ES2281081T3 - Uso de inmunomoduladores para elaborar medicamentos para inhibir respuestas inmunitarias contra virus recombinantes coadministrados. - Google Patents

Abstract

SE PROPORCIONA UN METODO PARA REDUCIR LA RESPUESTA INMUNITARIA DURANTE EL TRATAMIENTO GENETICO QUE CONSISTE EN LA CO-ADMINISTRACION DEL VECTOR VIRICO PORTADOR DE UN TRANSGEN TERAPEUTICO Y UN MODULADOR INMUNITARIO SELECCIONADO CAPAZ DE INHIBIR LA FORMACION DE ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES Y/O LA ELIMINACION POR CTL DE LOS VECTORES TRAS LA ADMINISTRACION REPETIDA.

Description

Uso de inmunomoduladores para elaborar medicamentos para inhibir respuestas inmunitarias contra virus recombinantes coadministrados.

La presente invención estuvo apoyada por las Concesiones del National Institutes of Health Nº DK 47757-02 y AI 34412-02. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en esta invención.

Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a la terapia génica y, más específicamente, al uso de inmunomoduladores y virus recombinantes coadministrados para la fabricación de medicamentos en los que el inmunomodulador inhibe la respuesta inmunitaria contra el virus recombinante.

Antecedentes de la invención

Los adenovirus recombinantes han surgido como vehículos atractivos para la transferencia génica in vivo a una amplia variedad de tipos celulares. Los vectores de primera generación, que se hacen defectuosos para la replicación mediante agotamiento de los genes tempranos inmediatos EIa y EIb, son capaces de transferencia génica in vivo altamente eficaz en células diana que no se dividen [M. Kay y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:2353-2357 (1994); S. Ishibashi y otros, J. Clin. Invest., 92:883-893 (1993); B. Quantin y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584 (1992); M. Rosenfeld y otros, Cell, 68:143 (1992); R. Simon y otros, Hum. Gene Thera., 4:771 (1993); Rosenfeld y otros, Science, 252:431-434 (1991); Stratford-Perricaudet y otros, Hum. Gene Ther., 1:241-256 (1990)].

Las respuestas inmunitarias del receptor al vector viral, el transgén soportado por el vector y las células infectadas con virus han surgido como problema recurrente en la aplicación inicial de esta tecnología a animales y seres humanos [Yang y otros, J. Virol., 69:2004-2015 (1995) (Yang I)]. Virtualmente en todos los modelos, incluyendo la terapia génica dirigida al pulmón y dirigida al hígado, la expresión del transgén es transitoria y está asociada con el desarrollo de patología en el sitio de transferencia génica.

La naturaleza transitoria de la expresión transgénica a partir de adenovirus recombinantes se debe, en parte, al desarrollo de respuestas inmunitarias celulares específicas para antígeno a las células infectadas con virus y su eliminación subsiguiente por el huésped. Específicamente, los vectores de primera generación, aunque sometidos a deleción en la región EIa del vector, expresan proteínas virales además del transgén. Estas proteínas virales activan linfocitos T citotóxicos (CTL) [Y. Dai y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 1401-1405 (1995); Y. Yang y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4407-4411 (1994) (Yang II); y Y. Yang y otros, Immunity, 1:433-442 (1994) (Yang III)]. La colaboración de CTLs dirigidos contra proteínas virales recientemente sintetizadas y células cooperadoras T específicas para virus [Zabner y otros, Cell, 75:207-216 (1993); Crystal y otros, Nat. Genet., 8:42-51 (1994)] conduce a la destrucción de las células infectadas con virus.

Otra diana antigénica para la depuración mediada inmunitariamente de células infectadas viralmente puede ser el producto del transgén cuando ese transgén expresa una proteína que es extraña para el huésped tratado. Los CTLs son así un efector importante en la destrucción de células diana, produciéndose la activación en algunos casos en el contexto del producto transgénico o de las proteínas sintetizadas viralmente, ambos de los cuales son presentados por moléculas del MHC clase I [Yang I y Zsengeller y otros, Hum. Gene Thera., 6:457-467 (1995)]. También se ha apuntado que estas respuestas inmunitarias provocan la presencia de hepatitis asociada que se desarrolla en receptores de terapia génica dirigida al hígado in vivo dentro de 2-3 semanas desde el tratamiento inicial.

Otra limitación de los adenovirus recombinates para la terapia génica ha sido la dificultad para obtener transferencia génica detectable durante una segunda administración de virus. Esta limitación es particularmente problemática en el tratamiento de trastornos hereditarios o enfermedades crónicas monogénicos, tales como fibrosis quística (CF), que requerirán terapias repetidas para obtener una reconstitución genética a largo plazo. La transferencia génica disminuida después de una segunda terapia se ha demostrado en una amplia variedad de modelos animales después del aporte intravenoso o intratraqueal de virus [T. Smith y otros, Gene Thera., 5:397 (1993); S. Yei y otros, Gene Thera., 1:192-200 (1994); K. Kozarsky y otros, J. Biol. Chem., 269:13695 (1994)]. En cualquier caso, la resistencia a la terapia génica repetida se asoció con el desarrollo de anticuerpos antiadenovirus neutralizantes, que frustraba la transferencia génica satisfactoria después de una segunda administración de virus.

Soluciones potenciales para estos problemas se han dirigido al desarrollo de virus recombinantes de segunda generación [Y. Yang y otros, Nat. Genet., 7:362-369 (1994) (Yang IV) y J. Engelhardt y otros, Hum. Gene Thera., 5:1217 (1994)] diseñados para disminuir la expresión de proteínas virales recientemente sintetizadas, y al uso de transgenes inmunogénicos, para prevenir la activación de CTLs. WO 92/19266 (US Gov't/Schlom) describe un antígeno carcinoembrionario (CEA)/virus vacunal recombinante u otro vector viral que provoque una respuesta inmunitaria humoral y/o mediada por células frente al CEA cuando se usa in vivo. También se describe administrar el vector viral con ciclofosfamida. WO 96/12030 (Rhone-Poulenc Rorer, Lee y Perricaudet) proporciona la inclusión de un gen adenoviral específico, gpl9k, en un constructo de adenovirus para proporcionar un efecto protector sobre una célula infectada por el constructo viral. WO 96/12406 (Genetic Therapy, Inc., Trapnell) proporciona un método de tratamiento que implica la administración de un adenovirus y un inmunosupresor seleccionado de entre anticuerpos anti-CD4, inmunoglobulina de CTLA4 y algunos inmunosupresores no específicos; interrumpir el transcurso de la administración y repetir la administración del agente inmunosupresor y el vector adenoviral. Además, proporciona la readministración de un adenovirus recombinante en presencia de un inmunomodulador.

Así, sigue existiendo una necesidad en la técnica de mejorar la eficacia de la transferencia génica durante administraciones repetidas de terapia génica viral.

Sumario de la invención

La presente invención utiliza un inmunomodulador y un vector viral recombinante para la fabricación de un medicamento que da como resultado una respuesta inmunitaria reducida al vector viral recombinante usado para efectuar la terapia. La invención implica coadministrar con el vector viral de la terapia génica un inmunomodulador seleccionado, que reduce substancialmente la presencia de respuestas de anticuerpos neutralizantes dirigidas contra los antígenos codificados por el vector y/o la eliminación de células T citolíticas de las células que contienen proteína viral. La invención es particularmente útil cuando se desea la readministración del virus recombinante. De acuerdo con la invención, el modulador inmunitario puede administrarse antes o simultáneamente con el vector viral recombinante que tiene el transgén que ha de aportarse.

Sin embargo, cuando el virus recombinante es un adenovirus, la readmisión del adenovirus en presencia de un inmunomodulador se rechaza en vista de la descripción de WO 96/12406 mencionada anteriormente, que se publicó después de la fecha de presentación del presente caso.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención se describen adicionalmente en la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la misma.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1A es una gráfica que resume la concentración de anticuerpos neutralizantes presente en muestras de fluido de lavado broncoalveolar (BAL) de ratones C57BL-6 infectados con adenovirus el día 0 y sometidos a necropsia el día 28, según se describe en el Ejemplo 2. El control representa ratones normales ("control"); CD4 mAB representa ratones agotados en células CD4+; IL-12 representa ratones tratados con IL-12 los días 0 y +1 e IFN-\gamma representa ratones tratados con IFN-\gamma los días 0 y +1. Los datos se presentan como la media \pm 1 desviación estándar para tres experimentos independientes.

La Fig. 1B es una gráfica que resume las cantidades relativas (DO_{405}) de IgG presentes en muestras de BAL. Los símbolos son como se describen en la Fig. 1A.

La Fig. 1C es una gráfica que resume las cantidades relativas (DO_{405}) de IgA presentes en muestras de BAL. Los símbolos son como se describen en la Fig. 1A.

La Fig. 2 es una gráfica que resume concentración de anticuerpo neutralizante, expresada como dilución recíproca de muestras de suero para los animales del Ejemplo 4. Los símbolos que representan los ratones se describen como sigue: ratones C57BL-6 infectados con H5.010CMVlacZ el día 0 y con H5.010CBALP el día 28 ("ratones B6"); ratones C57BL-6 infectados con H5.010CMVlacZ inactivado con UV el día 0 y con H5.010CBALP el día 28 ("ratones B6-UV"); ratones deficientes en MHC clase II infectados con H5.010CMVlacZ el día 0 y con H5.010CBALP el día 28 ("ratones clase II"); ratones deficientes en microglobulina B2 infectados con H5.010CMVlacZ el día 0 y con H5.010CBALP el día 28 ("ratones \beta2m^{-}"); y ratones C57BL/6 tratados con mAb GK1.5 (anti-CD4) e infectados con H5.010CMVlacZ el día 0 y con H5.010CBALP el día 28 ("ratones CD4Ab").

La Fig. 3A es una gráfica que resume concentración de anticuerpo neutralizante, expresada como dilución recíproca de muestras de suero para ratones C57BL/6 infundidos en la vena de la cola el día 0 con H5.010CMVLDLR y el día 21 con H5.010CMVLacZ y el día 42 con H5.010CBALP, y a los que se ha administrado solución salina los días -3, 0 y 3. La concentración se presenta como una función de los días después de la infección.

La Fig. 3B es una gráfica similar al de la Fig. 3A para ratones C57BL/6 infundidos en la vena de la cola el día 0 con H5.010CMVLDLR y el día 21 con H5.010CMVLacZ y el día 42 con H5.010CBALP, y a los que se ha administrado mAb anti-CD4 GK1.5 los días -3, 0 y 3.

La Fig. 3C es una gráfica similar a la de la Fig. 3A para ratones C57BL/6 infundidos en la vena de la cola el día 21 con H5.010CMVLacZ y el día 42 con H5.010CBALP, y a los que se ha administrado mAb anti-CD4 GK1.5 los días -3, 0 y 3.

La Fig. 4A es una gráfica que resume las cantidades relativas (DO_{405}) de IgGI presentes en muestras de suero como una función de diluciones de muestra, según se describe en el Ejemplo 6.

La Fig. 4B es una gráfica que resume las cantidades relativas (DO_{405}) de IgG2a presentes en las muestras de suero como una función de diluciones de muestra, según se describe en el Ejemplo 6.

La Fig. 5 es una gráfica que ilustra el porcentaje de lisis específica sobre células C57SV infectadas simuladamente ("simuladas") e infectadas con H5.010CBALP ("ALP") como una función de las relaciones de efector a diana para un ensayo de liberación de ^{51}Cr del Ejemplo 6B. Esplenocitos de ratones C57BL/6 ("B6") y ratones C57BL/6 tratados con IL-12 ("B6+IL12") 10 días después de la administración de H5.010CBALP se reestimularon in vitro con H5.010CMVlacZ durante 5 días.

La Fig. 6 es un diagrama de barras que proporciona los anticuerpos neutralizantes para Ad5 obtenidos en el BAL (experimento pulmonar) del Ejemplo 7. Los resultados de la columna son de ratones C57BL/6 (control), los resultados de la columna 2 son de ratones con inactivación total de la expresión ("knockout") deficientes en CD40L (CD40L-KO) y los resultados de la columna 3 son de ratones C57BL/6 tratados con anticuerpo para CD40L (CD40L Ab). Los datos se presentan como la concentración de anticuerpo neutralizante media de tres muestras +/- 1 D.E.

La Fig. 6B es un diagrama de barras como el descrito en la Fig. 6A, con datos obtenidos de suero para el experimento hepático del Ejemplo 7.

La Fig. 7A es una gráfica de líneas que compara el porcentaje de lisis específica en linfocitos recogidos de ratones C57BL/6 de control (círculos abiertos) y ratones C57BL/6 tratados con anticuerpo para CD40L (círculos rellenos). Siete días después de la administración de virus, los linfocitos se reestimularon in vitro durante 5 días y se probaron con respecto a la lisis específica sobre células C57SV infectadas simuladamente en un ensayo de liberación de ^{51}Cr de 6 horas. El porcentaje de lisis específica se expresa como una función de diferentes relaciones de efector a diana (6:1, 12:1, 25:1 y 50:1). Se usaron esplenocitos para este experimento pulmonar.

La Fig. 7B es una gráfica de líneas como la descrita en la Fig. 7A, usando células C57SV infectadas con virus.

La Fig. 7C es una gráfica de líneas como la descrita en la Fig. 7A, usando células infectadas simuladamente. Se usaron células de los nódulos linfáticos mediastinales (MLN) para estos experimentos hepáticos.

La Fig. 7D es una gráfica de líneas como la descrita en la Fig. 7A, usando células infectadas con virus. Se usaron células de MLN para estos experimentos hepáticos.

Descripción detallada de la invención

La presente invención utiliza un inmunomodulador para la fabricación de un medicamento para mejorar la capacidad de un animal o un ser humano para tolerar la administración de vectores virales de terapia génica. La invención proporciona un medicamento para prevenir transitoriamente la activación de células T CD4^{+} que están implicadas en las barreras inmunitarias tanto celulares como humorales a la terapia génica. La invención implica administrar a un individuo que recibe un vector de terapia génica una cantidad adecuada de un inmunomodulador, preferiblemente de acción corta. El inmunomodulador se administra preferiblemente simultáneamente con la administración del vector de terapia génica, es decir, un virus recombinante, usado para aportar un transgén terapéutico deseado para la terapia génica. El inmunomodulador también puede administrarse antes o después de la administración del vector, con tal de que cuando el vector recombinante sea un adenovirus dicho uso se caracterice además porque el adenovirus se readministra en ausencia de un inmunomodulador. La readministración del adenovirus en presencia de un inmunomodulador se rechaza en vista de la descripción de WO 96/12406, según se menciona anteriormente.

La invención, que evita el desarrollo de respuestas inmunitarias celulares y humorales adversas a vectores virales de terapia génica, se basa en la inmunosupresión para bloquear la activación de células cooperadoras T, específicamente la función CD4, y células B. En contraste con la técnica anterior, que implicaba la inmunosupresión crónica mediante administración continua de fármacos inmunosupresores no específicos, la presente invención usa un sistema transitorio para la inmunosupresión. Sin querer limitarse por una teoría, los inventores tienen la hipótesis de que el estímulo primario para la inmunoactivación son las proteínas de la cápsida viral procedentes del vector recombinante. La inmunosupresión crónica no es necesaria en tal escenario. Específicamente, la supresión transitoria de la función CD4 en o cerca del momento de la administración del virus recombinante de acuerdo con esta invención evita la formación de anticuerpo neutralizante, permitiendo de ese modo una transferencia génica eficaz después de al menos dos administraciones subsiguientes de vectores virales de terapia génica.

Según se ilustra posteriormente, la administración de inmunomoduladores de acuerdo con la presente invención se efectúa preferiblemente solo en el momento de la administración del virus. Sin embargo, puede ser necesaria una inmunomodulación más prolongada que la necesaria en los siguientes ejemplos de transferencia génica a hígado y/o pulmón de ratón, dependiendo de la manera en la que los antígenos se presenten en diferentes protocolos de terapia génica. Así, la inmunomodulación transitoria de la invención puede, en ciertas circunstancias, combinarse con inmunosupresión u otras terapias inmunomoduladoras a largo plazo.

I. Inmunomoduladores

El inmunomodulador seleccionado se define aquí como un agente capaz de inhibir la formación mediante células B activadas de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra el vector viral recombinante y/o capaces de inhibir la eliminación de linfocitos T citolíticos (CTL) del vector. El inmunomodulador puede seleccionarse para interferir con las interacciones entre los subgrupos de cooperadores T (T_{H1} o T_{H2}) y las células B para inhibir la formación de anticuerpos neutralizantes. Alternativamente, el inmunomodulador puede seleccionarse para inhibir la interacción entre células T_{H1} y CTLs para reducir la presencia de eliminación de CTL del vector. Más específicamente, el inmunomodulador deseablemente interfiere con o bloquea la función de las células T CD4.

Los inmunomoduladores para el uso para inhibir la formación de anticuerpos neutralizantes de acuerdo con esta invención pueden seleccionarse basándose en la determinación de los subtipos de inmunoglobulina de cualquier anticuerpo neutralizante producido en respuesta al vector viral. El anticuerpo neutralizante que se desarrolla en respuesta a la administración de un vector viral de terapia génica frecuentemente se basa en la identidad del virus, la identidad del transgén, qué vehículos se están usando para aportar el vector y/o la localización o el tipo de tejido diana para el aporte del vector viral.

Por ejemplo, las células T_{H2} generalmente son responsables de interferir con la transferencia eficaz de genes administrados durante la terapia génica. Esto es particularmente cierto cuando el vector viral se basa en adenovirus. Más particularmente, los inventores han determinado que los anticuerpos neutralizantes de los subtipos IgG_{1} e IgA, que dependen de la interacción entre células T_{H2} y células B, parecen ser la causa primaria de anticuerpos neutralizantes principales contra vectores adenovirales.

La identidad del anticuerpo neutralizante inducido administrando un vector viral recombinante de terapia génica específico se determina fácilmente en experimentos en animales. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 6. Por ejemplo, la administración de vectores adenovirales a través de los pulmones generalmente induce la producción de anticuerpo neutralizante IgA, mientras que la administración de vectores adenovirales a través de la sangre generalmente induce anticuerpo neutralizante IgG_{1}. En estos casos, una respuesta inmunitaria dependiente de T_{H2} interfiere con la transferencia del vector viral basado en adenovirus que soporta un transgén terapéutico.

Cuando el anticuerpo neutralizante inducido mediante administración de vector viral es un anticuerpo mediado por T_{H2}, tal como IgA o IgG_{1}, el inmunomodulador seleccionado deseablemente suprime o evita la interacción de células T_{H2} con células B. Alternativamente, se encuentra que si el anticuerpo neutralizante inducido es un anticuerpo mediado por T_{H1}, tal como IgG_{2A}, el inmunomodulador deseablemente suprime o evita la interacción de células T_{H1} con células B. Cuando se desea la reducción de la eliminación de CTL de los vectores virales así como el bloqueo de la formación de anticuerpos neutralizantes, el inmunomodulador se selecciona por su capacidad para suprimir o bloquear células T_{H1} CD4^{+} para permitir la permanencia prolongada del vector viral in vitro.

Los inmunomoduladores pueden comprender proteínas solubles o presentes en la naturaleza, incluyendo citoquinas y anticuerpos monoclonaes. Los inmunomoduladores pueden comprender otros productos farmacéuticos. Además, los inmunomoduladores de acuerdo con la invención pueden usarse solos o en combinación entre sí. Por ejemplo, pueden coadministrarse ciclofosfamida y el inmunomodulador más específico anticuerpo monoclonal anti-CD4. En tal caso, la ciclofosfamida sirve como un agente para bloquear la activación de T_{H1} y para estabilizar la expresión transgénica más allá del período de inmunobloqueo transitorio inducido por tratamiento con MAb anti-CD4.

Una cantidad o dosificación adecuada del inmunomodulador seleccionado dependerá principalmente de la identidad del modulador, la cantidad del vector recombinante que soporta el transgén que se administra inicialmente al paciente y el método y/o la zona de aporte del vector. Estos factores pueden ser evaluados empíricamente por un experto en la técnica usando los procedimientos descritos aquí. Otros factores secundarios, tales como el estado que se trata, la edad, el peso, la salud general y el estado inmunitario del paciente, también pueden ser considerados por un médico al determinar la dosificación de inmunomodulador que ha de administrarse a un paciente junto con un vector de terapia génica de acuerdo con esta invención.

Generalmente, por ejemplo, una dosis humana terapéuticamente eficaz de un inmunomodulador proteínico, por ejemplo, IL-12 o IFN-\gamma, se administra en el intervalo de aproximadamente 0,5 \mug a aproximadamente 5 mg por aproximadamente 1 x 10^{7} pfu/ml de vector viral. Diversas dosificaciones pueden ser determinadas por un experto en la técnica para equilibrar el beneficio terapéutico frente a cualesquiera efectos secundarios adversos.

A. Anticuerpos Monoclonales y Proteínas Solubles

Preferiblemente, inhibir una respuesta inmunitaria adversa al vector de terapia génica de acuerdo con la invención implica la inactivación no específica de células CD4^{+}, por ejemplo, administrando un anticuerpo monoclonal apropiado. Preferiblemente, tales anticuerpos bloqueadores se "humanizan" para evitar que el receptor monte una respuesta inmunitaria al anticuerpo bloqueador. Un "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo que tiene sus regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) y/u otras porciones de sus regiones estructurales de dominios variables ligeros y/o pesados derivadas de una inmunoglobulina de donante no humano, derivándose las restantes partes derivadas de inmunoglobulina de la molécula de una o más inmunoglobulinas humanas. Tales anticuerpos también pueden incluir anticuerpos caracterizados por una cadena pesada humanizada asociada con una cadena ligera no modificada donante o aceptora o una cadena ligera quimérica, o viceversa. Tal "humanización" puede efectuarse mediante métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, G.E. Mark y E. A. Padlan, "Chap. 4. Humanization of Monoclonal Antibodies", The Handbook of Experimental Pharmacology, vol. 113, Springer-Verlag, Nueva York (1994), pp. 105-133, que se incorpora aquí mediante referencia.

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Otros anticuerpos adecuados incluyen los que inhiben o agotan específicamente células CD4^{+}, tales como un anticuerpo dirigido contra CD4 de la superficie celular. Ha sido observado por los inventores que el agotamiento de células CD4^{+} inhibe la eliminación por CTL del vector viral. Tales agentes moduladores incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti-células T, tales como anti-OKT3+ [véanse, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.658.019, la Solicitud de Patente Europea Nº 501.233, publicada el 2 de septiembre de 1992]. Véase el Ejemplo 2 posterior, que emplea el anticuerpo disponible comercialmente GK1.5 (Nº de Registro del ATCC TIB207) para agotar células CD4^{+}.

Alternativamente, cualquier agente que interfiera con o bloquee las interacciones necesarias para la activación de células B por células T_{H}, y así la producción de anticuerpos neutralizantes, es útil como un inmunomodulador de acuerdo con los métodos de esta invención. Por ejemplo, la activación de células B por células T requiere que se produzcan ciertas interacciones [F. H. Durie y otros, Immunol. Today, 15(9):406-410 (1994)], tales como la unión del ligando de CD40 sobre la célula cooperadora T al antígeno CD40 sobre la célula B, y la unión de los ligandos de CD28 y/o CTLA4 sobre la célula T al antígeno B7 sobre la célula B. Sin ambas interacciones, la célula B no puede activarse para inducir la producción del anticuerpo neutralizante.

La interacción ligando de CD40 (CD40L)-CD40 es un punto deseable para bloquear la respuesta inmunitaria a vectores de terapia génica debido a su amplia actividad tanto en la activación como en la función de células cooperadoras T así como la ausencia de redundancia en su ruta de señalización. Un método actualmente preferido de la presente invención implica así bloquear transitoriamente la interacción de CD40L con CD40 en el momento de la administración del vector adenoviral. Esto puede efectuarse tratando con un agente que bloquea el ligando de CD40 sobre la célula T_{H} e interfiere con la unión normal del ligando de CD40 sobre la célula cooperadora T con el antígeno CD40 sobre la célula B. Bloquear la interacción CD40L-CD40 evita la activación de las células cooperadoras T que contribuye a problemas con la estabilidad y la readministración del transgén.

Así, un anticuerpo para el ligando de CD40 (anti-CD40L) [disponible de Bristol-Myers Squibb Co; véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente Europea 555.880, publicada el 28 de agosto de 1993] o una molécula de CD40 soluble puede ser un inmunomodulador seleccionado de acuerdo con la invención.

Alternativamente, un agente que bloquea los ligandos de CD28 y/o CTLA4 presentes sobre células cooperadoras T interfiere con la unión normal de esos ligandos con el antígeno B7 sobre la célula B. Así, una forma soluble de B7 o un anticuerpo para CD28 o CTLA4, por ejemplo, CTLA4-Ig [disponible de Bristol-Myers Squibb Co; véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente Europea 606,217, publicada el 20 de julio de 1994] puede ser el inmunomodulador seleccionado de acuerdo con la invención. La invención tiene mayores ventajas que la administración de citoquinas descrita posteriormente para evitar la activación de T_{H2}, debido a que se dirige a respuestas inmunitarias tanto celulares como humorales a antígenos extraños.

B. Citoquinas

Además, pueden emplearse en la invención otros inmunomoduladores que inhiben la función de células T_{H}.

Así, en una modalidad, un inmunomodulador para usar en la invención que inhibe selectivamente la función del subgrupo T_{H1} de células cooperadoras T CD4^{+} puede administrarse en el momento de la administración primaria del vector viral. Uno de tales inmunomoduladores es la interleuquina-4 (IL-4). La IL-4 potencia la actividad específica para antígeno de células T_{H2} a expensas de la función de células T_{H1} [véase, por ejemplo, Yokota y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83:5894-5898 (1986); Patente de Estados Unidos Nº 5.017.691]. Se prevé que otros inmunomoduladores que puedan inhibir la función de células T_{H1} también serán útiles en la invención.

En otra modalidad, el inmunomodulador puede ser una citoquina que previene la activación del subgrupo T_{H2} de células cooperadoras T. El éxito de esta modalidad depende de la contribución relativa que los isotipos de Ig dependientes de T_{H2} realicen en la neutralización del virus, cuyo perfil puede estar afectado por la cepa, la especie de animal así como del modo de aporte de virus y el órgano diana.

Un inmunomodulador deseable para usar en la invención que inhibe selectivamente la función T_{H2} del subgrupo de células T CD4^{+} en el momento de la administración primaria del vector viral incluye interleuquina-12 (IL-12). La IL-12 potencia la actividad específica para antígeno de células T_{H1} a expensas de la función de células T_{H2} [véanse, por ejemplo, la Solicitud de Patente Europea Nº 441.900; P. Scott, Science, 260:496-497 (1993); R. Manetti y otros, J. Exp. Med., 177:1199 (1993); A. D'Andrea y otros, J. Exp. Med., 176:1387 (1992)]. La IL-12 para el uso en la invención está preferiblemente en forma proteínica. IL-12 humana puede producirse recombinantemente usando técnicas conocidas o puede obtenerse comercialmente. Alternativamente, puede tratarse mediante ingeniería en un vector viral (que opcionalmente puede ser el mismo que el usado para expresar el transgén) y expresarse en una célula diana in vivo o ex vivo.

La supresión específica de T_{H2} con IL-12 es particularmente eficaz en terapias génicas dirigidaa al pulmón en las que IgA es la fuente principal de anticuerpo neutralizante. En terapia génica dirigida al hígado, las células tanto T_{H1} como T_{H2} contribuyen a la producción de anticuerpos específicos para el virus. Sin embargo, la cantidad total de anticuerpo neutralizante puede disminuirse con IL-12.

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Otro inmunomodulador seleccionado que realiza una función similar es el interferón gamma (IFN-\gamma) [S. C. Morris y otros, J. Immunol., 152:1047-1056 (1994); F. P. Heinzel y otros, J. Exp. Med., 177:1505 (1993)]. Se cree que el IFN-\gamma media en muchos de los efectos biológicos de IL-12 a través de la secreción de macrófagos activados en células cooperadoras T. El IFN-\gamma también inhibe parcialmente la activación estimulada por IL-4 de T_{H2}. El IFN-\gamma también puede obtenerse a partir de una variedad de fuentes comerciales.

Alternativamente, puede tratarse mediante ingeniería en un vector viral y expresarse en una célula diana in vivo o ex vivo usando técnicas de ingeniería genética conocidas.

Preferiblemente, tales inmunomoduladores de citoquina están en la forma de proteínas recombinantes humanas. Estas proteínas pueden producirse mediante métodos existentes en la técnica. Péptidos, fragmentos, subunidades o análogos activos de los inmunomoduladores conocidos descritos aquí, tales como IL-12 o interferón gamma, que comparten la función inhibidora de T_{H2} de estas proteínas, también serán útiles en este método cuando los anticuerpos neutralizantes estén mediados por T_{H2}.

Según se ilustra en los ejemplos siguientes, se muestra que las citoquinas IL-12 (que activa células T_{H1} para secretar IFN-\gamma) e IFN-\gamma suprimen la inmunidad humoral solamente (es decir, inhiben la diferenciación de T_{H2}). La coadministración de cualquier citoquina en el momento de la instilación del virus evitaba la formación de IgA y permitía una readministración eficaz de virus.

Para permitir una segunda administración eficaz del virus en terapia génica dirigida al hígado, el método puede comprender preferiblemente la administración de más de una citoquina, regímenes de dosificación específicos y/o la coadministración de un inmunomodulador adicional, tal como uno o más de los anticuerpos analizados anteriormente. El uso de citoquinas es ventajoso debido a que las citoquinas son productos naturales y así no es probable que generen respuestas inmunitarias adversas en el paciente al que se administran.

C. Otros Productos Farmacéuticos

Otros inmunomoduladores o agentes que inhiben no específicamente la función inmunitaria, es decir, ciclosporpina A o ciclofosfamida, también pueden usarse en los métodos de la invención. Por ejemplo, se ha demostrado que un tratamiento corto de ciclofosfamida interrumpe satisfactoriamente la activación de células cooperadoras T tanto CD4 como CD8 hacia la proteína de la cápsida del adenovirus en el momento del aporte del virus al hígado. Como resultado, la expresión transgénica se prolongaba y, a dosis superiores, se evitaba la formación de anticuerpo neutralizante, permitiendo la readministración satisfactoria de vector. En el pulmón, la ciclofosfamida evitaba la formación de anticuerpos neutralizantes en todas las dosis y estabilizaba la expresión transgénica en una dosis alta.

II. Vectores Virales

Vectores virales adecuados útiles en terapia génica son bien conocidos, incluyendo retrovirus, virus vacunales, poxvirus, adenovirus y virus adenoasociados, entre otros. Se anticipa que el método de esta invención es útil con cualquier virus que forme la base de un vector de terapia génica. Sin embargo, vectores virales ejemplares para el uso en los métodos de la invención son vectores de adenovirus [véanse, por ejemplo, M. S. Horwitz y otros, "Adenoviridae and Their Replication", Virology, segunda edición, pp. 1712, ed. B. N. Fields y otros, Raven Press Ltd., Nueva York (1990); M. Rosenfeld y otros, Cell, 68:143-155 (1992); J. F. Engelhardt y otros, Human Genet. Ther., 4:759-769 (1993); Yang IV; J. Wilson, Nature, 365:691-692 (octubre de 1993); B. J. Carter, en "Handbook of Parvoviruses", ed. P. Tijsser, CRC Press, pp. 155-168 (1990).

Particularmente deseables son adenovirus (Ad) tipo C humano, incluyendo serotipos Ad2 y Ad5, que se han hecho defectuosos con respecto a la replicación para la terapia génica sometiendo a deleción el locus génico temprano que codifica EIa y EIb. Se ha publicado mucho sobre el uso de adenovirus sometidos a deleción en E1 en la terapia génica. Véase Kozarsky y J. M. Wilson, Curr. Opin. Genet. Dev., 3:499-503 (1993). Las secuencias de DNA de un número de tipos de adenovirus están disponibles de Genbank, incluyendo el tipo Ad5 [Nº de Registro de Genbank M73260]. Las secuencias del adenovirus pueden obtenerse de cualquier tipo de adenovirus conocido, incluyendo los 41 tipos humanos actualmente identificados [Horwitz y otros, Virology, 2ª ed., B. N. Fields, Raven Press, Ltd., Nueva York (1990)]. Una variedad de cepas de adenovirus está disponible en the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, o están disponibles a petición de una variedad de fuentes comerciales e institucionales. En la siguiente modalidad, se usa por comodidad un adenovirus tipo 5 (Ad5).

No se anticipa que la selección del virus útil para tratar por ingeniería los vectores recombinantes, incluyendo tipo viral, por ejemplo adenovirus, y la cepa limiten la siguiente invención.

De forma similar, la selección del transgén contenido dentro de vector viral no es una limitación de esta invención. Se anticipa que este método es útil con cualquier transgén. Transgenes adecuados para el aporte a un paciente en un vector viral para terapia génica pueden ser seleccionados por los expertos en la técnica. Estas secuencias de ácido nucleico terapéuticas típicamente codifican productos para administración y expresión en un paciente in vivo o ex vivo para reemplazar o corregir un defecto genético heredado o no heredado o tratar un trastorno o enfermedad epigenéticos. Tales genes terapéuticos que son deseables para la realización de la terapia génica incluyen, sin limitación, un gen de receptor de lipoproteína de muy baja densidad (VLDL-R) para el tratamiento de la hipercolesterolemia familiar o la hiperlipidemia combinada familiar, el gen regulador de transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) para el tratamiento de la fibrosis quística, el alelo de Becker de la DMD para el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne, y un número de otros genes que pueden seleccionarse fácilmente por un experto en la técnica para tratar un trastorno o una enfermedad particulares. Así, no se considera que la selección del transgén sea una limitación de esta invención, ya que tal selección está dentro del conocimiento de los expertos en la técnica.

El vector viral que soporta un gen terapéutico puede administrarse a un paciente, preferiblemente suspendido en una solución biológicamente compatible o un vehículo de aporte farmacéuticamente aceptable. Un vehículo adecuado incluye solución salina estéril. Otras soluciones para inyección estériles isotónicas acuosas y no acuosas y suspensiones estériles acuosas y no acuosas conocidas por ser portadores farmacéuticamente aceptables y bien conocidas por los expertos en la técnica pueden emplearse para este propósito.

El vector viral se administra en cantidades suficientes para transfectar las células deseadas y proporcionar niveles suficientes de transducción y expresión del transgén seleccionado para proporcionar un beneficio terapéutico sin efectos adversos excesivos o con efectos fisiológicos médicamente aceptables que pueden ser determinados por los expertos en las técnicas médicas. Rutas de administración convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen aporte directo al órgano, el tejido o la zona diana, rutas de administración intranasales, intravenosas, intramusculares, subcutáneas, intradérmicas, orales y otras parenterales. Si se desea, las rutas de administración pueden combinarse.

Las dosificaciones del vector viral dependerán principalmente de factores tales como el estado que se trata, el gen seleccionado, la edad, el peso y la salud del paciente, y así pueden variar entre pacientes. Por ejemplo, una dosificación terapéuticamente eficaz para ser humano de los vectores virales está generalmente en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 ml de solución salina que contiene concentraciones de aproximadamente 1 x 10^{7} a 1 x 10^{10} pfu/ml de virus. Una dosificación preferida para ser humano adulto es aproximadamente 20 ml de solución salina a las concentraciones anteriores. La dosificación se ajustará para equilibrar el efecto terapéutico frente a cualesquiera efectos secundarios. Los niveles de expresión del gen seleccionado pueden verificarse para determinar la selección, el ajuste o la frecuencia de administración de la dosificación.

III. Administración del Medicamento de la Invención

La invención implica la coadministración del inmunomodulador seleccionado con el vector viral recombinante seleccionado. La coadministración se produce de modo que el inmunomodulador y el vector se administren dentro de una proximidad temporal estrecha entre sí. Actualmente se prefiere administrar el modulador simultáneamente con, o no mucho más tarde de uno a tres días antes de, la administración del vector. El inmunomodulador puede administrarse separadamente del vector recombinante o, si se desea, puede administrarse mezclado con el vector recombinante.

Según se ilustra mediante los ejemplos posteriores, el inmunomodulador, ya sea un anticuerpo anti-CD40L, un anticuerpo anti-CD4 o una citoquina, se administra deseablemente en una proximidad temporal estrecha con la administración del vector viral usado para la terapia génica. Particularmente, la administración de IL-12 o IFN-\gamma provoca la reducción en niveles de células T_{H2} durante aproximadamente 2-3 días. Por lo tanto, IL-12 y/o IFN-\gamma se administran deseablemente a menos de un día de la administración del vector viral que soporta el gen que ha de aportarse. Preferiblemente, sin embargo, la IL-12 y/o el IFN-\gamma se administran de forma esencialmente simultánea con el vector viral.

El inmunomodulador puede administrarse en un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina. Por ejemplo, cuando se formula separadamente del vector viral, el inmunomodulador se suspende deseablemente en solución salina. Tal solución puede contener componentes convencionales, por ejemplo ajustadores del pH, conservantes y similares. Tales componentes son conocidos y pueden ser seleccionados fácilmente por un experto en la técnica.

Alternativamente, el inmunomodulador puede administrarse él mismo como DNA, bien separadamente del vector o bien mezclado con el vector recombinante que soporta el transgén. Existen métodos en la técnica para la preparación farmacéutica del modulador como proteína o como DNA [véase, por ejemplo, J. Cohen, Science, 259:1691-1692 (1993) que se refiere a vacunas de DNA]. Deseablemente, el inmunomodulador se administra mediante la misma ruta que el vector recombinante.

El inmunomodulador puede formularse directamente en la composición que contiene el vector viral administrada al paciente. Alternativamente, el inmunomodulador puede administrarse separadamente, preferiblemente poco antes o después de la administración del vector viral. En otra alternativa, una composición que contiene un inmunomodulador, tal como IL-12, puede administrarse separadamente de una composición que contiene un segundo inmunomodulador, tal como anticuerpo anti-CD40L, etc., dependiendo del número de inmunomoduladores administrados. Estas administraciones pueden ser independientemente antes de, simultáneamente con o después de la administración del vector viral.

La administración del inmunomodulador seleccionado puede repetirse durante el tratamiento con el vector viral recombinante que soporta el transgén durante el período de tiempo en el que se expresa el transgén (según se verifica mediante ensayos que detectan la expresión del transgén o su efecto pretendido) o con cada refuerzo del vector recombinante. Alternativamente, cada reinyección del mismo vector viral puede emplear un inmunomodulador diferente. Sin embargo, cuando el virus recombinante es un adenovirus, su uso se caracteriza además porque el adenovirus se readministra en ausencia de un inmunomodulador. La readministración del adenovirus en presencia de un inmunomodulador se rechaza en vista de la descripción de WO 96/12406, según se menciona anteriormente.

Una ventaja de la invención es que representa una manipulación transitoria, necesaria solo en el momento de la administración del vector de terapia génica. Se anticipa que esta estrategia es más segura que estrategias basadas en la inhibición de tolerancia, que pueden deteriorar permanentemente la capacidad del receptor para responder a infecciones virales.

Por otra parte, se anticipa que el uso preferido de inmunomoduladores tales como las citoquinas o los anticuerpos mencionados anteriormente es más seguro que el uso de agentes tales como ciclosporina o ciclofosfamida (que provocan inmunosupresión generalizada) debido a que la inmunomodulación transitoria es selectiva (es decir, se retienen respuestas mediadas por CTL, como también respuestas humorales dependientes de la función T_{H1}).

En un ejemplo de transferencia génica eficaz de acuerdo con la invención, los inmunomoduladores seleccionados son IL-12, que provoca la inducción selectiva de células T_{H1}, y/o IFN-\gamma, que suprime la inducción de células T_{H2}. Otro inmunomodulador preferido es el anticuerpo anti-CD4^{+}, GK1.5, que agota las células T_{H1} y reduce la eliminación por CTL del vector. Otro inmunomodulador preferido más es el anticuerpo monoclonal anti-ligando de CD40, MR1, disponible de the American Type Culture Collection, Rockville, MD.

Según se ejemplifica posteriormente, el uso de los inmunomoduladores definidos anteriormente permitía una transferencia génica eficaz, así como el uso repetido del mismo vector viral, junto con la terapia génica que utilizaba un vector de adenovirus que contenía bien un transgén de fosfatasa alcalina ("ALP"), bien un transgén de beta-galactosidasa ("lacZ") o bien un transgén de receptor de lipoproteína de baja densidad ("LDLR").

Los siguientes ejemplos ilustran métodos preferidos para preparar vectores virales adecuados útiles en la terapia génica de acuerdo con la invención. Estos ejemplos son solo ilustrativos y no limitan el alcance de la invención.

Ejemplo 1 Construcción y Purificación de Vectores de Adenovirus Recombinantes Ejemplares

El adenovirus recombinante H5.010CMV/lacZ se construyó como sigue. Se usó el plásmido pAd.CMVlac [descrito en Kozarsky y otros, J. Biol. Chem., 269(18):13695-13702 (1994)], que contiene unidades de mapeo de adenovirus 0-1, seguido por un potenciador/promotor de citomegalovirus [Boshart y otros, Cell, 41:521-530 (1985)], un gen de beta-galactosidasa de E. coli (lacZ), una señal de poliadenilación (pA), 5 unidades de mapeo de adenovirus 9.2-16 (Ad 9.2-16) y secuencias plasmídicas genéricas incluyendo un origen de replicación y un gen de resistencia a ampicilina. Se linealizó pAd.CMVlacZ con NheI y se cotransfectó en células 293 [ATCC CRL 1573] con DNA de sub360 (derivado de adenovirus tipo 5) que se había digerido con XbaI y ClaI según se describe previamente [K. F. Kozarsky, Somatic Cell Mol. Genet., 19:449-458 (1993) y Kozarsky (1994), citado anteriormente]. El virus recombinante resultante, H5.010CMVlacZ, contiene unidades de mapeo de adenovirus 0-1, seguido por un potenciador/promotor de CMV, un gen lacZ, una señal de poliadenilación (PA), unidades de mapeo de adenovirus 9.2-100, con una pequeña deleción en el gen E3 en las unidades de mapeo 78,5 a 84,3 desde la cadena principal de sub360 de Ad 5. El adenovirus recombinante H5.010CBALP contiene las unidades de mapeo de adenovirus 0-1, seguido por un promotor de \beta-actina citoplásmico de conejo potenciado con CMV [T. A. Kost y otros, Nucl. Acids Res., 11 (23):8287 (1983)], un gen de ALP placentario humano, una señal de poliadenilación (pA) y unidades de mapeo 9-100 de adenovirus tipo 5, con una pequeña deleción en el gen E3 en las unidades de mapeo 78,5 a 84,3 en la cadena principal de sub360 de Ad 5. Este adenovirus recombinante se construyó de forma substancialmente similar al adenovirus H5.010CMVlacZ descrito anteriormente. Véase, además, Kozarsky (1994), citado anteriormente.

Estos adenovirus recombinantes H5.010CMVlacZ y H5.010CBALP se aislaron después de la transfección [Graham, Virol., 52:456-467 (1974)] y se sometieron a dos rondas de purificación por calvas. Los lisados se purificaron en dos gradientes de densidad de cloruro de cesio secuenciales según se describe previamente [Englehardt y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:11192-11196 (1991)]. El cloruro de cesio se retiró haciendo pasar el virus sobre columnas de filtración en gel BioRad DG10 usando solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Para experimentos en ratones, el virus se usó bien reciente o bien después de la purificación en columna, se añadió glicerol hasta una concentración final de 10% (v/v) y el virus se almacenó a -70ºC hasta el uso.

Ejemplo 2 Potenciación de la Transferencia Génica Mediada por Adenovirus Durante la Segunda Administración Mediante IL-12 e IFN-\gamma en Pulmón de Ratón

Los adenovirus recombinantes H5.010CMVlacZ y H5.010CBALP se usaron en este ejemplo. Cada virus expresa un transgén informador diferente cuya expresión puede discriminarse de la del primer transgén informador.

\newpage

Ratones C57BL/6 hembra (6-8 semanas de edad) se infectaron con suspensiones de H5.010CBALP (1 x 10^{9} puf en 50 \mul de PBS) a través de la tráquea el día 0 y de forma similar con H5.010CMVlacZ el día 28. Un grupo de tales ratones se usó como un control. Otro grupo de ratones se agotó agudamente de células CD4^{+} mediante inyección i.p. de anticuerpo para células CD4^{+} (GK 1.5; Nº del ATCC TIB207, dilución 1:10 de ascitis) en el momento de la terapia génica inicial (días -3, 0 y +3). Un tercer grupo de ratones fue inyectado con IL-12 (inyecciones intratraqueales de 1 \mug o i.p. de 2 \mug) en el momento de la primera administración de virus (días 0 y +1). Un cuarto grupo de ratones fue inyectado con interferón gamma (inyecciones intratraqueales de 1 \mug o i.p. de 2 \mug) en el momento de la primera administración de virus (días 0 y +1).

Cuando los ratones subsiguientemente se sometían a eutanasia y necropsia los días 3, 28 ó 31, los tejidos pulmonares se prepararon para criosecciones, mientras que el lavado alveolar bronquial (BAL) y los nódulos linfáticos mediastinales (MLN) se recogían para los ensayos inmunológicos.

A. Criosecciones

Los tejidos pulmonares se evaluaron con respecto a la expresión de ALP el día 3 y el día 28 mediante tinción histoquímica después de los procedimientos de Yang I, citados anteriormente. La expresión de \beta-galactosidasa se ensayó el día 31 mediante tinción histoquímica de X-gal. Los resultados descritos posteriormente se obtuvieron a partir de las tinciones histoquímicas para fosfatasa alcalina (100 aumentos) o tinciones con X-gal para \beta-galactosidasa (100 aumentos).

La instilación de virus ALP (10^{9} pfu) en las vías respiratorias de todos los grupos de los ratones C57BL/5 daba como resultado una expresión de transgén de alto nivel en la mayoría de las vías respiratorias conductoras que disminuía hasta niveles indetectables cerca del día 28. Se mostraba que la pérdida de expresión del transgén se debía a la eliminación mediada por CTL de los hepatocitos genéticamente modificados [Yang I, citado anteriormente]. En los ratones de control, no se detectó expresión génica recombinante tres días después de la segunda administración de virus, es decir, el día 31.

La administración de virus a los animales agotados en CD4^{+} se asoció con la expresión de transgén recombinante de alto nivel que era estable durante un mes. La expresión del segundo virus era detectable el día 31. Así, el agotamiento de las células CD4^{+} permite eficazmente la readministración del vector sin eliminación por CTL inmediata.

La transferencia génica de alto nivel inicial disminuía después de aproximadamente un mes en los ratones tratados con IL-12. Sin embargo, en contraste con el control, la transferencia génica de alto nivel a células epiteliales de las vías respiratorias se alcanzaba cuando el virus se readministraba a animales tratados con IL-12 el día 28, como se observa en los resultados del día 31.

Los animales tratados con interferón gamma eran virtualmente indistinguibles de los animales tratados con IL-12 ya que la transferencia génica eficaz se conseguía durante una segunda administración de virus.

Así, el uso de estas citoquinas como inmunomoduladores permitía la administración repetida del vector sin su eliminación inmediata por el anticuerpo neutralizante. En otros experimentos, células T_{H2} no se inhibían a expensas de la activación de T_{H1} incrementada. En ratones tratados con el virus ALP parenteralmente e IL-12 i.p., la IL-12 no incrementaba la actividad de CTL específica para adenovirus según se muestra mediante ensayos de liberación de cromo. De forma más importante, el tratamiento de los animales con IL-12 en el momento de la instilación intratraqueal de virus no potenciaba la inflamación ni disminuía la persistencia del transgén después de una segunda administración de virus.

B. Ensayos Inmunológicos - MLN

Linfocitos procedentes de MLN del grupo de control y el grupo tratado con IL-12 de ratones C57BL/6 se recogieron 28 días después de la administración de H5.010CBALP y se reestimularon in vitro con H5.010CMVlacZ inactivado con UV a 10 partículas/célula durante 24 horas. Sobrenadantes libres de células se ensayaron con respecto a la presencia de IL-2 o IL-4 sobre células HT-2 (una línea celular dependiente de IL-2 o IL-4) [Yang I, citado anteriormente]. La presencia de IFN-\gamma en el mismo sobrenadante de cultivo de linfocitos se midió sobre células L929 según se describe [Yang I, citado anteriormente]. El índice de estimulación (I.E.) se calculó dividiendo cpm de ^{3}H-timidina incorporados en células HT-2 cultivadas en sobrenadantes de linfocitos reestimulados con virus por cpm de ^{3}H-timidina incorporados en células HT-2 cultivadas en sobrenadantes de linfocitos incubados en medio libre de antígeno.

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Los resultados se muestran en la Tabla I posterior.

TABLA I

1

La estimulación de linfocitos procedentes de nódulos linfáticos regionales con ambos adenovirus recombinantes conducía a la secreción de citoquinas específicas para la activación de los subgrupos tanto T_{H1} (es decir, IL-2 e IFN-\gamma) como T_{H2} (es decir, IL-4) de células cooperadoras T (Tabla I).

El análisis de linfocitos procedentes de los animales tratados con IL-12 estimulados in vitro con virus revelaba una secreción incrementada de IL-2 e IFN-\gamma con relación a la producción de IL-4, en comparación con animales que no recibían IL-12 (es decir, la relación de IL-2/IL-4 se incrementaba de 3 a 6 cuando se usaba IL-12; Tabla I).

C. Ensayos Inmunológicos -BAL

Muestras de BAL obtenidas en animales 28 días después de la exposición primaria a virus recombinantes se evaluaron con respecto a anticuerpos neutralizantes para adenovirus e isotipos de anticuerpo anti-adenovirus como sigue. Los mismos cuatro grupos de ratones C57BL/6, es decir, control, agotados en CD4^{+}, tratados con IL-12 y tratados con IFN-\gamma, se infectaron con H5.010CBALP. El anticuerpo neutralizante se midió en muestras de BAL diluidas en serie (100 \mul) que se mezclaron con H5.010CBlacZ (1 x 10^{6} pfu en 20 \mul), se incubaron durante 1 hora a 37ºC y se aplicaron a células Hela confluentes al 80% en placas de 96 pocillos (2 x 10^{4} células por pocillo).

Después de 60 minutos de incubación a 37ºC, 100 \mul de DMEM que contenía FBS al 20% se añadieron a cada pocillo. Las células se fijaron y se tiñeron con respecto a la expresión de \beta-galactosidasa al día siguiente.

Todas las células eran positivas a lacZ en ausencia de anticuerpos antiadenovirales.

Se determinó el isotipo de anticuerpo específico para adenovirus en BAL usando un ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA). Brevemente, placas de 96 pocillos se revistieron con 10 \mul de PBS que contenían 5 x 10^{9} partículas de H5.010CBlacZ durante 18 horas a 4ºC. Los pocillos se lavaron 5 veces con PBS. Después de bloquear con 200 \mul de BSA al 2% en PBS, las placas se enjuagaron una vez con PBS y se incubaron con muestras de BAL diluidas 1:10 durante 90 minutos a 4ºC. Posteriormente, los pocillos se lavaron intensivamente y se rellenaron con 100 \mul de anti-(IgG o IgA de ratón) conjugada a ALP (Sigma) diluida 1:1000. Las placas se incubaron, subsiguientemente se lavaron 5 veces y se añadieron a cada pocillo 100 \mul de la solución de substrato (fosfato de p-nitrofenilo, PNPP). La conversión del substrato se detuvo mediante la adición de 50 \mul de EDTA 0,1 M y las reacciones se leyeron a
405 nm.

Los resultados se muestran gráficamente en las Figs. 1A a 1C, que resumen la concentración de anticuerpo neutralizante y las cantidades relativas (DO_{405}) de IgG e IgA presentes en muestras de BAL. La concentración de anticuerpo neutralizante para cada muestra se presentó como la dilución más alta con la que se teñía de azul menos de 50% de las células.

Según se demuestra en la primera barra de las Figs. 1A a 1C, las citoquinas identificadas en la Tabla I anterior se asociaron en los ratones de control con la aparición de anticuerpos para proteínas de adenovirus en BAL o de los isotipos tanto IgG como IgA que eran capaces de neutralizar el vector recombinante Ad5 humano en un ensayo in vitro hasta una dilución 1:800.

Según se muestra en la segunda barra de las gráficas de las Figs. 1A a 1C, el agotamiento de células CD4^{+} transitorio inhibía la formación de anticuerpo neutralizante (Fig. 1A) y anticuerpo IgA específico para el virus (Fig. 1C) en 80 veces, permitiendo de ese modo que se produjera la transferencia génica eficaz después de una segunda administración de virus. La Fig. 1 mostraba también una ligera inhibición de IgG.

Según se muestra en la tercera barra de las tres gráficas, la IL-12 bloqueaba selectivamente la secreción de IgA específica de antígeno (Fig. 1C) sin influir significativamente en la formación de IgG (Fig. 1B). Esto era simultáneo con una reducción de 20 veces en el anticuerpo neutralizante específico para virus (Fig. 1A).

Los animales tratados con interferón gamma (cuarta barra de las Figs. 1A y 1B) eran virtualmente indistinguibles de los animales tratados con IL-12 ya que la IgA específica para el virus (Fig. 1C) y el anticuerpo neutralizante (Fig. 1A) se disminuían en comparación con los animales de control no tratados con citoquina, pero no hasta la extensión obtenida con los tratados con IL-12.

Estos estudios demuestran que la administración de inmunomoduladores seleccionados a receptores de vectores virales recombinantes de terapia génica en o aproximadamente en el momento de la exposición primaria al vector puede evitar la formación de anticuerpos de bloqueo y/o la eliminación por CTL de vector tanto inicialmente como en el momento de la exposición repetida al vector viral. La reducción concordante de anticuerpo neutralizante con IgA antiviral sugiere que la inmunoglobulina del subtipo IgA es principalmente responsable del bloqueo de la transferencia génica.

Ejemplo 3 Potenciación de la Transferencia Génica Mediada por Adenovirus durante la Segunda Administración Mediante IL-12 e IFN-\gamma en Hígado de Ratón

Se efectuaron experimentos substancialmente idénticos a los descritos en el Ejemplo 2 anterior, en los que se administraron vectores virales a la sangre para la introducción del transgén en el hígado (en vez del aporte intratraqueal al pulmón).

Los adenovirus recombinantes H5.010CMVlacZ y H5.010CBALP se usaron en este ejemplo.

Ratones C57BL/6 hembra (6-8 semanas de edad) fueron inyectados con suspensiones de H5.010CBALP (1 x 10^{9} puf en 50 \mul de PBS) i.p el día 0 y de forma similar con H5.010CMVlacZ el día 28. Un grupo de tales ratones se usó como un control. Otro grupo de ratones se agotó agudamente de células CD4^{+} mediante inyección i.p. de anticuerpo para células CD4^{+} (GK 1.5; Nº del ATCC TIB207, dilución 1:10 de ascitis) en el momento de la terapia génica inicial (días -3, 0 y +3). Un tercer grupo de ratones se inyectó con IL-12 (2 \mug, inyecciones i.p.) en el momento de la primera administración de virus (días 0 y +1). Un cuarto grupo de ratones se inyectó con interferón gamma (2 \mug, inyecciones i.p.) en el momento de la primera administración de virus (días 0 y +1).

Cuando los ratones subsiguientemente se sometían a eutanasia y necropsia los días 3, 28 ó 31, los tejidos hepáticos se prepararon para criosecciones de acuerdo con los procedimientos usados anteriormente para tejido pulmonar en el Ejemplo 2.

Los resultados de la criosección eran substancialmente similares para la terapia génica dirigida al hígado de acuerdo con este método que para la terapia dirigida al pulmón del Ejemplo 2 anterior. Los resultados descritos posteriormente se obtuvieron a partir de las tinciones histoquímicas para fosfatasa alcalina (100 aumentos) o las tinciones con X-gal para \beta-galactosidasa (100 aumentos).

La administración de virus ALP (10^{9} pfu) en las venas de todos los grupos de los ratones C57BL/6 daba como resultado una expresión transgénica de alto nivel en el tejido hepático que disminuía hasta niveles no detectables cerca del día 28. Se mostraba que la pérdida de expresión transgénica se debía a la eliminación mediada por CTL de los hepatocitos genéticamente modificados [véase además Yang I, citado anteriormente].

En los ratones de control, no se detectó expresión del gen recombinante tres días después de la segunda administración de virus, es decir, el día 31.

La administración de virus a los animales agotados en CD4^{+} se asoció con substancialmente menos anticuerpos neutralizantes y expresión del transgén recombinante de alto nivel que era estable durante un mes. La expresión del segundo virus era detectable el día 31.

La transferencia génica de alto nivel inicial disminuía después de aproximadamente un mes en los ratones tratados con IL-12; sin embargo, en contraste con el control, se alcanzaba alguna transferencia génica hacia el hígado a través de la sangre cuando el virus se administraba a animales tratados con IL-12 el día 28 y el nivel de anticuerpo neutralizante se reducía.

Los animales tratados con interferón gamma eran virtualmente indistinguibles de los animales tratados con IL-12 ya que su transferencia génica eficaz se efectuaba durante una segunda administración de virus.

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Así, el uso de estas citoquinas y los anticuerpos anti-CD4^{+} como inmunomoduladores permitía la administración dirigida al hígado repetida del vector sin su eliminación inmediata por anticuerpos neutralizantes.

Ejemplo 4 Transferencia Génica Mediada por Adenovirus en Hígado de Ratón

Las respuestas inmunitarias a la administración primaria de virus recombinantes se caracterizaban adicionalmente usando diferentes cepas de ratones.

Virus recombinante (H5.010CNVLacZ o H5.010CBALP) se inactivó con luz ultravioleta en presencia de 8-metoxipsoraleno. Brevemente, virus purificado se resuspendió en 0,33 mg/ml de solución de 8-metoxipsoraleno y se expuso a una fuente de luz UV de 365 nm sobre hielo a 4 cm del filtro de la lámpara durante 30 min. El virus se hizo pasar a continuación sobre una columna Sephadex G-50 equilibrada con PBS. Los ensayos de transducción con dilución limitativa de pies inactivados de virus demostraban menos de un virus funcional por 10^{5} partículas de virus inactivado. Las suspensiones de los virus (2 x 10^{9} pfu en 100 \mul de PBS) se infundieron en la vena de la cola de ratones hembra de 6 a 8 semanas de edad según se detalla en los siguientes experimentos. Cada experimento se realizó con un mínimo de tres ratones en los que la expresión transgénica se cuantificaba en una sección de cada uno de 5 lóbulos. El análisis mínimo era 15 secciones por condición experimental.

a.

Ratones C57BL/6 [H-2^{b}; Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME] fueron inyectados con suspensiones de H5.010CMVlacZ el día 0 y de forma similar con H5.010CBALP el día 28 ("ratones B6");

b.

Ratones C57BL/6 fueron inyectados con H5.010CMVlacZ inactivado con UV el día 0 y H5.010CBALP el día 28 ("ratones B6-UV");

c.

Ratones deficientes en MHC clase II (II) [GenPharm International, Mountain View, CA], criados en el fondo C57BL/6 (entre 5-10 generaciones) y que tienen el haplotipo H-2^{b}, son incapaces de expresar determinantes I-A^{b} y no pueden desarrollar respuestas mediadas por células T CD4^{+} [Grusby y otros, Science, 253:1417-1420 (1991)]. Estos ratones se infectaron con H5.010CBALP el día 0 y H5.010CMVlacZ el día 28 ("ratones clase II");

d.

Ratones deficientes en inmunoglobulina B2 (\beta2m^{-}) [GenPharm International, Mountain View, CA], criados en el fondo C57BL/6 (entre 5-10 generaciones) y que tienen el haplotipo H-2^{b}, son incapaces de desarrollar respuestas asociadas con el MHC clase I. Estos ratones se infectaron con H5.010CMVlacZ el día 0 y H5.010CBALP el día 28 ("ratones \beta2m^{-}");

e.

Ratones C57BL/6 se inocularon i.p. con partes alícuotas de 0,5 ml de dilución 1:10 de fluido de ascitis de ratón que contiene el GK1.5 (MAb anti-CD4, ATCC TIB207) los días -3, 0 y +3, según se describe en el Ejemplo 2. Esto era equivalente a 100 \mug de anticuerpo policlonal purificado por inyección. Estos ratones agotados en células CD4^{+} se infectaron con H5.010CMVlacZ el día 0 y H5.010CBALP el día 28 ("ratones CD4Ab"); y

f.

Ratones C57BL/6, tratados con IL-2 (2 \mug en 200 \mul de PBS) i.p. el día 0 y el día +1 según se describe en el Ejemplo 2, se infectaron con H5.010CMVlacZ el día 0 y H5.010CBALP el día 28 ("ratones IL-12").

Ratones de cada grupo subsiguientemente se sometieron a eutanasia y los tejidos hepáticos se evaluaron con respecto a la expresión de lacZ mediante histoquímica con X-gal (100 aumentos) el día 3 y el día 28; y con respecto a la expresión de ALP mediante tinción histoquímica el día 31 (100 aumentos). El desarrollo de anticuerpo neutralizante para adenovirus en cada grupo de ratones se examinó en muestras de suero obtenidas el día 28.

La infusión de virus lacZ en ratones C57BL/6 se asoció con la expresión de alto nivel, pero transitoria, del gen informador y el desarrollo final de anticuerpo neutralizante dirigido contra antígeno adenoviral (Fig. 2). No se detectó transferencia génica cuando el virus ALP se infundía subsiguientemente en estos animales. En contraste, los ratones clase II^{-} no producían anticuerpo neutralizante (Fig. 2) y eran receptivos a transferencia génica de alto nivel a partir de una segunda administración de virus. De forma similar, los animales agotados transitoriamente de CD4 estabilizaban parcialmente la expresión de LacZ y no se desarrollaba anticuerpo neutralizante, permitiendo la readministración eficaz de virus.

En los ratones B6-UV que recibían virus recombinante inactivado con UV, el virus inactivado generaba una respuesta de anticuerpo neutralizante completa (Fig. 2) que evitaba completamente la transferencia génica subsiguiente. Este resultado demuestra que las proteínas de la cápsida del virus entrante son suficientes para activar una respuesta inmunitaria humoral bloqueadora mediada por células cooperadoras T y células B.

El experimento con ratones \beta2m^{-} se realizó para evaluar el papel de las células CD8 y la expresión del MHC clase I en la respuesta primaria a virus [Zijlstra y otros, Nature, 344:742-746 (1990)]. La expresión transgénica era estable en estos animales de acuerdo con datos presentados anteriormente [Yang III, citado anteriormente]. Sin embargo, la transferencia génica se producía a un nivel significativo en el entorno de una readministración de virus. Esto era inesperado debido a que esta cepa de ratones debe tener todos los componentes de la respuesta inmunitaria necesarios para producir anticuerpo neutralizante (es decir, células CD4, expresión del MCH clase II y células B). Estos animales no mostraban una respuesta de anticuerpo neutralizante significativa a antígenos adenovirales. Estos resultados sugieren la desregulación de la activación de células cooperadoras T y/o B (Fig. 2).

El análisis de linfocitos de animales \beta2m^{-} demostraba la secreción activada por antígeno de IFN-\gamma por encima de la medida en ratones C57BL/6, posiblemente debido a la persistencia de células infectadas con virus y la activación crónica de células T_{H1}. La respuesta T_{H1} amplificada en ratones \beta2m^{-} podía conducir a una inhibición de células T_{H2} dando como resultado la producción disminuida de anticuerpos antivirales.

Se encontró que la expresión transgénica se estabilizaba en animales deficientes en células CD8 y MHC clase I en virtud de una interrupción de \beta2m^{-} de la línea germinal. La supresión específica de perforina, la molécula en los CTLs y las células asesinas naturales (NK) que media en la citolisis, prolonga de forma similar la expresión transgénica (datos no mostrados).

Ejemplo 5 Efecto del Anticuerpo para CD4 sobre la Transferencia Génica Mediada por Ad sobre las Administraciones Repetidas

Suspensiones de los adenovirus recombinantes que expresan diferentes transgenes se infundieron en la vena de la cola de ratones C57BL/6 (H-2^{b}) a intervalos de 21 días. H5.010CMVLDLR es un adenovirus sometido a deleción de los genes E1a y E1b y tiene una deleción en el gen E3 en las unidades de mapeo 78,5 a 84,3 de la cadena principal de sub360 de Ad 5, con un gen receptor de LDL en lugar de la deleción de E1 [descrito en Kozarsky y otros, J. Biol. Chem., 269:1-8 (1994)].

H5.010CMVLDLR se administró el día 0; H5.010CMVlacZ el día 21 y H5.010CBALP el día 42. A un grupo de control de ratones se le administraron inyecciones i.p. de solución salina los días -3, 0 y +3, con respecto a cada infusión de virus. A un segundo grupo de ratones se le dieron inyecciones i.p. de anticuerpo que agota CD4 para bloquear la activación de células cooperadoras T (mAb KG1.5) en el mismo protocolo. A un tercer grupo de ratones se le dieron inyecciones i.p. de mAb GK1.5 los días -3, 0, 3, 18, 21 y 24. Un cuarto grupo de ratones, que no recibía la administración inicial de H5.010CMVLDLR, se trató con mAb GK1.5 los días -3, 0 y 3.

Los ratones se sometieron subsiguientemente a eutanasia y los tejidos hepáticos se evaluaron con respecto a la expresión de LDLR mediante inmunohistoquímica el día 3, con respecto a la expresión de lacZ mediante histoquímica con X-gal el día 24 y con respecto a la expresión de ALP mediante tinción histoquímica el día 45. Los ensayos se realizaron como sigue:

A.

La tinción inmunofluorescente para la expresión de LDLR se realizó como sigue: Secciones congeladas (6 \mum) se fijaron en metanol como se describe en Morris y otros, citado anteriormente. Después de bloquear con suero de cabra al 10% en PBS (GS/PBS), las secciones se incubaron con un anticuerpo policlonal para LDLR (1:200) durante 60 minutos y a continuación con anti-(IgG de conejo) caprina-FITC durante 30 minutos. Las secciones se lavaron y se montaron con Citiflour (Citifluor, Reino Unido).

B.

Se realizó inmunohistoquímica con X-gal como sigue: Secciones de tejido congelado reciente (6 \mum) se fijaron en glutaraldehído al 0,5% durante 10 minutos, se enjuagaron dos veces durante 10 minutos en PBS que contenía MgCl_{2} 1 mM y se incubaron en 1 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido (X-gal), K_{3}Fe(CN)_{6} 5 mM, K_{4}Fe(CN)_{6} 5 mM y MgCl_{2} 1 mM en PBS durante 3 horas.

C.

La histoquímica de ALP se realizó como sigue: Secciones congeladas (6 \mum) se fijaron en glutaraldehído al 0,5% durante 10 minutos, se enjuagaron en PBS, se incubaron a 65ºC durante 30 minutos para inactivar actividad de ALP endógena, se lavaron en Tris 100 mM (pH 9,5), NaCl 100 mM y MgCl_{2} 50 mM y se tiñeron en el mismo tampón que contenía 0,165 mg/ml de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) y 0,33 mg/ml de nitroazul tetrazolio (NBT) a 37ºC durante 30 minutos.

Los resultados analizados posteriormente se obtuvieron a partir de análisis de las tinciones citoquímicas de tejido hepático tres días después de cada infusión con virus, incluyendo virus LDLR el día 0, virus lacZ el día 21 y virus ALP el día 42 (150 aumentos).

También se recogieron muestras de suero los días 0, 3, 7, 14, 21, 28, 35 y 42 de cada grupo de animales y se ensayaron con respecto a la concentración de anticuerpo neutralizante. Las muestras de suero se incubaron a 56ºC durante 30 minutos y a continuación se diluyeron con DMEM en etapas de dos veces partiendo de 1:20. Cada dilución de suero (100 \mul) se mezcló con H5.010CKVlacZ (2 x 10^{6} pfu en 20 \mul), se incubó durante 1 hora a 37ºC y se aplicó a células Hela confluentes al 80% en placas de 96 pocillos (2 x 10^{4} células por pocillo). Después de 60 minutos de incubación a 37ºC, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de DMEM que contenía FBS al 20%. Las células se fijaron y se tiñeron con respecto a la expresión de \beta-galactosidasa al día siguiente. Todas las células se teñían de azul en ausencia de muestras de suero. La concentración de anticuerpo neutralizante para cada muestra se presentó como la dilución más alta con la que menos de 50% de las células se teñían de azul. Las Figs. 3A-3C presentan la concentración de anticuerpo expresada como una función de los días después de la infección.

Estos experimentos demostraban que en el grupo de ratones que no recibían anticuerpos para CD4, se producía transferencia génica eficaz después del primer virus. Sin embargo, el desarrollo de anticuerpo neutralizante bloqueaba la transferencia génica con los dos virus subsiguientes. El anticuerpo neutralizante rápidamente aparecía en suero después del segundo virus si no se coadministraban anticuerpos para CD4 (Figs. 3B). El tercer virus no era eficaz en estos animales. En contraste, la administración de anticuerpos para CD4 en el momento de la primera dilución de virus evitaba la formación de anticuerpos neutralizantes (Fig. 3B) y permitía una transferencia génica de alto nivel con el segundo virus. La aparición de anticuerpo neutralizante después del segundo virus se aceleraba (Fig. 3B en comparación con el transcurso del tiempo de una respuesta primaria en la Fig. 3A), sugiriendo que la activación de algún nivel de inmunidad celular se produce incluso en presencia de anticuerpos para CD4.

Estos experimentos demuestran que el inmunobloqueo transitorio en el momento del aporte del virus, en oposición a la inmunosupresión crónica, es todo lo necesario para una transferencia génica eficaz.

El tercer grupo de animales recibía anticuerpo para CD4 el día -3 sin administración de H5.010CMVLDLR, es decir 21 días antes de la administración primaria de virus. El anticuerpo neutralizante que se desarrollaba después de la estimulación primaria de virus bloqueaba la transferencia génica 21 días más tarde (Fig. 3C) de una manera indistinguible de la observada en animales normales tratados con anticuerpo para CD4 (Fig. 3A). Este resultado confirma la naturaleza transitoria del agotamiento de CD4.

Ejemplo 6 Efecto de IL-12 sobre Isotipos de Anticuerpo Específicos para Ad y Respuestas de CTL

A. Muestras de suero obtenidas de los ratones C57BL/6 ("B6") y ratones C57BL/6 tratados con IL-12 ("B6+IL12") del Ejemplo 5 se probaron 28 días después de la infección con respecto a isotipos de anticuerpo IgG1 e IgG2a específicos para adenovirus.

Se realizó un ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA) en fase sólida usando virus
H5.010CMVlacZ purificado como antígeno. Placas de microvaloración Immunolon-2-U (Fisher) se revistieron con 200 ng/pocillo de antígeno viral en 100 ml de PBS durante 6 horas a 37ºC, se lavaron tres veces en PBS y se bloquearon en PBS/BSA al 1% durante la noche a 4ºC. Al día siguiente, muestras de suero diluidas en serie cuatro veces se añadieron a placas revestidas con antígeno y se incubaron durante 4 horas a 37ºC. Las placas se lavaron tres veces en PBS/BSA al 1% y se incubaron anti-(IgG1 de ratón) caprina-biotina o anti-(IgG2a de ratón) caprina-biotina (CALTAG Laboratories, San Francisco, CA) con una dilución 1:5000 durante 2 horas a 37ºC. Las placas se lavaron como anteriormente y se añadió a cada pocillo Avidin-ALP (Sigma) con una dilución 1:5000 durante 1 hora a 37ºC. Los pocillos se lavaron de nuevo como anteriormente y se añadió substrato de PNPP. Las densidades ópticas se leyeron en un lector de microplacas Biorad modelo 450. Las Figs. 4A y 4B resumen las cantidades relativas (DO_{405}) de IgG1 e IgG2a, respectivamente, presentes en muestras de suero como una función de diluciones de muestra. Los ensayos de ELISA de los sueros revelaban anticuerpos antivirales de los subtipos tanto IgG1 como IgG2a de acuerdo con la activación de los subgrupos tanto T_{H1} como T_{H2}, respectivamente. Los animales que recibían IL-12 producían menos IgG1 antiviral a expensas de una producción incrementada de IgG2a.

B. Esplenocitos recogidos de ratones C57BL/6 ("B6") y ratones C57BL/6 tratados con IL-12 ("B6+IL12") del Ejemplo 5 se reestimularon in vitro 10 días después de la administración de H5.010CBALP con H5.010CMVlacZ durante 5 días en DMEM complementado con FBS al 5% y 2-mercaptoetanol 50 mM. Estas células se probaron con respecto a la lisis específica sobre células C57SV infectadas simuladamente ("simuladas") e infectadas con H5.010CBALP ("ALP") en un ensayo de liberación de ^{51}Cr realizado subsiguientemente usando las siguientes relaciones de células efectoras a diana (C57SV, H-2^{b}) en 200 \mul de DMEM con FBS al 10% en placas de 96 pocillos de fondo en V (E:T = 50:1, 25:1, 12:1, 6:1, 5:1 y 3:1).

Antes de mezclar con las células efectoras, las células diana (1 x 10^{6}) se marcaron con 100 \muCi de ^{51}Cr después de una infección de 24 h con H5.010CMVlacZ a una mdi (multiplicida de infección) de 50 y se usaron en 5 x 10^{3} células/pocillo. Después de la incubación durante 6 h, partes alícuotas de 100 \mul de sobrenadante se retiraron para el conteo en un contador gamma. El porcentaje de liberación de ^{51}Cr específica se calculó como: [(cpm de la muestra - cpm de liberación espontánea)/(cpm de liberación máxima - cpm de liberación espontánea)] x 100. Los resultados, presentados como porcentaje de lisis específica como una función de diferentes relaciones de efector a diana (Fig. 5), muestran que la actividad de CTL frente a células diana infectadas con virus no estaba afectada por el tratamiento con IL-12.

El resultado neto era una reducción de tres veces en el anticuerpo neutralizante, cuya magnitud era insuficiente para permitir la transferencia génica eficaz durante la readministración de virus. Las diferencias en la eficacia de la readministración de virus entre los ratones \beta2m- y los ratones C57BL/6 tratados con IL-12 podía reflejar una expresión mediada por citoquina inadecuada después de la inyección i.p. de IL-12 o mecanismos distintos a la inhibición de la activación de T_{H2}.

Ejemplo 7 Ratones Deficientes en CD40L Ilustran el Papel Necesario de la Activación de Células T en las Respuestas del Huésped a Vectores Adenovirales

El papel de la señalización mediada por CD40L de células T en respuestas inmunitarias celulares humorales a vectores adenovirales se estudió en ratones genéticamente deficientes en CD40L. Estudios previos han demostrado anormalidades en respuestas de células B timodependientes en estos ratones [J. Xu y otros, Immunity, 1:423-431 (1994) y B. Renshaw y otros, J. Exp. Med., 180:1889-1900 (1994)]. A los ratones deficientes en CD40L (CD40L KO) y sus crías normales en un fondo quimérico de C57BL/6-129 [J. Xu y otros, citado anteriormente] se les administró adenovirus sometido a deleción en E1 que contenía lacZ (H5.010CMVlacZ) el día 0 en la tráquea (1 x 10^{9} en 50 \mul de PBS), para efectuar la transferencia génica al pulmón, y en la circulación periférica a través de la vena de la cola (2 x 10^{9} en 100 \mul en PBS), para efectuar la transferencia génica al hígado. Los animales se trataron de nuevo con H5.010CBALP, un factor adenoviral que contiene un gen informador diferente (fosfatasa alcalina, ALP), el día 28. La sangre se analizó antes de la segunda administración de vector con respecto a anticuerpos neutralizantes y los tejidos se recogieron para el análisis de la expresión del gen informador tres días más tarde (es decir, el día 31). Los animales fueron sacrificados 3 y 28 días más tarde para determinar la eficacia y la estabilidad de la expresión transgénica, respectivamente. La Tabla II resume análisis morfométricos de estos tejidos.

TABLA II Análisis Cuantitativo de Pulmón e Hígado de Ratón con respecto a la Eficacia de la Expresión Transgénica

2

Crías normales a las que se les administraban vectores demostraban una expresión transgénica de alto nivel el día 3 en el pulmón y en el hígado que disminuía hasta niveles indetectables cerca del día 28 (similar a lo que se observa en ratones C57BL/6 normales; Tabla II). El suero y el lavado alveolar bronquial (BAL) se analizaron con respecto a anticuerpo neutralizante para Ad5 humano según se describe en Y. Dai y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 1401-1405 (1995). Se desarrollaba anticuerpo neutralizante substancial para proteínas de la cápsida adenoviral para el día 28 bien en fluido de BAL de animales que recibían vector intratraquealmente o bien en sangre de animales que recibían vector en la circulación venosa (Fig. 6). La readministración de vector el día 28 era insatisfactoria como se evidenciaba por la falta de expresión transgénica en el órgano diana 3 días más tarde (similar a lo que se observa en ratones C57BL/6, Tabla II). Se obtuvieron resultados substancialmente diferentes en los ratones deficientes en CD40L. La expresión transgénica era estable con poca disminución durante 28 días tanto en el pulmón como en el hígado (Tabla II). Además, el anticuerpo neutralizante no se desarrollaba (Fig. 6), dando como resultado una expresión transgénica altamente eficaz después de una segunda administración de virus (Tabla I).

Ejemplo 8 El Bloqueo Transitorio del Ligando de CD40 con Anticuerpo Evita la Activación Primaria de Células T y Prolonga la Expresión Transgénica

El siguiente ejemplo demuestra que la inhibición transitoria de CD40L con anticuerpo bloqueaba el cebado de células T CD4^{+} en el modelo pulmonar de terapia génica y eliminaba eficazmente respuestas efectoras de células T y B CD4. La expresión transgénica persistente y la eficacia de la readministración del vector en el pulmón eran esencialmente idénticas en animales genéticamente deficientes en CD40L (Ejemplo 7 anterior) en comparación con los inhibidos transitoriamente con anticuerpo para CD40L (véase posteriormente).

Los resultados alentadores obtenidos en los ratones deficientes en CD40L que se muestran en el Ejemplo 7 anterior proporcionaban una base para desarrollar una terapia génica adyuvante con vectores adenovirales basada en la inhibición farmacológica de la señalización de CD40L. Esta terapia se basa en los hallazgos de que las proteínas de la cápsida en los virus entrantes son la fuente primaria de antígeno para la activación de células T CD4^{+}, restringiendo de ese modo el tiempo de bloqueo coestimulante a un corto intervalo cuando se administra
vector.

Los experimentos en ratones C57BL/6 (seis semanas de edad, hembras) no tratados con anticuerpo o tratados con anticuerpo de control del isotipo demostraban una expresión transgénica de alto nivel el día 3 en el pulmón (Tabla II) y el hígado (Tabla II), que disminuía hasta niveles indetectables para el día 28 (Tabla II). Los experimentos de transferencia génica también se realizaron en animales C57BL/6 inyectados con 100 \mug de mAb para CD40L (MR1, hibridoma del ATCC HB11048) i.p. los días -3, 0, +3 y +6 con relación a la administración de vector inicial o cantidades equivalentes de un anticuerpo monoclonal de hámster de control. Los estudios en pulmón de múrido demostraban la estabilización de la expresión transgénica en animales tratados con mAb para CD40L, en los que los hepatocitos que expresan transgén se disminuían ligeramente desde 89% hasta 47% a lo largo de un intervalo de 28 días (Tabla II). La expresión transgénica se estabiliza en animales tratados con anticuerpo para CD40L al menos seis semanas, que es el punto temporal más largo evaluado (datos no mostrados).

Los animales receptores se analizaron con respecto a la activación específica para antígeno de células T CD4^{+} y CD8^{+} usando ensayos tanto in vitro como in vivo. El efecto del bloqueo de CD40L sobre células T CD4^{+} se estudió en ensayos de proliferación de linfocitos estimulados con adenovirus inactivado con UV esencialmente como se describe posteriormente (Tabla III). Brevemente, linfocitos de nódulos linfáticos mediastinales (para el experimento pulmonar) o esplenocitos (para el experimento hepático) procedentes de ratones 10 días después de la administración de virus se reestimularon con virus inactivado con UV durante 24 horas. Los sobrenadantes se probaron sobre células HT-2 (ATCC, CRL 1841) con respecto a la secreción de citoquina y la proliferación se determinó 72 horas más tarde midiendo la incorporación de ^{3}H-timidina. La activación de células T específicas para adenovirus, según se cuantifica mediante el índice de estimulación, se documentó inicialmente el día 7 en animales no tratados con anticuerpo que eran administrados a través de vector al pulmón o el hígado. La activación de células específicas para adenovirus se incrementaba progresivamente a lo largo de los 14 días siguientes. El índice de estimulación se calculó dividiendo los conteos de ^{3}H en presencia de antígeno por aquellos en ausencia de antígeno. La activación de células T se inhibía substancialmente en ambos modos de coadministración de anticuerpo para CD40L. La mayor inhibición se observó en animales a los que se administraba vector al pulmón.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA III Respuestas de Células T CD4^{+} y Anticuerpo Neutralizante

3

La activación de células T CD8^{+} mediante células infectadas con virus se analizó en ensayos de liberación de cromo usando células diana compatibles con MHC H-2 infectadas con vectores adenovirales. Según se muestra previamente, se demostró lisis específica con linfocitos recogidos de receptores C57BL/6 el día 7, que se estimulaban in vitro con células presentadoras de antígeno infectadas con adenovirus, y se incubaban con dianas infectadas adenoviralmente (Fig. 7). No se demostró lisis para dianas infectadas simuladamente.

Linfocitos recogidos de animales tratados con anticuerpo para CD40L también demostraban actividad de CTL para células infectadas con adenovirus. Sin embargo, la extensión de la lisis era consecuentemente inferior que la obtenida a partir de animales inmunoabladidos. La necesidad de amplificar CTL mediante estimulación in vitro antes del ensayo citolítico puede oscurecer diferencias más significativas en la activación de CTL que se producía después de la exposición primaria in vivo.

El efecto primario de la inhibición de CD40L sobre la activación de células T CD4^{+} específicas para adenovirus se evaluó adicionalmente in vivo usando técnicas de inmunocitoquímica. Estos experimentos se restringían al modelo de la transferencia génica dirigida al hígado debido a limitaciones técnicas de la inmunofluorescencia en secciones pulmonares. Los tejidos hepáticos se analizaron el día 14 con respecto a la infiltración de células T CD4^{+} y CD8^{+} mediante inmunofluorescencia doble. Los animales no tratados con anticuerpo mostraban un infiltrado linfocítico mixto típico que estaba dominado por células T CD4^{+} y se asociaba con la regulación al alza substancial del MHC clase I sobre la superficie vasolateral de los hepatocitos. Estudios previos han sugerido que la secreción de IFN-\gamma a partir de células T CD4^{+} activadas con respecto a T_{H1} contribuye al incremento en el MHC clase I que puede sensibilizar los hepatocitos a la eliminación mediada por CTL. Los animales tratados con anticuerpo para CD40L todavía movilizaban un infiltrado linfocítico mixto. Sin embargo, la proporción de células T CD4^{+} es substancialmente inferior y el incremento en el MHC clase I se corta substancialmente. La especificidad de los ensayos de inmunofluorescencia se demostró en animales infectados simuladamente.

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Ejemplo 9 El Anticuerpo para CD40L Evita la Formación de Anticuerpo Bloqueador en la Transferencia Génica Dirigida al Pulmón

El impacto del bloqueo transitorio de la señalización de CD40L en el momento de la administración del vector sobre la producción de anticuerpo neutralizante y la eficacia de la administración de vector repetida se evaluó en este experimento. Animales que recibían vector el día 0 con o sin mAb se trataron de nuevo con un vector adenoviral que contenía un gen informador diferente el día 28. La sangre se analizó antes de la administración del segundo vector con respecto a anticuerpos neutralizantes, los tejidos se recogieron para el análisis de la expresión del informador tres días más tarde (es decir, el día 31).

Los resultados más impresionantes se obtuvieron en el modelo de terapia génica dirigida al pulmón. El desarrollo de anticuerpo neutralizante en BAL después de la transferencia génica de vector dirigida al pulmón se inhibía 20 veces en animales a los que se administraba anticuerpo para CD40L (Fig. 7). La transferencia génica con el segundo vector era insatisfactoria en animales no tratados con anticuerpo o animales tratados con un mAb de control del isotipo (datos no mostrados), según se evidencia por la ausencia completa de expresión transgénica tres días después de la readministración del vector. Esto contrasta con animales tratados durante la primera administración del vector con anticuerpo para CD40L en los que la transferencia génica se efectuaba después de una segunda administración de vector. La expresión transgénica se detectó en > 25% de las células epiteliales de las vías respiratorias de 30% de las vías respiratorias después del segundo vector, lo que solo es ligeramente inferior que el número de vías respiratorias que expresan transgén en un animal normal tratado con vector (es decir, 75%, Tabla II). El anticuerpo para CD40L bloqueaba parcialmente la producción de anticuerpo neutralizante en suero después de la infusión intravenosa de virus (Fig. 7). Esto era suficiente para permitir alguna transferencia génica al hígado con el segundo vector (8% de hepatocitos), que no se producía en ausencia de anticuerpo, pero es substancialmente reducido con respecto a lo que se alcanzaba después de una administración primaria de vector en animales normales (89%).

Ejemplo 10 El Tratamiento Corto de Ciclofosfamida Evita Respuestas Inmunitarias Destructivas en Pulmón e Hígado de Ratón

A ratones C57BL/6 se les dio ciclofosfamida en diversos regímenes de dosificación al tiempo que se administraba un virus lacZ sometido a deleción en E1 a la sangre, para estudiar la transferencia génica dirigida al hígado, y a la tráquea, para estudiar la transferencia génica dirigida al pulmón. Un segundo virus sometido a deleción en E1, que expresa el gen informador de fosfatada alcalina, se readministra al mismo órgano que recibía el primer vector. Se aislaron linfocitos de sitios regionales y se evaluaron in vitro con respecto a la activación de células T específicas para el vector. Los tejidos se recogieron en diversos momentos para el análisis de la inflamación y sus consecuencias así como la expresión de los genes informadores tanto lacZ como ALP.

A. Estudios Animales

Ratones hembra C57BL/6 fueron inyectados con 1 x 10^{9} pfu de 5.010CMVlacZ a través de la tráquea (estudios pulmonares) o la vena de la cola (estudios hepáticos) el día 0. Se dieron inyecciones de ciclofosfamida iv según se indica (en 200 ml de PBS). Se inyectó H5.010CBALP como se describe anteriormente el día 28. Los animales se sacrificaron el día 3, 28, 31 y 50 para el análisis de la expresión transgénica. Cuando se realizaba la necropsia, los tejidos pulmonares y hepáticos se preparaban para criosecciones, mientras que el bazo, el lavado alveolar bronquial (BAL) y los nódulos linfáticos mediastinales (MLN) se recogían para ensayos inmunológicos.

B. Análisis Morfológicos

Para los análisis inmunocitoquímicos, tejido hepático congelado se crioseccionó, mientras los pulmones estaban inflados con una mezcla 1:1 de PBS/OTC, se congelaban y los bloques se crioseccionaban. Para la histoquímica con X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galactopiranósido), secciones de tejido de 6 mm congeladas se fijaron en glutaraldehído al 0,5% durante 10 min, se lavaron dos veces con PBS que contenía MgCl_{2} 1 mM y se incubaron en 1 mg de X-Gal por ml, K_{3}Fe(CN)_{6} 5 mM, K_{4}Fe(CN)_{6} 5 mM y MgCl_{2} 1 mM en PBS durante 4 horas. Para la tinción de fosfatasa alcalina, las secciones congeladas se fijaron en glutaraldehído al 0,5% durante 10 minutos y se lavaron dos veces en PBS. Las secciones se incubaron a 65ºC durante 10 minutos para inactivar actividad de fosfatasa alcalina endógena, se lavaron una vez en PBS y se tiñeron en Tris-HCl 100 mM (pH 9,5), NaCl 100 mM, MgCl_{2} 50 mM que contenía 0,165 mg de BCIP (fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo) y 0,33 mg de nitroazul tetrazolio por ml a 37ºC durante 30 minutos.

C. Inmunofluorescencia

Secciones congeladas se fijaron en metanol a -20ºC durante 10 minutos, se secaron al aire y se rehidrataron en PBS dos veces y la unión no específica se bloqueó en suero caprino al 10%/PBS durante 30 minutos. Las secciones se incubaron durante 1 hora bien con anticuerpo anti-(CD4 de ratón) de rata (anti-L3T4, GibcoBRL, dilución 1:100 en suero caprino al 2%), seguido por una incubación de 30 minutos con 5 mg de anti-(inmunoglobulina G (IgG) de rata) caprina-fluoresceína o anti-(CD8a de ratón) de rata-isotiocianato de fluoresceína (anti-Ly-2, GibcoBRL, dilución 1:100 en suero caprino al 2%). Para la tinción del MHC clase I, las secciones se incubaron con sobrenadante de hibridoma de ratón diluido 1:50 a H-2K^{b}D^{b} (20-8-4S) durante 60 minutos, seguido por una incubación de 30 minutos con 5 mg/ml de isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado a anti-(IgG de ratón) caprina. Las secciones se lavaron dos veces y se montaron con el antidecolorador Citifluor (Canterbury Chemical Lab., Canterbury, Reino Unido).

D. Ensayo de CTL

Para ensayos de CTL, esplenocitos de tres ratones o linfocitos de diez ratones se reunieron. Las células se reestimularon in vitro durante 5 días con H5.010CMVlacZ (MOI 0,5) y se ensayaron sobre células diana compatibles con el MHC, que previamente se infectaron con H5.010CMVlacZ y se cargaron con ^{51}Cr, usando diferentes relaciones de células efectoras/diana. El porcentaje de liberación específica de ^{51}Cr se calculó como [(cpm de muestra - cpm de liberación espontánea)/(cpm de liberación máxima - cpm de liberación espontánea)] x 100. La liberación espontánea se determinó ensayando células diana sin células efectoras en el medio, mientras que la liberación máxima se estimaba añadiendo SDS al 5% a las células diana durante el tiempo de incubación de 6 horas.

E. Ensayo de Liberación de Citoquina

Se cultivaron 6 x 10^{6} esplenocitos con o sin antígeno (es decir, H5.010CMVlacZ inactivado con UV a una MOI de 10) durante 24 h en una placa de 24 pocillos. 100 ml de sobrenadante libre de células se transfectaron sobre 2 x 10^{3} células HT-2 (línea celular dependiente de IL-2 e IL-4) en placas de 96 pocillos de fondo redondo. Se usaron medio y sobrenadante de concanavalina A de rata al 10% como controles negativo y positivo. La proliferación se determinó 48 h más tarde mediante un impulso de [^{3}H]timidina (0,35 mCi/pocillo) de 6 h.

F. Ensayo de Anticuerpos Neutralizantes

Se incubaron suero y BAL durante 30 min a 56ºC para inactivar el complemento. Diluciones en serie de suero y BAL en DMEM sin FBS (50 ml, empezando a 1:20) se incubaron con 1 x 10^{6} pfu de H5.010CMVlacZ durante 60 min y se aplicaron sobre 2 x 10^{4} células Hela (80% confluentes) en placas de 96 pocillos. Después de una incubación de 60 minutos, se añadieron 100 ml de DMEM que contenía FBS al 20%. Las células se fijaron 16-18 horas más tarde y se tiñeron con respecto a la actividad de \beta-galactosidasa. Todas las células se teñían de azul cuando se añadía medio en lugar de suero o BAL. La concentración de anticuerpo neutralizante se determinó mediante la dilución más alta con la que menos de 50% de las células se teñían de azul.

Numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención se incluyen en la memoria descriptiva identificada anteriormente y se espera que sean obvias para el experto en la técnica. Se cree que tales modificaciones y alteraciones, incluyendo el inmunomodulador específico seleccionado, el modo de administración, el vector recombinante y el transgén seleccionados, la ruta de administración, etc., están abarcados en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (15)

1. Uso de un inmunomodulador para la fabricación de un medicamento para inhibir una respuesta inmunitaria contra un virus recombinante que se coadministra con dicho medicamento, caracterizado porque dicho virus recombinante comprende un gen terapéutico, y caracterizado porque dicho medicamento inhibe respuestas de anticuerpos neutralizantes contra dicho virus, y caracterizado porque en el caso de una readministración adicional del virus recombinante, la readministración se realiza opcionalmente en ausencia del inmunomodulador, con tal de que cuando dicho recombinante sea un adenovirus, la readministración se lleve a cabo en ausencia de un inmunomodulador.

2. Uso de un virus recombinante para la fabricación de un medicamento en el que el virus recombinante se coadministra con un inmunomodulador para inhibir una respuesta inmunitaria contra el virus recombinante, caracterizado porque dicho virus recombinante comprende un gen terapéutico, y caracterizado porque dicho inmunomodulador inhibe respuestas de anticuerpos neutralizantes contra dicho virus, y caracterizado porque en el caso de una readministración adicional del virus recombinante, la readministración se realiza opcionalmente en ausencia del inmunomodulador, con tal de que cuando dicho virus recombinante sea un adenovirus, la readministración tenga se lleve a cabo en ausencia de un inmunomodulador.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho inmunomodulador comprende un agente seleccionado de grupo que consiste en:

a)

una citoquina;

b)

un agente que inhibe selectivamente la activación o la función de células CD4+, reduciendo de ese modo la eliminación por CTL del virus;

c)

un anticuerpo anti-células T;

d)

un agente que se une al ligando de CD40 sobre una célula T e inhibe la unión de dicho ligando con CD40 sobre una célula B; y

e)

un agente que se une al ligando de CD28 o a ligando de CTLA4 sobre una célula T e inhibe la unión de dicho ligando con el antígeno B7 sobre una célula B.

4. Uso de acuerdo con la reivindicación 3a, en el que dicha citoquina es interleuquina-4.

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 3a, en el que dicha citoquina es interleuquina-12.

6. Uso de acuerdo con la reivindicación 3a, en el que dicha citoquina es interferón gamma.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 3b, en el que dicho agente comprende un anticuerpo anti-CD4.

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 3d, en el que dicho agente se selecciona del grupo que consiste en molécula de CD4 soluble y anticuerpo anti-ligando de CD40.

9. Uso de acuerdo con la reivindicación 3e, en el que dicho agente se selecciona del grupo que consiste en CD28 soluble, CTLA4 soluble, anticuerpo anti-CD28 y anticuerpo anti-CTLA4.

10. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho inmunomodulador comprende una molécula de DNA.

11. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho inmunomodulador comprende una proteína.

12. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho virus recombinante se selecciona del grupo que consiste en virus adenoasociado, retrovirus, virus vacunal y poxvirus.

13. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho virus recombinante es un virus adenoasociado recombinante.

14. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el medicamento se administra simultáneamente con dicho virus recombinante.

15. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el virus recombinante se readministra en ausencia de un inmunomodulador.