DE69937294T2

DE69937294T2 - Von cyclophilin b abstammende tumorantigen-peptide

Info

Publication number: DE69937294T2
Application number: DE69937294T
Authority: DE
Inventors: Kyogo Miyaki-gun ITOH; Shinya Soja-shi GOMI
Original assignee: Green Peptide Co Ltd
Current assignee: Green Peptide Co Ltd
Priority date: 1998-06-25
Filing date: 1999-06-24
Publication date: 2008-07-03
Anticipated expiration: 2019-06-25
Also published as: EP1090924B1; ES2294844T3; HK1067645A1; US7041297B1; EP1090924A4; TWI228128B; KR100653590B1; NZ508996A; EP1090924B8; AU4392699A; ID27788A; CN1318447C; US20060008463A1; JP4413429B2; CN1525980A; WO1999067288A9; AU749544B2; ATE375362T1; KR20010053180A; EP1090924A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue, von Cyclophilin B abstammende Tumorantigen-Peptide und Derivate davon, die funktionell äquivalente Eigenschaften aufweisen, und außerdem Arzneimittel, prophylaktische Mittel oder Diagnosemittel für Tumoren, die in vivo oder in vitro solche Tumorantigen-Peptide, Derivate davon, Cyclophilin-B-Polypeptide oder Gene dafür nutzen.
Es ist bekannt, dass das Immunsystem, insbesondere T-Zellen, eine wichtige Rolle in der Eliminierung eines Tumors durch einen lebenden Körper spielen. Tatsächlich wurde eine Infiltration von Lymphocyten, die cytotoxische Effekte auf Tumorzellen ausüben, in menschlichen Tumorherden festgestellt (Arch. Surg. 126: 200, 1990), außerdem wurden cytotoxische T-Lymphocyten (CTLs), welche autologe Tumorzellen erkennen, ohne große Schwierigkeiten aus Melanomen isoliert (z. B. Immunol. Today 8: 385, 1987; J. Immunol. 138: 989, 1987; und Int. J. Cancer 52: 52, 1992). Des Weiteren weisen auch die Ergebnisse einer klinischen Behandlung von Melanomen durch eine Übertragung der CTLs, die autologe Tumorzellen erkennen, darauf hin, dass T-Zellen bei der Eliminierung von Tumoren eine wichtige Rolle spielen (J. Natl. Cancer. Inst. 86: 1159, 1994).
Lange war unbekannt, welches die Zielmoleküle für die CTLs, die autologe Tumorzellen angreifen, sind; durch Erfolge in der Immunologie und Molekularbiologie macht jedoch in letzter Zeit die Aufklärung solcher Zielmoleküle immer mehr Fortschritte. Insbesondere wurde gefunden, dass ein CTL unter Verwendung der T-Zell-Rezeptoren (TCRs) einen Komplex zwischen einem Peptid, genannt Tumorantigen-Peptid, und einem Haupt-Histokompatibilitätskomplex-Antigen der Klasse I (MHC Klasse-I-Antigen, und im Fall des Menschen als HLA-Antigen bezeichnet) erkennt und dadurch autologe Tumorzellen angreift.
Tumorantigen-Peptide werden durch Abbau von Proteinen, welche für Tumoren spezifisch sind, d. h. Tumorantigen-Proteinen, in Zellen mit Proteasomen erzeugt, wobei diese Proteine intrazellulär synthetisiert werden. Die auf diese Weise erzeugten Tumorantigen-Peptide binden an MHC Klasse-I-Antigene (HLA-Antigene) im endoplasmatischen Retikulum, wodurch Komplexe gebildet werden, und die Komplexe werden zur Zelloberfläche transportiert, wo sie als Antigen präsentiert werden. Ein tumorspezifischer CTL erkennt den als Antigen präsentierten Komplex und übt durch seine cytotoxische Wirkung oder durch die Produktion von Lymphokinen anti-Tumor-Effekte aus. Als Folge davon, dass eine Reihe der Wirkungen aufgeklärt wurde, ist es nun möglich geworden, Tumoren durch die Verwendung von Tumorantigen-Proteinen oder Tumorantigen-Peptiden als sogenannte Krebsvakzine zu behandeln, wodurch tumorspezifische CTLs im Körper eines Tumorpatienten vermehrt werden.
Im Jahr 1991 identifizierten T. Boon et al. erstmals ein MAGE genanntes Protein aus menschlichen Melanomzellen als ein Tumorantigen-Protein (Science 254: 1643, 1991). In der Folge wurden mehrere weitere Tumorantigen-Proteine hauptsächlich aus Melanomzellen identifiziert. Beispiele von Melanomantigenen, die identifiziert wurden, sind melanosomale Proteine wie ein Melanocytengewebespezifisches Protein, gp100 (J. Exp. Med. 179: 1005, 1994), MART-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3515, 1994) und Tyrosinase (J. Exp. Med. 178: 489, 1993), MEGE-verwandte Proteine, die nicht nur auf Melanomen, sondern auch auf verschiedenen Krebszellen und normalen Hodenzellen exprimiert werden (J. Exp. Med. 179: 921, 1994), β-Catenin, das eine tumorspezifische Aminosäuremutation aufweist (J. Exp. Med. 183: 1185, 1996), und CDK4 (Science 269: 1281, 1995). Außerdem wurden noch andere Tumorantigen-Proteine als diejenigen aus Melanomen identifiziert, einschließlich Produkte von Onkogenen wie HER2-neu (J. Exp. Med. 181: 2109, 1995) und p53 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14704, 1996), Tumormarker wie CEA (J. Natl. Cancer Inst. 87: 982, 1995) und PSA (J. Natl. Cancer Inst. 89: 293, 1997), und Virusproteine wie HPV (J. Immunol 154: 5934, 1995) und EBV (Int. Immunol. 7: 653, 1995). Ausführliche Beschreibungen dieser Themen finden sich in veröffentlichten Übersichtsartikeln (z. B. Immunol. Today 18: 267, 1997; J. Exp. Med. 183: 725, 1996; und Curr. Opin. Immunol. 8: 628, 1996).
Bei Anwendungen eines Tumorantigen-Proteins oder Tumorantigen-Peptids zur Behandlung oder Diagnose von Tumoren ist es wichtig, ein Tumorantigen zu identifizieren, das ein großes Spektrum von Anwendungsmöglichkeiten für Epitheltumoren wie Magen- und Lungenkarzinome hat, die im Vergleich zu Melanomen mit einer viel höheren Inzidenz auftreten. In diesem Zusammenhang clonierten die Erfinder ein Gen, welches ein neues Tumorantigen-Protein codiert, aus Plattenepithelkarzinomzellen, die von einem Ösophaguskarzinom stammten, und sie identifizierten erstmals aus Tumorzellen, die keine Melanome sind, verschiedene Tumorantigen-Peptide, die an HLA-Antigene der HLA-Typen HLA-A24 oder HLA-A26 gebunden und darauf präsentiert werden (J. Exp. Med. 187: 277, 1998; Internationale Patentveröffentlichung WO 97/46676 ).
Wenn diese Tumorantigen-Peptide in der Praxis klinisch angewendet werden, ist es wünschenswert, eher zwei oder mehrere verschiedene Tumorantigen-Peptide als nur ein einzelnes Peptid einzusetzen. Das heißt, wenn man die Tatsache in Betracht zieht, dass nicht alle Krebszellen gemeinsam ein identisches Tumorantigen exprimieren und dass auf einer einzelnen Krebszelle zwei oder mehrere verschiedene Tumorantigen-Peptide präsentiert werden, kann man davon ausgehen, dass eine Behandlung unter Verwendung von zwei oder mehreren verschiedenen Tumorantigen-Peptiden besser wirksam ist. Tatsächlich wurden im Fall des Melanoms Versuche unternommen, Cocktail-Formulierungen, welche zwei oder mehrere Peptide enthalten, zu entwickeln, da ein einzelnes Peptid, das von einem Tumorantigen stammte, nicht die entsprechenden Effekte zeigte (Int. J. Cancer 66: 162, 1996; und Int. J. Cancer 67: 54, 1996). Unter solchen Umständen ist es erforderlich, neue Tumorantigen-Proteine und Tumorantigen-Peptide zu identifizieren, die ein großes Spektrum von Anwendungsmöglichkeiten für Epitheltumoren wie Magen- und Lungenkarzinome, die mit einer hohen Inzidenz auftreten, haben.
Die vorliegende Erfindung zielt darauf, neue Tumorantigen-Peptide, bestehend aus einer Länge von 8 bis 14 Aminosäuren von Cyclophilin B, die eine Aminosäuresequenz, wie in einer der SEQ ID NOs: 1 bis 36 gezeigt, umfassen und die an ein HLA-Antigen binden und von cytotoxischen T-Lymphocyten erkannt werden, und Derivate davon, die funktionell äquivalente Eigenschaften aufweisen, sowie Arzneimittel, prophylaktische Mittel und Diagnosemittel für Tumoren bereitzustellen, welche in vivo oder in vitro die Tumorantigen-Peptide, die Derivate davon, Cyclophilin-B-Polypeptide oder Gene dafür nutzen.
Das von Cyclophilin B abstammende Tumorantigen-Peptid der vorliegenden Erfindung umfasst ein Tumorantigen-Peptid, das an HLA-A24 und HLA-A2 gebunden ist und darauf präsentiert wird, wobei es sich um HLA-Antigene handelt, welche die Japaner und Kaukasier mit einer hohen Wahrscheinlichkeit aufweisen, und außerdem handelt es sich um ein Tumorantigen-Peptid, das für die Behandlung oder Verhinderung eines großen Spektrums von Tumoren, einschließlich Epitheltumoren, wie Lungenkrebs, Blasenkrebs und Osteosarkom, sowie Leukämien, angewendet werden kann. Demgemäß kann man davon ausgehen, dass Cyclophilin B oder von Cyclophilin B abstammende Tumorantigen-Peptide und ein Gen dafür als neue Antitumormedikamente geeignet sind.
Die Erfinder sind wie folgt vorgegangen, um neue Tumorantigen-Peptide und ein Tumorantigen-Protein, von welchem die Peptide abstammen, zu erhalten.
Zuerst haben die Erfinder aus Lymphocyten eines Patienten mit Lungenadenokarzinom eine CTL-Zelllinie etabliert, welche HLA-A24- oder HLA-A2-positive Blasenkrebs-, Lungenkrebs-, Osteosarkom- oder Leukämie-Zelllinien erkennt, und sie mit KG-CTL bezeichnet (Hinterlegungsnummer: FERM BP-6725).
Als nächstes wurde eine cDNA-Bank aus der Blasenkrebs-Zelllinie HT-1376 hergestellt, mit welcher der vorstehende KG-CTL stark reagierte, und sodann wurden COS-7-Zellen mit einem rekombinanten Plasmid der Bank und einem rekombinanten Plasmid, enthaltend HLA-A2402-(ein Typ von HLA-A24)cDNA, doppelt transfiziert. Die resultierenden Transfektanten wurden mit dem vorstehenden KG-CTL behandelt, und danach wurde die Menge des produzierten IFN-γ gemessen, um zu bestimmen, ob der KG-CTL aktiviert war oder nicht. Als Ergebnis einer solchen wiederholt durchgeführten Durchmusterung konnten die Erfinder schließlich ein Gen clonieren, welches ein Tumorantigen-Protein codiert. Durch Basensequenzierung des Gens wurde gezeigt, dass das Tumorantigen-Protein die gleiche Aminosäuresequenz wie diejenige eines bekannten Proteins, Cyclophilin B, aufwies.
Von Cyclophilin B ist bekannt, dass es ein Bindungsprotein für ein immunsuppressives Mittel, Cyclosporin A, darstellt und an der Aktivierung von Immunzellen beteiligt ist. Jedoch war bisher, bevor die vorliegende Erfindung gemacht wurde, noch nicht bekannt, dass es eine Funktion als ein Tumorantigen hat.
Danach identifizierten die Erfinder Tumorantigen-Peptid-Teile in der Aminosäuresequenz von Cyclophilin B, die an HLA-A24 und HLA-A2 gebunden und darauf präsentiert werden, und sie zeigten, dass solche Peptide und Derivate davon eine Aktivität als Tumorantigen-Peptid besitzen.
Weiterhin haben die Erfinder gezeigt, dass Homologa von Cyclophilin B, die Cyclophiline A, C und D, auch Tumorantigen-Peptid-Aktivitäten ähnlich wie Cyclophilin B besitzen.
Die vorliegende Erfindung wurde auf Grundlage der wie vorstehend beschriebenen Erkenntnisse vervollständigt.
Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung auf:

(1) ein Tumorantigen-Peptid, bestehend aus einer Länge von 8 bis 14 Aminosäuren von Cyclophilin B, das eine Aminosäuresequenz, wie in einer der SEQ ID NOs: 1 bis 36 gezeigt, umfasst und das an ein HLA-Antigen bindet und von cytotoxischen T-Lymphocyten erkannt wird;
(2) das Tumorantigen-Peptid gemäß dem vorstehenden Punkt (1), das die in SEQ ID NO: 1 oder 2 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst;
(3) ein Derivat des Tumorantigen-Peptids gemäß dem vorstehenden Punkt (1), in welchem der Aminosäurerest an Position 2 und/oder der C-Terminus in der in einer der SEQ ID NOs: 1 bis 36 gezeigten Aminosäuresequenz durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist und in welchem das Derivat an ein HLA-Antigen bindet und von cytotoxischen T-Lymphocyten erkannt wird;
(4) das Derivat gemäß dem vorstehenden Punkt (3), in welchem der Aminosäurerest an Position 2 und/oder der C-Terminus in der in SEQ ID NO: 1 oder 2 gezeigten Aminosäuresequenz durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist;
(5) das Derivat gemäß dem vorstehenden Punkt (3), in welchem der Aminosäurerest an Position 2 in der in einer der SEQ ID NOs: 1 bis 11 gezeigten Aminosäuresequenz durch Tyrosin, Phenylalanin, Methionin oder Tryptophan ersetzt ist und/oder der Aminosäurerest am C-Terminus durch Phenylalanin, Leucin, Isoleucin, Tryptophan oder Methionin ersetzt ist;
(6) das Derivat gemäß dem vorstehenden Punkt (3), in welchem der Aminosäurerest an Position 2 in der in einer der SEQ ID NOs: 12 bis 36 gezeigten Aminosäuresequenz durch Leucin, Methionin, Valin, Isoleucin oder Glutamin ersetzt ist und/oder der Aminosäurerest am C-Terminus durch Valin oder Leucin ersetzt ist;
(7) das Derivat gemäß dem vorstehenden Punkt (5), umfassend die in SEQ ID NO: 37 oder 38 gezeigte Aminosäuresequenz;
(8) das Derivat gemäß dem vorstehenden Punkt (7), umfassend die in SEQ ID NO: 39 oder 40 gezeigte Aminosäuresequenz;
(9) ein Arzneimittel, umfassend mindestens einen der Stoffe, ausgewählt aus Tumorantigen-Peptiden und Derivaten davon gemäß einem der vorstehenden Punkte (1) bis (8);
(10) ein Arzneimittel, umfassend ein partielles Polypeptid von Cyclophilin B, welches ein Tumorantigen-Peptid gemäß dem vorstehenden Punkt (1) oder (2) umfasst, oder ein Gen, welches das partielle Polypeptid codiert;
(11) einen Antikörper, welcher spezifisch an das Tumorantigen-Peptid oder das Derivat davon gemäß einem der vorstehenden Punkte (1) bis (8) bindet;
(12) eine Antigen-präsentierende Zelle, wobei ein Komplex zwischen einem HLA-Antigen und dem Tumorantigen-Peptid oder dem Derivat davon gemäß einem der vorstehenden Punkte (1) bis (8) auf der Oberfläche einer Zelle, welche Antigenpräsentierende Eigenschaften hat, präsentiert wird, wobei die Zelle aus einem Tumorpatienten isoliert ist;
(13) eine Antigen-präsentierende Zelle, auf welcher ein Komplex zwischen einem HLA-Antigen und dem von Cyclophilin B abstammenden Tumorantigen-Peptid präsentiert wird, wobei die Antigen-präsentierende Zelle dadurch hergestellt wird, dass einer Zelle, welche Antigen-präsentierende Eigenschaften hat und welche aus einem Tumorpatienten isoliert ist, erlaubt wird, Cyclophilin B, ein partielles Polypeptid von Cyclophilin B, welches das Tumorantigen-Peptid gemäß dem vorstehenden Punkt (1) oder (2) umfasst, oder ein Gen, welches das Cyclophilin B oder das partielle Polypeptid davon codiert, aufzunehmen;
(14) ein Arzneimittel, umfassend die Antigen-präsentierende Zelle gemäß dem vorstehenden Punkt (12) oder (13);
(15) einen cytotoxischen T-Lymphocyt, welcher spezifisch einen Komplex zwischen einem HLA-Antigen und einem Tumorantigen-Peptid oder Derivat davon gemäß einem der vorstehenden Punkte (1) bis (8) erkennt;
(16) einen cytotoxischen T-Lymphocyt, welcher spezifisch einen Komplex zwischen einem HLA-Antigen und einem Tumorantigen-Peptid oder Derivat davon erkennt, welches auf einer Antigen-präsentierenden Zelle gemäß einem der vorstehenden Punkte (12) oder (13) präsentiert wird;
(17) ein Arzneimittel, umfassend den cytotoxischen T-Lymphocyt gemäß dem vorstehenden Punkt (15) oder (16);
(18) einen cytotoxischen T-Lymphocyt, welcher die Hinterlegungsnummer FERM BP-6725 hat;
(19) ein Verfahren zur Identifizierung von Tumorantigen-Proteinen oder Tumorantigen-Peptiden, umfassend die Verwendung von FERM BP-6725 gemäß dem vorstehenden Punkt (18);
(20) ein Diagnosemittel für Tumoren, umfassend ein Tumorantigen-Peptid oder ein Derivat davon gemäß einem der vorstehenden Punkte (1) bis (8);
(21) Verwendung von mindestens einem der Stoffe, ausgewählt aus Tumorantigen-Peptiden und Derivaten davon, gemäß einem der vorstehenden Punkte (1) bis (8), Cyclophilin B, einem partiellen Polypeptid von Cyclophilin B, welches ein Tumorantigen-Peptid gemäß dem vorstehenden Punkt (1) oder (2) umfasst, oder einem Gen, welches Cyclophilin B oder das partielle Polypeptid davon codiert, einer Antigen-präsentierenden Zelle gemäß dem vorstehenden Punkt (12) oder (13) oder dem cytotoxischen T-Lymphocyt gemäß dem vorstehenden Punkt (15) oder (16), für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumoren.

Die vorliegende Erfindung beruht auf unserer ersten Demonstration, dass Stoffe, die Cyclophiline genannt werden, eine Aktivität als ein Tumorantigen-Protein besitzen. Obwohl die vorliegende Erfindung nachstehend mit Bezug auf Cyclophilin B als Gegenstand der vorliegenden Erfindung ausführlich beschrieben wird, sind die folgenden Beschreibungen nicht auf Cyclophilin B beschränkt und beziehen sich auch auf die anderen bekannten Cyclophiline, d. h. Cyclophilin A, C und D (Biochemistry 3: 8218, 1994), die jedoch nicht im Umfang der vorliegenden Erfindung liegen.
In der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „Tumorantigen-Peptid" auf ein partielles Peptid, das einen Teil von Cyclophilin B umfasst und in der Lage ist, an ein HLA-Antigen zu binden und durch CTL erkannt zu werden. Demgemäß fällt ein beliebiges Peptid in den Umfang eines Tumorantigen-Peptids der vorliegenden Erfindung, das eine Länge von 8 bis 14 Aminosäuren hat und eine wie in den SEQ ID NOs: 1 bis 36 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, wobei es ein Teil der Aminosäuresequenz des menschlichen Cyclophilin B ist, welches in der Datenbank WWW Entrez Databases als GenBank-Hinterlegungsnummer M60857 registriert ist und in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1903–1907, 1991, beschrieben ist, und wobei ein Komplex zwischen dem Peptid und einem HLA-Antigen in der Lage ist, von CTL erkannt zu werden. Solche Tumorantigen-Peptide der vorliegenden Erfindung können identifiziert werden, indem ein Peptidkandidat synthetisiert wird, der einen Teil von Cyclophilin B umfasst, und indem ein Test durchgeführt wird, mit dem bestimmt wird, ob ein Komplex zwischen dem Peptidkandidaten und einem HLA-Antigen durch CTL erkannt wird oder nicht, mit anderen Worten ob der Peptidkandidat eine Aktvität als ein Tumorantigen-Peptid hat oder nicht.
In diesem Zusammenhang kann die Synthese von Peptiden gemäß einem Verfahren durchgeführt werden, das üblicherweise in der Peptidchemie eingesetzt wird. Beispiele solcher bekannten Verfahren sind diejenigen, die in der Fachliteratur beschrieben sind, umfassend „Peptide Synthesis", Interscience, New York, 1966; „The Proteins", Bd. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; „Pepuchido-Gosei", Maruzen Co. Ltd., 1975; „Pepuchido-Gosei-no-Kiso-to-Jikkenn", Maruzen Co. Ltd., 1985; und „Iyakuhin-no-Kaihatu, Zoku, Bd. 14, Peputido-Gosei", Hirnkawa Shoten, 1991.
Verfahren zum Identifizieren von Tumorantigen-Peptiden der vorliegenden Erfindung werden nachstehend noch weiter beschrieben.
Die entsprechenden Sequenzregeln (Motive) von Antigen-Peptiden, die an die folgenden HLA-Typen gebunden und darauf präsentiert werden, waren schon bekannt; HLA-A1, -A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -A11, -A24, -A31, -A6801, -B7, -B8, -B2705, -B37, -Cw0401 und -Cw0602 (vgl. z. B. Immunogenetics 41: 178, 1995). Wenn man z. B. das Motiv für HLA-A24 betrachtet, ist bekannt, dass in der Sequenz von Peptiden, die aus 8 bis 11 Aminosäuren bestehen, die Aminosäure an Position 2 Tyrosin, Phenylalanin, Methionin oder Tryptophan ist und die Aminosäure am C-Terminus Phenylalanin, Leucin, Isoleucin, Tryptophan oder Methionin ist (J. Immunol. 152: 3913, 1994; Immunogenetics 41: 178, 1995; J. Immunol. 155: 4307, 1994). Genauso sind die Motive, die in der folgenden Tabelle 1 dargestellt sind, für HLA-A2 bekannt (Immunogenetics 41: 178, 1995; J. Immunol. 155: 4749, 1995). Tabelle 1

Typ von HLA-A2 Aminosäure an der 2. Position vom N-Terminus aus Aminosäure am C-Terminus

HLA-A0201 L, M V, L

HLA-A0204 L L

HLA-A0205 V, L, I, M L

HLA-A0206 V, Q V, L

HLA-A0207 L L

(Die Peptide haben eine Länge von 8 bis 11 Aminosäuren)

Durch die Analyse von Antigenpeptiden, die an verschiedene HLA-Moleküle gebunden waren (Immunogenetics 41: 178, 1995), wurde gezeigt, dass die Länge der Peptide üblicherweise etwa 8 bis 14 Aminosäuren beträgt, wobei jedoch für HLA-DR, -DP und -DQ auch Antigenpeptide mit einer Länge von 14 oder mehr Aminosäuren festgestellt wurden.
Es ist einfach, Peptidteile zu selektieren, die an solchen Motiven aus der Aminosäuresequenz von Cyclophilin B beteiligt sind. D. h. solche Peptidteile, die an den vorstehenden Motivstrukturen beteiligt sind, können einfach selektiert werden, indem die Aminosäuresequenz von Cyclophilin B untersucht wird. Danach können Tumorantigen-Peptide der vorliegenden Erfindung identifiziert werden, indem auf dieses Weise selektierte Peptidkandidaten gemäß einem vorstehend beschriebenen Verfahren synthetisiert werden und anschließend ein Test durchgeführt wird, mit dem bestimmt wird, ob ein Komplex zwischen dem Peptidkandidaten und einem HLA-Antigen durch CTL erkannt wird oder nicht, mit anderen Worten ob der Peptidkandidat eine Aktivität als ein Tumorantigen-Peptid besitzt oder nicht.
Ein spezifisches Beispiel des Verfahrens zum Identifizieren von Tumorantigen-Peptiden der vorliegenden Erfindung ist ein in J. Immunol. 154: 2257, 1995, beschriebenes Verfahren. Genau gesagt werden periphere Blutlymphocyten aus einem Menschen isoliert, der für denjenigen Typ eines HLA-Antigens positiv ist, von dem man erwartet, dass er den Peptidkandidaten präsentiert, und diese werden sodann in vitro durch Zugabe des Peptidkandidaten stimuliert. Wenn der Kandidat einen CTL stimuliert, der spezifisch die mit dem Peptidkandidaten gepulsten HLA-Antigen-präsentierenden Zellen erkennt, wird dadurch angezeigt, dass der Peptidkandidat möglicherweise eine Funktion als Tumorantigen-Peptid hat. In diesem Zusammenhang kann das Vorliegen oder die Abwesenheit einer CTL-Induktion nachgewiesen werden, indem z. B. die Menge von verschiedenen Cytokinen (z. B. IFN-γ) gemessen wird, die durch den CTL als Antwort auf die Antigenpeptid-präsentierenden Zellen produziert werden, wobei z. B. ein ELISA-Verfahren eingesetzt werden kann. Alternativ kann für einen solchen Nachweis auch ein Verfahren verwendet werden, in welchem die Cytotoxizität von CTL gegen Antigenpeptid-präsentierende Zellen, markiert mit ⁵¹Cr, gemessen wird (⁵¹Cr-Freisetzungs-Test, Int. J. Cancer 58: 317, 1994).
Weiterhin kann der vorstehende Nachweis auch wie folgt erreicht werden. Ein Expressionsplasmid, welches eine cDNA für denjenigen Typ eines HLA-Antigens exprimiert, von welchem man erwartet, dass er den Peptidkandidaten präsentiert, wird z. B. in COS-7-Zellen (ATCC Nr. CRL1651) oder VA-13-Zellen (RIKEN CELL BANK, The Institute of Physical and Chemical Research) eingeführt, und sodann werden die resultierenden Zellen mit dem Peptidkandidaten gepulst. Danach werden die Zellen, wie vorstehend beschrieben, mit CTLs behandelt, und sodann wird die Menge von verschiedenen, durch die CTLs produzierten Cytokinen (z. B. IFN-γ) gemessen (J. Exp. Med. 187: 277, 1998).
Spezifische Beispiele von verschiedenen Tests, wie vorstehend beschrieben, werden nachstehend in den Beispielen 7, 10 und 12 erläutert.
Cyclophilin B enthält HLA-A24- oder HLA-A2-restringierte Tumorantigen-Peptid-Teile. Um HLA-A24-restringierte Tumorantigen-Peptide zu identifizieren, kann HLA-A24-cDNA (Cancer Res. 55: 4248–4252, GenBank-Hinterlegungsnummer M64740) als eine cDNA, welche das HLA-Antigen codiert, zusammen mit denjenigen CTLs, die durch Peptidstimulation menschlicher peripherer Blutlymphocyten hergestellt wurden, oder zusammen mit KG-CTL (FERM-BP-6725) verwendet werden. Genauso kann für HLA-A2-restringierte Tumorantigen-Peptide eine Identifizierung solcher Tumorantigen-Peptide in ähnlicher Weise erreicht werden wie vorstehend, nur mit der Ausnahme, dass HLA-A2-cDNA (GenBank-Hinterlegungsnummer M84379) verwendet wird.
Abgesehen von den vorstehenden Fällen, bei denen die Sequenzregeln (Motive) aufgeklärt wurden, können in den Fällen, wenn ein relevantes Peptidmotiv noch nicht aufgeklärt wurde, wie HLA-A26, Tumorantigen-Peptide der vorliegenden Erfindung z. B. gemäß dem in WO 97/46676 beschriebenen Verfahren identifiziert werden, mit der Maßgabe, dass eine CTL-Linie, welche einen Komplex zwischen HLA-A26 und einem Tumorantigen-Peptid erkennt, verfügbar ist.
Die Verfahren zum Identifizieren von Tumorantigen-Peptiden, wie vorstehend beschrieben, können nachstehend alle zusammen als „Testverfahren für Tumorantigen-Peptide" bezeichnet sein.
Wie vorstehend beschrieben, ist bekannt, dass die Sequenzen von Tumorantigen-Peptiden, die an HLA-A24 gebunden und darauf präsentiert werden, einer bestimmten Regel (Motiv) gehorchen, wobei insbesondere das Motiv so aussieht, dass in einer Sequenz eines aus 8 bis 11 Aminosäuren bestehenden Peptids die Aminosäure an Position 2 Tyrosin, Phenylalanin, Methionin oder Tryptophan ist und die Aminosäure am C-Terminus Phenylalanin, Leucin, Isoleucin, Tryptophan oder Methionin ist (J. Immunol. 152: 3913, 1994; Immunogenetics 41: 178, 1995; J. Immunol. 155: 4307, 1994). Genauso lässt sich eine ähnliche Regel (Motiv) in den Sequenzen von Tumorantigen-Peptiden finden, die an HLA-A2 gebunden und darauf präsentiert werden, wobei insbesondere die Motive bekannt sind, die in der vorstehenden Tabelle 1 dargestellt sind (Immunogenetics 41: 178, 1995; J. Immunol. 155: 4749, 1995). Demgemäß dienen von den Tumorantigen-Peptiden der vorliegenden Erfindung die HLA-A24- und HLA-A2-restringierten Tumorantigen-Peptide als Beispiele für diejenigen Tumorantigen-Peptide, welche partielle Peptide sind, die an solchen Motivstrukturen in der Aminosäuresequenz von Cyclophilin B beteiligt sind und die in der Lage sind, an entsprechende HLA-Antigene zu binden und durch CTLs erkannt zu werden.
Spezielle Beispiele von den vorstehend beschriebenen HLA-A24-restringierten Tumorantigen-Peptiden sind diejenigen Tumorantigen-Peptide, welche die gesamte oder einen Teil einer Aminosäuresequenz umfassen, die in einer der SEQ ID NOs: 1 bis 11 dargestellt ist, und welche in der Lage sind, an HLA-A24-Antigen zu binden und durch CTL erkannt zu werden. Genauso sind spezielle Beispiele von HLA-A2-restringierten Tumorantigen-Peptiden diejenigen Tumorantigen-Peptide, welche die gesamte oder einen Teil einer Aminosäuresequenz umfassen, die in einer der SEQ ID NOs: 12 bis 36 dargestellt ist, und welche in der Lage sind, an HLA-A2-Antigen zu binden und durch CTL erkannt zu werden.
Somit schließen Beispiele von Tumorantigen-Peptiden der vorliegenden Erfindung ein:

1) Peptide, welche aus einer Aminosäuresequenz, wie in einer der SEQ ID NOs: 1 bis 36 gezeigt, bestehen,
2) Peptide, welche die vollständige Länge einer Aminosäuresequenz, wie in einer der SEQ ID NOs: 1 bis 36 gezeigt, umfassen und welche in der N-terminalen und/oder C-terminalen Richtung im Vergleich zu der Aminosäuresequenz verlängert sind, oder Peptide, welche aus einem zusammenhängenden Teil einer Aminosäuresequenz, wie in einer der SEQ ID NOs: 1 bis 36 gezeigt, bestehen, wobei die Peptide in der Lage sind, an entsprechende HLA-Antigene zu binden und durch CTLs erkannt zu werden. In diesem Zusammenhang können die Peptide im vorstehenden Punkt 2) eine Länge von etwa 8 bis 14 Aminosäuren aufweisen, und zwar unter Berücksichtigung der Tatsache, dass sie an entsprechende HLA-Antigene gebunden und darauf präsentiert werden.

Geeignete Beispiele von HLA-A24-restringierten Tumorantigen-Peptiden der vorliegenden Erfindung schließen diejenigen Tumorantigen-Peptide ein, welche die in SEQ ID NO: 1 oder 2 gezeigte Aminosäuresequenz umfassen und welche in der Lage sind, an ein HLA-A24-Antigen zu binden und von CTL erkannt zu werden. Somit sind Beispiele:

1) Peptide, welche aus der in SEQ ID NO: 1 oder 2 gezeigten Aminosäuresequenz bestehen,
2) Peptide, welche die vollständige Länge der in SEQ ID NO: 1 oder 2 gezeigten Aminosäuresequenz umfassen und welche in der N-terminalen und/oder C-terminalen Richtung im Vergleich zu der Aminosäuresequenz verlängert sind, oder Peptide, welche aus einem zusammenhängenden Teil der in SEQ ID NO: 1 oder 2 gezeigten Aminosäuresequenz bestehen, wobei die Peptide in der Lage sind, an HLA-A24-Antigene zu binden und durch CTLs erkannt zu werden. In diesem Zusammenhang können die Peptide im vorstehenden Punkt 2) eine Länge von etwa 8 bis 14 Aminosäuren aufweisen, und zwar unter Berücksichtigung der Tatsache, dass sie an HLA-A24-Antigene gebunden und darauf präsentiert werden.

In der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „Derivat, das Eigenschaften aufweist, die zu denjenigen eines Tumorantigen-Peptids funktionell äquivalent sind" (kann nachstehend einfach als Tumorantigen-Peptid-Derivat bezeichnet werden) auf ein verändertes Peptid, dessen Aminosäuresequenz eine Substitution von einem oder zwei spezifischen Aminosäureresten einer Aminosäuresequenz eines Tumorantigen-Peptids der vorliegenden Erfindung enthält und welches die Eigenschaften eines Tumorantigen-Peptids aufweist, das in der Lage ist, an ein HLA-Antigen zu binden und durch CTL erkannt zu werden.
Die Länge von Tumorantigen-Peptid-Derivaten der vorliegenden Erfindung beträgt 8 bis 14 Aminosäuren, wie im Fall des vorstehend beschriebenen Tumorantigen-Peptids.
Solche Tumorantigen-Peptid-Derivate der vorliegenden Erfindung können identifiziert werden, indem veränderte Peptide, die eine Änderung eines Teils eines Tumorantigen-Peptids der vorliegenden Erfindung enthalten, gemäß der vorstehenden Herstellung des Peptids synthetisiert werden und indem der vorstehende Test für Tumorantigen-Peptide durchgeführt wird.
Wie vorstehend beschrieben, wurden die Sequenzregeln (Motive) für Peptide aufgeklärt, welche an HLA-Typen wie HLA-A0201, -A0204, -A0205, -A0206 und -A0207 gebunden und darauf präsentiert werden. Folglich können Tumorantigen-Peptid-Derivate, welche eine Substitution von einer oder zwei spezifischen Aminosäuren in einem Tumorantigen-Peptid der vorliegenden Erfindung enthalten, auf der Grundlage solcher Motive hergestellt werden.
Z. B. ist unter Betrachtung des Motivs für Antigenpeptide, die an HLA-A24 gebunden und darauf präsentiert werden, wie vorstehend beschrieben, bekannt, dass in der Sequenz eines aus 8 bis 11 Aminosäuren bestehenden Peptids die Aminosäure an Position 2 Tyrosin, Phenylalanin, Methionin oder Tryptophan ist und die Aminosäure am C-Terminus Phenylalanin, Leucin, Isoleucin, Tryptophan oder Methionin ist (J. Immunol. 152: 3913, 1994; Immunogenetics 41: 178, 1995; J. Immunol. 155: 4307, 1994). Genauso sind die Motive; die in der vorstehenden Tabelle 1 dargestellt sind, für HLA-A2 bekannt. Außerdem können auch Aminosäurereste akzeptiert werden, welche ähnliche Eigenschaften wie diejenigen von Aminosäuren gemäß den Motiven aufweisen. Deshalb schließen Beispiele von Tumorantigen-Peptid-Derivaten der vorliegenden Erfindung diejenigen Peptidderivate ein, die das Tumorantigen-Peptid der vorliegenden Erfindung umfassen, in welchem ein oder zwei Aminosäurereste an beliebigen Positionen, für die eine Substitution gemäß den Motiven möglicherweise erlaubt ist (für HLA-A24 und HLA-A2, Position 2 und der C-Terminus), durch andere Aminosäuren ersetzt sind, wobei diese Derivate eine Aktivität zur Bindung an HLA-Antigene und zur Erkennung durch CTLs besitzen. Bevorzugte Beispiele sind diejenigen Tumorantigen-Peptid-Derivate, die das Tumorantigen-Peptid der vorliegenden Erfindung umfassen, in welchem eine Substitution von Aminosäureresten ausgewählt ist aus derjenigen von Aminosäureresten an den Positionen gemäß den vorstehenden Motiven, wobei die Derivate die vorstehende Aktivität besitzen. Die Länge der Aminosäuresequenz beträgt 8 bis 14 Aminosäuren.
Beispiele von HLA-A24- oder HLA-A2-restringierten Tumorantigen-Peptid-Derivaten schließen diejenigen Peptidderivate ein, die das Tumorantigen-Peptid der vorliegenden Erfindung darstellen, in welchem ein oder zwei Aminosäurereste an Positionen, an denen eine Substitution gemäß den vorstehenden Motiven erlaubt ist, insbesondere an Position 2 und/oder am C-Terminus, eines von der Aminosäuresequenz von Cyclophilin B abstammenden Peptids, das ein Bindungsmotiv für HLA-A24 oder HLA-A2 aufweist, durch andere Aminosäurereste ersetzt sind, wobei die Derivate die vorstehende Aktivität besitzen. Bevorzugte Beispiele sind diejenigen Tumorantigen-Peptid-Derivate, die das Tumorantigen-Peptid der vorliegenden Erfindung darstellen, in welchem die Aminosäurereste an Position 2 und/oder der C-Terminus durch Aminosäurereste gemäß den vorstehenden Motiven ersetzt sind, wobei die Derivate die vorstehende Aktivität besitzen. In solchen HLA-A24- oder HLA-A2-restringierten Tumorantigen-Peptid-Derivaten beträgt eine bevorzugte Länge der Aminosäuresequenz 8 bis 11 Aminosäuren. Insbesondere sind Beispiele von HLA-A24-restringierten Tumorantigen-Derivaten diejenigen Tumorantigen-Peptid-Derivate, die die Tumorantigen-Peptid-Derivate der vorliegenden Erfindung sind, in welchen der Aminosäurerest an Position 2 einer Aminosäuresequenz, wie in einer der SEQ ID NOs: 1 bis 11 gezeigt, durch Tyrosin, Phenylalanin, Methionin oder Tryptophan ersetzt ist und/oder der Aminosäurerest am C-Terminus durch Phenylalanin, Leucin, Isoleucin, Tryptophan oder Methionin ersetzt ist, wobei die Derivate die vorstehende Aktvität besitzen. Genauso sind Beispiele von HLA-A2-restringierten Tumorantigen-Derivaten diejenigen Tumorantigen-Peptid-Derivate, welche das Tumorantigen-Peptid der vorliegenden Erfindung darstellen, in welchem der Aminosäurerest an Position 2 einer Aminosäuresequenz, wie in einer der SEQ ID NOs: 12 bis 36 gezeigt, durch Leucin, Methionin, Valin, Isoleucin oder Glutamin ersetzt ist und/oder der Aminosäurerest am C-Terminus durch Valin oder Leucin ersetzt ist, wobei die Derivate die vorstehende Aktvität besitzen.
Geeignete Beispiele von HLA-A24-restringierten Tumorantigen-Peptid-Derivaten der vorliegenden Erfindung sind diejenigen Tumorantigen-Peptid-Derivate, welche das Tumorantigen-Peptid der vorliegenden Erfindung darstellen, in welchem die Aminosäurereste an Position 2 und/oder am C-Terminus der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 1 oder 2 gezeigt, durch andere Aminosäurereste ersetzt sind, wobei die Derivate die vorstehende Aktvität besitzen. Stärker bevorzugte Beispiele sind diejenigen Tumorantigen-Peptid-Derivate, die das Tumorantigen-Peptid der vorliegenden Erfindung darstellen, in welchem ein oder mehrere Aminosäurereste gemäß den vorstehenden Motiven ersetzt sind, d. h. ein Derivat, wie vorstehend definiert, umfassend die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 37 oder 38 gezeigt, wobei die Derivate die vorstehende Aktivität besitzen. Geeignete Beispiele solcher Tumorantigen-Peptid-Derivate sind in den SEQ ID NOs: 39 und 40 dargestellt.
Ein Tumorantigen-Peptid oder ein Derivat davon der vorliegenden Erfindung kann für ein Arzneimittel zur Behandlung oder Verhinderung von Tumoren wie folgt verwendet werden.
Bei der Verwendung mit dem Ziel zur Behandlung oder Verhinderung von Tumoren wird mindestens eines der Tumorantigen-Peptide oder ihrer Derivate der vorliegenden Erfindung oder eine Kombination von zwei oder mehreren davon an einen Patienten verabreicht, sofern erforderlich in Kombination mit anderen Mitteln wie anderen Tumorantigen-Peptiden. Wenn die Zusammensetzung zur Behandlung oder Verhinderung von Tumoren, welche als Wirkstoff ein Tumorantigen-Peptid oder ein Derivat davon der vorliegenden Erfindung umfasst, an einen Cyclophilin-B-positiven Patienten verabreicht wird, wird das Tumorantigen-Peptid oder ein Derivat davon zusammen mit einem HLA-Antigen von Antigen-präsentierenden Zellen mit einer hohen Dichte präsentiert, und deshalb proliferieren CTLs, die für den präsentierten HLA-Antigenkomplex spezifisch sind, und zerstören die Tumorzellen. Als Ergebnis kann der Tumor des Patienten behandelt werden, oder die Proliferation oder Metastasierung des Tumors kann verhindert werden. Weiterhin kann die Zusammensetzung zur Behandlung oder Verhinderung von Tumoren, wobei die Zusammensetzung als Wirkstoff ein Tumorantigen-Peptid oder ein Derivat davon der vorliegenden Erfindung umfasst, durch ihre Verwendung in Kombination mit einer Chemotherapie oder Radiotherapie noch eine gesteigerte therapeutische Wirkung zur Folge haben.
Die Zusammensetzung zur Behandlung oder Verhinderung von Tumoren, die als Wirkstoff ein Tumorantigen-Peptid oder ein Derivat davon der vorliegenden Erfindung umfasst, kann zusammen mit einem Adjuvans verabreicht werden, um die zelluläre Immunität effektiv aufzubauen, oder sie kann in einer partikulären Dosierungsform verabreicht werden. Hierfür können diejenigen Adjuvantien eingesetzt werden, die in der Literatur beschrieben sind (Clin. Microbiol. Rev. 7: 277–289, 1994). Des Weiteren sind auch liposomale Präparate, partikuläre Präparate, in welchen der Bestandteil an Perlen mit einem Durchmesser von mehreren μm gebunden ist, oder Präparate, in welchen der Bestandteil an Lipide angelagert ist, möglich. Die Verabreichung kann z. B. intradermal, hypodermal oder durch intravenöse Injektion erfolgen. Zwar kann die Menge eines Tumorantigen-Peptids oder eines Derivats davon der vorliegenden Erfindung in der Formulierung, die verabreicht werden soll, abhängig von z. B. der zu behandelnden Krankheit, dem Alter und dem Körpergewicht des jeweiligen Patienten auf einen geeigneten Wert eingestellt werden, üblicherweise ist es jedoch bevorzugt, 0,0001 mg bis 1000 mg, vorzugsweise 0,001 mg bis 1000 mg und stärker bevorzugt 0,1 mg bis 10 mg alle paar Tage bis alle paar Monate zu verabreichen.
Weiterhin kann auch ein Cyclophilin-B-Protein, von welchem Tumorantigen-Peptide der vorliegenden Erfindung abstammen, oder ein Gen, welches das Cyclophilin B codiert, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Verhinderung von Tumoren verwendet werden. Außerdem kann die gewünschte Behandlung oder Verhinderung von Tumoren zusätzlich zu dem vollständigen Cyclophilin B oder dem vollständigen Gen hierfür durch beliebige Teile hiervon wie miteinander verbundene Teile oder sogar solche, die Änderungen in ihren Basen- oder Aminosäuresequenzen enthalten, erreicht werden, so lange sie mindestens einen der Peptidteile umfassen, welche an ein HLA-Antigen binden können und durch CTLs erkannt werden. In diesem Zusammenhang werden diejenigen Stoffe, die „mindestens einen der Peptidteile umfassen, welche an ein HLA-Antigen binden können und durch CTLs erkannt werden", hier als „partielle Polypeptide" bezeichnet.
Wenn ein Cyclophilin-B-Protein oder ein partielles Polypeptid davon als die Zusammensetzung zur Behandlung oder Verhinderung von Tumoren angewendet wird, kann es in einer Dosierungsform, Verabreichungsart und Dosis verabreicht werden, welche denjenigen des vorstehenden Tumorantigen-Peptids oder Derivats davon ähnlich sind. Wenn ein Cyclophilin-B-Protein oder ein partielles Polypeptid davon an einen Tumorpatienten verabreicht wird, wird es von Antigenpräsentierenden Zellen aufgenommen, und dann binden Tumorantigen-Peptide, die anschließend durch intrazellulären Abbau erzeugt werden, an HLA-Antigene, wodurch Komplexe gebildet werden. Die Komplexe werden mit einer hohen Dichte auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert, und sodann proliferieren CTLs, die für den präsentierten Komplex spezifisch sind, im Körper effizient und zerstören die Tumorzellen. Auf diese Weise wird eine Behandlung oder Verhinderung von Tumoren erreicht.
Die folgenden Verfahren können verwendet werden, um ein Gen, welches Cyclophilin B oder ein partielles Polypeptid davon codiert, in einer Zusammensetzung zur Behandlung oder Verhinderung von Tumoren anzuwenden.
Die Verabreichung und Einführung des Gens der vorliegenden Erfindung in Zellen kann erreicht werden, indem virale Vektoren gemäß einem von weiteren Verfahren verwendet werden (Nikkei-Science, April 1994, S. 20–45; Gekkan-Yakuji 36 (1): 23–48 (1994); Jikken-Igaku-Zokan 12 (5), 1994, und darin zitierte Referenzen).
Beispiele der Verfahren unter Verwendung von viralen Vektoren schließen diejenigen Verfahren ein, in welchen DNA der vorliegenden Erfindung in ein DNA- oder RNA-Virus wie Retrovirus, Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Herpesvirus, Vacciniavirus, Pockenvirus, Poliovirus oder Sindbis-Virus eingebaut wird und dieses dann in Zellen eingeführt wird. Von diesen Verfahren sind diejenigen besonders bevorzugt, bei denen Retrovirus, Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus oder Vacciniavirus verwendet wird.
Andere Verfahren können wie folgt einschließen: diejenigen, bei denen Expressionsplasmide direkt intramuskulär injiziert werden (DNA-Vakzination), das Liposom-Verfahren, Lipofectin-Verfahren, Mikroinjektion, das Calciumphosphat-Verfahren und Elektroporation, wobei die DNA-Vakzination und das Liposom-Verfahren besonders bevorzugt sind.
Eines der folgenden zwei Verfahren kann eingesetzt werde, um die Verwendung eines Gens der vorliegenden Erfindung in der Praxis als ein Medikament möglich zu machen: ein in vivo-Verfahren, bei welchem DNA direkt in den Körper eingeführt wird, oder ein ex vivo-Verfahren, bei dem bestimmte Zellen aus einem Menschen entnommen werden und die Zellen, nachdem DNA in diese Zellen extrakorporal eingeführt wurde, wieder in den Körper eingeführt werden (Nikkei-Science, April 1994, S. 20–45; Gekkan-Yakuji, 36 (1): 23–48, (1994); Jikkenn-Igaku-Zokan, 12 (15), 1994; und die darin zitierten Referenzen). Ein in vivo-Verfahren ist stärker bevorzugt.
Im Fall von in vivo-Verfahren kann das Gen über eine beliebige geeignete Route verabreicht werden, abhängig von der Krankheit und den Symptomen, die behandelt werden sollen, sowie von anderen Faktoren. Z. B. kann es über die intravenöse, intraarterielle, subkutane, intrakutane oder intramuskuläre Route verabreicht werden. Im Fall von in vivo-Verfahren können die Zusammensetzungen in verschiedenen Dosierungsformen wie als Lösung verabreicht werden, und sie werden typischerweise z. B. in Form einer Injektionslösung formuliert, welche DNA der vorliegenden Erfindung als Wirkstoff enthält, zu der auch herkömmliche Träger zugegeben werden können, falls dies erforderlich ist. Wenn ein Gen der vorliegenden Erfindung in Liposomen oder Membran-fusionierte Liposomen (wie Sendai-Virus (HVJ)-Liposomen) eingeschlossen ist, können die Zusammensetzungen in Form von Liposomformulierungen wie einer Suspension, eines gefrorenen Arzneistoffs, eines durch Zentrifugation eingeengten, gefrorenen Arzneistoffs und dergleichen vorliegen.
Zwar kann die Menge eines Gens der vorliegenden Erfindung in solchen Formulierungen variieren, abhängig von der zu behandelnden Krankheit, dem Alter und dem Gewicht des Patienten und dergleichen, üblicherweise ist es jedoch typischerweise bevorzugt, 0,0001 bis 100 mg, vorzugsweise 0,001 mg bis 10 mg eines Gens der vorliegenden Erfindung alle paar Tage bis alle paar Monate zu verabreichen.
Durch eine solche Verabreichung eines Gens der vorliegenden Erfindung wird das Tumorantigen-Protein in Antigen-präsentierenden Zellen stark exprimiert. Tumorantigen-Peptide, die anschließend durch intrazellulären Abbau erzeugt werden, binden an HLA-Antigene, wodurch Komplexe gebildet werden, und die Komplexe werden auf der Zelloberfläche mit einer hohen Dichte präsentiert. Als Ergebnis proliferieren CTLs, die für diese Komplexe spezifisch sind, im Körper effizient und zerstören Tumorzellen. Auf diese Weise wird eine Behandlung oder Verhinderung einer Proliferation oder Metastasierung von Tumoren erreicht.
Cyclophilin B, partielle Polypeptide davon und Gene, welche solche Stoffe codieren, die als Medikamente, wie vorstehend beschrieben, verwendet werden können, können wie folgt hergestellt werden. Ein Gen, welches Cyclophilin B codiert, kann einfach cloniert werden, indem geeignete PCR-Primer auf der Grundlage der Basensequenz der menschlichen Cyclophilin-B-cDNA hergestellt werden, welche bei GenBank unter der Hinterlegungsnummer M60857 registriert ist, zu finden durch eine Datenbanksuche: WWW Entrez Databases Search, und indem diese dann zur Durchführung einer PCR gemäß der Beschreibung eines Standardtextes wie „Molecular Cloning", 2. Auflg., Cold Spring Harbor Laborstory Press (1989), eingesetzt werden. Für diesen Zweck kann man Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1903, 1991, zu Rate ziehen, wobei es sich um einen Bericht handelt, der die Clonierung von Cyclophilin B betrifft. Weiterhin kann auch ein kommerziell verfügbarer Cyclophilin-B-cDNA-Clon (ATCC-Nr. 107758, Bezeichnung: HTNAQ10) verwendet werden. Sofern es gewünscht wird, kann eine Änderung gemäß einem Standardtext, wie dem vorstehend erwähnten „Molecular Cloning", einfach durchgeführt werden. Weiterhin kann die Expression von Cyclophilin-B-Protein unter Verwendung eines auf diese Weise clonierten Gens, welches menschliches Cyclophilin B codiert, gemäß zahlreichen Veröffentlichungen und Referenzen wie dem vorstehend erwähnten „Molecular Cloning" erreicht werden. Ein Expressionsplasmid, welches sich in Wirtszellen repliziert und darin funktioniert, wird konstruiert, indem DNA, die exprimiert werden soll, in einen geeigneten Vektor (z. B. pSV-SPORT1) eingebaut wird, in einigen Fällen nachdem (eine) regulatorische Sequenz(en) wie eine Promotorsequenz, welche die Transkription steuert (z. B. trp-, lac-, T7- oder früher SV40-Promotor), stromaufwärts der DNA angefügt wird (werden). Danach wird das Expressionsplasmid in geeignete Wirtszellen eingeführt, wodurch Transformanten erhalten werden. Beispiele von Wirtszellen schließen z. B. Prokaryonten wie Escherichia coli, einzellige Eukaryonten wie Hefe und Zellen ein, die von mehrzelligen Eukaryonten wie Insekten oder Tieren stammen. Ein Gentransfer in Wirtszellen kann durch das Calciumphosphat-Verfahren, DEAE-Dextran-Verfahren, das Elektropuls-Verfahren oder dergleichen erreicht werden. Transformanten, die in einem geeigneten Medium gezüchtet werden, produzieren dann das Protein von Interesse. Das auf diese Weise erhaltene Tumorantigen-Protein kann gemäß biochemischen Standardverfahren isoliert und gereinigt werden.
Es kann bestimmt werden, ob Cyclophilin-B-Protein, ein partielles Polypeptid davon oder ein Gen, welches einen solchen Stoff codiert, wie vorstehend beschrieben hergestellt, eine Aktivität als Tumorantigen aufweist oder nicht, d. h. ob Tumorantigen-Peptide, die in der Lage sind, an ein HLA-Antigen zu binden und von CTL erkannt zu werden, durch intrazellulären Abbau des Proteins erzeugt werden oder nicht, und zwar z. B. durch ein Verfahren unter Verwendung von Genexpression, das im Folgenden beschrieben wird.
Zuerst werden ein Expressionsplasmid, welches einen Genkandidaten oder ein Genfragment enthält, und ein anderes Expressionsplasmid, welches DNA, die ein HLA-Antigen codiert, enthält, in Zellen, welche keine Tumorantigen-Proteine exprimieren, wie COS-7 (ATCC CRL 1651), hergeleitet von der Niere der afrikanischen grünen Meerkatze, oder Fibroblast VA-13 (RIKEN CELL BANK, The Institute of Physical and Chemical Research), doppelt transfiziert. Die Transfektion kann z. B. durch ein Lipofectin-Verfahren unter Verwendung von Lipofectamin-Reagens (Gibco BRL) durchgeführt werden. Anschließend wird ein auf Tumor ansprechender CTL, der für das bestimmte, verwendete HLA-Antigen restringiert ist, zugegeben, man lässt ihn auf die Transfektanten wirken, und danach kann die Menge verschiedener Cytokine (z. B. IFN-γ), die durch den CTL als Antwort auf die Zielzellen produziert werden, z. B. durch ELISA gemessen werden, wobei bestimmt wird, ob der Genkandidat eine DNA ist, welche ein Tumorantigen-Protein codiert. Da Cyclophilin B HLA-A24- oder HLA-A2-restringierte Tumorantigen-Peptid-Teile enthält, kann HLA-A24-cDNA (Cancer Res. 55: 4248–4252 (1995); GenBank-Hinterlegungsnummer M64740) oder HLA-A2-cDNA (GenBank-Hinterlegungsnummer M84379) als die vorstehende DNA, welche das HLA-Antigen codiert, eingesetzt werden, und diejenigen CTLs, die aus menschlichen peripheren Blutlymphocyten hergestellt werden, und außerdem KG-CTL (FERM BP-6725) können als der vorstehende CTL eingesetzt werden.
Ein spezifisches Beispiel einer solchen Aktivitätsmessung wird nachstehend in Beispiel 2 beschrieben.
Auch Antikörper, die spezifisch an ein Tumorantigen-Peptid der vorliegenden Erfindung oder ein Derivat davon binden, sind in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Solche Antikörper werden einfach hergestellt, z. B. gemäß einem Verfahren, das in „Antibodies: A Laboratory Manual", Lane, H. D., et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989, beschrieben ist. Genau gesagt werden Antikörper, die ein Tumorantigen-Peptid oder ein Derivat davon der vorliegenden Erfindung erkennen, und Antikörper, die weiterhin seine Aktivität neutralisieren, einfach hergestellt, indem unter Verwendung des Tumorantigen-Peptids oder Derivats davon ein Tier in herkömmlicher Weise geeignet immunisiert wird. Solche Antikörper können in Affinitäts-Chromatographie, immunologischer Diagnose und dergleichen eingesetzt werden.
Eine immunologische Diagnose zur Bestimmung des Vorliegens oder der Abwesenheit von Tumoren unter Verwendung des Antikörpers kann durchgeführt werden, indem zuerst der vorstehende Antikörper wie erforderlich markiert wird und indem er sodann verwendet wird, um das Vorliegen von Antigenen in einer Probe (wie Blut, Tumorgewebe) nachzuweisen, die von einem Patienten erhalten wurde, von dem angenommen wird, dass er einen Tumor hat. Insbesondere kann eine solche immunologische Diagnose geeignet ausgewählt werden aus Immunblot-Verfahren, Radioimmuntest (RIA), enzymverbundenem Immunadsorptionstest (ELISA), einem Fluoreszenz- oder Luminsenez-Test und dergleichen.
Ein Tumorantigen-Peptid, Derivat davon, Tumorantigen-Protein (Cyclophilin B) oder Gen dafür der vorliegenden Erfindung kann auch in vitro für die Behandlung von Tumorpatienten wie folgt eingesetzt werden.
Bei Verwendung eines Tumorantigen-Peptids, Derivats davon, Tumorantigen-Proteins oder Gens dafür in der Behandlung eines Tumors ist es wichtig, ein Verabreichungsverfahren einzusetzen, welches spezifische CTLs im Körper eines Patienten effizient induzieren kann. Die vorliegende Erfindung stellt als eines der Mittel hierfür eine Antigen-präsentierende Zelle bereit, die einen Komplex zwischen einem HLA-Antigen und einem Tumorantigen-Peptid oder einem Derivat davon der vorliegenden Erfindung umfasst, wobei der Komplex auf der Oberfläche einer Zelle präsentiert wird, welche Antigen-präsentierende Eigenschaften hat und aus einem Tumorpatienten isoliert ist, und außerdem stellt sie ein Arzneimittel zur Behandlung von Tumoren bereit, welches die Antigen-präsentierende Zelle als einen Wirkstoff umfasst.
In diesem Zusammenhang ist die „Zelle, welche Antigen-präsentierende Eigenschaften hat" nicht spezifisch eingeschränkt, so lange sie eine Zelle darstellt, welche auf ihrer Zelloberfläche ein HLA-Antigen exprimiert, das in der Lage ist, ein Tumorantigen-Peptid oder ein Derivat davon der vorliegenden Erfindung zu präsentieren, wobei dendritische Zellen bevorzugt sind, von denen berichtet wurde, dass sie besonders stark ausgeprägte Antigen-präsentierende Eigenschaften besitzen. Der Stoff, der zugegeben werden muss, um eine Antigen-präsentierende Zelle der vorliegenden Erfindung aus der vorstehend erwähnten Zelle, welche Antigen-präsentierende Eigenschaften hat, herzustellen, kann Tumorantigen-Peptide oder ihre Derivate der vorliegenden Erfindung, außerdem das Tumorantigen-Protein, Cyclophilin B und ein Gen dafür darstellen. Für die Herstellung einer Antigen-präsentierenden Zelle der vorliegenden Erfindung können nicht nur das vollständige Cyclophilin B und das Gen dafür, sondern auch ein partielles Polypeptid davon und ein Gen dafür verwendet werden. Wenn hierfür ein Protein oder Gen verwendet wird, muss dieses von den Zellen aufgenommen werden. Vgl. in dieser Hinsicht die vorstehenden Beschreibungen für die Zusammensetzung zur Behandlung oder Verhinderung von Tumoren, wobei die Zusammensetzung das Gen oder Protein als ein Wirkstoff umfasst.
Für die Herstellung von Antigen-präsentierenden Zellen der vorliegenden Erfindung werden Zellen, welche Antigen-präsentierende Eigenschaften haben, aus einem Tumorpatienten isoliert und ex vivo mit einem Tumorantigen-Peptid, einem Derivat davon, einem Tumorantigen-Protein oder einem partiellen Polypeptid davon der vorliegenden Erfindung gepulst, wodurch ein Komplex zwischen einem HLA-Antigen und dem Tumorantigen-Peptid oder Derivat davon hergestellt wird (Cancer Immunol. Immunother. 46: 82, 1998; J. Immunol. 158: 1796, 1997; Cancer Res. 59: 1184, 1999). Wenn dendritische Zellen verwendet werden, können Antigen-präsentierende Zellen der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, indem z. B. Lymphocyten aus dem peripheren Blut eines Tumorpatienten unter Verwendung des FicoII-Verfahrens isoliert werden, nicht-adhärente Zellen entfernt werden, adhärente Zellen in Gegenwart von GM-CSF und IL-4 inkubiert werden, um dendritische Zellen zu induzieren, und sodann die dendritischen Zellen mit einem Tumorantigen-Peptid, Tumorantigen-Protein der Erfindung oder dergleichen inkubiert und gepulst werden. Einzelheiten finden sich in Beispiel 11.
Wenn Antigen-präsentierende Zellen der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, indem ein Gen, welches ein Tumorantigen-Protein oder ein partielles Polypeptid davon der vorliegenden Erfindung codiert, in die vorstehend erwähnten Zellen, welche Antigen-präsentierende Eigenschaften haben, eingeführt wird, kann das Gen in Form von DNA oder RNA vorliegen. Insbesondere kann DNA verwendet werden, vgl. z. B. Cancer Res. 56: 5672, 1996; oder J. Immunol. 161: 5607, 1998; und RNA kann eingesetzt werden, vgl. z. B. J. Exp. Med. 184: 465, 1996.
Ein Arzneimittel zur Behandlung von Tumoren, welches die vorstehenden Antigen-präsentierenden Zellen als ein Wirkstoff umfasst, enthält vorzugsweise physiologische Kochsalzlösung, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), Medium oder dergleichen, um die Antigen-präsentierenden Zellen stabil aufrechtzuerhalten. Es kann z. B. intravenös, subkutan oder intradermal verabreicht werden. Durch Wiedereinführen einer solchen Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren, welche Antigen-präsentierende Zellen als einen Wirkstoff umfasst, in den Körper des Patienten werden spezifische CTLs in dem Cyclophilin-B-positiven Patienten effizient induziert, so dass eine Behandlung des Tumors erreicht wird. Es sollte selbstverständlich sein, dass die HLA-Typen zwischen dem Patienten und dem verwendeten Peptid kompatibel sein müssen. Z. B. muss bei einem HLA-A24-positiven Tumorpatienten ein HLA-A24-restringiertes Tumorantigen-Peptid oder ein Derivat davon eingesetzt werden.
Ein weiteres Beispiel einer in vitro-Verwendung eines Tumorantigen-Peptids, eines Derivats davon, eines Tumorantigen-Proteins oder eines Gens dafür gemäß der vorliegenden Erfindung stellt außerdem die folgende adoptive Immuntherapie dar.
Bei Melanomen wurde festgestellt, dass eine adoptive Immuntherapie eine therapeutische Wirkung erreicht, wobei Tumor-infiltierende T-Zellen, die aus dem Patienten oder der Patientin selbst entnommen wurden, ex vivo in großen Mengen gezüchtet wurden und danach in den Patienten wiedereingeführt wurden (J. Natl. Cancer Inst. 86: 1159, 1994). Genauso wurde beim Melanom der Maus eine Suppression der Metastasierung durch eine in vitro-Stimulation von Splenocyten mit einem Tumorantigen-Peptid TRP-2 festgestellt, wobei CTLs, die für das Tumorantigen-Peptid spezifisch waren, proliferierten und die CTLs dann an eine Melanom-transplantierte Maus verabreicht wurden (J. Exp. Med. 185: 453, 1997). Dies kam durch eine in vitro-Proliferation eines CTL zustande, der spezifisch den Komplex zwischen einem HLA-Antigen von Antigen-präsentierenden Zellen und dem Tumorantigen-Peptid erkennt. Demgemäß kann man davon ausgehen, dass ein Verfahren zur Behandlung von Tumoren nützlich ist, welches eine in vitro-Stimulation von peripheren Blutlymphocyten aus einem Patienten unter Verwendung eines Tumorantigen-Peptids, eines Derivats davon, eines Tumorantigen-Proteins oder eines Gens davon gemäß der vorliegenden Erfindung zum Proliferieren von Tumorspezifischen CTLs und ein anschließendes Wiedereinführen der CTLs in den Patienten umfasst.
Somit stellt die vorliegende Erfindung CTLs bereit, die spezifisch einen Komplex zwischen dem HLA-Antigen und dem Tumorantigen-Peptid oder einem Derivat davon erkennen, und sie stellt außerdem ein Arzneimittel zur Behandlung von Tumoren bereit, welches die CTLs als einen Wirkstoff umfasst. Eine solche Zusammensetzung enthält vorzugsweise physiologische Kochsalzlösung, Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), Medium oder dergleichen, um die CTLs stabil aufrechtzuerhalten. Sie kann z. B. intravenös, subkutan oder intradermal verabreicht werden. Durch Wiedereinführen der Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren, wobei die Zusammensetzung CTLs als einen Wirkstoff enthält, in den Körper des Patienten wird die toxische Wirkung von CTLs gegen die Tumorzellen in dem Cyclophilin-B-positiven Patienten verstärkt und dadurch werden die Tumorzellen zerstört, wodurch eine Behandlung des Tumors erreicht wird.
Tumorantigen-Proteine, Tumorantigen-Peptide und Derivate davon gemäß der vorliegenden Erfindung können auch als ein Wirkstoff eines Diagnosemittels zum Diagnostizieren von Tumoren eingesetzt werden. Somit ist es möglich, durch die Verwendung eines Tumorantigen-Proteins, Tumorantigen-Peptids oder Derivats davon gemäß der vorliegenden Erfindung selbst als ein Diagnosemittel zum Nachweisen des Vorliegens von Antikörpern in einer Probe (wie Blut oder ein Tumorgewebe), die von einem Patienten erhalten wurde, von dem angenommen wird, dass er einen Tumor hat, Tumoren schon früh nachzuweisen und ein Rezidiv und eine Metastasierung zu diagnostizieren. Die gleiche Prozedur kann auch für die Auswahl von Tumorpatienten eingesetzt werden, denen Medikamente verabreicht werden, welche als einen Wirkstoff z. B. Tumorantigen-Protein oder Tumorantigen-Peptid der vorliegenden Erfindung enthalten. Insbesondere kann eine solche Diagnose unter Verwendung von Immunblot-Verfahren, RIA, ELISA oder eines Fluoreszenz- oder Luminsezenz-Tests durchgeführt werden.
Weiterhin wurde in den letzten Jahren ein neues Nachweisverfahren zum Nachweisen von Antigen-spezifischen CTLs eingeführt, wobei ein Komplex zwischen dem Antigenpeptid und einem HLA-Antigen verwendet wird (Science 274: 94, 1996). Der frühe Nachweis von Tumoren und die Diagnose eines Rezidivs oder einer Metastasierung sind möglich, indem ein Komplex zwischen einem Tumorantigen-Peptid oder Derivat davon gemäß der vorliegenden Erfindung und einem HLA-Antigen dem vorstehenden Nachweisverfahren unterworfen wird und dadurch Tumorantigen-spezifische CTLs nachgewiesen werden. Diese gleiche Prozedur kann auch für eine Auswahl von Tumorpatienten eingesetzt werden, an welche ein Medikament verabreicht werden kann, welches als einen Wirkstoff z. B. ein Tumorantigen-Protein oder Tumorantigen-Peptid der vorliegenden Erfindung umfasst, oder sie kann für die Bestimmung der therapeutischen Wirkung des Medikaments eingesetzt werden. Somit stellt die vorliegende Erfindung auch ein Diagnosemittel für Tumoren bereit, das als einen Teil des Wirkstoffs ein Tumorantigen-Peptid oder Derivat davon gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
Insbesondere kann eine solche Diagnose wie folgt durchgeführt werden: ein Tetramer eines Komplexes zwischen einem HLA-Antigen, das gemäß dem in der Literatur beschriebenen Verfahren fluoreszierend markiert wurde (Science 274: 94, 1996), und einem Tumorantigen-Peptid wird hergestellt und eingesetzt, um die Antigenpeptid-spezifischen CTLs in peripheren Blutlymphocyten eines Patienten, von dem angenommen wird, dass er einen Tumor hat, unter Verwendung eines Durchflusscytometers quantitativ zu bestimmen.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung KG-CTL bereit (Hinterlegungsnummer FERM BP-6725); dabei handelt es sich um einen CTL, der aus Tumor-infiltrierenden Lymphocyten, die von einem Lungen-Adenomkarzinom stammten, etabliert wurde. Es wurde gezeigt, dass KG-CTL auf HLA-A24- und HLA-A2-positive Krebszellen anspricht, und auch Cyclophilin B der vorliegenden Erfindung ist ein Tumorantigen-Protein, das anhand seiner Reaktivität mit dem KG-CTL als Indikator entdeckt wurde. Deshalb können unter Verwendung von KG-CTL wie beim Cyclophilin B möglicherweise noch neue Tumorantigen-Proteine und Tumorantigen-Peptide gefunden werden. Einzelheiten finden sich im nachstehenden Beispiel 2.
1 ist eine grafische Darstellung, welche die Ergebnisse einer Messung zeigt, wobei COS-7-Zellen, die mit einem rekombinanten Plasmid von HLA-A2402-cDNA oder einem rekombinanten Plasmid von HLA-A2601-cDNA transfiziert waren, zusammen mit KG-CTLs nach Zugabe eines Tumorantigen-Peptids der vorliegenden Erfindung „84–92 (SEQ ID NO: 1)" gezüchtet wurden und wobei sodann die Menge des durch KG-CTLs produzierten IFN-γ gemessen wurde. Die Abszisse gibt die Konzentration des zugegebenen Peptids an, und die Ordinate gibt die Menge des durch KG-CTLs produzierten IFN-γ an.
2 ist eine grafische Darstellung, welche die Ergebnisse einer Messung zeigt, wobei COS-7-Zellen, die mit einem rekombinanten Plasmid von HLA-A2402-cDNA oder einem rekombinanten Plasmid von HLA-A2601-cDNA transfiziert waren, zusammen mit KG-CTLs nach Zugabe eines Tumorantigen-Peptids der vorliegenden Erfindung „91–99 (SEQ ID NO: 2)" gezüchtet wurden und wobei sodann die Menge des durch KG-CTLs produzierten IFN-γ gemessen wurde. Die Abszisse gibt die Konzentration des zugegebenen Peptids an, und die Ordinate gibt die Menge des durch KG-CTLs produzierten IFN-γ an.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele noch weiter erläutert, sie wird durch diese Beispiele jedoch in keiner Weise eingeschränkt.
Beispiel 1
Etablieren einer Zelllinie cytotoxischer T-Lymphocyten (CTLs) aus Tumorinfiltrierenden Lymphocyten (TILs), die von einem Lungenadenokarzinom stammen

Eine von einem Patienten mit Lungenadenokarzinom operativ entnommene Probe wurde in einem Kulturmedium in kleine Stücke zerteilt, und anschließend wurden die Zellen in einem Kulturmedium, das Kollagenase und DNase enthielt, suspendiert. Sodann wurden die Lymphocyten aus der Zellsuspension durch Dichtezentrifugation unter Verwendung einer FicoII-Conray-Lösung abgetrennt. Die Lymphocyten wurden in einem Kulturmedium gezüchtet (nachstehend als Lymphocytenmedium bezeichnet), bestehend aus 45% RPMI-1640, 45% AIM-V (Gibco BRL) und 10% FKS, angereichert mit 100 E/ml Interleukin-2 und 0,1 mM NEAA (Gibco BRL). Während der ersten zwei Tage der Züchtung wurde ein anti-CD3-Antikörper NU-T3 (Nichirei Corporation) zum Kulturmedium bei 1 μg/ml zugegeben. Die Züchtung wurde länger als 30 Tage fortgesetzt, und auf diese Weise wurde eine CTL-Linie etabliert, die auf mehrere Typen von HLA-A24- oder HLA-A2-positiven Krebszelllinien ansprach. Die CTL-Linie wurde mit KG-CTL bezeichnet und in den folgenden Experimenten eingesetzt. Die Reaktivität von KG-CTL gegenüber verschiedenen Krebszelllinien wurde wie folgt bestimmt. Krebszelllinien wurden in die Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen bei 1 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung plattiert. Am nächsten Tag wurden KG-CTLs bei 1 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung zugegeben und weitere 18 Stunden gezüchtet, danach wurde das Kulturmedium geerntet und die Menge des durch die KG-CTLs produzierten Interferon-γ (IFN-γ) bestimmt. Die quantitative Bestimmung von IFN-γ erfolgte durch einen Enzymimmuntest (ELISA). Genau gesagt wurde ein gegen menschliches IFN-γ gerichteter monoclonaler Antikörper der Maus an Vertiefungen einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen als Festphasen-Antikörper adsorbiert, anschließend, nachdem unspezifische Bindungen mit Rinderserumalbumin blockiert worden waren, ließ man das IFN-γ in der Probe an den Antikörper binden. Danach ließ man einen gegen menschliches IFN-γ gerichteten polyclonalen Antikörper des Kaninchens als Nachweisantikörper binden. Nach der Bindung eines mit alkalischer Phosphatase markierten, gegen Kaninchen-Immunglobulin gerichteten Antikörpers der Ziege ließ man eine Farbentwicklung zu, indem man einen Peroxidase-Farbentwicklungs-Kit T (Sumitomo Bakelite Co.) einsetzte, und danach wurde die Absorption (405 nm) gemessen. Diese wurde mit den Werten verglichen, die mit Standard-IFN-γ erhalten wurden, und auf diese Weise wurde die Menge von IFN-γ quantitativ bestimmt. Die Reaktivität von KG-CTL jeweils gegenüber verschiedenen Adenokarzinom-Zelllinien ist in Tabelle 2 angegeben. Genauso ist die Reaktivität von KG-CTL jeweils gegenüber Lymphoid-Zelllinien in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 2

Adenokarzinom-Zelllinie	Menge von IFN-γ, produziert durch KG-CTL (pg/ml)	HLA-A-Typ
HT-1376 (Blasenkrebs-Zelllinie)	4608	2402/2402
1–87 (Lungenkrebs-Zelllinie)	194	0207/1101
11–18 (Lungenkrebs-Zelllinie)	4632	0201/2402
PC-9 (Lungenkrebs-Zelllinie)	1102	0206/2402
LC-1 (Lungenkrebs-Zelllinie)	129	3101/3302
YT-803 (Lungenkrebs-Zelllinie)	285	3101/3302
143 B (Osteosarkom-Zelllinie)	1547	0211/0211
Keine (nur KG-CTL)	100	-

Tabelle 3

Zelllinie	Menge von IFN-γ, produziert durch KG-CTL (pg/ml)	HLA-A-Typ
SSB (B-Zelllinie)	5769	2402/2402
Ban-B1 (B-Zellinie¹)	78	3101/3302
HPB-MLT (Leukämie-Zelllinie)	189	0101/0201
MOLT-16 (Leukämie-Zelllinie)	13	2301/3002
MT-2 (Leukämie-Zelllinie)	3495	2402/2402
Keine (nur KG-CTL)	0	-

¹⁾B-Zelllinie, die durch Transformation von B-Zellen eines gesunden Spenders mit EB-Virus erhalten wurde.

Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, dass KG-CTL mit HLA-A2402-positiven Krebszellen in der Tabelle (HT-1376, 11–18 und PC-9) stark reagiert und IFN-γ produziert und dass er außerdem mit HLA-A2-positiven Zellen (1438) reagiert und IFN-γ produziert. Genauso zeigen die Ergebnisse in Tabelle 3, dass KG-CTL mit der HLA-A2402-positiven EB-Virus-transformierten B-Zelllinie und einer Leukämie-Zelllinie (SSB und MT-2) stark reagiert und dass er außerdem mit der HLA-A2-positiven Leukämie-Zellline (HBP-MLT) stark reagiert.
Der angelegte KG-CTL wurde bei The National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) hinterlegt (Bezeichnung von Mikroorganismus: KG-CTL; Hinterlegungsdatum: 19. Juni 1998; Hinterlegungsnummer FERM P-16854) (Datum der Umwandlung zur internationalen Hinterlegung: 20. Mai 1999, Hinterlegungsnummer: FERM BP-6725). Des Weiteren wurde eine Typisierung von HLA-Molekülen von KG-CTL durch Shionogi & Co. gemäß dem in Nakao et al., Cancer Res. 55: 4248–4252 (1995), beschriebenen Verfahren durchgeführt, und es wurde bestätigt, dass der A-Locus A0206 und A2402 ist.
Beispiel 2
Identifizierung eines Tumorantigen-Proteins
Eine cDNA-Bank wurde aus der Blasenkrebs-Zelllinie HT-1376 (ATCC CRL 1472), mit welcher KG-CTL in Beispiel 1 stark reagierte, durch das folgende Beispiel hergestellt.
Zuerst wurde Poly(A)⁺-mRNA aus HT-1376 hergestellt, indem die gesamte RNA-Fraktion isoliert und auf einer Oligo(dT)-Säule unter Verwendung eines mRNA-Reinigungssystems (Pharmacia Biotech) gemäß dem Protokoll des Herstellers gereinigt wurde. Aus den mRNAs wurden cDNAs, bei welchen ein NotI-Adapter und ein ScaI-Adapter an jeweils einem Terminus gebunden waren, unter Verwendung von SuperScipt^TM Plasmid System (Gibco BRL) gemäß dem Protokoll des Herstellers hergestellt und diese danach in die gespaltene Stelle eines Expressionsvektors, des Plasmids pSV-SPORTI (Gibco BRL), das mit den Restriktionsenzymen NotI und SalI gespalten worden war, ligiert, wodurch rekombinante Plasmide erhalten wurden. Die rekombinanten Plasmide wurden unter Verwendung elektrischer Pulse im Gene Pulser (Bio-Rad) in E. coli ElectroMAX DH10B^TM-Zellen (Gibco BRL) eingeführt, und sodann wurden Transformanten, in welche die rekombinanten Plasmide eingeführt worden waren, in LB-Medium (1% Bacto-Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, pH 7,3), das Ampicillin enthielt (50 μg/ml), selektiert.
Die rekombinanten Plasmid-DNAs wurden aus Pools von etwa 100 vorstehend beschriebenen Transformanten wie folgt gewonnen. 100 Transformanten wurden in jede Vertiefung einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen und U-förmigem Boden, enthaltend LB-Medium plus Ampicillin (50 μg/ml), eingeführt und gezüchtet. Sodann wurde ein Teil der Kultur auf eine andere Mikroplatte mit 96 Vertiefungen und U-förmigem Boden überführt, die 0,25 ml TYGPN-Medium (F. M. Ausubel et al., „Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Inc.) pro Vertiefung enthielt, und 48 Stunden bei 37°C gezüchtet. Die restlichen Kulturen in LB-Medium auf der Mikroplatte wurden gefroren aufbewahrt. Die Herstellung rekombinanter Plasmid-DNAs aus Transformanten, die in TYGPN-Medium gezüchtet worden waren, erfolgte auf der Mikroplatte durch das alkalische Lyseverfahren (F. M. Ausubel et al., „Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Inc.). Die rekombinanten Plasmid-DNAs, die durch Isopropanol-Fällung gewonnen wurden, wurden in 50 μl 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,4, enthaltend 20 ng/ml RNase, suspendiert.
Andererseits wurden, ausgehend von einer Ösophaguskarzinom-Zelllinie KE-4, hinterlegt bei The National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) (Hinterlegungsdatum: 23. Mai 1997; Hinterlegungsnummer: FERM BP-5955), rekombinante Plasmide hergestellt, in welchen cDNAs für HLA-A2402 (GenBank-Hinterlegungsnummer M64740) und HLA-A2601 in einen Expressionsvektor, pCR3 (Invitrogen), gemäß der Beschreibung in Nakao et al., Cancer Res. 55: 4248–4252 (1995), eingebaut worden waren.
Anschließend wurde eine Zelllinie, die von der Niere der afrikanischen grünen Meerkatze abstammte, COS-7 (ATCC Nr. CRL1651), mit dem rekombinanten Plasmid von HT-1376-cDNA und dem rekombinanten Plasmid von HLA-A2402-cDNA unter Verwendung des Lipofectin-Verfahrens wie folgt doppelt transfiziert. 8000 COS-7-Zellen wurden in jede Vertiefung eines Mikroplatte mit 96 Vertiefungen und flachem Boden gegeben und einen Tag in 100 μl RPMI-1640-Medium, enthaltend 10% FKS, inkubiert. Unter Verwendung von Lipofectamin-Reagens (Gibco BRL) wurden 30 µl eines 70-µl-Gemisches, bestehend aus 25 µl des rekombinanten Plasmids von HT-1376-cDNA, entsprechend etwa 100 Transformanten, 10 µl (200 ng) des rekombinanten Plasmids von HLA-A2402-cNDA und 35 µl einer etwa 50-fachen Verdünnung von Lipofectin-Reagens zugegeben, wodurch die COS-7-Zellen doppelt transfiziert wurden. Transfektanten wurden in doppelter Ausführung hergestellt. Nach fünf Stunden wurden 200 µl eines Kulturmediums, enthaltend 10% FKS, zu den Transfektanten zugegeben und diese sodann weitere 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach Entfernung des Kulturmediums wurden 1,5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung von KG-CTL zugegeben und 24 Stunden bei 37°C in 100 µl eines Kulturmediums, das 10% FKS und 25 E/ml IL-2 enthielt, gezüchtet. Das Kulturmedium wurde gewonnen und die Menge von IFN-γ durch das ELISA Verfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben, gemessen.
Für diejenigen Gruppen, die zu einer hohen Produktion von IFN-γ führten, wurden in den weiteren Durchmusterungstests die entsprechenden gefroren gelagerten Pools von etwa 100 Transformanten, die mit rekombinanten Plasmiden von HT-1376-cDNA transfiziert waren, verwendet. Die Pools der Transformanten wurden auf LB-Agarmedium, das Ampicillin enthielt (50 µg/ml), plattiert, so dass Kolonien erhalten wurden. Für jede Gruppe wurden 400 Kolonien, wie vorstehend beschrieben, gezüchtet, so dass in jeder Vertiefung ein einzelner Typ einer Transformante enthalten war, und rekombinante Plasmid-DNAs für HT-1376-cDNA wurden hergestellt. Weiterhin wurden in ähnlicher Weise, wie vorstehend beschrieben, COS-7-Zellen mit dem rekombinanten Plasmid von HT-1376-cDNA und dem rekombinanten Plasmid von HLA-A2402-cDNA doppelt transfiziert, worauf eine gemeinsame Kultivierung mit KG-CTL folgte, anschließend wurde das durch KG-CTL als Antwort auf die Zielzellen produzierte IFN-γ quantitativ bestimmt, und auf diese Weise wurden positive Plasmide selektiert. Durch diese Vorgehensweisen wurde ein rekombinanter HT-1376-cDNA-Plasmidclon selektiert, und der Clon wurde mit 4F2 bezeichnet. Des Weiteren wurden ähnliche Verfahren mit 4F2 wiederholt, wobei die Menge des durch KG-CTL produzierten IFN-γ bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4

Zellen Menge von IFN-γ, produziert durch KG-CTL (pg/ml)

COS-7 + HLA-A2402 469

COS-7 + HLA-A2402 + 4F2 543
Im Vergleich zu COS-7-Zellen, die nur mit HLA-A2402 transfiziert waren, reagierte der KG-CTL stärker mit COS-7-Zellen, die mit HLA-A2402 und 4F2 doppelt transfiziert waren, und er produziert mehr IFN-γ. Diese Ergebnis zeigte, dass das durch 4F2 codierte Protein ein Tumorantigen-Protein ist.
Beispiel 3
Bestimmung der Basensequenz des Gens des Tumorantigen-Proteins
Die Basensequenz des wie vorstehend in Beispiel 2 erhaltenen Plasmidclons 4F2, welcher das Tumorantigen-Protein codiert, wurde unter Verwendung des DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing-Kits (Perkin-Elmer) bestimmt. Die bestimmte Basensequenz und die durch die Basensequenz codierte Aminosäuresequenz wurden mit bekannten Sequenzen unter Verwendung von WWW Entrez-Datenbanken verglichen, wobei gezeigt wurde, dass die Basensequenz des Plasmidclons 4F2 der Aminosäuresequenz des menschlichen Cyclophilin B, registriert als GenBank-Hinterlegungsnummer N60857, entspricht. Die Sequenz des Cyclophilin B ist auch in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1903, 1991, beschrieben. Cyclophilin B ist ein Bindungsprotein für ein immunsuppressives Mittel, Cyclosporin A, und es ist bekannt, dass es in vivo an der Aktivierung von Immunzellen beteiligt ist. Durch das vorstehende Beispiel 2 wurde erstmals gefunden, dass Cyclophilin B, dessen einzige benannte Funktion seine Beteiligung an einer Aktivierung von Immunzellen war, eine Funktion als ein Tumorantigen-Protein besitzt.
Beispiel 4
Selektion von Peptidkandidaten
Es gibt bestimmte Regeln (Motive) in den Sequenzen von Antigenpeptiden, die durch HLA-Antigene gebunden und präsentiert werden. Wenn man das Motiv für HLA-A24 betrachtet, ist bekannt, dass in der Sequenz von Peptiden, die aus 8 bis 11 Aminosäuren bestehen, die Aminosäure an Position 2 Tyrosin, Phenylalanin, Methionin oder Tryptophan ist und die Aminosäuren am C-Terminus Phenylalanin, Tryptophan, Leucin, Isoleucin oder Methionin ist (Immunogenetics 41: 178, 1995; J. Immunol. 152: 3913, 1994; J. Immunol. 155: 4307, 1994). Genauso ist für HLA-A2 bekannt, dass die Peptide aus 8 bis 11 Aminosäuren bestehen und dass für HLA-A0201 die Aminosäure an Position 2 Leucin oder Methionin ist und die Aminosäure am C-Terminus Valin oder Leucin ist; dass für HLA-A0204 die Aminosäure an Position 2 Leucin ist und die Aminosäure am C-Terminus Leucin ist; dass für HLA-A0205 die Aminosäure an Position 2 Valin, Leucin, Isoleucin oder Methionin ist und die Aminosäure am C-Terminus Leucin ist; dass für HLA-A0206 die Aminosäure an Position 2 Valin oder Glutamin ist und die Aminosäure am C-Terminus Valin oder Leucin ist; dass für HLA-A0207 die Aminosäure an Position 2 Leucin ist und die Aminosäure am C-Terminus Leucin ist (Immunogenetics 41: 178, 1995; J. Immunol. 155: 4749, 1995; vgl. auch Tabelle 1).
Gemäß solchen Motiven wurden Peptidteile, welche aus 8 bis 11 Peptiden bestanden und die vorstehenden Motive aufwiesen, aus der Aminosäuresequenz von Cyclophilin B (GenBank-Hinterlegungsnummer M60857) selektiert, für die durch die Erfinder nachgewiesen wurde, dass sie eine Funktion als Tumorantigen-Protein haben. Ausgewählte Peptide, die ein Bindungsmotiv für HLA-A24 aufweisen, sind in den SEQ ID NOs: 1 bis 11 dargestellt, und Peptide, die ein Bindungsmotiv für HLA-A2 aufweisen, sind in den SEQ ID NOs: 12 bis 36 dargestellt. Diese Peptide wurden bei Biologica Co. durch das Fmoc-Verfahren synthetisiert.
Danach wurden 10⁴ COS-7-Zellen mit einem rekombinanten Plasmid von HLA-A2402-cDNA durch das Lipofectin-Verfahren gemäß der Literatur transfiziert, so dass sie HLA-A2402 exprimierten (J. Exp. Med. 187: 277, 1998). Zu diesen Zellen wurden verschiedene, vorher synthetisierte Peptide, die ein Bindungsmotiv für HLA-A24 aufwiesen, jeweils bei 10 µM für zwei Stunden zugegeben, wodurch die Zellen gepulst wurden. Danach wurden die Zellen zusammen mit 2 × 10⁴ KG-CTLs 18 Stunden kultiviert, und anschließend wurde die Menge des durch KG-CTL produzierten IFN-γ im Kulturüberstand durch das ELISA-Verfahren bestimmt. Anschließend wurden zwei Peptide den folgenden Experimenten unterworfen, d. h. ein Peptid, das die Sequenz von Position 84 bis zu Position 92 in der Aminosäuresequenz von Cyclophilin B umfasste (SEQ ID NO: 1, nachstehend manchmal einfach als „84–92" bezeichnet), und ein Peptid, das die Sequenz von Position 91 bis zu Position 99 umfasste (SEQ ID NO: 2, nachstehend manchmal einfach als „91–99" bezeichnet).
Beispiel 5
Synthese von Lys-Phe-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe (SEQ ID NO: 1)
In dieser Synthese wurde als Harz Fmoc-Phe-Alko Resin (0,56 mMol/g, 100–200 Mesh) eingesetzt. Unter Verwendung von 100 mg dieses Harzes wurde die Synthese gemäß dem nachstehend beschriebenen Schema 1 gestartet, wobei die folgenden Reste in der Reihenfolge gekoppelt wurden: Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Phe-OH und Fmoc-Lys(Boc)-OH. Nach der Kopplung wurden die Verfahren bis zu Schritt 3 des nachstehend in Tabelle 5 dargestellten Schemas 1 durchgeführt, wodurch ein Peptidharz erhalten wurde.
Zu diesem Peptidharz wurden 2 ml Reagens K (5% Phenol, 5% Thioanisol, 5% H₂O und 2,5% Ethandithiol in TFA) zugegeben, und sodann wurde die Reaktion 2,5 Stunden bei Raumtemperatur zugelassen. Während der Kühlung mit Eis wurden 10 ml Diethylether zum Reaktionsgemisch zugegeben, das Gemisch wurde zehn Minuten gerührt, filtriert und danach mit 10 ml Diethylether gewaschen. Zu dem Filterkuchen wurden 10 ml 10% wässrige Essigsäurelösung (nachstehend als wässrige Essigsäure bezeichnet) zugegeben und das Gemisch 30 Minuten gerührt. Danach wurde das Harz abfiltriert und mit 4 ml wässriger Essigsäure gewaschen. Nach Lyophilisieren des Filtrats und der Waschlösung wurde das erhaltene Rohpeptid in wässriger Essigsäure gelöst und in eine Packmaterial COSMOSIL 5C18-AR-Umkehrphasen-Säule (25 ⌀ × 250 mm), voräquilibriert mit 0,1% wässriger TFA, injiziert. Die Säule wurde mit 0,1% wässriger TFA gewaschen, und anschließend wurde die Konzentration von Acetonitril innerhalb von 260 Minuten auf 25% erhöht, wobei das Produkt mit einer Fließrate von 7 ml/Min. eluiert wurde. Das Eluat wurde bei A 220 nm überwacht. Die Fraktionen, welche das gewünschte Produkt enthielten, wurden vereinigt und gefriergetrocknet, wodurch 11,7 mg von Lys-Phe-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe erhalten wurden.
Das erhaltene Peptid, Lys-Phe-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe, hatte in einer Analyse unter Verwendung einer Packmaterial YMC-PACK ODS-AM-Umkehrphasen-Säule (4,6 ⌀ × 250 mm), eluiert mit einem linearen Gradienten einer Acetonitril-Konzentration von 0 bis 60%, enthaltend 0,1% TFA, eine Retentionszeit von 23,9 Minuten, und die Ergebnisse von Aminosäureanalyse und Massenspektrometrie des Produkts stimmten mit den theoretischen Werten überein.
Aminosäureanalyse:

Hydrolyse: 1% Phenol/6 N wässrige Salzsäure, 110°C, 24 Stunden;
Analyseverfahren: Ninhydrin-Verfahren;
* Referenzaminosäure; die theoretischen Werte sind in Klammern angegeben:
Asx: 1,01 (1)
*Val: 1,00 (1)
Ile: 0,85 (1)
Phe: 1,94 (2)
Lys: 1,74 (2)
His: 0,95 (1)
Arg: 0,86 (1)

Massenspektrum (FAB):

[M + H]⁺: 1190

Tabelle 5 Schema 1

Schritt	Dauer (Min.) × Zahl der Behandlungen
1. (Waschen) DMF 1,2 ml	1 × 2
2. (Entfernen v. Schutzgruppen) 50% Piperidin/DM	F 12 × 1
3. (Waschen) DMF 1,2 ml	1 × 7
4. (Kopplung) jede aminogeschütze Aminosäure
(5 Äquivalente)/NMP-Lösung 0,9 ml,
DIC (5 Äquivalente)/NMP-Lösung 0,3 ml	30 × 1
5. (Waschen) DMF 1,2 ml	1 × 2
6. (Kopplung) jede aminogeschützte Aminosäure
(5 Äquivalente)/NMP-Lösung 0,9 ml,
DIC (5 Äquivalente)/NMP-Lösung 0,3 ml	30 × 1
7. (Waschen) DMF 1,2 ml	1 × 4

Beispiel 6
Synthese von Asp-Phe-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe (SEQ ID NO: 2)
In gleicher Weise, wie in Beispiel 5 beschrieben, wurden unter Verwendung von 100 mg Fmoc-Phe-Alko Resin, Fmoc-Asp (OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH und Fmoc-Asp(OtBu)-OH in der Reihenfolge gekoppelt, und danach wurden von dem Produkt die Schutzgruppen entfernt. Das erhaltene Rohpeptid wurde in wässriger Essigsäure gelöst und in eine Packmaterial COSMOSIL 5C18-AR-Umkehrphasen-Säule (25 ⌀ × 250 mm), voräquilibriert mit 0,1% wässriger TFA, injiziert. Die Säule wurde mit 0,1% wässriger TFA gewaschen, und anschließend wurde die Konzentration von Acetonitril innerhalb von 260 Minuten auf 31% erhöht, wobei das Produkt mit einer Fließrate von 7 ml/Min. eluiert wurde. Das Eluat wurde bei A 220 nm überwacht. Die Fraktionen, welche das gewünschte Produkt enthielten, wurden vereinigt und gefriergetrocknet, wodurch 3,6 mg von Asp-Phe-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe erhalten wurden.
Das erhaltene Peptid, Asp-Phe-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe, hatte in einer Analyse unter Verwendung einer Packmaterial YMC-PACK ODS-AM-Umkehrphasen-Säule (4,6 ⌀ × 250 mm), eluiert mit einem linearen Gradienten einer Acetonitril-Konzentration von 0 bis 60%, enthaltend 0,1% TFA, eine Retentionszeit von 25,8 Minuten, und die Ergebnisse von Aminosäureanalyse (wobei Met nicht nachgewiesen wird) und Massenspektrometrie des Produkts stimmten mit den theoretischen Werten überein.
Aminosäureanalyse:

Hydrolyse: 1% Phenol/6 N wässrige Salzsäure, 110°C, 24 Stunden;
Analyseverfahren: Ninhydrin-Verfahren;
* Referenzaminosäure; die theoretischen Werte sind in Klammern angegeben:
Asx: 2,02 (2)
Glx: 1,04 (1)
Gly: 2,04 (2)
*Ile: 1,00 (1)
Phe: 1,97 (2)

Massenspektrum (FAB):

[M + H]⁺: 1029

Beispiel 7
Identifizierung eines Tumorantigen-Peptids
Ein Experiment wurde mit zwei Peptiden, die in den vorstehenden Beispielen 5 und 6 synthetisiert wurden, in gleicher Weise, wie in Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt, und es wurde gefunden, dass diese Peptide eine Funktion als Tumorantigen-Peptid haben. Die Ergebnisse sind in den 1 und 2 dargestellt. In den Figuren gibt die Abszisse die Peptidkonzentration (pg/ml) an, und die Ordinate gibt die Menge des durch KG-CTLs produzierten IFN-γ an. Wenn COS-7-Zellen, die mit einem rekombinanten Plasmid von HLA-A2402-cDNA transfiziert waren, mit „84–92" und „91–99" gepulst wurden, wurde die Reaktivität von KG-CTL in einer konzentrationsabhängigen Weise erhöht. Im Vergleich zu COS-7-Zellen, die mit einem rekombinanten Plasmid von HLA-A2601-cDNA transfiziert waren, ergaben COS-7-Zellen, die mit dem rekombinanten Plasmid von HLA-A2402-cDNA transfiziert waren, wenn sie gepulst wurden, eine höhere Reaktivität von KG-CTL. Durch die vorstehenden Ergebnisse wurde gezeigt, dass die zwei Peptide „84–92" und „91–99" eine Funktion als HLA-A24-restringiertes Tumorantigen-Peptid haben.
Beispiel 8
Synthese von Lys-Tyr-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe (SEQ ID NO: 39)
Da im Beispiel 7 gezeigt wurde, dass „84–92" und „91–99" eine Funktion als Tumorantigen-Peptid haben, wurden zwei Derivate hergestellt, in welchen Phenylalanin an Position 2 innerhalb des Umfangs des Bindungsmotivs für HLA-A24 durch Tyrosin ersetzt ist, nämlich „84–92·2F-Y" (SEQ ID NO: 39) und „91–99·2F-Y" (SEQ ID NO: 40).
Das Peptid Lys-Tyr-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe (SEQ ID NO: 39) wurde in gleicher Weise, wie in Beispiel 5 beschrieben, synthetisiert. Genau gesagt wurden unter Verwendung von 100 mg Fmoc-Phe-Alko Resin, Fmoc-Asp (OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH und Fmoc-Lys(Boc)-OH in der Reihenfolge gekoppelt, und danach wurden von dem Produkt die Schutzgruppen entfernt. Das erhaltene Rohpeptid wurde in wässriger Essigsäure gelöst und in eine Packmaterial COSMOSIL 5C18-AR-Umkehrphasen-Säule (25 ⌀ × 250 mm), voräquilibriert mit 0,1 % wässriger TFA, injiziert. Die Säule wurde mit 0,1% wässriger TFA gewaschen, und anschließend wurde die Konzentration von Acetonitril innerhalb von 200 Minuten auf 25% erhöht, wobei das Produkt mit einer Fließrate von 7 ml/Min. eluiert wurde. Das Eluat wurde bei A 220 nm überwacht. Die Fraktionen, welche das gewünschte Produkt enthielten, wurden vereinigt und gefriergetrocknet, wodurch 44,9 mg von Lys-Tyr-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe erhalten wurden.
Das erhaltene Peptid, Lys-Tyr-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe, hatte in einer Analyse unter Verwendung einer Packmaterial YMC-PACK ODS-AM-Umkehrphasen-Säule (4,6 ⌀ × 250 mm), eluiert mit einem linearen Gradienten einer Acetonitril-Konzentration von 0 bis 60%, enthaltend 0,1% TFA, eine Retentionszeit von 17,7 Minuten, und die Ergebnisse von Aminosäureanalyse und Massenspektrometrie des Produkts stimmten mit den theoretischen Werten überein.
Aminosäureanalyse:

Hydrolyse: 1% Phenol/6 N wässrige Salzsäure, 110°C, 24 Stunden;
Analyseverfahren: Ninhydrin-Verfahren;
* Referenzaminosäure; die theoretischen Werte sind in Klammern angegeben:
Asx: 1,06 (1)
*Val: 1,00 (1)
Ile: 0,85 (1)
Tyr: 0,89 (1)
Phe: 0,95 (1)
Lys: 1,85 (2)
His: 0,98 (1)
Arg: 0,91 (1)

Massenspektrum (FAB):

[M + H]⁺: 1206

Beispiel 9
Synthese von Asp-Tyr-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe (SEQ ID NO: 40)
In gleicher Weise, wie in Beispiel 5 beschrieben, wurden unter Verwendung von 100 mg Fmoc-Phe-Alko Resin, Fmoc-Asp (OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH und Fmoc-Asp(OtBu)-OH in der Reihenfolge gekoppelt, und danach wurden von dem Produkt die Schutzgruppen entfernt. Das erhaltene Rohpeptid wurde in wässriger Essigsäure gelöst und in eine Packmaterial COSMOSIL 5C18-AR-Umkehrphasen-Säule (25 ⌀ × 250 mm), voräquilibriert mit 0,1% wässriger TFA, injiziert. Die Säule wurde mit 0,1% wässriger TFA gewaschen, und anschließend wurde die Konzentration von Acetonitril innerhalb von 200 Minuten auf 27% erhöht, wobei das Produkt mit einer Fließrate von 7 ml/Min. eluiert wurde. Das Eluat wurde bei A 220 nm überwacht. Die Fraktionen, welche das gewünschte Produkt enthielten, wurden vereinigt und gefriergetrocknet, wodurch 12,8 mg von Asp-Tyr-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe erhalten wurden.
Das erhaltene Peptid, Asp-Tyr-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe, hatte in einer Analyse unter Verwendung einer Packmaterial YMC-PACK ODS-AM-Umkehrphasen-Säule (4,6 ⌀ × 250 mm), eluiert mit einem linearen Gradienten einer Acetonitril-Konzentration von 0 bis 60%, enthaltend 0,1% TFA, eine Retentionszeit von 24,7 Minuten, und die Ergebnisse von Aminosäureanalyse (wobei Met nicht nachgewiesen wird) und Massenspektrometrie des Produkts stimmten mit den theoretischen Werten überein.
Aminosäureanalyse:

Hydrolyse: 1% Phenol/6 N wässrige Salzsäure, 110°C, 24 Stunden;
Analyseverfahren: Ninhydrin-Verfahren;
* Referenzaminosäure; die theoretischen Werte sind in Klammern angegeben:
Asx: 2,04 (2)
Glx: 1,02 (1)
Gly: 2,06 (2)
*Ile: 1,00 (1)
Tyr: 0,82 (1)
Phe: 0,98 (1)

Massenspektrum (FAB):

[M + H]⁺: 1045

Beispiel 10
Induktion von CTL aus peripheren Blutlymphocyten durch Tumorantigen-Peptide und Derivate davon
Die Erfinder untersuchten, ob Antigen-spezifische CTLs aus peripheren Blutlymphocyten unter Verwendung des Peptids „84–92" (SEQ ID NO: 1), das in Beispiel 5 synthetisiert wurde, und des Peptids „84–92·2F-Y" (SEQ ID NO: 39), das in Beispiel 8 synthetisiert wurde, induziert werden können.
Lymphocyten wurden aus peripherem Blut eines Leukämiepatienten, der für A24 im HLA-A-Locus heterozygot war, unter Verwendung des FicoII-Verfahrens abgetrennt. Die Lymphocyten wurden in die Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen bei 2 × 10⁶ Zellen pro Vertiefung eingebracht und im Lymphocytenmedium gezüchtet. Die vorstehenden Tumorantigen-Peptide wurden zum Kulturmedium bei 10 µM zugegeben, um die peripheren Blutlymphocyten zu stimulieren. Nach einer Woche wurde das vorstehende Tumorantigen-Peptid, so dass 10 µM erreicht wurden, zusammen mit etwa 2 × 10⁵ Zellen von röntgenbestrahlten (50 Gy) peripheren Blutlymphocyten für die zweite Stimulation zugefügt.
Nach einer weiteren Woche wurde die dritte Stimulation in ähnlicher Weise durchgeführt. Die gezüchteten Lymphocyten wurden eine Woche nach der dritten Stimulation geerntet. Unter Verwendung der Zielzellen (1 × 10⁴ Zellen) BEC-2, wobei es sich um eine HLA-A2402-positive, EB-Virus-transformierte B-Zelllinie handelt, die das Tumorantigen-Protein der vorliegenden Erfindung (Cyclophilin B) exprimiert, und Ban-B1, wobei es sich um eine HLA-A2402-negative, EB-Virus-transformierte B-Zelllinie handelt, die das Tumorantigen-Protein der vorliegenden Erfindung exprimiert, wurde die Menge des durch die vorstehenden Lymphocyten (8 × 10⁴ Zellen) als Antwort auf die Zielzellen produzierten IFN-γ im Kulturmedium durch ELISA gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6

IFN-γ im Überstand (pg/ml)

Antigenpeptid BEC-2 Ban-B1

„84–92" 383 38

„84–92·2F-Y" 489 63

Keines 245 74
Außerdem wurde ein weiteres Experiment, ähnlich wie das vorstehend beschriebene, unter Verwendung von „91–99" (SEQ ID NO: 2), synthetisiert in Beispiel 6, und „91–99·2F-Y" (SEQ ID NO: 40), synthetisiert in Beispiel 9, und außerdem des vorstehenden „84–92" (SEQ ID NO: 1) und „84–92·2F-Y" (SEQ ID NO: 39) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7

IFN-γ im Überstand (pg/ml)

Antigenpeptid BEC-2 Ban-B1

„84–92" 1896 160

„84–92·2F-Y" 710 46

„91–99" > 2000 40

„91–99·2F-Y" 650 100
Periphere Blutlymphocyten, die mit „84–92"-, „84–92·2F-Y"-, „91–99"- und „91–99·2F-Y"-Peptiden stimuliert wurden, reagierten mit HLA-A24-positiven BEC-2, nicht jedoch mit HLA-A24-negativen Ban-B1, dies zeigt eine Induktion von HLA-A24-restringierten Tumorantigen-Peptid-spezifischen CTLs. Weiterhin reagierten die mit „84–92·2F-Y"- und „91–99·2F-Y"-Peptiden stimulierten peripheren Blutlymphocyten mit BEC-2 wie die mit „84–92"- und „91–99"-Peptiden stimulierten peripheren Blutlymphocyten; dies zeigt, dass die Derivate, die durch Substitution aus den ursprünglichen Peptiden erhalten wurden, eine Fähigkeit zur CTL-Induktion besaßen, die ähnlich war wie diejenige der ursprünglichen Peptide.
Genauso kann ein ähnliches Experiment durchgeführt werden, wobei COS-7-Zellen (ATCC Nr. CRL 1651) oder VA-13-Zellen (RIKEN CELL BANK, The Institute of Physical and Chemical Research), in welche ein Expressionsplasmid für HLA-A2402-cDNA (GenBank-Hinterlegungsnummer M64740) eingeführt worden war und welche mit den vorstehenden Peptiden gepulst worden waren, anstelle der im vorstehenden Experiment verwendeten BEC-2 eingesetzt werden und wobei COS-7- oder VA-13-Zellen, in welche das Expressionsplasmid für HLA-A2402-cDNA eingeführt worden war, die jedoch nicht mit den Peptiden gepulst worden waren, anstelle der im vorstehenden Experiment verwendeten Ban-B1 eingesetzt werden (J. Exp. Med. 187: 277, 1998).
Beispiel 11
Induktion von CTL aus peripheren Blutlymphocyten durch ein Cyclophilin-Protein
Unter Bezug auf die in der Literatur beschriebenen Verfahren (z. B. J. Immunol. 158: 1796, 1997; und Cancer Res. 59: 1184, 1999) können geeignete Zellen mit einem Cyclophilin der vorliegenden Erfindung, einem partiellen Polypeptid davon, einem von Cyclophilin abstammenden Tumorantigen-Peptid der vorliegenden Erfindung oder dergleichen gepulst werden, um Antigen-präsentierende Zellen herzustellen, auf welchen ein Komplex zwischen einem HLA-Antigen und einem von Cyclophilin abstammenden Tumorantigen-Peptid präsentiert wird. Die erfolgreiche Herstellung von gewünschten Antigen-präsentierenden Zellen kann bestätigt werden, indem bestimmt wird, ob Antigen-spezifische CTLs aus peripheren Blutlymphocyten durch die Antigen-präsentierenden Zellen induziert werden oder nicht. Obwohl die folgenden Beschreibungen ein Beispiel darstellen, in welchem peripheres Blut von einem gesunden Spender verwendet wird, ist es selbstverständlich auch möglich, dass Antigen-präsentierende Zellen in ähnlicher Weise unter Verwendung von peripherem Blut von einem Tumorpatienten hergestellt werden können.
Zuerst werden die Lymphocyten durch das FicoII-Verfahren aus dem peripheren Blut eines HLA-A24-positiven, gesunden Spenders abgetrennt. Die Lymphocyten lässt man drei Stunden bei 37°C in einem Kulturkolben stehen, um nicht-adhärente Zellen zu entfernen. Die adhärenten Zellen werden sieben Tage in Gegenwart von GM-CSF (2000 E/ml) und IL-4 (2000 E/ml) gezüchtet, um dendritische Zellen zu induzieren, von denen bekannt ist, dass sie stark ausgeprägte Antigen-präsentierende Eigenschaften besitzen. Die geernteten dendritischen Zellen werden mit 10 µg/ml Tumorantigen-Peptid der vorliegenden Erfindung oder 100 µg/ml Tumorantigen-Protein (Cyclophilin) der vorliegenden Erfindung oder eines partiellen Polypeptids davon zwei Stunden bei 37°C gezüchtet, wodurch sie gepulst werden, und danach werden sie mit Röntgenstrahlen (5000 Rad) bestrahlt. Anschließend werden die mit dem vorstehenden Peptid oder Protein gepulsten dendritischen Zellen in einer Platte mit 24 Vertiefungen zusammen mit CD8⁺-T-Zellen, die unter Verwendung biomagnetischer Trennperlen (Dynal) aus peripheren Blutlymphocyten des vorstehenden gesunden Spenders hergestellt wurden, für die antigene Stimulation gezüchtet. Am Tag nach der Stimulation wird IL-2 (100 E/ml) zugegeben. Die T-Zellen werden wöchentlich (zwei- bis viermal) in gleicher Weise stimuliert, wobei die vorstehenden, mit dem Peptid oder Protein gepulsten dendritischen Zellen verwendet werden. Eine Woche nach der letzten Stimulation werden die gezüchteten T-Zellen geerntet. Unter Verwendung der Zielzellen BEC-2, wobei es sich um eine HLA-A2402-positive, EB-Virus-transformierte B-Zelllinie handelt, die das Tumorantigen-Protein der vorliegenden Erfindung exprimiert, und Ban-B1, wobei es sich um eine HLA-A2402-negative EB-Virus-transformierte B-Zelllinie handelt, die das Tumorantigen-Protein der vorliegenden Erfindung exprimiert, wurde die Reaktivität der vorstehenden T-Zellen bestimmt, indem die Menge von IFN-γ im Kulturüberstand durch ELISA wie in Beispiel 10 gemessen wurde oder indem die cytotoxische Aktivität bei ⁵¹Cr-markierten Zielzellen gemessen wurde. Wenn Antigen-spezifische CTLs induziert wurden, wird die Reaktion nur gegenüber BEC-2 festgestellt. Anhand des vorstehenden Experiments kann man bestimmen, ob Antigen-präsentierende Zellen (dendritische Zellen), die mit dem Tumorantigen-Peptid, Tumorantigen-Protein der vorliegenden Erfindung oder dergleichen gepulst wurden, eine Aktivität zum Induzieren von Antigen-spezifischen CTLs besitzen.
Genauso kann ein ähnliches Experiment durchgeführt werden, wobei COS-7-Zellen (ATCC Nr. CRL 1651) oder VA-13-Zellen (RIKEN CELL BANK, The Institute of Physical and Chemical Research), in welche ein Expressionsplasmid für HLA-A2402-cDNA (GenBank-Hinterlegungsnummer M64740) eingeführt worden war und welche mit einem Tumorantigen-Peptid oder Tumorantigen-Protein der vorliegenden Erfindung gepulst worden waren, anstelle der im vorstehenden Experiment verwendeten BEC-2 eingesetzt werden und wobei COS-7- oder VA-13-Zellen, in welche das Expressionsplasmid für HLA-A2402-cDNA eingeführt worden war, die jedoch nicht mit dem vorstehenden Peptid oder dergleichen gepulst worden waren, anstelle der im vorstehenden Experiment verwendeten Ban-B1 eingesetzt werden (J. Exp. Med. 187: 277, 1998).
Freier Text zum Sequenzprotokoll
In der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 37 dargestellt ist, ist die zweite Aminosäure Phenylalanin, Tyrosin, Methionin oder Tryptophan, und die neunte Aminosäure ist Phenylalanin, Leucin, Isoleucin, Tryptophan oder Methionin.
In der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 38 dargestellt ist, ist die zweite Aminosäure Phenylalanin, Tyrosin, Methionin oder Tryptophan, und die neunte Aminosäure ist Phenylalanin, Leucin, Isoleucin, Tryptophan oder Methionin.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können von Cyclophilin B abstammende Tumorantigen-Peptide und Derivate davon, welche die funktionell äquivalenten Eigenschaften aufweisen, sowie Arzneimittel, prophylaktische Mittel oder Diagnosemittel für Tumoren unter Verwendung von solchen Tumorantigen-Peptiden, Derivaten davon, Cyclophilin-B-Polypeptiden oder Genen dafür in vivo oder in vitro bereitgestellt werden. Sequenzprotokoll

Claims

Tumorantigen-Peptid bestehend aus einer Länge von 8 bis 14 Aminosäuren des Cyclophilins B, das eine Aminosäuresequenz wie in einer der SEQ ID NOs: 1 bis 36 gezeigt umfasst und das an ein HLA-Antigen bindet und von cytotoxischen T-Lymphocyten erkannt wird.
Tumorantigen-Peptid nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 oder 2 gezeigt.
Derivat des Tumorantigen-Peptids nach Anspruch 1, in welchem der Aminosäurerest an Position 2 und/oder der C-Terminus in der Aminosäuresequenz wie in einer der SEQ ID NOs: 1 bis 36 gezeigt, ersetzt ist durch einen anderen Aminosäurerest und in welchem das Derivat an ein HLA-Antigen bindet und von cytotoxischen T-Lymphocyten erkannt wird.
Derivat nach Anspruch 3, in welchem der Aminosäurerest an Position 2 und/oder der C-Terminus in der Aminosäuresequenz wie in der SEQ ID NO: 1 oder 2 gezeigt durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist.
Derivat nach Anspruch 3, in welchem der Aminosäurerest an Position 2 in der Aminosäuresequenz wie in einer der SEQ ID NOs: 1 bis 11 gezeigt, ersetzt ist durch Tyrosin, Phenylalanin, Methionin oder Tryptophan und/oder der Aminosäurerest am C-Terminus ersetzt ist durch Phenylalanin, Leucin, Isoleucin, Tryptophan oder Methionin.
Derivat nach Anspruch 3, in welchem der Aminosäurerest an Position 2 in der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NOs: 12 bis 36 gezeigt, ersetzt ist durch Leucin, Methionin, Valin, Isoleucin oder Glutamin und/oder der Aminosäurerest am C-Terminus ersetzt ist durch Valin oder Leucin.
Derivat nach Anspruch 5, umfassend die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 37 oder 38 gezeigt.
Derivat nach Anspruch 7, umfassend die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 39 oder 40 gezeigt.
Arzneimittel, umfassend mindestens einen der Stoffe, ausgewählt aus Tumorantigen-Peptiden und Derivaten davon nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
Arzneimittel, umfassend ein partielles Polypeptid von Cyclophilin B, welches ein Tumorantigen-Peptid nach Anspruch 1 oder 2 umfasst, oder ein Gen, welches das partielle Polypeptid codiert.
Antikörper, welcher spezifisch an das Tumorantigen-Peptid oder das Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 8 bindet.
Antigen-präsentierende Zelle, wobei ein Komplex zwischen einem HLA-Antigen und dem Tumorantigen-Peptid oder dem Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 8 auf der Oberfläche einer Zelle, welche Antigen-präsentierende Eigenschaften hat, präsentiert wird, wobei die Zelle aus einem Tumorpatienten isoliert ist.
Antigen-präsentierende Zelle, auf welcher ein Komplex zwischen einem HLA-Antigen und einem Tumorantigen-Peptid abgeleitet von Cyclophilin B präsentiert wird, wobei die Antigen-präsentierende Zelle dadurch hergestellt wird, dass einer Zelle, welche Antigen-präsentierte Eigenschaften hat und aus einem Tumorpatienten isoliert ist, erlaubt wird, Cyclophilin B, ein partielles Polypeptid von Cyclophilin B, welches das Tumorantigen-Peptid nach Anspruch 1 oder 2 umfasst, oder ein Gen, welches Cyclophilin B oder das partielle Polypeptid davon codiert, aufzunehmen.
Arzneimittel, umfassend die Antigen-präsentierende Zelle nach Anspruch 12 oder 13.
Cytotoxischer T-Lymphocyt, welcher spezifisch einen Komplex zwischen einem HLA-Antigen und einem Tumorantigen-Peptid oder Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erkennt.
Cytotoxischer T-Lymphocyt, welcher spezifisch einen Komplex zwischen einem HLA-Antigen und einem Tumorantigen-Peptid oder Derivat davon erkennt, welcher auf einer Antigen-präsentierenden Zelle nach einem der Ansprüche 12 oder 13 präsentiert wird.
Arzneimittel, umfassend den cytotoxischen T-Lymphocyten nach Anspruch 15 oder 16.
Cytotoxischer T-Lymphocyt, welcher die Hinterlegungsnummer FERM BP-6725 hat.
Verfahren zur Identifizierung von Tumorantigen-Proteinen oder Tumorantigen-Peptiden, umfassend die Verwendung von FERM BP-6725 nach Anspruch 18.
Diagnosemittel für Tumore, umfassend ein Tumorantigen-Peptid oder ein Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
Verwendung von mindestens einem der Stoffe ausgewählt aus Tumorantigen-Peptiden und Derivaten davon nach einem der Ansprüche 1 bis 8, Cyclophilin B, einem partiellen Polypeptid von Cyclophilin B welches ein Tumorantigen-Peptid nach Anspruch 1 oder 2 umfasst, oder einem Gen, das Cyclophilin B oder das partielle Polypeptid davon codiert, einer Antigen-präsentierenden Zelle nach Anspruch 12 oder 13 oder dem cytotoxischen T-Lymphocyt nach Anspruch 15 oder 16 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumoren.