logan等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81:3655−3659(1984)]またはAd5突然変異体d17001バックボーン[Dr.William Wold、ワシントン大学、St.Louis]のE1を欠失した領域に挿入された治療ミニ遺伝子で構築されることができる。両突然変異体ウイルスはまた、アデノウイルスゲノムのE3領域において、すなわち、sub360においては78.5ないし84.3muで、そしてd17001においては78.4ないし86muで欠失を含む。sub360及びd17001の両方の生活環は、野生型の特徴を示す。
より好ましいアデノウイルスベクターは、E1遺伝子、E3領域の少なくとも一部の欠失、及びVLDLRミニ遺伝子を受け入れるためのE1及びE3以外のアデノウイルス遺伝子内の付加的な欠失、並びに/またはアデノウイルスタンパク質の減少した発現及び/または減少したウイルス複製をもたらす他の突然変異を有して構築されることができる。例えば、(mu67.9ないし61.5にわたる)アデノウイルス遅延型初期遺伝子E2aの全てまたは一部が、アデノウイルスベクターから除かれることができる。他の遅延型初期遺伝子(mu29ないし14.2にわたる)E2b及び(mu96.8ないし91.3にわたる)E4もまた、アデノウイルスベクターから除かれることができることが予想される。
欠失はまた、アデノウイルスゲノムのmu16.45ないし99にわたる後期遺伝子L1からL5までのいずれにおいてもなされることができる。同様に、欠失は、(mu9.8及び11.2の間に位置する)中間遺伝子IX及び(16.1ないし11.1の間に位置する)IVa2において有用であることができる。他の有用な欠失は、他の構造または非構造アデノウイルス遺伝子においてもなされることができる。
本発明における使用のためのアデノウイルス配列は、E1のみに欠失を含むことができる。代わりに、生物学的活性を消失させるのに効果のある全遺伝子または部分の欠失は、あらゆる組み合わせにおいて用いられることができる。例えば、ある典型的なベクターにおいて、アデノウイルス配列は、E3の欠失と共にまたはこれなしに、E1遺伝子及びE3遺伝子の、またはE1、E2a、及びE3遺伝子の、またはE1及びE4遺伝子の、またはE1、E2a、及びE4遺伝子のなどの欠失を含むことができる。
ベクターはまた、ウイルス複製に必要な遺伝子に付加的な突然変異を含むこともできる。アデノウイルスベクターは、温度感受性(ts)ウイルスを生産する突然変異を含むことができる。そのような突然変異の中に、62.5muでAd5 H5ts125株[P.Vander Vliet等、J.Virol.、15:348−354(1975)]において見いだされたE2a領域におけるミスセンス温度感受性突然変異体の包含を含む。この株においてE2a遺伝子から生産される72kdタンパク質(DBP)のカルボキシ末端(62.5mlu)での単一アミノ酸置換は、一本鎖DNA結合タンパク質であり、そしてアデノウイルスゲノムDNAの複製に関与するタンパク質産物を生産する。許容温度(約32℃)では、ts株は、HeLa細胞において生育される完全な生活環ができ、一方、非許容温度(約38℃)では、アデノウイルスDNAの複製は見られない。加えて、非許容温度では、減少した免疫反応性の72kdタンパク質が、HeLa細胞において見られる。
本発明における使用のための典型的なベクターは、例えば、sub360またはd17001、H5ts125、及び治療ミニ遺伝子に対して5’に置かれたE1a配列を有するcDNAプラスミドを含む、3つの独立したDNA構築物からのフラグメントを組み合わせることにより得られることができる。この型のベクターは、例えば、全て引用することにより本明細書に取り込まれる、J.F.Engelhardt等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、91:6196−6200(1994年6月);Y.Yang等、Nature Genet.、7:362−369(1994年7月)、及び本明細書において引用される参考文献により記述されている。ベクター中の突然変異のために、減少したウイルス複製、発現されるタンパク質の減少、及び導入遺伝子発現の持続性の増加がある。他の好ましいアデノウイルスベクターは、sub360及びd17001のE3欠失に加えて、H5ts125突然変異を含む。導入遺伝子としてVLDLRを含んでいるミニ遺伝子は、選択したAdウイルスのあらゆる欠失領域に挿入されることができる。
本発明を例示するために用いられる典型的なAdウイルスベクターは、E3における小さい欠失を有して、アデノウイルス配列Ad m.u.0−1、及びそれに続くVLDLRミニ遺伝子、及び配列Ad m.u.9ないし100を含む欠損アデノウイルスベクターH5.010CMVVLDLRである。以下に記述される図3を参照。組み換えアデノウイルスは、E1a、E1bを完全に欠失され、E3を部分的に欠失された。この組み換えウイルスベクターは、実施例1において詳細に記述される。
3.Ad/AAVハイブリッドベクター
他の好ましいベクターは、引用することにより本明細書に取り込まれる、同時に所有され、同時に係属中である米国特許出願番号第08/331,384号の主題であるハイブリッドAd/AAVベクターである。
最小で、本発明のハイブリッドベクターに用いられるアデノウイルス核酸配列は、上記のように、前もって形成されたキャプシドヘッドにアデノウイルスゲノムDNAをパッケージングするために必要な最小のアデノウイルスゲノム配列である。5’ITR及びパッケージング/エンハンサー領域を含んでいる全アデノウイルス5’配列は、ハイブリッドベクターにおける5’アデノウイルス配列として用いられることができる。ベクターの3’アデノウイルス配列は、上に説明したアデノウイルスゲノムの右末端(3’)ITR配列を含む。生物学的機能に不都合に影響しないこれらの配列に対するいくつかの修飾が許容されることができる。
本発明のハイブリッドベクターの部分はまた、アデノ関連ウイルスの配列である。ハイブリッドベクターにおいて有用なAAV配列は、rep及びcapポリペプチドをコードしている配列が欠失されるウイルス配列である。より詳細には、用いられるAAV配列は、シスに作用する5’及び3’逆末端反復(ITR)配列[例えば、上に引用したB.J.Carterを参照]である。AAV ITR配列は、約143bpの長さである。これらの配列のある程度のわずかな修飾が、本使用のために許容できると予想されるけれども、実質的にITRをコードしている全配列が、ベクターに用いられる。これらのITR配列を修飾する技量は、当該技術分野の技術の範囲である。例えば、上に引用したSambrook等を参照。
Ad/AAVハイブリッドベクター構築物において、AAV配列は、上に説明したアデノウイルス配列により隣接される。5’及び3’AAV ITR配列は、上記のように、これら自体、VLDLRミニ遺伝子配列に隣接する。従って、VLDLRミニ遺伝子及び隣接する5’及び3’AAV配列により形成される配列は、ベクターのアデノウイルス配列中のあらゆる欠失部位に挿入されることができる。例えば、AAV配列は、望ましくは、アデノウイルスの欠失したE1a/E1b遺伝子の部位、すなわち地図単位1の後に挿入される。代わりに、AAV配列は、E3欠失、E2a欠失などに挿入されることができる。アデノウイルス5’ITR/パッケージング配列及び3’ITR配列がベクターに用いられるなら、AAV配列はこれらの間に挿入される。
最小アデノウイルス配列に関して上に記述されたように、ハイブリッドベクターのアデノウイルス部分に存在しない遺伝子配列は、組み換えハイブリッドウイルス粒子を作るために、パッケージング細胞系及び/またはヘルパーアデノウイルスのいずれかにより供給されなければならない。細胞によるこのハイブリッドウイルスの取り込みは、アデノウイルス及びAAV配列によるベクターに起因する感染能力によりもたらされる。いったんウイルスまたはウイルスコンジュゲートが細胞により取り込まれると、AAV ITRが隣接する導入遺伝子は、母体のアデノウイルスバックボーンから解放されなければならない。導入遺伝子の解放は、感染した細胞にAAV rep遺伝子を与えることによる。
AAV rep遺伝子は、上に含まれた応用において記述されたいくつかの方法によりハイブリッドウイルスに与えられることができる。トランスにrepタンパク質を与えるための一つの態様は、ハイブリッドベクターで前もって感染させた細胞の標的単層へ、AAV P5プロモーターの制御下にAAV rep78kDa及び52kDaタンパク質をコードしている遺伝子を含むリポソームで包んだプラスミドをトランスフェクトすることによるものである。インビボでの使用のためにより好ましくは、AAV rep遺伝子はハイブリッドウイルスの一部として運ばれることもできる。この単一粒子の概念の一つの態様は、ハイブリッドウイルスのポリカチオンコンジュゲートにより与えられる。この修飾したウイルスコンジュゲートの感染は、上に同定されたものと同様に、そして同じ標的細胞に関して達成される。しかしながら、rep78及び52タンパク質をコードするプラスミドが直接複合体を形成されるハイブリッドウイルスのポリリジンコンジュゲートは、機能的成分の全てを単一粒子構造にまとめる。従って、ハイブリッドウイルスコンジュゲートは、治療用途のためにかなりより望ましい、細胞への単一粒子の運搬を可能にする。他の態様において、ハイブリッドウイルスは、ハイブリッドベクターのアデノウイルスゲノム部分へrep cDNAを直接クローニングすることにより修飾される。
このハイブリッドベクターのこれらのそしてさらなる特徴は、参考応用により上に含まれるものにより提供される。
C.組み換えウイルス粒子の生産
1.ヘルパーウイルス/パッケージング細胞系
VLDLRミニ遺伝子を運ぶために用いられるプラスミドベクターのアデノウイルス遺伝子の量により、パッケージング細胞系またはヘルパーアデノウイルスまたは両方が、VLDLRミニ遺伝子を含んでいる感染性組み換えウイルス粒子を生産するために必要な、十分なアデノウイルス遺伝子配列を提供するために必要であることができる。
有用なヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクター構築物に存在しない、またはベクターがトランスフェクトされる細胞系により発現されない選択したアデノウイルスの遺伝子配列を含む。好ましいヘルパーウイルスは、望ましくは複製能力を欠き、上記の修飾した配列に加えて様々なアデノウイルス遺伝子を含む。この状態において、ヘルパーウイルスは、望ましくは、アデノウイルス遺伝子を安定に発現するパッケージング細胞系と組み合わせて用いられる。ヘルパーウイルスはまた、引用することにより本明細書に取り込まれるWu等、J.Biol.Chem.、264:16985−16987(1989);K.J.Fisher及びJ.M.Wilson、Biochem.J.、299:49(1994年4月1日)、及び米国特許出願番号第08/331,381号において記述されたように、ポリカチオンコンジュゲートに形成されることもできる。
ヘルパーウイルスは、場合によっては、第二のレポーターミニ遺伝子を含む。多数のそのようなレポーター遺伝子が、当該技術分野において既知である。アデノウイルスベクター上の導入遺伝子と異なるヘルパーウイルス上のレポーター遺伝子の存在は、Adベクター及びヘルパーウイルスの両方が独立してモニターされることを可能にする。この第二のレポーターは、精製の際に、得られた組み換えウイルス及びヘルパーウイルス間の分離を可能にするために用いられる。望ましいヘルパー細胞の構築は、当該技術分野の技術の範囲内である。
一つの例として、ウイルスベクターを生産するために用いられる細胞系が、パッケージング細胞系でなく、そしてベクターが上に同定された最小アデノウイルス配列のみを含む場合、ヘルパーウイルスは、必要なアデノウイルス初期遺伝子E1、E2a、E4、及び全ての残りのアデノウイルスゲノムの後期、中間、構造、及び非構造遺伝子を与える野生型Adベクターであることができる。しかしながら、この状態において、E1タンパク質を与えるパッケージング細胞系が293である場合、ヘルパー細胞系は、E1遺伝子を含む必要はない。
他の態様において、アデノウイルスベクター構築物が、複製能力を欠き(E1遺伝子がなく、そして場合によってはE3遺伝子がない)、そして293細胞系が用いられる場合、ハイブリッドウイルスの生産のためにヘルパーウイルスは必要ない。E3遺伝子産物は、機能するウイルス粒子の形成のために必要ないので、E3は、ヘルパーウイルスから除かれることができる。
好ましくは、精製を容易にし、ヘルパーウイルスとウイルスベクター粒子の汚染を減らすために、効率よいパッケージングを導くヘルパーウイルスの天然のアデノウイルス遺伝子配列を、ヘルパーウイルスのパッケージング機能またはその複製能力を実質的に奪うまたは「損なう」ように修飾することが有用である。
望ましい「損なわれた」アデノウイルスは、複製された直鎖状アデノウイルスゲノムの効率よいパッケージングのために必要な、少なくとも7つの異なるが機能的に重複した配列(「PAC」配列)を通常含む、5’ITRパッケージング/エンハンサー領域において修飾される。Ad5ゲノムのbp194−358からの一続きのヌクレオチド配列内に、これらのPAC配列の5つ、すなわち、bp241−248でPACIまたはその相補鎖[配列番号4]、bp262−269でPAC IIまたはその相補鎖[配列番号5]、bp304−311でPAC IIIまたはその相補鎖[配列番号6]、bp314−321でPAC IVまたはその相補鎖[配列番号7]、そしてbp339−346でPAC Vまたはその相補鎖[配列番号8]が位置される。突然変異または欠失は、望ましい損なわれたヘルパーウイルスを作るために、アデノウイルスヘルパーウイルス中の一つまたはそれより多いこれらのPAC配列に作られることができる。この領域の修飾は、連続したまたは非連続のPAC配列の欠失を含む、5つ全てより少ない天然のアデノウイルスPAC配列を含む5’アデノウイルス配列を含むことができる。代わりの修飾は、5つの天然のPAC配列の最も頻繁に使われるヌクレオチドを含んでいる共通配列の一つまたはそれより多い反復での、一つまたはそれより多い天然のPAC配列の置換であることができる。代わりに、このアデノウイルス領域は、一つまたはそれより多い天然のPAC配列を分断する故意に挿入した突然変異により修飾されることができる。当該技術分野において熟練した者は、ヘルパーウイルスのパッケージング効率を所望するレベルまで減少する効果を同様に達成するために、PAC配列をさらに操作することができる。
この情報を考慮すれば、当該技術分野において熟練した者が、ベクター構築物におけるアデノウイルス欠失を補足し、組み換えウイルス粒子の生産を可能にするために、他のヘルパーウイルスを設計したり、または他のパッケージング細胞系を開発できることに留意しなければならない。従って、あらゆる特定のヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞系の使用または記述は、制限的ではない。
E1に加えてアデノウイルスタンパク質を与えることのできる他のパッケージング細胞系の存在下で、ヘルパーウイルスは、従って、これらのアデノウイルスタンパク質をコードしている遺伝子を欠失されることができる。そのようなさらに欠失されたヘルパーウイルスはまた、望ましくは、上記のような損なう修飾も含む。
ヘルパーウイルス中に存在しない、他のアデノウイルス遺伝子を含んでいるプラスミドと会合されることのできるポリカチオンヘルパーウイルスコンジュゲートも有用である。上記のヘルパーウイルスは、アデノウイルス−ポリリジンコンジュゲート技術の方法によりさらに修飾されることができる。例えば、上に引用したWu等及び上に引用したK.J.Fisher及びJ.M.Wilsonを参照。
この技術を用いて、好ましくは後期アデノウイルス遺伝子を含んでいるヘルパーウイルスは、ヘルパーウイルスのキャプシドの周りに分配されたポリカチオン配列の付加により修飾される。好ましくは、ポリカチオンは、外側の陽性電荷を形成するために陰性に荷電したベクターの周りに付着するポリリジンである。次に、プラスミドが、ヘルパーウイルス中に存在しないアデノウイルス遺伝子、例えば、E1、E2、及び/またはE4遺伝子を発現するように設計される。このプラスミドは、ポリリジン配列上の電荷を通してヘルパーウイルスコンジュゲートに会合する。このコンジュゲートは、さらなるアデノウイルス遺伝子が、ヘルパーウイルスから除かれ、そして組み換えウイルスベクターの生産中にウイルスに組み込まれるようにならないプラスミド上に存在することを可能にする。従って、汚染の影響がかなり減少される。
2.ウイルス粒子の組み立て及び細胞系の感染
アデノウイルス、AAV、及びレポーター遺伝子または治療遺伝子、及び他のベクター成分の選択したDNA配列のハイブリッドベクターへの組み立て、並びにハイブリッドウイルス粒子を生産するためのハイブリッドベクターの使用は、通常の技術を用いる。そのような技術は、指定研究書[上に引用したSambrook等]において記述されるようなcDNAの通常のクローニング技術、アデノウイルス及びAAVゲノムの重複しているオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、及び所望するヌクレオチド配列を与えるあらゆる適当な方法を含む。標準的なトランスフェクション及び同時トランスフェクション技術、例えば、相補性293細胞系を用いたCaPO4トランスフェクション技術が用いられる。他の用いられる常法は、ウイルスゲノムの相同組み換え、寒天オーバーレイ中のウイルスのプラーク形成、シグナル生成を測定する方法などを含む。
例えば、所望するミニ遺伝子を含んでいるプラスミドベクターの構築及び組み立ての後に、このベクターを、適切なヘルパーウイルス及び/またはパッケージング細胞系の存在下で、インビトロで感染させる。ベクター中のアデノウイルス−導入遺伝子配列が複製され、ビリオンキャプシドにパッケージされることを可能にする、ヘルパー及びベクター間の相同組み換えが起こり、組み換えベクターウイルス粒子をもたらす。そのようなウイルス粒子を生産するための現在の方法は、トランスフェクションに基づく。簡潔に言えば、ヘルパーウイルスが、パッケージング細胞系ヒトHEK293のような細胞を感染するために用いられ、この細胞は、次に、常法により、VLDLR導入遺伝子を含んでいるアデノウイルスプラスミドベクターで続いてトランスフェクトされる。トランスフェクション後、約30またはそれより長い時間に、細胞は集められ、抽出物が調製され、VLDLR導入遺伝子を含んでいる組み換えウイルスベクターが、CsCl勾配中の浮遊密度超遠心により精製される。
導入するウイルス粒子の収量は、主として、プラスミドでトランスフェクトされる細胞の数により決まり、これを、高い効率を有するトランスフェクションプロトコルを用いるために望ましくしている。一つのそのような方法は、上記のようなポリ−L−リジン化したヘルパーアデノウイルスの使用に関する。VLDLRミニ遺伝子を含んでいるプラスミドは、次に、陽性に荷電したヘルパーウイルスキャプシドに直接複合され、プラスミドベクター及びヘルパーウイルスのヘルパー機能を含んでいる単一のトランスフェクション粒子の形成をもたらす。
II.遺伝子治療における組み換えウイルスベクターの使用
上記のように、アデノウイルスベクター及びヘルパーウイルス、またはアデノウイルスベクター及びパッケージング細胞系の協力により生産された、VLDLRミニ遺伝子を含んでいる得られた組み換えアデノウイルスベクターは、従って、VLDLR遺伝子をインビボまたはエクスビボで患者に運び、そして肝臓細胞への遺伝子の組込みを与えることができる、効率よい遺伝子導入媒体を提供する。
上記の組み換えベクターは、遺伝子導入のための常法においてヒトに投与され、LDLレセプター欠損症または他のリポタンパク質代謝異常に対する代わりのまたは補足の遺伝子治療として働く。VLDLR遺伝子を保有しているウイルスベクターは、好ましくは、生物学的に適合する溶液または製薬学的に受容しうる運搬媒体中に懸濁されて患者に投与されることができる。適当な媒体は、滅菌した食塩水を含む。製薬学的に受容しうる担体であると知られた、そして当該技術分野において熟練した者によく知られた他の水性及び非水性の等張の滅菌注入溶液、並びに水性及び非水性の滅菌懸濁液が、この目的のために用いられることができる。
ウイルスベクターは、医学の当該技術分野において熟練した者により決定されることのできる過度に不都合でないかまたは医学的に受容しうる生理学的効果を有する治療利益を提供するために、肝臓細胞をトランスフェクトし、そしてVLDLR遺伝子の十分なレベルの導入及び発現を与えるために十分な量において投与される。通常のそして製薬学的に受容しうる投与経路は、肝臓への直接運搬、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経口、及び他の非経口投与経路を含む。所望される場合、投与経路は、組み合わされることができる。
ウイルスベクターの服用量は、主に、治療される状態、患者の年齢、体重、及び健康のような因子により決まり、従って、患者間で変わり得る。例えば、ウイルスベクターの治療的に有効なヒト服用量は、通常、約1 x 109から1 x 1011pfu/mlまでのウイルスベクターの濃度を含む約20から約100mlまでの食塩水溶液の範囲である。好ましい成人ヒト服用量は、2 x 1010pfu/mlで約50mlの食塩水溶液であると概算される。服用量は、あらゆる不都合な副作用と治療利益を比較検討して調整される。VLDLR遺伝子の発現レベルは、服用量投与の頻度を決定するためにモニターされることができる。
場合によっては方法工程は、ウイルスベクターの投与と同時または前または後のいずれかで、好ましくは短時間作用形である免疫調節剤の適当量を患者へ共投与することを伴う。本明細書において、選択される免疫調節剤は、本発明の組み換えベクターの産物に対して誘導される中和抗体の形成を阻害することができ、そして/またはベクターを含んでいる細胞の細胞溶解性Tリンパ細胞(CTL)除去を防ぐことができる試剤として定義される。免疫調節剤は、中和抗体形成を防ぐためにTヘルパーサブセット(TH1またはTH2)及びB細胞間の相互作用を妨げることができる。代わりに、免疫調節剤は、ベクターのCTL除去の発生を減少させるためにTH1細胞及びCTL間の相互作用を妨げるように選択されることができる。より明確には、免疫調節剤は、望ましくは、CD4 T細胞の機能を妨げるまたは阻止する。
中和抗体形成を防ぐことにおける使用のための免疫調節剤は、VLDLRを含んでいるアデノウイルスベクターに対する反応において生産されるあらゆる中和抗体の免疫グロブリンサブタイプの決定に基づいて選択されることができる。例えば、中和抗体がIgAのようなTH2が仲介する抗体である場合、免疫調節剤は、望ましくは、B細胞とTH2細胞の相互作用を抑制または防害する。代わりに、誘導される中和抗体がIgG2AのようなTH1が仲介する抗体である場合、免疫調節剤は、望ましくは、B細胞とTH1細胞の相互作用を抑制または防害する。
本発明のウイルスベクターの投与に対する反応において生じる中和抗体は、しばしば、ベクターを運ぶために何の媒体が用いられるか、及び/または運搬位置に基づくことができる。例えば、肺を経由したアデノウイルスベクターの投与は、通常、IgA中和抗体の生産を誘導する。血液を経由したアデノウイルスベクターの投与は、通常、IgG1中和抗体を誘導する。中和抗体の決定は、動物モデルにおける選択したウイルスベクターの試験において容易に決定される。ウイルスベクターのCTL除去の減少が所望される場合、免疫調節剤は、インビトロでのウイルスベクターの延長した耐性を可能にするためのCD4+TH1細胞を抑制または阻止する能力に関して選択される。
従って、免疫調節剤の選択は、妨げられるまたは阻止されるために要求される機構に基づくことができる。免疫調節剤は、サイトカイン及びモノクローナル抗体を含む、可溶性のタンパク質または天然に生じるタンパク質であることができる。免疫調節剤は、通常の製薬であることができる。本明細書において同定される免疫調節剤は、単独または互いに組み合わせて用いられることができる。例えば、シクロホスファミド及びより特異的な免疫調節剤抗CD4モノクローナル抗体が、共に投与されることができる。そのような場合、シクロホスファミドは、TH1活性化を阻止し、そして一時的な免疫遮断の期間を越えて導入遺伝子発現を安定させる試剤として働く。
免疫調節剤の適当な量または服用量は、主に、患者に最初に投与されるVLDLR遺伝子を保有している組み換えベクターの量、及び選択される免疫調節剤の型による。患者の治療される状態、年齢、体重、一般的な健康、及び免疫状態のような他の二次的な因子もまた、患者に与えられる免疫調節剤の服用量を決定する際に医師により考慮されることができる。
通常、例えば、治療的に有効なヒト服用量のサイトカイン免疫調節剤、例えば、IL−12またはIFN−γは、約1 x 107pfu/mlウイルスベクター当たり約0.5μgから約5mgまでの範囲に通常ある。様々な服用量が、あらゆる副作用と治療利点を比較検討するために、当該技術分野において熟練した者により決定されることができる。
A.モノクローナル抗体及び可溶性タンパク質
好ましくは、遺伝子治療ベクターに対する不都合な免疫反応を防ぐ方法は、CD4+細胞の非特異的な不活性化に関する。好ましくは、そのような阻止抗体は、レシピエントが阻止抗体に対する免疫反応を高めるのを防ぐように「ヒト化」される。「ヒト化抗体」は、非ヒトドナーの免疫グロブリン由来の相補性決定部位(CDR)、並びに/あるいはL及び/またはH可変領域構成部の他の部分を有し、分子の残りの免疫グロブリン由来の部分が、一つまたはそれより多いヒト免疫グロブリンに由来する抗体をいう。そのような抗体はまた、ドナーまたはアクセプターの被修飾L鎖またはキメラのL鎖と結合したヒト化したH鎖、あるいはその逆により特徴づけられた抗体も含むことができる。そのような「ヒト化」は、当該技術分野において既知の方法により達成されることができる。例えば、引用することにより本明細書に取り込まれる、G.E.Mark及びE.A.Padlan、「第4章 Humanization of Monoclonal Antibodies」、The Handbook of Experimental Pharmacology、第113巻、Springer−Verlag、New York(1994)、105−133頁を参照。
他の適当な抗体は、細胞表面のCD4に対して誘導された抗体のようなCD4+細胞を特異的に阻害または枯渇させるものを含む。CD4+細胞の枯渇は、ウイルスベクターのCTL除去を防ぐことが発明者等により示されている。そのような調節剤は、抗−OKT3+[例えば、米国特許番号第4,658,019号;欧州特許出願番号第501,233号、1992年9月2日公表、を参照]のような抗T細胞抗体を含むが、これらに制限されない。CD4+細胞を枯渇させるために市販されている抗体GK1.5(ATCC登録番号TIB207)を用いる、以下の実施例2を参照。
代わりに、TH細胞によるB細胞の活性化のために必要な相互作用、従って中和抗体の生産を妨げるまたは阻止するあらゆる薬剤が、これらの方法の免疫調節剤として有用である。例えば、T細胞によるB細胞の活性化は、B細胞上のCD40抗原へのTヘルパー細胞上のCD40リガンドの結合、並びにB細胞上のB7抗原へのT細胞上のCD28及び/またはCTLA4リガンドの結合のようなある種の相互作用が起こることを必要とする[F.H.Durie等、Immunol.Today、15(9):406−410(1994)]。両方の相互作用なしに、B細胞は、中和抗体の生産を誘導するように活性化されることはできない。
CD40リガンド(CD40L)−CD40相互作用は、Tヘルパー細胞の活性化及び機能の両方におけるその広い活性、並びにそのシグナリング経路における重複がないために、遺伝子治療ベクターに対する免疫反応を阻止するための望ましい地点である。従って、本発明の一般に好ましい方法は、アデノウイルスベクターの投与時にCD40とCD40Lの相互作用を一時的に阻止することに関する。このことは、TH細胞上のCD40リガンドをふさぎ、B細胞上のCD40抗原とTヘルパー細胞上のCD40リガンドの正常な結合を妨げる試剤で処理することにより達成されることができる。CD40L−CD40の相互作用を阻止することは、導入遺伝子の安定性及び再投与に関する問題に寄与するTヘルパー細胞の活性化を防ぐ。
従って、CD40リガンドに対する抗体(抗CD40L)[Bristol−Myers Squibb Coから入手できる;例えば、欧州特許出願第555,880号、1993年8月18日公表を参照]または可溶性のCD40分子が、この方法において選択される免疫調節剤であることができる。
代わりに、Tヘルパー細胞上に存在するCD28及び/またはCTLA4リガンドをふさぐ試剤は、B細胞上の抗原B7とこれらのリガンドの正常な結合を妨げる。従って、B7の可溶性型またはCD28もしくはCTLA4に対する抗体、例えば、CTLA4−Ig[Bristol−Myers Squibb Coから入手できる;例えば、欧州特許出願第606,217号、1994年7月20日公表を参照]]が、本発明の方法において選択される免疫調節剤であることができる。この方法は、異種抗原に対する細胞性及び体液性の両方の免疫反応に向けられるので、以下に記述されるTH2活性化を防ぐためのサイトカインの投与より優れた利点を有する。
B.サイトカイン
TH細胞機能を阻害するさらに他の免疫調節剤が、本発明において用いられることができる。
従って、一つの態様において、CD4+Tヘルパー細胞のTH1サブセットの機能を選択的に阻害する免疫調節剤が、ウイルスベクターの最初の投与時に投与されることができる。一つのそのような免疫調節剤は、インターロイキンー4(IL−4)である。IL−4は、TH1細胞機能を犠牲にして、TH2細胞の抗原特異的活性を増大する[例えば、Yokota等、Proc−Natl.Acad.Sci.、USA、83:5894−5898(1986);米国特許番号第5,017,691号を参照]。TH1細胞機能を阻害できる他の免疫調節剤もまた、本発明の方法において有用であることが予見される。
他の態様において、免疫調節剤は、Tヘルパー細胞のTH2サブセットの活性化を防ぐサイトカインであることができる。この方法の成功は、TH2依存性Igイソタイプがウイルス中和において果たす相対的な寄与により決まり、そしてその概要は、株、動物の種類、並びにウイルス運搬の方法及び標的器官により影響され得る。
ウイルスベクターの最初の投与時にCD4+T細胞サブセットTH2機能を選択的に阻害する望ましい免疫調節剤は、インターロイキン−12(IL−12)を含む。IL−12は、TH2細胞機能を犠牲にして、TH1細胞の抗原特異的活性を増大する[例えば、欧州特許出願番号第441,900号;P.Scott、Science、260:496−497(1993);R.Manetti等、J.Exp.Med.、177:1199(1993);A.D’Andrea等、J.Exp.Med.、176:1387(1992)を参照]。本発明における使用のためのIL−12は、好ましくは、タンパク質の形態にある。ヒトIL−12は、既知の技術を用いて組み換え体として作られることができ、または購入されることができる。代わりに、IL−12は、(場合によっては、導入遺伝子を発現するために用いられるものと同じであることができる)ウイルスベクター中に設計され、インビボまたはエクスビボで標的細胞中において発現されることができる。
IL−12でのTH2特異的除去は、IgAが中和抗体の主な源である肺への遺伝子治療において特に効果的である。肝臓への遺伝子治療においては、TH1及びTH2細胞の両方がウイルス特異的抗体の生産に寄与する。しかしながら、中和抗体の全量は、IL−12で減少されることができる。
同様の機能を果たす他の選択される免疫調節剤は、γ−インターフェロン(IFN−γ)である[S.C.Morris等、J.Immunol.、152:1047−1056(1994);F.P.Heinzel等、J.Exp.Med.、177:1505(1993)]。IFN−γは、活性化マクロファージ及びTヘルパー細胞の分泌を介して、多数のIL−12の生物学的効果をもたらすと思われている。IFN−γはまた、IL−4が刺激するTH2の活性化を部分的に阻害する。IFN−γはまた、様々な市販品から得られることができる。
代わりに、IFN−γは、既知の遺伝子工学技術を用いて、ウイルスベクター中に設計され、インビボまたはエクスビボで標的細胞中において発現されることができる。
好ましくは、そのようなサイトカイン免疫調節剤は、ヒト組み換えタンパク質の形態にある。これらのタンパク質は、当該技術分野において存在する方法により作られることができる。中和抗体がTH2によりもたらされる場合、これらのタンパク質のTH2阻害機能を共有する、IL−12またはγ−インターフェロンのような、本明細書において記述された既知の免疫調節剤の活性ペプチド、フラグメント、サブユニット、または類似体もまた、本法において有用である。
C.他の製薬
免疫機能を非特異的に阻害する他の免疫調節剤または試剤、すなわち、サイクロスポリンAまたはシクロホスファミドもまた、本発明の方法において用いられることができる。例えば、短いクールのシクロホスファミドは、肝臓へのウイルス運搬時のアデノウイルスキャプシドタンパク質に対するCD4及びCD8の両方のTヘルパー細胞の活性化をうまく妨げることが示されている。その結果、導入遺伝子の発現は引き延ばされ、そしてより多い服用量で中和抗体の形成が防がれ、成功したベクターの再投与が可能であった。肺においては、シクロホスファミドは、全ての服用量で中和抗体の形成を防ぎ、多い服用量で導入遺伝子の発現を安定化した。
D.免疫調節剤の投与
場合によっては選択した免疫調節剤の投与は、(例えば、LDLレベルによりモニターされるように)VLDLR遺伝子が発現される期間の間、ヒトVLDLR遺伝子を保有している組み換えアデノウイルスベクターでの治療中、または組み換えベクターのあらゆるブースターと共に繰り返されることができる。
従って、本発明の組成物及び方法は、ヒト肝細胞におけるVLDLR遺伝子の安定な発現を与えることによるLDL代謝における欠陥に対する望ましい治療、及び患者による望ましくない免疫反応を招くことなしに所望されるようにベクターを再投与する技能を提供する。
以下の実施例は、本発明のウイルスベクター及びVLDLレセプター遺伝子インサートの構築及び試験、並びに代謝異常の治療におけるこれらの使用を例示する。ヒトVLDLレセプターをコードしている典型的な組み換えアデノウイルスは、以下の実施例1において記述されるように構築された。これらの実施例は、例証であるだけであり、本発明の範囲を制限しない。
実施例1−H5.010CMVVLDLRの構築及び精製
ヒト超低密度リポタンパク質(VLDL)レセプターのcDNA[上に引用したM.E.Gafvels等;配列番号1]を(Invitrogen Corp.から得た)プラスミドpRc/CMVのポリリンカー領域に挿入した。得られたプラスミド、pRc/CMVVLDLRを制限酵素、SnaBI及びNotIで消化し、サイトメガロウイルス(CMV)即時−初期プロモーター及びVLDLレセプターcDNAを含んでいる4kbフラグメントを単離した。
プラスミドpAd.CMVlacZ[上に引用したKozarsky II]をCMVプロモーター及びlacZ cDNAを除くためにSnaBI及びNotIで消化し、5.6kbバックボーンを単離した。pAd.CMVVLDLR(図2及び9;配列番号3)を作製するために、2つのフラグメントを連結した。pAd.CMVVLDLRをNheIで直鎖状にし、以前記述された[上に引用したK.F.Kozarsky I及びII]ようにXbaI及びClaIで消化した(アデノウイルス5型由来の)sub360DNAと共に293細胞に同時にトランスフェクトした。
H5.010CMVVLDLRと呼ばれる、得られた組み換えアデノウイルスは、E3遺伝子に小さい欠失を有して、pAd.CMVVLDLRのヌクレオチド約12から約4390までの配列及びAd.5地図単位9−100を含む(ジーンバンク登録番号M73260及び図3の説明を参照)。この組み換えアデノウイルスを、2回のプラーク精製後に単離した。H5.010CMVVLDLRを293細胞において生育させ、以前に記述された[上に引用したK.F.Kozarsky I及びII]ように2回の塩化セシウム密度遠心により精製した。リン酸緩衝食塩水で平衡化したBioRad 10DG脱塩カラム上に通すことにより、塩化セシウムを除いた。
ウサギ実験のためには、新しく精製したウイルスを用い、マウス実験のためには、新しいウイルスを用いるか、またはカラム精製後にグリセロールを10%(v/v)の最終濃度に加え、そして使用まで−70℃でウイルスを保存した。
以下の実施例において記述されるように、VLDLレセプターのインビボ機能を決定し、そしてLDLレセプター欠損症に対する代わりのまたは補足的な遺伝子治療としての有用性を決定するために、この組み換えアデノウイルスベクターをWHHLウサギの肝臓及びLDLレセプターノックアウトマウスの肝臓へ導入した。
実施例2−他の組み換えアデノウイルス
CMVエンハンサー/プロモーターの制御下にlacZ遺伝子をコードしているH5.010CMVlacZ、CMVがエンハンスしたニワトリβ−アクチンプロモーターの制御下にヒト低密度リポタンパク質(LDL)レセプターcDNAをコードしているH5.010CBhLDLRを、以前記述されたように調製した[上に引用したK.F.Kozarsky I及びII]。
実施例3−WHHLウサギにおけるVLDLレセプターの肝臓発現の効果
実施例1及び2において記述されたようにして得られたH5.010CMVVLDLRまたは(β−ガラクトシダーゼをコードしている)H5.010CMVlacZを、以下のように、WHHLウサギ[Camm Research]に静脈内に注入した。0日に、ウサギに7.5 x 1012粒子のいずれかの組み換えアデノウイルスを縁耳静脈を通して注入した。加えて、2匹のNew Zealand White(NZW)ウサギ[Hazleton、Inc.]に各ウイルスを注入し、肝臓への遺伝子導入の程度を実証するために注入後5日目に殺した。
11:00am頃に各日運ばれるピューリナ研究所食事の規定食で12時間の明/暗周期においてウサギを維持した。示した日の10:00am頃に縁耳静脈から静脈サンプルを得た。
A.血漿分析
コレステロールHPキット及びPrecise標準(Boehringer Mannheim)を用いて、全コレステロールに関して血漿サンプルを分析した。簡潔に言えば、FPLCカラムバッファー(1mM EDTA、154mM NaCl、pH8.0)中250μlの容量に調整した、個々のマウスからの50μlの血漿に対してFPLC分析を行った。希釈したサンプル(200μl)を0.4ml/分の流速で連続した2本のSuperose 6カラム(Pharmacia)に添加し、1mlのフラクションを集めた。100μlサンプルに対してマイクロプレートアッセイにおいてコレステロール含有量を分析した。50mM PIPES、pH 6.9、7.8g/L HDCBS、0.51g/L 4−AAT、1.27g/Lコール酸、0.245%Triton X−100、7.31g/L KClを含み、1.22U/mlコレステロールオキシダーゼ、7.64U/mlコレステロールエステラーゼ、及び245U/mlペルオキシダーゼを補足した100μlの新しく調製した溶液をサンプルに加え、室温で一晩インキュベートし、そして490nmでO.D.を測定した。
組み換えアデノウイルスを与えられる前後のWHHLウサギの各々に対して、血漿コレステロールレベルを評価した。図4は、H5.010CMVlacZを注入したウサギがコレステロールレベルにおける何の著しい変化も有さないことを示す。しかしながら、H5.010CMVVLDLRを注入後、コレステロールレベルは、140から420mg/dlまでに及ぶ最大の減少を有して下がった(図4B)。このことは、VLDLレセプターの発現が、LDLレセプター欠損ウサギにおいて減少したコレステロールレベルをもたらすことを示した。
B.組織化学分析
肝臓の一部をパラフィンで包埋し、切片にし、そしてヘマトキシリン及びエオシンで染色した。ある部分を新しく凍結し、切片にし、グルタルアルデヒド中で固定し、X−galで染色し、そしてヘマトキシリンで軽く対比染色した。ある新しく凍結した切片をメタノール中で固定し、次に、以前記述したように[上に引用したK.F.Kozarsky I及びII]、ポリクローナル抗β−ガラクトシダーゼ抗体(5’−3’)、ポリクローナル抗ヒトLDLレセプター抗体、またはポリクローナル抗VLDLレセプター抗体のいずれかで、続いて、フルオレセインイソチオシアナートを結合した抗ウサギ抗体(Jackson Immunoresearch)により染色した。37%ホルムアルデヒド中で1分間固定し、次にすすぎ、そしてOil Red O(イソプロピルアルコール中0.5%のOil Red O 3/水2)中で10分間染色した新しく凍結した切片に対してOil Red O染色を行った。スライドガラスをヘマトキシリン中で対比染色し、水溶液中にmountした。
注入されたウサギの免疫蛍光分析は、H5.010CMVlacZを注入したウサギからの約50%の肝細胞がβ−ガラクトシダーゼを発現し、H5.010CMVVLDLRを注入したウサギからの肝臓組織がわずかに高い割合のVLDLレセプターを発現している肝細胞を有することを示した。VLDLレセプターmRNA発現がほとんどまたは全くないことを示すノーザンブロット分析[上に引用したM.E.Gafvels等]と一致して、lacZを注入したウサギからの肝臓は、抗VLDLレセプター抗体で何の反応性も示さなかった。
実施例4−LDLレセプターノックアウトマウスにおけるVLDLレセプターの短期間の肝臓発現の効果
C57BL/6マウス及びLDLレセプターノックアウトマウス(Jackson Labs)に、尾の静脈を通して0.5または1.0 x 1010粒子の組み換えアデノウイルスを静脈内に注入し、注入前後でコレステロールレベルをモニターした。
明確には、各3匹のマウスに、H5.010CMVlacZ、H5.010CMVVLDLR、または(ヒトLDLレセプターcDNAをコードしている)H5.010CBhLDLRを注入した。発表された結果[上に引用したKozarsky I及びII]を確認するために、この最後のウイルスをコントロールとして含んだ。ヘパリン化した毛細管を用いてretro−orbital出血により血漿サンプルを得た。実験を開始する前の離乳直後少なくとも3週間、1.25%コレステロール、7.5%ココアバター、7.5%カゼイン、及び0.5%コール酸塩で補足したピューリナマウス食事からなる高コレステロール規定食(1.25%コレステロール規定食)で、LDLレセプターノックアウトマウスを維持した。注入後5日目に、マウスを殺した。
実施例3において記述された技術による導入遺伝子の発現に対する免疫蛍光により肝臓組織を分析し、そして同様に記述されたように、血漿コレステロールレベルを測定した。リポタンパク質の分別のために、3倍のLDLレセプターノックアウトマウスからの血漿をプールし、密度超遠心に供し、フラクションを集め、そして常法によりコレステロール含有量を測定した。
免疫蛍光分析は、H5.010CMVlacZを注入したマウスにおける適度なレベルのβ−ガラクトシダーゼ発現を、そしてH5.010CBhLDLR及びH5.010CMVVLDLRを注入したマウスにおける高いレベルのヒトLDLレセプター及びVLDLレセプター発現のいずれかをそれぞれ示した。
おそらく、マウスにおいて肝毒性を生じることのできる、組み換えアデノウイルスの注入の非導入遺伝子に関係する効果のために[Y.Yang等、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、91:4407−4411(1994年5月)、コントロールのH5.010CMVlacZを注入したマウスにおいてコレステロールレベルは、わずかに減少した(図5)。しかしながら、コントロールマウスにおいて観察された減少と対照的に、注入後5日目にH5.010CBhLDLRを注入したマウスにおいて、コレステロールレベルは注入前の50%まで著しく減少した。H5.010CMVVLDLRを注入したマウスにおけるコレステロールレベルもまた、注入前レベルの約60%まで減少した。血漿リポタンパク質のさらなる分析は、H5.010CBhLDLRで処理したマウスにおいて、IDL及びVLDLフラクションにおける付加的な減少と共に、LDLレベルが急に落ちることを示した(図6)。H5.010CMVVLDLRを注入したマウスは、VLDLフラクションのより大きい減少をLDLのより小さい減少と共に示した。
一緒に、これらのデータは、VLDLレセプターの肝臓発現は、血漿からのVLDLの増加した排除をもたらし、VLDLが前駆物質であるリポタンパク質(すなわち、IDL及びLDL)の量の減少及び全血漿コレステロールの全般的な減少をもたらした。
実施例5−LDLレセプターノックアウトマウスにおけVLDLレセプターの長期間の肝臓発現の効果
FH患者及びWHHLウサギの両方において観察されるコレステロールレベルに近いものを得るために、LDLレセプターノックアウトマウス(Jackson Labs)を0.2%コレステロール、10%ココナッツオイル、及び0.05%コール酸塩で補足したピューリナマウス食事からなる高コレステロール規定食(0.2%コレステロール規定食)で維持した。これらのマウスにおけるコレステロールレベルは、930から1550mg/dlにおよび、一方、1.25%コレステロール規定食のマウス(実施例4)は、1900ないし3100mg/dlのレベルを有した。
ウイルスを使用直前に解かし、1 x 1012粒子/mlの濃度にPBSで希釈した。3匹のマウスに各々、β−ガラクトシダーゼ(H5.010CMVlacZ)またはヒトLDLレセプター(H5.010CBhLDLR)のいずれかをコードしている1 x 1011粒子のE1を欠失した組み換えアデノウイルスを含んでいる0.1mlのウイルスを静脈内に注入し、血清脂質を時間にわたって精察した。示した日に、マウスをメトキシフルランで麻酔にかけ、レトロ・オービタル(retro−orbital)静脈集網叢の穿刺によりヘパリン化毛細管に集めた。
免疫蛍光染色は、大部分の肝細胞が、β−ガラクトシダーゼ、ヒトLDLレセプター、またはVLDLレセプターのいずれかの導入遺伝子産物を発現したことを示した。肝臓切片のヘマトキシリン及びエオシン染色は、H5.010CMVlacZを注入したマウスにおける本質的に正常な形態を示した。しかしながら、H5.010CBhLDLR及びH5.010CMVVLDLRを注入したマウスの両方に対して、肝細胞は内部液胞を有しているように見えた。組織を中性脂質に対する染色であるOil Red O染色で分析した時、H5.010CMVlacZを注入したコトロールと比較すると、レセプターを注入した動物からの肝臓は、大きな脂肪滴の蓄積を明らかに示した。このことは、これらのLDLレセプター欠損マウスにおけるLDLレセプターまたはVLDLレセプターの短期間の高いレベルの発現が、脂質の細胞内蓄積をもたらすことを示唆した。
導入遺伝子産物の生物学的活性を確かめるために、血漿コレステロールレベルを組み換えアデノウイルスの投与の前後で精察した。図7Aは、H5.010CMVlacZを注入したマウスにおける血清コレステロールレベルが、全てのリポタンパク質フラクション(HDL、IDL/VLDL、及びLDL)の小さい変化に反映される、特徴的であるが、時間にわたって著しくない変動を示したことを示す。それに反して、H5.010CBhLDLRを注入したマウスは、コレステロールの大きいが一時的な減少を有する(図7B参照)。特に、これらのマウスは、約2週間続く大きい血漿コレステロールの減少を示した。コレステロールレベルは、3倍(966から353mg/dlまで)及び7倍(1554から219mg/dlまで)減少し、注入後3週までに基準まで戻った。血清コレステロールの減少は、血清LDLの同等の減少に反映される。免疫調節剤が同等に投与されない場合のこのアデノウイルス注入の非特異的な効果は、以前に記述されており、そして関連した炎症の結果として起こる肝機能における変化のためであると思われる。H5.010CMVVLDLRを注入したマウスは、4倍以上(1186から288mg/dlまで及び1453から299mg/dlまで)の最大の減少を伴って、H5.010CBhLDLRを注入したマウスにおいて見られるものと大きさにおいて類似した血漿コレステロールの大きい減少を示した。意外なことに、血漿コレステロールレベルは、注入後3週までに基準まで戻らなかった。H5.010CMVVLDLRを注入したマウスにおける血漿コレステロールレベルの変化(図7A)は、注入後の9週(現在の実験期間)にわたって統計的に有意(p<0.05)であった。
リポタンパク質フラクションに対するVLDLレセプター発現の効果を確認するために、個々のマウスからの血清を、FPLCにより分析した。注入後3日に、VLDL及びLDLフラクションは検出できず、注入後10週でさえ、LDLのピークの高さはHDLのピークの高さよりわずかに低かったけれども、時間にわたって、LDLフラクションはゆっくりと回復した。コレステロールアッセイの感度における制限のために、小さな変化は検出から逃れるかもしれないけれども、VLDLは検出できないままであった。LDLのピークは、全血漿コレステロールレベルを反映し、血漿コレステロールの長く続く低減が、VLDL及びLDLレベルの持続した減少により伴われることを確認した。これらのデータは、肝臓におけるVLDLレセプターの発現が、高コレステロール血症のための有効な治療であることを示唆する。
LDLレセプターノックアウトマウスの注入と同時に、正常なV57BL/6マウスに組み換えアデノウイルスの各々を注入した。これらのマウスを注入後様々な時に殺し、そしてβ−ガラクトシダーゼ発現を検出するためのX−gal組織化学及びLDLレセプター発現を測定するために行われる免疫蛍光を用いた導入遺伝子発現の直接分析のために、肝臓組織を集めた。ウイルスの注入後3日目に集めた組織は、少なくとも80%の肝細胞においてβ−ガラクトシダーゼまたはヒトLDLレセプターのいずれかの発現を示した。
各実験において、ベクター特異的なシグナルは、遺伝子導入前または関係のない遺伝子を発現している同量のアデノウイルスの注入後の動物において見られるものよりかなり高かった。lacZ及びLDLレセプターの両方に対して、導入遺伝子の発現は、21日までに検出できないレベルまで減少し、10日目に最大量に達する肝臓における自己限定性の単核浸潤物の発生と関係した。この浸潤物は、小食片の存在により伴われた、門脈並びに小葉の炎症からなった。LacZ及びLDLレセプターを注入したマウス間で、病変の程度は区別できなかった。LDLレセプターの発現の時間経過は、血漿コレステロールの最初の大きな減少及びそれに続く基準への回復と一致する。
対照的に、H5.010CMVVLDLRを注入した2匹のマウスは、高いレベルでVLDLレセプターを発現した、肝細胞の割合は5日のマウスに比較してわずかに減少したかもしれない。これらのデータは、H5.010CMVVLDLRを注入したマウスにおける血漿コレステロールレベルの持続した減少は、VLDLレセプターの持続した発現によったことを示唆する。
実施例6−回転(turnover)の研究
リポタンパク質代謝に対する肝臓VLDLレセプター発現の効果をさらに特徴づけるために、以下のように回転の研究を行った。
LDLレセプターノックアウトマウスに、実施例4において記述されたように高コレステロールの規定食で3週後、組み換えアデノウイルスを注入した。各3匹のマウスに、LacZ及びLDLレセプターアデノウイルスを注入し、1匹のマウスにはLDLレセプターアデノウイルスを注入した。注入後5日に、マウスに尾の静脈を通して、0.2mlの全量中約8 x 106cpmの125I標識したヒトLDL及び1.6 x 105cpmの125I標識したヒトVLDLを注入した。血液サンプルを放射性標識の注入後1分に得、「時間0」サンプルと呼んだ。示した時間にヘパリン化毛細管に血液を集め、残っている放射能をガンマカウンターを用いて測定した。
LDLレセプターアデノウイルスの注入は、LDLレセプターノックアウトマウスにおける以前の研究[S.Ishibashi等、J.Clin.Invest.、92:883−893(1993)]と一致する、lacZアデノウイルスの注入に比較して加速されたLDLの排除をもたらした。同様に、VLDLの排除は、lacZを注入したマウスに比較して、LDLレセプターで処理したマウスにおいて加速された。VLDLレセプターを注入したマウスにおけるLDLの回転は、lacZを注入したマウスと区別できず、これは、LDLがVLDLレセプターに対するリガンドでないことを示すインビトロのデータ[T.Yamamoto等、Trends in Cardiovascular Medicine、3:144−148(1993);F.Batley等、J.Biol.Chem.、269:23268−23273(1994)]と一致する。VLDLレセプターを注入したマウスにおけるVLDLの排除は、lacZを注入したマウスよりわずかに速かったが、LDLレセプターを注入したマウスにおけるより著しく遅かった。
上に説明したように、VLDLレセプターアデノウイルスを注入したマウスにおけるVLDLの回転は、その効果の大きさが、LDLレセプターウイルスで処理した動物において見られるものよりはるかに低かったけれども、lacZを注入したマウスにおけるより著しく速かった。このことは、循環しているVLDLのVLDLレセプターが介在する排除が、減少した血清VLDLをもたらす唯一の経路ではないかもしれないことを示唆する。一つの可能な機構は、キロミクロン残存物の肝臓の取り込みと共に起こる分泌−再捕獲[T.Willnow & J.Herz、J.Mol.Med.、73:213−220(1995);H.Shimano等、J.Clin.Invest.、93−2215−2223(1994)]であり、VLDLの減少した分泌及び血漿VLDLの減少したレベルをもたらす。第二の機構は、明らかにレセプターが細胞表面に達する前のリガンドの結合を防ぐために、細胞内で様々なレセプターと相互作用する[G.Bu等、EMBO J、14:2269−2280(1995)]レセプター結合(associated)タンパク質(RAP)[上に引用したBattey;H.Mokuno等、J.Biol.Chem.、269:13238−13243(1994)]とVLDLレセプターの相互作用に関するかもしれない。アデノウイルスを注入したマウスの肝臓において発現された高レベルのVLDLレセプターは利用できるRAPを圧倒し、その結果、細胞内でVLDLレセプターが新しく合成されたリガンド(apoE、遊離または脂質と会合のいずれか)に結合し、その血漿への分泌を防いでいる可能性がある。全血漿コレステロール並びにリポタンパク質コレステロールレベルに対する肝臓VLDLレセプター発現の影響は、VLDLレセプターがインビボでリポタンパク質代謝において主要な役割を果たすことができることを示す。
実施例7−VLDLレセプターの発現の安定性
本実験は、マウスにおける相対的な導入遺伝子の持続性を示す。
LDLレセプターノックアウトマウスに、0日に1 x 1011粒子のH5.010CMVlacZ、H5.010CBhLDLR、またはH5.010CMVVLDLRを静脈内に注入した。注入後の示した日(3、10、または21)にマウスを殺し、肝臓の新しく凍結した切片をそれぞれ、lacZ遺伝子の発現を検出するためにX−galで、LDLレセプター及びVLDLレセプターを検出するために抗LDLレセプター抗体または抗VLDLレセプター抗体、及びそれに続くフルオレセインを結合した二次抗体で染色した。
ウイルスの注入後3日目に集めた肝臓の分析は、>80%の肝細胞においてVLDLレセプタータンパク質を示し、細胞の周辺に局在化した明るい蛍光シグナルは、遺伝子導入前及びlacZまたはLDLレセプターを含んでいるアデノウイルスを注入した動物の組織にはなかった。VLDLレセプタータンパク質の発現は著しく安定で、ウイルスの注入後105日目に集められた組織からの約5ないし10%の肝細胞において組み換えタンパク質が検出された。このことは、導入遺伝子の発現が、遺伝子導入の3週以内に検出できないレベルまで消失したlacZ及びLDLレセプターアデノウイルスで得られた結果に対して際立って対照的である。VLDLレセプターの発現は、実験の期間(22週)を通して検出可能なままであった。
ゲノムDNAをマウス肝臓から単離し、EcoRIで消化し、そしてアデノウイルスDNA配列の時間にわたる存在をモニターするためにサザンブロッティング[K.Kozarsky等、J.Biol.Chem.、269:13695−13702(1994)]に供した。Boehringer MannheimからのGeniusキット及びそれに続く化学発光検出を用いて、アデノウイルス配列を検出した。lacZアデノウイルスを注入したC57BL/6マウスにおいて、ウイルスDNAは時間と共に迅速に減少し、注入後70日を通してわずかに検出できるレベル(〜0.05コピー/細胞)の安定基準に達した。VLDLレセプターを注入したマウスは、わずかにより高い最初のDNAレベルであるが、同様の時間経過のアデノウイルス配列の喪失を有した。さらなるDNAハイブリダイゼーション研究は、肝臓へ最初に運ばれたアデノウイルスDNAの大部分が、マウスゲノムに組み込まれないことを示した(データは示さない)が、しかしながら、このアッセイは、あるレベルの組み込みを排除することはできない。
VLDLレセプターウイルスを注入したマウスからの肝臓組織の組織病理分析は、初期の時点での炎症及びアポプトーシス細胞を示した。病理結果のタイミング及び程度は、lacZ及びLDLレセプターウイルスを注入したマウスの肝臓組織と区別できなかった。しかしながら、注入後15及び22週で、VLDLレセプターを注入したマウスからの肝臓組織は、ヘマトキシリン及びエオシン並びにoil red O染色により示されたような、中性脂質の識別できる蓄積を示した。同様な変化が、PBS、LDLレセプター、及び/またはlacZアデノウイルスを注入したLDLレセプターノックアウトマウスにおいてまれに観察された。LDLレセプターノックアウトマウスにおいて観察されたものと区別できない長期間の遺伝子発現にもかかわらず、VLDLレセプターウイルスを注入した正常C57BL/6マウスの肝臓においては、何の脂質の蓄積も観察されなかった。このことは、VLDLレセプター発現だけでは、LDLレセプターノックアウトマウスにおいて観察された脂質の蓄積における変化のために十分ではなく、その代わりに、≧18週間高コレステロールの規定食で維持されたLDLレセプターノックアウトマウスにおいて、長く続くVLDLレセプター発現により加速される何らかの脂質の蓄積があることを示す。
VLDLレセプターアデノウイルスを注入したマウスからの血漿サンプルを、VLDLレセプタータンパク質に対して誘導された抗体の存在に関して分析した。12匹のうち1匹のみが、ウイルスを与えられた各動物におけるアデノウイルスキャプシドタンパク質に対する高レベルの抗体の存在にもかかわらず、VLDLレセプターに対して抗体を生じた。VLDLレセプターアデノウイルスを注入した動物は、lacZまたはLDLレセプターアデノウイルスのいずれかを注入した動物から得られたものと区別できないアデノウイルスタンパク質にたいするCTL反応を高めた。しかしながら、これらのマウスは、VLDLレセプタータンパク質に対するCTL反応を高めなかった。従って、組み換えアデノウイルスの注入後の導入遺伝子に対するCTL反応の発生は、処理した動物における特定の導入遺伝子の抗原性による。
実施例8−アデノウイルス及び導入遺伝子に対する体液性及び細胞性免疫反応
A.体液性免疫反応
2匹のLDLレセプターノックアウトマウス(K020及びK027)または2匹の正常C57BL/6マウスに、尾の静脈を通して、0日に1 x 1011粒子のH5.010BhLDLRを注入し、ノックアウトマウスに対しては注入前(pre)、及び注入後10、24、39、52、及び70日の両方に、そしてC57BL/6マウスに対しては21日に血清サンプルを集めた。以前に記述された[K.Kozarsky等、J.Biol.Chem.、269:13695−13702(1994);K−Kozarsky等、Som.Cell and Molec.Genet.、19:449−458(1993)]ように、ウェスタンブロッティングを行った。抗アデノウイルス抗体を検出するために、精製したアデノウイルスを抗原として用いた。陽性コントロール(+)は、精製したH5.010BhLDLRの静脈内注射後に単離したウサギ抗血清であった。陰性コントロール(−)は、免疫前のウサギ血清であった。陽性コントロールとしてβ−ガラクトシダーゼ(Sigma)に特異的なモノクローナル抗体と共に精製したタンパク質(Sigma)を用いて、β−ガラクトシダーゼでのウェスタンブロットを行った。
ヒトLDLレセプターに対して誘導された抗体を、ヒトLDLレセプターをコードしているレトロウイルスを形質導入した3T3細胞系、24−23細胞から調製したライセートを用いて検出した。抗VLDLレセプター抗体の検出のために、H5.010CMVVLDLRを注入後2日目のHeLa細胞からライセートを調製した。
1 x 1011粒子の組み換えアデノウイルスを注入した全てのマウスは、ヘキソン、ペントン、及び繊維に対応する主要なバンドと共に、アデノウイルスキャプシドタンパク質に対する抗体を発生した。H5.010BhLDLRを注入した全てのマウスは、ヒトLDLレセプタータンパク質に対する抗体を発生し、LDLレセプターノックアウトマウスは、一貫して、C57BL/6マウスより高い力価の抗体を発生した。LDLレセプターノックアウトマウスからの抗体は、マウスLDLレセプタータンパク質と交差反応し、一方、(正常なマウスLDLレセプターを発現する)C57BL/6マウスからの抗体は、交差反応しなかった。
このことは、ヒト及びマウスでない配列を用いたけれども、VLDLレセプターがこれらのマウスにおいて免疫原性でなかったことを示す。ヒト及びマウスLDLレセプターのアミノ酸配列は約78%同一であり、一方、ヒト及びマウスVLDLレセプターは>94%同一である。この増加した配列の類似性は、H5.010CMVVLDLRの注入の結果としてのマウス肝臓における高いレベルの発現にもかかわらず、ヒトVLDLレセプターに対する抗体の発生がないことを説明するように思われる。
これらのデータは、動物が、導入遺伝子産物並びに注入したアデノウイルス上にコードされたウイルスタンパク質に特異的な体液性免疫を生じることができるを示す。また、成熟した、抗体を分泌しているB細胞の発達のために通常必要とされる、Tヘルパー細胞の抗原特異的な活性化の間接的な証拠も提供する。
B.細胞性免疫反応
この研究は、ウイルス抗原及び導入遺伝子産物であるヒトLDLレセプターの両方に対するCTLの活性化に関して、LDLレセプターアデノウイルスの注入後の動物を分析した。
Y.Yang等、Immunity、1:433−442(1994)において記述されたように、CTLアッセイを行った。以下のように作製された組み換えワクシニアで感染させることにより、組み換えワクシニアタンパク質を発現している標的細胞を作った。(pRC/CMVプラスミド中の)VLDLレセプターcDNAをBluescript KS+のHindIII部位にサブクローン化した。CFTR cDNA[J.R.Riordan等、Science、245:1066−1073(1989)]をBluescript KS+(Stratagene)のPstI部位にクローン化した。pUC19ベクター中のLDLレセプターcDNA[T.Yamamoto等、Cell、39:27−38(1984)]を制限酵素HindIII及びSacIで切り出し、Bluescript KS+のHindIII及びSacI部位に連結した。これらのcDNAの各々を次に、酵素SacII及びKpnIを用いて切り出し、ワクシニア発現ベクターpSC11[S.Chakrabarti等、Molec.Cell.Biol.、5:3403−3409(1985)]の改変形のSacII及びKpnI部位にクローン化した。コントロール組み換えワクシニア、VRGは、狂犬病ウイルス糖タンパク質を発現し、T.Wiktor等、Porc.Natl.Acad.Sci.USA、81:7194−7198(1984)において記述されたように調製された。
MHC適合標的細胞を単一の関係する遺伝子産物を発現する組み換えアデノウイルスまたはワクシニアウイルスのいずれかで感染させた、標準的な51クロム(51Cr)放出アッセイにおいて、特定の標的に対するCTLを検出した。図10は、%特異的な溶解が、増加するエフェクター対標的比の関数として測定される51Cr放出アッセイの実施例(図10B)、並びに累積的なデータの要約(図10A)の両方を示す。ヒトLDLレセプターまたはヒトCFTRのいずれかを含んでいる組み換えアデノウイルスを注入したC57BL/6マウスからの脾臓細胞を、ウイルスタンパク質に対する活性を測定するために組み換えアデノウイルス、またはLDLレセプタータンパク質に対する活性を測定するためにLDLレセプターを含んでいるワクシニアウイルスのいずれかで感染させた標的を溶解する能力に関して評価した。同じウイルスで感染させた細胞を標的とするLDLレセプターウイルスを感染させた動物からのリンパ細胞で細胞溶解活性を示した。擬似感染させた標的に対しては何の細胞溶解も検出されず、このことは、アッセイの特異性を裏づける。これらの同じエフェクター細胞は、コントロールワクシニアで感染させた時に存在しなかった、LDLレセプターワクシニアウイルスで感染させた標的に対する著しい細胞溶解活性を示した。これらの実験は、遺伝子治療後のC57BL/6マウスにおけるヒトLDLレセプターに対する活性化されたCTLの存在に対する有力な証拠を提供する。
実施例9−マウス肺におけるIL−12及びIFN−γによる第二の投与の際のアデノウイルスが媒介する遺伝子導入の向上
組み換えアデノウイルスH5.010CMVlacZ及びH5.010CBALP(sub360バックボーンにおいてCMVがエンハンスしたβ−アクチンプロモーターから発現されるアルカリホスファターゼ遺伝子)をこの実験に用いた。各類似したウイルスは、発現を最初のレポーター遺伝子のものから識別することのできる異なるレポーター遺伝子を発現する。
0日にH5.010CBALP(50μlのPBS中1 x 109pfu)の懸濁液を気管を通して、そして28日にH5.010CMVlacZを同様に、メスのC57BL/6マウス(6−8週年齢)に注入した。そのようなマウスの一群をコントロールとして用いた。別の群のマウスは、最初の遺伝子治療時(−3、0、及び+3日)に、CD4+細胞に対する抗体(GK1.5;ATCC番号TIB207、腹水の1:10希釈)のi.p.注射によりCD4+細胞を急激に枯渇させた。第三群のマウスには、ウイルスの一回目の投与時(0及び+1日)に、IL−12(1μgの気管内または2μgのI.p.注射)を注入した。第四群のマウスには、ウイルスの一回目の投与時(0及び+1日)に、γ−インターフェロン(1μgの気管内または2μgのI.p.注射)を注入した。
続いて、3、28、または31日でマウスを安楽死させ、検死解剖した時に、肺組織を凍結切片用に調製し、一方、気管支肺胞洗浄(BAL)及び縦隔リンパ節(MLN)を免疫学的アッセイのために集めた。
A.凍結切片
肺組織を、上に引用したY.Yang等の方法に従って、組織化学染色によりアルカリホスファターゼ発現に関して評価した。
C57BL/6マウスの全ての群の気道へのアルカリホスファターゼウイルス(109pfu)の注入は、28日までに検出できないレベルまで減少する伝達(conducting)気道の大部分における高いレベルの導入遺伝子の発現をもたらした。導入遺伝子発現の喪失は、遺伝子的に修飾された肝細胞のCTLがもたらす除去のためであることが示された[上に引用したY.Yang等]。
コントロールマウスにおいては、ウイルスの2回目の投与後3日目、すなわち、31日目で、何の組み換え遺伝子発現も検出されなかった。
CD4+を枯渇させた動物へのウイルスの投与は、1カ月間安定である高いレベルの組み換え導入遺伝子の発現と関係した。第二のウイルスの発現は、31日に検出できた。
最初の高いレベルの遺伝子導入は、IL−12で処理したマウスにおいて約1か月後に減少したが、しかしながら、コントロールと対照的に、31日の結果において見られるように、28日にIL−12で処理した動物へウイルスを再投与し時、気道上皮細胞への高いレベルの遺伝子導入が得られた。
γ−インターフェロン処理した動物は、ウイルスの2回目の投与の際に効率よい遺伝子導入が達成された点において、IL−12で処理した動物と実質的に区別できなかった。
B.免疫学的アッセイ−MLN
H5.010CBALPの投与後28日目に集めたC57BL/6マウスのコントロール群及びIL−12処理群のMLNからのリンパ細胞を、10粒子/細胞でUVで不活性化したH5.010CMVlacZでインビトロで24時間再刺激した。無細胞上清を、HT−2細胞(IL−2またはIL−4依存性細胞系)においてIL−2またはIL−4の存在に関してアッセイした[上に引用したY.Yang等]。同じリンパ細胞培養上清中のIFN−γの存在を記述された[上に引用したY.Yang等]ようにL929細胞において測定した。ウイルスで再刺激したリンパ細胞の上清中で培養したHT−2細胞へ取り込まれた3H−チミジンcpmを抗原を含まない培地中でインキュベートしたリンパ細胞の上清中で培養したHT−2細胞へ取り込まれたもので割ることにより、刺激指標(S.I.)を計算した。
これらの結果を以の表Iに示す。
両組み換えアデノウイルスでの局所(regional)リンパ節からのリンパ細胞の刺激は、Tヘルパー細胞のTH1(すなわち、IL−2及びIFN−γ)及びTH2(すなわち、IL−4)サブセットの両方の活性化に特異的なサイトカインの分泌をもたらした(表I)。
ウイルスでインビトロで刺激したIL−12処理した動物からのリンパ細胞の分析は、IL−12を与えられなかった動物と比較して、IL−2及びIFN−γの増加した分泌、並びにIL−4の相対的に減少した生産を示した(すなわち、IL−12を用いた場合、IL−2/IL−4の割合は3から6まで増加した;表I)。
C.免疫学的アッセイ−BAL
組み換えウイルスに対する最初の提示後28日目の動物から得たBALサンプルを、以下のようにアデノウイルスに対する中和抗体及び抗アデノウイルス抗体のイソタイプに関して評価した。C57BL/6マウスの同じ4群、すなわち、コントロール、CD4+枯渇、IL−12処理、及びIFN−γ処理をH5.010CBALPで感染させた。H5.010CMVlacZ(20μl中に1 x 106pfu)と混合し、37℃で1時間インキュベートし、そして96穴プレート中80%融合したHela細胞(ウェル当たり2 x 104細胞)に添加した、連続希釈したBALサンプル(100μl)において中和抗体を測定した。37℃で60分のインキュベーション後、20%FBSを含んでいる100μlのDMEMを各ウェルに加えた。細胞を固定し、次の日にβ−ガラクトシダーゼ発現に対して染色した。
抗アデノウイルス抗体の非存在下で、全ての細胞がlacZ陽性であった。
酵素結合免疫測定法(ELISA)を用いて、アデノウイルス特異的抗体のイソタイプをBALにおいて決定した。簡潔に言えば、96穴プレートを5 x 109粒子のH5.010CMVlacZを含んでいる100μlのPBSで4℃で18時間被覆した。これらのウェルをPBSで5回洗浄した。PBS中2%のBSA200μlでブロッキングした後、プレートをPBSで1回すすぎ、そして1:10希釈したBALサンプルと共に4℃で90分間インキュベートした。その後、ウェルをよく洗浄し、100μlの1:1000希釈したアルカリホスファターゼを結合した抗マウスIgGまたはIgA(Sigma)で再び満たした。プレートをインキュベートし、続いて5回洗浄し、そして100μlの基質溶液(p−ニトロフェニルリン酸塩、PNPP)を各ウェルに加えた。50μlの0.1M EDTAの添加により基質の転換を停止した。プレートを405nmで読み取った。
これらの結果を、中和抗体価、並びにBALサンプル中に存在するIgG及びIgAの相対量(OD405)を要約する、図11Aから11Cまでに図式的に示す。各サンプルに対する中和抗体の力価を、50%未満の細胞が青色に染色される最も高い希釈として報告した。
図11Aから11Cまでの第一の棒において示されるように、上の表1において同定されたサイトカインは、1:800希釈までのインビトロアッセイにおいてヒトAd5組み換えベクターを中和することのできるIgG及びIgAの両方のイソタイプのBAL中のアデノウイルスタンパク質に対する抗体の出現にコントロールマウスにおいて関係した。
図11Aから11Cまでのグラフの第二の棒において示されるように、一時的なCD4+細胞の枯渇は、中和抗体(図11A)及びウイルス特異的なIgA抗体(図11C)の形成を80倍まで抑制し、それによりウイルスの2回目の投与後に効率よい遺伝子導入が起こることを可能にした。図11Bは、同様にIgGのわずかな抑制を示す。
より重要なことには、3つのグラフの第3の棒において示されるように、IL−12は、IgGの形成に対して著しく影響を与えずに(図11B)、抗原特異的なIgAの分泌を選択的に阻止した(図11C)。このことは、中和抗体の32倍の減少(図11A)と同時に起こった。
γ−インターフェロンで処理した動物(図11Aから11Bまでの第4の棒)は、ウイルス特異的なIgA(図11C)及び中和抗体(図11A)がサイトカインで処理されなかったコントロール動物に比べて減少する点においてIL−12で処理した動物と実質的に区別できないが、IL−12で処理したもので得られたほどではなかった。
これらの研究は、ウイルスへの最初の提示時のCD4+機能の阻害が、阻止抗体の形成を防ぐのに十分であることを示す。抗ウイルスIgAと中和抗体の一致した減少は、IgAサブタイプの免疫グロブリンが、主に、遺伝子導入に対する妨害の原因であることを示唆する。
上に再び引用した全ての参考文献は、参考文献により本明細書に含まれる。本発明の多数の修正及び変形が上に同定された明細書中に含まれ、そしてこれらは当該技術分野において熟練した者にとって明らかであると思われる。VLDLR遺伝子を運ぶために選択されたアデノウイルスベクターの異なる修飾の選択、あるいはベクターまたは免疫調節剤の選択または服用量のような本発明の組成物及び方法に対するそのような修正及び改変は、本明細書に付加した請求の範囲内であると考えられる。
配列表
(1)一般情報
(i)出願人:ペンシルバニア大学(University of Pennsylvania)の受託者(trustees)
Wilson、James M.
Kozarsky Karen F.
Strauss、Jerome F.
(ii)発明の名称:リポタンパク質代謝における欠陥の治療のための遺伝子治療の方法及び組成物
(iii)配列数:8
(iv)通信住所
(A)受信人:Howson and Howson
(B)通り:スプリングハウスコーポレートセンター(Spring House Corporate Cntr.)、私書箱457(
C)市:スプリングハウス(Spring House)
(D)州:ペンシルバニア(Pennsylvania)
(E)国:米国(USA)
(F)郵便番号:19477
(v)コンピューター可読形態
(A)媒質のタイプ:フロッピーディスク
(B)コンピューター:IBM PC 互換性
(C)オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
(D)ソフトウェア:PatentIn リリース#1、バージョン#1
(vi)現在の出願データ
(A)出願番号:
(B)申請日:
(C)分類:
(vii)先行する出願データ
(A)出願番号:US08/393,734
(B)申請日:1995年2月24日
(viii)弁護士/代理人の情報
(A)氏名:Bak、Mary E.
(B)登録番号:31,215
(C)証明書番号:GNVPN009CIPl.PCT
(ix)遠距離通信の情報
(A)電話:215−540−9200
(B)ファックス:215−540−5818
(2)配列番号1の情報
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:3656塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(ix)特徴
(A)名称/KEY:CDS
(B)位置:392..3010
(xi)配列:配列番号1
2)配列番号2の情報
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:873アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号2
(2)配列番号3の情報
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:9592塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号3
(2)配列番号4の情報
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:14塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号4
(2)配列番号5の情報
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:14塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号5
(2)配列番号6の情報
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:14塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号6
(2)配列番号7の情報
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:14塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号7
(2)配列番号8の情報
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:14塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号8
Claims (9)
- 肝細胞における発現を誘導する調節配列に適切に連結されたヒトVLDLレセプター遺伝子を含んでなる組み換えウイルスベクター。
- 該ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項1記載のベクター。
- アデノウイルスE1遺伝子の全てまたは一部における欠失をさらに含んでなる、請求項2記載のベクター。
- アデノウイルスE3遺伝子の全てまたは一部における欠失をさらに含んでなる、請求項3記載のベクター。
- 肝細胞における発現を誘導する調節配列に適切に連結されたヒトVLDLレセプター遺伝子を含んでなる組み換えウイルスベクターによる該肝細胞のトランスダクシヨンを通して、その中に導入されたヒトVLDLレセプター遺伝子を発現する哺乳類の肝細胞。
- 製薬学的に受容しうる担体及びウイルスベクターを含んでなり、該ベクターが、肝細胞における発現を誘導する調節配列に適切に連結されたヒトVLDLレセプター遺伝子を含んでなる、製薬学的組成物。
- 該ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項6記載の組成物。
- アデノウイルスE1遺伝子の全てまたは一部における欠失をさらに含んでなる、請求項7記載の組成物。
- アデノウイルスE3遺伝子の全てまたは一部における欠失をさらに含んでなる、請求項8記載の組成物。
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