NO332137B1 - Polypeptid, nukleinsyre, T-lymfocytt og vektor for anvendelse innen medisin samt farmasoytisk sammensetning omfattende nevnte polypeptid. - Google Patents

Abstract

Oppfinnelsen angår polypeptider nukleinsyre DNA som koder for disse polypeptidene, hvilket er i stand til å indusere en immunreaksjon mot cancer, fremgangsmåter for å generere T-lymfocytter som er i stand til å gjenkjenne og ødelegge tumorceller og farmasøytiske sammensetninger for behandling, profylakse eller diagnose av cancer.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår polypeptider og nukleinsyre-DNA som koder for disse polypeptidene, som er i stand til å indusere en immunreaksjon mot cancer, fremgangsmåter for å generere T-lymfocytter som er i stand til å gjenkjenne og ødelegge tumorceller, og farmasøytiske preparater for behandling, profylakse eller diagnose av cancer.

Cancer utvikles gjennom en flertrinnsprosess som involverer flere mutasjonshendelser. Disse mutasjoner resulterer i endret ekspresjon/funksjon av gener som tilhører to kategorier, onkogener og tumorsuppressorgener. Onkogener oppstår naturlig fra proto-onkogener gjennom punktmutasjoner eller translokasjoner, hvorpå cellen som huser denne mutasjon går over i en transformert tilstand. Onkogener koder for og fungerer gjennom et protein. Protoonkogener er normale gener i celler som har potensiale for å bli onkogener. I de fleste tilfeller er proto-onkogener vist å være komponenter av signaltransduksjonsreaksjonsveier. Onkogener virker på en dominant måte. Tumorsuppressorgener på den annen side virker på en recessiv måte, dvs. gjennom tap av funksjon, og bidrar til onkogenesen når begge alleler som koder for det funksjonelle protein er endret til å produsere ufunksjonelle genprodukter.

Innen feltet human cancer-immunologi er det i løpet av de siste to tiår gjort anstrengende forsøk på å karakterisere genuine cancerspesifikke antigener. 1 særdeleshet er anstrengelser med hensyn på analyse av antistoffer mot humane tumorantigener. Kjent teknikk antyder at slike antistoffer kan anvendes for diagnostiske og terapeutiske hensikter, for eksempel i forbindelse med et anti-cancermiddel. Antistoffer kan imidlertid bare bindes til tumorantigener som er eksponert på overflaten av tumorceller. Av denne årsak er forsøkene på å frembringe en cancerbehandling basert på kroppens immunsystem vært mindre vellykket enn antatt.

Et fundamentalt trekk ved immunsystemet er at det kan skille egne fra fremmede molekyler og at det normalt ikke reagerer mot egne molekyler. Det er vist at avstøting av vev eller organer fra andre individer av en immunrespons mot fremmede antigener på overflaten av de transplanterte celler. Immunresponsen omfatter en humoralrespons mediert av antistoffer, og en cellulær respons. Antistoffene produseres og utskilles av B-lymfocytter, og gjenkjenner typisk frie antigener i nativ konformasjon. De kan derfor potensielt gjenkjenne nesten et hvilket som helst sete eksponert på antigenoverflaten. I motsetning til antistoffer gjenkjenner T-celler som medierer den cellulære delen av immunsystemet, bare antigener sammen med histokompatibihtetskompleks-moekyler-(MHC)-molekyler, og bare etter hensiktsmessig antigen prosessering. Denne antigenprosessenng består vanligvis av proteolytiske fragmentering av proteinet, hvilke resulterer i polypeptider som passer inn i gropen til MHC-molekylene. Dette gjør T-cellene i stand til også å gjenkjenne polypeptider avledet fra intracellulære proteinfragmenter/antigener.

T-celler kan gjenkjenne avkortede polypeptider avledet fra hvor som helst i tumorcellen, sammen med MHC-molekyler på overflaten av tumorcellen. T-cellene kan deretter aktiveres til å eliminere tumorcellen som inneholder dette avkortede polypeptid. I eksperimentelle modeller som involverer musetumorer er det vist at punktmutasjoner i intracellulære egne proteiner kan gi opphav til tumoravstøtningsantigener, bestående av polypeptider som er forskjellig i bare en enkelt aminosyre i forhold til det normale polypeptidet. T-cellene gjenkjenner disse polypeptider sammen med MHC-molekylene på overflaten av tumorcellene og er i stand til å drepe tumorcellene og følgelig avstøte tumoren fra verten (Boon et al., 1989, Cell 58: 293-303).

MHC-molekylene hos menneske betegnes normalt som HLA (human leukocyte antigen)-molekyler. Det er to hovedklasser av HLA-molekyler: klasse I og klasse II. HLA klasse I-molekyler kodes av HLA A-, B- og C-subloci og aktiverer primært CD8+ cytotoksiske T-celler. HLA klasse II-molekylene aktiverer på den annen side primært CD4+ (cytotoksiske eller hjelper) T-celler, og kodes av HLA DR, DP og DQ-subloci. Hvert normalt individ har seks ulike HLA klasse I-molekyler, vanligvis to alleler fra hver av de tre undergruppene A, B og C, selv om antallet av forskjellige HLA klasse I-molekyler i noen tilfeller er redusert på grunn av forekomst av det samme HLA-allelet to ganger. For en generell oversikt se avskrift Roitt, LM. et al. (1998) Immunology, 5<lh>utgave, Mosby, London.

HLA-genproduktene er svært polymorfe. Ulike individer uttrykker ulike HLA-molekyler som er forskjellig fra de som finnes i andre individer. Dette forklarer vanskeligheten med å finne HLA-tilpassede organdonorer ved transplantasjoner. Betydningen av genetisk variasjon av HLA-molekylene innen immunbiologi ligger i deres rolle som immunresponsgener. Gjennom deres polypeptidbindende kapasitet bestemmes tilstedeværelsen eller fraværet av visse HLA-molekyler evnen individet har til å respondere på spesifikke polypeptidepitoper. Som et resultat påvirker HLA-molekyler resistens eller suseptibilitet overfor sykdom.

T-celler kan inhibere utvikling og vekst av cancer ved ulike mekanismer. Cytotoksiske T-celler, både HLA klasse I-begrensede CD8+ og HLA klasse Il-begrensede CD4+, kan drepe tumorceller direkte som presenterer de passende tumorantigener. Normalt er CD4+ hjelper T-celler nødvendig for cytotoksisk CD8+ T-cellerespons, men dersom polypeptidantigenet presenteres av en passende APC, kan cytotoksiske CD8+ T-celler aktiveres direkte, hvilket resulterer i en raskere, sterkere og mer effektiv respons.

I den internasjonale søknaden PCT/N092/00032 (publisert som W092/14756) beskrives syntetiske polypeptider og fragmenter av onkogene produkter som har en punktmutasjon eller translokasjoner sammenliknet med deres proto-onkogene eller tumorsuppressorgenprotein. Deres polypeptider tilsvarer, dekker fullstendig eller er fragmenter av det prosesserte og onkogenproteinfragment eller tumorsuppressorgenfragment slik det presenteres av cancerceller eller andre antigenpresenterende celler, og presenteres som et HLA-polypeptidkompleks av minst et allel i hvert individ. Polypeptidene er vist å indusere spesifikke T-celleresponser mot det aktuelle onkogenproteinfragment produsert av cellen ved processenng og presentert i HLA-molekylet. I særdeleshet beskrives i W092/14756 polypeptider som er avledet fra p21-ras-proteinet som har punktmutasjoner ved spesielle aminosyreposisjoner, nemlig posisjonene 12,13 og 61. Disse polypeptider er vist å være effektive ved regulering av vekst av cancerceller in vitro. Videre er polypeptidene vist å indusere CD4+ T-celleimmunitet mot cancerceller som har det muterte p21-ras-onkogenproteinet ved administrering av slike polypeptider i vaksiner eller cancerterapiregimer. Det er senere blitt vist at disse polypeptidene også induserer CD8+ T-celleimmunitet mot cancerceller som har det muterte p21-røs-onkogenproteinet ved administreringen nevnt ovenfor (Gjertsen, M.K. et. al, 1997, Int. J Cancer 72: 784-790).

Den internasjonale søknad PCT/NO99/00143) (publisert som W099/58552) beskriver syntetiske polypeptider og fragmenter av muterte proteinprodukter som oppstår fra leserammeforskyvningsmutasjoner som forekommer i gener i cancerceller. Disse polypeptidene tilsvarer, dekker fullstendig eller er fragmenter av prosesserte leserammeforskyvningsmutasjonsproteinfragment slik det presenteres av cancerceller eller andre antigen presenterende celler, og presenteres som et HLA-polypeptidkompleks av minst ett av et allel i hvert individ. I særdeleshet beskrives polypeptider som er et resultat av leserammeforskyvningsmutasj onene i BAX- og hTGFP-RIIgener. Disse polypeptider er vist å være effektive ved stimulering av CD4+ og CD8+ T-celler på en spesifikk måte.

Polypeptidene beskrevet ovenfor vil imidlertid være nyttige bare ved visse typer cancer som involverer onkogener med punktmutasjoner, leserammeforskyvningsmutasjoner eller translokasjon i et proto-onkogen eller tumorsuppressorgen. Det er et sterkt behov for en anticancerbehandling eller vaksine som vil være effektiv for et bredt spekter av cancerformer.

Den samordnende virkning av kombinasjonen av endrede onkogener og tumorsuppressorgener resulterer i cellulær transformasjon og utvikling av en malign fenotype. Slike celler har imidlertid tendens til aldring og har en begrenset livslengde. I de fleste cancers krever immortalisering av tumorcellene av et enzymkompleks kalt telomerase slås på. I somatiske celler uttrykkes den katalytiske subenhet til telomerase holoenzymet, hTERT (human telomerase reverse transcnptase), vanligvis ikke. Ytterligere hendelser, slik som virkning av proteiner som kodes av et tumorvirus eller demetylering av stille (metylerte) promoterseter, kan resultere i ekspresjon av gener som koder for komponenter av det funksjonelle telomerasekompleks i tumorceller.

På grunn av tilstedeværelsen av telomerase i de fleste typer cancerceller har enzymet blitt beskrevet som en generell cancervaksinekandidat (den internasjonale patentsøknad nr. PCT/NO99/00220, publisert som WO00/02581). WO00/02581 beskriver en fremgangsmåte for forebyggelse eller behandling av cancer ved generering av en T-cellerespons mot telomeraseuttrykkende celler i et pattedyr som lider (eller sannsynligvis lider av) cancer. Det er vist i WOOO/02581 at både CD4+ og CD8+ T-celler kan stimuleres ved administrering av polypeptider med sekvenser avledet fra et slikt telomeraseprotein.

Alternative spleisevarianter av telomerase pre-mRNA er rapportert i litteraturen (Kilian, A. et al, 1997, Hum. Mol Genet. 6: 2011-2019). Kilian et al. (1997, supra) antydet at det er bemerkelsesverdig at flere spleisevarianter ble lokalisert med det kritiske RT (revers transknptase)-domenet hTERT. De bekrefter imidlertid at en full forståelse av betydningen av hTERT-spleisevarianter ikke er oppnådd og at ytterligere funksjonell karakterisering var nødvendig.

Analyse av den fullstendige genomsekvensen til hTERT-genet har verifisert at ulike mRNA-spleisevarianter oppstår fra anvendelse av alternative spleisevarianter i hTERT-pre-mRNA (Wick, M. et al., 1999, Gene 232: 97-106'). Sammenliknet med fullengde hTERT-mRNA, har minst fem ytterligere spleisevarianter blitt påvist. En skjematisk fremstilling av disse variantene finnes i fig. 1 og fig. 2 og viser en oppstilling av proteinene som kodes. To av spleisevariantene, betegnet cc-del (eller DELI) og P-del (eller DEL2), representerer delesjoner i spesifikke kodende sekvenser, oc-del-varianten har fjernet de første 36 nukleotidene av exon 6 og koder for et protein som mangler en strekning på 12 indre aminosyrer. I p-del-varianten mangler 182 nukleotider som representerer hele exon 7 og 8, hvilket fører til et skift i den åpne leserammen og et avkortet protein med en 44 aminosyrers lang karboksylterminal ende som ikke er til stede i fullengde hTERT-proteinet. De gjenværende spleisevarianter er et resultat av anvendelse av alternative spleiseseter lokalisert innenfor intronregionene, hvilket resulterer i innskudd av intronsekvenser innenfor den åpne leserammen og for tidlig terminering av translasjonen. 8-innskuddssvarianten (eller INS1) er et resultat av et innskudd av de første 38 nukleotider av intron 4. 8-innskuddet inneholder ikke et stoppkodon, men den åpne leserammen strekker seg i stedet 22 nukleotider inn i den normale sekvensen ved anvendelse v en alternativ leseramme. y-innskuddsvarianten (eller INS3) er frembrakt ved innskudd av de siste 159 nukleotidene fra intron 14. Ins-4 inneholder de første 600 nukleotidene fra intron 14 samtidig som exon 15 og det meste av exon 16 er fjernet. De avkortede proteinene som er et resultat av translasjon av disse spleisevarianter er vist i fig. 2.

Flere nyere studier har fokusert på reguleringen av telomeraseaktiviteten, og noen sammenhenger mellom hTERT mRNA-transkripsjon og telomeraseaktivitet er rapportert for flere cellelinjer og vev (Nakamura, T.M. et al. 1997, Science 277:955-959, Meyerson, M. et al. 1997, Int. J. Cancer 85: 330-335; Nakayama, J. et al 1998, Nature Genet. 18l 65-68; Liu, K. et al, 1999, Proe. Nati Acad. Sei. USA 96: 5147-5152). Andre studier har vist at telomeraseaktiviteten oppreguleres gjennom fosforylering av hTERT-proteinet ved protein kinase Ca, og motsatt, nedregulering ved tilstedeværelse av protein kinase C-inhibitorer og fosfatase-2A (Li, H. et al, 1997, J. Biol. Chem. 272:16729-16732; Li, H. et al, 1998, J. Biol. Chem. 273: 33436-33442; Bodnar, A.G. et al, 1996, Exp. Cell Res. 228: 58-64; Ku, W.C. et al, 1997, Biochem Biophys. Res. Comm. 241: 730-736). Alternativ spleising av hTERT pre-mRNA representerer en tilleggsmekanisme for regulering av telomeraseaktivitet, og er vist å mediere nedregulering under føtal nyreutvikling og i ovarie og uterusvev hos voksne (Ulaner, G.A. et a/., 1998, Cancer Res. 58: 4168-4172; Ulaner, G.A. et al, 2000, In. J. Cancer 85j. 330-335). Fokus i de ovennevnte studier har vært på a- og 0-spleisevananter, fortrinnsvis fordi de fjerner sekvenser som antas å kode for kritiske revers transkriptasemotiver (Lingner, J. et al, 1997, Science 276: 561-567). Vonderheide et al., Immunity, vol. 10, nr. 6,1999, s. 673-679, ISSN 1074-7613 beskriver hTERT som et universelt uttrykt tumorassosiert antigen som kan utløse en antitumor cytotoksisk T-lymfocytt respons. Tabell 1 viser binding av ulike peptider av hTERT til humant HLA A<*>0201,

Foreliggende oppfinnelse frembringer peptider og nukleinsyrer som koder for disse peptider basert på TERT y- og 8-spleisevarianter, og ny anvendelse av disse peptider og nukleinsyrer innen medisin.

Foreliggende oppfinnelse omfatter polypeptid for anvendelse innen medisin, kjennetegnet ved at polypeptidet omfatter en sekvens gitt ved SEQ ID NO: 3,4, 5 eller 6, der polypeptidet er i stand til å indusere en T-cellerespons.

Videre omfatter oppfinnelsen nukleinsyremolekyl for anvendelse innen medisin, kjennetegnet ved at nukleinsyremolekylet: a) har en tråd som koder for et polypeptid beskrevet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3;

b) har en tråd som er komplementær med en tråd beskrevet i a) ovenfor; eller

c) har en tråd som hybridiserer under stringente betingelser med et molekyl

beskrevet i a) eller b) ovenfor.

Omfattet av foreliggende oppfinnelsen er også vektor eller celle for anvendelse imien medisin, kjennetegnet ved at den omfatter et nukleinsyremolekyl ifølge krav 4 i rekombinant form.

T-lymfocytt for anvendelse innen medisin, kjennetegnet ved at T-lymfocytten er i stand til å drepe en celle som uttrykker et polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3 eller er i stand til å hjelpe til med drepingen av en slik celle er også omfattet av foreliggende oppfinnelse.

Videre omfattes anvendelse av et polypeptid som beskrevet i et hvilket som helst av kravene 1 til 3, en nukleinsyre som beskrevet i krav 4, eller en vektor eller en celle som beskrevet i krav 5, for fremstilling av et medikament for behandling av cancer, eller for fremstilling av et diagnostisk middel for diagnostisering av cancer.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også farmasøytisk sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter et polypeptid som beskrevet i et hvilket som helst av kravene 1 til 3, en nukleinsyre som beskrevet i krav 4 eller en vektor eller en celle som beskrevet i krav 5.

Betegnelsen "omfatter" anvendt her i dokumentet inkluderer "består av". Polypeptidet (eller nukleinsyren) ifølge foreliggende oppfinnelse kan flankeres av en eller flere aminosyre (eller nukleinsyre)-rester med mindre annet er angitt. For eksempel kan polypeptidet være en del av et fusjonsprotein som har en eller flere flankerende domener ved den N- eller C-terminale ende for å muliggjøre rensing av fusjonsproteinet.

Aminosyreendringer eller modifiseringer (for eksempel substitusjoner) i polypeptidet kan i særdeleshet utføres for å forankre resten som passer inn i HLA- eller MHC-molekylene for presentering for T-celler. Forsterket binding og immunogene egenskaper til polypeptidet mot HLA- eller MHC-molekylene kan således oppnås (se Bristol, J. A. et al, 1998, J. Immunol. 160( 5V 2433-2441; Clay, T.M. et al, 1999, J. Immunol. 162( 31: 1749-1755).

Polypeptidet beskrevet ovenfor kan eventuelt:

a) ha minst 55% sekvensidentitet med et molekyl omfattende sekvensen SEQ ID NO: 1, som definert ved en NCBIBLASTP versjon 2.1.2-søk med standard parametere; b) ha minst 55% sekvensidentitet med et molekyl omfattende sekvensen SEQ ID NO: 2, som bestemt ved NCBI BLASTP versjon2.1.2-søk med standard parametere; c) ha minst 40% sekvensidentitet med et molekyl omfattende sekvensen SEQ ID NO: 3, som bestemt ved et NCBI BLASP versjon 2.1.2-søk meden "Expect"-verdi på 1000 og andre parametere som standard; d) ha minst 40% sekvensidentitet med et molekylomfattende sekvensen SEQ ID NO: 4, som bestemt ved et NCBI BLASTP versjon 2.1.2-søk med en "Expect"-verdi på 1000 og andre parametere som standard. e) ha minst 70% sekvensidentitet med et molekyl omfattende sekvensen SEQ ID NO: 5, som bestemt ved et NCBI BLASTP versjon 2.1.2-søk med en "Expect"-verdi på 100000 og andre parametere som standard; f) ha minst 50% sekvensidentitet med et molekyl omfattende sekvensen SEQ DD NO: 6, som bestemt ved et NCBI BLASTP versjon 2.1.2-søk med en "Expect"-verdi på 10000 og andre parametere som standard; eller

Det NCBI BLASTP-programmet kan finnes på http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/ blast/ og standard parametere endres under det avanserte søket. Høyere enn standard "Expect"-verdier kan være nødvendig når det søkes med små søkesekvenser for å vise tilpasningen. Betegnelsen "sekvensidentitet" som anvendes her i dokumentet henviser til aminosyrerester i optimalt oppstilte sekvenser som passer nøyaktig ved tilsvarende relative posisjoner. For eksempel frembringer NCBI BLASTP-programmet en prosentverdi for identitet mellom søkesekvensene og treff ("hit")-sekvensene.

Polypeptidet beskrevet ovenfor kan omfatte en sekvens ifølge SEQ ID NO: 1,2 3,4, 5, 6 eller kan være et fragment av en sekvens vist i SEQ ID NO: 1,3,5,6.

Mens polypeptidene som presenteres av HLA klasse II-molekyler er av varierende lengde (12-25 aminosyrer), må polypeptidene som presenteres av HLA klasse I-molekyler normalt være ni amiosyrerester lange for å passe inn i klasse IHLA-bindingsgropen. Et lenger polypeptid vil ikke binde dersom det ikke kan prosesseres internt av en APC eller målcelle, slik som en cancercelle, før det presenteres i den HLA klasse I begrensede gropen. Bare et begrenset antall avvik fra dette krav på ni aminosyrer er rapportert, og i de tilfeller er lengden av det presenterte polypeptid enten åtte eller ti aminosyrerester langt. For oversikter over polypeptidbinding til MHC-molekyler se Rammensee, H.-G. et al. (1995) Immunogenetics 4<_>k 178-228 og Barinaga

(1992), Science 257: 880-881. Male, D.K. et al. (1996, Advanced Immunology, Mosby, London) som gir bakgrunnsinformasjon innen immunologifeltet.

T-celleresponsen generert ved polypeptidet beskrevet ovenfor genereres etter intracellulær spalting av polypeptidet for å frembringe et fragment som passer inn i en MHC- eller HLA-bindingsgrop. alternativt kan polypeptidet beskrevet ovenfor ikke

trenge intracellulær spalting for å passe inn i en MHC eller HLA klasse I-bindingsgrop. I dette tilfelle kan polypeptidet være fra 8 til 10 aminosyrer langt. Det frembringes også et polypeptid beskrevet ovenfor som ikke trenger intracellulær spalting for å passe inn i en MHC eller HLA klasse II bindingsgrop. I dette tilfelle kan polypeptidet være 12 til 25 aminosyrer langt.

T-celleresponsen ifølge foreliggende oppfinnelse kan øke antallet og/eller aktiviteten til T-hjelpeceller og/eller cytotoksiske T-celler.

Det frembringes også et polypeptid som ikke stimulerer en vesentlig cytotoksisk T-cellerespons hos en pasient mot en eller flere av de følgende: benmargsstamceller, epiteliale celler i tykktarmskrypter eller lymfocytter.

Videre frembringes det ifølge foreliggende oppfinnelse et nukleinsyremolekyl for anvendelse innen medisin, der nukleinsyremolekylet: a) har en tråd som koder for et polypeptid beskrevet ovenfor; b) har en tråd som er komplementær med en tråd som beskrevet i a) ovenfor; eller c) har en tråd som hybridiserer med et molekyl som beskrevet i a) eller b) ovenfor

(for eksempel under stringente betingelser).

Stringente hybndiseringsbetingelser diskuteres i detalj på sidene 1.101 - 1.110 og 11.45 - 11.611Sambrook, J. et al (s989, Molecular Cloning, annen utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor). Et eksempel på hybndiseringsbetingelser som kan anvendes involverer anvendelse av en forvaskeløsning på 5X SSC, 0,5%SDS, l,0mM EDTA (pH 8,0) og forsøke hybridisering over natten ved 55%C ved anvendelse av 5 X SSC. Hybridiserende nukleinsyresekvenser innen rammen av foreliggende oppfinnelse inkluderer prober, primere eller DNA-fragmenter. Betegnelsen primer inkluderer et enkelttrådet oligonukleotid som virker som et initieringspunkt for templatdirigert DNA-syntese under passende betingelser (for eksempel i nærvær av fire ulike nukleocid trifosfater og et polymeriseringsmiddel, slik som DNA- eller RNA-polymerase eller revers transkriptase) i en hensiktsmessig buffer og ved en egnet temperatur.

Det frembringes også en vektor eller en celle for anvendelse innen medisin omfattende et nukleinsyremolekyl ifølge foreliggende oppfinnelse.

Videre frembringes et bindemiddel for anvendelse innen medisin, der bindemiddelet binder til et polypeptid som beskrevet ovenfor. Bindemiddelet kan være spesifikt for et polypeptid som beskrevet ovenfor. Bindemiddelet kan være et antistoff eller et fragment av dette. Bindemiddelet kan være lectin.

Betegnelsen antistoff i dets ulike grammatikalske former anvendes her idokumentet for å betegne immunglobulinmolekyler og immunologisk aktive deler av immunglobulinmolekyler, dvs. molekyler som inneholder et antistoff-kombinerende sete eller paratop. Slike molekyler betegnes også som "antigenbindende fragmenter" av immunglobulinmolekyler. Eksempler på antistoffmolekyler er intakte immunglobulinmolekyler, vesentlig intakte immunglobulinmolekyler og de deler av et immunglobulinmolekyl som inneholder paratopen, inkludert de deler kjent innen teknikken som Fab, Fab', F(ab')2 og F(v). Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være monoklonale eller polyklonale. Betegnelsen antistoff er også tilsiktet å utgjøre enkeltkjedete antistoffer, kimære, humaniserte eller primatiserte (CDR-kodede) antistoffer og liknende, så vel som kimære eller CDR-podete enkeltkjedete antistoffer som omfatter deler fra to ulike arter. For fremstilling av antistoffer se(Harlow, E. og Lane, d (1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor) og Harlow, E. og Lane, D. (1999, Us ing Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).Immunologiske adjuvanser for vaksiner omfattende lecitin kan også anvendes for å stimulere antistoffproduksjonen (se for eksempel US4803070).

Videre frembringes ifølge foreliggende oppfinnelse en T-lymfocytt for anvendelse innen medisin; der T-lymfocytten er i stand til å drepe en celle som uttrykker et polypeptid beskrevet ovenfor ifølge foreliggende oppfinnelse eller å hjelpe til med drepingen av en slik celle. T-lymfocytten kan være en cytotoksisk T-celle eller en T-hjelpercelle. Det frembringes også en cellelinjeklon for anvendelse innen medisin omfattende flere T-lymfocytter som beskrevet ovenfor. Det frembringes også en blanding av T-lymfocytter for anvendelse innen medisin omfattende en T-hjelpecelle eller en cellelinjeklon v slike celler og en cytotoksisk T-celle eller en cellelinjeklon av slike celler.

Det frembringes også en fremgangsmåte for å generere T-lymfocytter som er i stand til å gjenkjenne og destruere tumorceller hos et pattedyr, omfattende det å ta en prøve av T-lymfocytter fra et pattedyr og å dyrke T-lymfocyttprøven i nærvær av minst et polypeptid beskrevet ovenfor i en mengde tilstrekkelig for å generere T-lymfocytter spesifikke mot hTERT y-innskuddsproteinet og/eller T-lymfocytter spesifikke mot hTERT 8-innskuddsproteinet.

Det frembringes også en B-lymfocytt som kan være nyttig ved generering av antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse. Hybridomer som er i stand til å generere antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse er også inkludert (se for eksempel Koehler et al 1995, Nature 256: 495-497; Kosbor et al, 1983, Immunol. Today 4: 72; Cote et al, 1983, PNAS USA 80: 2026-2030; Cole et al, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., New York, s 77-96).

Videre frembringes ifølge foreliggende oppfinnelse anvendelse av polypeptid som beskrevet ovenfor, en nukleinsyre som beskrevet ovenfor, en vektor eller en celle som beskrevet ovenfor, et bindemiddel som beskrevet ovenfor, en T-lymfocytt som beskrevet ovenfor, en cellelinje som beskrevet ovenfor, eller en blanding av T-lymfocytter som beskrevet ovenfor, for fremstilling av et medikament for behandling av cancer, eller for fremstilling av et diagnostisk middel for diagnostisering av cancer. Canceren kan være en pattedyrcancer. I særdeleshet kan cancertypen være en human cancer. For eksempel kan cancertypen være brystcancer, protstatacancer, pancreascancer, colorektalcancer, lungecancer, malignt melanom, leukemi, lymfom, ovanecancer, cervikalcancer eller gallekanalskarsinom.

Medikamentet kan være en vaksine.

Polypeptidene beskrevet her er spesielt egnet for anvendelse i en vaksine som er i stand til på en trygg måte å indusere enten CD4+ eller CD8+ T-celleimmunitet. Siden polypeptidene kan være produsert syntetisk, inkluderer ikke medikamentene som inneholder polypeptidene transformerende cancergener eller andre seter eller materialer som kan medføre skadelige effekter. Polypeptidene kan være målrettet mot en spesiell type T-cellerespons uten bivirkninger i form av andre uønskede responser.

Medikamentet kan være et antisensmolekyl eller i stand til å generere et antisensmolekyl in vivo.

Det diagnostiske middel kan tilbys i et kitt. Kittet kan omfatte midler for å generere et påvisbart signal (for eksempel en fluorescerende markør, en radioaktiv markør) eller en påvisbar endring (for eksempel en enzymkatalysert endring). Kittet kan inkludere bruksanvisning for anvendelse ved diagnostisering av cancer.

Videre frembringes en farmasøytisk sammensetning omfattende et polypeptid som beskrevet ovenfor, en nukleinsyre som beskrevet ovenfor, en vektor eller en celle som beskrevet ovenfor, et bindemiddel som beskrevet ovenfor, en T-lymfocytt som beskrevet ovenfor, en cellelinje som beskrevet ovenfor eller en blanding av T-lymfocytter som beskrevet ovenfor.

Den farmasøytiske sammensetning kan omfatte et polypeptid som er i stand til å indusere en T-cellerespons rettet mot et polypeptid produsert av et onkogen eller mot et mutant tumorsuppressorprotein, eller en nukleinsyre som koder for et slikt polypeptid, eller et bindemiddel som binder et slikt polypeptid eller en T-celle som er i stand til å drepe en celle som uttrykker et slikt polypeptid eller i stand til å hjelpe til med drepingen av en slik celle. Eksempler på slike onkogener eller mutante tumorsuppressorproteiner inkluderer p21-røs, Rb, p53, abl, gip, gsp, ret eller trk. Det onkogene målet kan være p21-ras-polypeptider beskrevet i den internasjonale patentsøknad PCT/NO92/00032 (publikasjonsnr. W092/14756).

Det frembringes også et kombinasjonspreparat omfattende en komponent fra de farmasøytiske sammensetninger beskrevet ovenfor for samtidig, atskilt eller sekvensiell anvendelse innen anticancerterapi.

Det frembringes også en farmasøytisk sammensetning eller et kombinert preparat som beskrevet ovenfor som ytterligere omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer, fortynningsmiddel, additiv, stabilisator og/eller adjuvans; der sammensetningen eller det kombinerte preparat eventuelt ytterligere inkluderer en eller flere av: et cytokin eller en vekstfaktor (for eksempel IL-2, IL-12 og/eller GM.CSF) og et annet polypeptid som stammer fra en leserammeforskyvningsmutasjon (for eksempel en leserammeforskyvningsmutasjon i BAX eller hTERT(3-RII-genet).

Den stimulerende effekt på CD4+ og CD8+ T-celler på en spesifikk måte ved polypeptider som oppstår ved leserammeforskyvningsmutasjoner i BAX og hTERT-RTI-genene er beskrevet i W099/58552 (se ovenfor).

Den farmasøytiske sammensetning eller det kombinerte preparat beskrevet ovenfor kan være en vaksine.

Den farmasøytiske sammensetning eller det kombinerte preparat beskrevet ovenfor kan omfatte eller være i stand til å produsere antisensmolekyler.

Det frembringes også en fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning slik beskrevet ovenfor, omfattende trinnene av å kombinere de ovenfor beskrevne komponenter med en farmasøytisk akseptabel bærer, fortynningsmiddel, additiv, stabilisator og /eller adjuvans.

En farmasøytisk sammensetning ifølge oppfinnelsen kan omfatte en hvilken som helst av de følgende blandinger. a) en blanding av minst et polypeptid beskrevet ovenfor sammen med et annet polypeptid med en forskjellig sekvens; b) b) en blanding av minst et polypeptid beskrevet ovenfor sammen medd et annet polypeptid med en overlappende sekvens, slik at polypeptidene er egnet til å være tilpasset ulike MHC- eller HLA-alleler; c) en blanding av begge blandingene av a) og b); d) en blanding av flere blandinger av a);

e) en blanding av flere blandinger av b); eller

f) en blanding av flere blandinger av a) og flere blandinger av b).

Polypeptidene i blandingen kan være kovalent bundet med hverandre for å danne større

polypeptider eller også sykliske polypeptider. Polypeptidene selv kan være i en lineær eller syklisk form.

Foreliggende oppfinnelse frembringer også en diagnostisk sammensetning omfattende polypeptid som beskrevet ovenfor, en nukleinsyre som beskrevet ovenfor, en vektor eller celle som beskrevet ovenfor, et bindemiddel som beskrevet ovenfor, en T-lymfocytt som beskrevet ovenfor, en cellelinje som beskrevet ovenfor eller en blanding av T-lymfocytter som beskrevet ovenfor.

Ifølge foreliggende oppfinnelse omfattes også anvendelsen av et diagnostisk kitt som beskrevet ovenfor.

Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres i en mengde i området fra 1 mikrogram (1 ug) til 1 gram (lg) til en gjennomsnittlig human pasient eller et individ som skal vaksineres. Det foretrekkes å anvende en mindre dose i området fra 1 mikrogram (1 ug) til 1 milligram (1 mg) for hver administrering.

De eksakte doser, dvs. farmasøytisk akseptable doser, og administreringsregimer av farmasøytiske sammensetninger og medikamenter ifølge foreliggende oppfinnelse kan enkelt bestemmes av en fagperson innen teknikken, for eksempel ved å benytte dose-responsanalyser.

Administreringen kan finne sted en eller flere ganger slik det er best egnet for å etablere og/eller opprettholde T-celleimmunitet. Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan administreres sammen, enten samtidig eller atskilt, med forbindelser slik som cytokiner og/eller vekstfaktorer, dvs. ineterleukin-2 (IL-2), interleukin-12 (IL-12), granulocyttmakrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF) eller liknende for å styrke immunresponsen slik det er kjent innen teknikken. Polypeptidene kan anvendes i en vaksine eller i en terapeutisk sammensetning enten alene eller i kombinasjon med andre materialer, for eksempel kan polypeptidet eller polypeptidene tilføres i form av et lipopeptidkonjugat som er kjent å indusere en høyaffinitetscytotoksisk T-cellerespons (Deres, K. et al, 1989, Nature 342: 561-564).

Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan administreres til et individ eller dyr i form av DNA-vaksiner. DNA som koder for polypeptidene kan være i form av et klonet plasmid-DNA eller syntetisk oligonukleotid. DNA kan avleveres sammen med cytokiner, slik som IL-2, og/eller andre ko-stimulerende molekyler. Cytokmene og/eller ko-stimulerende molekyler kan selv avleveres i form av plasmid eller ohgonukleotid-DNA.

Respons mot en DNA-vaksine er vist å økes ved tilstedeværelse av immunstimulerende DNA-sekvenser (ISS) Disse kan ha form av heksamere motiver inneholdende metylert CåpG, ifølge formelen: 5'-purin-purin-CG-pyrimidin-pyrimidin-3'. DNA-vaksinene ifølge oppfinnelsen kan derfor inkorporere disse eller andre ISS, i DNA som koder for hTERT y-innskuddsproteinet og /eller hTERT 8-innskuddsproteinet, i DNA som koder for cytokinet eller andre ko-stimulerende molekyler i begge. En oversikt over fordelene ved DNA-vaksinering er gitt av Tighe et al. (1998, Immunology Today, 19( 2) : 89-97).

Ifølge foreliggende oppfinnelse frembringes det også et polypeptid som beskrevet ovenfor, eventuelt i isolert form, der polypeptidet ikke er et polypeptid bestående av sekvensene vist i fig. 4.

Polypeptidsekvensen vist i fig. 4 representerer beskrivelsen i fig. 5C til Kilian et al, (1997. supra) av 46 aminosyrerester ved den C-terminale ende av det ca.

1 lOOaminosyrelange hTERT y-innskuddsspleisevarianten, som inkluderer 44 aminosyrer av SEQ ED NO: 1. Sekvensen gitt i Kilian et al (1997, supra) viser den "alternativeC-terminale ende" hTERT y-innskuddsspleisevariantproteinet. (Kilian et al, 1997, supra antyder at den korresponderende DNA-sekvensen er gitt ved ganbankaksesjonsnumrnerert AF015950.) Kilian et al. (1997, supra beskriver ikke polypeptidet ifølge SEQ DD NO: 1, 2 eller 5 ved den C-terminale ende av hTERT y-innskuddsspleisevariantproteinet som en separat enhet og verken beskriver eller antyder medisinsk anvendelse av polypeptidet ifølge SEQ DD NO: 1, 2 eller 5.

Polypeptidene beskrevet her i dokumentet kan fremstilles ved konvensjonelle fremgangsmåter, for eksempel ved ulike polypeptidsyntesemetoder kjent innen teknikken. Alternativt kan det være fragmenter av et hTERT y-innskuddssprotein og/eller et hTERT 5-innskuddsprotein fremstilt ved spalting, for eksempel ved anvendelse av cyanogenbromid, og påfølgende rensing. Enzymatisk spalting kan også anvendes. hTERT y-innskuddssproteinet og hTERT 8-innskuddsprotein eller peptider kan også være i form av rekombinante uttrykte proteiner eller polypeptider.

Nukleinsyren beskrevet her i dokumentet frembringes også, eventuelt i isolert form; der nukleinsyren ikke er en nukleinsyre som koder for polypeptidet ekskludert ovenfor og er heller ikke en nukleinsyre som vist i fig. 4 eller 5.

Nukleinsyresekvensen ved den 3'-ende av det ca. 3100 basepar hTERT y-innskuddsspleisevarianten, der deler av den koder for den C-terminale ende av det tilsvarende protein som inkluderer SEQ DD NO: 1, er gitt i fig. 4 i KILIAN et al. (1997, supra). Nukleinsyresekvenen ved exon-introl-grensene til hTERT-spleisevariantene i INS1 (ekvivaletnt tmed y-inninnskuddsspleisevarianten) og INS3 (ekvivalent med y-lnnskuddsspleisevarianten), som beskrevet i fig. 2B i Wick et al. (1999, supra) som vist i fig. 5. Nukleinsyrene vist i fig. 5 som beskrevet i fig. 2B av Wick et al { supra) inkluderer nukleotider som koder for aminosyrerestene tilstede i SEQ DD NO:: 1-6 og 11. Wick et al.( 1999, supra) gjør ingen bestemte referanser til eksistensen av nukleinsyrer vist som atskilte enheter eller til deres medisinske anvendelse. Wick et al. 1999, supra, henviser til komplette nukleotidsekvenser av deres hTERT-gen i genbankaksesjonsnummeret AF128893 og AF128894.

Nukleinsyrer som koder for polypeptider ifølge oppfinnelsen kan lages ved ohgonukleotidsyntese. Dette kan gjøres ved en hvilken som helst av de forskjellige fremgangsmåtene tilgjengelig innen teknikken. En nukleinsyre som koder for telomeraseprotein kan klones fra et genomisk eller cDNA-bibliotek ved anvendelse av konvensjonell bibliotekscreening. Proben kan tilsvare en del av en hvilken som helst sekvens av en kjent hTERT y-innskudd og/eller hTERT 8-innskuddsgen. Alternativt kan nukleinsyren oppnås ved anvendelse av polymerasekjedereaksjonen (PCR). Nukleinsyren er fortrinnsvis DNA, og kan godt klones inn i en vektor. Subkloner kan genereres ved anvendelse av egnede restriksjonsenzymer. Det klonede eller subklonede DNA kan formeres i en egnet vert, for eksempel en bakterievert. Alternativt kan verten være en eukaryot organisme, slik som gjær eller baculovirus. hTERT y-innskudds og hTERT 8-innskuddsproteine eller polypeptidene kan fremstilles ved ekspresjon i en egnet vert. I dette tilfelle klones DNA inn i en ekspresjonsvektor. Flere kommersielle ekspresjonskitt er tilgjengelige. Fremgangsmåtene beskrevet i Sambrook, J. et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor) kan anvendes for disse formål.

Det frembringes også en vektor eller celle som beskrevet her i dokumentet, eventuelt i isolert form.

Videre frembringes bindingsmiddelet som beskrevet her i dokumentet, eventuelt i isolert form.

Videre frembringes T-lymfocytten som beskrevet her i dokumentet, eventuelt i isolert form.

Cellelinjeklonen beskrevet her i dokumentet frembringes eventuelt også i isolert fonn.

Videre frembringes blandingen av T-lymfocytter som beskrevet her i dokumentet.

Videre frembringes en maskinlesbar dataformidler for eksempel en (diskett) omfattende sekvensen til et polypeptid eller en nukleinsyre som beskrevet her i dokumentet.

Videre frembringes en fremgangsmåte omfattende anvendelse av sekvensen til et polypeptid eller et nukleinsyremolekyl som beskrevet her i dokumentet for utførelse av sekvensidentitetsstudier, sekvensomologistudier eller hybridiseringsstudier. Metoden kan inkludere anvendelse av nevnte sekvens til å forutsi struktur og/eller funksjon (for eksempel forutsi anti-canceraktivitet). Det frembringes også anvendelse av denne metoden i en medikamentutviklingsprosedyre eller screeningsprosedyre.

Videre frembringes et medikament identifisert eller utvalgt ved denne prosedyren. Det frembringes også en datamaskin eller database som viser eller lagrer en sekvens av et polypeptid eller et nukleinsyremolekyl som beskrevet her i dokumentet eller som er satt opp for å utføre en fremgangsmåte som beskrevet ovenfor.

Oppfinnelsen omfatter det som i hovedsak er beskrevet i det foregående med henvisning til de følgende figurer og eksempler.

Betegnelsen "aminosyrerest" og "aminosyre" er definert bredt for å inkludere modifiserte og uvanlige aminosyrer slik det defineres i WD?0 standard ST.25.

Oppfinnelsen vil bli ytterligere klargjort ved den følgende beskrivelse med henvisning til de mange støttende figurer, som viser, kun som eksempel, ulike polypeptider og deres anvendelse.

Figurer:

Fig. 1 er en skjematisk tegning av fullengde hTERT mRNA og spleisevarianter funnet i cancercellelinjer; Fig. 2 viser en proteinoppstilling mellom en del av hTERT-proteinet og proteiner som er et resultat av translasjon av spleisevarianter; Fig. 3 viser den karboksylterminale enden til hTERT y-innskudds og 8-lnnskuddsspleisevariantproteiner; Fig. 4 viser kjente sekvenser beslektet med hTERT y-innskuddsspleisevarianten slik den er beskrevet i fig. 5C ifølge Kilian et al. (1997 supra) ; Fig. 5 viser kjente sekvenser beslektet med hTERT y-innskudds- og 8-innskuddsspleisevarianter slik de beskrives i fig. 2B ifølge Wick et al (1997, supra) ; Fig. 6 viser resultater fra RT-PCR-analyser av regionene som tilsvarer y-innskudds (A) og 8-innskudds (B) spleisevarianter av hTERT; Fig. 7 viser proliferative T-celleresponser indusert i humane blodprøver av et polypeptid med aminosyresekvensen til et peptid avledet fra hTERT 8-lnnskuddspolypeptidet; Fig. 8 viser proliferasjon av T-cellekloner er indusert av et polypeptid med aminosyresekvensen til et peptid avledet fra hTERT 8-innskuddspolypeptidet og Fig. 9 viser proliferasjon av andre T-cellekloner indusert av et polypeptid med aminosyresekvensen til et peptid avledet fra hTERT 8-innskuddspolypeptidet.

I fig. 1 antydes posisjonen til introner til stede i hTERT pre-mRNA ved bokstaven "i" etterfulgt av et passende tall. Insersjons- og delesjonsvarianter er vist som firkantede bokser; Skyggelagte bokser representerer sekvenser som koder for proteinsekvenser som ikke er til stede i hTERT-proteinet. Posisjon og orientering til oligonukleotidprimere anvendt for å analysere de ulike spleisevariantene er antydet med piler.

I fig. 2 er aminosyrenummereringen vist over sekvensen. Aminosyrene er gitt ved standard enbokstavsforkortelser kjent innen teknikken.

I fig. 3 gjengir SEQ DD NO: 1 den avkortede halen til hTERT y-innskuddssproteinet og SEQ DD NO: gjengir det samme polypeptidet med en forlengelse i den aminoterminale enden med ni aminosyrer vanligvis funnet i disse posisjonene i det naturlig forekommende hTERT y-innskuddsekspresjonsproduktet (understreket). SEQ DD NO: 3 gjengir den avkortede halen til hTERT 8-innskuddsproteinet. SEQ DD NO: 4 gjenspeiler SEQ DD NO: 3 med en forlengelse i den aminoterminale enden med de ni aminosyrene som normalt finnes i disse posisjoner i det naturlig forekommende hTERT 8-innskuddsekspresj onsproduktet (understreket).

I fig. 4 vises exon/intron forbindelsen til innskuddsspleisevariant 3 (ekvivalent med hTERT y-innskuddsspleisevarianten) slik det går frem av fig. 5C ifølge Kilian et al

(1997), supra). Den følgende informasjon er gitt av Kilian et al. (1997, supra) : nukleinsyresekvensen vises over en proteintranslasjonssekvens, med den antatte uspleisede intron gitt i uthevet skrift; antatte exon/intron forbindelser er markert med |; nukleinsyresekvensnummereringen tilsvarer det følgende: nukleotid 1 tilsvarer nukleotid 139 i sekvensen med genbank aksesjonsnummer AF015950; og aminosyrene som tilsvarer det antatte c-Abl/SH3-bindingssete er understreket. Aminosyresekvensen vist av Kilian et al. (1997; supra) representerer den C-terminale ende av en ca. 1100 aminosyre lang hTERT y-iimskuddsspleisevariantprotein.

I fig. 5 vises nukleotidene i exon-intron grensen til hTERT-spleisevariantene TNS1 (ekvivalent med 8-innskuddspleisevarianten) og rNS3 (ekvivalent med y-innskuddsspleisevarianten) slik det beskrives i figur 2B ifølge Wick et al. (1999, supra). Intron- og exonsekvenser er vist i henholdsvis små bokstaver og store bokstaver. Wick et al. (1999, supra) antyder at nukleinsyresekvensen til deres hTERT-gen er blitt deponert i genbank som aksesjonsnummer AF128893 og AF128894.

Det er etablert at hTERT y-innskudds- og 8-innskuddsspleisevarianter uttrykkes i cancercellelinjer og tumorer, men er ikke påvisbare, eller til stede i svært lave nivåer i normale celler. Foreliggende oppfinnelse beskriver derfor generelle cancervaksinekandidater med forbedret spesifisitet sammenliknet med vaksiner basert på den funksjonelle variant av telomerase (hTERT) proteinet. Både y- og a-innskuddene resulterer i dannelse av et tidlig stopp kodon og ekspresjon av et protein som er avkortet i den karboksylterminale ende. De avkortede hTERT y- og 8-innskuddsproteiner har selv ingen telomeraseaktivitet. I tilfelle et y-innskudd er den avkortede halen til proteinet en sekvens på 44 aminosyrer (SEQ ED NO: 1). Et 8-innskudd resulterer i et protein der den avkortede halen er en sekvens på 20 aminosyrer (SEQ ID NO: 3). De uttrykkes kraftig i cancercellelinjer men er ikke påvisbare eller til stede svært lave nivåer i normale celler og er derfor mål for spesifikk immunterapi. Ifølge foreliggende oppfinnelse er polypeptidene som tilsvarer den karboksylterminale ende (avkortet hale) til proteinene uttrykt av hTERT y-innskudds- og/eller 8-innskuddsspleisevarianter nyttige som anti-cancer midler eller vaksiner som virker ved å igangsette den cellulære delen av immunsystemet (T-celler) hos menneske mot cancerceller. I en foretrukken utførelsesform ifølge oppfinnelsen omfatter polypeptidet sekvensen ifølge SEQ ED NO: 5. i en annen foretrukken utførelsesform ifølge oppfinnelsen omfatter polypeptidet sekvensen ifølge SEQ ED NO: 6.

Eksperimenter

Eksperimentene beskrevet her i dokumentet omfatter karakterisering av hTERT-spleisevariantene i ulike cancercellelinjer sammenliknet med normale celler. Syntese av polypeptidene ifølge oppfinnelsen, og eksperimenter for å teste effektiviteten til polypeptidene for anvendelse i cancerterapi er beskrevet. Et eksperiment som viser induksjon og proliferering av humane T-celler ved et peptid avledet fra hTERT 8-inskuddspolypetid er beskrevet.

RT- PCR analyse av y- innskudds og 5- innskuddsspleisevariantene til hTERT

Rna analyse:

Poly(A)+ mRNA fra fullstendig lyserte celler ble isolert direkte fra ubearbeidede lysater ved anvendelse av magnetiske oligo(dT)-kuler (Dynal AS; Jakobsen, K.S. et al, 1990, Nucleic Acids Res. 18: 3669). Cytosol mRNA-fraksjoner ble tilberedt ved å inkubere celler i 1% IGEPAL (Sigma) med 0°C i ett minutt etterfulgt av sentrifugering [10000g; 1 min.; 4°C] for å fjerne kjerner. Poly(A)+ mRNA ble deretter isolert fra supernatanten ved anvendelse av oligo(dT)-kuler som beskrevet ovenfor.

cDNA- syntese og PCR:

Første tråd cDNA-syntese ble utført ved standard prosedyrer ved anvendelse av M-MLV RNaseH- revers transkriptase (Promega Corp.) og PCR-reaksjonene ble utført ved anvendelse av HotStar Taq DNA polymerase (Quiagen) og kjørt i 35 sykluser på en PTC-200 sykler (MJ Research). For å oppnå detekterbare produkter fra PBM og CD34+-celler, ble 10% av reaksjonen anvendt som templat i en annen PCR-reaksjon og ampifisert ved ytterligere 15 sykluser.

For analyser av y-innskuddsspleisevarianten ble pluss-trådprimeren hTERT-p3195 (5-GCC TCC CTC TGC TAC TCC ATC CT - SEQ EO NO: 7) og minus-trådprimeren hTERT-m3652 (5-CGT CTA GAG CCG GAC ACT CAG CCT TCA - SEQ ED NO: 8 anvendt. Anvendt på fullengde hTERT cDNA og y-innskuddsvarianten frembrakte disse primerfragmenter på henholdsvis 465 og 624 nukleotider. Analysen av 8-innskuddsvarianten ble utført ved anvendelse av primerne hTERT-P6 (5GCC AAG TTC CTG CAC TGG CTG A - SEQ ED NO: 9) og hTERT-m2044 (5GCT CTA GAA CAG TGC CTT CAC CCT CG - SEQ ED NO: 10). Amplifiseringsproduktet som oppstod ved anvendelse av disse primere med fullengde hTERT-cDNA og 8-innskuddsvarianten omfattet henholdsvis 369 og 407 nukleotider. For å verifisere at disse PCR-produktene representerte genuine spleisevarianter ble fragmentene isolert fra gelen og analysert ved direkte sekvensering ved anvendelse av en ABI prism 310 automatisert sekvensator (PE Corp.).

Resultater:

Telomeraseaktivitet er utsatt for kompleks regulering på det post-transkripsjonelle nivået, og fremgangsmåter anvendt for å påvise tilstedeværelse eller fravær av telomeraseproteiner bør involvere direkte måling av proteinet selv, eller alternativt mRNA-vananter. Videre er overfloden av ulike hTERT-spleisevarianter funnet i celler ikke nødvendigvis korrelert med de nivåene som finnes i cytosol fraksjonen av den samme cellen (se fig. 6). Slike avvik kan forklares ved forskjeller i effektiviteten med hvilket mRNA-variantene transporteres fra kjernen til cytosol, og/eller ved forskjellig stabilitet av de spesifikke spleisevarianter i cytosol. Det er vel kjent innen teknikken at slike mekanismer er deler av genreguleringskonseptet. Ikke desto mindre har studiene som er utført for å forklare hTERT-regulenng, inkludert forsøkene sitert ovenfor, anvendt totalt RNA eller mRNA isolert fra fullstendig lyserte celler for sine analyser. Kitt og reagenser for å utføre denne type RNA-isolering er lett tilgjengelig på det kommersielle markedet. For å oppnå et korrekt bilde av genekspresjon bør studier på mRNA-overflod inkludere analyser av mRNA spesifikk for cytosol.

Fig. 6 viser resultater fra RT-PCR-analyser av regionene omfattende y- (A) og s -8-innskuddsvarianter (B) av hTERT. HL60, K562 og Jurkat angir de analyserte cancercellelinjer. HL60 er en promyeolytisk leukemicellelinje (Sokoloski, J.A. et al, 1993, Blood 82: 625-632). K562 er en erytroid leukemicellelinje (Lozzio, C.B. et al. 1975m Blood 45: 321-324), mens Jurkat er avledet fra akutte T-lymfocyttleukemiceller (Gillis, S. et al, 1980, J. Exp. Med 152: 1709-1719). HL60, K562 og Jurkat cancercellelinjer er kommersielt tilgjengelige (for eksempel fra ATCC, Oslo). PBM1, PBM2, PBM3 og PBM4 representerer perifere mononukleære blodcellepopulasjoner (PBM) isolert fra fire ulike friske givere. CD34 angir CD34-positive stamceller isolert fra friske givere, og CC1/CC2 angir coloncancerbiopsier oppnådd fra to cancerpasienter ved det norske Radiumhospital, Oslo, med CC2a og CC2bsom to vevsprøver dissekert fra samme tumor. RT-PCR-reaksjoner utført med mRNA isolert fra fullstendig lyserte celler og med mRNA isolert fra cytosolfraksjonene og markert henholdsvis med bokstvene "T" og "C". "M" antyder felter med molekylvekstmarkører. Posisjonen til PCR-fragmentene som representerer y- og 8-innskuddsspleisevananter og de respektive fullengde hTERT-produktene er (+) antydet på høyre side av panelene.

RT-PCR-analysen viste at både y- og 8-innskuddsspleisevariantene var lett påvisbare i alle cancercellelinjer og i en av tumorprøvene som ble analysert (CC2b), og med 8-innskuddssvarianten som den mest forekommende i cytosolfraksj onen. I motsetning var vi ikke i stand til å påvise disse variantene i cytosol mRNA-populasjonene isolert fra PBM-celler på tross av den omfattende PCR-amplifisering utført med disse prøver. Identiteten til det svake 395-baseparfragmentet produsert med 8-innskuddsprimeren på PBM og CD34-positive celler er for tiden ukjent.

Polvpeptidsyntese og analyse for applikasjoner i forbindelse med cancer

Polypeptid syntese: Polypeptidene ble syntetisert ved anvendelse av kontinuerlig fastfasepeptidsyntese. N-a-Fmoc-aminosyrer med hensiktsmessig sidekjedebeskyttelse ble anvendt. Fmoc-aminosyrene ble aktivert for kopling som pentaflyorfenylestere eller ved anvendelse av enten TBTU eller diisopropyl karbodiimid aktivering før kopling. 20% piperidin i DMF ble anvendt for selektiv fjerning av Fmoc etter hver kopling. Spalting fra resinet og endelig fjerning av sidekjedebeskyttelsen ble utført med 95% TFA inneholdende passende scavengers. Polypeptidene ble renset og analysert ved revers fase HPLC. Identiteten til polypeptidene ble bekreftet ved anvendelse av elektrospray massespektroskopi.

Polypeptidtesting og cancerterapi:

For at en cancervaksine og fremgangsmåter for spesifikk cancerterapi basert på T-celleimmunitet skal være effektiv, må to betingelser imøtekommes: (a) polypeptidet er minst 8 aminosyreer langt og er et fragment av hTERT y-innskuddssprotein et eller hTERT 8-iimskuddsproteinet og (b) polypeptidet er i stand til å indusere, enten i sin fulle lengde eller etter prosessenng av en antigenpresenterende celle, T-celleresponser.

De følgende eksperimentelle fremgangsmåter kan anvendes for å bestemme om disse to betingelsene for å bestemme om disse to betingelsene er imøtekommet for spesielt polypeptid. Først bør det bestemmes om det spesielle polypeptid gir opphav til T-celleimmunresponser in vitro. Det må også etableres hvorvidt de syntetiske polypeptider tilsvarer eller er i stand til etter prosessering å gi, polypeptidfragmenter tilsvarende polypeptidfragmenter som oppstår i cancerceller som har hTERT y-innskuddsprotein og/eller hTERT 8-innkuddsprotein eller antigenpresenterende celle som har prosessert naturlig forekommende hTERT y-innskuddsprotein og/eller hTERT 8-innskuddsprotein. Spesifisiteten til T-celler indusert in vivo av hTERT y-innskudds- og/eller hTERT 8-innskuddspolypeptidvaksinering kan også bestemmes.

In vitro T- celleresponsanalyser-

Det er nødvendig å bestemme om hTERT y-innskudds- og/eller hTERT 8-innskuddsuttrykkene tumorcellelinjer kan drepes ved T-cellekloner oppnådd fra perifert blod fra karsinompasienter etter hTERT y-innskudds- og/eller hTERT 8-lnnskuddspolypeptidvaksinering. T-cellekloner oppnås etter kloning av T-celleblaster til stede i perifere blodmononukleære celler (PBMC) fra en karsinompasient etter hTERT Y-innskudds- og/eller hTERT 8-innskuddspolypeptidvaksinering. Polypeptidvaksineringsprotokollen inkluderer flere in vivo injeksjoner av polypeptider intrakutant med GM-CSF eller en annen vanlig anvendt adjuvans. Kloning av T-celler utføres ved å så ut responderende T-celleblaster ved 5 blåster per brønn på Terasake-plater. Hver bbrønn inneholder 2 x IO4 autologe, bestrålte (30 Gy) PBMC som næringsceller. Cellene formeres med kandidatpeptidet hTERT y-innskuddet og/eller hTERT 8-innskuddet ved 25 um og 5 U/ml rekombinant interleukin-2 (rIL-2)

(Amerham, Aylesbury, UK) i et totalt volum på 20 ml. Etter 9 dager ble T-celleklonene overført til flatbunnede 96-brønnsplater (Costar, Cambridge, MA) med 1 mg/ml fytohemagglutinin (PHA, Wellcome, Dartford, UK) 5 U/ml rIL-2 og allogene bestrålte (30 Gy) PBMC (2 x 10<5>) per brønn som næringsceller. Voksne kloner blir ytterligere ekspandert i 24-brønnsplater med PHA/rIL-2 og 1 x IO<6>allogene, bestrålte PBMC som næringsceller og screenet for polypeptidspesifisitet etter 4 til 7 dager.

T-cellekloner utvelges for videre karakterisering. Celleoverflatefenotypen til T-celleklonen bestemmes for å forsikre om T-celleklonen er CD4+ eller CD8+. T-celleklonen inkuberes med autologe tumorcellemål med ulike forhold mellom effektorceller og målceller for å bestemme om lyse av tumorcelle oppstår. Lyse antyder at T-cellen har reaktivitet rettet mot et tumoravledet antigen, for eksempel hTERT y-innskudds- og/eller hTERT 8-innskuddsproteiner.

Korrelasjon mellom polypeptidene og in vivo hTERT-innskuddsfragmenter:

For å verifisere at antigenet som gjenkjennes er forbundet med hTERT y-innskuddsproteinet eller hTERT 8-innskuddsproteinet, og for å identifisere HLA klasse I- eller klasse II-molekylet som presenterer det antatte hTERT y-innskuddspolypeptidet eller hTERT 8-innskuddspolypeptidet for T-celleklonen anvendes ulike hTERT y-innes-og/eller hTERT 8-innskuddsuttrykkene tumorcellelinjer som bærer en eller flere HLA klasse I- elle Il-molekyler felles med pasientens som målceller i cytotoksisitetsanalyser. Målcellene merkes med<51>Cr eller 3H-thymidin (9,25 x 10<4>Gq/mL) over natten, vaskes en gang og sås ut ved 5000 celler per brønn i 96-brønnsplater. T-cellene innsettes ved ulike forhold mellom effektorceller og målcveller og platene inkuberes i 4 timer ved 37°C og høstes deretter før de telles i en væskescintillasjonsteller (Packard Topcount). For eksempel kan blærekarsinomcellelinjen T24 (12Val<+>, HLA-A1<+>, B35<+>) melanomcellelinjen (FMEX (12Val<+>, HLA-A2<+>'B35<+>) og kolonkarsinomcellelmjen SW 480 (12Val<+>, HLA-A2<+>, B8) eller andre telomerasepositive tumorcellelinjer anvendes som målceller. En egnet cellelinje som ikke uttrykker hTERT y-innskudds-og/eller hTERT 5-innskuddsproteiner kan anvendes som en kontroll, og bør ikke lyseres. Lyse av en spesiell cellelinje indikerer at T-celleklonen som testes gjenkjeimer en endogent prosessert hTERT y-innskuddsepitop og/eller hTERT s-innskuddssepitop i sammenheng med HLA klasse I- eller klasse II-subtypen uttrykt av den cellelinjen.

Karakterisering av T- cellekloner:

HLA klasse I eller klasse II begrensning av en T-celleklon kan bestemmes ved blokkeringseksperimenter. Monoklonale antistoffer mot HLA klasse I-antigener, for eksempel det panreaktive HLA klasse I monoklonale antistoff W6/32, eller mot klasse II-antigener, for eksempel monoklonale antistoffer rettet mot HLA klasse II-DR, DQ-og-DP-antigener (B8/11, SPV-L3 og B7/21) kan anvendes. T-celleklonaktiviteten mot den autologe tumorcellelinjen halveres ved anvendelse av monoklonale antistoffer rettet mot HLA klasse I- og klasse II-molekyler med en sluttkonsentrasjon på 10 u.g/ml. Analyser settes opp som beskrevet ovenfor i triplikater i 96-brønnsplater og målcellene preinkuberes i 30 min. ved 37°C før tilsetting av T-celler.

Den smale spesifisitet til en T-celleklon kan bestemmes ved anvendelse av polypeptid pulseeksperimenter. For å identifisere hTERT y-innskuddspolypeptidet og/eller hTERT 8-innskuddspolypeptidet som faktisk gjenkjennes av en T-celleklon testes et panel av nonamere polypeptider.51 Cr- eller 3H-tymidinmerkede, svakt skjult eluerte autologe fibroblaster såes ut ved 25oo celler per brønn i 96 brønnsplater og pulses med polypeptider ved en konsentrasjon på 1 um sammen med p2-mikroglobulin (2,5 ug/mL) i en 5% CO2inkubator ved 37°C før tilsetting av T-celler. Analysen settes opp i triplikater 1 96 b-brønnsplater og inkuberes i 4 timer med et effektor/målforhold på 5 til 1. Kontroller kan inkludere T-celleklonekulturen alene, med APC i fravær av polypeptider eller med et irrelevant melanom assosiert polypeptid MART-l/Melan-A-polypeptid.

En alternativ protokoll for å bestemme den smale spesifisiteten til en T-celleklon kan også anvendes. I denne alternative protokoll anvendes den TAP-defisiente T2-cellelinjen som antigenpresenterende celler. Denne cellelinjen uttrykker bare små mengder av HLA-A2-antigen, men økende nivåer av HLA klasse I-antigener på celleoverflaten kan induseres ved tilsetting av p2-mikroglobulin. 3H-merkede målceller inkuberes med ulike testpolypeptider og kontroUpolypeptider ved en konsentrasjon på 1 uM sammen med P2 mikroglobulin (2,5 ug/mL) i en time ved 37°C. Etter polypeptidpulsing ble målcellene vasket grundig, telt og sådd ut ved 2500 celler per brønn i 96-brønnsplater før tilsetting av T-cellene. Platene inkuberes i 4 timer ved 37°c i 5% CO2før høsting. Kontrollene inkluderer T-celleklonkulturen alene eller med målceller i fravær av polypeptider. Analysen ble satt opp i triplikater i 96-brønnsplater med et effektor til målforhold på 20 til 1.

Sensitiviteten til en T-clleklon for et spesielt polypeptid identifisert ovenfor kan også bestemmes ved anvendelse av et dose-responseksperiment. Polypeptidsensitibiliserte fibroblaster kan anvendes som målceller. Målcellene pulses med det spesielle peptidet som beskrevet ovenfor for bestemmelse av den smale spesifisitet, med det unntak at peptidene tilsettes ved ulike konsentrasjoner før tilsetting av T-celler. Kontroller inkluderer målceller alene og målceller pulset med det irrelevante melanomassosierte peptid Melan-A/Mart-1.

Induksjon og prolifierin<g>av humant T- cellerespons mot hTERT S- innskuddspeptidet

I dette eksperimentet ble perifere blodmononukleære celler (PBMC) fra fire friske mennesker (donor "14328", "14313", "23244" og "23255") isolert og primet i syv dager med dendrittiske celler pulset med peptidet avledet fra hTERT

8-innskuddspolypeptidet, etterfulgt av to sykluser bestående av syv dagers re-stimulering med peptidpulsede autologe PBMC. De dendrittiske cellene var avledet fra monocyttter fra perifert blod. T-celler fra den resulterende stamkulturen ble testet i triplikater med eller uten peptidpulsede antigenpresenterende celler (APC) før høsting etter 3 dager. For å måle den proliferative kapasitet til kulturene ble 3H-thymidin (3,7 x IO<4>Gq/brønn) tilsatt kulturen over natten før høsting. Kulturene med ikkepulsede APC eller uten APC fungerte som kontroller. Resultatene som viser den proliferative kapasitet til kulturene vises i fig. 7. Ytterligere detaljer angående protokollen som ble anvendt beskrives nedenfor.

T-celleklonene be oppnådd fra den resulterende stamkulturen fra uvaksinerte donor 14313 og 23255. Klonene ble oppnådd fra-celleblaster til stede1PBMC som beskrevet i avsnittet ovenfor " in vitro T-celleresponsanalyser". Resultatene fra proliferasjon av T-celeklonene med peptidpulsede og ikke-peptidpulsede antigenpresenterende celler er vist i fig. 8 (donor 14313) og fig. 9 (donor 23255).

Resultatene fra fig. 7, 8 og 9 er gitt som gjennomsnittlig tellinger per minutt (cpm) av triplikate målinger. Dataene viser at blod fra mennesker inneholder sirkulerende T- celler spesifikke for et peptid avledet fra hTERT 5-innskuddspolypeptidet, og videre at slike T-celler kan ekspandere in vitro etter stimulering med det relevante peptidet.

Følgelig viser eksperimentene i fig. 7, 8 og 9 at hTERT 8-innskuddspolypeptidet er

immunogent i menneske. In vitro (eller in vivo) stimulering kan gi opphav til hTERT 8-innskuddsproteinspesifikke T-celleresponser med potensial for å gjenkjenne det samme antigen når det overuttrykkes av ent urnor som vokser i en cancerpasient. Dette spesielle eksperiment viser at dette peptidet avledet fra hTERT

8-inskuddspolypetid i prinsippet kan utvikles som en cancervaksine for mennesker.

Protokoll for induksjon av MHC klasse II- begrenset T- cellerespons

DagO:

PBMC ble separert fra 50 ml blod (fra buffy coat). Cellene ble telt og re-suspendert i fullstendig RPMI-1640/15% serum fra serumpool.

Stamkulturer ble satt opp med 1-2 brønner på en 24-brønnsplate med PBMC ved 2 x IO<6>celler/ml i 1 -1,5 ml. 25 uM peptid avledet fra hTERT 8-innskuddspolypeptidet ble tilsatt.

Dag 9-10:

Stamkulturene ble høstet og stimulert med bestrålt PBMC og peptid. Dersom det var stor celledød ble kulturene separert ved hjelp av lymfoprep, hvis ikke ble de telt og resuspendert i RPMI/25% serum fra serumpool. (Lymfoprep-sentrifugering av stamkulturene utføres i 15 ml Falcon-rør ved) tilsetting av 8 ml cellesuspensjon og 2; underlag 2 ml lymfoprep. 'Sentrifugeres ved 1500 rpm i 30 min. og vaskes to ganger med saltvann). En ampulle autologt PBMC ble tint, vasket, telt og resuspendert i RPMI/15% FCS. PBMC ble bestrålt (25 GY, 5 min 58 sek.). Cellene ble sådd ut i 24 brønns plater. 0,5 - 2,0 x IO6 T-celler fra stamkulturene ble stimulert med 1 x 106 bestrålte næringsceller (PBMC) og 25 uM peptid avledet fra hTERT 8-lnnskuddspolypeptidet. Sluttvolumet var 1 ml.

Dag 12:

IL-2 (10U/ml) ble tilsatt. Medium ble også tilsatt om nødvendig ved å erstatte halvparten av volumet. Kulturene ble delt om nødvendig.

Dag 17:

T-cellene i stamkulturen ble re-stimulert som på dag 19, det vil si med autologe bestrålte PBMC og.

Dag 19:

IL-2(10U/ml) ble tilsatt stamkulturene som ble re-stimulert dag 17.

Dag 24:

En prolifereringsanalyse for testing av T-celler for peptidspesifisitet ble satt opp i 96-brønns plater, hver betingelse i triplikater:

På dag 2-3 av prolifereringsanalysen ble<3>H-thymidin (20 ul) tilsatt, og inkubert ved 37°C over natten før høsting.

I en variant av protokollen (som anvendt i eksempelet ovenfor) ble PBMC på dag 0 primet med dendrittiske celler pulset med peptid avledet fra hTERT 8-lnnskuddspolypeptidet.

Claims (17)

1. Polypeptid for anvendelse innen medisin,karakterisertv e d at polypeptidet omfatter en sekvens gitt ved SEQ EO NO: 3, 4, 5 eller 6, der polypeptidet er i stand til å indusere en T-cellerespons.

2. Polypeptid for anvendelse innen medisin ifølge krav 1,karakterisert vedat polypeptidet ikke behøver intracelleulær kutting for å passe inn i en MHC eller HLA klasse II bindingsfordypning og er fra 12 til 25 aminosyrer langt.

3. Polypeptid for anvendelse innen medisin ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat T-celleresponsen øker antallet og/eller aktiviteten til T-hjelperceller og/eller cytotoksiske T-celler.

4. Nukleinsyremolekyl for anvendelse innen medisin,karakterisert vedat nukleinsyremolekylet: d) har en tråd som koder for et polypeptid beskrevet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3; e) har en tråd som er komplementær med en tråd beskrevet i a) ovenfor; eller f) har en tråd som hybridiserer under stringente betingelser med et molekyl beskrevet i a) eller b) ovenfor.

5. Vektor eller celle for anvendelse innen medisin,karakterisert vedat den omfatter et nukleinsyremolekyl ifølge krav 4 i rekombinant form.

6. T-lymfocytt for anvendelse innen medisin,karakterisertv e d at T-lymfocytten er i stand til å drepe en celle som uttrykker et polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3 eller er i stand til å hjelpe til med drepingen av en slik celle.

7. Anvendelse av et polypeptid som beskrevet i et hvilket som helst av kravene 1 til 3, en nukleinsyre som beskrevet i krav 4, eller en vektor eller en celle som beskrevet i krav 5, for fremstilling av et medikament for behandling av cancer, eller for fremstilling av et diagnostisk middel for diagnostisering av cancer.

8. Anvendelse ifølge krav 7, der cancertypen er en pattedyrcancer.

9. Anvendelse ifølge krav 8,karakterisert vedat cancertypen er human cancer.

10. Anvendelse ifølge krav 7 til 9, der cancertypen er brystcancer, prostatacancer, pankreascancer, colorektalcancer, lungecancer, malignt melanom, leukemi, lymfom, ovariealcancer, cervicalcancer eller gallekanalskarsinom.

11. Anvendelse ifølge krav 7 til 10, der medikamentet er en vaksine.

12. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 7 til 10 der det diagnostiske middel frembringes i et kit.

13. Farmasøytisk sammensetning,karakterisert vedat den omfatter et polypeptid som beskrevet i et hvilket som helst av kravene 1 til 3, en nukleinsyre som beskrevet i krav 4 eller en vektor eller en celle som beskrevet i krav 5.

14. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 13,karakterisertv e d at den ytterligere omfatter et polypeptid som er i stand til å indusere en T-cellerespons rettet mot et polypeptid produsert av et onkogen eller mot et mutant tumorsuppressorprotein, eller en nukleinsyre som koder for et slikt polypeptid.

15. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 14,karakterisertv e d at nevnte onkogen eller mutante tumorsuppressorprotein er p21-ras, Rb, p53, abl, gip, gsp, ret eller trk.

16. Farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 13 til 15,karakterisert vedat det omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer, fortynningsmiddel, additiv, stabilisator og/eller adjuvans; der nevnte sammensetning eller kombinerte preparat eventuelt ytterligere inkluderer en eller flere av et cytokin eller en vekstfaktor.

17. Farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 13 til 16,karakterisert vedat den er en vaksine.