JP2002512785A

JP2002512785A - 疾患治療用のアデノウイルスベクター

Info

Publication number: JP2002512785A
Application number: JP2000545977A
Authority: JP
Inventors: ハーミストン，テリー; ケー．ホーキンス，リンダ; ジョンソン，レイサ
Original assignee: オニックスファーマシューティカルズ，インコーポレイティド
Priority date: 1998-04-24
Filing date: 1999-04-19
Publication date: 2002-05-08
Also published as: CY1111931T1; WO1999055831A3; AU772963B2; ATE517999T1; CA2323235A1; DK1071805T3; EP1071805A2; WO1999055831A2; CN1298451A; PT1071805E; AU3656399A; EP1071805B1

Abstract

(57)【要約】 E3領域の部分又は全部、あるいはその中の選択遺伝子の部分又は全部の欠失を容易にする制限部位をE3領域内に有するアデノウイルスベクター、例えばアデノウイルス変異体、これを含有する組成物、及び希望する場合にこれを異種遺伝子によって置換する方法。前記遺伝子は、置換された内在性アデノウイルス遺伝子と同様の発現時期及び発現量の様式で発現する。本ベクターは場合により、アデノウイルスゲノムの他の部分、例えばE1B又はE1A領域内の変異を更に含有する。本ベクターは、疾患、好ましくは不必要な細胞増殖が関与する疾患、例えばガンを診断又は治療するために用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、一般的には遺伝子治療に関し、特には予防的又は治療的に用いるア
デノウイルスベクターに関する。

【０００２】発明の背景アデノウイルスは、遺伝子治療にベクターとして用いられる。Jolly, D., Can
cer Gene Therapy, vol.1, no.1., 1994: pp51-64参照。アデノウイルスの分子
遺伝的性質は十分に評価されているので、この様なベクターとして有利である。
アデノウイルスは、エンベロープを有さない20面体であり、約36k塩基対の線状
二重鎖DNAを有する。当ウイルスゲノムの各末端には、ウイルス複製に必要な逆
方向末端反復配列(ITR)という短い配列を有する。当ウイルスゲノム内の部分を
、異種起源のDNAによって容易に置換することができ、しかも組換えアデノウイ
ルスは構造的に安定である。

【０００３】アデノウイルスの複製サイクルは二相から成る。１つは４つの転写単位E1、E2
、E3及びE4が発現される初期相であり、もう１つは、ウイルスDNAの合成開始後
に始まり、後期転写産物が主要後期プロモーターから発現される後期相である。
後期mRNAは、ウイルスの構造タンパク質の大部分をコードする。E1、E2及びE4の
遺伝子産物は、転写活性化、細胞の形質転換、ウイルスDNAの複製、並びにその
他のウイルス機能を担当するものであり、ウイルス増殖に必須である。

【０００４】今日まで、ほとんどのアデノウイルスベクターは、E1、E3、又は、外来DNAの
挿入部位を供給するE4の上流部位に関する変異ウイルスに基づく。おそらくその
大部分のベクターは、E1領域を欠失したアデノウイルス変異株に基づく。その領
域の欠失により、そのウイルスは複製不能となり、しかもそこに外来遺伝子の挿
入が可能となる。

【０００５】遺伝子治療のためのアデノウイルスの使用に関する報告が多数ある。例えば、
Smith et al., Nature Genetics, Vol.5, 397-402 (1993)には、ヒト第IX因子
遺伝子を含有するアデノウイルスベクターのマウスへの投与が開示されている。
この投与により、肝臓への効率的な形質導入が為され、血友病Ｂ患者を治療でき
るであろう血漿レベルのヒト第IX因子が生産された。しかしヒト第IX因子のレベ
ルは、注射後９週間まで基底レベルまで徐々に減少し、しかも２回目のベクター
注射によって再度回復しなかった。Smith et al.は、アデノウイルスに対する中
和抗体が、アデノウイルスの再投与の効果を阻害することも認めた。

【０００６】 Kozarsky et al., J.Biol.Chem., Vol.269, No.18, 13695-13702 (May 6, 199
4)には、LDL受容体をコードするDNAを含有するアデノウイルスベクターのウサギ
への注入が開示されている。そのウサギにおいてLDL受容体遺伝子の安定な発現
は７〜10日間観察されたが、３週間以内に検出できないレベルまで減少した。ア
デノウイルスに対する中和抗体の発達により、２回目の投与は完全に無効となっ
た。

【０００７】 Kass-Eisler et al., Gene Therapy, Vol.1, 395-402 (1994)では、Ｔ細胞応
答が、これだけが原因ではないが、成人におけるアデノウイルスからの発現期間
の制約に関与することが示唆されている。この著者らは、シクロスポリンＡは、
ベクターに対する液性応答を阻害する効果が無いことも示している。

【０００８】 Fang et al., J.Cell.Biochem., Supplement 21A, C6-109, pg363 (1995)には
、免疫抑制剤シクロスポリンＡで処理されたイヌにおいてアデノウイルスベクタ
ーの再投与を試みたことが報告されている。この試験再投与は成功した。

【０００９】 Yang et al., Proc.Natl.Acad.Sci. Vol.91, 4407-4411 (May 1994)には、E1a
及びE1b領域を欠失した組換えアデノウイルスが記載されている。このウイルス
はトランス遺伝子も含有する。このアデノウイルスを動物宿主に投与した場合、
この組換えウイルスゲノムを保有する細胞は、希望通りにトランス遺伝子を発現
するが、その発現量はやはり低かった。

【００１０】前記例示の通り、アデノウイルスは、インビボでの細胞への遺伝子導入に効率
的であり、従って真核細胞に希望遺伝子を導入する供給担体として利用でき、細
胞の受容体への結合を介して真核細胞へ希望遺伝子を供給する。しかしアデノウ
イルスによる遺伝子導入には、アデノウイルスベクター粒子、そのベクター粒子
の分解産物、又は被導入細胞に対する宿主応答が部分的に関与するいくつかの制
約がある。これらの宿主応答には、非特異的な応答と特異的な免疫応答がある。
非特異的な応答には、炎症性又は非炎症性の変化があり、後者の例は、宿主細胞
の遺伝子発現変化である。特異的な免疫応答には、種々の細胞性応答と液性抗体
応答があり、この細胞応答は、Ｔヘルパーリンパ球、Ｔサプレッサーリンパ球、
細胞毒性リンパ球(CTL)、及びナチュラルキラー細胞による。

【００１１】アデノウイルスによる遺伝子導入の効率は高いが、当導入は一過的であること
から、アデノウイルスベクター投与の繰り返しが必要であろう。しかしコトンラ
ットを用いた最近の実験では、アデノウイルスベクターに対する宿主の免疫応答
が、再投与後の遺伝子導入の効率及び発現の低下と相関することが示された。Ye
i et al., Gene Therapy 1, 192-200 (1994)。E3領域は、ウイルス複製に必要で
ないいくつかの免疫調節タンパク質：gp19K, 10.4K, 14.5K及び14.7K、並びに、
感染細胞の溶解及び感染性子孫の放出に必要な１つのタンパク質11.6Kをコード
する。

【００１２】 E3領域はウイルス複製に必須ではないが、ウイルスに対する宿主免疫応答を調
節する重要な役割を有する。例えばgp19Kは、小胞体内で MHCクラスＩ分子と結
合し、そのグルコシル化及び、ウイルス感染した細胞の表面への輸送を阻害する
。従ってその感染細胞は、細胞毒性リンパ球によって外来物質と認識されない。
Burgert, B., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1987: vol.8: 1356-60。

【００１３】 E3領域には多くの機能があるために、E3の特定領域を欠失させ、そこを使用目
的に応じた外来DNAで置換した遺伝子治療用アデノウイルスベクターが望まれて
いる。例えば、XbaI部位間の1.88kbを除去したE3領域の欠失が報告されている。
Berkner, K. and Sharp, P. (1983) Nucleic Acids Res. Vol.11, 6003-6020及
びHaj-Ahmad, Y. and Graham, F. (1986) J.Virol. Vol.57, 267-274。更に、E1
及びE3の両領域に挿入又は欠失を有するアデノウイルスを構築するための組成物
及び方法が報告されている。Ginsberg, H.S. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA
1989, vol.86, 3823-7。従って、E3領域の変異を有する、すなわちその領域の大部分を欠失したベクタ
ーが存在するが、これまで、当領域中の選択した部分を除去して、そこを外来DN
Aに置換したベクターは存在していない。

【００１４】発明の要旨本発明の第１の対象は、E3領域の部分又は全部、あるいはその中の選択遺伝子
の部分又は全部の欠失を容易にする制限部位をE3領域内に有する組換えアデノウ
イルスベクターであり、希望する場合には、当部分を異種遺伝子で置換して、そ
の遺伝子を、置換された内在性アデノウイルス遺伝子と同様の発現時期及び発現
量の様式で発現させる前記組換えアデノウイルスベクターである。

【００１５】本発明の第２の対象は、6.7k及びgp19kタンパク質をコードするE3領域内の初
期領域遺伝子中に制限部位を有する組換えアデノウイルスベクターである。本発明の第３の対象は、10.4k、14.5k及び14.7kタンパク質をコードするE3領
域内の初期領域遺伝子中に制限部位を有する組換えアデノウイルスベクターであ
る。本発明の第４の対象は、E3領域の部分又は全部、あるいはその中の選択遺伝子
の部分又は全部の欠失を容易にする制限部位をE3領域内に有する組換えアデノウ
イルスベクターであり、並びに当部分を外来遺伝子で置換するための組成物及び
方法である。

【００１６】本発明の第５の対象は、E3領域の部分又は全部、あるいはその中の選択遺伝子
の部分又は全部の欠失を容易にする制限部位をE3領域内に有する組換えアデノウ
イルスベクターを作成する方法である。本発明の第６の対象は、E3領域の部分又は全部、あるいはその中の選択遺伝子
の部分又は全部の欠失を有する組換えアデノウイルスベクターを保有する宿主細
胞である。本発明の第７の対象は、E3領域の部分又は全部、あるいはその中の選択遺伝子
の部分又は全部の欠失を容易にする制限部位をE3領域内に有する組換えアデノウ
イルス変異体である。

【００１７】本発明の第８の対象は、E3領域の部分又は全部、あるいはその中の選択遺伝子
の部分又は全部の欠失を容易にする制限部位をE3領域内に有する組換えアデノウ
イルス変異体、例えばビリオン：E3SV, E3SV+V, E3SV+B及びE3SV+V+Bである。本発明の第９の対象は、E3領域の部分又は全部の欠失を容易にする制限部位を
E3領域内に有し、且つアデノウイルスゲノム内の他の領域、好ましくはE1A, E1B
及び/又はE4領域にも変異を有する組換えアデノウイルス変異体である。

【００１８】本発明の第10の対象は、E3領域の部分又は全部、あるいはその中の選択遺伝子
の部分又は全部の欠失を容易にする制限部位をE3領域内に有し、且つ当部分が、
医療上有益なタンパク質をコードする遺伝子によって置換されている組換えアデ
ノウイルス変異体を用いて、疾患、好ましくは不必要な細胞増殖が関与する疾患
、例えば新生物形成を診断又は治療するための方法及び組成物である。

【００１９】本発明の前記対象及びその他の対象は、本明細書における本発明の記載により
当業者に明らかになろう。本発明の対象を、図面、詳細な説明、及び実施例から
より詳細に説明する。

【００２０】発明の詳細な説明本明細書中に記載された特許及び特許出願を含む全ての文献を引用により本文
に組み込む。定義特に定義していない限り、本文中の全ての技術及び科学用語は、本発明の分野
の当業者が一般的に理解しているものと同じ意味である。一般に、本文中の命名
法及び下記の研究方法は、周知のものであり、そして当分野で通常用いられるも
のである。

【００２１】組換え核酸技術、ポリヌクレオチド合成、並びに微生物の培養及び形質転換(
例えばエレクトロポレーション、リポフェクション)に関して、標準的な技術を
用いる。一般に、酵素反応及び精製過程を、製造業者の取扱説明書に従って行う
。関連する技術及び方法を、一般に、当分野における通常方法及び種々の一般参
考書に従って行う(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Mannua
l, 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, N.Y.)。本文中の命名法並びに、分析化学、有機合成化学及び医薬調製
に関する研究方法は、周知のものであり、そして当分野で通常用いられるもので
ある。化学合成、化学分析、医薬の調製と供給、及び患者の処置に関して、標準
的な技術を用いる。

【００２２】アデノウイルスを遺伝子工学的に修飾して、E3領域で変異誘発するために参考
となる文献が、当業者にも明らかである。この様な文献には、E1領域へのDNAの
挿入を記載したMcGrory, W.J. et al. (1988) Virology, vol.177, 437-444；E3
領域への外来DNAの挿入を記載したHanke, T. et al. (1990) Virology, vol.177
, 437-444及びBett, A.J. et al. (1933) J.Virol. vol.67, 5911-5921；並びに
、E1及びE3領域へのDNAの挿入を記載したBett, A.J. et al. (1994) Proc.Natl.
Acad.Sci. vol.91, 8802-8806がある。

【００２３】本発明の特定の態様を表す一般式において、アミノ末端基及びカルボキシル末
端基は、特に表示することも多くないが、特に指示のない場合、生理学的pH条件
下での形である。従って、特定の実施例又は一般式において、必ずしも明示しな
いが、生理学的pH条件下でＮ末端はH2+であり、そしてＣ末端はO-である。ポリ
ペプチドの表示では、標準的な表示及び慣習に従って、当分子の左側がアミノ末
端であり、そして右側がカルボキシ末端である。当然、塩基添加塩及び酸添加塩
、例えば非生理学的pH条件下で形成された前記塩もまた、本発明の化合物に含ま
れる。本文中のアミノ酸残基は、好ましくはＬ体である。通常の20アミノ酸の立
体異性体(例えばD-アミノ酸)、非天然アミノ酸、例えばa,a-分配型アミノ酸、N-
アルキルアミノ酸、乳酸、及びその他の通常でないアミノ酸も、そのポリペプチ
ドによって機能特性が保持される限り、本発明のポリペプチドの成分として適す
る。ポリペプチドを表示する場合、標準的なポリペプチド命名法(J.Biol.Chem.
243: 3552-59 (1969)及び37 CFK§1.822(b)(2))に従って、通常のアミノ酸の３
文字表記法によって、適宜、コードされた残基を表示する。Ｃ末端又はＮ末端の
ものを含む遊離の官能基は、非干渉性の置換基と呼ばれ、アミド化、アシル化又
はその他の置換によって修飾することができ、それによって、例えば、活性に影
響することなく当化合物の溶解性を変えることができる。

【００２４】本文中の下記の用語は、特に指示しない限り、下記の意味を有する。用語「単離されたタンパク質」とは、cDNA、組換えRNA、又は合成起源、又は
それらの組合せに由来するタンパク質であり、その起源に依り、「単離されたタ
ンパク質」は、(1)天然に存在するタンパク質と結合せず、(2)同起源に由来する
他のタンパク質、例えばヒトタンパク質、を含まず、(3)異なった種の細胞によ
り発現され、又は(4)天然に存在しないことを意味する。

【００２５】対象物が「天然に存在する」とは、その対象物を天然に発見できることを指す
。例えば、生物体(ウイルスを含む)中に存在するポリペプチド又はポリヌクレオ
チド配列であって、天然の起源から単離することができ、そして実験室で人為的
に修飾されていないものが、天然に存在するものである。

【００２６】用語「アデノウイルス」は、ヒト、並びに他の多数の哺乳類及び鳥類から単離
された40種類超のサブタイプのアデノウイルスを指す。Strauss "Adenovirus in
fections in human" in The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plenum Press, New
York, NY, pp.451-596 (1984)参照。好ましくは当用語は、ヒトの２種類の血清
型Ad2とAd5を指す。

【００２７】用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも10塩基長のヌクレオチド重合体であ
り、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド、又はいずれかのヌクレオ
チドの修飾体から成るものを指す。当用語には、DNAの一本鎖又は二本鎖が含ま
れる。

【００２８】用語「オリゴヌクレオチド」は、天然及び非天然のヌクレオチド結合によって
相互に連結された天然及び修飾ヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチドは、20
0以下の塩基から成るポリヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、好まし
くは10〜60塩基長である。オリゴヌクレオチドは通常、例えばプローブに用いる
場合一本鎖であり、例えば変異遺伝子を構築する場合二本鎖である。本発明のオ
リゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかで
ある。用語「天然ヌクレオチド」とは、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌク
レオチドを指す。用語「修飾ヌクレオチド」とは、修飾された又は置換された糖
基を有するヌクレオチド、及び当業界で周知のその様なヌクレオチドを指す。

【００２９】用語「標識」又は「標識された」とは、検出可能なマーカーの組込みを指し、
これは、例えば放射性標識されたアミノ酸の組込み、あるいは標識アビジン(光
学法又は比色法によって検出する蛍光マーカー又は酵素を含有するストレプトア
ビジン)によって検出するビオチン部分のポリペプチドへの結合などに依る。ポ
リペプチド及び糖タンパク質を標識する当業界に周知の種々の方法を用いること
ができる。ポリペプチドの標識の例は、限定でなく、放射性同位体(例えば³H, ¹ ⁴ C, ³⁵S, ¹²⁵I, ¹³¹I)、蛍光標識(例えばFITC、ローダミン、ランタン系蛍光体)
、酵素標識(例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、b-ガラクトシダーゼ、ルシフ
ェラーゼ、アルカリホスファターゼ)、化学発光体、ビオチニル基、二次レポー
ターによって認識される事前に決定されたポリペプチドエピトープ(例えばロイ
シンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ
)である。いくつかの実施態様では、立体障害の可能性を減らすために、種々の
長さの間隙アームによって標識を取り付ける。

【００３０】用語「配列相同性」とは、２つの核酸配列間で一致した塩基の割合、又は２つ
のアミノ酸配列間で一致したアミノ酸の割合を指す。配列相同性をパーセントで
、例えば50％と言う様に表示する場合、このパーセントは、他の配列と比較した
配列の長さに対する一致部分の割合を指す。一致を最大にするために(２つの配
列のいずれかに)ギャップを挿入してよい。ギャップ長は通常15塩基以下であり
、好ましくは６塩基以下、より好ましくは２塩基以下である。

【００３１】用語「選択的にハイブリダイズする」とは、検出可能に、且つ特異的に結合す
ることを指す。本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びその断片は
、非特異的な核酸に対する検出可能な結合量を最小にするハイブリダイズ及び洗
浄の条件下で、核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。当業界に周知な通り、そ
して以下に記載の通り、選択的なハイブリダイゼーションを行うために、高スト
リンジェント条件を用い得る。一般に、本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌク
レオチド及びその断片と、注目の核酸配列との間の核酸配列相同性は少なくとも
80％であり、典型的には、より高い相同性、少なくとも85、90、95、99及び 100
％が好ましい。

【００３２】２つのアミノ酸配列は、それらの配列間に部分的又は完全な一致が存在する場
合に相同である。例えば、85％相同とは、２つの配列を、最大の一致を得る様に
整列させた場合、85％のアミノ酸が一致することを指す。一致を最大にするため
に(２つの配列のいずれかに)ギャップを挿入してよい。ギャップ長は、好ましく
は５以下であり、より好ましくは２以下である。あるいは、そして好ましくは、
変異データマトリクス及び６以上のギャップペナルティを用いたALIGNプログラ
ムによって、アライメントスコアが(標準偏差単位で)５より大きい場合、２つの
タンパク質配列(又は、それらに由来する少なくとも30アミノ酸長のポリペプチ
ド配列)は相同である。Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Str
ucture, 1972, vol.5, National Biomedical Research Foundation, pp.101-110
, 及び Supplement 2 to this volume, pp.1-10参照。２つの配列又はそれらの
部分を、ALIGNプログラムによって最適に整列させ、それらのアミノ酸が50％以
上一致した場合、それらはより好ましく相同である。

【００３３】用語「相当する」とは、ポリヌクレオチド配列が、参照するポリヌクレオチド
配列の全部又は部分と相同である(すなわち同一であり、厳密には進化上の類縁
ではない)こと、あるいはポリペプチド配列が、参照するポリペプチド配列と同
一であることを指す。対照的に、用語「相補的な」とは、相補的な配列が、参照
するポリヌクレオチド配列の全部又は部分と相同であることを指す。例えば、ヌ
クレオチド配列"TATAC"は、参照配列"TATAC"と相同であり、参照配列"GTATA"と
相補的である。

【００３４】２以上のポリヌクレオチド間の配列関係を記すために、以下の用語を用いる：
「参照配列」、「比較域」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」及び「
実質的な同一」。「参照配列」は、配列比較の基礎として用いる規定された配列
のことである。例えば、配列表に示した全長cDNA又は遺伝子配列のある区分に、
完全なcDNA又は遺伝子配列が含まれ得るので、参照配列は、より大きな配列のサ
ブセットでもよい。一般に、参照配列の長さは、少なくとも20ヌクレオチドであ
り、多くは少なくとも25ヌクレオチドであり、しばしば少なくとも50ヌクレオチ
ドである。２つのポリヌクレオチドは各々、(1)その２つのポリヌクレオチド間
で類似する配列(すなわち完全なポリヌクレオチド配列の部分)を含み、且つ(2)
その２つのポリヌクレオチド間で異なる配列を更に含み得るので、２つ(又はそ
れ以上)のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、配列類似性を有する
局所領域を同定及び比較するために「比較域」においてその２つのポリヌクレオ
チドの配列を比較することによって行われる。「比較域」とは、少なくとも20の
連続したヌクレオチド位置の概念上の区分を指し、そこでは、ポリヌクレオチド
配列を、少なくとも20の連続したヌクレオチドから成る参照配列と比較し、そし
て比較域中のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適な整列のために
、参照配列(これは付加又は欠失を含まない)との比較において、20％以下の付加
又は欠失(すなわちギャップ)を含み得る。

【００３５】比較域を整列させるために、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2
: 482に記載の局所相同アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch (1970) J.M
ol.Biol. 48: 443に記載の相同整列アルゴリズムにより、Pearson and Lipman (
1988) Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 85: 2444に記載の類似性検索法により、これ
らのアルゴリズムのコンピュータによる実行(Wisconsin Genetics Software Pac
kage Release 7.0 (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)
中のGAP, BESTFIT, FASTA及びTEASTA)により、あるいは検視により、最適な配列
整列を行うことができ、そして種々の方法により得られた最良の整列(すなわち
比較域における最高率の相同性が得られる整列)を選択する。

【００３６】用語「配列同一性」とは、比較する領域において、２つのポリヌクレオチド配
列が(ヌクレオチド毎に)同一であることを指す。用語「配列同一性のパーセント
」は、比較域において最適に整列された２つの配列を比較し、一致した位置の数
を得るために、両配列において核酸塩基(例えばA, T, C, G, U又はI)が同一であ
る位置の数を決定し、一致した位置の数を、比較域中の位置の総数(比較域サイ
ズ)で除し、そしてその結果に100を乗じることによって計算することができる。

【００３７】用語「実質的に同一」とは、ポリヌクレオチド配列の特性を表し、そのポリヌ
クレオチドが、少なくとも20ヌクレオチド、多くは少なくとも25〜50ヌクレオチ
ドから成る比較域において、参照配列に対して少なくとも85％、好ましくは少な
くとも90〜95％、より普通には少なくとも99％の配列同一性を有する配列を含有
する特性を指す。この配列同一性のパーセントは、参照配列とポリヌクレオチド
配列とを比較することによって計算され、そのポリヌクレオチド配列には、比較
域において合計で参照配列の20％以下の欠失又は付加が含まれてもよい。参照配
列は、より大きい配列のサブセットであってもよい。

【００３８】「実質的に純粋な」とは、対象物が、優勢に存在すること(すなわちモルベー
スで、それが、組成物中の任意の他の物に比べて豊富であること)を指す。実質
的に精製された分画とは、好ましくは、含有される全ての高分子の(モルベース
で)少なくとも約50％で対象物が存在する組成物を指す。一般に、実質的に純粋
な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子の約80％超、より好ましくは約85
、90、95及び99％超の対象物を含有する。より好ましくは、対象物は、実質的に
均一になるまで精製され(通常の検出方法では組成物中で混入物が検出されない)
、その組成物は、単一種の高分子から本質的に成る。

【００３９】ポリペプチドに対して「実質的に同一」とは、２つのペプチド配列が、例えば
デフォルトのギャップ値を用いたプログラムGAP又はBESTFITにより、最適に整列
された場合、少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは95％
、最も好ましくは99％の配列同一性を有することを指す。同一でない残基が、保
存的なアミノ酸によって置換されていることが好ましい。保存的なアミノ酸置換
とは、類似の側鎖を有する残基間の相互交換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖
を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシ
ンであり、ヒドロキシル化脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、セリン及びトレオ
ニンであり、含アミド側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギン及びグルタミン
であり、芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン及びト
リプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リシン、アルギニン及
びヒスチジンであり、含硫黄側鎖を有するアミノ酸群は、システイン及びメチオ
ニンである。保存的アミノ酸置換される好ましい群は、バリン−ロイシン−イソ
ロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリ
ン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。

【００４０】用語「ポリペプチド断片」又は「ペプチド断片」とは、アミノ末端及び/又は
カルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドを指す。残ったアミノ酸配列は、例
えば完全長のcDNA配列から推定される天然配列における対応する位置の配列に等
しい。当断片は、典型的には８〜10アミノ酸、好ましくは少なくとも10〜20アミ
ノ酸、更に好ましくは20〜70アミノ酸の長さである。

【００４１】本文中のその他の化学用語は、当分野の通常の使用に従って、例えばThe McGr
aw-Hill Dictionary of Chemical Terms (ed. Parker, S., 1985), McGraw-Hill
, San Franciscoに記載の通り、使用される。クローン化された遺伝子から遺伝子工学的にタンパク質を生産することは周知
である。例えば米国特許4,761,371(Bell et al.)６段３行〜９段65行を参照す
る。従って以下の説明は、この分野の概略であり、その全てではない。

【００４２】本発明のアデノウイルス構成体中のE3領域に挿入し得る、タンパク質をコード
するDNAを、化学合成により、適当な細胞又は株化細胞に由来するmRNAの逆転写
産物のスクリーニングにより、適当な細胞に由来するゲノムライブラリーのスク
リーニングにより、又はこれらの方法の組合せにより、下記の説明通り得ること
ができる。プローブを、周知の方法に従って検出可能な基、例えば蛍光基、放射
性原子又は化学発光基により標識し、そして実施例に詳細に記載した通り、それ
を通常のハイブリダイゼーション検査で用いる。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法によって遺伝子配列を回収すること
もできる。米国特許4,683,195 (Mullis et al.)及び4,683,202 (Mullis)参照。

【００４３】ベクターは、複製可能なDNA構成体である。好ましい態様では、アデノウイル
スE3変異体を実現するためのベクターは、Promega社のpGEMベクターに基づく。
所望のタンパク質をコードするDNAを増幅するため、及び/又はそのタンパク質を
コードするDNAを発現させるためにベクターが利用される。発現ベクターは複製
可能なDNA構成体であり、その中で、注目のタンパク質をコードするDNA配列が、
適当な宿主内でのそのタンパク質の発現を可能にする適当な調節配列に作用可能
に連結されている。その様な調節配列は、選択した宿主細胞及び形質転換法に依
存して変動する。一般に、調節配列には、転写プロモーター、転写を調節するた
めの任意のオペレーター配列、適当なmRNAのリボソーム結合部位をコードする配
列、並びに、転写及び翻訳の停止を調節する配列が含まれる。増幅ベクターは、
発現調節ドメインを必要としない。これは、通常複製起点によって付与される宿
主内での複製能、及び形質転換体の同定を容易にする選択遺伝子が必要とされる
。

【００４４】本発明の実行に有用なベクターには、プラスミド、ウイルス(ファージを含む)
、及び組込み可能DNA断片(すなわち相同組換えによって宿主ゲノムに組み込まれ
得る断片)がある。ベクターは、宿主ゲノムと独立して複製及び機能し、あるい
は場合により、そのゲノム内に組み込まれてもよい。適当なベクターは、希望す
る発現宿主内で機能するものに由来するレプリコン及び調節配列を有する。形質
転換された宿主細胞は、組換えDNA技術により構築されたベクターによって形質
転換された、又はそのベクターが導入された細胞である。

【００４５】 DNA領域が相互に機能的に連関する場合に、それらは作用可能に連結されたこ
とになる。例えば、プロモーターがコード配列の転写を調節する場合に、それは
その配列に作用可能に連結され、リボソーム結合部位が翻訳を可能にする様に配
置された場合に、それはコード配列に作用可能に連結されたことになる。一般に
、作用可能な連結とは連続なものであり、リーダー配列の場合には読み枠内で連
続的である。本発明の好ましい態様では、あるE3領域DNAが欠失し、そこがDNA置
換されている場合、そのプロモーターは、ネガティブ選択遺伝子に作用可能に連
結された組織特異的プロモーターである。

【００４６】適当な宿主細胞には、原核細胞、酵母細胞、又はより高等な真核細胞がある。
原核細胞には、グラム陰性菌又はグラム陽性菌、例えば大腸菌又はバチルス菌が
ある。より高等な真核細胞には、以下の記載の通り、哺乳動物に由来する確立し
た細胞株がある。典型的な宿主細胞は、DH5a、大腸菌W3110 (ATCC 27325)、大腸
菌Ｂ、大腸菌X1776 (ATCC 31537)及び大腸菌294 (ATCC 31446)である。

【００４７】多様な適当な微生物用ベクターが入手可能であり、本発明のアデノウイルスベ
クターを構築するために利用される。一般に微生物用ベクターは、使用する宿主
によって認識される複製起点、その宿主内で機能するプロモーター、並びに表現
型選択用遺伝子、例えば抗生物質耐性を付与する、又は独立栄養性を付与するタ
ンパク質をコードする遺伝子、を保有する。他の宿主のために類似の構成体が作
成される。典型的には、pBR322によって大腸菌を形質転換する。Bolivar et al.
, Gene 2, 95 (1977)参照。pBR322は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性
遺伝子を保有するので、形質転換細胞を簡単に同定できる。発現ベクターは、宿
主生物によって認識されるプロモーターを保有する必要がある。これは一般に、
使用する宿主から得られるプロモーターを意味する。微生物用組換え発現ベクタ
ーにおいて最も普通に使用されるプロモーターには、ベータラクタマーゼ(ペニ
シリナーゼ)プロモーター及びラクトースプロモーター(Chang et al., Nature 2
75, 615 (1978)；並びGoeddel et al., Nucleic Acids res. 8, 4057 (1980)及
びEPO出願公開36,776)、並びに tacプロモーター(H.De Boer et al., Proc.Natl
.Acad.Sci.USA 80, 21(1983))がある。これらが一般に使用されるが、その他の
微生物プロモーターも適する。多数のプロモーターのヌクレオチド配列の詳細が
公表されているので、当業者は、それらを、プラスミド又はウイルスベクター内
で DNAに作用可能に連結することができる(Siebenlist et al., Cell 20, 269,
1980)。

【００４８】多細胞生物に由来する培養細胞は、組換えタンパク質合成にとって望ましい宿
主である。原則的には、脊椎動物又は無脊椎動物に関わらず、任意の高等真核細
胞の培養が有用である。しかし哺乳動物の細胞が好ましい。その様な細胞の培養
増殖は、日常的な作業となっている。Tissue Culture, Academic Press, Kruse
and Paterson, editors (1973)参照。有用な宿主細胞株の例は、VERO細胞及びHe
La細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株、並びにFL5.12, WI138, BHK,
COS-7, CV及びMDCK細胞株である。この様な細胞のための発現ベクターは一般に
、(必要なら)複製起点、発現させる遺伝子の上流に位置するプロモーター、更に
リボソーム結合部位、RNAスプライス部位(イントロンを有するゲノムDNAを用い
る場合)、ポリアデニル化部位、そして転写停止配列を保有する。

【００４９】複製起点は、外来性起点、例えばSV40又はその他のウイルス(例えばポリオー
マ、アデノウイルス、VSV又はBPV)に由来する起点、を保有するベクターを構築
することによって、あるいは宿主細胞の染色体複製機構によって供給され得る。
ベクターが宿主細胞の染色体内に組み込まれる場合には、後者で十分であろう。

【００５０】形質転換される脊椎動物細胞において使用される発現ベクター内の転写及び翻
訳調節配列は、しばしば、アデノウイルスを含むウイルスによって供給される。
ウイルス及び哺乳動物の種々の構成的プロモーター要素を用いることができる。
Mittal et al. (1993) Virus Research, vol.28, pp.67-90参照。例えば、普通
に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２及びサルウイルス
40(SV40)に由来する。例えば米国特許4,599,308参照。それの初期プロモーター
及び後期プロモーターが有用である。なぜなら両者は、そのウイルスから、SV40
ウイルスの複製起点をも保有する断片として簡単に得られるからである。Fiers
et al., Nature 273, 113(1978)参照。

【００５１】アデノウイルスE3変異体の構築アデノウイルス変異体を構築する方法は、当業界で周知である。Mittal,S.K.,
Virus Res., 1993, vol.28, 67-90参照。更に、アデノウイルス５のゲノムは、
Genbank No.M73260として登録されており、しかもこのウイルスを、American Ty
pe Culture Collection (Rockville, Maryland, USA)からNo.VR-5として入手で
きる。

【００５２】一般に、アデノウイルスベクターの構築では、標準的な方法によりプラスミド
カセット中で、そのアデノウイルスゲノム、好ましくは Ad5ゲノム内の希望の領
域を先ず除去又は修飾する。例えば、Ad5ゲノムから、Ad5のNdeI断片(塩基19549
-31089に相当する)を切り出し、適当なプラスミド、好ましくはpGEM5zf+ (Prome
ga Corporation)に挿入することができる。このプラスミドを pNBと称し、以下
の実施例でより詳細に説明する。

【００５３】続いて、pNB中に存在する、E3領域に相当するアデノウイルスDNA又はその断片
を、別のプラスミド(これもpGEM5zf+でよい)にクローン化する。例えば、 pNBか
ら、Ad5ゲノムのSpeI/NdeI断片(塩基27082-31089に相当する)を切り出し、pGEM5
zf+のマルチクローニング部位(MCS)のSpeI及びNdeI部位にクローン化する。この
ベクターを pSNと称し、適当なE3ベクター、プラスミド及びウイルスを得るため
に、その中に存在する塩基27082-31089に相当するアデノDNAを用いて、そのE3領
域中に希望する制限部位を遺伝子工学的に作成する。以下で詳細に説明する。

【００５４】アデノウイルス変異体を構築するために用いる材料及び方法が、Hanke, T., e
t al. (1990) Virology, vol.177, pages 437-444及びBett, A.J., et al. (199
3) J.Virol. vol.67, pages 5911-5921及びPCT/CA96/00375に記載されている。M
icrobix Biosystems, Inc. (341 Bering Avenue, Toronto, Ontario, Canada)が
、アデノウイルス変異体を構築するための多くの材料を販売しており、そしてそ
の作成方法に関する製品情報書を提供している。

【００５５】注目すべきことに、本発明は、アデノウイルス５型について説明しているが、
その他の類似のアデノウイルス血清型を用いることもできる。アデノウイルスの
一般的な構成は、血清型に関わらず保存されていて、特的の機能が同様に保持さ
れている。

【００５６】本文に記載するE3領域の変異を、E3領域外の変異を有するアデノウイルス変異
体に組み込むことができる。好ましくは、前記変異は、アデノウイルスゲノムの
E1b及び/又はE1a及び/又はE4orf6領域中に存在し得る。E1b変異の場合、好まし
い変異は、標準細胞に比べて、腫瘍抑制因子 p53を機能的に欠失する新生細胞中
で選択的に複製する能力を、アデノウイルスに付与するものである。この変異は
、典型的には、55kタンパク質をコードするE1B内で生じる。種々の方法でp53の
欠陥を誘導することができ、例えば、p53と相互作用するタンパク質の欠陥、す
なわちp53を機能的に不活性化するp53経路の欠陥に依る。米国特許5,677,178参
照。従って、本文中に記載したE3変異を、アデノウイルスdl 1520のE1B欠失と組
合せ得る。このウイルスは、Barker and Berk (1987) Virology 156: 107に記載
されている。

【００５７】 E1A変異の場合、好ましい変異は、標準細胞に比べて、網膜芽細胞腫の腫瘍抑
制因子遺伝子産物、すなわちp105Rbを機能的に欠失する新生細胞中で選択的に複
製する能力を、アデノウイルスに付与するものである。この不活性化変異は、典
型的には、p105Rbタンパク質との結合に関与するE1a CR1ドメイン(Ad5のアミノ
酸30-85;ヌクレオチド697-790)及び/又は CR2ドメイン(Ad5のアミノ酸120-139;
ヌクレオチド920-967)内で生じる。好ましくは、アデノウイルスゲノムの CR3ド
メイン(アミノ酸150-186)は保存され、短縮型p289Rポリペプチドとして発現され
、そしてアデノウイルス初期遺伝子のトランス活性化に関する機能を発揮する。
種々の方法で欠陥Rbを誘導することができ、例えば、Rbと相互作用するタンパク
質の欠陥、すなわちRbを機能的に不活性化するRb経路の欠陥に依る。米国特許5,
677,178参照。従って、本文中に記載したE3変異を、アデノウイルスAd5 NT dl 1
010のE1A欠失と組合せ得る。

【００５８】本発明の別の点は、異種遺伝子を、本文記載のE3変異体のE1B, E1A又はE4orf6
領域に組み込むことである。従ってこの様なウイルスは、E3内に、そして場合に
よりE1B, E1A又はE4orf6内に異種遺伝子を含有し得る。生物活性ペプチドをコー
ドするこの様な異種遺伝子又はその断片の例には、免疫調節タンパク質及びプロ
ドラッグ活性化因子(すなわちシトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ、米国
特許5,358,866及び5,677,178)をコードするものがある。前者の例は、インター
ロイキン2(米国特許4,738,927又は5,641,665)；インターロイキン7(米国特許4,9
65,195又は5,328,988)；及びインターロイキン12(米国特許5,457,038)；腫瘍壊
死因子α(米国特許4,677,063又は5,773,582)；インターフェロンγ(米国特許4,7
27,138又は4,762,791)；又はGM-CSF(米国特許5,393,870又は5,391,485)がある。
更に免疫調節タンパク質には、マクロファージ炎症性タンパク質、例えばMIP-3
(Well, T.N. and Peitsch, MC, J.Leukoc.Biol. vol.61(5), pages 545-50, 199
7参照)及び、細胞自殺又はアポトーシス誘導タンパク質、例えばBAD及びBAXがあ
る。Yang, E., et al. Cell vol.80, pages 285-291 (1995)及びSandeep, R., e
t al. Cell vol.91, pages 231-241 (1997)参照。

【００５９】前記通り、E3領域の部分又は全部、あるいはその中の選択遺伝子の部分又は全
部の欠失を容易にする新しい制限部位をE3領域内に有する組換えアデノウイルス
変異体を構築する際の最初の過程は、分子生物学の十分に確立した技術を用いて
、プラスミドカセット内で、アデノウイルスゲノム中の変異を作成することであ
る。以下の制限部位を、アデノウイルス５のE3領域中に細胞工学的に作成する：
PacI, ClaI, PmeI, SwaI, BamHI, BstBI, SspI, NheI, StuI及びEcoRV。E3領域
中のそれらの相対的な位置を図４〜７に示す。当制限部位を、決定的なスプライ
シング配列及びポリアデニル化配列を破壊しない様に配置した。更に、E3領域中
のタンパク質コード配列も考慮され、多くの場合、新しい制限部位を付加するた
めに作られた変異は、そのコード配列を変化させなかったが、アミノ酸変異が作
られた場合には、それは、性質が保存されるものであった。

【００６０】従って、E3領域内に異種遺伝子を挿入したこの様なアデノウイルスの重要な利
点、すなわち当遺伝子は、発現の時期及び程度に関して、置換された元の内在性
アデノウイルス遺伝子の場合と類似した発現パターンを示すこと、を指摘するこ
とは重要である。

【００６１】また本発明のアデノウイルスベクターでは、除去したE3領域の部分に、別の遺
伝子、好ましくはネガティブ選択遺伝子の発現を制御する組織特異的プロモータ
ーを組み込むこともできる。組織特異的プロモーターの例には、前立腺特異的抗
原のプロモーターがある。PCT/US95/14461参照。ネガティブ選択遺伝子の例には
、シトシンデアミナーゼ及びチミジンキナーゼがある。シトシンデアミナーゼに
関して、米国特許5,358,866及び5,677,178を参照すること。

【００６２】例えば、HSV tk遺伝子カセットを、E3プロモーターの直ぐ下流に作用可能に連
結することができる。多くの場合、ネガティブ選択カセットを収容するために、
アデノウイルスゲノムの必須でない部分(すなわちウイルス複製及びパッケージ
ングのための部分)を除去することが望ましい。従って、E3遺伝子領域の実質的
な部分を除去して、ネガティブ選択カセット、例えば、組織特異的プロモーター
(及びエンハンサー)又はその他の適当なプロモーター/エンハンサーに作用可能
に連結されたHSV tk遺伝子により置換することができる。あるいは、後期遺伝子
プロモーターからの転写により特徴づけられる複製表現型を有する細胞において
、ネガティブ選択遺伝子産物の効率的な発現を可能にするために、ネガティブ選
択遺伝子を、アデノウイルス後期領域プロモーターに作用可能に連結することも
できる。

【００６３】細胞内のHSV tk遺伝子の発現は、その細胞が、ネガティブ選択剤、例えばガン
シクロビル又はFIAUに露出されない限り、細胞に対して直接に毒性を示さない。
ネガティブ選択遺伝子を実質的に発現する複製表現型を有する感染細胞は、ネガ
ティブ選択剤(例えばガンシクロビル)が、選択に有効な用量で投与されない限り
、本質的に付加的な細胞毒性を発揮しないだろう。ネガティブ選択剤が投与され
た時点で、tk遺伝子を発現する感染細胞は、選択的に除去されるだろう。従って
、細胞変性殺死を促進するために、及び/又は複製表現型を有する細胞を殺死す
ることによって更なるウイルス複製を抑えるために、ネガティブ選択を利用する
ことができる。

【００６４】好ましい態様は、tk発現カセットを形成するために、ポリアデニル化部位と共
に適当なプロモーター及び/又はエンハンサーに作用可能に連結されたHSV tk遺
伝子カセット(Zjilstra et al. (1989) Nature 342:435; Mansour et al. (1988
) Nature 336:348; Johnson et al. (1989) Science 245:1234; Adair et al. (
1989) Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 86:4574; Capecchi, M. (1989) Science 244:
1288)である。このtk発現カセット(又はその他のネガティブ選択発現カセット)
を、アデノウイルスゲノム内に、例えばE3領域の実質的な欠損を置換するものと
して、挿入する。

【００６５】希望するタンパク質をコードする本発明のアデノウイルスベクターを、適当な
哺乳動物の宿主細胞を形質転換するために用いることができる。宿主細胞にポリ
ヌクレオチドを導入する任意の既知の方法に従って、形質転換することができる
。例えば、ウイルス中へポリヌクレオチドをパッケージングし、そしてそのウイ
ルスを宿主細胞に形質導入するか、又は当業界に既知のトランスフェクション法
、例えば米国特許4,399,216; 4,912,040; 4,740,461及び4,959,455に記載の方法
に依る。使用する形質転換方法は、形質転換する宿主に依る。異種ポリヌクレオ
チドを哺乳動物細胞に導入する方法は当業界に周知であり、例えばデキストラン
法、リン酸カルシウム沈降法、ポリブレン法、電気穿孔法、リポソーム封入法、
及び核内へのDNAの直接注入法がある。

【００６６】治療方法疾患、好ましくは新生物形成疾患の治療を、本発明のアデノウイルスを含有し
、且つ更にネガティブ選択遺伝子を含有する組成物を患者に投与することによっ
て行うことができる。後者の例には、シトシンデアミナーゼ及びチミジンキナー
ゼがあろう。

【００６７】種々のヒト新生物を、本発明のアデノウイルス構成体、特に当ウイルスのE3領
域が、疾患の遺伝子治療に有用なタンパク質をコードする当構成体によって治療
することができる。そのタンパク質の例には、サイトカイン、好ましくはインタ
ーロイキンがある。適当なアデノウイルスを、抗新生物活性に有効な用量で投与
することによって、例えば限定でなく、気管支原性カルシノーマ、鼻咽頭カルシ
ノーマ、喉頭カルシノーマ、小細胞及び非小細胞性肺カルシノーマ、肺アデノカ
ルシノーマ、肝臓カルシノーマ、膵臓カルシノーマ、膀胱カルシノーマ、大腸カ
ルシノーマ、乳房カルシノーマ、頚部カルシノーマ、卵巣カルシノーマ、又はリ
ンパ球性白血病を有する人間又は人間以外の哺乳動物を治療することができる。
感染性のアデノウイルス粒子の縣濁液を、種々の経路、例えば静脈内、腹腔内、
筋肉内、皮下及び局所を介して、新生物組織に適用することができる。約10³〜1
0¹²個、又はそれ以上のビリオン粒子/mlを含有するアデノウイルス縣濁液を、噴
霧吸入し(例えば気管支原性カルシノーマ、小細胞カルシノーマ、非小細胞性肺
カルシノーマ、肺アデノカルシノーマ、喉頭カルシノーマを治療するために肺経
由で供給して)、腫瘍(例えば気管支原性カルシノーマ、鼻咽頭カルシノーマ、喉
頭カルシノーマ、頚部カルシノーマ)を治療するために腫瘍部位に直接塗布し、
又は注入し(卵巣ガンを治療するために腹腔内に、肝カルシノーマ又は他の原発
巣からの肝転移を治療するために門脈内に)、あるいはその他の適当な経路で投
与し、例えば腫瘍塊に直接注射し(例えば乳ガン)、注腸し(例えば大腸ガン)又は
カテーテル注入(例えば膀胱ガン)することができる。

【００６８】更に、本発明のアデノウイルス変異体を、新生細胞を移植したnu/nuマウスに
おいて腫瘍形成又は新生細胞負荷を減弱させる能力に関して、同等の新生細胞を
移植した未処理マウスと比較することにより、評価することができる。

【００６９】本発明のE3変異ウイルスを用いたアデノウイルス治療法を、他の抗新生物治療
法、例えば通常の化学療法と組合せることができる。また、本発明のE3アデノウ
イルスベクター又はウイルスが、宿主動物内でその効果を減弱させる免疫応答を
誘起する場合、それらを、適当な免疫抑制剤と共に投与することができる。

【００７０】アデノウイルス変異体の増殖本発明のアデノウイルス変異体を、ウイルス保存液として、希望のウイルス機
能を供給することができる細胞株、必要な場合にはトランスで感染性変異体ビリ
オンの複製及び形成を支援することができる細胞株(例えば 293細胞株; ATCC #C
RL 1573, American Type Culture Collection, Rockville, MD; Graham et al.
(1977) J.Gen.Virol. 36: 59又はA549細胞)で増殖させる。

【００７１】製剤アデノウイルスE3変異体を、治療及び予防のために患者に投与するために製剤
化することができる。治療又は予防上の使用のために、医薬的に有効な用量の１
又は複数種類のアデノウイルス変異体を含有する無菌組成物を、治療のために、
例えば新生物形成症状の治療のために、人間又は人間以外の獣医学上の動物に投
与する。一般に当組成物は、約10³〜10¹⁵、又はそれ以上のアデノウイルス粒子
を水性縣濁液中に含有する。医薬上容認される担体又は賦形剤を、この様な組成
物にしばしば使用する。種々の水溶液、例えば水、緩衝化水、0.4%塩水、0.3%グ
リシンなどを使用できる。前記水溶液は無菌であり、且つ一般的には希望のアデ
ノウイルスビリオン以外の粒子物を含まない。当組成物は、適当な生理学的条件
に必要な医薬上容認される補助剤、例えばpH調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤など
、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳
酸ナトリウムなどを含み得る。アデノウイルスの細胞感染を促進する賦形剤を含
み得る。

【００７２】本発明のアデノウイルス、又はその中に含まれるDNAを、リポソーム又はイム
ノリポソーム供給法により新生細胞に供給し得る。後者の供給法は、新生細胞群
上に存在する細胞表面特性(例えば、イムノリポソーム上のイムノグロブリンと
結合する細胞表面タンパク質の存在)に基づいて、新生細胞を選択的に目標とす
るものである。典型的には、当ビリオンを含有する水性縣濁液を、リポソーム又
はイムノリポソーム中に封入する。例えば、通常の方法に従ってアデノウイルス
ビリオンをミセル内に封入して、イムノリポソームを作る(米国特許5,043,164;
4,957,735; 4,925,661; Connor and Huang (1985) J.Cell Biol. 101:582; Lasi
c DD (1992) Nature 355:279; Novel Drug Delivery (eds. Prescott LF and Ni
mmo WS: Wiley, New York, 1989); Reddy et al. (1992) J.Immunol. 148:1585)
。個体のガン細胞上に存在するガン細胞抗原(例えばCALLA, CEA)に特異的に結合
する抗体を保有するイムノリポソームを用いて、ビリオン又はビリオンDNAを、
その細胞に目的的に供給する。

【００７３】新生物形成疾患を予防又は治療するために、本発明のアデノウイルス又はその
混合液を含有する組成物を投与し得る。治療使用では、特定の新生物形成疾患に
既に羅患した患者に、その症状及びその合併症を治癒する又は少なくとも部分的
に阻止するために十分な量で当組成物を投与する。これを達成するために適する
量を、「治療上有効な用量」又は「有効量」と称する。この有効量は、症状の重
症度、患者の総状態、及び投与経路に依存する。

【００７４】予防使用では、新生物再発に対する患者の耐性を強化するため又は緩解期間を
延長するために、その時点で新生物形成疾患状態にない患者に、本発明のアデノ
ウイルス又はその混合液を含有する組成物を投与する。このための投与量を「予
防上有効な用量」と称する。この様な使用でもやはり、正確な用量は、患者の健
康状態及び総免疫レベルに依存する。

【００７５】治療担当医師が決定した投与量及び投与様式に従って、当組成物の一回又は複
数回投与を行い得る。いずれにしろ当医薬製剤により、有効に患者を治療するた
めに十分な量の本発明の抗新生物性アデノウイルスを供給する必要がある。本発明の抗新生物性アデノウイルス療法を、他の抗新生物療法、例えば通常の
化学療法と組合せ得る。

【００７６】本発明の使用前記開示から明らかに、本発明のアデノウイルスベクター/ウイルスは、遺伝
子治療などの多数の使用に供される。例えば１つの態様では、医療上有用なタン
パク質をコードする遺伝子を、本発明のビリオンのE3領域内にクローン化するこ
とができ、そのビリオンを、疾患治療のために遺伝子治療法において直接使用す
る。別の態様では、前記通り、この様なE3変異ビリオンはE1b領域に欠失を有し
、そこを希望の特性を有する遺伝子で置換することもできる。E3又はE1B領域中
の前記遺伝子は、サイトカイン、例えばインターロイキン、細胞周期調節タンパ
ク質、例えば p16若は ras、又は細胞自殺又はアポトーシスを誘導するタンパク
質、プロドラッグ活性化因子、例えばシトシンデアミナーゼ若はチミジンをコー
ドするものでよい。更に腫瘍壊死因子α、インターフェロンγ及びmip-3を用い
得る。

【００７７】免疫原又はワクチンとして有用なタンパク質を発現させるために、通常発現していない特定のタンパク質を発現させる様に細胞を形質転換するため
に、本発明のアデノウイルスベクターを用いることもできる。これらのタンパク
質を発現する細胞は、結合検査に有用な細胞膜調製品を作成するための中間体と
して有用であり、そしてそれは次に薬剤スクリーニングのために有用である。以下の実施例は、本発明の特定の態様及びその使用を説明するものであり、本
発明を限定するものではない。

【００７８】実施例１一般的な方法及び使用ベクターヒトアデノウイルスベクターの作成法及び増殖法は、当業界に周知であり、以
下の実施例で当業者により用いられる。当方法には、以下の文献に記載されたも
のがある。Cell Biology, a Laboratory Handbook, J.Celis (Ed), Academic Pr
ess, N.Y. (1996), Graham, F.L. and Prevec, L. Adenovirus based expressio
n vectors and recommbinant vaccines。Vaccines, New Approaches to Immunol
ogical Problems, R.W. Ellis (ed) Butterworth, 363-390, Graham, F.L. and
Prevec, L. Manipulation of adenovirus vectors。Methods in Molecular Biol
ogy, Vol.7, Gene Transfer and Expression Techniques, E.J. Murray and J.M
. Walker (eds) Humana Press Inc., Clifton, N.J. pp109-128, 1991。前記文
献に記載された材料及び方法を以下で用いた。

【００７９】アデノウイルスベクター： pGEM (Promega Corp.)を基にしたベクターを修飾し、そしてAd5のE3領域中の
適当な領域をクローン化、サブクローン化、及び変異誘発するために使用した。
このベクターは、E3領域中に存在する制限部位を利用し、それらを表１に示す。

【００８０】表１ Ad5中に存在する制限部位 ─────────────── NdeI 19549及び31089 SpeI 27082 EcoRI 27295及び30049 SunI 28390 EcoRV 27295 KpnI 28787 MunI 29355 NotI 29510 XhoI 29791 HpaI 30569 ───────────────

【００８１】ベクターpNBを、Ad5のNdeI断片(塩基19549〜31089)をpGEM5Zf+ (Promega Corp
.)のNdeI部位に挿入することにより作成した。更にこれを、Ad5のSpeI(27082)〜
NdeI(31089)断片をpGEM5Zfのマルチクローニング部位(MCS)中のSpeI及びNdeI部
位に挿入することによりサブクローン化した。このプラスミドをpSNとした。ウ
イルス作成を容易にするためにpNBベクターを作成した。従ってAd5のNdeI断片を
単離し、NdeIで切断したAd5 TP-DNAに連結することができる。次にこれを、図２
に示す様に細胞にトランスフェクションすることができる。この構成体は、図３
に示す通りその重複領域が長いので、相同組換えによるウイルス構成体の作成に
も適する。pSNプラスミドを作成したのは、これが、操作されるE3領域を含み、
且つpNBよりも小さいために制限部位の種類が制限されるからである。

【００８２】 pSNの場合、そのベクターpGEMを更に修飾した。なぜならそれが３つのSspI部
位(2199, 2384, 2408)を有するからである。SspIは、E3シャトルベクター中に遺
伝子工学的に作成した部位の１つである。当ベクター中のSspI部位を除くことに
より、部分制限切断が不必要になり、遺伝子をE3中のSspI部位に挿入することが
容易になる。当ベクター部位を除去するために、プラスミドpGEMをSspI及びEcoR
V(MCS中の塩基51に存在する)で切断し、そして再連結した。残念ながら、2199番
のSspI部位の除去は不十分であったので、その部位が、生成した改変ベクター中
に残存した。従って生成したベクターは、2384番のSspIから51番のEcoRVまでを
欠失している。この余分なSspI部位が存在するために、E3領域中のSspIを用いる
場合、部分的制限切断が必要であるが、これらの２つの部位間を除去することに
より適切な断片が簡単に単離される。注意することに、E3領域内の30172番にもS
spI部位が存在する。この部位は、作成したSspI部位を用いる場合に切り出され
るであろう同一領域中に位置する。従ってこの部位は切断パターンに影響せず、
問題にはならない。この改変pGEMベクターを、Ad5のSpeI/NdeI断片を挿入するた
めのベクターとして、そして次にE3領域を操作するために用いた。これをpGと表
示した。

【００８３】実施例２ E3シャトルベクターの作成前記のベクターを利用して、以下の制限部位を、アデノウイルス５のE3領域中
に作成した：PacI, ClaI, PmeI, SwaI, BamHI, BstBI, SspI, NheI, StuI及びEc
oRV。これらのE3領域中の相対的な位置を図７に示す。これらの制限部位を、決
定的なスプライシング配列及びポリアデニル化配列を故意に破壊しない様に注意
深く配置した(図１参照)。またタンパク質のコード配列も考慮され、多くの場合
コードされるアミノ酸は変化せず、変化した場合それらは保存的であった。この
様な改変を有するベクターを作成した後、シャトルベクター中のE3領域の機能を
確認するために、スプライシング、タンパク質レベル、及び機能に関して野生型
Ad5と比較した。

【００８４】作成された部位の位置から、いくつかの変異は連続的に行われる必要があった
。変異誘発のために用いた全てのオリゴヌクレオチド配列及びその正確な位置(A
d5中での位置番号)を表に示す。全ての変異を制限切断により確認し、そして全
ての構成体の配列を決定した。表２に、アデノウイルス５のE3領域に追加した制
限部位を要約している。

【００８５】表２ Ad5のE3に追加した制限部位。番号は Ad5ゲノムに基づく。 ──────────── PacI 28497 NheI 28532 PmeI 29310 BstBI 29484 StuI 29718 EcoRV* 29781 ClaI 29862 SspI 30377 BamHI** 30467 SwaI 30830 ──────────── * 10.4Kのための開始コドンが、この変異により変化した。 ** 14.7Kのための開始コドンが、この変異により変化した。

【００８６】 PacI及びClaI部位を、変異オリゴヌクレオチドPacC + PacNC及びClaC + ClaNC
を各々用いて、Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit (Clontech #K1600
-1)により取扱説明書の通りに同時に作成した。PmeI及びSwaI部位を、PmeC + Pm
eNC及びSwaC + SwaNCを各々用いて、QuickChange Site-Directed Mutagenesis K
it (Stratagene #200518)により取扱説明書の通りに別個に作成した。PmeI部位
を含有するKpnI/XhoI(天然Ad5部位)断片をPacI/ClaI保有プラスミドに挿入する
ことにより、PmeI部位をこのプラスミド中にクローン化した。HpaI/NdeI断片を
用いて、この構成体にSwaI部位を挿入した。この生成した構成体をpG-PPCSと称
し、次の変異誘発に用いた。

【００８７】 BamHI 以下の全ての変異を、忠実性の高いPfuポリメラーゼ(Staratgene)を用いたPCR
による変異誘発(Nucleic Acids Research 17:5404, 1989；米国特許4,683,195 (
Mullis et al.)及び4,683,202 (Mullis))により作成した。次に、PCRによる全て
の生成断片の配列を決定し、誤りが無いことを確認した。この方法では、２回の
連続したPCR反応を行い、最終生成物を切断して、希望のプラスミドに挿入した
。

【００８８】前記のpG-PPCSを鋳型として、１回目のPCRではオリゴヌクレオチドBamC及びSw
aNCを用いて、そして２回目のPCRではその生産物及びPmeCを用いて、BamHI部位
を作成した。この断片(２回目のPCR産物)をPmeI及びSwaIで切断し、それをpG-PP
CSに挿入した。これをpG-PPCS+Bと称した。注目すべきことに、この変異により1
4.7Kの開始コドンが変化するので、この部位に挿入された遺伝子の前成熟の開始
が抑えられ、そしてその最終的な４種類のE3シャトルベクターの内２つだけがBa
mHI部位を有する。

【００８９】 BstBI, NheI及びStuI １回目のPCRにおいてBstBC及びSwaNCを用いて、そして２回目のPCRにおいてPm
eC及び最初の生産物を用いて、BstBI部位を作成した。２回目のPCR産物をMunI及
びSwaIで切断し、それをpG-PPCSに挿入して、pG-PPBCSを得た。BamHI部位を含む
前記ベクター種を作るために、この部位を有するClaI-HpaI断片を挿入すること
により、pG-PPBCS+Bを作成した。

【００９０】別個の反応でpG-PPBCS+/-Bを鋳型として、１回目のPCRではNheC及びPmeNCを用
いて、２回目のPCRではSunC及び最初の生成物を用いて、NheI部位を作成した。
この断片をPacI及びPmeIで切断し、それを、前記の２つの構成体pG-PPBCS+/-Bに
挿入した。この構成体をpG-PNPBCS+/-Bと称した。 pG-PPBCS+/-Bを鋳型として、１回目の反応ではStuC及びSwaNCを用いて、そし
て２回目の反応ではPmeC及び最初の生産物を用いて、StuI部位を付加した。この
断片をMunI及びSwaIで切断し、それを、前記の２つの構成体(-/+BamHI)に挿入し
た。この構成体を各々pG-PPBSCS又はpG-PPBSCS+Bと称した。その２種のプラスミドをPacI及びPmeIで切断し、NheI部位を含む断片(pG-PNPB
CS由来)を、StuIを含むプラスミド(pG-PPBSCS)に挿入することにより、新しいSt
uI及びNheI部位を相互に付加した。この作業を、BamHI部位を有する又は有さな
いプラスミドで行った。生成したプラスミドを各々pG-PNPBSCS+B及びpG-PNPBSCS
と称した。

【００９１】前記のプラスミドpG-PNPBSCS及びpG-PNPBSCS+Bを鋳型として、最後の２つの変
異を作成した。１回目のPCRではSspC及びHpaNCプライマーを用いて、２回目のPC
RではNheC及び最初PCR産物を用いて、SspI部位を作成した。この断片をXhoI及び
HpaIで切断し、BamHIを含む又は含まない親のプラスミドに挿入した。１回目のPCRにおいてEcoRVC及びHpaNCプライマーを用いて、２回目のPCRにお
いてNheC及び最初PCR産物を用いて、EcoRV部位を作成した。この断片をXhoI及び
HpaIで切断し、それを前記プラスミドに挿入した。 BamHIを含む又は含まないプラスミドをPmeI及びClaIで切断し、EcoRVを含む断
片を親のプラスミドに挿入することにより、SspI及びEcoRV部位を相互に付加し
た。注目することに、EcoRV部位により10.4Kの開始コドンが変化するので、その
5'末端でClaI部位に挿入された遺伝子の前成熟の開始が抑えられる。EcoRV部位
を含む領域はまた、スプライシングに関与するので、遺伝子の挿入のために、Ec
oRV部位の代わりにClaI部位を使用する。

【００９２】これらの最終のE3シャトルベクター種を図４〜７に示す。これらを、pE3SV, p
E3SV+V, pE3SV+B及びpE3SV+V+Bと称した。これらの違いは、EcoRV及びBamHI部位
の有無である。これらのシャトルベクターを、外来遺伝子を挿入した又はAd5 E3
遺伝子を除去した以下の全プラスミドを作成するために用いる。

【００９３】希望のE3領域を変異誘発するために用いたオリゴヌクレオチドを表３に示す。表３アデノウイルス５のE3領域を変異誘発するために用いたオリゴヌクレオチド配列

【表１】全ての配列は5'から3'へ記載されている。変更した全ての塩基を下線で示す。挿
入した塩基を太字で示す。

【００９４】実施例３ウイルス作成及び調節ウイルスを作成するために最初の過程として、前記の改変したE3領域をpNBプ
ラスミド内に挿入した。このために、プラスミドpG-PPCS及びpNBをSpeIで切断し
た。pNBは２つのSpeI部位を有する。１つはAd5挿入体中に、もう１つはpGEM5のM
CS中に存在する。MCS部分及びNdeI 19549〜SpeI 27082を含有するpNB由来の断片
を、SpeIで切断したpG-PPCSプラスミド内に挿入した。挿入方向が適切なことを
確認した。生成したプラスミドをpNB-PPCSと称した。最終的なE3シャトルベクタ
ーの全種を、このプラスミド内にクローン化した。すなわちそのより小さいプラ
スミドのPacI〜SwaI領域を、より大きいpNB-PPCS内に挿入した。生成したプラス
ミドをpNB-E3SV, pNB-E3SV+V, pNB-E3SV+B及びpNB-E3SV+V+Bと表示する。図２に
示す通り、次にこれらのプラスミドを用いて、対応するアデノウイルスE3SV, E3
SV+V, E3SV+B及びE3SV+V+Bを生産した。これらを、American Type Culture Coll
ectionに寄託した。

【００９５】注目すべきことに、6.7K〜gp19Kの領域内に遺伝子を挿入するために用い得る
３種類の部位の組合せがある。それらは、PacIとPmeI、SunIとMunI、及びNheIと
PmeIである。PacI部位は、後期遺伝子産物の翻訳のために重要なｙリーダーと重
複する。この配列の破壊により、ある種の適用のためのそれの効果が欠損し得る
。悪影響が認められない場合、次にAd5中に天然に存在するSunI〜MunI部位が、
そのより大きなクローニング容量のために有用であろう。

【００９６】空のコントロールの作成コントロールのために、作成した部位を利用して、各E3遺伝子を除去した。こ
のために、当シャトルプラスミドを以下の酵素の組によって切断し、T4 DNAポリ
メラーゼにより平滑化し、そして再連結した：PacIとPmeI、SunIとMunI、NheIと
PmeI、BstBIとStuI(全てpG-E3SVにおいて)、ClaIとSwaI(pG-E3SV+Vにおいて)、C
laIとSspI(pG-E3SV+Vにおいて)、及びBamHIとSwaI(pG-E3SV+Bにおいて)。これら
を全て、ウイルス作成のためにpNBベクター内に組み込んだ。

【００９７】実施例４ CDプラスミドの作成治療上の使用に関して当シャトルベクターを試験するために、大腸菌遺伝子シ
トシンデアミナーゼ(CD)を、そのプロドラッグ性のために用いた。CDを得るため
に、ATCCから入手したプラスミドpCD2(#40999)から、以下の通りにCD遺伝子を増
幅した。注目すべきことに、CD遺伝子はNdeI制限部位を保有する。最終的なプラ
スミド内に存在するNdeI部位(Ad5中のNdeI部位19549及び31089)をこの制限酵素
で切断する予定であったので、PCR変異誘発によってCD遺伝子内のNdeI部位を除
く必要があった。この作業を、Pfuポリメラーゼを用いて、E3領域内に新しい制
限部位を作成するために用いた技法通りに行った。表３及び４に、CD遺伝子を増
幅するために用いたオリゴヌクレオチドを示す。

【００９８】要約すると、NdeI部位内の塩基ＴをＣに変えて、保存的変異を作成した。１回
目のPCR反応に用いるプライマーはCD-NdeC及びSwaCDNCであった。プラスミドpCD
2を鋳型として用いた。２回目のPCR反応では、この生産物と共に、同一の鋳型と
プライマーCD-PacCを用いた。これにより２つの目標を達成した。すなわちNdeI
部位を改変し、そして制限部位PacI及びSwaIを5'及び3'末端に各々追加した。最
終PCR産物をPacI及びSwaIで切断し、そしてシャトルベクターE3SVもPacI及びSwa
Iで切断した。これらの断片をゲルで精製し、そしてNEB T4 DNAリガーゼで連結
した。この連結混合液を用いて大腸菌XL-1を形質転換し、それを、選択のために
アンピシリン含有プレートにまき、そしてコロニーを拾い上げて培養した。その
DNAを単離し、適切な挿入及び欠失を検定するために制限切断により選別を行っ
た。適切と思われるクローンにおいて、その全CD遺伝子配列及びそのベクター内
の周辺配列を決定して、希望しない変異が生じていないことを確認した。その結
果確認された適切なクローンをpG-CDPacSwaと称し、これを用いてPCR増幅を行っ
て、他の領域に挿入するためのCD遺伝子を増幅した。注意すべきことに、このCD
遺伝子は細菌の開始コドンGTGを有する。従って、開始コドンを含む5'プライマ
ーにおいて、それを真核細胞用のコドンATGに変更した。

【００９９】当遺伝子の5'又は3'末端に希望する制限部位を組み込む適当なプライマーを設
計して、その他のCD保有ベクターを作成した。5'プライマーは常にATG開始コド
ンを有する。CD遺伝子を、以下の制限部位を用いてE3領域に挿入した：BstBI〜S
tuI、NheI〜MunI、NheI〜PmeI、PacI〜PmeI、SunI〜MunI、ClaI〜SwaI、及びBam
HI〜SwaI。これらのプラスミドを各々pG-CDBstStu、pG-CDNheMun、pG-CDNhePme
、pG-CDPacPme、pG-CDSunMun、pG-CDClaSwa、及びpG-CDBamSwaと称した。用いた
全プライマーを表３に示し、鋳型として、確認したプラスミドpG-CDPacSwaを常
に用いた。ClaI〜SwaI領域中のCD遺伝子をプラスミドE3SV+Vに挿入した。BamHI
〜SwaI領域中のCD遺伝子をプラスミドE3SV+Bに挿入した。希望しない変異が生じ
ていないこと、及びCd遺伝子が適切に挿入されたことを保証するために、全挿入
配列を決定した。

【０１００】ウイルスを作成するために、構成体pG-CDClaSwa、pG-CDPacSwa及びpG-CDBamSw
aを、PacI及びSwaIで切断し、CD遺伝子を含む断片をゲルで精製した。同時にベ
クターpNB-E3SVもPacI及びSwaIで切断し、ゲルで精製した。これらを連結し、そ
れを用いて細菌を形質転換し、そしてコロニーを選別及び選択して、次のウイル
ス作成に用いた。

【０１０１】いくつかの点が、前記のE3の挿入から形成されたウイルスから予想される。先
ず、pG-CDSunMun内で見られる様に、ｙリーダーの部分が除かれた構成体は、前
記通り感染過程に対して悪影響を及ぼすだろう。このことは、PacI部位に挿入さ
れた遺伝子にも、ｙリーダーの欠損部分は少ないが、当てはまるだろう。次の予
想として、pG-CDBstStuで見られる様に、11.6K領域への挿入により、感染性が大
きく低下するだろう。報告されている通り、11.6Kタンパク質(アデノウイルス致
死タンパク質ADP)の欠損により、その感染細胞は、野生型の感染に比べて、適当
な時点で溶解できない。この場合、その細胞は代謝し続け、細胞あたりのウイル
ス生産が増加し、そして基本的に外来遺伝子の製造工場となる。またADPは、感
染の後期相において主要後期プロモーターによって大量に合成されるので、その
領域に挿入された外来遺伝子は、同様な発現特性を示すであろう。これらのウイ
ルスを用いた結果を以下で説明する。

【０１０２】実施例５ TNFプラスミドの作成マウスの腫瘍壊死因子(mTNF)遺伝子を有するプラスミドをATCC (#63169)から
入手した。このプラスミドは、プロ配列のコード領域を含んだ完全なmTNF遺伝子
配列を保有する。PCR及びゲルによる精製を介して、このプラスミドからmTNF遺
伝子を増幅した。ベクターpG-E3SVをBstBI及びStuIで切断し、ゲルで精製した。
同時にベクターpG-E3SV+VをClaI及びSwaIで切断し、ゲルで精製した。精製したP
CR産物を、末端が適合するので、前記ベクターに挿入した。これらの構成体をpG
-mTNFBstStu及びpG-mTNFClaSwaと称した。

【０１０３】鋳型として前記ATCCプラスミドを再度用いて、PCRによりmTNFを増幅した。プ
ラスミドpG-E3SV+B及びPCR産物をBamHI及びSwaIで切断し、ゲルで精製し、そし
て互いに連結した。この構成体をpG-mTNFBamSwaと称した。全ての構成体の配列
を十分に決定して、希望しない変異が無いことを検査した。

【０１０４】実施例６ CD及びTNFウイルスの作成前記の構成体をAd5ゲノム内に挿入するために、前記の利点のために、BstLink
TP-DNAを用いた。このプラスミド構成体を実施例８で説明する。Ad5野生型TP-D
NAによる組換えウイルスに関する記載の通りに、このウイルス構成体を調製した
。全てのトランスフェクションを６cmのディッシュ上で行った。ここに記載した
量は６cmディッシュあたりの量である。

【０１０５】方法：E3-CD-PacPme (Onyx 301), E3-CD-NhePme (Onyx 302), E3-CD-SunMun (
Onyx 303), E3-CD-NheMun (Onyx 304), E3-CD-BstStu (Onyx 305)及びE3-mTNF-B
stStu (Onyx 320)を以下の通りに作成した。最初に、0.5μgのBstLink TP-DNA及
び10μgのプラスミドをEcoRI(20単位)により37℃で５時間切断した。(過剰のプ
ラスミドDNAを用いることで、トランスフェクションあたり約５μgの実際の挿入
DNAが利用できた。)この時点でTP-DNAは室温で切断し続け、一方切断されたプラ
スミドは1%アガロースゲルで電気泳動された。Qiagenのゲル精製キットを用いて
、挿入DNAをゲルで精製した。切断したTP-DNAと精製した断片とを、10単位の高
濃度T4DNAリガーゼにより16℃で一晩連結した。トランスフェクションのために
、この反応液を直接用いた。

【０１０６】ウイルスCDPacSwa, mTNFClaSwa, CDBamSwa, mTNFBamSwaを作成するために、E3
領域中でこれらの変異がEcoRI部位の外側に位置するので、異なった方法、すな
わち相同組換えを用いた。DNA及びTP-DNAの量は前記と同じである。トランスフ
ェクションのために、BstLink TP-DNAをBstBIで切断した。CDを保有するプラス
ミドをSpeI及びNdeIで切断し、そしてmTNFを保有するプラスミドをPacI及びNdeI
で切断した。これらの断片をゲルで精製し、そして水で抽出した。トランスフェ
クションのために、切断したTP-DNA及び精製した断片をそのまま用いた。

【０１０７】トランスフェクション方法：トランスフェクションのために、トランスフェク
ション当日に細胞密度が約70〜80％になる様に、前日にA549細胞を６cmディッシ
ュをまいた。この細胞にトランスフェクションするために、２つの溶液を作り、
そして混合した。溶液Ａは、連結反応液及び300μlのOptiMEM (Life Technologi
es)/６cmディッシュを含有した。溶液Ｂは、300μlのOptiMEM及び13μlのLipofe
ctamine (Life Technologies)を含有した。これらの２つの溶液を混合し、緩や
かに撹拌し、そして室温で30〜45分間インキュベーションした。このインキュベ
ーションの終了間近に、前記細胞を暖かいOptiMEMで洗浄し、また2.4mlのOptiME
Mを前記混合液に添加した。この最終混合液３mlを、洗浄した単層細胞に直接添
加し、そして37℃で５時間インキュベーションした。次に、トランスフェクショ
ン混合液を除くことなく、３mlのDME/20%FBSをディッシュに加え、最終血清濃度
を10％にした。これを37℃で一晩インキュベーションした。この細胞上に、８ml
のDME/2%FBS/1.0%アガーノーブル(Difco)を重層した。重層後５日目に、プラー
クを視覚化するために、0.3%天然紅(Life Technologies)を更に含有する重層液(
5ml)を更に重層した。

【０１０８】変異ウイルスの増殖及び確認：プラークが出現したら(トランスフェクション
後10〜20日目)、それを、滅菌パスツールピペットでアガー塊として単離した。
そのアガー塊中に存在するウイルスを増殖させるために、前日に3.5cmプレート
上にDME/10%FBS中のA549細胞をまいた。感染当日に、培地をDME/2%FBSに交換し
、そして細胞に単離したプラークを添加した。この感染による細胞変性効果(CPE
：ウイルス感染の結果、細胞が丸まり、プレートから離れる)を毎日調べた。こ
れは通常、感染後３〜５日目に生じる。全培地及び細胞を収集して、−20℃で保
存した。ウイルスの変異を検査するために、細胞及び培地混合液 200μlから、Q
iagen Blood Kitを用いて(細胞DNAと共に)ウイルスDNAを単離した。CD遺伝子又
はそのE3領域中のフランキング配列に対応するプライマーを用いたPCRによって
、精製したDNAを検査した。組換えウイルスDNAのPCRにより、適切なサイズの断
片が生じた場合、更にそのPCR断片が、CD又はmTNFに特有の制限酵素断片に切断
されること、及びそのPCR断片の配列決定により、その特性を評価した。

【０１０９】 CPEを示した3.5cmディッシュから得た前記混合液 500μlによってA549細胞のT
150を感染させることにより、適切なウイルスを増殖させた。約３日目に十分なC
PEを示すまで(75％超の細胞がフラスコ表面に接着しなくなる時まで)増殖させた
。この細胞と培地の混合液7.5mlを用いて、3Lの回転培養器中のKB細胞を感染さ
せ、そして塩化セシウム勾配法によりウイルスを単離した。感染粒子数/単位容
量を決定するために、プラーク検査を行った。

【０１１０】この時点で各ウイルスを、挿入したもの及び挿入した部位を明示する様に命名
した。各ウイルス毎に、参照を容易にするために番号を振り付け、それを括弧内
に示す。それらの名称を、E3-CD-PacPme (Onyx 301), E3-CD-NhePme (Onyx 302)
, E3-CD-SunMun (Onyx 303), E3-CD-NheMun (Onyx 304), E3-CD-BstStu (Onyx 3
05)及びE3-mTNF-BstStu (Onyx 320)とした。

【０１１１】 CD測定：シトシンデアミナーゼ(CD)活性を検査するために、Rogulski et al.
1997の記載と同様に反応を行った。簡単に述べると、感染当日に細胞密度が約70
〜80％(約２〜４x106細胞/プレート)に成る様にA549細胞を10cmプレートにまい
た。各E3-CDウイルス毎に、感染多重度(MOI)10pfu(プラーク形成単位)/細胞にて
細胞を感染させた。コントロールとしてAd5感染及び偽感染を行った。感染のた
めに、適量のウイルスを、10cmプレートあたり２mlのDME中に縣濁し、そして単
層細胞に添加した。１時間後、８mlのDME/2%FBS培地を各プレートに加えた。感
染後種々の時間(4, 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 120時間)で細胞を洗
浄し、冷PBS 1mlを加え、細胞を掻き取り、そして1.5mlエッペンドルフチューブ
にペレットとして集めた。全PBSを除き、細胞ペレットをドライアイス/エタノー
ル中で凍結し、そして−80℃で保存した。

【０１１２】 200μlの測定用緩衝液(100mM Tris/HCl pH8.0, 1mM EDTA, 1mMβメルカプトエ
タノール)を各プレートに加え、４回凍結融解を繰り返して細胞を溶解した。そ
の溶解液を４度で５分間最高速度で遠心して、透明な上清を得た。Bio-radの試
薬を用いてBradford検査によりタンパク質量を測定した。酵素測定のために、５
μg又は0.6μgの総タンパク質、及び2.5mMの[2-14C]-シトシン(1μCi; 5μl; Mo
ravek Biochemicals #MC131)、及び反応容量を10μlにするための測定用緩衝液
を用いた。37℃で１時間反応を行った。反応を停止するために、10μlの冷シト
シン/ウラシル(0.4mg/ml)を加えた。各反応液10μlを薄層クロマトグラフィープ
レート(Baker #7009-04)にスポットし、そして1-ブタノール/水(86%/14%)で平衡
化されたタンク内に置いた。この溶媒の先端が薄層プレートの上端付近まで上が
った後(約２時間)、このプレートを乾燥して、フィルムに露光した。このオート
ラジオグラムをスキャンして、図に示した像を得た。

【０１１３】マウスTNFα測定：感染のために約80％密度になる様に、A549細胞を６cmプレ
ートにまいた。前記通りMOI 10にて感染を行った。種々の時間で培地を除き、３
mlの新しいDME/2%FBSに置き換えた。これを37℃で１時間インキュベーションし
た。その後その培地１mlを抜き出し、全試料採取が終わるまで−80℃で凍結保存
した。各プレートでその培地を置き換えるので、次の時点までその最終容量は４
mlであった。培地中に分泌されたmTNFをELISA法(Biosource #KMC3012)で測定し
た。各試料毎に２回測定を行い、そして２つの感染細胞のプレートから各時間の
試料を採取した。

【０１１４】ウエスタンブロット分析：ウエスタンブロット分析のために、６cmプレート上
のA549細胞をMOI 10にて感染させた。感染後種々の時間で、前記通り細胞を掻き
集めて、収集した。細胞ペレットを−80℃で保存した。溶解用緩衝液300μlを各
試料に加え、３回凍結融解を繰り返し、そして22ゲージの針を通過させた。Brad
ford法によってタンパク質の量を測定した。総タンパク質10μgを14%SDSゲルに
添加し、電位泳動を行った。このタンパク質をPVDF転写膜に転写し、3%ドライミ
ルク/PBSによりブロッキングを行い、適当な抗体により検出を行った。そのE3タ
ンパク質に対する抗体及びpVIII(感染後期に生産されるタンパク質)に対する抗
体は、ウサギのポリクローナル抗体であった。これらを1:400に希釈して用いた
。マウスTNFに対する抗体をR and D systemsから入手し、0.1μg/mlで用いた。
適当な二次抗体を用いて、ECL系(Amersham)により映像化した。

【０１１５】細胞溶解物のウエスタンブロット分析に加えて、時間毎に採取した培地をウエ
スタンブロットで分析した。培地25μl/レーンを用い、そして前記の抗mTNF抗体
で検出した。

【０１１６】表４：CD遺伝子の増幅に用いたオリゴヌクレオチド

【表２】全ての配列は5'から3'へ記載されている。変更した全ての塩基を下線で示す。挿
入した塩基を太字で示す。

【０１１７】実施例７ CD又はmTNFのウイルスによる発現 CDを含有するウイルス：E3-CD-PacPme (Onyx 301), E3-CD-NhePme (Onyx 302)
, E3-CD-SunMun (Onyx 303), E3-CD-NheMun (Onyx 304)。これらを各々301, 302
, 303及び304と称する。ウイルス301, 302, 303及び304によりMOI 10にて細胞株
A549を感染させた。CD活性を測定するために、感染後(p.i.)指定の時間に前記通
りに試料を採取した。また各時間で、表現型の差を示すために細胞の写真を撮っ
た。

【０１１８】図８は、コントロールの偽感染細胞及びAD5感染細胞を示し、図９は、gp19K領
域に挿入されたCDを保有するウイルス、すなわちウイルス301, 302, 303及び304
を感染させた細胞を示す。野生型ウイルスの感染は標準的に進行し、感染後48時
間までにほぼ全細胞でCPEが認められる。ウイルス304は、感染後48時間で野生型
とほぼ同程度のCPEを示し、一方ウイルス303は少し弱い感染を示す。他の２つの
ウイルス301及び302は中間の表現型を示す。興味深いことに、303は、SunI部位
でCD置換されたものであり、予想通り、おそらくｙリーダーの部分的欠失、後期
メッセージへの付加の廃止、そしておそらく翻訳効率の低下のために、その感染
は野生型に比べて遅い。301の場合大部分の、302の場合全部のｙリーダーがぞの
まま保存されているので、ウイルス301及び302は、Ad5に比べて少し遅いだけで
ある。

【０１１９】実験から、本発明のE3ウイルス構成体中に挿入された異種遺伝子の発現時間は
、置換元の内在性ウイルス遺伝子の場合と類似することが分かる。ウイルス301,
302, 303及び304は、gp19Kを置換したものである。図10に示す通り、ウエスタ
ンブロット分析から、gp19Kの合成は、感染後４〜８時間に始まる。この時間は
、公表されている時間と類似する。ウエスタンブロット分析では、感染後48時間
にこの合成は明白である。また図10に示される通り、CDウイルスは、gp19K遺伝
子を欠失しているので、予想どおりそれを合成することはない。

【０１２０】 CD合成の発現時間が、gp19K合成と類似するかどうか見るために、活性測定に
よりCDタンパク質を分析した。前記通りにCD測定を行った。このタンパク質は非
常に安定なので、この測定は、ウエスタンブロットほど鋭敏ではない。従ってCD
活性を測定するために、反応において２種類の量の総タンパク質を用いて２種類
の測定を行った。CDが最初に発現される時点を調べるために、反応あたり５μg
の総タンパク質を用いた。この結果を図11に示す。gp19Kの場合と同様に、ウイ
ルス301〜304においてCD活性は、感染後８時間ほどの早さで認められる。このこ
とから、内在性遺伝子の発現時間と、挿入されたCD遺伝子の発現時間とが類似す
ることが確認される。

【０１２１】各時点で合成されるCDタンパク質の量を調べるために、反応あたり0.6μgの総
タンパク質を用いた。この結果を図12に示す。ウイルス間の比較を行うために不
完全な基質変換を起こさせるために、より少量のタンパク質を用いた。図12に示
す通り、301, 302及び304により同程度の量のCDが合成される。一方303では、約
24時間で全基質の転換が認められ、これは比較的により多量のCDが存在すること
を意味する。従って、このウイルスはおそらく他のウイルスよりも多量のCDを生
産すると結論された。

【０１２２】 ADPのCD及びmTNFへの置換：E3のアデノウイルス致死タンパク質(ADP)遺伝子を
、前記通りCD又はmTNFで置換した。ADP欠失ウイルスは、野生型との比較から期
待される時点で、感染細胞を溶解しないことが知られている。従ってこの遺伝子
は、ウイルスの放出において重要であると考えられる。この領域を他の遺伝子に
置換した本発明のウイルスは、ADP欠失ウイルスと同様の表現型を示す。これを
図13及び14に示す。野生型ウイルスの感染が完全なCPEを示す感染後72時間で、
ウイルス305(CD挿入)及び320(mTNF挿入)はかなり割合のCPEを示す。この感染は
、感染後96時間まで完全なCPEに至らない(図14)。毎24時間毎に培地交換をする
と、細胞は接着し続け、感染後120時間でもほぼ正常の表現型を示す。感染後164
時間(7日間)までは、細胞は典型的なCPEを示さず、しかもディッシュから剥離し
ない。この観察は重要であり、そして治療上有意であろう。なぜなら感染細胞が
即座に溶解しない場合でも、その細胞は、注目の異種遺伝子を発現し続けるから
である。

【０１２３】 ADPは、主要後期プロモーターから合成される後期タンパク質であり、後期相
において、すなわちDNA複製後に高レベルで発現される。挿入された外来遺伝子
が同様の発現様式を示すかどうか決定するために、305においてCD測定を行い、3
20においてmTNFの分析を行った。図11に示す通り、305は、後期相に入った後で
ある感染後期12時間までCD活性を示さない。図11で、gp19K領域、すなわち初期
領域中に存在するCDに比べて、これは対照的である。明らかに、タンパク質合成
の発現時期に差が認められる。

【０１２４】 CD活性量を比較するために、0.6μgの総タンパク質を用いてCD測定を行った。
視覚的な判断により図12(実験を同時に行った)との比較から、305は、301〜304
ほどには合成を行っていない。しかし305感染細胞では感染経過が遅いことに注
意すべきである。

【０１２５】感染が後期相であることを確認するために、後期構造タンパク質pVIII及びADP
(11.6K)に対する抗体を用いて、細胞溶解物に対してウエスタンブロット分析を
行った。感染後24時間で、Ad5及び320において11.6K及びpVIIIの発現が認められ
た。このことは、ウイルスが12〜24時間で後期相に入ったことを示す。また予想
通り、その遺伝子を保有しないので、305はADPを生産しないことが認められる。

【０１２６】 ADPの代わりに挿入されたCDは、ADPと同様な発現時間を示す。同様な観察が、
ADPの代わりにmTNFが挿入されたOnyx320において為された。簡単に述べると、細
胞を感染させ、感染後種々の時間で溶解液を調製した。この溶解液に対してウエ
スタンブロット分析を行った。コントロールとして偽感染及びAd5感染細胞を用
いた。感染後24時間まで、細胞内のmTNF発現は観察されなかった。このことは、
アデノウイルスの内在性遺伝子を置換した外来遺伝子は同様な発現様式を示すと
いう本発明者の以前の発見と一致する。

【０１２７】実施例８ BstLinkウイルス/TP-DNAの作成最初により小さなプラスミドへのクローニング、次により大きなpNBを基にし
たベクターへの挿入が関与するので、選択した遺伝子の挿入は広範な過程から成
る。これは、ほぼ常に、より小さなpSNを基にしたプラスミドに比べて、より大
きなpNBプラスミド中に多数の制限部位が存在するためである。本発明のウイル
スにより、クローニングがより簡単になる。なぜならそれにより、希望しない断
片から分離することがしばしば困難である部分切断した断片を単離する必要がな
く、しかもより小さなプラスミドを用いることで、DNA収量がより高くなるから
である。しかし、相同組換えに必要な重複配列の量が制限されるので、ウイルス
作成のための共トランスフェクションにそれらを用いることは難しい。例えば、
標準的にEcoRIでTP-DNAを切断する場合、5'末端では240塩基対が重複するだけで
ある。

【０１２８】従って重複領域を増すために、BstLinkと呼ばれるウイルスを以下の通りに作
成した。その選択の有利性から、pG-Bst→Stuと称される空のコントロールを用
いた。これは11.6K致死遺伝子を欠失するので、かなり小さなプラークになる。
従って、11.6K遺伝子(又は別の致死遺伝子)を含有するべき組換えウイルスのプ
ラークを選択する場合、野生型(小さいプラーク)と組換え体(より大きなプラー
ク)との表現型の差異により、組換え体の選択がより明白になる。このプラスミ
ドをMunIで切断し、T4 DNAポリメラーゼで平滑化し、そしてBstBIリンカーを連
結付加した。この制限部位は、Ad5ゲノムの他のどの部分にも存在しないので、
選択された。この作業の目的は、この構成体(11.6Kを有せず、且つ追加のBstBI
部位を有するE3領域)をウイルス(任意の背景のもの)内に作成し、そのウイルス
からTP-DNAを調製し、そしてウイルス作成のためにこれを用いることである。こ
れによって5'末端の相同部位が2273塩基対に増加する。小さなプラスミドから大
きなプラスミドにプラスミドを更に作成する必要がないので、時間が節約される
だろう。また組換えウイルスは、表現型の差に基づいて容易に選択される。しか
しそのプラークを変異に関して選択しなければならないが、適切なウイルスクロ
ーンの割合はより高くなると予想される。

【０１２９】特許請求の範囲及びその意図から逸脱することなく、当業者が本発明に対して
改変及び修飾をなし得ることは自明であろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、５型アデノウイルスのE3領域の転写単位の地図である。分断された矢
印は、mRNAのスプライシング構造を示す(四角又は黒塗り線はエキソンを、破線
はイントロンを示す)。矢印の太さは、相対的な量を示す。矢印上の斜線横棒はE
3タンパク質を示し、それらの名称は分子量に基づく。

【図２】図２は、pNB及びAd5 TP-DNAを用いた組換えウイルスの作成を示す(m.u.は地図
単位を意味する)。

【図３】図３は、pSN及びAd5 TP-DNAを用いた組換えウイルスの作成を示す。

【図４】図４は、アデノウイルスE3SVのE3領域の制限地図を示す。

【図５】図５は、アデノウイルスE3SV+VのE3領域の制限地図を示す。

【図６】図６は、アデノウイルスE3SV+BのE3領域の制限地図を示す。

【図７】図７は、アデノウイルスE3SV+V+BのE3領域の制限地図を示す。

【図８】図８は、偽感染又はAd5感染させたA549細胞を示す。

【図９】図９は、ウイルス301, 302, 303及び304を感染させたA549細胞を示す。

【図１０】図10は、ウイルス301, 302, 303及び304を感染させた細胞から、感染後種々の
時間で調製した細胞溶解物中のgp19kのウエスタンブロット分析を示す。

【図１１】図11は、ウイルス301, 302, 303, 304及び305を感染させた細胞から、感染後
種々の時間で調製した細胞溶解物におけるCD測定を示す。

【図１２】図12は、ウイルス301, 302, 303, 304及び305を感染させた細胞から、感染後
種々の時間で調製した細胞溶解物において、0.6μg/反応を用いた場合のCD測定
を示す。

【図１３】図13は、感染後種々の時間におけるウイルス305及び320による細胞変性効果を
示す。

【図１４】図14は、感染後ある時間で培地交換を行った、又は行わなかった場合の細胞に
おけるウイルス320の細胞変性効果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｐ 35/00 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｎ 1/15 Ａ６１Ｋ 37/02 1/19 37/24 1/21 37/66 Ｈ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ジョンソン，レイサアメリカ合衆国，カリフォルニア 94549，ラファイエット，フランシスドライブ 574

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 E3領域の部分又は全部、あるいはその中の選択遺伝子の部分
又は全部の欠失を容易にする制限部位をE3領域内に有する組換えアデノウイルス
ベクターを含んで成る組成物。
【請求項２】前記組換えアデノウイルスベクターが、E3領域内の6.7k及び
gp19kタンパク質をコードする初期領域遺伝子中に制限部位を有する、請求項１
に記載の組成物。
【請求項３】前記組換えアデノウイルスベクターが、E3領域内の10.4k、1
4.5k及び14.7kタンパク質をコードする初期領域遺伝子中に制限部位を有する、
請求項１に記載の組成物。
【請求項４】 E3領域の部分又は全部、あるいはその中の選択遺伝子の部分
又は全部の欠失を容易にする制限部位をE3領域内に有する組換えアデノウイルス
を含んで成る組成物。
【請求項５】 E3領域の部分又は全部、あるいはその中の6.7k及びgp19kタ
ンパク質をコードする選択遺伝子の部分又は全部の欠失を容易にする制限部位を
E3領域内に有する組換えアデノウイルスを含んで成る組成物。
【請求項６】 E3領域の部分又は全部、あるいはその中の10.4k、14.5k及び
14.7kタンパク質をコードする選択遺伝子の部分又は全部の欠失を容易にする制
限部位をE3領域内に有する組換えアデノウイルスを含んで成る組成物。
【請求項７】 pE3SV, pE3SV+V, pE3SV+B及びpE3SV+V+Bから成る群中から選
択されるアデノウイルスベクターを含んで成る組成物。
【請求項８】 E3SV, E3SV+V, E3SV+B及びE3SV+V+Bから成る群中から選択さ
れるアデノウイルスを含んで成る組成物。
【請求項９】除去されたE3領域の部分又は全部が、場合により組織特異的
プロモーターに作用可能に連結された異種タンパク質をコードする遺伝子によっ
て置換された、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】前記アデノウイルスベクターのE1A又はE1b領域が更に欠失
している、ただしそのE1b領域が55kタンパク質をコードする、請求項１に記載の
組成物。
【請求項１１】欠失した前記E1b又はE1A領域が、異種タンパク質をコード
する遺伝子によって置換された、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】前記異種タンパク質が、腫瘍壊死因子α、インターフェロ
ンγ、インターロイキン、細胞自殺タンパク質、及びmip-3から成る群中から選
択される、請求項９又は11に記載の組成物。
【請求項１３】前記異種タンパク質がネガティブ選択遺伝子である、請求
項９に記載の組成物。
【請求項１４】前記ネガティブ選択遺伝子が、シトシンデアミナーゼ及び
チミジンキナーゼから成る群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】請求項７に記載のアデノウイルスベクターを保有する細胞
。
【請求項１６】請求項８に記載のアデノウイルスを保有する細胞。
【請求項１７】哺乳動物のガンを治療する方法であって、前記異種タンパ
ク質が抗ガン活性を有する請求項９又は１１に記載の組成物の治療上有効な量を
、当治療を必要とする哺乳動物に投与することを含んで成る前記方法。
【請求項１８】前記異種タンパク質が、腫瘍壊死因子α、インターフェロ
ンγ、インターロイキン、細胞自殺タンパク質、及びmip-3から成る群中から選
択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】前記組成物と共に化学療法剤又は免疫抑制剤を投与するこ
とを更に含んで成る、請求項１８に記載の方法。