DE60127715T2

DE60127715T2 - Polypeptide zur auslösung einer immunreaktion gegen krebs

Info

Publication number: DE60127715T2
Application number: DE60127715T
Authority: DE
Inventors: Gustav Det Norske R GAUDERNACK; Stein Saeboe-Larssen; Mona Moller; Jon Amund Eriksen
Original assignee: Gemvax AS
Current assignee: Gemvax AS
Priority date: 2000-12-22
Filing date: 2001-12-18
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2021-12-19
Also published as: ATE550426T1; EP2361978B1; AU2002216477B2; EP1862544B1; US20060194731A1; US20120269858A1; AU2002216477C1; CA2432971C; CY1106564T1; EP1352056A2; DE60127715D1; AU2007211889B2; WO2002051994A3; ES2280311T3; PT1352056E; EP1862544A1; AU2010200620A1; AU2007211889B8; CY1112735T1; EP2361978A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide und Nukleinsäure-DNA, die diese Polypeptide kodiert, die in der Lage sind, eine Immunreaktion gegen Krebs auszulösen, Verfahren zum Erzeugen von T-Lymphozyten, die in der Lage sind, Tumorzellen zu erkennen und zu zerstören, und Arzneimittel zur Behandlung, Prophylaxe oder Diagnose von Krebs.
Krebs entwickelt sich durch einen Mehrstufenprozess, der mehrere Mutationsereignisse einschließt. Diese Mutationen haben eine veränderte Expression/Wirkungsweise von Gene zur Folge, die zu zwei Kategorien gehören: Onkogene und Tumorsuppressorgene. Onkogene entstehen in der Natur aus Protoonkogenen durch Punktmutationen oder Translokationen, wodurch sie einen transformierten Zustand der Zelle, die die Mutation beherbergt, zur Folge haben. Alle Onkogene kodieren und funktionieren durch ein Protein. Protoonkogene sind normale Gene der Zelle, welche das Potential haben, Onkogene zu werden. In der Mehrheit der Fälle ist gezeigt worden, dass Protoonkogene Komponenten von Signaltransduktionswegen sind. Onkogene wirken auf eine dominante Art und Weise. Tumorsuppressorgene wirken auf der anderen Seite auf eine rezessive Art und Weise, d.h. durch Verlust der Funktion, und tragen zur Onkogenese bei, wenn beide Allele, die das funktionelle Protein kodieren, verändert worden sind, wobei nicht funktionelle Genprodukte produziert werden.
Auf dem Gebiet der Krebsimmunologie des Menschen haben die letzten zwei Dekaden intensive Bemühungen gesehen, um ursprüngliche krebsspezifische Antigene zu charakterisieren. Insbesondere ist der Analyse von Antikörpern gegen Tumorantigene des Menschen Bemühung gewidmet worden. Der Stand der Technik legt nahe, dass derartige Antikörper zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken, zum Beispiel in Verbindung mit einem Antikrebsmittel, verwendet werden können. Jedoch können Antikörper nur an Tumorantigene binden, die an der Oberfläche von Tumorzellen exponiert sind. Aus diesem Grund sind die Bemühungen, eine Krebsbehandlung zu erzeugen, die auf dem Immunsystem des Körpers beruht, weniger erfolgreich gewesen als erwartet.
Ein grundlegendes Merkmal des Immunsystems ist, dass es eigene von nichteigenen Molekülen unterscheiden kann und normalerweise nicht gegen eigene Moleküle reagiert. Es ist gezeigt worden, dass Rejektion von Geweben oder Organen, die von anderen Individuen transplantiert werden, eine Immunantwort auf die fremden Antigene an der Oberfläche der transplantierten Zellen ist. Die Immunantwort besteht allgemein aus einer humoralen Antwort, vermittelt durch Antikörper, und einer zellulären Antwort. Antikörper werden durch B-Lymphozytn produziert und sezerniert und erkennen typischerweise freies Antigen in der nativen Konformation. Sie können deshalb potentiell fast jede Stelle, die an der Antigenoberfläche exponiert ist, erkennen. Im Gegensatz zu Antikörpern erkennen T-Zellen, welche den zellulären Arm der Immunantwort vermitteln, Antigene nur im Zusammenhang mit Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC-Molekülen) und nur nach passender Antigenverarbeitung. Diese Antigenverarbeitung besteht normalerweise aus der proteolytischen Fragmentierung des Proteins, was Peptide zur Folge hat, die in die Furche der MHC-Moleküle passen. Dies ermöglicht T-Zellen, auch Polypeptide zu erkennen, die sich von intrazellulären Proteinfragmenten/Antigenen ableiten.
T-Zellen können aberrante Polypeptide, die sich von irgendwo in der Tumorzelle ableiten, im Zusammenhang mit MHC-Molekülen an der Oberfläche der Tumorzelle erkennen. Die T-Zellen können nachfolgend aktiviert werden, um die Tumorzelle zu beseitigen, die das aberrante Polypeptid beherbergt. In experimentellen Modellen, die Mäusetumoren einschließen, ist gezeigt worden, dass Punktmutationen in intrazellulären „Eigen"-Proteinen Tumorrejektionsantigene entstehen lassen können, die aus Polypeptiden bestehen, die sich in einer einzigen Aminosäure vom normalen Polypeptid unterscheiden. Die T-Zellen, die diese Polypeptide im Zusammenhang mit den MHC-Molekülen an der Oberfläche der Tumorzellen erkennen, sind in der Lage, die Tumorzellen abzutöten und folglich den Tumor vom Wirt abzustoßen (Boon et al., 1989, Cell, 58, 293–303).
MHC-Moleküle in Menschen werden normalerweise als HLA-Moleküle (humanes leukozytäres Antigen, Histokompatibilitätsantigen) bezeichnet. Es gibt zwei Hauptklassen von HLA-Molekülen, Klasse I und Klasse II. HLA-Moleküle der Klasse I werden durch die Subloci HLA-A, -B und -C kodiert und aktivieren in erster Linie zytotoxische CD8⁺-T-Zellen. HLA-Moleküle der Klasse II auf der anderen Seite aktivieren in erster Linie CD4⁺-T-Zellen (zytotoxische oder Helferzellen) und werden durch die Subloci HLA-DR-, -DP- und -DQ kodiert. Jedes Individuum hat normalerweise sechs verschiedene HLA-Moleküle der Klasse I, gewöhnlich zwei Allele von jeder der drei Untergruppen A, B und C, obwohl in einigen Fällen die Anzahl der verschiedenen HLA-Moleküle der Klasse 1 wegen des zweimaligen Auftretens desselben HLA-Allels verringert ist. Für einen allgemeinen Überblick siehe Roitt, I.M. et al. (1998) Immunology, 5. Auflage, Mosby, London.
Die HLA-Genprodukte sind hochpolymorph. Verschiedene Individuen exprimieren eindeutige HLA-Moleküle, die sich von denen unterscheiden, die in anderen Individuen gefunden werden. Dies erklärt die Schwierigkeit des Findens von HLA-zusammenpassenden Organdonoren bei Transplantationen. Die Bedeutung der genetischen Variation der HLA-Moleküle in der Immunbiologie liegt in ihrer Rolle als Immunantwortgene. Durch ihre Peptidbindungsfähigkeit regelt die Gegenwart oder Abwesenheit bestimmter HLA-Moleküle die Fähigkeit eines Individuums, auf spezifische Polypeptidepitope zu antworten. Als Folge beeinflussen die HLA-Moleküle den Widerstand gegen oder die Anfälligkeit für eine Krankheit.
T-Zellen können die Entwicklung und das Wachstum von Krebs durch verschiedene Mechanismen hemmen. Zytotoxische T-Zellen, sowohl HLA-Klasse I beschränkte CD8⁺ als auch HLA-Klasse II beschränkte CD4⁺, können Tumorzellen direkt abtöten, die die passenden Tumorantigene präsentieren. Normalerweise werden CD4⁺-Helfer-T-Zellen für zytotoxische CD8⁺-T-Zell-Antworten benötigt, aber wenn das Polypeptidantigen durch ein passendes APC präsentiert wird, können zytotoxische CD8⁺-T-Zellen direkt aktiviert werden, welches eine schnellere, stärkere und wirksamere Antwort zur Folge hat.
In der Internationalen Anmeldung PCT/NO92/00032 (veröffentlicht als WO92/14756) sind synthetische Polypeptide und Fragmente von Onkogenproteinprodukten, welche eine Punktmutation oder Translokationen aufweisen, verglichen mit ihrem Protoonkogen oder Tumorsuppressorgenprotein beschrieben. Diese Polypeptide entsprechen dem, stimmen vollständig überein mit dem oder sind Fragmente des verarbeiteten Onkogenproteinfragments oder Tumorsuppressorgenfragments, wie durch Krebszellen oder andere antigenpräsentierende Zellen präsentiert, und werden als HLA-Polypeptidkomplex durch mindestens ein Allel in jedem Individuum präsentiert. Es wurde auch gezeigt, dass diese Polypeptide spezifische T-Zell-Antworten auf das tatsächliche Onkogenproteinfragment induzieren, das durch die Zelle durch Verarbeitung produziert und im HLA-Molekül präsentiert wird. Insbesondere ist in WO92/14756 beschrieben, dass sich Polypeptide vom p21-ras-Protein ableiteten, welches Punktmutationen an bestimmten Aminosäurepositionen aufwies, nämlich an den Positionen 12, 13 und 61. Es ist gezeigt worden, dass diese Polypeptide beim Regulieren des Wachstums von Krebszellen in vitro wirksam sind. Ausserdem wurde gezeigt, dass die Polypeptide durch die Verabreichung derartiger Polypeptide in Impfungs- oder Krebstherapieschemata CD4⁺-T-Zellimmunität gegen Krebszellen, die das mutierte p21-ras-Onkogenprotein beherbergen, hervorrufen. Es ist nachfolgend gezeigt worden, dass diese Polypeptide durch die vorstehend erwähnte Verabreichung auch CD8⁺-T-Zellimmunität gegen Krebszellen, die das veränderte p21-ras-Onkogenprotein beherbergen, hervorrufen (siehe Gjertsen, M.K. et al., 1997, Int. J. Cancer 72: 784–790).
Die Internationale Anmeldung PCT/NO99/00143 (veröffentlicht als WO99/58552) beschreibt synthetische Polypeptide und Fragmente von mutierten Proteinprodukten, die aus Rastermutationen entstehen, die in Genen in Krebszellen auftreten. Diese Polypeptide entsprechen dem, stimmen vollständig überein mit dem oder sind Fragmente des verarbeiteten Rastermutantenproteinfragments, wie durch Krebszellen oder andere antigenpräsentierende Zellen präsentiert, und werden als HLA-Polypeptidkomplex durch mindestens ein Allel in jedem Individuum präsentiert. Insbesondere Polypeptide, die sich aus Rastermutationen in den BAX- und hTGFβ-RII-Genen ergeben, werden offenbart. Es wurde gezeigt, dass diese Polypeptide in stimulierenden CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen auf eine spezifische Art und Weise wirksam sind.
Jedoch sind die vorstehend beschriebenen Polypeptide nur in einer bestimmten Anzahl von Krebsarten nützlich, die Onkogene mit Punktmutationen, Rastermutationen oder Translokation in einem Protoonkogen oder Tumorsuppressorgen einschließen. Es gibt deshalb eine starke Notwendigkeit für eine Antikrebsbehandlung oder einen Impfstoff, die/der gegen einen allgemeineren Bereich von Krebsarten wirksam ist.
Die konzertierte Aktion einer Kombination von veränderten Onkogenen und Tumorsuppressorgenen hat die zelluläre Transformation und Entwicklung eines malignen Phänotyps zur Folge. Derartige Zellen sind jedoch alterungsanfällig und haben eine beschränkte Lebensdauer. Bei den meisten Krebsarten erfordert die Immortalisation der Tumorzellen das Anschalten eines Enzymkomplexes, der Telomerase genannt wird. In somatischen Zellen ist die katalytische Untereinheit des Telomeraseholoenzyms, hTERT (menschliche Telomerase-reverse Transkriptase), normalerweise nicht exprimiert. Zusätzliche Ereignisse, wie die Funktion von Proteinen, die durch ein Tumorvirus oder eine Demethylierung von abgeschalteten (methylierten) Promotorstellen kodiert werden, können die Expression der Gene zur Folge haben, die die Komponenten des funktionellen Telomerasekomplexes in Tumorzellen kodieren.
Wegen der Gegenwart von Telomerase in den meisten Arten von Krebszellen ist das Enzym als allgemeiner Krebsimpfstoffanwärter offenbart worden (Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/NO99/00220, veröffentlicht als WO00/02581). WO00/02581 beschreibt ein Verfahren zum Verhindern oder Behandeln von Krebs durch Erzeugen einer T-Zell-Antwort gegen Telomerase-exprimierende Zellen in einem Säugetier, das an Krebs leidet (oder wahrscheinlich daran leidet). Es wird in WO00/02581 dargelegt, dass sowohl CD4⁺- als auch CD8⁺-T-Zellen durch Verabreichung von Polypeptiden mit Sequenzen, die sich von einem derartigen Telomeraseprotein ableiten, stimuliert werden können. Vonderheide et al. (Immunity, Vol. 10, 673–679, Juni 1999) berichten, dass die katalytische Unterheit der Telomerase ein Tumor-assoziiertes Antigen ist, das durch zytotoxische T-Lymphozyten erkannt wird.
Von Varianten alternativen Spleißens der Telomerase-Prä-mRNA ist in der Literatur berichtet worden (Kilian, A. et al., 1997, Hum. Mol. Genet. 6: 2011–2019). Kilian et al. (1997, vorstehend) zeigten an, dass es bemerkenswert war, dass mehrere Spleißvarianten sich bei der kritischen RT- (Reversen Transkriptase-) Domäne von hTERT befanden. Sie gaben jedoch an, dass ein vollständiges Verstehen der Bedeutung der hTERT-Spleißvarianten nicht erhalten wurde, und dass weitere funktionelle Charakterisierung erforderlich war.
Die Analyse der kompletten genomischen Sequenz des hTERT-Gens hat festgestellt, dass die verschiedenen mRNA-Spleißvarianten aus der Verwendung von Stellen alternativen Spleißens in der hTERT-Prä-mRNA entstehen (Wick, M. et al., 1999, Gene 232: 97–106). Verglichen mit der hTERT-mRNA voller Länge sind mindestens fünf zusätzliche Spleißvarianten detektiert worden. Eine schematische Zeichnung dieser Varianten sind in 1 bereitgestellt, und 2 zeigt ein Alignment (Abgleich) der kodierten Proteine. Zwei der Spleißvarianten, die α-del (oder DEL1) und β-del (oder DEL2) genannt werden, stellen Deletionen von spezifischen Kodierungssequenzen dar. Bei der α-del-Variante sind die ersten 36 Nukleotide von Exon 6 deletiert, und sie kodiert ein Protein, welchem eine Ausdehnung von 12 internen Aminosäuren fehlt. Bei der β-del-Variante fehlen 182 Nukleotide, welche die gesamten Exons 7 und 8 darstellen, was zu einer Verschiebung des offenen Leserasters und einem trunkierten Protein mit einem 44-Aminosäuren langen Carboxyl-Terminus führt, der im hTERT-Protein voller Länge nicht vorliegt. Die restlichen Spleißvarianten ergeben sich aus der Verwendung von Stellen alternativen Spleißens, die sich im Inneren von Intronregionen befinden, was Insertion von Intronsequenzen innerhalb des offenen Leserasters und vorzeitige Beendigung der Translation zur Folge hat. Die σ-Insertionsvariante (INS1) ergibt sich aus einer Insertion der ersten 38 Nukleotide von Intron 4. Die σ-Insertion enthält kein Stoppcodon, aber statt dessen erstreckt sich das offene Leseraster 22 Nukleotide in die normale Sequenz hinein, wobei ein alternatives Leseraster verwendet wird. Die γ-Insertionsvariante (oder INS3) wird durch Insertion der letzten 159 Nukleotide von Intron 14 verursacht. Ins-4 enthält die ersten 600 Nukleotide von Intron 14, während gleichzeitig Exon 15 und das meiste von Exon 16 deletiert ist. Die trunkierten Proteine, die sich aus der Translation dieser Spleißvarianten ergeben, sind in 2 gezeigt.
Mehrere neue Studien haben sich der Regulation der Telomeraseaktivität gewidmet, und von einer gewissen Korrelation zwischen hTERT-mRNA-Transkription und Telomeraseaktivität ist für mehrere Zelllinien und Gewebe berichtet worden (Nakamura, T.M. et al., 1997, Science 277: 955–959; Meyerson, M. et al., 1997, Int. J. Cancer 85: 330–335; Nakayama, J. et al., 1998, Nature Genet. 18: 65–68; Liu, K. et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 5147–5152). Andere Studien haben gezeigt, dass die Telomeraseaktivität durch Phosphorylierung des hTERT-Proteins durch die Proteinkinase Ca hochreguliert wird, und andererseits durch die Gegenwart von Proteinkinase C-Inhibitoren und der Phosphatase 2A herunterreguliert wird (Li, H. et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 16729–16732; Li, N. et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 33436–33442; Bodnar, A.G. et al. 1996, Exp. Cell Res. 228: 58–64; Ku, W.C. et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Comm. 241: 730–736). Das alternative Spleißen der hTERT-Prä-mRNA stellt einen zusätzlichen Mechanismus zum Regulieren der Telomeraseaktivität dar, und es ist gezeigt worden, dass es während der fötalen Nierenentwicklung und in Eierstock- und Gebärmuttergeweben des Erwachsenen die Herunterregulation vermittelt (Ulaner, G.A. et al., 1998, Cancer Res. 58: 4168–4172; Ulaner, G.A. et al., 2000, Int. J. Cancer 85: 330–335). Der Fokus der obenerwähnten Studien hat auf den α und β-Spleißvarianten gelegen, vermutlich weil sie Sequenzen deletieren, von welchen angenommen wird, dass sie kritische Reverse Transkriptasemotive kodieren (Lingner, J. et al., 1997, Science 276: 561–567).
Die vorliegende Erfindung stellt Peptide und Nukleinsäuren, die die Peptide, beruhend auf den TERT-γ- und-σ-Spleißvarianten, kodieren, und die neue Verwendung dieser Peptide und Nukleinsäuren in der Medizin bereit.
Folglich wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid zur Verwendung in der Medizin bereitgestellt; wobei das Polypeptid eine Sequenz umfasst, die in den SEQ ID NR. 3, 4, 5, oder 6 angegeben ist, wobei das Polypeptid in der Lage ist, eine T-Zell-Antwort zu induzieren.
Der hier verwendete Begriff „umfasst" schließt „bestehen aus" ein. Das Polypeptid (oder die Nukleinsäure) der vorliegenden Erfindung kann durch einen oder mehr Aminosäure- (oder Nukleinsäure-) Reste flankiert sein, wenn nichts anderes angegeben ist. Zum Beispiel kann das Polypeptid Teil eines Fusionsproteins sein, welche eine oder mehrere flankierende Domänen am N oder C-Terminus aufweist, um Reinigung des Fusionsproteins zuzulassen.
Aminosäureänderungen oder-modifikationen (z.B. Substitutionen) im Polypeptid können insbesondere bei Ankerresten durchgeführt werden, welche in HLA- oder MHC-Moleküle zur Präsentation den T-Zellen passen. Erhöhte Bindungs- und immunogene Eigenschaften des Polypeptids an HLA- oder MHC-Moleküle können folglich erreicht werden (siehe Bristol, J.A. et al., 1998, J. Immunol. 160(5): 2433–2441; Clay, T.M. et al., 1999, J. Immunol. 162(3): 1749–1755).
Es werden hier auch Polypeptide offenbart, welche das folgende aufweisen:

a) mindestens 55% Sequenzidentität mit einem Molekül aufweisen, das die Sequenz von SEQ ID NR. 1 umfasst, wie mit einer Suche mit NCBI BLASTP Version 2.1.2 mit Standardparametern bestimmt;
b) mindestens 55% Sequenzidentität mit einem Molekül aufweisen, das die Sequenz von SEQ ID NR. 2 umfasst, wie mit einer Suche mit NCBI BLASTP Version 2.1.2 mit Standardparametern bestimmt;
c) mindestens 40% Sequenzidentität mit einem Molekül aufweisen, das die Sequenz von SEQ ID NR. 3 umfasst, wie mit einer Suche mit NCBI BLASTP Version 2.1.2 mit einem Erwartungswert von 1000 und anderen Parametern als Standard bestimmt;
d) mindestens 40% Sequenzidentität mit einem Molekül aufweisen, das die Sequenz von SEQ ID NR. 4 umfasst, wie mit einer Suche mit NCBI BLASTP Version 2.1.2 mit einem Erwartungswert von 1000 und anderen Parametern als Standard bestimmt;
e) mindestens 70% Sequenzidentität mit einem Molekül aufweisen, das die Sequenz von SEQ ID NR. 5 umfasst, wie mit einer Suche mit NCBI BLASTP Version 2.1.2 mit einem Erwartungswert von 100000 und anderen Parametern als Standard bestimmt;
f) mindestens 50% Sequenzidentität mit einem Molekül aufweisen, das die Sequenz von SEQ ID NR. 6 umfasst, wie mit einer Suche mit NCBI BLASTP Version 2.1.2 mit einem Erwartungswert von 10000 und anderen Parametern als Standard bestimmt; oder
g) mindestens 40% und vorzugsweise 60% Sequenzidentität mit einem Molekül aufweisen, das die Sequenz von SEQ ID NR. 11 umfasst, wie mit einer Suche mit NCBI BLASTP Version 2.1.2 mit einem Erwartungswert von 1000 und anderen Parametern als Standard bestimmt.

Das NCBI BLASTP-Programm kann bei http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ gefunden und Standardparameter unter Verwendung der Erweiterten Suche (Advanced Search) geändert werden. Höhere als Standard„erwartungs"werte können erforderlich sein, wenn mit kleinen Abfragesequenzen für anzuzeigende Übereinstimmungen gesucht wird. Der Begriff „Sequenzidentität", der hier verwendet wird, bezieht sich auf Aminosäurereste in optimal abgeglichenen Sequenzen, welche genau an entsprechende relative Positionen passen. Zum Beispiel stellt das NCBI BLASTP-Programm einen Wert des Prozentsatzes von Identitäten zwischen Abfrage und Gegenstands- („Treffer"-) Sequenzen bereit.
Es werden hier auch Polypeptide offenbart, welche eine Sequenz umfassen, wie in den SEQ ID NR. 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 11 angegeben, oder Fragmente einer Sequenz sind, wie in den SEQ ID NR. 1, 3, 5, 6 oder 11 gezeigt.
Während die Polypeptide, die durch HLA-Moleküle der Klasse II dargestellt sind, von unterschiedlicher Länge (12–25 Aminosäuren) sind, müssen die Polypeptide, die durch HLA-Moleküle der Klasse I dargestellt sind, normalerweise neun Aminosäurereste lang sein, um in die HLA-Bindungsfurche der Klasse I zu passen. Ein längeres Polypeptid bindet nicht, wenn es nicht durch eine APC- oder Targetzelle, wie eine Krebszelle, innerlich verarbeitet werden kann, bevor es in der beschränkten HLA-Furche der Klasse I präsentiert wird. Es ist nur von einer beschränkten Anzahl von Abweichungen von diesem Erfordernis von neun Aminosäuren berichtet worden, und in jenen Fällen ist die Länge des präsentierten Polypeptids entweder acht oder zehn Aminosäurereste lang gewesen. Für Überblicke über Polypeptidbindung an MHC-Moleküle siehe Rammensee, H.-G. et al. (1995) Immunogenetics, 41, 178–228 und Barinaga (1992) Science, 257, 880–881. Male D.K. et al. (1996, Advanced Immunology, Mosby, London) stellt Hintergrundinformation auf dem Gebiet der Immunologie bereit.
Die T-Zell-Antwort, die durch das vorstehend beschriebene Polypeptid erzeugt wird, kann nach intrazellulärer Spaltung des Polypeptids erzeugt werden, um ein Fragment bereitzustellen, das in eine MHC- oder HLA-Bindungsfurche passt. In einer anderen Ausführungsform benötigt das vorstehend beschriebene Polypeptid möglicherweise keine intrazelluläre Spaltung, um in eine MHC- oder HLA-Bindungsfurche der Klasse I zu passen. In diesem Fall kann das Polypeptid 8 bis 10 Aminosäuren lang sein. Es wird auch ein vorstehend beschriebenes Polypeptid bereitgestellt, welches keine intrazelluläre Spaltung benötigt, um in eine MHC- oder NLA-Bindungsfurche der Klasse II zu passen. In diesem Fall kann das Polypeptid 12 bis 25 Aminosäuren lang sein.
Die T-Zell-Antwort gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Anzahl und/oder Aktivität von T-Helfer- und/oder zytotoxischen T-Zellen erhöhen.
Es wird auch ein Polypeptid bereitgestellt, welches keine sehr zytotoxische T-Zell-Antwort bei einem Patienten gegen eines oder mehrere der folgenden stimuliert: Knochenmark-Stammzellen, Epithelzellen in den Kolonkrypten oder Lymphozyten.
Es wird ferner gemäß der vorliegenden Erfindung ein Nukleinsäuremolekül zur Verwendung in der Medizin bereitgestellt; wobei das Nukleinsäuremolekül:

a) einen Strang aufweist, der ein vorstehend beschriebenes Polypeptid kodiert, das Teil der vorliegenden Erfindung ist;
b) einen Strang aufweist, der zu einem Strang, wie vorstehend in a) beschrieben, komplementär ist; oder
c) einen Strang aufweist, der unter stringenten Bedingungen mit einem Molekül, wie vorstehend in a) oder b) beschrieben, hybridisiert.

Stringente Hybridisierungsbedingungen werden ausführlich bei S. 1.101–1.110 und 11.45–11.61 von Sambrook, J. et al. (1989, Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor) besprochen. Ein Beispiel von Hybridisierungsbedingungen, die verwendet werden können, schließen die Verwendung einer Vorwaschlösung von 5 × SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) und das Versuchen der Hybridisierung über Nacht bei 55°C unter Verwendung von 5 × SSC ein. Die Hybridisierung von Nukleinsäuresequenzen innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung schließen Sonden, Primer oder DNA-Fragmente ein. Der Begriff Primer schließt ein Einzelstrang-Oligonukleotid, welches als Punkt der Initiation der Matrize-gerichteten DNA-Synthese unter geeigneten Bedingungen (z.B. in Gegenwart von vier verschiedenen Nukleosidtriphosphaten und eines Mittels zur Polymerisierung, wie DNA- oder RNA-Polymerase oder Reverse Transkriptase) in einem geeigneten Puffer und bei einer geeigneten Temperatur ein.
Es wird auch ein Vektor oder eine Zelle zur Verwendung in der Medizin bereitgestellt, der/die ein Nukleinsäuremolekül gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
Ferner wird ein Bindungsmittel zur Verwendung in der Medizin bereitgestellt; wobei das Bindungsmittel an ein vorstehend beschriebenes Polypeptid bindet, wie vorstehend beschrieben. Das Bindungsmittel kann für ein Polypeptid spezifisch sein, wie vorstehend beschrieben. Das Bindungsmittel kann ein Antikörper oder ein Fragment davon sein. Das Bindungsmittel kann Lektin sein.
Der Begriff Antikörper in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen wird hier verwendet, um Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teile von Immunglobulinmolekülen, d.h. Molekülen, die eine Antikörperbindungsstelle oder Paratop enthalten, zu bezeichnen. Derartige Moleküle werden auch als „Antigenbindungsfragmente" von Immunglobulinmolekülen bezeichnet. Veranschaulichende Antikörpermoleküle sind intakte Immunglobulinmoleküle, im wesentlichen intakte Immunglobulinmoleküle und jene Teile eines Immunglobulinmoleküls, die das Paratop enthalten, einschließlich jener Teile, die auf dem Fachgebiet als Fab, Fab', F(ab')2 und F(v) bekannt sind. Antikörper der vorliegenden Erfindung können monoklonal oder polyklonal sein. Der Begriff Antikörper soll auch Single-Chain-Antikörper, chimäre, humanisierte oder primatisierte (CDR-übertragene) Antikörper und dergleichen, sowie chimäre oder CDR-übertragene Single-Chain-Antikörper, die Teile von zwei verschiedenen Spezies umfassen, einschließen. Zur Herstellung von Antikörpern siehe Harlow, E. und Lane, D. (1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor) und Harlow, E. und Lane, D. (1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor). Immunologische Hilfsstoffe für Impfstoffe, die Lecithin umfassen, können verwendet werden, um die Antikörperherstellung zu stimulieren (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 4,803,070).
Ferner wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein T-Lymphozyt zur Verwendung in der Medizin bereitgestellt; wobei der T-Lymphozyt in der Lage ist, eine Zelle, die ein vorstehend beschriebenes Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert, abzutöten oder beim Abtöten einer solchen Zelle zu helfen. Der T-Lymphozyt kann eine zytotoxische T-Zelle oder eine T-Helferzelle sein.
Es wird auch eine klonale Zelllinie zur Verwendung in der Medizin offenbart, die eine Mehrzahl von T-Lymphozyten umfasst, wie vorstehend beschrieben. Es wird auch ein Gemisch von T-Lymphozyten zur Verwendung in der Medizin bereitgestellt, die eine T-Helferzelle oder eine klonale Zelllinie derartiger Zellen und eine zytotoxische T-Zelle oder eine klonale Zelllinie derartiger Zellen umfasst.
Es wird auch ein Verfahren zur Erzeugung von T-Lymphozyten offenbart, die in der Lage sind, Tumorzellen in einem Säugetier zu erkennen und zu zerstören, das das Nehmen einer Probe von T-Lymphozyten aus einem Säugetier und das Kultivieren der T-Lymphozyten-Probe in Gegenwart mindestens eines vorstehend beschriebenen Polypeptids in einer Menge umfasst, die ausreichend ist, um hTERT-γ-Insertionsprotein-spezifische T-Lymphozyten und/oder hTERT-σ-Insertionsprotein-spezifische T Lymphozyten zu erzeugen.
Es wird auch ein B-Lymphozyt offenbart, welcher beim Erzeugen von Antikörpern nützlich sein kann. Hybridoma-Zellen, welche in der Lage sind, Antikörper zu erzeugen, werden auch offenbart (siehe zum Beispiel Koehler et al., 1975, Nature 256: 495–497; Kosbor et al., 1983, Immunol. Today 4: 72; Cote et al., 1983, PNAS USA 80: 2026–2030; Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., New York, S. 77–96).
Ferner wird gemäß der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Polypeptids, wie vorstehend beschrieben, einer Nukleinsäure, wie vorstehend beschrieben, oder eines Vektors oder einer Zelle, wie vorstehend beschrieben, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs oder bei der Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Diagnose von Krebs bereitgestellt. Der Krebs kann ein Säugetierkrebs sein.
Insbesondere kann der Krebs ein Krebs beim Menschen sein. Zum Beispiel kann der Krebs Brustkrebs, Prostatakrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Kolorektalkrebs, Lungenkrebs, ein malignes Melanom, Leukämie, ein Lymphom, Ovarialkrebs, Gebärmutterhalskrebs oder Krebs der Gallengänge sein.
Das Medikament kann ein Impfstoff sein.
Die hier beschriebenen Polypeptide sind besonders zur Verwendung in einem Impfstoff geeignet, der in der Lage ist, entweder CD4+- oder CD8+-T-Zellimmunität sicher auszulösen. Wenn die Polypeptide synthetisch hergestellt werden können, schließen die Medikamente, die die Polypeptide einschließen, keine transformierenden Krebsgene (Onkogene) oder andere Stellen oder Materialien ein, welche gesundheitsschädliche Wirkungen hervorrufen könnten. Die Polypeptide können für eine bestimmte Art von T-Zell-Antwort ohne die Nebenwirkungen anderer unerwünschter Antworten zielgerichtet werden.
Das Medikament kann ein Antisensemolekül sein oder ist in der Lage, ein Antisensemolekül in vivo zu erzeugen.
Das diagnostische Mittel kann in einem Kit bereitgestellt werden. Der Kit kann Mittel zum Erzeugen eines detektierbaren Signals (z.B. eine Fluoreszenzmarkierung, eine radioaktive Markierung) oder einer detektierbaren Änderung (z.B. eine Enzym-katalysierte Änderung) umfassen. Der Kit kann zur Verwendung bei der Diagnose von Krebs eine Gebrauchsanweisung einschließen.
Ferner wird ein Arzneimittel bereitgestellt, das ein Polypeptid, wie vorstehend beschrieben, eine Nukleinsäure, wie vorstehend beschrieben, oder einen Vektor oder eine Zelle, wie vorstehend beschrieben, umfasst.
Das Arzneimittel kann ein Polypeptid, das in der Lage ist, eine T-Zell-Antwort direkt gegen ein Polypeptid, das durch ein Onkogen produziert wird, oder gegen eine Mutante eines Tumorsuppressorproteins zu induzieren, oder eine Nukleinsäure umfassen, die ein derartiges Polypeptid kodiert. Beispiele derartiger Onkogene oder Mutanten eines Tumorsuppressorproteins schließen p21-ras, Rb, p53, abl, gip, gsp, ret oder trk ein. Das Onkogentarget können die p21-ras-Polypeptide sein, die in der Internationalen Anmeldung Nr. PCT/NO92/00032 (Veröffentlichung Nr. WO92/14756) beschrieben sind.
Es wird auch eine kombinierte Herstellung offenbart, die eine Komponente aus den vorstehend beschriebenen Arzneimitteln für die gleichzeitige, getrennte oder aufeinanderfolgende Verwendung in der Antikrebstherapie umfasst.
Es wird auch ein Arzneimittel, wie vorstehend beschrieben, das ferner einen pharmazeutisch verträglichen Träger, ein Verdünnungsmittel, einen Zusatzstoff, ein Stabilisierungsmittel und/oder einen Hilfsstoff umfasst; wobei die Zusammensetzung oder kombinierte Herstellung ferner gegebenenfalls eines oder mehrere von folgendem einschließt: ein Zytokin oder einen Wachstumsfaktor (z.B. IL-2, IL-12; und/oder GM-CSF) und ein anderes Polypeptid, das aus einer Rastermutation entsteht (z.B. eine Rastermutation im BAX- oder hTGFβ-RII-Gen).
Die stimulierende Wirkung auf CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen auf eine spezifisch Art und Weise durch die Polypeptide, die sich aus den Rastermutationen in den BAX- und hTGFβ-RII-Genen ergeben, wurde in WO99/58552 offenbart (siehe vorstehend).
Das vorstehend beschriebene Arzneimittel kann ein Impfstoff sein.
Das vorstehend beschriebene Arzneimittel kann die Herstellung von Antisensemolekülen umfassen oder es kann in der Lage sein, diese herzustellen.
Es wird auch ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, wie vorstehend beschrieben, das die Schritte des Kombinierens der vorstehend beschriebenen Komponenten mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, einem Verdünnungsmittel, einem Zusatzstoff, einem Stabilisierungsmittel und/oder einem Hilfsstoff umfasst, offenbart.
Ein Arzneimittel kann eines der folgenden Gemische umfassen:

a) ein Gemisch von mindestens einem vorstehend beschriebenen Polypeptid zusammen mit einem anderen Polypeptid mit einer verschiedenen Sequenz;
b) ein Gemisch aus mindestens einem vorstehend beschriebenen Polypeptid zusammen mit einem anderen Polypeptid mit einer überlappenden Sequenz, so dass die Polypeptide geeignet sind, für verschiedene MHC- oder HLA-Allele zu passen;
c) ein Gemisch aus beiden Gemischen a) und b);
d) ein Gemisch aus mehreren Gemischen a);
e) ein Gemisch aus mehreren Gemischen b); oder
f) ein Gemisch aus mehreren Gemischen a) und mehreren Gemischen b).

Die Polypeptide im Gemische können kovalent miteinander verbunden sein, um größere Polypeptide oder sogar zyklische Polypeptide zu erzeugen. Die Polypeptide selbst können in einer linearen oder zyklischen Form vorliegen.
Es wird hier auch eine Diagnosezusammensetzung offenbart, die ein Polypeptid, wie vorstehend beschrieben, eine Nukleinsäure, wie vorstehend beschrieben, einen Vektor oder eine Zelle, wie vorstehend beschrieben, ein Bindungsmittel, wie vorstehend beschrieben, einen T-Lymphozyten, wie vorstehend beschrieben, eine Zelllinie, wie vorstehend beschrieben, oder ein Gemisch aus vorstehenden T-Lymphozyten umfasst.
Es wird hier auch ein Diagnosekit, wie vorstehend beschrieben, offenbart.
Es wird hier auch ein Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe von Krebs des menschlichen oder Tierkörpers offenbart, das das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge des vorstehend beschriebenen Arzneimittels an einen Patienten oder an ein Tier, die dasselbe benötigen, umfasst. Die Offenbarung schließt ein Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe eines Patienten oder Tieres, die an Krebs leiden, ein, wobei das Verfahren das Verabreichen des vorstehend beschriebenen Arzneimittels an den Patienten oder das Tier in einer Menge umfasst, die ausreicht, um eine T-Zell-Antwort gegen den Krebs auszulösen. Das Verfahren der Behandlung kann auch eine Stimulierung mit einem vorstehend beschriebenen Arzneimittel in vivo oder ex vivo einschließen. Die ex vivo-Therapie kann das Isolieren von dendritischen Zellen oder anderen geeigneten Antigenpräsentierenden Zellen aus einem Patienten oder Tier, das Beladen der Zellen mit mindestens einem vorstehend beschriebenen Polypeptid oder einer vorstehend beschriebenen Nukleinsäure und das Einflößen dieser beladenen Zellen zurück in den Patienten oder das Tier einschließen. Die vorstehend beschriebenen Polypeptide oder Nukleinsäuren können auch in einem Verfahren der Schutzimpfung von einem Patienten verwendet werden, um Resistenz gegen Krebs zu erhalten. Onkogen sind gelegentlich mit Viren verbunden. Die vorliegende Erfindung ist auch zur Behandlung von bestimmten Viruserkrankungen geeignet.
Die Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung können in einer Menge im Bereich von 1 Mikrogramm (1 μg) bis 1 Gramm (1 g) an einen zu impfenden durchschnittlichen menschlichen Patienten oder ein zu impfendes Individuum verabreicht werden. Es ist bevorzugt, eine kleinere Dosis im Bereich von 1 Mikrogramm (1 μg) bis 1 Milligramm (1 mg) für jede Verabreichung zu verwenden.
Die genauen Dosierungen, d.h. pharmazeutisch verträglichen Dosierungen, und das Verabreichungsschema von Arzneimitteln und Medikamenten der vorliegenden Erfindung können vom Fachmann leicht bestimmt werden, zum Beispiel durch Verwendung von zum Beispiel Dosis-Wirkungs-Analysen.
Die Verabreichung kann einmal oder mehrere Male stattfinden, wie geeignet, um die gewünschte T-Zellimmunität herzustellen und/oder beizubehalten. Die Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung können entweder gleichzeitig oder getrennt zusammen mit Verbindungen, wie Zytokinen und/oder Wachstumsfaktoren, d.h. Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-12 (IL-12), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) oder dergleichen verabreicht werden, um die Immunantwort zu verstärken, wie auf dem Fachgebiet bekannt. Die Polypeptide können in einem Impfstoff oder einer therapeutischen Zusammensetzung entweder alleine oder in Verbindung mit anderen Materialien verwendet werden. Zum Beispiel können das Polypeptid oder die Polypeptide in Form eines Lipopeptidkonjugats zugeführt werden, von welchem bekannt ist, dass es eine hochaffine zytotoxische T Zell-Antwort induziert (Deres, K. et al., 1989, Nature 342: 561–564).
Die Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung können einem Individuum oder Tier in Form von DNA-Impfstoffen verabreicht werden. Die DNA, die das/die Polypeptide) kodierten, kann/können in Form einer klonierten Plasmid-DNA oder eines synthetischen Oligonukleotids sein. Die DNA kann zusammen mit Zytokinen, wie IL-2 und/oder anderen costimulierenden Molekülen zugeführt werden. Die Zytokine und/oder costimulierenden Moleküle können selbst in Form von Plasmid- oder Oligonukleotid-DNA zugeführt werden Es ist gezeigt worden, dass die Antwort auf einen DNA-Impfstoff durch die Gegenwart der Immunstimulanz-DNA-Sequenzen (ISS) erhöht wird. Diese können die Form von hexameren Motiven annehmen, die methyliertes CpG gemäß der Formel enthalten: 5'-Purin-Purin-CG-Pyrimidin-Pyrimidin-3'. DNA-Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung können deshalb diese oder andere ISS in die DNA, die das hTERT-γ-Insertionsprotein und/oder das hTERT-σ-Insertionsprotein kodiert, in die DNA, die das Zytokin oder andere costimulierende Moleküle kodiert, oder in beide einbringen. Ein Überblick der Vorteile der DNA-Schutzimpfung wird durch Tighe et al. (1998, Immunology Today, 19(2): 89–97) bereitgestellt.
Es wird auch gemäß der vorliegenden Erfindung das Polypeptid, wie vorstehend beschrieben, gegebenenfalls in isolierter Form bereitgestellt, wobei das Polypeptid kein Polypeptid ist, das aus den Sequenzen, die in 4 gezeigt sind, besteht.
Die Polypeptidsequenz, die in 4 gezeigt ist, stellt die Offenbarung in 5C von Kilian et al. (1997, vorstehend) von 46 Aminosäureresten am C-terminalen Ende der circa 1100 Aminosäurereste umfassenden hTERT-γ-Insertionsspleißvariante dar, welche 44 Aminosäuren der SEQ ID NR. 1 einschließt. Die Sequenz, die in Kilian et al. (1997, vorstehend) bereitgestellt wird, zeigt den „alternativen C-Terminus" des Proteins der hTERT-γ-Insertionsspleißvariante (Kilian et al., 1997, vorstehend, zeigen an, dass die entsprechende DNA-Sequenz durch die GenBank-Zugangsnummer AF015950 bereitgestellt wird). Kilian et al. (1997, vorstehend) offenbaren nicht als getrenntes Gebilde das Polypeptid gemäß der SEQ ID NR. 1, 2 oder 5 am C-terminalen Ende des Proteins der hTERT-γ-Insertionsspleißvariante, und sie offenbaren nicht oder legen nahe die medizinische Verwendung des Polypeptids gemäß SEQ ID NR. 1, 2 oder 5.
Die hier beschriebenen Polypeptide können durch herkömmliche Verfahren zum Beispiel durch die verschiedenen Polypeptidsyntheseverfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden. In einer anderen Ausführungsform können sie Fragmente eines hTERT-γ-Insertionsproteins und/oder eines hTERT-σ-Insertionsproteins sein, die durch durch Spaltung zum Beispiel unter Verwendung eines Cyanbromids und nachfolgende Reinigung hergestellt werden. Enzymatische Spaltung kann auch verwendet werden. Das hTERT-γ-Insertionsprotein und das hTERT-σ-Insertionsprotein oder -peptide können auch in der Form von rekombinanten exprimierten Proteinen oder Polypeptiden vorliegen.
Es wird auch die Nukleinsäure, wie hier beschrieben, gegebenenfalls in isolierter Form bereitgestellt; wobei die Nukleinsäure keine Nukleinsäure ist, die das vorstehend ausgeschlossene Polypeptid kodiert, und auch keine Nukleinsäure ist, wie in 4 oder 5 gezeigt.
Die Nukleinsäuresequenz am 3'-Ende der circa 3100 bp umfassenden hTERT-γ-Inserfionsspleißvariante, deren Teil das C-terminale Ende des entsprechenden Proteins kodiert, das die SEQ ID NR. 1 einschließt, wird in 4 von Kilian et al. (1997, vorstehend) bereitgestellt. Die Nukleinsäuresequenz an den Exon-Intron-Grenzen der hTERT-Spleißvarianten INS1 (entspricht der σ-Insertionsspleißvariante) und INS3 (entspricht der γ-Inserfionsspleißvariante), wie in 2B von Wick et al. (1999, vorstehend) offenbart, wird in 5 gezeigt. Die in 5 gezeigten Nukleinsäuren, wie in 2B von Wick et al. (1999, vorstehend) offenbart, schließen Nukleotide ein, welche Aminosäurereste kodieren, die in den SEQ ID NR. 1–6 und 11 vorliegen. Wick et al. (1999, vorstehend) nimmt keinen spezifischen Bezug auf das Bestehen der Nukleinsäuren, die als getrennte Gebilde gezeigt werden, oder auf ihre medizinische Verwendung. Wick et al., 1999, vorstehend, stellt einen Bezug zur vollständigen Nukleotidsequenz ihres hTERT-Gens in den GenBank-Zugangsnummern AF128893 und AF128894 bereit.
Nukleinsäuren, die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung kodieren, können durch Oligonukleotidsynthese hergestellt werden. Dies kann durch eine der verschiedenen Verfahren durchgeführt werden, die auf dem Fachgebiet verfügbar sind. Eine Nukleinsäure, die ein Telomeraseprotein kodiert, kann aus einer genomischen oder cDNA-Genbank unter Verwendung des herkömmlichen Genbankabsuchens kloniert werden. Die Sonde kann einem Teil einer Sequenz eines bekannten hTERT-γ-Insertions- und/oder hTERT-σ-Inserfionsgens entsprechen. In einer anderen Ausführungsform kann die Nukleinsäure durch Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erhalten werden. Die Nukleinsäure ist vorzugsweise DNA und kann geeigneterweise in einen Vektor kloniert werden. Subklone können durch Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme erzeugt werden. Die klonierte oder subklonierte DNA kann in einen geeigneten nichthumanen Wirt, zum Beispiel einen Bakterienwirt, übertragen werden. In einer anderen Ausführungsform kann der nichthumane Wirt ein eukaryotischer Organismus, wie Hefe oder Baculovirus sein. Die hTERT-γ-Insertions- und hTERT-σ-Insertionsproteine oder -polypeptide können durch Expression in einem geeigneten nichthumanen Wirt produziert werden. In diesem Fall wird die DNA in einen Expressionsvektor kloniert. Eine Vielzahl von kommerziellen Expressionskits ist erhältlich. Die Verfahren, die in Sambrook, J. et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor) beschrieben sind, können zu diesen Zwecken verwendet werden.
Es wird auch der Vektor oder die Zelle, wie hier beschrieben, gegebenenfalls in isolierter Form bereitgestellt.
Ferner wird das hier beschriebene Bindungsmittel gegebenenfalls in isolierter Form offenbart.
Noch ferner wird der T-Lymphozyt, wie hier beschrieben, gegebenenfalls in isolierter Form bereitgestellt.
Es wird auch die klonale Zelllinie, wie hier beschrieben, gegebenenfalls in isolierter Form offenbart.
Ferner wird das Gemisch von T-Lymphozyten, wie hier beschrieben, bereitgestellt.
Es wird auch ein maschinenlesbarer Datenträger (z.B. eine Disk), die die Sequenz eines Polypeptids oder einer Nukleinsäure, wie hier beschrieben, umfasst, offenbart.
Noch ferner wird ein Verfahren offenbart, das die Verwendung der Sequenz eines Polypeptids oder eines Nukleinsäuremoleküls, wie hier beschrieben, umfasst, um Sequenzidentitätsstudien, Sequenzhomologiestudien oder Hybridisierungsstudien durchzuführen. Das Verfahren kann die Verwendung der Sequenz einschließen, um Struktur und/oder Funktion vorauszusagen (z.B. um Antikrebsaktivität vorauszusagen). Es wird auch die Verwendung dieses Verfahrens in einem Arzneistoffentwicklungs- oder -absuchverfahren bereitgestellt.
Es wird auch ein Computer oder eine Datenbank offenbart, die eine Sequenz eines Polypeptids oder eines Nukleinsäuremoleküls, wie hier beschrieben, anzeigt oder speichert, oder die installiert wird, um ein Verfahren, wie vorstehend beschrieben, durchzuführen.
Die Begriffe „Aminosäurerest" und „Aminosäure" werden breit definiert, um modifizierte und ungewöhnliche Aminosäuren, wie in WIPO-Standard ST.25 definiert und hier durch Bezugnahme aufgenommen, einzuschließen.
Der hier verwendete Begriff Behandlung oder Therapie schließt eine prophylaktische Behandlung oder Therapie, wenn anwendbar, ein.
Der Inhalt von jedem der hier besprochenen Bezüge, einschließlich der darin zitierten Bezüge, wird hier durch Bezugnahme in seiner Ganzheit aufgenommen.
Die Erfindung ist ferner aus der folgenden Beschreibung mit Bezug auf die mehreren dazugehörigen Figuren ersichtlich, welche durch ein Beispiel nur verschiedene Polypeptide und ihre Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung zeigen.
Von den Figuren:
1 ist eine schematische Zeichnung der hTERT-mRNA voller Länge und der Spleißvarianten, die in Krebszelllinien gefunden wurden;
2 zeigt ein Proteinalignment zwischen einem Teil des hTERT-Proteins und Proteinen, die sich aus der Translation der Spleißvarianten ergeben;
3 zeigt die Carboxyltermini der Proteine der hTERT-γ-Insertions- und σ-Insertionsspleißvarianten;
4 zeigt Sequenzen nach dem Stand der Technik, die die hTERT-γ-Insertionsspleißvariante betreffen, wie in 5C von Kilian et al. (1997, vorstehend) offenbart;
5 zeigt Sequenzen nach dem Stand der Technik, die die hTERT-γ-Insertions- und σ-Insertionsspleißvarianten betreffen, wie in 2B von Wick et al. (1999, vorstehend) offenbart;
6 zeigt Ergebnisse von einer RT-PCR-Analyse der Regionen, die die γ-Insertions- (A) und σ-Insertions- (B) Spleißvarianten von hTERT umfassen;
7 zeigt proliferative T Zell-Antworten, die in menschlichen Blutproben durch ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR. 11 induziert wurden;
8 zeigt die Proliferation von T-Zellklonen, die durch ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NR. 11 induziert wurden; und
9 zeigt die Proliferation anderer T-Zellklone, die durch ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NR. 11 induziert wurden.
In 1 ist die Position der Introns, die in der hTERT-Prä-mRNA vorliegen, mit dem Buchstaben „i", gefolgt von einer passenden Zahl, angezeigt. Insertions- und Deletionsvarianten sind als quadratische Kästen gezeigt; eine schattierte Füllung stellt Sequenzen dar, die eine Proteinsequenz kodieren, die im hTERT-Protein voller Länge nicht vorliegt. Position und Orientierung der Oligonukleotidprimer, die verwendet werden, um die verschiedenen Spleißvarianten zu analysieren, wird durch Pfeile angezeigt.
In 2 ist die Aminosäurenumerierung oberhalb der Sequenz gezeigt. Aminosäuren sind durch ihre Standardeinbuchstabenabkürzung, die auf dem Fachgebiet bekannt ist, dargestellt.
In 3 spiegelt SEQ ID NR. 1 das trunkierte Endstück des hTERT-γ-Insertionsproteins wider und spiegelt SEQ ID NR. 2 dasselbe Polypeptid mit einer Verlängerung am Aminoterminus mit den neun Aminosäuren wider, die normalerweise in diesen Positionen im natürlich vorkommenden hTERT-γ-Insertionsexpressionsprodukt (unterstrichen) gefunden werden. SEQ ID NR. 3 spiegelt das trunkierte Endstück des hTERT-σ-Insertionsproteins wider. SEQ ID NR. 4 spiegelt SEQ ID NR. 3 mit einer Verlängerung am Aminoterminus mit den neun Aminosäuren wider, die normalerweise in diesen Positionen im natürlich vorkommenden hTERT-σ-Insertionsexpressionsprodukt (unterstrichen) gefunden werden.
In 4 sind die Exon/Intron-Verbindungen der Insertionsspleißvariante 3 (entspricht der hTERT-γ-Insertionsspleißvariante) gezeigt, wie in 5C von Kilian et al. (1997, vorstehend) bereitgestellt. Die folgende Information ist von Kilian et al. (1997, vorstehend) bereitgestellt: die Nukleinsäuresequenz ist oberhalb einer Proteintranslationssequenz gezeigt, wobei das mutmaßliche nichtgespleißte Intron in Fettschrift angegeben ist; mutmaßliche Exon/Intron-Verbindungen sind mit | gekennzeichnet; die Nukleinsäuresequenznumerierung entspricht wie folgt: Nukleotid 1 entspricht Nukleotid 139 der Sequenz in der GenBank-Zugangsnummer AF015950; und die Aminosäuren, die der mutmaßlichen c-Abl/SH3-Bindungsstelle entsprechen, sind unterstrichen. Die Aminosäuresequenz, die bei Kilian et al. (1997; vorstehend) gezeigt ist, stellt das C-terminale Ende eines circa 1100 Aminosäurereste umfassenden Proteins einer hTERT-γ-Insertionspleißvariante dar.
In 5 sind die Nukleotide der Exon-Intron-Grenzen der hTERT-Spleißvarianten INS1 (entspricht der σ-Insertionsspleißvariante) und INS3 (entspricht der γ-Insertionsspleißvariante), wie in 2B von Wick et al. (1999, vorstehend) offenbart, dargestellt. Intron- und Exon-Sequenzen sind in Klein- beziehungsweise Großbuchstaben gezeigt. Wick et al. (1999, vorstehend) zeigen an, dass die Nukleotidsequenz ihres hTERT-Gens als GenBank-Zugangsnummern AF128893 und AF128894 hinterlegt worden ist.
Es ist dargelegt worden, dass die hTERT-γ-Insertions- und σ-Insertionsspleißvarianten in Krebszelllinien und Tumoren exprimiert werden, aber nicht detektierbar sind, oder in normalen Zellen in sehr geringen Mengen vorliegen. Die vorliegende Anmeldung offenbart deshalb allgemeine Krebsimpfstoffanwärter mit verbesserter Spezifität im Vergleich mit den Impfstoffen, die auf der funktionellen Variante des Telomerase- (hTERT-) Proteins beruhen. Sowohl γ- als auch σ-Insertionen haben die Erzeugung eines frühen Stoppcodons und die Expression eines Proteins, das am Carboxylterminus trunkiert ist, zur Folge. Die trunkierfen hTERT-γ- und -σ-Insertionsproteine weisen selbst keine Telomeraseaktivität auf. Im Fall einer γ-Insertion ist das trunkierte Endstück des Proteins eine Sequenz von 44 Aminosäuren (SEQ ID NR. 1). Eine σ-Insertion hat ein Protein zur Folge, in welchem das trunkierte Endstück eine Sequenz von 20 Aminosäuren (SEQ ID NR. 3) ist. Sie werden hauptsächlich in Krebszelllinien exprimiert, sind aber nicht detektierbar, oder liegen in normalen Zellen in sehr geringen Mengen vor und sind deshalb Targets für die spezifische Immuntherapie. Gemäß der vorliegenden Erfindung sind Polypeptide, die dem Carboxylende (dem trunkierten Endstück) der Proteine entsprechen, die durch hTERT-γ-Insertions- und/oder σ-Insertionsspleißvarianten exprimiert wurden, als Antikrebsmittel oder Impfstoffe mit der Funktion, den zellulären Arm des Immunsystems (T-Zellen) in Menschen gegen Krebszellen zu aktivieren, nützlich. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Polypeptid die Sequenz gemäß SEQ ID NR. 5. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Polypeptid die Sequenz gemäß SEQ ID NR. 6. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polypeptid die Sequenz gemäß SEQ ID NR. 11.
Experimente
Die Experimente, die hier umrissen sind, beschreiben die Charakterisierung der hTERT- Spleißvarianten in verschiedenen Krebszelllinien, die mit normalen Zellen verglichen werden. Die Synthese von Polypeptiden gemäß der vorliegenden Erfindung und die Experimente zur Prüfung der Wirksamkeit der Polypeptide zur Verwendung in der Krebstherapie sind ausführlich beschrieben. Ein Experiment, das die Induktion und Proliferation von menschlichen T-Zellen durch das Peptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR. 11 zeigt, wird beschrieben.
RT-PCR-Analyse der γ-Insertions- und σ-Insertionsspleißvarianten von hTERT
RNA-Analyse:
Poly(A)⁺-mRNA von vollständig lysierten Zellen wurde unter Verwendung von magnetischen Oligo(dT)-Kügelchen (Dynal AS; Jakobsen, K.S. et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 3669) direkt aus Rohlysaten isoliert. Zytosolische mRNA-Fraktionen wurden durch Inkubieren von Zellen in 1% IGEPAL (Sigma) eine Minute lang bei 0°C, gefolgt von Zentrifugation [10000 × g; 1 min.; 4°C], um Kerne zu entfernen, hergestellt. Poly(A)⁺-mRNA wurde dann unter Verwendung von Oligo(dT)-Kügelchen, wie vorstehend beschrieben, aus dem Überstand isoliert.
cDNA-Synthese und PCR:
Erststrang-cDNA-Synthese wurde mit Standardverfahren unter Verwendung von M-MLV RNaseH+-Reverser Transkriptase (Promega Corp.) durchgeführt, und die PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von HotStar Taq-DNA-Polymerase (Qiagen) und 35 Zyklen langes Laufenlassen in einem thermischen Cycler PTC-200 (MJ Research) durchgeführt. Um detektierbare Produkte aus PBM- und CD34⁺-Zellen zu erhalten, wurde 10% der Umsetzung als Matrize in einer zweiten PCR-Reaktion verwendet und durch 15 weitere Zyklen amplifiziert.
Zur Analyse der γ-Insertionsspleißvariante wurden die Plusstrang-Primervariante, die Plusstrang-Primer hTERT-p3195 (5-GCC TCC CTC TGC TAC TCC ATC CT – SEQ ID NR. 7) und Minusstrang-Primer hTERT-m3652 (5-CGT CTA GAG CCG GAC ACT CAG CCT TCA – SEQ ID NR. 8) verwendet. Angewendet auf die hTERT-cDNA voller Länge und γ-Insertionsvariante, erzeugen diese Primer Fragmente von 465 beziehungsweise 624 Nukleotiden. Die Analyse der σ-Insertionsvariante wurde unter Verwendung der Primer hTERT-P6 (5-GCC AAG TTC CTG CAC TGG CTG A – SEQ ID NR. 9) und hTERT-m2044 (5-GCT CTA GAA CAG TGC CTT CAC CCT CG – SEQ ID NR. 10) durchgeführt. Das Amplifikationsprodukt, das sich aus dem Verwenden dieser Primer mit hTERT-cDNA voller Länge ergab, und die σ-Insertionsvariante umfassten 369 beziehungsweise 407 Nukleotide. Um zu überprüfen, dass diese PCR-Produkte echte Spleißvarianten darstellen, wurden die Fragmente aus dem Gel isoliert und durch direktes Sequenzieren mit einem automatisierten ABI Prism 310-Sequenzer (PE Corp.) analysiert.
Ergebnisse:
Die Telomeraseaktivität ist komplizierter Regulierung auf der posttranskriptionellen Ebene unterworfen, und die Verfahren, die verwendet werden, um die Gegenwart oder das Fehlen von Telomeraseproteinen zu detektieren, sollten direkte Messungen des Proteins selbst oder in einer anderen Ausführungsform von mRNA-Varianten einschließen. Ausserdem korreliert die Häufigkeit der verschiedenen hTERT-Spleißvarianten, die in den Zellen gefunden wurden, nicht notwendigerweise mit den Mengen, die in der zytosolischen Fraktion derselben Zellen gefunden wurden (siehe 6). Derartige Abweichungen können durch Unterschiede in der Wirksamkeit, mit welcher mRNA-Varianten aus dem Kern zum zytosolischen Kompartiment transportiert werden, und/oder durch unterschiedliche Stabilität der spezifischen Spleißvarianten im Zytosol erklärt werden. Es ist auf dem Fachgebiet bekannt, dass derartige Mechanismen Teil des Konzeptes der Genregulierung sind. Dennoch haben die Studien, die durchgeführt wurden, um die hTERT-Regulierung zu erklären, einschließlich jener, die vorstehend zitiert sind, Gesamt-RNA oder mRNA, die aus vollständig lysierten Zellen isoliert wurde, für ihre Analyse verwendet. Die Kits und Reagenzien, die erforderlich sind, um diese Art von RNA-Isolierung durchzuführen, sind im kommerziellen Markt weit verfügbar. Um ein korrektes Bild der Genexpression zu erhalten, sollten Untersuchungen über die mRNA-Häufigkeit die Analyse von mRNA einschließen, die spezifisch für das zytosolische Kompartiment ist.
6 zeigt Ergebnisse von der RT-PCR-Analyse der Regionen, die die γ-(A) und σ-Insertionsvarianten (B) von hTERT umfassen. HL60, K562 und Jurkat bezeichnen die analysierten Krebszelllinien. HL60 ist eine Promyelozytenleukämie-Zelllinie (Sokoloski, J.A. et al., 1993, Blood 82: 625–632), K562 ist eine Erythroleukämie-Zelllinie (Lozzio, C.B. et al., 1975, Blood 45: 321–324), während Jurkat sich von den akuten T-Lymphozytenleukämiezellen ableitet (Gillis, S. et al., 1980, J. Exp. Med. 152: 1709–1719). Die HL60-, K562- und Jurkat-Krebszelllinien sind im Handel erhältlich (zum Beispiel von ATCC, Oslo). PBM1, PBM2, PBM3 und PBM4 stellen Populationen von peripheren einkernigen Blutzellen (PBM) dar, die aus vier verschiedenen gesunden Donoren isoliert wurden. CD34 bezeichnet CD34-positive Stammzellen, die aus einem gesunden Donor isoliert wurden, und CC1/CC2 bezeichnet die Dickdarmkrebsbiopsien, die von zwei Krebspatienten am Norwegischen Radiumkrankenhaus (Norwegian Radium Hospital), Oslo erhalten wurden, wobei CC2a und CC2b zwei Gewebeproben sind, die vom selben Tumor seziert wurden. RT-PCR-Reaktionen, die mit mRNA, die durch vollständige Lyse von Zellen isoliert wurde, und mit mRNA, die aus zytosolischen Fraktionen isoliert wurde, durchgeführt wurden, werden mit den Buchstaben „T" beziehungsweise „C" bezeichnet. „M" zeigt die Spur mit dem Molekulargewichtsmarker an. Die Position der PCR-Fragmente, die die γ- und σ-Insertionsspleißvarianten und die jeweiligen hTERT-Produkte voller Länge (+) darstellen, ist auf der rechten Seite der Felder angezeigt.
Die RT-PCR-Analyse zeigte, dass sowohl die γ- als auch σ-Insertionsspleißvarianten in allen Krebszelllinien und in einer der analysierten Tumorproben (CC2b) leicht detektierbar waren, und wobei die σ-Insertionsvariante als die häufigste in den zytosolischen Fraktionen erscheint. Im Gegensatz dazu waren wir nicht in der Lage, diese Varianten in Populationen zytosolischer mRNA, die aus PBM-Zellen isoliert wurden, trotz umfangreicher PCR-Amplifikation, die mit diesen Proben durchgeführt wurde, zu detektieren. Die Identität des schwachen 395 bp-Fragments, das mit den σ-Insertionsprimern an PBM- und CD34-positiven Zellen produziert wurde, ist zur Zeit unbekannt.
Polypeptidsynthese und -analyse für Anwendungen, die Krebs betreffen
Polypeptidsynthese:
Die Polypeptide wurden unter Verwendung der Durchfluss-Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert. N-a-Fmoc-Aminosäuren mit geeignetem Seitenkettenschutz wurden verwendet. Die Fmoc-Aminosäuren wurden zur Kupplung als Pentafluorphenylester oder unter Verwendung entweder von TBTU oder Diisopropylcarbodiimidaktivierung vor der Kupplung aktiviert. 20% Piperidin in DMF wurde zum selektiven Entfernen von Fmoc nach jeder Kupplung verwendet. Spaltung vom Harz und abschließendes Entfernen des Seitenkettenschutzes wurde durch 95% TFA, das geeignete Reiniger enthält, durchgeführt. Die Polypeptide wurden gereinigt und durch Reverse Phase-HPLC analysiert. Die Identität der Polypeptide wurde unter Verwendung der Elektronenspray-Massenspektroskopie bestätigt.
Polypeptidprüfung und Krebstherapie:
Damit ein Krebsimpfstoff gemäß der vorliegenden Erfindung und Verfahren zur spezifischen Krebstherapie, die auf der T-Zellimmunität beruht, wirksam sind, müssen zwei Bedingungen erfüllt sein:

(a) das Polypeptid ist mindestens 8 Aminosäuren lang und ist ein Fragment des hTERT-γ-Insertionsproteins oder das des hTERT-σ-Insertionsproteins und
(b) das Polypeptid ist in der Lage, entweder in seiner vollen Länge oder nach Verarbeitung durch eine Antigen-präsentierende Zelle T-Zell-Antworten zu induzieren.

Die folgenden experimentellen Verfahren können verwendet werden, um zu bestimmen, ob diese beiden Bedingungen für ein bestimmtes Polypeptid erfüllt sind. Zuerst sollte bestimmt werden, ob das bestimmte Polypeptid T-Zellimmunantworten in vitro entstehen lässt. Es muss auch nachgewiesen werden, ob die synthetischen Polypeptide Polypeptidfragmenten entsprechen oder in der Lage sind, diese nach Verarbeitung zu ergeben, die Polypeptidfragmenten entsprechen, die in Krebszellen, die das hTERT-γ-Insertionsprotein und/oder das hTERT-σ-Insertionsprotein beherbergen, oder Antigen-präsentierenden Zellen vorkommen, die natürlich vorkommendes hTERT-γ-Insertionsprotein und/oder hTERT-σ-Insertionsprotein verarbeitet haben. Die Spezifität von T-Zellen, die in vivo durch Schutzimpfung mit hTERT-γ-Insertions- und/oder hTERT-σ-Insertionspolypeptid induziert wurden, kann auch bestimmt werden.
In vitro-Analyse der T-Zell-Antwort:
Es ist erforderlich, zu bestimmen, ob hTERT-γ-Insertion- und/oder hTERT-σ-Insertionexprimierende Tumorzelllinien durch die T-Zellklone abgetötet werden können, die aus peripherem Blut von Krebspatienten nach Schutzimpfung mit hTERT-γ-Insertions- und/oder hTERT-σ-Insertionspolypeptid erhalten werden. T-Zellklone werden nach dem Klonieren von T-Zellblasten, die in peripheren einkernigen Blutzellen (PBMC) vorliegen, aus einem Krebspatienten nach Schutzimpfung mit hTERT-γ-Insertions- und/oder hTERT-σ-Insertionspolypeptid erhalten. Das Protokoll der Schutzimpfung mit Polypeptid schließt mehrere intrakutane in vivo-Injektionen von Polypeptiden mit GM-CSF oder einem anderen häufig verwendeten Hilfsstoff ein. Das Klonieren von T-Zellen wird durch das Ausplattieren von antwortenden T-Zellblasten mit 5 Blasten pro Vertiefung auf Terasaki-Platten durchgeführt. Jede Vertiefung enthält 2 × 104 autogene, bestrahlte (30 Gy) PBMC als Fütterzellen (Feeder cells). Die Zellen werden mit dem Anwärter-hTERT-γ-Insertionsund/oder hTERT-σ-Insertionspolypeptid bei 25 μM und 5 U/ml rekombinantem Interleukin-2 (rIL-2) (Amersham, Aylesbury, UK) in einem Gesamtvolumen von 20 ml gezüchtet. Nach 9 Tagen werden T-Zellklone auf Flachbodenplatten mit 96 Vertiefungen (Costar, Cambridge, MA) mit 1 mg/ml Phythämagglutinin (PHA, Wellcome, Dartford, UK), 5 U/ml rIL-2 und allogenen bestrahlten (30 Gy) PBMC (2 × 105) pro Vertiefung als Fütterzellen überführt. Wachsende Klone werden in Platten mit 24 Vertiefungen mit PHA/rIL-2 und 1 × 10⁶ allogenen, bestrahlten PBMC als Fütterzellen weiter ausgebreitet und nach 4 bis 7 Tagen auf Polypeptidspezifität abgesucht.
T-Zellklone werden für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Der Zelloberflächenphänotyp des T-Zellklons wird bestimmt, um zu ermitteln, ob der T-Zellklon CD4⁺ oder CD8⁺ ist. Der T-Zellklon wird mit autogenen Tumorzelltargets bei verschiedenen Effektor-Target-Verhältnissen inkubiert, um zu bestimmen, ob Lyse von Tumorzellen auftritt. Lyse zeigt an, dass die T-Zelle Reaktivität aufweist, die gegen ein Tumor-abgeleitetes Antigen, zum Beispiel hTERT-γ-Insertions- und/oder hTERT-σ-Insertionsproteine, gerichtet ist.
Korrelation zwischen Polypeptiden und in vivo-hTERT-Insertionsfragmenten:
Um nachzuprüfen, dass das erkannte Antigen mit dem hTERT-γ-Insertionsprotein oder dem hTERT-σ-Insertionsprotein verbunden ist, und um das HLA-Klasse I- oder -Klasse II-Molekül zu identifizieren, das das mutmaßliche hTERT-γ-Insertions- oder hTERT-σ-Insertionspolypeptid dem T-Zellklon präsentiert, werden verschiedene hTERT-γ-Insertionund/oder hTERT-σ-Insertion-exprimierende Tumorzelllinien, die eines oder mehrere HLA-Klasse I- oder -Klasse II-Moleküle wie jene des Patienten tragen, als Targetzellen in Zytotoxizitätsanalysen verwendet. Die Targetzellen werden über Nacht mit ⁵¹Cr oder ³H-Thymidin (9,25 × 10⁴ Bq/ml) markiert, einmal gewaschen und mit 5000 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert. T-Zellen werden bei verschiedenen Effektor-Target-Verhältnissen zugefügt, und die Platten werden 4 Stunden lang bei 37°C inkubiert und dann vor dem Zählen in einem Flüssigszintillationszähler (Packard Topcount) geerntet. Zum Beispiel können die Blasenkrebszelllinie T24 (12Val⁺, HLA-A1⁺, B35⁺), die Melanomzelllinie FMEX (12Val⁺, HLA-A2⁺, B35⁺) und die Dickdarmkrebszelllinie SW 480 (12Val⁺, HLA-A2⁺, B8⁺) oder jede andere Telomerase-positive Tumorzelllinie als Targetzellen verwendet werden. Eine geeignete Zelllinie, welche keine hTERT-γ-Insertions- und/oder hTERT-σ-Insertionsproteine exprimiert, kann als Kontrolle verwendet werden und sollte nicht lysiert werden. Lyse einer bestimmten Zelllinie zeigt an, dass der T-Zellklon, der geprüft wird, ein endogen-verarbeitetes hTERT-γ-Insertions- und/oder hTERT-σ-Insertionsepitop im Zusammenhang mit dem HLA-Klasse I- oder -Klasse II-Subtyp, der durch diese Zelllinie exprimiert wird, erkennt.
Charakterisierung von T-Zellklonen:
Die HLA-Klasse I- oder -Klasse II-Restriktion eines T-Zellklons kann durch Blockierexperimente bestimmt werden. Monoklonale Antikörper gegen HLA-Klasse I-Antigene, zum Beispiel der monoklonale Pankreas-HLA-Klasse I-Antikörper W6/32, oder gegen Klasse II-Antigene, zum Beispiel monoklonale Antikörper, die gegen HLA-Klasse II-DR-, -DQ- und -DP-Antigene (B8/11, SPV-L3 und B7/21) gerichtet sind, können verwendet werden. Die T-Zellklonaktivität gegen die autogene Tumorzelllinie wird unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die gegen HLA-Klasse I- und -Klasse II-Moleküle gerichtet sind, bei einer Endkonzentration von 10 μg/ml bewertet. Die Analysen werden, wie vorstehend beschrieben, in Platten mit 96 Vertiefungen dreifach durchgeführt, und die Targetzellen werden vor der Zugabe von T-Zellen 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert.
Die Feinspezifität eines T-Zellklons kann unter Verwendung von Polypeptid-pulsing-Experimenten bestimmt werden. Um das hTERT-γ-Insertions- und/oder hTERT-σ-Insertionspolypeptid zu identifizieren, das durch einen T-Zellklon tatsächlich erkannt wird, wird eine Fülle von Nonamerpolypeptiden getestet. ⁵¹Cr oder ³H-Thymidin markierte, mildsauer eluierte autogene Fibroblasten werden mit 2500 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert und mit den Polypeptiden bei einer Konzentration von 1 μM zusammen mit b2-Mikroglobulin (2,5 μg/ml) in einem 5%-CO₂-Inkubator bei 37°C vor der Zugabe von T-Zellen pulsiert. Die Analysen werden in Platten mit 96 Vertiefungen dreifach durchgeführt und 4 Stunden lang mit einem Effektor-Target-Verhältnis von 5 zu 1 inkubiert. Kontrollen können einen T-Zellklon einschließen, der alleine, mit APC in Abwesenheit von Polypeptiden oder mit einem irrelevanten Melanom-assoziierten Polypeptid MART-1/Melan-A-Polypeptid gezüchtet wird.
Ein alternatives Protokoll zum Feststellen der Feinspezifität eines T-Zellklons kann auch verwendet werden. In diesem alternativen Protokoll wird die TAP-defiziente T2-Zelllinie als Antigen-präsentierende Zellen verwendet. Diese Zelllinie exprimiert nur kleine Mengen des HLA-A2-Antigens, aber erhöhte Mengen von HLA-Klasse I-Antigenen an der Zelloberfläche können durch Zugabe von b2-Mikroglobulin induziert werden. ³H-markierte Targetzellen werden mit den unterschiedlichen Testpolypeptiden und Kontrollpolypeptiden bei einer Konzentration von 1 μM zusammen mit b2-Mikroglobulin (2,5 μg/ml) eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Nach dem Pulsieren mit dem Polypeptid werden die Targetzellen ausführlich gewaschen, gezählt und vor der Zugabe der T-Zellen mit 2500 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert. Die Platten werden vor dem Ernten 4 Stunden lang bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Kontrollen schließen einen T-Zellklon ein, der alleine oder mit Targetzellen in Abwesenheit von Polypeptiden gezüchtet wird. Die Analysen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen mit einem Effektor-Target-Verhältnis von 20 zu 1 dreifach durchgeführt.
Die Sensitivität eines T-Zellklons gegenüber einem vorstehend identifizierten bestimmten Polypeptid kann auch unter Verwendung eines Dosis-Wirkungs-Experiments bestimmt werden. Polypeptid-sensibilisierte Fibroblasten können als Targetzellen verwendet werden. Die Targetzellen werden mit dem bestimmten Peptid, wie für die Bestimmung der Feinspezifität vorstehend beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Peptide bei unterschiedlichen Konzentrationen vor der Zugabe der T-Zellen zugegeben werden, gepulst. Die Kontrollen schließen Targetzellen alleine und mit dem irrelevanten Melanom-assoziierten Peptid Melan-A/Mart-1 gepulste Targetzellen ein.
Induktion und Proliferation von menschlicher T-Zell-Antwort auf das hTERT-σ-Insertionspegtid
In diesem Experiment wurden periphere einkernige Blutzellen (PBMC) von vier gesunden Menschen (Donor „14328", „14313", „23244" und „23255") isoliert und sieben Tage lang mit dendritischen Zellen vorbereitet, die mit dem SEQ ID NR. II-Peptid gepulst waren, das sich vom hTERT-σ-Insertionspolypeptid ableitet, gefolgt von zwei Zyklen, die aus sieben Tage langer erneuter Stimulierung mit Peptid-gepulsten autogenen PBMC bestehen. Die dendritischen Zellen waren von Monozyten aus peripherem Blut abgeleitet. T-Zellen aus der so erhaltenen Massenkultur wurden mit oder ohne Peptid-gepulsten Antigenpräsentierenden Zellen (APC) vor dem Ernten nach 3 Tagen dreifach geprüft. Um die proliferative Kapazität der Kulturen zu messen, wurde vor dem Ernten über Nacht ³H-Thymidin (3,7 × 10⁴ Bg/Vertiefung) zur Kultur zugefügt. Kulturen mit nicht-gepulsten APC oder ohne APC dienten als Kontrollen. Die Ergebnisse, die die proliferative Kapazität der Kulturen zeigen, sind in 7 gezeigt. Weitere Einzelheiten des verwendeten Protokolls sind nachstehend dargelegt.
T-Zellklone wurden aus den so erhaltenen Massenkulturen von den nicht geimpften Donoren 14313 und 23255 erhalten. Die Klone wurden aus T-Zellblasten erhalten, die in PRMCs vorliegen, wie in dem vorstehenden Abschnitt „In vitro T-Zell-Antwort-Analyse" beschrieben. Die Ergebnisse der Proliferation der T-Zellklone mit Peptid-gepulsten und Nichtpeptidgepulsten Antigen-präsentierenden Zellen sind in 8 (Donor 14313) und 9 (Donor 23255) gezeigt.
Die Ergebnisse in den 7, 8 und 9 sind als mittlere Zählungen pro Minute (cpm) von dreifachen Messungen angegeben. Die Daten legen dar, dass das Blut von Menschen zirkulierende T-Zellen enthält, die für ein Peptid spezifisch sind (SEQ ID NR. 11), das sich vom Peptid ableitet, das sich von dem hTERT-σ-Insertionspolypeptid ableitet, und ausserdem dass sich derartige T-Zellen im Anschluss an eine Stimulierung mit dem relevanten Peptid in vitro ausbreiten können.
Folglich zeigen die Experimente der 7, 8 und 9, dass das hTERT-σ-Insertionspolypeptid im Menschen immunogen ist. in vitro- (oder in vivo-) Stimulierung kann dies hTERT-σ-Insertionsprotein-spezifische T Zell-Antworten mit der Möglichkeit hervorrufen, dasselbe Antigen zu erkennen, wenn es durch einen Tumor, der bei einem Krebspatienten wächst, überexprimiert wird. Dieses besondere Experiment legt dar, dass das Peptid der SEQ ID NR. 11 prinzipiell als Krebsimpfstoff in Menschen entwickelt werden könnte.
Protokoll zur Induktion von MHC-Klasse II-beschränkter T Zell-Antwort
Tag 0:
PBMCs wurden aus 50 ml Blut (aus Buffy coat) abgetrennt. Die Zellen wurden in komplettem RPMI-1640/15% Poolserum gezählt und resuspendiert.
Massenkulturen wurden mit 1–2 Vertiefungen auf einer Platte mit 24 Vertiefungen von PBMCs bei 2 × 106 Zellen/ml in 1–1,5 ml angesetzt. 25 μM SEQ ID NR. II-Peptid, das sich vom hTERT-σ-Insertionspolypeptid ableitet, wurden zugefügt.
Tag 9-10:
Die Massenkulturen wurden geerntet und mit bestrahlten PBMCs und Peptid stimuliert. Wenn es viel Zelltod gab, wurden die Kulturen mit Lymphoprep getrennt, andernfalls wurden sie gezählt und in RPMI/15% Poolserum resuspendiert. (Lymphoprep-Zentrifugation von Massenkulturen wird in 15 ml-Falkonröhrchen durch 1 durchgeführt; Zufügen von 8 ml Zellensuspension und 2; Unterlegen mit 2 ml Lymphoprep. 30 Minuten langes Zentrifugieren bei 1500 U/min und zweimal waschen mit Salzwasser). Ein Fläschchen von autogenen PBMCs wurde aufgetaut, gewaschen, gezählt und in RPMI/15% FCS resuspendiert. Die PBMCs wurden bestrahlt (25 Gy, 5 min 58 sek). Zellen wurden auf Platten mit 24 Vertiefungen ausplattiert. 0,5 – 2,0 × 106 T-Zellen aus Massenkulturen wurden mit 1 × 106 bestrahlten Futterzellen (PBMCs) und 25 μM SEQ ID NR. II-Peptid stimuliert. Das Endvolumen betrug 1 ml.
Tag 12:
IL-2 (10 U/ml) wurde zugefügt. Medium wurde, wenn notwendig, durch Ersetzen des halben Volumens auch zugefügt. Kulturen wurden, wenn notwendig, geteilt.
Tag 17:
Die T-Zellen in der Massenkultur wurden wie an Tag 10 mit autogenen bestrahlten PBMC's und SEQ ID NR. II-Peptid stimuliert.
Tag 19:
IL-2 (10 U/ml) wurde zu den an Tag 17 erneut stimulierten Massenkulturen zugefügt.
Tag 24:
Eine Proliferationsanalyse zur Prüfung von T-Zellen auf Peptidspezifität wurde in Platten mit 96 Vertiefungen angesetzt, jede Bedingung dreifach:

¹ 50000 bestrahlte PBMCs,
² 50000 T-Zellen aus der Massenkultur,
³ 1 U/ml,
⁴ 25 μg/ml SEQ ID NR. 11-Peptid

An Tag 2–3 der Proliferationsanalyse wurde ³N-Thymidin (20 μl) zugefügt und vor dem Ernten bei 37°C über Nacht inkubiert.
In einer Variante des Protokolls (wie im vorstehenden Beispiel verwendet) wurden die PBMCs am Tag 0 mit dendritischen Zellen, die mit SEQ ID NR. 11 gepulst waren, vorbereitet. Sequenzverzeichnis

Claims

Polypeptid zur Verwendung in der Medizin, wobei das Polypeptid eine Sequenz umfasst, die in den SEQ ID NR. 3, 4, 5 oder 6 angegeben sind, und wobei das Polypeptid in der Lage ist, eine T-Zell-Antwort zu induzieren.
Polypeptid zur Verwendung in der Medizin gemäß Anspruch 1; wobei das Polypeptid keine intrazelluläre Spaltung benötigt, um in eine MHC- oder HLA-Klasse II-Bindungsfurche zu passen, und wobei es 12 bis 15 Aminosäuren lang ist.
Polypeptid zur Verwendung in der Medizin gemäß Anspruch 1 oder 2; wobei die T-Zell-Antwort die Anzahl und/oder Aktivität von T-Helfer- und/oder zytotoxischen T-Zellen erhöht.
Nukleinsäuremolekül zur Verwendung in der Medizin; wobei das Nukleinsäuremolekül: a) einen Strang aufweist, der ein Polypeptid kodiert, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beschrieben; b) einen Strang aufweist, der zu einem Strang, wie vorstehend in a) beschrieben, komplementär ist; oder c) einen Strang aufweist, der unter stringenten Bedingungen mit einem Molekül, wie vorstehend in a) oder b) beschrieben, hybridisiert.
Vektor oder Zelle zur Verwendung in der Medizin, umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 4 in rekombinanter Form.
T-Lymphozyt zur Verwendung in der Medizin; wobei die T-Lymphozyte in der Lage ist, eine Zelle zu töten, die ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 exprimiert, oder beim Töten einer solchen Zelle zu helfen.
Verwendung eines Polypeptids, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beschrieben, einer Nukleinsäure, wie in Anspruch 4 beschrieben, oder eines Vektors oder einer Zelle, wie in Anspruch 5 beschrieben, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs oder bei der Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Diagnose von Krebs.
Verwendung gemäß Anspruch 7; wobei der Krebs ein Säugetierkrebs ist.
Verwendung gemäß Anspruch 8; wobei der Krebs ein Krebs beim Menschen ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9; wobei der Krebs Brustkrebs, Prostatakrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Kolorektalkrebs, Lungenkrebs, ein malignes Melanom, Leukämie, ein Lymphom, Ovarialkrebs, Gebärmutterhalskrebs oder Krebs der Gallengänge ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10; wobei das Medikament ein Impfstoff ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10; wobei das diagnostische Mittel in einem Kit bereitgestellt wird.
Arzneimittel, umfassend ein Polypeptid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beschrieben eine Nukleinsäure, wie in Anspruch 4 beschrieben, oder einen Vektor oder eine Zelle, wie in Anspruch 5 beschrieben.
Arzneimittel gemäß Anspruch 13, das ferner ein Polypeptid umfasst, das in der Lage ist, eine T-Zell-Antwort zu induzieren, die gegen ein Polypeptid, das von einem Onkogen produziert wird, oder gegen eine Mutante eines Tumorsuppressorproteins oder eine Nukleinsäure, die ein solches Polypeptid kodiert, gerichtet ist.
Arzneimittel gemäß Anspruch 14; wobei das Onkogen oder die Mutante eines Tumorsuppressorproteins p21-ras, Rb, p53, abl, gip, gsp, ret oder trk ist.
Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger, ein Verdünnungsmittel, einen Zusatzstoff, ein Stabilisierungsmittel und/oder einen Hilfsstoff; wobei die Zusammensetzung oder kombinierte Präparation gegebenenfalls ferner ein oder mehrere eines Zytokins oder eines Wachstumfaktors einschließen.
Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 13 bis 16, welches ein Impfstoff ist.