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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifikation
von aus hsp70 erhaltenen Peptidzusammensetzungen, die wenigstens
eine Mutation oder eine Abänderung
hinsichtlich der natürlichen
Sequenz von hsp70 aufweisen, wobei diese Zusammensetzungen eine
tumorspezifische T-Antwort mit sich bringen, sowie Peptidzusammensetzungen,
die man bei diesem Verfahren erhalten kann. Die Erfindung betrifft
auch die Verwendung dieser Peptidzusammensetzungen, um eine wiederholte
Immunisierung bei einem Individuum zu bewirken, derart dass die
Immuntoleranz für
das entsprechende natürliche
(nichtmutierte) Peptid gebrochen wird. Die Peptidzusammensetzungen
werden für
die Herstellung eines Medikamentes verwendet, insbesondere zur Behandlung
von Krebs, gegebenenfalls in Verbindung mit jeglichem Mittel, das
einen Stress der Tumorzellen hervorruft.
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Seit
langem haben Forscher versucht, Mechanismen zum Anregen der Immunabwehr
von Tumoren zu finden, ausgehend von der Hypothese, dass Antigene,
die als Ziel dienen können,
an der Oberfläche
der Krebszellen exprimiert werden. Das empfindliche Gleichgewicht
zwischen dem Wachstum und der Rückbildung
der Tumore ist Gegenstand vieler Theorien, insbesondere was die
Rolle des Immunsystems betrifft. Die Immunüberwachung ist eine bestechende
Theorie, gemäß der die
Tumore im allerersten Stadium ihrer Entwicklung durch Immunabwehrmechanismen
zerstört
werden. Z. B. scheint die Beobachtung, dass eine große Anzahl
von Tumoren durch lymphoide Zellen infiltriert sind, ein günstiges
Prognosezeichen zu sein.
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Das
Auftreten von Krebs bei Individuen mit Immundefekten ist jedoch
nicht merklich höher
als bei der allgemeinen Bevölkerung.
Diese Tatsache ist durch Versuche mit immundefizienten Mäusen (nackten
Mäusen) in
Bezug gesetzt worden. Tatsächlich
entwickeln diese, unter sterilen Bedingungen aufgezogenen Mäuse nicht mehr
Tumore als die Mäuse
des Wildgenotyps. So ist es heute allgemein anerkannt, dass das
sehr leicht erhöhte
Risiko des Auftretens von Krebs bei immundefizienten Individuen
direkt mit dem Auftreten von viralen Infektionen (onkogene Viren)
zusammenhängt.
Dies legt nahe, dass die Immunantwort eingreift, indem sie die Dissemination
der Viren begrenzt und die die viralen Antigene tragenden Krebszellen
erkennt. Sobald ein krebsbildendes Virus in das Genom der Wirtszeile
eindringt, findet durch diese Zellen eine Expression von modifizierten
Proteinen statt, die geeignet sind, die Antigenziele zu bilden.
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Was
die Tumore nichtviraler Herkunft betrifft, so kommt das Hauptproblem
für die
Immunabwehr aus der Tatsache, dass keine deutlichen, antigenischen
Unterschiede zu den normalen Zellen bestehen. Dies ist der Grund,
warum die Tumore in einem gewissen Maß der Immunüberwachung entwischen. Gewisse
Antigene, die spezifisch von nichtviralen Tumoren exprimiert worden
sind, sind in Evidenz genommen worden. Z. B. das Protein CALLA (Common
Accute Lymphoblastic Leukemia Antigen), das normalerweise in den
hämatopoetischen
Zellen exprimiert und in den normalen reifen B-Lymphozyten reprimiert
wird, findet sich in den Lymphoblasten überexprimiert. Somit sind die
antigenischen Proteine der Tumore dem Organismus nicht fremd und
sind natürlicherweise
in gewissen normalen Zellen vorhanden.
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Somit
ist, was die antigenischen Proteine unterscheidet und was durch
die Immunabwehr erkannt werden kann, eine Mutation, eine Änderung
(z. B. eine post-translationale
Modifikation einer Aminosäure)
oder eine differentielle Verteilung oder auch eine Überexpression.
Es ist klar, dass die Erkennung dieser Proteine durch die Lymphozyten
aufgrund der Tatsache ihres Vorhandenseins in den normalen Zellen
(negative klonale Auswahl) verringert ist. Der Fachmann muss somit
dieses Problem lösen,
um einen wirksamen Aktivierungsmechanismus der Immunabwehr gegenüber den
Krebszellen zu finden. Die Herausforderung ist umso größer als
die Konzentration der Antigene gering ist und ihre Präsentation
durch die MHC-Moleküle
mitunter unzureichend ist.
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Aufgabe
ist es somit, die tumorspezifischen, antigenischen Peptide zu identifizieren,
die geeignet sein müssen,
wirksam die Immunabwehr in vivo zu stimulieren, insbesondere die
zytotoxischen T-Lymphozyten. Diese Peptide können als Impfstoff dienen,
der gegebenenfalls Co-Stimulatoren, wie Cytokine oder Lymphokine
aufweist.
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Farace
et al (1997) hat gezeigt, dass die Induktion einer entzündlichen
Antwort bei DTH (delayed type hypersensitivy) und Impfstellen eines
immunisierten Patienten von der Bereitstellung nur einiger Klone
der T-Zellen stammt. Diese Zellen entsprechen den in das Innere
eines Tumors infiltrierten und bereits vor der Immunisierung amplifizierten
Lymphozyten. Somit können
die Antigene der Tumore verwendet werden, um die tumorspezifischen
T-Lymphozyten zu sammeln und lokal zu amplifizieren. Die aktivierten
Zellen in vivo können in
vorteilhafter Weise durch die Gabe von IL-2 amplifiziert werden.
Tatsächlich
haben Kumar A. et al (1996) gezeigt, dass die Aktivität der Klone
der T-Zellen im Blut und in den Tumoren der das IL-2 aufnehmenden
Patienten induziert wird.
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Es
war schwierig, die Klone von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL),
die spezifisch für
die Zellen von Nierenkarzinomen sind, zu isolieren und zu amplifizieren,
Bernhard et al (1994) und Brouwenstijn et al (1996). Diese Schwierigkeit
rührt vom
Mangel dar Proliferation von in einem Tumor infiltrierten Lymphozyten
(TIL) her, insbesondere in Nierenkarzinomzellen (RCC), Alexander
et al (1993). Obwohl gewisse Ergebnisse zeigen, dass die RCC in
vitro immunogenetisch sein könnten,
da diese Tumore häufig
stark von T-Lymphozyten, insbesondere von den TCR α/β+ DR+ Th1-polarisierten Lymphozyten, infiltriert
sind, Angevin et al (1997), und aufgrund der relativ erhöhten Ansprechrate
(15 bis 20%) bei gewissen Immunotherapieprotokollen, Rosenberg et al
(1992).
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Ein
von CTL autolog zu RCC erkanntes Antigen ist von Gaugler et al (1996)
identifiziert worden. Dieses Antigen wird von einem Gen genannt
RAGE 1 kodiert, das in vielen Tumoren exprimiert wird, das jedoch in
normalen reifen Geweben fehlt, außer jenem der Niere. Es ist
klar, dass die Verwendung von RAGE 1 für die Immunotherapie von Krebs
Probleme schafft, da dies autoimmunitäre Abwehrreaktionen der Niere
hervorrufen könnte.
Präparate
mit Vereinigung hsp-Peptid isoliert aus Krebszellen oder aus durch
Viren infizierten Zellen schaffen einen immunitären Schutz gegenüber den
Tumoren und den infizierten Zellen, Blachere et al (1997). Andere
Dokumente, wie die WO 97/10001, WO 97/06828, WO 97/26910, Tamura
et al (1993) und (1997) betreffen die Behandlung von neoplastischen
Zellen durch die Komplexe hsp70-Peptide, die aus Krebszellen erhalten
wurden. Diese Dokumente des Standes der Technik beschreiben die
Fähigkeit
von hsp70, die Peptide der Zellen wie ein Schwamm zu absorbieren.
Die Isolierung von hsp70 die von Krebszellen stammen, gestattet
das Identifizieren von vielen Tumorproteinfragmenten, die potentiell
antigenisch sein können.
Man hat jetzt festgestellt, dass Mutationen oder Änderungen
im Protein hsp70 bestehen, das in Tumoren exprimiert ist und dass
diese Mutationen oder Änderungen
sich als immunogen erweisen. Wissend, dass hsp70 in den Tumoren überexprimiert
werden kann, werden diese Peptide verwendet, einen Toleranzbruch
gegenüber
hsp70 zu induzieren.
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Somit
offenbart kein Dokument des Standes der Technik die Erfindung, wie
sie unten dargelegt ist, noch wird diese nahegelegt.
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Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Identifizieren
von Peptidzusammensetzungen, die eine Aminosäuresequenz enthalten, die wenigstens
eine Mutation oder eine Abänderung
gegenüber
der natürlichen
humanen Sequenz hsp70 hat und wenigstens 80% Homologie in Bezug
auf diese Sequenz zeigt, wobei diese Zusammensetzungen eine tumorspezifische
T-Antwort enthalten und das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
- a) PCR-Amplifikation eines DNA-Fragmentes,
das für
hsp70 kodiert, das man ausgehend von einem oder mehreren Tumor(en)
erhalten hat,
- b) Klonierung der DNA, die man beim Schritt (a) erhalten hat,
in einem Vektor, der sich in einer Bakterie replizieren kann,
- c) Sequenzierung des Fragmentes in jeder Bakterienkolonie, die
man nach der Kultivierung der Bakterien aus Schritt (b) erhalten
hat und Identifizierung der Mutation(en) in hsp70,
- d) Bestimmung der Immunogenität der mutierten Peptidfragmente
unter jenen, die beim Schritt (c) identifiziert worden sind. Vorteilhafterweise
besteht der Schritt (d) in einem Elispot-Test. Es ist möglich, einfach
die Immunogenität
der Peptidfragmente zu untersuchen, die eine Verankerungssequenz
für ein
gegebenes HLA-Molekül
haben (siehe unten das Verfahren der "reversen Immunologie").
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Die
im Schritt (d) zu testenden Peptidfragmente können einfach durch chemische
Synthese, ausgehend von allgemeinem Wissen in dem technischen Bereich
erhalten werden.
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Man
versteht unter "hsp70" im Rahmen der Erfindung
hsp70-1 ebenso wie hsp70-2. Der Elispot-Test ist ausführlich in
den Dokumenten des Standes der Technik beschrieben. Z. B. betrifft
Herr et al (1998) ein Elispot-Verfahren zum Nachweisen und Quantifizieren
von T-CD8+-Lymphozyten, die TNF-α absondern.
Kurz gesagt, werden Multi-Screen-HA-Platten (Millipore, Bedford,
MA) mit einem anti-TNF-α-Antikörper (Klon
195, Boehringer Mannheim) bedeckt und die T-CD8+-Lymphozyten werden
unter Anwesenheit von antigenischen Peptiden hinzugefügt. Das
abgeson derte TNF-α wird
mit einem anti-TNF-α-Antikörper von
Kaninchen (Serotec, Oxford, UK), einem anti-IgG-Antikörper von
Kaninchen gekoppelt mit dem Biotin (Boehringer, Mannheim) und dem
Komplex Biotin-Avidin-Peroxidase (Vector, Burlingame, CA) nachgewiesen.
Die Anzahl und die Oberfläche
der Zonen, wo das Cytokin vorhanden ist, werden automatisch durch
den Rechner bestimmt (Herr et al, 1997). Andere Dokumente, wie Herr
et al (1996) Abschnitt Materialien und Verfahren, Absatz 2, Seiten
132 bis 135, und Scheibenbogen et al (1997) Seite 933, beschreiben
dieses Verfahren und werden in die Beschreibung durch Bezugnahme
ebenso eingebracht.
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Die
Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweis von Mutationen
oder punktuellen künstlichen Änderungen,
die geeignet sind, die Immunogenität der mutierten Peptidzusammensetzungen
zu erhöhen,
die eine Aminosäuresequenz
enthalten, die wenigstens eine Mutation oder Änderung gegenüber der
natürlichen humanen
hsp70-Sequenz hat und wenigstens 80% Homologie in Bezug auf diese
Sequenz hat, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass
es die folgenden Schritte enthält:
- a) Bestimmung der Fragmente des humanen hsp70
von ungefähr
9 bis 10 Aminosäuren,
die eine Verankerung für
ein gegebenes HLA-Molekül
besitzen,
- b) Einbringung einer Mutation oder einer zusätzlichen punktuellen Änderung
im Bereich der Reste 4, 5, 6, 7 oder 8,
- c) Bestimmung der Immunogenität der Peptidfragmente, die
im Schritt (b) erhalten worden sind.
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Vorzugsweise
besteht der Schritt (c) in einem Elispot-Test.
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Dieses
Verfahren ist dem Fachmann gut bekannt. Man kann insbesondere durch
Bezugnahme die Lehren, die sich auf der folgenden Internet-Adresse
finden, in die Beschreibung einbringen:
www.bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/
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Dieses
Verfahren erlaubt die Bestimmung aller Mutationen oder punktueller,
künstlicher Änderungen (nicht
in menschlichen Tumoren vorhanden), die geeignet wären, das
aktive Prinzip zu verbessern (das immunogene, mutierte Peptid),
indem die "reverse
Immunologie" genannte
Methode eingesetzt wird. Ausgehend von der Kenntnis der Aminosäurensequenz
eines Proteins, wie hsp70, ist es möglich, vorherzusagen, welches die
Peptide sind, die sich an eine HLA-Tasche, was auch ihre Spezifität (HLA-A2,
HLA-A1, HLA-B7 ...) sei, binden können, dann diese Peptide in
vitro auf ihre Fähigkeit,
sich wirksam an die betrachtete HLA-Allele zu binden, zu testen,
dann eine Mutation oder eine punktuelle Änderung an den Aminosäuren an
bestimmten, für
die Affinität
kritischen Positionen einzubringen. Das Informatikprogramm BIMAS
erlaubt es, eine solche Vorhersage zu erhalten. Allgemeine Regeln
betreffend die Aminosäuren,
die bei der Verankerung mit HLA-Molekülen impliziert sind, sind in
Parker et al (1992 und 1994) und Rammensee et al (1995) dargestellt.
Diese Informationen sind durch Bezugnahme in die Beschreibung eingebracht.
Selbstverständlich
ist das Verfahren gemäß der Erfindung
nicht auf die Verwendung des Programmes BIMAS beschränkt und
kann mit jedem äquivalenten Programm
durchgeführt
werden.
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Ein
anderes Ziel der Erfindung betrifft eine Peptidzusammensetzung,
die ausgehend von einem Verfahren, wie oben beschrieben, erhalten
werden kann. Diese Zusammensetzung ist dadurch gekennzeichnet, dass
sie eine Sequenz von wenigstens 8 Aminosäuren, abgeleitet von hsp70,
besitzt, dass sie wenigstens eine Mutation oder eine Änderung
gegenüber
der natürlichen
Sequenz des hsp70 aufweist und dass sie eine spezifische T-Antwort
mit sich bringt.
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Ein
besonderes Ziel betrifft eine Peptidzusammensetzung, die mindestens
80% Homologie mit den Aminosäuren
zwischen den Positionen 286 und 294 des hsp70 hat.
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Vorzugsweise
ist die Aminosäure
an der Position 293 Isoleucin, Leucin, Valin, Alanin, Glycin oder
Phenylalanin, besonders bevorzugt Isoleucin. Diese bevorzugten Peptidzusammensetzungen
der Erfindung haben wenigstens eine der folgenden Sequenzen:
- – SEQ
ID Nr. 1: 286SLFEGIDIY294
- – SEQ
ID Nr. 2: 286SLFEGIDIYT295
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Die
genannten Zusammensetzungen können
auch nichtnatürliche
Aminosäuren
aufweisen, die zu natürlichen
Aminosäuren äquivalent
oder nicht sein können.
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Man
versteht unter "Peptidzusammensetzung" ein Gebilde, das
wenigstens durch ein Peptidfragment von hsp70, wie oben definiert,
oder durch ein Folgeprodukt der genannten Peptidfragmente gebildet
wird und eventuell ein oder mehrere andere von natürlichen
oder nichtnatürlichen
Aminosäuren
verschiedene Elemente hat. Diese Elemente haben den Zweck, die peptidischen
Fragmente chemisch oder physikalisch zu schützen und/oder ihre Absorption
durch den Organismus und/oder ihre Verabreichung und/oder ihre Bioverfügbarkeit zu
begünstigen.
Z. B. erlaubt dieser Schutz den Peptiden ihre Ziele zu erreichen,
ohne sich der Wirkung verschiedener Proteasen, die im Organismus
vorhanden sind, zu unterwerfen. Solche chemischen Modifikationen können auch
die Affinität
eines antigenischen Peptids für
die HLA-A2-Moleküle
erhöhen
und eine erhöhte
Wirksamkeit des Impfstoffes in vivo erlauben, Rosenberg et al (1998).
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Diese
Elemente können
z. B. sein:
- – Dem Fachmann bekannte chemische
Schutzgruppen, die an NH2- und/oder COOH-Enden eines Peptids reagieren,
wobei diese Änderung
den immunogenischen Charakter des Peptids nicht wesentlich vermindert.
- – Chemische
Gruppen, die die Wirksamkeit des Impfstoffes in vivo verbessern.
- – Lipide
oder Fettsäuren,
die man in kovalenter Weise an die Peptidfragmente anhängt, um
Lipopeptide genannte Peptidzusammensetzungen zu bilden. Die Palmitinsäure ist
ein Beispiel unter anderen, Vitiello et al (1995), durch Bezugnahme
in die Beschreibung eingebracht.
- – Ein
Trägerprotein
für die
Peptidfragmente, das Restriktionsstellen hat und es erlaubt, die
Peptidfragmente intakt bis zu den Stellen ihrer Wirksamkeit im Organismus
zu senden.
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Ein
zweites Ziel der Erfindung betrifft die DNA-Fragmente, die für die obengenannten
Peptidfragmente kodieren. Man versteht unter "DNA-Fragmente" Einzelstrang-, Doppelstrang-, DNA-,
cDNA- und/oder RNA-Fragmente. Die Nukleotidsequenz, die der Aminosäurensequenz
der Peptidfragmente entspricht, kann derart variieren, dass sie
jegliche verschiedene Codons enthält, die für eine gegebene Aminosäure nach
dem Prinzip des degenerierten genetischen Codes möglich sind.
Die vorliegende Erfindung hat als Gegenstand auch einen Expressionsvektor
eines Peptidfragmentes, der ein obengenanntes DNA-Fragment enthält, das
mit einem starken Promotor fusioniert und in den eukaryotischen
Zellen und/oder in den prokaryotischen Zellen, insbesondere in Humanzellen,
wirksam ist. Der Vektor kann viral, plasmidisch oder ein Pseudovektor
sein und kann Auswahlmarker enthalten und immunologische Adjuvantien,
wie Cytokine und/oder Lymphokine, exprimieren.
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Die
Erfindung betrifft auch dendritische Zellen, die mit Peptidzusammensetzungen
beladen sind, und dendritische Zellen, die durch den Expressionsvektor
transformiert sind, der die Peptidfragmente exprimiert. Diese Zellen
können
auch Makrophagen sein. Nestle et al (1998) beschreibt eine Impfmethode,
die darin besteht, dendritische Zellen, die einem Patienten entnommen
wurden, mit antigenischen Peptiden (in einer in vitro-Kultur) zu
beladen und sie in das Lymphsystem desselben Patienten zu injizieren.
Diese Veröffentlichung ist
durch Bezugnahme in die Beschreibung eingebracht.
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Ein
anderes Ziel der Erfindung hat als Gegenstand eine pharmazeutische
Zusammensetzung, die eine Peptidzusammensetzung oder eine Mischung
von Peptidzusammensetzungen gemäß der Erfindung
und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält. Diese Zusammensetzung kann
unter anderem eine oder mehrere immunologische Adjuvantien, insbesondere
zytotoxische Tumorfaktoren enthalten.
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Die
Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die
einen Expressionsvektor, wie er oben erwähnt wurde, und einen pharmazeutisch
akzeptablen Träger
oder ein DNA-Fragment gemäß der Erfindung
oder auch noch die oben angegebenen Zellen und einen pharmazeutisch
akzeptablen Träger enthält.
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Ein
zusätzliches
Ziel der Erfindung betrifft ein Kombinationsprodukt, das wenigstens
eine Peptidzusammensetzung gemäß der Erfindung
und wenigstens ein zellstressinduzierendes Mittel für eine simultane, getrennte
oder gestaffelte Anwendung im Zeitraum einer Krebsbehandlung enthält. Vorzugsweise
ist das Mittel geeignet, eine Überexpression
von Hitzeschockproteinen, insbesondere hsp70 zu induzieren. Vorteilhafterweise
ist das Mittel ein Apoptoseinduktor, der insbesondere aus den Mitteln,
die DNA schädigen,
den Liganden des Glucocortocoidrezeptors oder den proapoptotischen
Secondmessengern ausgewählt
ist.
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Das
Kombinationsprodukt kann einen viralen Vektor enthalten, der ein
Gen besitzt, das für
ein Enzym kodiert, das die Aktivierung der pro-apoptotischen Mittel
erlaubt, insbesondere die Thymidinkinase.
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Man
bezeichnet mit "zellstressinduzierendes
Mittel" alle Mittel,
die geeignet sind, eine Überexpression von
Hitzeschockproteinen, insbesondere hsp70 zu induzieren. Diese Mittel
können
insbesondere Apoptoseinduktoren sein. Man versteht unter "Apoptoseinduktormittel" alle Substanzen,
die direkt oder indirekt die Lebensfähigkeit einer Zelle angreifen.
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Das
genannte Apoptoseinduktormittel der vorliegenden Erfindung kann
insbesondere aus Mitteln, die die DNA schädigen, Liganden des Glucocorticoidrezeptors
oder den pro-apoptotischen Secondmessengern ausgewählt werden.
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Diese
Mittel können
vorzugsweise unter jenen ausgewählt
werden, die üblicherweise
in der Behandlung von Krebs eingesetzt werden. Der pro-apoptotische
Secondmessenger wird insbesondere aus den folgenden Zusammensetzungen
ausgewählt:
- – den
Derivaten der Glucocorticoide,
- – unter
den Alkylierungsmitteln, wie Chlorethylamin, z. B. das Cyclophosphamid,
- – den
Platinkomplexen, z. B. das Cisplatin,
- – den
Derivaten des Ethylen-imin, der Dimethan-sulfonoxy-alkane,
- – den
Derivaten des Piperazin,
- – unter
den Inhibitoren der Topoisomerasen, wie den Inhibitoren der Topoisomerase
2, z. B. die Anthracykline, das Epipodophyllotoxin, wie das Etoposid,
die Inhibitoren der Topoisomerase 1, z. B. die Derivate des Camptothecin,
- – unter
den Antimetaboliten, wie die Antifolate, z. B. Methotrexat, die
Antipurine, z. B. das 6-Mercaptopurin, die Pyrimidinanaloga, z.
B. das 5-Fluoruracil,
- – unter
den Antimitotika, wie die Vinca-alkaloide, die Taxoide, wie das
Taxoter,
- – und
unter den verschiedenen Zytostatika, wie das Bleomycin, das Dacarbazin,
das Hydroxycarbamid, die Asparaginase, das Mitoguazon, das Plicamycin.
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Diese
antineoplastischen Mittel sind in Actualite Pharmaceutiques Nr.
302 (Okt. 1992), Seiten 38 bis 39 und 41 bis 43, beschrieben, die
durch Bezugnahme in die Beschreibung aufgenommen sind.
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Man
kann die Apoptoseinduktormittel auch unter den zur Strahlenbehandlung
verwendeten Gammastrahlen, dem Etoposid, dem Doxorubicin, dem Dexamethason,
dem Ceramid, wie dem Ceramid C8, dem Lonidamin auswählen. Einige
der genannten Antikrebsmittel sind ausführlicher in der
US 5 260 327 , die die Verwendung des Lonidamin
für die
Behandlung von Metastasen beschreibt, in der JO 5017353, die die
Verwendung des Londidamin in Verbindung mit anderen Antikrebsmitteln
betrifft, und in der
EP 291151 ,
die die Verwendung der Derivate des Phlorizin beschreibt, beschrieben.
Diese Dokument sind durch Bezugnahme in die Beschreibung aufgenommen.
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Das
Produkt gemäß der vorliegenden
Erfindung kann auch einen viralen Vektor enthalten, der ein Gen besitzt,
das für
ein Enzym kodiert, das es erlaubt, die obengenannten Zusammensetzungen
und/oder Mittel zu aktivieren, z. B. die Thymidinkinase. Zahlreiche
Patente betreffen die Verwendung von Suizidgenen, die in speziellen
Geweben aktiviert werden, insbesondere um Krebszellen für Nukleotidanaloga
zu sensibilisieren. Unter diesen Dokumenten, die durch Bezugnahme
in die Beschreibung aufgenommen werden, findet man:
EP 494 776 ,
EP 690 129 ,
EP 657 540 und
EP 657 541 , die insbesondere die Herstellung
eines Medikamentes betreffen, das einen Vektor enthält, der
ein Gen besitzt, das fähig
ist, den Übergang
einer Prodroge in eine aktive Substanz zu katalysieren. Insbesondere
hat die
EP 657 539 die
Verwendung des Gens der Thymidinkinase mit einer Zellspezifität zur Behandlung
von Krebs zum Gegenstand.
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In
einer anderen Ausführungsform
ist das zellstressinduzierende Mittel aus Verbindungen ausgewählt, die
eine Tumorhypoxie induzieren, insbesondere aus den Angiogeneseinhibitoren.
Man kann besonders das Endostatin und das Angiostatin, beschrieben
durch J. Folkman, die Thrombospondine-1 und -2 (TSP-1, -2), Locopo
et al (1998); die IFN-Gamma-, TNF-Alpha- und IL-1Alphafaktoren,
Maier et al (1999), U-995,
ein Inhibitor, der aus Haifischknorpel stammt, Sheu et al (1998),
zitieren. Diese Veröffentlichungen,
die Zeitschrift über natürliche Inhibitoren,
Paper et al (1998), und die allgemeine Zeitschrift über die
verschiedenen bekannten Inhibitoren, Harris et al (1998) sind durch
Bezugnahme in der Beschreibung eingebracht.
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Die
pharmazeutische Zusammensetzung oder das Kombinationsprodukt gemäß der Erfindung
kann unter anderem eine oder mehrere immunologische Adjuvantien
enthalten, insbesondere zytotoxische Tumormittel. Diese Produkte
können
einen pharmazeutischen Träger
enthalten, der mit einer IV-, Subkutan-, Oral- oder Nasalverabreichung
kompatibel ist, insbesondere ausgewählt unter den Liposomen, den
Nanopartikeln oder den Lipidemulsionen, die positiv oder negativ
geladen sind.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Peptidzusammensetzung
gemäß einem der
Ansprüche
7 bis 9 für
die Herstellung eines Medikamentes, das zur Behandlung von Krebs
bestimmt ist, im Speziellen von soliden Tumoren, insbesondere Karzinomen,
Melanomen, Neuroblastomen, Krebs im Hals und im Kopf, vorzugsweise
von Nierenkarzinomen. Dieses Medikament kann für eine Immunisierung ex situ oder
in situ bestimmt sein. Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der Peptidzusammensetzung
zur Vergrößerung der
Population der CTL der Tumore im Kulturmilieu und/oder die Induktion
der Sekretion zytotoxischer Faktoren, wie z. B. IL-2, IFN-γ und TNF
durch die genannten CTL und/oder zur Stimulation der Immunabwehr,
insbesondere durch Vergrößerung der
Population des CTL der Tumore und/oder die Induktion der Sekretion
der zytotoxischen Faktoren, wie z. B. IL-2, IFN-γ und TNF durch die genannten
CTL.
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Selbstverständlich kann
man die Zusammensetzungen und Produkte der Erfindung in Kombination
mit Strahlentherapie verwenden.
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Vorteilhafterweise
kann man die Zusammensetzungen und Produkte der Erfindung verwerten,
um eine wiederholte Immunisierung zu bewirken in Hinblick darauf,
einen Toleranzbruch gegen das entsprechende (nichtmutierte) natürliche Peptid
bei einem Patienten hervorzurufen. Tatsächlich, in dem Wissen dass
hsp70 in Tumoren überexprimiert
ist oder sein kann, ist es jedenfalls interessant, Patienten gegen
dieses Protein immunisieren zu können.
Eine Immunisierung mit mutierten Peptiden dieses Proteins ist geeignet,
die Toleranz des Immunsystems der Patienten gegenüber hsp70
zu brechen und infolgedessen spezifisch die zytotoxischen und Helfer-T-Lymphozyten gegen
die Krebszellen zu stimulieren, unabhängig vom Typ des Krebses oder
des Patienten.
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Ein
zusätzlicher
Aspekt der Erfindung betrifft ein Herstellungsverfahren für Antikörper, die
sich an einen Mutanten des hsp70, insbesondere an den Mutanten hsp70-2
I-293 binden, wobei die Schritte bestehen aus:
- a)
Immunisieren eines Säugetieres
mit einer Peptidzusammensetzung gemäß der Erfindung,
- b) Isolieren eines monoklonalen Antikörpers, der sich an hsp70-2-293,
insbesondere an hsp70-2 I-293, in einem immunologischen Test bindet.
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Die
vorliegende Erfindung enthält
auch einen monoklonalen Antikörper,
der sich an hsp70-2-293, insbesondere an hsp70-2 I-293, bindet und
ein Verfahren zur Auffindung der Mutation oder der Änderung
des hsp70-2-293, insbesondere der Mutation oder der Änderung
hsp70-2 I-293, wobei die Schritte bestehen aus:
- a)
in Kontakt bringen einer von einem Individuum entnommenen Probe
mit einem monoklonalen Antikörper,
- b) Zulassen der Bildung eines Komplexes Antikörper-hsp70-2-293,
- c) Auffinden von hsp70-2-293 mittels eines auffindbaren Markers
in dem Komplex oder der sich an den Komplex bindet.
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In
einer zusätzlichen
Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung einen Diagnosekit, der insbesondere
einen oder mehrere der genannten Antikörper enthält. Dieser Kit kann insbesondere
für den
Nachweis von Krebs und für
die Prognose von Krebs, der in einem Individuum gefunden wurde,
dienen. Schließlich
hat die Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung zum
Gegenstand, die einen oder mehrere der genannten, monoklonalen Antikörper und
einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält. Die vorliegende Erfindung
betrifft auch die Verwendung der obengenannten, pharmazeutischen
Zusammensetzung in der Medizin zur Herstellung eines Medikamentes,
insbesondere für
die Behandlung von Krebs, im Speziellen für die Behandlung von soliden
Tumoren, vorteilhafterweise von Karzinomen, Melanomen, Neuroblastomen,
Krebse im Hals oder im Kopf, vorzugsweise Nierenkarzinome.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Der
Gegenstand der vorliegenden Erfindung erlaubt also das Stimulieren
der Immunabwehr durch Vergrößerung der
Population der tumorspezifischen CTL und durch Induktion der Sekretion
zytotoxischer Faktoren durch die genannten CTL. Eine solche Amplifikation
der spezifischen CTL führt
zu einer Mitnahme und einer Vergrößerung einer echten Armee an
Zellen, die die Tumore zerstören.
Tatsächlich
spielen die zytotoxischen T-Lymphozyten eine besondere Rolle bei
der Erkennung der Antigene und dringen selbst in solide Tumore ein.
Die Aktivität
der CTL besteht im Erkennen des Antigens, das mit den Molekülen der
Klasse 1 des syngenen MHC assoziiert ist. Die CTL und die Zielzelle
bilden dann eine Verbindung durch die Assoziation TCR-CD8 an MHC 1.
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Die
Schritte des Mechanismus der Zytotoxizität sind die folgenden:
- – Erkennen,
hochspezifische Bindung und Bildung eines ternären Komplexes TCR-CD8-MHC 1
(antigenes Peptid),
- – Sekretion
des Perforin und verschiedener Enzyme in Richtung der Membran der
Zielzelle durch die CTL,
- – Bildung
von Kanälen
in der Membran der Zielzelle durch Polymerisation des Perforin durch
ein Enzym unter Vorhandensein von Calcium (polyperforine Kanäle),
- – Durchgang
von Proteasen und Toxinen durch die Kanäle und Wirkung im Inneren der
Zielzelle,
- – andere
toxische Faktoren, wie das TNF-α,
das Lymphotoxin (TNF-β)
und das IFN-γ,
die durch die CTL freigesetzt wurden, fixieren sich auf den spezifischen
Rezeptoren der Membran der Zielzelle. Man beobachtet dann eine Apoptose,
gekennzeichnet durch die Auflösung
der DNA mit den Pickeln der zytoplastischen Membran mit dem Zerfall
der Zelle in kleine Fragmente (apoptopische Körper).
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Ein
Gegenstand der Erfindung ist es also, dem Organismus ausreichende
Mengen der Peptide mit potentieller, immunogenischer Kraft und spezifisch
für Tumore
zu liefern. Solche Peptidfragmente sind sehr selten und unter einer
Unendlichkeit von Peptiden verstreut und schwierig zu identifizieren.
Tatsächlich
befindet sich die Bindung der Peptide mit dem MHC-Molekül in einer
Einstülpung
der Topologie und unter präzisen
physikochemischen Eigenschaften, die entsprechend der Natur der
eingesetzten Aminosäuren
variieren. So bindet sich ein Peptid (ungefähr 9 Aminosäuren) an MHC, abhängig von
der Natur dieser Seitenketten und seiner Komplementarität mit der
Kavität
des MHC-Moleküls.
Diese Anbindung an MHC findet in besonderen interzellularen Organismen
statt. Die antigenen Proteine werden im allgemeinen in den Proteasomen
(ubiquitäre,
multikatalytische Proteinasekomplexe) vor dem Transport der genannten
Peptide in das raue, endoplasmatische Retikulum (RER) zu Peptiden
degradiert. Die Synthese des MHC 1 und das Zusammensetzen mit den
Peptiden vor Ort im RER. Dann werden die Antigen-MHC 1-Komplexe
an die Oberfläche
der Zellen exportiert, indem sie den Golgi-Apparat durchsetzen.
Man versteht daher, warum nur bestimmte Peptide sich an MHC 1 binden
können.
Was die Peptide der vorliegenden Erfindung betrifft, hat man gezeigt
(siehe unten), dass sie eine sehr geringe Dissoziationkonstante
Kd (sehr starke Anbindung) enthalten. In diesem Sinne ermöglichen sie
die wirksame Aktivierung des Immunsystems, insbesondere der CTL.
-
Die
RCC spezifischen CTL können,
ausgehend von im Tumor eines Patienten infiltrierten Lymphozyten
(TIL), isoliert werden. Wenigstens 80% der TIL von RCC sind aktivierte
CD8+ DR+ LAG-3+-Zellen, Angevin et al (1997). Infolge einer
kurzen Aktivierung in vitro dieser TIL wird eine Antwort vom polarisierten
Typ Th1 beobachtet (Sekretion von IL-2 und Interferon γ, aber nicht
von IL-4). Im Gegenzug hat Finke et al (1993) veröffentlicht,
dass das Fehlen sichtbarer Aktivität der TIL in vivo im schlechten
Funktionieren der verschiedenen Regulationskaskaden in diesen Zellen
begründet
ist. Allerdings ist unter den 5 CTL, die in der vorliegenden Erfindung
beschrieben sind, der Klon 2A11 (TCRBVIJIS6) besonders interessant,
da er an der Stelle des Tumors amplifiziert wird und bis zu 3% TCR α/β+ TILs
zeigt. Zusätzlich
erkennt dieser Klon ein tumorspezifisches Antigen, das durch das
HLA-Cw16 gezeigt wird, Angevin et al (1997). Dies demonstriert also,
dass die HLA-C-Moleküle
fähig sind,
Elemente an der Stelle des Tumors beim Patienten zu zeigen.
-
hsp70
wird durch den Doppellocus (hsp70-1, hsp70-2) kodiert, der in der
Region MHC bei 92 Kb des Gens C2 in Richtung des Telomers lokalisiert
ist, Milner et al (1990). Dieses DNA-Segment wird Region der Klasse
IV genannt und enthält
wenigstens 7 Gene, die bei Entzündungs-
und Stressantworten einbezogen werden, Gruen (1997). Die beiden
Gene ohne Intron (hsp70-1 und hsp70-2) kodieren für ein identisches
Protein mit 641 Aminosäuren.
Es gibt einige Unterschiede in den Sequenzen im Promotorbereich
und eine vollständige
Divergenz in der nichtübersetzten
3'-Region. Bei Verwendung
einer hsp70-2 spezifischen Sonde hat man eine Erhöhung der
mRNA-Menge (2,4 Kb) infolge eines Hitzeschocks gezeigt. Die hsp70-2-Sonde
erlaubt den Nachweis einer geringen Menge mRNA von 2,4 Kb in der
konstitutiven RNA der Zelllinien des RCC-Tumors und in den chirurgischen
Gefrierproben des genannten Tumors. Der Grund, aus dem die allogene
Zelllinie HLA-A2+ RCC, die auf geringen
Niveaus mRNA-hsp70-2 exprimiert, nicht durch CTL 11C2 getötet wird, kann
die während
der Zielsensibilisierungsversuche (Target Sensitization Assays)
beobachtete Differenz zwischen den mutierten Peptiden und dem Wildtyp-Decapeptid
286–295
(5 × 10–11 M
und 5 × 10–8 M
jeweils für die
halbe maximale Lyse) sein. Die Transkription und die Überexpression
von hsp70-2 Wildtyp in den COS-7-Zellen induziert die Sekretion
des TNF durch CTL 11C2.
-
Man
weiß,
dass die hsp nicht polymorphe Moleküle sind, die sich in ihrer
primären
Struktur nicht von den normalen Geweben oder den Krebsen oder von
den normalen Zellen und den durch Viren infizierten Zellen unterscheiden.
Die Fähigkeit
zur Immunisierung der hsp enthaltenden Zusammensetzungen ist in
der Anbindung der hsp-Moleküle an die
Peptide begründet,
die durch die Zellen erzeugt wurden, in welchen die hsp isoliert
wurden. Tatsächlich
können
die hsp-Peptidkomplexe in vitro generiert werden und die biologische
Aktivität solcher
Komplexe ist mit jenen der in vivo generierten hsp-Peptid-Komplexe
vergleichbar, Blachere et al (1997). Wenn diese Beobachtung zeigt,
dass die hsp Adjuvantien sind, die eine Antwort der CD8+ T-Zellen
ans Licht bringen, so deuten unsere Resultate daraufhin, dass bestimmte
Peptidfragmente des hsp70 direkt immunogen sind.
-
Im
Folgenden der Beschreibung und für
die Beispiele wird auf Figuren Bezug genommen, deren Legende unten
angegeben ist.
-
Legenden
-
1: Spezifische, lytische Aktivität des Klon
11C2 gegen die autologe Zelllinie RCC-7
-
Die
Zytotoxizität
der CTL-11C2 gegenüber
der Zelllinie RCC-7 wurde durch einen Standardversuch der Chromabgabe
(chromium release assay) bei verschiedenen Verhältnissen Wirkstoff/Ziel (ration
E/C) getestet. Die Hemmung der zytotoxischen Aktivität des 11C2
wurde nach mehreren Preinkubationen der CTL während zwei Stunden mit dem
angegebenen mAb (monoklonalen Antikörper) der Klasse 1 anti-HLA bei einer vorgegebenen
Sättigungskonzentration
getestet. 1 stellt den
Prozentsatz der spezifischen Lyse als Funktion des Verhältnisses
Wirkstoff/Ziel dar. Die Kurve mit den schwarzen Quadraten entspricht
der Zytotoxizität der
CTL-11C2, die nichtvorbereitend mit dem monoklonalen Antikörper inkubiert
wurden gegenüber
der Zelllinie RCC-7; die Kurve mit den weißen Kreisen entspricht der
Zytotoxizität
der CTL-11C2, die vorbereitend mit dem monoklonalen Antikörper W6-32
mAb inkubiert wurde gegenüber
der Zelllinie RCC-7; die Kurve mit den weißen Dreiecken entspricht der
Zytotoxizität
der CTL-11C2, die vorbereitend mit dem monoklonalen Antikörper B1.23.2
mAb inkubiert wurden gegenüber
der Zelllinie RCC-7; die Kurve mit den weißen Rauten entspricht der Zytotoxizität der CTL-11C2,
die vorbereitend mit dem monoklonalen Antikörper MA2.1 mAb inkubiert wurden
gegenüber
der Zelllinie RCC-7.
-
2: Sekretion von TNF durch den Klon CTL-11C2
während
der Stimulation mit der autologen Zelllinie RCC-7
-
5
000 CTL wurden mit 20 000 RCC-7-Zellen inkubiert. Die Menge an TNF
wurde nach 20 Stunden Kultur gemessen, indem die Toxizität der Überstände mit
WEHI-164-Zellen
(Klon 13), die sensibel für
TNF sind, getestet wurde. Die Hemmung der Sekretion von TNF wurde
nach Preinkubation des Klons 11C2 während zwei Stunden mit dem
mAb-anti-HLA der Klasse 1, wie angegeben, getestet. Diese Figur
stellt die Menge an abgesondertem TNF (in pg/ml) durch den Klon
CTL-11C2 dar. Die erste Säule
(weiß)
entspricht dem Milieu (Kontrolle); die zweite Säule (schwarz) entspricht den
RCC-7-Zellen bei Vorhandensein von CTL, die nicht mit monoklonalem
Antikörper
preinkubiert wurden; die dritte Säule (weiß) entspricht den RCC-7-Zellen
bei Vorhandensein von CTL, die mit monoklonalem Antikörper W6-32
mAb preinkubiert wurden; die vierte Säule (diagonale Schraffuren)
entspricht RCC-7-Zellen bei Vorhandensein von CTL, die mit monoklonalem
Antikörper MA2.1
mAb preinkubiert wurden; die fünfte
Säule (horizontale
Schraffuren) entspricht RCC-7-Zellen bei Vorhandensein von CTL,
die mit monoklonalem Antikörper
B1.23.2 mAb preinkubiert wurden.
-
3: Zytotoxizität der CTL-11C2 auf mehreren
allogenen RCC-Zelllinien
-
11C2
wurde an der autologen Linie RCC-7 und an mehreren allogenen RCC-Zelllinien (RCC-8, RCC-9,
RCC-10 und RCC-11) während
eines Standardversuches zur Chromabgabe beim angegebenen E/C-Verhältnis getestet.
Die HLA-Moleküle,
die mit RCC-7 gemeinsam sind, sind in Klammern angegeben. Diese
Figur stellt den Prozentsatz der spezifischen Lyse als Funktion
des Verhältnisses
Wirstoff/Ziel dar. Die Kurve mit durchgezogener Linie mit den schwarzen
Quadraten entspricht der Linie RCC-7 (deren HLA-Moleküle A2, A29,
B44, B51, Cw15 und Cw16 sind); die strichlierte Kurve mit den weißen Kreisen
entspricht der Linie RCC-8 (wobei die mit RCC-7 gemeinsamen HLA-Moleküle A2, A29,
B44 und Cw16 sind); die strichlierte Kurve mit den weißen Rauten
entspricht der Linie RCC-9 (wobei die mit RCC-7 gemeinsamen HLA-Moleküle A29 und
Cw16 sind); die strichlierte Kurve mit den weißen Dreiecken entspricht der
Linie RCC-10 (wobei die mit RCC-7 gemeinsamen HLA-Moleküle A29,
B44 und Cw16 sind); die strichlierte Kurve mit den weiß karrier ten
Quadraten entspricht der Linie RCC-11 (wobei die mit RCC-7 gemeinsamen
HLA-Moleküle
A29 sind).
-
4: Stimulation von CTL-11C2 durch die
Zellen, die in transitorischer Weise mit der autologen HLA-A*0201 cDNA und cDNA A18 co-transfektiert
wurden
-
Man
füllte
die CTL-11C2 48 Stunden nach der co-Transfektion auf. Das TNF, das
in den Überständen enthalten
war, wurde 20 Stunden später
abgeschätzt,
indem seine Toxizität
an WEHI-164(Klon 13)-Zellen getestet wurde. Die Stimulationszellen
enthalten die Zelllinie RCC-7 als positive Kontrolle und die COS-7-Zellen, die
nicht transfektiert oder nur mit HL*201
cDNA allein transfektiert sind, als negative Kontrolle.
-
5: Lokalisierung der epitopen Region
des hsp70-2 erkannt durch CTL-11C2
-
- (A) Die Gesamtlänge der hsp70-2 cDNA ist schematisch
in schwarz-weiß dargestellt.
5'UT und 3'UT entsprechen jeweils
den nichtübersetzten
5'- und 3'-Bereichen. Die kodierende
Region (in schwarz) beginnt mit der Anfangsstelle der Traduktion
(Codon ATG) und entspricht dem Nukleotid+1. Die verschiedenen gekürzten Klone,
die ausgehend von cDNA A18 erhalten wurden sind in grau dargestellt.
Die cDNA A18 beginnt beim Nukleotid 577 der kodierenden Region.
Das mutierte Nukleotid ist durch einen Stern (Position 877) gekennzeichnet;
- (B) zeigt die Stimulation des CTL-11C2 durch die COS-7-Zellen,
die vorübergehend
mit autologer HLA-A*0201 cDNA und mit jeder
der verschiedenen cDNA A18-Kürzungen
co-transfektiert wurden. Diese transfektierten Zellen wurden während 24
Stunden mit 5 000 CTL-11C2
inkubiert und die Menge an TNF wurde 20 Stunden später gemessen.
Die kontrollierten Stimulationszellen enthielten COS-7-Zellen, die nicht
transfektiert oder nur mit cDNA A18 alleine als negative Kontrolle
transfektiert waren und mit cDNA A18 und A*0201
als positive Kontrolle co-transfektiert waren.
-
6: Lyse der autologen Zelllinie, die
durch EBV transformiert und mit den durch hsp70-2 kodierten Peptiden inkubiert
wurde durch CTL-11C2
-
2
000 durch EBV transformierte Zellen, die mit Cr51 markiert
waren, wurden während
einer Stunde bei Vorhandensein von hsp70-2-Peptiden angegeben für verschiedene
Konzentrationen inkubiert. CTL-11C2 wurde dann auf ein Verhältnis Wirkstoff/Ziel (E/C)
von 31/1 ergänzt.
Die Abgabe von Chrom wurde 4 Stunden danach gemessen. Die Sterne
zeigen die mutierte Aminosäure
an. Diese Figur stellt den Prozentsatz der spezifischen Lyse als
Funktion der Konzentration der Peptide (in M) dar. Die Kurve mit
den schwarzen Quadraten entspricht dem Peptid SLFEGIDI*YT;
die Kurve mit den weißen
Quadraten entspricht dem Peptid SLFEGIDEYT; die Kurve mit den schwarzen
Dreiecken entspricht dem Peptid SLFEGIDI*Y;
die Kurve mit den weißen Dreiecken
entspricht dem Peptid SLFEGIDFY.
-
7: Induktion der Expression von HLA-A2
auf den Zellen T2 durch die antigenen Peptide des hsp70-2
-
Die
Zellen T2 wurden bei 26°C
während
16 Stunden im serumfreien Milieu mit und ohne Peptid bei einer Konzentration
von 20 μm
inkubiert. Dann wurden die Peptide neuerlich aufgefüllt und
bei 37°C
inkubiert. In Intervallen von 30 Minuten oder einer Stunde wurden
die Reste der Zellen gesammelt und die Änderung der Expression des
HLA-A2 wurde durch Flusszytometrie mit einem anti-HLA-A2 mAb (MA2.1)
analysiert. Die Aminosäurensequenzen
der Peptide sind dargestellt, die mutierte Aminosäure ist
durch einen Stern dargestellt. Diese Figur stellt die mittlere Fluoreszenz
als Funktion der Zeit dar. Die strichlierte Kurve mit den schwarzen
Quadraten entspricht dem Milieu (Kontrolle); die durchgezogene Kurve
mit den schwarzen Quadraten entspricht dem Peptid SFLEGIDIYT; die
durchgezogene Kurve mit den weißen
Quadraten entspricht dem Peptid SFLEGIDFYT; die durchgezogene Kurve
mit den schwarzen Dreiecken entspricht dem Peptid SFLEGIDIY; die durchgezogene
Kurve mit den weißen
Dreiecken entspricht dem Peptid SFLEGIDFY; die strichlierte Kurve
mit den weißen
Kreisen entspricht dem Peptid MART-126-35;
die strichlierte Kurve mit den weißen Rauten entspricht dem Peptid
LPRHPQELL (HLA-B7).
-
8: Northern Blot-Analyse
-
Die
gesamte zytoplastische RNA (15 μg),
erhalten vom Tumor RCC-7 (Ordnungsnr. 1), der Zelllinie RCC-7 (Nr.
2) und der autologen, durch EBV transformierten Zelllinie (Nr. 3)
wurde bei 37°C
gehalten (Unterordnung C) oder durch Hitzeschock während 2
Stunden bei 40°C
(Unterordnung HS) behandelt, wurde auf denaturierendem Agaroseformaldehydgel
fraktioniert und auf eine Nylonmembran Hybond-N+ transferiert. Der Northern
Blot wurde durch Sonden hybridisiert, die aus einem spezifischen
Fragment des hsp70 und der cDNA der Glyceraldehyd-3-phosphat-deshydrogenase
(GAPDH) gebildet wurden. Die Position der Migration der RNA 28s
und 18s ist dar gestellt. Das Transkript hsp70-2 von ungefähr 2,4 Kb
ist durch einen Pfeil über
der RNA 18s und der mRNA GAPDH angedeutet.
-
9: Elispot-Test
-
Diese
Figur zeigt, dass die Mutation oder Änderung eine sehr erhöhte Immunogenitätsstärke mit
sich bringt. Mutiertes hsp ist die Peptidzusammensetzung gemäß der Erfindung
(weiße
Säulen),
hsp nat ist das entsprechend natürliche
Peptid (nicht mutiert) (weiße
Säulen
mit schwarzen Rauten), MP ist die positive Kontrolle (sehr immunogenes
Peptid des Proteins "Matrixprotein") (schwarze Säulen) und
T2 ist die negative Kontrolle (nicht durch das Peptid stimulierte
Zellen) (schraffierte Säulen).
-
Die
Arbeiten der vorliegenden Erfindung haben die Isolation der Klone
CTL-RCC, die von TIL (in den Tumor eingedrungene Lymphozyten) erlaubt,
die während
drei verschiedenen Versuchen und unter Verwendung zweier Versuchsbedingungen
(Verwendung von IL-2 oder von IL-2 + IL-7 + IL-12) erhalten wurden.
Zwischen dem 20. und dem 30. Tag wurden die Zellen, die zu Kulturen
gehörten,
die eine bedeutende Lyse der autologen Zelllinie des Tumors RCC-7
zeigten, durch begrenzte Verdünnung
geklont. Auf 8 Klone, die durch dieses Protokoll erhalten wurden,
wurden 5 in Funktion ihres bestimmten TCR-Phenotyps behalten. Alle
Klone sind zytotoxische Zellen CD4– CD8+ TCR α/β+ und
erzeugen TNF, wenn sie durch autologe Zellen des Tumors stimuliert
werden. Der Blockiereffekt des anti-Klasse 1 mAb WC/32 hat gezeigt,
dass die zytotoxische Aktivität auf
MHC 1-Moleküle
(1) beschränkt ist.
Die lytische Aktivität
des Klons 11C2 wurde durch mAb MA2.1 spezifisch für HLA-A2
(2) blockiert. Dieses
Ergebnis deutet daraufhin, dass HLA-A2 das Molekül zur Darstellung für 11C2 ist
und dass 11C2 die autologen Zellen der Tumore erkennt (3).
-
Identifizierung der cDNA
des durch CTL-11C2 erkannten Antigens
-
Um
das Gen zu identifizieren, das für
das Antigen kodiert, verwendet man einen genetischen Zugang, der
die Transfektion einer cDNA-Bibliothek, die von einem RCC-Tumor stammt in COS-7-Zellen
mit der cDNA, die für
das HLA-A2-Molekül
für die
Darstellung kodiert, Seed B. (1987) enthält. Der verwendete Expressionsvektor
enthält
einen Replikationsursprung von SV40, was eine beachtliche Multiplikation
der Episomen des transfektierten Plasmid ermöglicht und dadurch eine erhöhte Expression
der transfektierten Gene. Man verwendete eine cDNA-Bibliothek, die
im Ex pressionsvektor pcDNA I aufgebaut war, indem man die von der RCC-7-Zelllinie
stammende RNA verwendet. Diese Bibliothek war in 400 Teile von 200
rekombinanten Plasmiden unterteilt und jeder Teil wurde doppelt
mit der Konstruktion pcDNA I HLA-A 0201 autolog in die COS-7-Zellen
co-transfektiert. Die COS-7-Zellen wurden dann auf ihre Fähigkeit
getestet, die Produktion von TNF durch den Klon 11C2 zu stimulieren.
Nach 48 Stunden wurden die co-transfektierten COS-7-Zellen über Nacht
mit 11C2 inkubiert und die Konzentration des TNF im Überstand
wurde durch seine zytotoxische Wirkung auf WEHI-Zellen bestimmt.
Die Menge des TNF in den Überständen war
unter 5 pg/ml, außer
für zwei Paare
(40 und 45 pg/ml), der Doppelexperimente. Das zweite Screening wurde
durchgeführt,
indem die COS-Zellen mit 100 Teilen von 20 rekombinanten Plasmiden
transfektiert wurden, die aus den positiven Doppeln extrahiert wurden.
Schließlich
hat uns ein drittes Screening zur Isolation von zwei cDNA-Klonen
(genannt A8 und B65) geführt,
die es ermöglichten
die Expression des Antigens in die COS-7 HLA-A*0201+-Zellen zu transferieren. Die mit dem Klon
cDNA A18 erhaltenen Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
-
Die
Sequenz der längsten
cDNA (A18) ist 1,9 Kb lang mit einer Homologie von 100% an den Nukleotiden
577 bis 2876 der cDNA des hsp70-2 mit Ausnahme einer Mutation an
der Position 877 (ein Adenin anstelle eines Thymin). Die Position
+1 ist die Anfangsstelle der Troduktion des hsp70-2, Milner et al
(1990).
-
Für das Ziel,
die gesamte Länge
der cDNA des hsp70-2 zu identifizieren und zu verifizieren, ob die Mutation
nur an der Tumorstelle vorhanden ist, wurde eine PCR (hsp70-2 ist
ein intronloses Gen) an der DNA durchgeführt, die aus der Extraktion
von RCC-7-Zellen und von durch EBV transformierten B-Zellen und
von PHA-Blasten stammt. Ein einzigartiges Produkt von 2 Kb entsprechend
dem Nukleotid –36 – 1974 wurde
in jedem der Fälle
erhalten und in den pcDNA I-Vektor zum Sequenzieren und für Expression
subgeklont. 4 von 7 DNA-Klonen, die ausgehend vom Fragment des Tumors
erhalten wurden, enthielten die Mutation. Bei den durch EBV transformierten
Zellen und den Blasten enthielt keine der analysierten 14 DNA-Sequenzen
die Mutation. Daher ist die Mutation nur in einem Chromosom in den
Tumorzellen vorhanden und fehlt in den normalen Zellen.
-
Identifikation des antigenischen
Peptids
-
Um
die minimale Nukleotidregion, die für das antigenische Peptid kodiert,
zu beschränken,
wurden verschiedene, gekürzte
cDNA, ausgehend vom Klon cDNA A18 erhalten. Die Verwendung von Exonuklease III
erlaubt progressiv Deletionen vom 3'-Ende
der cDNA zu erzeugen (5).
Diese cDNA-Fragmente wurden in COS-7-Zellen mit autologer NLA-A*0201
cDNA co-transfektiert. Eine minimale, kodierende Nukleotidregion wurde
zwischen den Nukleotiden 730 und 944 lokalisiert. Die Kürzung in
dem Bereich, der die einzigartige spezifische Mutation des Tumors
trägt,
beseitigt das Erkennen durch CTL 11C2. Man suchte nach Peptiden,
die das HLA-A*0201-Bindungsmotif in dieser Region tragen
und unter den 18 getesteten Peptiden trugen nur 2 (das Nonapeptid
SLFEGIDIY, Aminosäuren
286 bis 294 und das Decapeptid SLFEGIDIYT, Aminosäuren 286 bis
295) den Isoleucinmutationsrest an der Position 8 und wurden erkannt.
Die halbe Maximallyse wurde mit nur 5 × 10–11 M
des Decapeptid verglichen mit 5 × 10–7 M
des Nonapeptid (6) erhalten.
CTL 11C2 erkennt auch das wildtype Decapeptid 286–295 (SLFEGIDFYT)
mit einer halben Maximallyse mit 5 × 10–8 M
aber nicht das wildtype Nonapeptid 286–294 (6).
-
Bindung der Peptidfragmente
des hsp70-2 an HLA-A2
-
Die
antigenen Peptide, die HLA-A2 binden können, können die Expression der HLA-A2-Moleküle in den
T2-Zellen positiv steuern, Nijman et al (1993). Die Fähigkeit
der Bindung der Decapeptide 286–295
des hsp70-2 (mutiert oder wildtype) wurde mit jener des Nonapeptid
286–294
verglichen. Die Bindung der beiden Decapeptide ist über eine
Periode von 4 Stunden bei 20 μM
stabil, ohne einen Unterschied zwischen der mutierten und Wildtyp-Form
aufzuweisen (7). Die
hsp70-2-Nonapeptide sind weniger wirksam, aber ihre Bindung ist
mit jener des MART-127–35 an HLA-A2 vergleichbar.
Wie man erwarten konnte, wurde keine Wirkung für das Kontrollpeptid HLA-B7
beobachtet (siehe 7).
-
Northern Blot Analyse
-
Eine
hsp70-2 locusspezifische Sonde, enthaltend die nichtübersetzte
3'-Region, wurde
verwendet, um die Expression des hsp70-2-Gens zu untersuchen. Eine
mRNA von 2,4 Kb wurde in den autologen Zellen, die durch EBV transformiert
waren, nachgewiesen. Ebenso wurde ein geringes Expressionsniveau
in den nichtbehandelten RCC-7-Zellen und in den chirurgischen Gefrierproben
des RCC-7 beobachtet (8).
Die geringeren Expressionsniveaus wurden auch in anderen Tumoren,
insbesondere in den Melanomen, den Neuroblasten, den Adenokarzinomen
des Darms und den Fragmenten von Blasentumoren beobachtet.
-
Beispiel 1: Herstellung
der RCC-Zelllinien
-
Die
Zelllinien wurden, ausgehend von Nierenkarzinom-RCC-Zellen, wie
zuvor von Angevin et al (1997) beschrieben, hergestellt. Kurz gesagt,
wurden die Primärtumore
von nichtbehandelten Patienten erhalten, die sich einer radikalen
Nephraktomie an unserem Institut unterzogen haben. Der Patient 7
(HLA-A2, -A29 -B44, -B51 -Cw15, -Cw16) ist ein männliches Individuum von 54
Jahren mit einem metastasierenden RCC. Nach Chirurgie und enzymatischem
Abbau wurden die Suspensionen von frischen RCC-Tumorzellen in ein
Kulturmilieu, bestehend aus Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM),
Penizillin (50 IU/ml), Streptomycin (50 μg/ml), 1% L-Glutamin von 200
mM, 1% Natriumpyruvat von 200 mM, 10% fötales Kälberserum (FCS), und 1% Ultroser
G (Gibco-BRL, Paisley, UK) eingebracht. Dieses Milieu wird im Folgenden
im Dokument "RCC-Milieu" genannt. Alle Tumorzellenlinien
wurden in diesem RCC-Milieu erhalten. Die RCC-7-Zelllinie wurde
von einem Primärtumor
des Patienten 7 erhalten.
-
Beispiel 2: Zellen- und
Kulturmilieus
-
Die
autologe EBV-Zelllinie wurde nach Infektion des PBMC des Patienten
7 erhalten. Die durch EBV transformierte Zelllinie wurde in RPMI
1640 (Gibco-BRL) ergänzt
mit 10% FCS aufbewahrt.
-
Der
Klon 13 von WEHI-164, eine Zelllinie des Fibrosarcoms der Maus,
die sensibel für
TNF ist, wurde freundlicherweise von Benoit Van Den Eynde (Ludwig
Institute for Cancer Research, Brüssel, Belgien) zur Verfügung gestellt
und wurde zur Kultur in RPMI 1640 (Seromed, Biochrom KG, Berlin,
Deutschland) ergänzt
mit dem L-Glutamin,
dem Natriumpyruvat, Antibiotika und 5% des FCS in einer Konzentration
von 0,01 bis 0,05 × 106 Zellen/ml gegeben.
-
Die
mutierte Humanzelllinie CEM × 721.174.T2
(T2), Salter et al (1989) wurde in RPMI-1640 ergänzt mit 10% FCS aufbewahrt.
Diese Zelllinie wurde freundlicherweise von Pierre Langlade (Institut
Pasteur, Paris, Frankreich) zur Verfügung gestellt. Al le Zellkulturen
wurden in einer mit Wasser gesättigten
Atmosphäre
und mit einem 5%igen CO2-Gehalt aufbewahrt.
-
Beispiel 3: Herstellung
der TIL-Zelllinien
-
Die
TIL, die von Tumorsuspensionen stammen, wurden in Flaschen geimpft,
die RPMI 1640, das Penicillin, das Streptomycin, 1% L-Glutamin,
1% Natriumpyruvat und 8% humanes AB-Serum (Institut Jacques Boy
S. A., Reims, Frankreich), genannt vollständiges Milieu, enthielten.
Die TIL wurden in der gleichen Konzentration in das vollständige Milieu,
ergänzt
mit 10 IU/ml rIL-2, 50 IU/ml rIL-7 (Sanofi, Toulouse, Frankreich) und
10 IU/ml rIL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA) während drei
Tagen eingebracht. Ab dem 3. Tag wurden die TIL unter Verwendung
des vollständigen
Milieus mit 30 IU/ml rIL-2, 50 IU/ml rIL-7 und 10 IU/ml rIL-12 ernährt. Der
Phenotyp und die zytotoxische Aktivität der TIL-Zelllinien wurden
nach 14 und 21 Tagen Stimulation charakterisiert.
-
Beispiel 4: Monoklonale
Antikörper
(mAb), serologisches Mittel und Phenotypanalyse
-
Mit
Fluoreszin (FITC) oder Phycoerythrin (PE) verbundene mAb, die gegen
das TCR α/β, CD3 (Leu4), CD4
(Leu3a), CD8 (Leu8), CD80 (B7.1), HLA DR (L249) gerichtet sind,
wurden von Becton Dickinson (Mountain View, CA) gekauft. CD56 (NKH1A)
stammte von Coultronics (Hialeah, FL). Die TIL wurden durch Doppelimmunofärbung charakterisiert,
indem die Zellen für
30 mit bei 4°C
mit FITC- oder PE-mAb
inkubiert wurden. Die Flusszytometrieanalyse wurde auf einem FACScan
(Becton Dickinson) und unter Verwendung der Cellquestsoftware durchgeführt. Die
Ascitesflüssigkeiten
des Labors waren W6.32 (anti-HLA-A/B/C), MA2.1 (anti-HLA-A2 und
-B17) und B1.23.2 (anti-HLA-B/C) und wurden für funktionelle und Immunofluoreszenzversuche in
vorgegebenen Sättigungskonzentrationen
bis zu einer Endverdünnung
zwischen 1/200 und 1/2000 ausgewählt.
-
Beispiel 5: Klonen der
TIL-Zelllinien
-
Nach
3 Wochen Kultur wurden die Lymphozyten durch Verdünnen bis
ans Limit geklont. Das Klonen wurden zwischen 600 und 0,6 Zellen/Vertiefung
in Platten mit 96 Vertiefungen durchgeführt, die das RPMI-Milieu, ergänzt durch
8% humanes AB-Serum,
30 IU/ml rIL-2 und 3% TCGF, enthielten. Am Boden der Vertiefungen
hat man eine Nährschicht,
bestehend aus bestrahlten, autologen Tumorzellen (1 × 104/Vertiefung), bestrahlten allogenen Lymphozyten
(8 × 104/Vertiefung) und durch EBV transformierte,
bestrahlte Zellen (2 × 104/Vertiefung) kultiviert. Die Klone wurden
dreimal pro Woche mit dem vollständigen
Milieu, enthaltend rIL-2 und TCGF ernährt. Der immunologische Phenotyp
und die Zytotoxizität
wurden für
die geklonten Zellen charakterisiert.
-
Beispiel 6: Zytotoxizitätstest
-
Die
Zytotoxizitätstests
wurden durch ein Standardexperiment zur Freisetzung von Chrom während 4 Stunden,
wie zuvor von Angevin et al (1997) beschrieben, durchgeführt. Kurz
gesagt, wurden 2 × 103 mit Chrom 51 markierte Zielzellen für 4 Stunden
bei 37°C
Effektorzellen bei verschiedenen E/T-Verhältnissen in einem Endvolumen
von 200 μl
inkubiert. Zur Verhinderung der Lyse durch die mAb wurden die Zielzellen
für zwei
Stunden in Anwesenheit von Sättigungskonzentrationen
der mAb vor dem Hinzufügen
der Effektorzellen pre-inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden
40 μl des Überstandes
auf die Platten "Lumaplate
96 solid scintillation plates" (Packard
Instruments, Meriden, CT) transferiert, über Nacht getrocknet und in
einem Betastrahlungszähler
(Packard Instruments) gezählt.
-
Beispiel 7: Klonen und
Expression der HLA-Moleküle
-
HLA-Klasse
1 Allele wurden unter Verwendung des durch Ennis et al (1990) beschriebenen
PCR-Verfahrens mit einigen kleinen Änderungen geklont. Gesamt-RNA
wurde, ausgehend von der RCC-7-Zelllinie, unter Verwendung von RNAB (Bioprobe Systems) hergestellt. Der erste
cDNA-Strang wurde mit einer Oligo(dT)-Sonde und reverser Transkriptase
(Invitrogen) synthetisiert. Die cDNA diente als Schablone für eine PCR-Amplifikation
mit 30 Zyklen mit den folgenden Primern:
-
-
Diese
Primer entsprechen jeweils Sequenzen, die mit den nichtübersetzten
5'- und 3'-Bereichen der Klasse
1 Allele übereinstimmen.
Diese Primer sind identisch mit den Primern HLA-5P2 und HLA-3P2,
die von Ennis et al (1990) vorbeschrieben sind, bis auf die Klonstelle
(es wurden die Stellen Sal I und Hind III für 5P2 und Hind III und Xba
I für 3P2
ersetzt). Die PCR-Produkte wurden mit Hind III und Xba I verdaut
und in das Plasmid pcDNA I (Invitrogen) gebunden. Diese Konstruktionen
wurden im E. Coli MC 1061/P3 transfektiert. Die plasmidische DNA
wurde dann ausgehend von mehreren Kolonien unter Verwendung von
QIAGEN-Säulen
(Qiagen) extrahiert. DNA-Sequenzierung wurde unter Verwendung eines "ABI PRISM Dye Terminator
cycle sequencing ready reaction kit" (Applied Biosystems) und einem automatischen
DNA-Sequenzer durchgeführt. Die
Sequenzen wurden mit HLA Klasse 1 Nukleotidsequenzen von Spenderdatenbanken
verglichen.
-
Beispiel 8: Aufbau der
cDNA-Bibliothek
-
Poly(A)+ RNA wurde ausgehend von RCC-7-Zelllinien
unter Verwendung des mRNA-Isolationssystems
(Fast Track kit 2.0, Invitrogen) bei Berücksichtigung der Anleitungen
des Herstellers extrahiert. Der erste cDNA-Strang wurde unter Verwendung
der inversen Transkriptase AMV mit einem Oligo-dT-Primer synthetisiert,
der an seinem 5'-Ende
eine Not I-Stelle enthielt. Das RNA-cDNA-Hybrid, das durch die Synthese
des ersten Stranges erzeugt wurde, wurde durch DNA-Polymerase I
in Kombination mit Rnase H und von E. Coli-DNA-Ligase in cDNA-Doppelstrang
umgewandelt. Dann hat man DNA-Polymerase T4 verwendet, um einen offenen
Schnitt in der cDNA durchzuführen.
Die BstX I-Adaptoren wurden hinzugefügt und die Größe der cDNA wurde
durch Fraktionierung auf Agarosegel erhalten. Die cDNA mit der gewünschten
Größe (größer als
800 Nukleotide) wurde im Inneren eines pcDNA I-Vektors geschnitten durch BstX I/Not
I gebunden und der geeignete E. Coli-Stamm (MC1061/P3) wurde transformiert.
Für die
Screening-Versuche wurde die Plasmid-DNA, die von bestimmten Bakterienkolonien
erhalten wurde, gemäß dem folgenden
Protokoll vorbereitet: 100 oder 200 Kolonien, die im LB-Agar-Milieu
(mit 30 μl/ml
Ampicillin und 10 μl/ml
Tetracyklin) kultiviert waren, wurden in 2 ml des LB-Milieus eingebracht
und über
Nacht bei 37°C
inkubiert. Die Plasmid DNA wurde unter Verwendung des Alkalinlyse-Verfahrens
Birnboim et at. (1979) extrahiert und in 30 μl von 10 mM Tris-EDTA 1 mM pH 7,5
enthaltend 20 μl/ml
RNAse A. resuspendiert. Die Konzentration der Plasmid DNA wurde
auf 40 ng/μl
eingestellt.
-
Beispiel 9: Transfektion
der COS-7 Zellen und Screening der Transfektanten
-
Die
Transfektionsversuche wurden durch das Verfahren "DEAE-Dextranschloroquin" Brichard et al. (1993)
verwirklicht. Drei Tage vor der Transfektion wurden die COS-7 Zellen
in Platten mit 96 Mikrovertiefungen in einer Konzentration von 5 × 103 Zellen pro Vertiefung in 150 μl des RPMI-Milieus,
das 20% fötales
Kälberserum
enthielt eingebracht. Für
die Transfektion wurde das Milieu durch 30 μl der DEAE-Dextran/DNA Mischung
ersetzt. Diese Mischungen wurden für die Doppeltransfektionen
in den Mikrovertiefungen hergestellt in dem aufeinanderfolgend hinzugefügt wurden:
- – 200
ng Plasmid DNA aus der cDNA-Bibliothek,
- – 200
ng Plasmid pcDNA I/HLA-A*0201,
- – 25 μl NaCl 150
mM, Tris 10 mM, pH 7,4 (bezeichnet als TBS Puffer)
- – 35 μl TBS enthaltend
1 mg/ml DEAE-Detran (Pharmacia Biotech Europe GmbH, Saclay, Frankreich)
-
Die
Zellen wurden mit dieser Mischung und 150 μlμl DMEM vervollständigt mit
10% nicht komplementiertem "NuSerum"(Becton Dickinson)
und 100 mM Chloroquin (Sigma-Aldrich Chimie SARL, Saint Quentin Fallavier,
France) während
30 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert. Dann wurden die Zellen
für vier Stunden
bei 37°C
in einer Atmosphäre
von 5% CO2 inkubiert. Nach der Inkubation
wurde das Milieu entfernt und die Zellen wurden zwei Minuten in
PBS 1 × enthaltend
10% einer Dimethylsulfoxid-Lösung
inkubiert. Die Zellen wurden einmal mit PBS 1 × gewaschen und mit RPMI enthaltend
10% FCS für
48 Stunden inkubiert. Das Milieu wurde dann entfernt und die Zellen
wurden einmal mit PBS 1 × gewaschen.
5.000 CTL wurden in die Vertiefungen in 100 μl RPMI enthaltend 10% FCS hinzugefügt. Nach
20 Stunden wurde der Überstand
gesammelt und sein Gehalt an TNF wurde bestimmt, indem seine Zytotoxizität an Klonen
13 WEHI-164 in einem MTT(3-[4,5-Dimethylthiozol]2,5-Diphenyl-Tetrazolium
Bromid (Sigma-Aldrich), kolorimetrischen Test wie zuvor von Traversari
et al. (1992) beschrieben getestet wurde. Zur Hemmung der Sekretion
des TNF durch die mAb wurden die Zielzellen für zwei Stunden in Anwesenheit
einer gesättigten
Konzentration der mAb preinkubiert vor dem Hinzufügen der
Effektorzellen für
weitere 20 Stunden.
-
Beispiel 10: Test PCR
für die
Isolation der Gesamtlänge
von hsp 70-2
-
Die
genomische DNA wurde ausgehend von der RCC-7 Zelllinie mit DN AzolTM (Life Technologies) extrahiert. 1 μl der DNA
wurde für
eine PCR Reaktion verwendet, in dem DNA Polymerase Taq (Perkin Elmer) verwendet
wurde. Die folgenden Primer wurden verwendet:
-
-
-
Diese
Primer enthalten Restriktionsstellen Hind III und Xba I. Die Bedingungen
für die
PCR waren 98°C
für eine
Minute gefolgt von 30 Amplifikationszyklen (98°C für 15 Sekunden, 65°C für eine Minute,
72°C für 2 Minuten
mit einer Endverlängerung
für 10
Minuten bei 72°C.)
Das erhaltene PCR Produkt wurde mit Hind III und Xba I verdaut,
auf absorbierenden Glaskugeln (Geneclean) gereinigt und dann in
die Hind III und Xba I Stellen des pcDNA I Expressionsvektors zum
Sequenzieren und Kotransfektieren mit HLA-A*0201
in die COS-7 Zellen subkloniert.
-
Beispiel 11: Identifizierung
der minimalen Nukleotidregion die für das antigene Peptid kodiert
-
cDNA
A 18 wurde von der cDNA Bibliothek, die ausgehend vom pcDNA I Expressionsvektor
hergestellt wurde isoliert. Das Plasmid wurde mit Sph I und Xba
I verdaut vor der Behandlung mit Exonuklease III, um progressive
Deletionen ausgehend vom 3' Ende
der cDNA A18 herzustellen. Um eine wesentliche Anzahl von gekürzten cDNA
Klonen zu erhalten, hat man das "Exo
Mung Bean Deletion Kit" (Stratagene)
verwendet. Nach der Bindung wurden MC1061/P3 E. Coli Bakterien mit
den gekürzten
cDNA Stücken
transformiert. Die Plasmid DNA wurde von jedem Klon extrahiert,
dann sequenziert und mit HLA-A*0201 in den
COS-7 Zellen co-transfektiert.
-
Beispiel 12: Synthese
und Test für
die Erkennung von Peptiden
-
Im
Screening Test wurden die verwendeten Peptide durch die "PepSet Technology" (Chiron Technologies,
Suresnes, France) synthetisiert. Für die funktionellen Tests wurden
die Peptide in fester Phase unter Verwendung von F-moc (vorübergehender
NH2-Endschutz) synthetisiert und durch vorbereitende HPLC gereinigt.
Analytische HPLC zeigte, dass die Peptide wenigstens 95% Reinheit
hatten. Die lyophilisierten Peptide wurden in 10 mM DMSO in Wasser
gelöst
und bei –20°C konserviert.
Man verwendete die Peptide während eines
Tests zur Freisetzung von Chrom. 2000 autologe durch EBV transformierte
und mit Chrom 51 markierte Zellen wurden für eine Stunde bei 37°C auf Platten
mit 96 Vertiefungen mit verschiedenen Peptidkonzentrationen inkubiert,
bevor CTL 11C2 zugegeben wurde.
-
Beispiel 13: Test zur
Bindung der Peptide
-
Die
T2 Zellen, Nijman et al. (1993) wurden 48 Stunden vor dem Test in
einem serumfreien AIM-V Milieu (Gibco-BRL) kultiviert. Für die Bindungstests
wurden die T2 Zellen (106) bei 26°C für 16 Stunden
in demselben Milieu in 0,8% DMSO mit oder ohne Peptide bei einer
Konzentration von 20 μM
inkubiert. Dann wurden die Peptide (20 μM) neuerlich hinzugefügt und die
Zellen wurden bei 37°C
inkubiert. In Intervallen von 30 Minuten oder einer Stunde wurden
die Zellreste gesammelt und das Expressionsniveau des HLA-A2 wurde
unter Verwendung der anti-HLA-A2 (MA2.1) überwacht.
-
Beispiel 14: Isolierung
der RNA und Northern Blot Analyse
-
Die
Zellen wurden vor der Gewinnung durch Zentrifugation entweder bei
37°C gehalten
oder einem Hitzeschock bei 42°C
für zwei
Stunden unterworfen. Die gesamte RNA wurde durch Guanidinium Isothocyanat-Analyse
extrahiert und in Cesiumchlorid ultra-zentrifugiert. Proben der
Gesamt RNA (15 μg)
wurden in 1% Agarose-Formaldehyd
denaturierendem Gel fraktioniert und auf Nylonmembranen Hybond-N+
entsprechend den Anleitungen des Herstellers (Amersham France S.
A., Ies Ulis, Frankreich) transferiert. Der Northern Blot wurde
mit einer hsp70-2 (Nukleotide 1955 bis 2159) spezifischen Sonde
und mit einer Glyceraldehyd-3-Posphat-Dehydrogenase (GAPDH) Sonde hybridisiert.
Alle Sonden waren mit dCTP [32P] (3000 Ci
mmol–1)
markiert in dem das Prime-ITTM II Random
Primer labeling Kit (Stratagene) verwendet wurde. Die Hybridisierung wurde
bei 45°C
für 16
Stunden mit der hsp70-2 (106 cpm/ml) und
der GAPDH Sonde (105 cpm/ml) durchgeführt. Die
Membranen wurden zweimal mit 2 × SSC
bei Umgebungstemperatur, einmal für 45 Minuten mit 2 × SSC/01%
SDS bei 62°C
und einmal bei 62°C
für 10
Minuten mit 0,1 × SSC
vor der Autoradiographie bei 80°C für elf Tage
gewaschen.
-
Beispiel 15: Elispot Test
-
Die
CD8+ Zellen wurden von HLA-A2 positiven Spendern für die immunomagnetische
negative Reinigung isoliert (Verwendung von Antikörpern gegen
die CD4 und CD56 Zellen). 100.000 CD8+ Zellen wurden direkt zu 100.000
T2 HLA-A2.1 Zellen, die positiv mit 10–6 M
der Peptide beladen waren, in Platten mit 96 Vertiefungen deren
Boden durch Nitrozellulose bedeckt war (Millipore) hinzugefügt. Nach
der Stimulation der CD8+ Zellen für 20 Stunden wurde ein IFNγ Elispot-Test
durchgeführt.
Die Resultate sind in der nachfolgenden Tabelle 1 dargestellt. Die
positive Kontrolle ist das Peptid MP oder "Matrix-Protein", Hüllprotein
des Influenzavirus, das beim Menschen sehr immunogen ist.
-
Tabelle
1: Ergebnisse des IFNγ Elispot-Test
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass es möglich
ist, humane CD8 Lymphozyten von HLA-A2+ gesunden Subjekten
mit einer bevorzugten Peptidzusammensetzung der Erfindung (SEQ ID
Nr. 1 und 2) zu induzieren, jedoch nicht mit dem entsprechenden
nicht mutierten Peptid. Daraus folgt klar, dass die Mutation eine
sehr erhöhte
Immunogenitätsstärke mit
sich bringt, da die Lymphozyten, die niemals durch dieses Peptid
stimuliert wurden, fähig
sind das Gammainterferon für
24 Stunden abzusondern, ohne Zugabe in eine Invitrokultur oder Hinzufügen von
Cytokinen.
-
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