CN111925431A - Koc1衍生的肽和包含它们的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有诱导细胞毒性T细胞的能力的KOC1衍生的表位肽。本发明还提供编码所述肽的多核苷酸，呈递所述肽的抗原呈递细胞，和靶向所述肽的细胞毒性T细胞，以及诱导抗原呈递细胞或CTL的方法。本发明还提供了含有它们作为活性成分的组合物和药物组合物。此外，本发明提供了使用本发明的肽、多核苷酸、抗原呈递细胞、细胞毒性T细胞或药物组合物来治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发的方法。还提供了诱导针对癌症的免疫应答的方法。

Description

KOC1衍生的肽和包含它们的疫苗
本申请是申请日为2015年7月31日，申请号为201580052377.4，发明名称 为“KOC1衍生的肽和包含它们的疫苗”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
发明涉及生物科学领域，更具体的说涉及癌症治疗领域。具体而言，本 发明涉及作为癌症疫苗有效的新肽，使用所述肽治疗和/或预防肿瘤的方法， 以及包含所述肽的药物组合物。
本申请要求提交于2014年08月04日提交的日本专利申请(日本专利申请 号2014-158919,2014-158920,和2014-158921)的权益，其全部内容通过提述 并入本文。
发明背景
已经显示细胞毒性T细胞(CTLs)可识别主要组织相容性复合物(MHC)I 类分子上发现的肿瘤相关抗原(TAA)所衍生的表位肽，然后杀死肿瘤细胞。 从发现黑素瘤抗原(MAGE)家族以来，已经通过免疫学方法发现了许多其它 TAA(NPL1:Boon T,Int J Cancer1993 May 8,54(2):177-80；NPL2:Boon T& van der Bruggen P,J Exp Med 1996 Mar 1,183(3):725-9)。这些TAAs中的一些 目前正在作为免疫治疗靶标进行临床开发。
在这些TAAs中的数个中，鉴定了可以被CTLs识别的表位肽，并且预期 它们在用于各种类型的癌症的免疫治疗中的应用(NPL3:Harris CC,J Natl Cancer Inst 1996 Oct16,88(20):1442-55；NPL4:Butterfield LH等人,Cancer Res 1999 Jul 1,59(13):3134-42；NPL5:Vissers JL等人,Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21):5554-9；NPL6:van der BurgSH等人,J Immunol 1996 May 1,156(9) 3308-14；NPL7:Tanaka F等人,Cancer Res 1997Oct 15,57(20):4465-8；NPL8: Fujie T等人,Int J Cancer 1999 Jan 18,80(2):169-72；NPL9:Kikuchi M等人,Int J Cancer 1999 May 5,81(3):439-66；NPL10:Oiso M等人,IntJ Cancer 1999 May 5,81(3):387-94)。到目前为止，已经报道了使用这些TAA衍生的CTL表位肽的几项临床试验。不幸的是，许多这些临床试验显示出低的客观反应率 (NPL11:BelliF等人,J Clin Oncol 2002 Oct 15,20(20):4169-80；NPL12: Coulie PG等人,ImmunolRev 2002 Oct,188:33-42；NPL13:Rosenberg SA等人, Nat Med 2004 Sep,10(9):909-15)。因此，仍然需要鉴定可以用于癌症免疫治 疗的新的CTL表位。
在通过使用含有23,040种基因的全基因组cDNA微阵列的基因表达概况 分析，将KOC1(胰岛素样生长因子II mRNA结合蛋白3，也描述为IGF2BP3 或IMP-3；参考序列:GeneBank登录号NM_006547.2(SEQ ID NO:109))鉴定 为在肺癌中上调的基因(NPL14:Kikuchi T等人,Oncogene.2003 Apr 10； 22(14):2192-205；PTL1:WO2004/031413)。观察到在超过90％的肺癌患者的 肿瘤细胞中KOC1特异性表达上调，但其在除睾丸和胎盘之外的其他正常重 要器官中不表达。此外，显示了作为通过RNA干扰下调KOC1表达的结果， 表达KOC1的癌细胞系中的细胞增殖受到抑制。
最近，已经鉴定了KOC1衍生的HLA-A24限制性CTL表位肽(PTL2: WO2006/090810；NPL15:Suda T等人,Cancer Sci.2007 Nov；98(11):1803-8) 和HLA-A2限制性CTL表位肽(PTL3:WO2011/067920；NPL16:Tomita Y等, Cancer Sci.2011 Jan；102(1):71-8)。这些肽在具有HLA-A24型或HLA-A2型的 癌症患者中有效，但不能预期对不具有这些HLA型的癌症患者具有效果。
[引用列表]
[专利文献]
[PTL 1]WO2004/031413
[PTL2]WO2006/090810
[PTL3]WO2011/067920
[非专利文献]
[NPL 1]Boon T,Int J Cancer 1993 May 8,54(2):177-80
[NPL 2]Boon T&van der Bruggen P,J Exp Med 1996 Mar 1,183(3): 725-9
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[NPL 16]Tomita Y等人,Cancer Sci.2011 Jan；102(1):71-8
发明概述
本发明涉及肽，其可以诱导对表达KOC1的细胞特异性的CTLs。当这些 肽通过人白细胞抗原(HLA)呈递在抗原呈递细胞(APCs)上时，诱导显示出针 对表达KOC1的细胞的特异性细胞毒性活性的CTLs。迄今已经鉴定的具有 CTL诱导能力(CTL诱导力)的KOC1衍生肽是HLA-A2限制性肽或HLA-A24限 制性肽，其不能诱导针对不表达这些HLAs的细胞的CTLs。因此，常规肽不 适合在不具有这些HLA的受试者中进行免疫治疗。HLA-A11，HLA-A33和 HLA-A03是亚洲人常见的等位基因(Sette A,Sidney J.,Immunogenetics 1999, 50:201-12),而HLA-A03和HLA-A01是在高加索人中常见的等位基因(Cao等 人,Hum Immunol 2001；62(9):1009-30)。期望对HLA-A11阳性受试者施用 HLA-A11限制性肽，对HLA-A33阳性受试者施用HLA-A33限制性肽，对 HLA-A03阳性受试者施用HLA-A03限制性肽，和对HLA-A01阳性受试者施 用HLA-A01限制性肽。因此，本发明涉及KOC1衍生肽，其具有对HLA-A11, HLA-A33,HLA-A03,或HLA-A01限制性的CTL诱导能力。基于本文公开的 结果，已经证明本发明的肽是表位肽，其能够诱导针对表达KOC1和 HLA-A11，HLA-A33，HLA-A03或HLA-A01的细胞的强力和特异性的免疫 应答。
因此，本发明的目的之一是提供能够以HLA-A11-，HLA-A33-，HLA-A03- 或HLA-A01限制性方式诱导CTL的KOC1衍生肽。这些肽可以用于体外、离 体或体内诱导CTL，或可用于施用至受试者用于诱导针对表达KOC1的癌细 胞的免疫应答的目的。优选的肽是包含选自以下氨基酸序列的肽：SEQ ID NOs:5,28,30,32,61,62,63,64,67,74,77,52,79,80,85,27,86,87,90,92,46, 95和41；更优选的肽是九肽或十肽；和甚至更优选的肽是选自由以下氨基 酸序列组成的肽SEQ ID NOs:5,28,30,32,61,62,63,64,67,74,77,52,79,80, 85,27,86,87,90,92,46,95和41。
本发明的肽包含以下肽，其中一个，两个或更多个氨基酸被取代，缺失， 插入和/或添加，只要所得修饰肽保留了原始肽的CTL诱导能力。
本发明还提供了分离的多核苷酸，其编码本发明的任一种肽。与本发明 的肽类似，这些多核苷酸可用于诱导具有CTL诱导能力的APC，并可施用至 受试者用于诱导针对KOC1表达的癌细胞的免疫应答。
本发明还提供了组合物，其包含本发明的一种或多种类型的肽，编码本 发明的一种或多种类型的肽的一种一种或多种类型的多核苷酸，本发明的 APCs，呈递本发明肽的外来体，和/或本发明的CTLs。本发明的组合物优选 是药物组合物。本发明的药物组合物可用于治疗和/或预防癌症，以及防止其 手术后复发。它们还可以用于诱导针对癌症的免疫应答。当施用于受试者时， 本发明的肽呈递于APC的表面上，结果诱导了靶向肽的CTL。因此，本发明 的另一个目的是提供用于诱导CTLs的组合物，其中组合物包含一种或多种类 型的本发明的肽，编码一种或多种类型的本发明的肽的一种或多种类型的多 核苷酸，本发明的APC，和/或呈递本发明的肽的外来体。
本发明的另一个目的是提供诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，其中 所述方法包括将本发明的一种或多种类型的肽与APC接触的步骤，或将编码 本发明的任何一种肽的多核苷酸引入APC的步骤。
本发明还提供了诱导CTL的方法，包括将CD8-阳性T细胞与在其表面上 呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的APC共培养的步骤，将CD8-阳性T细 胞与在其表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的外来体共培养的步 骤，或将载体引入CD8-阳性T细胞的步骤，所述载体包含编码T细胞受体(TCR) 的每个亚基的多核苷酸，所述TCR能够结合由细胞表面上的HLA抗原所呈递 的本发明的肽。本发明中优选的HLA抗原是HLA-A11，HLA-A33，HLA-A03或HLA-A01。
本发明的另一个目的是提供分离的APC，在其表面上呈递HLA抗原和本 发明的肽的复合物。本发明还提供靶向本发明肽的分离的CTLs。这些APCs 和CTLs可以用于针对表达KOC1的癌症的免疫治疗。在本发明中，经受免疫 治疗的癌症是例如存在于具有HLA-A11，HLA-A33，HLA-A03或HLA-A01 的纯合子或杂合子患者中的癌症。也就是说，本发明提供了用于表达KOC1 和至少一种选自HLA-A11，HLA-A33，HLA-A03和HLA-A01的HLA抗原的 癌症的免疫治疗。
本发明的另一个目的是提供在受试者中诱导针对癌症的免疫应答的方 法，其中所述方法包括向受试者施用本发明的肽，编码所述肽的多核苷酸， 本发明的APC，呈递本发明肽的外来体，和/或本发明的CTL的步骤。本发明 的另一个目的是提供在受试者中治疗和/或预防癌症以及预防其手术后复发 的方法，其中所述方法包括向受试者施用本发明的肽，编码所述肽的多核苷 酸，本发明的APC，呈递本发明肽的外来体，和/或本发明的CTL的步骤。
除了上述之外，当结合附图和实施例阅读以下详细描述时，本发明的其 它目的和特征将变得更加显而易见。然而，应当理解，本发明的前述概述和 以下详细描述都是示例性实施方案，而对本发明或本发明的其它替代实施方 案不是限制性的。特别地，尽管本文参照多个具体实施方案描述了本发明， 但是应当理解，该描述是本发明的说明，而不构成对本发明的限制。在不脱 离如所附权利要求所描述的本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员 可以想到各种修改和应用。同样地，本发明的其它目的，特征，益处和优点 将从该概述和下面描述的某些实施方案中变得明显，并且对于本领域技术人 员将是显而易见的。从上述结合所附实施例，数据，附图和从其中得出的所 有合理推断，单独或与并入本文的参考文献一同考虑，此类目的，特征，益 处和优点将是显而易见的。
附图简述
图1由照片(a)至(e)组成，其显示了使用衍生自KOC1的肽诱导的CTLs中 的干扰素(IFN)-gamma酶联免疫点(ELISPOT)测定的结果。与对照相比，具有 KOC1-A11-9-415(SEQID NO:5)的孔#6中(a)，具有KOC1-A11-10-414(SEQ ID NO:28)的孔#4中(b)；具有KOC1-A11-10-204(SEQ ID NO:30)的孔#5中 (c)，和具有KOC1-A11-10-14(SEQ ID NO:32)的孔#8中(d)的CTLs显示出强的 IFN-gamma生产。在这些照片中，孔上的正方形显示繁殖来自相应孔的细胞 用于建立CTL系。与此相反，KOC1-A11-9-258(SEQ ID NO:1)(e)显示为其 中没有特异性IFN-gamma产生的典型阴性数据的实例。图中，“+”表示针对 用合适的肽冲击(pulsed)的靶细胞的IFN-gamma产生；和“-”表示针对尚未 用任何肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生。
图2由一系列的线型图(a)至(c)组成，其显示IFN-gamma酶联免疫吸附测 定(ELISA)的结果，证实了在用KOC1-A11-9-415(SEQ ID NO:5)(a), KOC1-A11-10-204(SEQID NO:30)(b)或KOC1-A11-10-14(SEQ ID NO:32) (c)刺激的CTL系中IFN-gamma的产生。这些结果证明通过用每种肽刺激建立 的CTL系与对照相比显示出强的IFN-gamma产生。在图中，“+”表示针对用合 适的肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生；和“-”表示针对尚未用任何肽冲击 的靶细胞的IFN-gamma产生。R/S比率表示CTL克隆(响应细胞)的细胞数与靶 细胞(刺激细胞)的细胞数的比率。
图3由线型图(a)和(b)组成，显示通过用KOC1-A11-9-415(SEQ ID NO：5) 或KOC1-A11-10-14(SEQ ID NO：32)刺激的CTL系的有限稀释建立的CTL克 隆中的IFN-gamma产生。这些结果证明通过用每种肽刺激建立的CTL克隆与 对照相比显示出强的IFN-gamma产生。在图中，“+”表示针对用合适的肽冲 击的靶细胞的IFN-gamma产生；和“-”表示针对尚未用任何肽冲击的靶细胞 的IFN-gamma产生。R/S比率表示CTL系(响应细胞)的细胞数与靶细胞(刺激细 胞)的细胞数的比率。
图4的线型图显示了针对表达KOC1和HLA-A*1101两者的靶细胞的特异 性CTL活性。制备用HLA-A*1101或全长KOC1基因转染的COS7细胞作为对 照。使用KOC1-A11-10-14(SEQ ID NO：32)建立的CTL克隆表现出针对用 KOC1和HLA-A*1101两者转染的COS7细胞的特异性CTL活性(黑色菱形)。另 一方面，未显示出显著的针对用HLA-A*1101(白色三角形)和KOC1(白色圆形) 中的任一种转染的靶细胞的特异性CTL活性。
图5由照片(a)至(l)组成，显示了使用衍生自KOC1的肽诱导的CTLs中的 IFN-gamma ELISPOT测定的结果。与对照相比，在具有KOC1-A33-9-543 (SEQ ID NO:61)的孔#1中(a)，具有KOC1-A33-9-282(SEQ ID NO:62)的孔#2 中(b)，具有KOC1-A33-9-317(SEQ IDNO:63)的孔#3中(c)，具有 KOC1-A33-9-485(SEQ ID NO:64)的孔#8中(d)，具有KOC1-A33-9-286(SEQ ID NO:67)的孔#3中(e)，具有KOC1-A33-9-34(SEQ ID NO:74)的孔#8中(f)， 具有KOC1-A33-10-542(SEQ ID NO:77)的孔#4中(g)，具有KOC1-A33-10-281 (SEQ ID NO:52)(h)的孔#3中，具有KOC1-A33-10-543(SEQ ID NO:79)的孔 #6中(i)，具有KOC1-A33-10-424(SEQ ID NO:80)的孔#1中(j)，和具有 KOC1-A33-10-285(SEQ ID NO:85)的孔#5中(k)的CTLs中显示出强的 IFN-gamma产生。在这些照片中，孔上的正方形显示繁殖来自相应孔的细胞 用于建立CTL系。与此相反，KOC1-A33-9-517(SEQ ID NO:4)(l)显示为其 中没有特异性IFN-gamma产生的典型阴性数据的实例。图中，“+”表示针对 用合适的肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生；和“-”表示针对尚未用任何肽 冲击的靶细胞的IFN-gamma产生。
图6由一系列的线型图(a)至(f)组成，显示了IFN-gamma ELISA的结果， 证实了用以下刺激的CTL系中的IFN-gamma产生：KOC1-A33-9-543(SEQ ID NO:61)(a),KOC1-A33-9-282(SEQ ID NO:62)(b),KOC1-A33-9-485(SEQ ID NO:64)(c),KOC1-A33-9-286(SEQ IDNO:67)(d),KOC1-A33-10-542 (SEQ ID NO:77)(e),或KOC1-A33-10-281(SEQ ID NO:52)(f)。这些结果证 实了与对照相比，通过用每种肽刺激所建立的CTL系显示出强的IFN-gamma 产生。图中，“+”表示针对用合适的肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生；和 “-”表示针对尚未用任何肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生。R/S比率表示 CTL系(响应细胞)的细胞数与靶细胞(刺激细胞)的细胞数的比率。
图7由一系列的线型图(a)至(f)组成，显示了通过来自用以下刺激的CTL 系的有限稀释建立的CTL克隆中的IFN-gamma产生：KOC1-A33-9-543(SEQ ID NO:61)(a),KOC1-A33-9-282(SEQ ID NO:62)(b),KOC1-A33-9-485 (SEQ ID NO:64)(c),KOC1-A33-9-286(SEQ ID NO:67)(d), KOC1-A33-10-542(SEQ ID NO:77)(e),或KOC1-A33-10-281(SEQ IDNO: 52)(f)。这些结果证实了与对照相比，通过用每种肽刺激所建立的CTL克隆 显示出强的IFN-gamma生产。图中，“+”表示针对用合适的肽冲击的靶细胞 的IFN-gamma生产；和“-”表示针对尚未用任何肽冲击的靶细胞的IFN-gamma 生产。R/S比率表示CTL系(响应细胞)的细胞数与靶细胞(刺激细胞)的细胞数 的比率。
图8由一系列的线型图(a)至(c)组成，显示了针对表达KOC1和 HLA-A*3303两者的靶细胞的特异性CTL活性。制备了用HLA-A*3303或全长 KOC1基因转染的COS7细胞作为对照。使用KOC1-A33-9-485(SEQ ID NO: 64)(a),KOC1-A33-9-286(SEQ ID NO:67)(b),和KOC1-A33-10-542(SEQ ID NO:77)(c)建立的CTL克隆表现出针对用KOC1和HLA-A*3303两者转染的 COS7细胞的特异性CTL活性(黑色菱形)。另一方面，未显示出针对用 HLA-A*3303(白色三角形)或KOC1(白色圆圈)之一转染的靶细胞的显著的特 异性CTL活性。
图9由照片(a)至(d)组成，显示了用衍生自KOC1的肽诱导的CTLs中 IFN-gammaELISPOT测定的结果。与对照相比，在具有KOC1-A03-10-120 (SEQ ID NO:27)的孔#5中(a),具有KOC1-A03-10-204(SEQ ID NO:30)的孔 #3中(b),和具有KOC1-A03-10-281(SEQ IDNO:52)的孔#5中(c)的CTLs显示 出强的INF-gamma产生。在这些照片中，孔上的正方形显示繁殖来自相应孔 的细胞用于建立CTL系。与此相反，KOC1-A03-10-414(SEQ ID NO:28)(d)作为其中没有特异性IFN-gamma产生的典型阴性据的实例显示。图中，“+” 表示针对用合适的肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生；和“-”表示针对尚未 用任何肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生。
图10是一系列的线型图，显示了IFN-gamma ELISA的结果，证实了在用 KOC1-A03-10-120(SEQ ID NO:27)刺激的CTL系中IFN-gamma的产生。这些 结果证实了与对照相比，通过用每种肽刺激所建立的CTL系显示强的 IFN-gamma产生。图中，“+”表示针对用合适的肽冲击的靶细胞的IFN-gamma 产生；和“-”表示针对尚未用任何肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生。R/S 比率表示CTL系(响应细胞)的细胞数与靶细胞(刺激细胞)的细胞数的比率。
图11是线型图，显示了在通过来自用KOC1-A03-10-120(SEQ ID NO:27) 刺激的CTL系的有限稀释所建立的CTL克隆中IFN-gamma的产生。这些结果 证实了与对照相比，通过用每种肽刺激所建立的CTL系显示强的IFN-gamma 产生。图中，“+”表示针对用合适的肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生；和 “-”表示针对尚未用任何肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生。R/S比率表示 CTL系(响应细胞)的细胞数与靶细胞(刺激细胞)的细胞数的比率。
图12是线型图，显示了针对表达KOC1和HLA-A*0301两者的靶细胞的特 异性CTL活性。制备用HLA-A*0301或全长KOC1基因转染的COS7细胞作为 对照。使用KOC1-A03-10-120(SEQ ID NO:27)建立的CTL克隆表现出针对用 KOC1和HLA-A*0301两者转染的COS7细胞的特异性CTL活性(黑色菱形)。另 一方面，未显示出针对用HLA-A*3301(白色三角形)或KOC1(白色圆圈)之一 转染的靶细胞的显著的特异性CTL活性。
图13由照片(a)至(h)组成，显示了使用衍生自KOC1的肽诱导的CTLs中的 IFN-gamma ELISPOT测定的结果。与对照相比，在具有KOC1-A01-9-96(SEQ ID NO:86)的孔#2中(a)，具有KOC1-A01-9-118(SEQ ID NO:87)的孔#4中(b)， 具有KOC1-A01-9-404(SEQ IDNO:90)的孔#3中，具有KOC1-A01-9-402 (SEQ ID NO:92)的孔#4中(d)，具有KOC1-A01-10-312(SEQ ID NO:46)的孔 7#中(e)，具有KOC1-A01-10-402(SEQ ID NO:95)的孔#1中(f),和具有 KOC1-A01-10-535(SEQ ID NO:41)(g)的孔#1中的CTLs显示出强的 IFN-gamma产生。在这些照片中，孔上方的正方形显示繁殖来自相应孔的细 胞以建立CTL系。与此相反，KOC1-A01-9-536(SEQ ID NO:13)(h)作为其中 没有特异性IFN-gamma产生典型阴性数据的示例显示。图中，“+”表示针对 用合适的肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生；和“-”表示针对尚未用任何肽 冲击的靶细胞的IFN-gamma产生。
图14由一系列的线型图(a)和(b)组成，显示IFN-gamma ELISA的结果，证 实了用以下刺激的CTL系中IFN-gamma的产生：KOC1-A01-9-96(SEQ ID NO: 86)(a)或KOC1-A01-9-118(SEQ ID NO:87)(b)。这些结果证实了与对照相比， 通过用每种肽刺激建立的CTL系显示强的IFN-gamma产生。图中，“+”表示 针对用合适的肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生；和“-”表示针对尚未用任 何肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生。R/S比率表示CTL系(响应细胞)的细胞 数与靶细胞(刺激细胞)的细胞数的比率。
图15是线型图，显示了通过来自用KOC1-A01-9-96(SEQ ID NO:86)刺激 的CTL系的有限稀释建立的CTL克隆中的IFN-gamma产生。这些结果证实了 与对照相比，通过用每种肽刺激建立的CTL克隆显示强的IFN-gamma产生。 图中，“+”表示针对用合适的肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生；和“-”表 示针对尚未用任何肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生。R/S比率表示CTL系 (响应细胞)的细胞数与靶细胞(刺激细胞)的细胞数的比率。
图16是线型图，显示了针对表达KOC1和HLA-A*0101两者的靶细胞的特 异性CTL活性。制备用HLA-A*0101或全长KOC1基因转染的COS7细胞作为 对照。使用KOC1-A01-9-96(SEQ ID NO:86)建立的CTL克隆显示了针对用 KOC1和HLA-A*0101两者转染的COS7细胞的特异性CTL活性(黑色菱形)。另 一方面，未显示出针对用HLA-A*0101(白色三角形)或KOC1(白色圆圈)之一 转染的靶细胞的显著的特异性CTL活性。
发明详述
具体实施方式的说明
尽管在实施或检验本发明的实施方案中可使用与本文中描述的方法和 材料相似或等同的任何方法和材料，现在描述优选的方法、装置和材料。然 而，在描述本发明的材料和方法之前，应当理解，本发明不限于本文所描述 的特定大小，形状，尺度，材料，方法学，方案等，因为这些可以根据常规 实验和优化改变。还应当理解，本说明书中使用的术语仅用于描述特定版本 或实施方案的目的，并且不旨在限定本发明的范围，本发明的范围将仅由所 附权利要求限定。
I.定义
除非另有明确说明，如本文中使用的词语“一个/种”、“该”、和“所述” 意味着“至少一个/种”。
术语“分离的”和“纯化的”与物质(例如肽、抗体、多核苷酸等)相关 使用时，指该物质基本上不含至少一种可以包括在天然来源中的物质。因此， 分离的或纯化的肽指基本上不含另一种细胞材料，例如来自所述肽的细胞或 组织来源的碳水化合物、脂质或其它污染性蛋白质。当化学合成肽时，分离 或纯化的肽是指基本上不含有前体物质或另一种化学物质的肽。短语“基本 上不含细胞物质”包括肽制备物，其中所述肽与分离出该肽的或重组产生该 肽的细胞的细胞组分是分离的。如此，基本上不含细胞材料的肽包括肽制备 物，其含有小于约30％,20％,10％,5％,3％,2％或1％(以干重计)的其他细胞材 料。当肽以重组方式生成时，分离或纯化的肽基本上不含有培养基，其包含 肽制备物，所述肽制备物含有小于肽制备物体积的约20％,10％,或5％,3％, 2％或1％(以干重计)的培养基。当化学合成肽时，分离或纯化的肽基本上不 含有前体物质或其它化学物质，其含有肽制备物，所述肽制备物包含小于约 30％,20％,10％,5％,3％,2％或1％(以干重计)肽制备物体积的前体物质或其 它化学物质。可以通过例如在十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色或此类凝胶之后出现单一条带来确认肽制备物是分离的或 纯化的。在优选的实施方案中，本发明的肽和多核苷酸是分离的或纯化的。
术语“多肽”，“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，并指氨基酸残基 的聚合物。除天然存在的氨基酸聚合物外，这些术语也适用于非天然存在的 氨基酸聚合物，其包含一种或多种非天然存在的氨基酸残基。非天然存在的 氨基酸包括氨基酸类似物，氨基酸模拟物，以及此类。
本文所用的术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸，以及与天然存在的 氨基酸发挥相似功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在氨基酸是细 胞中那些通过遗传密码编码的，以及那些翻译后修饰的(例如羟脯氨酸， gamma-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸等)。短语“氨基酸类似物”是指具有与 天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(与氢结合的alpha碳，羧基，氨基和R 基团)但具有修饰的R基团或修饰的骨架的化合物(如，高丝氨酸，正亮氨酸， 甲硫氨酸亚砜，甲硫氨酸甲基锍等)。短语“氨基酸模拟物”是指与一般氨 基酸具有不同结构但具有相似功能的化合物。氨基酸可以是L-氨基酸或D- 氨基酸，并且本发明的肽优选是L-氨基酸聚合物。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，并且是指核苷酸的 聚合物。
本说明书中使用的术语“组合物”旨在包括包含指定量的指定成分的产 品，以及直接或间接由指定量的指定成分的组合产生的任何产品。当组合物 是药物组合物时，术语“组合物”旨在包括活性成分和惰性成分的产品，以 及从任何两种或多种成分的组合，络合或聚集，从一种或多种成分的离解， 或从一种或多种成分的其它类型的反应或相互作用直接或间接产生的任何 产品。因此，本发明的药物组合物包括通过将本发明的化合物或细胞与药学 上或生理学上可接受的载体混合而制备的任何组合物。不限于此，本说明书 中使用的术语“药学上可接受的载体”或“生理学上可接受的载体”包括液 体或固体填充剂，稀释剂，赋形剂，溶剂和包封材料；并且是指药学或生理 学上可接受的材料，组合物，物质或介质。
除非另有说明，术语“癌症”是指过表达KOC1基因的癌症；且其实例 包括膀胱癌，宫颈癌，胆管细胞癌，慢性骨髓性白血病(CML)，结肠癌，直 肠癌，食管癌，弥漫性胃癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤， 卵巢癌，肾癌，头颈部癌，软组织肿瘤，睾丸癌等,但不限于此。在示例性 实施方案中，“癌症”是表达KOC1和HLA-A11，HLA-A33，HLA-A03和/或HLA-A01的癌症。
除非另有说明，术语“细胞毒性T淋巴细胞”和“细胞毒性T细胞”和“CTL” 在本文中可互换使用。除非另有明确说明，它们是指可识别非自身细胞(例 如肿瘤/癌细胞，病毒感染的细胞)并诱导此类细胞的死亡的T淋巴细胞亚群。
除非另有说明，术语“HLA-A11”是指包括诸如HLA-A*1101, HLA-A*1102,HLA-A*1103,和HLA-A*1104的亚型的HLA-A11型。
除非另有说明，术语“HLA-A33”是指包括诸如HLA-A*3303, HLA-A*3301,和HLA-A*3304亚型的HLA-A33型。
除非另有说明，术语“HLA-A03”是指包括诸如HLA-A*0301, HLA-A*0302,和HLA-A*0305亚型的HLA-A03型。
除非另有说明，术语“HLA-A01”是指包括诸如HLA-A*0101, HLA-A*0102,HLA-A*0103,和HLA-A*0104亚型的HLA-A01型。
在受试者或患者的语境中，短语“受试者(或患者)的HLA抗原是 HLA-A11”是指受试者或患者具有纯合或杂合的HLA-A11抗原基因作为 MHC(主要组织相容性复合物)I类分子,并且HLA-A11抗原在受试者或患者 的细胞中作为HLA抗原表达。类似地，本文所用的短语“受试者(或患者)的 HLA抗原是HLA-A33”，“受试者(或患者)的HLA抗原是HLA-A03”，以及“受 试者(或患者)的HLA抗原是HLA-A01”分别指受试者或患者具有纯合或杂合 的HLA-A33抗原基因作为MHC(主要组织相容性复合物)I类分子，且 HLA-A33抗原在受试者或患者的细胞中作为HLA抗原表达；受试者或患者具 有纯合或杂合的HLA-A03抗原基因作为MHC(主要组织相容性复合物)I类分 子，且HLA-A03抗原在受试者或患者的细胞中作为HLA抗原表达；受试者或 患者具有纯合或杂合的HLA-A01抗原基因作为MHC(组织相容性复合物)I类 分子，且HLA-A01抗原在受试者或患者的细胞中作为HLA抗原表达。
只要本发明的方法和组合物在癌症“治疗”的语境中是有用的，则当其 实现临床优势时，该治疗被认为是“有效的”，例如，在受试者中减少癌症 的尺寸，扩散或转移能力，延缓癌症进展，减轻癌症的临床症状，延长存活 期，抑制术后复发。当预防性地施用治疗时，“有效”是指治疗延迟或防止 癌症形成，或防止或减轻癌症的临床症状。有效性是相对于任何公知的用于 诊断或治疗特定肿瘤类型的方法来确定的。
只要本发明的方法和组合物用于癌症“预防(防范)”的语境中，本文中 术语“预防(防范)”包括减轻与癌症相关的死亡率或发病率的负担的任何工 作。预防(防范)可以在“初级，二级和三级预防(防范)水平”进行。尽管一 级预防(防范)避免疾病的发展，在二级和三级水平的预防(防范)包括预防(防 范)疾病进展和症状的出现，以及旨在通过恢复功能和减少疾病相关并发症 来降低现有疾病的不良影响。或者，预防(防范)可以包括减轻特定病症的严 重性，例如旨在减少肿瘤生长和转移的广泛的预防性治疗。
在本发明的语境中，癌症的治疗和/或预防(防范)和/或其手术后复发预防 (防范)包括任一事件，例如抑制癌细胞增殖，肿瘤退化或消退，诱导癌症发 展的缓解和抑制，肿瘤消退，以及减少或抑制转移，抑制癌症的术后复发和 延长存活期。癌症的有效治疗和/或预防(防范)降低死亡率，改善患有癌症的 个体的预后，降低肿瘤标志物的血液水平，并减轻与癌症相关的可检测的症 状。例如，症状的缓解或改善构成有效的治疗和/或预防(防范)，并包括其中 症状稳定或减轻10％,20％,30％或更多的病患。
在本发明的语境中，术语“抗体”是指与指定的蛋白质或其肽特异性反 应的免疫球蛋白及其片段。抗体可以包括人抗体，灵长类化抗体，嵌合抗体， 双特异性抗体，人源化抗体，与其他蛋白或放射性标记融合的抗体，和抗体 片段。此外，本文中的“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体涵盖完整单 克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体，由两个或多个完整抗体形成的多特 异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展示所需的生物学活性。 “抗体”可以是所有类别的抗体(例如IgA，IgD，IgE，IgG和IgM)。
除非另有说明，本文使用的技术术语和科学术语都具有与本发明所属领 域的普通技术人员通常理解的术语相同的含义。
II.肽
HLA-A11和HLA-A33是亚洲人常见的等位基因(Sette A,Sidney J.,Immunogenetics 1999,50:201-12)，且HLA-A03和HLA-A01是在高加索人中 常见的等位基因(Cao等人.,Hum Immunol 2001；62(9):1009-30)。因此，对于 亚洲人或高加索人的大量群体，治疗表达KOC1的癌症的有效方法可以通过 提供限制于HLA-A11，HLA-A33，HLA-A03或HLA-A01的KOC1衍生的CTL 诱导肽来提供。因此本发明提供了KOC1衍生肽，其能够以HLA-A11-, HLA-A33-,HLA-A03-,或HLA-A01限制性方式诱导CTLs。
本发明的肽是KOC1衍生肽，其能够以HLA-A11-,HLA-A33-,HLA-A03-, 或HLA-A01限制性方式诱导CTLs。能够以HLA-A11限制性方式诱导CTLs的 肽包括具有选自SEQ IDNOs:5,28,30和32的氨基酸序列的肽。类似地，能 够以HLA-A33限制性方式诱导CTLs的肽包括具有选自SEQ ID NOs:61,62, 63,64,67,74,77,52,79,80和85的氨基酸序列的肽。类似地，能够以HLA-A03 限制性方式诱导CTLs的肽包括具有选自SEQ ID NOs:27,30和52的氨基酸序 列的肽。类似地，能够以HLA-A01限制性方式诱导CTLs的肽包括具有选自 SEQ IDNOs:86,87,90,92,46,95和41的氨基酸序列的肽。
具有对这些肽特异的细胞毒性活性的CTLs可以通过用这些肽冲击 (pulsed)的树突细胞(DC)对T细胞体外刺激来建立。建立的CTLs显示出针 对用每种肽冲击的靶细胞的特异性细胞毒性活性。
KOC1基因在癌症细胞中过表达，例如在如膀胱癌，宫颈癌，胆管细胞 癌，慢性骨髓性白血病(CML)，结肠癌，直肠癌，食管癌，弥漫性胃癌，非 小细胞肺癌，小细胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，卵巢癌，肾癌，头颈癌，软组 织肿瘤，睾丸癌等中的癌细胞中，但在大多数正常器官中不表达。因此它是 免疫治疗的极好的靶标。因此，本发明的肽可以适当地用于癌症免疫治疗。 优选的肽是九肽(由9个氨基酸残基组成的肽)或十肽(由10个氨基酸残基组成的肽)，且更为优选的是由选自以下氨基酸序列组成的组的肽：SEQ ID NOs: 5,28,30,32,61,62,63,64,67,74,77,52,79,80,85,27,86,87,90,92,46,95, 和41。例如具有SEQ IDNO:32的氨基酸序列的肽适于诱导显示针对表达 HLA-A11和KOC1细胞的特异细胞毒性活性的CTL，并可以适合用于 HLA-A11阳性患者的癌症免疫治疗。此外，例如，具有选自SEQ IDNO：64, 67和77的氨基酸序列的肽适于诱导显示针对表达HLA-A33和KOC1细胞的特 异细胞毒性活性的CTL，并可以适合用于HLA-A33阳性患者的癌症免疫治 疗。另外，例如，具有SEQID NO:27的氨基酸序列的肽适于诱导显示针对 表达HLA-A03和KOC1细胞的特异细胞毒性活性的CTL，并可以适合用于 HLA-A03阳性患者的癌症免疫治疗。另外，例如，具有SEQ IDNO:86的氨 基酸序列的肽适于诱导显示针对表达HLA-A01和KOC1细胞的特异细胞毒性 活性的CTL，并可以适合用于HLA-A01阳性患者的癌症免疫治疗。在更优选 的实施方案中，本发明的肽是选自由以下的氨基酸序列组成的肽：SEQ ID NOs:32,64,67,77,27和86。
对于本发明的肽，可以值得另外的氨基酸残基以附加(adjoin)本发明的肽 的氨基酸序列，只要得到的肽保留原始肽的CTL诱导能力即可。另外的氨基 酸残基可以由任何类型的氨基酸组成，只要它们不损害原始肽的CTL诱导能 力即可。因此，本发明的肽包含具有CTL诱导能力的肽，其包含选自以下的 氨基酸序列：SEQ ID NOs:5,28,30,32,61,62,63,64,67,74,77,52,79,80, 85,27,86,87,90,92,46,95,和41。此类肽例如少于约40个氨基酸，在许多情 况下少于约20个氨基酸，并通常少于约15个氨基酸。因此，如果原始肽是九肽，则本发明的肽包含10个氨基酸长或11-40个氨基酸长的肽，其通过将另外 的氨基酸附加至所述肽产生。此外，如果原始肽是十肽，则本发明的肽包含 11-40个氨基酸长的肽，其通过将另外的氨基酸附加至所述肽产生。此类肽可 以是(例如)11-20个氨基酸长的肽或11-15个氨基酸长的肽。另外的氨基酸残 基的优选实例为在KOC1的全长氨基酸序列中邻接本发明的肽的氨基酸序列 的氨基酸残基(例如SEQ ID NO:110)。因此，本发明的肽包括含有选自以 下氨基酸序列的肽：SEQ ID NOs:5,28,30,32,61,62,63,64,67,74,77,52, 79,80,85,27,86,87,90,92,46,95,和41,且其中所述肽是KOC1的肽片段并 具有CTL诱导活性。
一般而言，某些肽中一个，两个或更多个氨基酸的修饰不会影响肽的功 能，或在有些情况下甚至会增强原始蛋白质的期望功能。事实上，已知经过 修饰的肽(即由与原始参照序列相比其中一个、两个或数个氨基酸残基修饰 (即取代、添加、缺失和/或插入)的氨基酸序列构成的肽)保留原始肽的生物学 活性(Mark等人.,Proc Natl Acad Sci USA1984,81:5662-6；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982,10:6487-500；Dalbadie-McFarland等人.,Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13)。因此，在一个实施方案中，本发明的肽可 以是包含以下氨基酸序列的肽，其中选自SEQ ID NOs:5,28,30,32,61,62,63,64,67,74,77,52,79,80,85,27,86,87,90,92,46,95和41的氨基酸序列的 一个，两个或数个氨基酸残基被取代，缺失，插入和/或添加，并具有CTL 诱导活性。
本领域技术人员可以认识到对氨基酸序列的个别取代(其改变了单个氨 基酸或少数百分比的氨基酸)倾向于导致原始氨基酸侧链的特性的保留。其 通常被称作“保守取代”或“保守修饰”；且通过“保守取代”或“保守修 饰”对蛋白质的修饰可以导致修饰的蛋白具有与原蛋白相似的功能。提供功 能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域公知的。功能上相似的氨基酸侧链 特征的例子包括例如疏水性氨基酸(A,I,L,M,F,P,W,Y,V)、亲水性氨基酸(R, D,N,C,E,Q,G,H,K,S,T)、和具有以下共同官能团或特征的侧链：脂肪族 侧链(G,A,V,L,I,P)；含羟基侧链(S,T,Y)；含硫原子侧链(C,M)；含羧酸和 酰胺侧链(D,N,E,Q)；含碱侧链(R,K,H)；和含芳香侧链(H,F,Y,W)。另外， 以下八组各自含有本领域认可互为保守替代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton,Proteins 1984)。
此类保守修饰肽也被包含在本发明的肽中。然而，本发明的肽不限于此， 并可包括非保守修饰，只要该肽保留原始肽的CTL诱导能力。另外，经过修 饰的肽不排除衍生自KOC1的多态性变体、种间同源物、和等位基因的可诱 导CTL的肽。
只要肽保留原始肽的CTL诱导能力，可以修饰(即取代，缺失，插入和/ 或添加)少数(例如，1个、2个或数个)或小百分比的氨基酸。这里，术语“数 个”意指5个以下的氨基酸，如4个或3个或更少。被修饰的氨基酸的百分比 优选为20％或更少，更优选15％或更少，进一步更优选10％或更少，例如1至 5％。
当在癌症免疫疗法的语境中使用时，本发明的肽呈递在细胞或外来体的 表面上，优选作为与HLA抗原的复合物。因此，优选的是本发明的肽拥有对 HLA抗原的高结合亲和力。为此目的，可以对肽通过取代、缺失、插入和/ 或添加氨基酸残基来修饰以产生具有改善结合亲和力的修饰肽。由于通过结 合HLA抗原而被展示的肽的序列规律是已知的(Falk,等人,Immunogenetics 1994 40 232-41；Chujoh,等人,Tissue Antigens 1998:52:501-9；Takiguchi,等 人,Tissue Antigens 2000:55:296-302.)，可将基于此类规律的修饰引入本发 明的肽。
例如，在具有对HLA I类分子具有结合亲和力的肽中，自N端起的第二 个氨基酸和C末端氨基酸通常是参与结合至HLA I类的锚定残基(Rammensee HG,等人,Immunogenetics.1995；41(4):178-228.)。例如，对于HLA-A11，苏 氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸作为N末端的第二个 氨基酸，赖氨酸和精氨酸作为C末端氨基酸被认为是对HLA-A11具有高结合 亲和力的锚定残基(Falk,等人,Immunogenetics 1994,40:232-41；Chujoh,等 人,Tissue Antigens 1998:52:501-9)。此外，在HLA-A11中，在N末端的3和7 位有辅助锚定残基；并且已知亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，异亮氨酸和丙氨 酸优选作为从N末端开始的第三个氨基酸，且亮氨酸，异亮氨酸，酪氨酸， 缬氨酸和苯丙氨酸优选作为从N末端开始的第七个氨基酸(Falk,等人, Immunogenetics 1994,40:232-41；Chujoh,等人,Tissue Antigens 1998:52: 501-9)。因此，为了维持或增强HLA-A11结合亲和力，有可能期望用苏氨酸， 缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸或酪氨酸取代自N端起的第二个氨基 酸，和/或用赖氨酸或精氨酸取代C末端的氨基酸。此外，还可能需要用亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，异亮氨酸或丙氨酸取代自N端起的第三个氨基酸， 和/或用亮氨酸，异亮氨酸，酪氨酸，缬氨酸或苯丙氨酸取代自N端起的第七 个氨基酸。因此，具有CTL诱导能力的包含选自SEQ ID NOs:5,28,30和32 的氨基酸序列的肽包括在本发明的肽中：在选自自N端起的第二个氨基酸被 取代为苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸或酪氨酸；自N端起 的第三个氨基酸被取代为亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，异亮氨酸或丙氨酸； 自N端起的第七个氨基酸被取代为亮氨酸，异亮氨酸，酪氨酸，缬氨酸或苯 丙氨酸；和/或C末端氨基酸被取代为赖氨酸或精氨酸。在优选的实施方案中， 本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸序列组成的肽，其中在选自 SEQ ID NOs:5,28,30和32中的氨基酸序列中，自N端起的第二个氨基酸被取 代为苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸或酪氨酸；自N端起的 第三个氨基酸被取代为亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，异亮氨酸或丙氨酸；自 N端起的第七个氨基酸被取代为亮氨酸，异亮氨酸，酪氨酸，缬氨酸或苯丙 氨酸；和/或C末端氨基酸被取代为赖氨酸或精氨酸。即，本发明的肽包括具 有CTL诱导能力的包含氨基酸序列的肽，其中将选自以下(a)至(d)的一个或多 个取代引入选自SEQ ID NOs:5,28,30和32的氨基酸序列中：
(a)自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨 酸，苯丙氨酸，或酪氨酸；
(b)自N端起的第三个氨基酸被取代为亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，异亮 氨酸或丙氨酸；
(c)自N端起的第七个氨基酸被取代为亮氨酸，异亮氨酸，酪氨酸，缬氨 酸或苯丙氨酸；和
(d)C末端氨基酸被取代为赖氨酸或精氨酸。
在优选的实施方式中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸 组成的肽，其中将选自以上(a)至(d)的一个或多个取代引入选自SEQ ID NOs: 5,28,30和32的氨基酸序列中。在本发明中，优选的取代数目是选自以上(a) 至(d)的1,2,3或4个取代。
本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的包含氨基酸序列的肽，其中在选 自SEQ IDNOs:5,28,30和32的氨基酸序列中，自N端起的第二个氨基酸被取 代为苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸或酪氨酸，和/或C末端 氨基酸被取代为赖氨酸或精氨酸。优选地，本发明的肽可以是具有CTL诱导 能力的由氨基酸序列组成的肽，其中在选自SEQ IDNOs:5,28,30和32的氨 基酸序列中，自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸， 亮氨酸，苯丙氨酸或酪氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为赖氨酸或精氨酸。 即，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的包含氨基酸序列肽，其中将选自 以下(a)和(b)的一个或多个取代引入选自SEQ ID NOs:5,28,30和32的氨基酸 序列中：
(a)自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨 酸，苯丙氨酸，或酪氨酸；和
(b)C末端氨基酸被取代为赖氨酸或精氨酸。
在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸 序列组成的肽，其中将选自以上(a)至(b)的一个或多个取代引入选自SEQ ID NOs:5,28,30和32的氨基酸序列中。在更优选的实施方案中，自N端起的第 二个氨基酸被苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，或亮氨酸取代。
在HLA-A33中，对于自N端起的第二个氨基酸的苯丙氨酸，酪氨酸，丙 氨酸，异亮氨酸，亮氨酸和缬氨酸，以及对于C末端氨基酸的赖氨酸和精氨 酸已知是对HLA-A33具有高结合亲和力的锚定残基(Falk,等人, Immunogenetics 1994,40:232-41；Takiguchi,等人,Tissue Antigens 2000,55: 296-302)。此外，在HLA-A33中，还已知自N端起的第一个氨基酸残基用作 锚定残基，并且已知天冬氨酸和谷氨酸优选作为自N端起的第一个氨基酸(Falk,等人,Immunogenetics 1994,40:232-41；Takiguchi,等人,Tissue Antigens 2000:55:296-302)。因此，为了维持或增强HLA-A33结合亲和力， 有可能期望用天冬氨酸或谷氨酸取代自N端起的第一个氨基酸，用苯丙氨酸， 酪氨酸，丙氨酸，异亮氨酸，亮氨酸或缬氨酸取代自N端起的第二个氨基酸， 和/或用赖氨酸或精氨酸取代C末端氨基酸。因此具有CTL诱导能力的包含以 下氨基酸序列的肽包括在本发明的肽中：所述肽的氨基酸序列选自SEQID NO：61,62,63,64,67,74,77,52,79,80和85，自N端起的第一个氨基酸被取 代为天冬氨酸或谷氨酸，自N端起的第二个氨基酸被取代为苯丙氨酸，酪氨 酸，丙氨酸，异亮氨酸，亮氨酸或缬氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为赖氨 酸或精氨酸。在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的 由氨基酸组成的肽，其中在选自SEQ ID NOs:61,62,63,64,67,74,77,52,79, 80和85的氨基酸序列中，自N端起的第一个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨 酸，自N端起的第二个氨基酸被取代为苯丙氨酸，酪氨酸，丙氨酸，异亮氨 酸，亮氨酸或缬氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为赖氨酸或精氨酸。即，本 发明的肽包括具有CTL诱导的能力的包含氨基酸序列的肽，其中将选自以下 (a)至(c)的一个或多个取代引入选自SEQ ID NOs:61,62,63,64,67,74,77,52, 79,80和85的氨基酸序列中：
(a)自N端起的第一个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸；
(b)自N端起的第二个氨基酸被取代为苯丙氨酸，酪氨酸，丙氨酸，异亮 氨酸，亮氨酸，或缬氨酸；和
(c)C末端氨基酸被取代为精氨酸或赖氨酸。
在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸 序列组成的肽，其中将选自以上(a)至(c)的一个或多个取代引入选自SEQ ID NOs:61,62,63,64,67,74,77,52,79,80和85的氨基酸序列中。在本发明中， 优选的取代数目是选自以上(a)至(c)的1,2或3个取代。
此外，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的包含氨基酸序列的肽，其 中在选自SEQ ID NOs:61,62,63,64,67,74,77,52,79,80和85的氨基酸序列 中，自N端起的第二个氨基酸被取代为苯丙氨酸，酪氨酸，丙氨酸，异亮氨 酸，亮氨酸或缬氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为精氨酸或赖氨酸。优选地， 本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸序列组成的肽，其中在选自SEQ ID NOs:61,62,63,64,67,74,77,52,79,80和85的氨基酸序列中，自N端 起的第二个氨基酸被取代为苯丙氨酸，酪氨酸，丙氨酸，异亮氨酸，亮氨酸 或缬氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为精氨酸或赖氨酸。即，本发明的肽可 以是具有CTL诱导能力的包含氨基酸序列的肽，其中将选自以下(a)和(b)的一 个或多个取代引入选自SEQ IDNOs:61,62,63,64,67,74,77,52,79,80和85 的氨基酸序列中：
(a)自N端起的第二个氨基酸被取代为苯丙氨酸，酪氨酸，丙氨酸，异亮 氨酸，亮氨酸或缬氨酸；和
(b)C末端氨基酸被取代为精氨酸或赖氨酸。
在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸 序列组成的肽，其中将选自以上(a)和(b)的一个或多个取代引入选自SEQ ID NOs:61,62,63,64,67,74,77,52,79,80和85的氨基酸序列中。在一个更优选 的实施方案中，自N端起的第二个氨基酸被取代为苯丙氨酸或酪氨酸。
在HLA-A03中，对于自N端起的第二个氨基酸的丙氨酸，异亮氨酸，丝 氨酸和苏氨酸，对于C末端氨基酸的精氨酸，赖氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸已 知是对HLA-A03具有高结合亲和力的锚定残基(Kubo RT.等人,J Immunol. 1994Apr 15；152(8):3913-24；Sidney J等人,Hum Immunol.1996Feb；45(2): 79-93；Gambacorti-Passerini C等人,Clin CancerRes.1997May；3(5):675-83)。 因此，为了维持或增强HLA-A03结合亲和力，有可能优选用亮氨酸，甲硫氨 酸，缬氨酸，丙氨酸，异亮氨酸，丝氨酸或苏氨酸取代自N端起的第二个氨 基酸，和/或用精氨酸，赖氨酸，酪氨酸或苯丙氨酸取代C末端氨基酸。因此， 具有CTL诱导能力的包含以下氨基酸序列的肽包括在本发明的肽中：其中在 选自SEQ ID NOs:27,30,和52的氨基酸序列中，自N端起的第二个氨基酸被 取代为亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丙氨酸，异亮氨酸，丝氨酸或苏氨酸， 和/或C-末端氨基酸被取代为精氨酸，赖氨酸，酪氨酸或苯丙氨酸。在优选的 实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸组成的肽，其 中在选自SEQ ID NOs:27,30和52的氨基酸序列中，自N端起的第二个氨基酸 被取代为亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丙氨酸，异亮氨酸，丝氨酸或苏氨酸， 和/或C-末端氨基酸被取代为精氨酸，赖氨酸，酪氨酸或苯丙氨酸。即，本发 明的肽包括具有CTL诱导能力的包含氨基酸序列的肽，其中将选自以下(a) 和(b)的一个或多个取代引入选自SEQ ID NOs:27,30和52的氨基酸序列中：
(a)自N端起的第二个氨基酸被取代为亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丙氨 酸，异亮氨酸，丝氨酸或苏氨酸；和
(b)C末端氨基酸被取代为精氨酸，赖氨酸，酪氨酸或苯丙氨酸。
在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸 序列组成的肽，其中将选自以上(a)和(b)的一个或多个取代引入选自SEQ ID NOs:27,30和52的氨基酸序列中。在一个更优选的实施方案中，自N端起的 第二个氨基酸被取代为亮氨酸，甲硫氨酸或缬氨酸。在本发明中，优选的取 代数目是选自以上(a)和(b)的1或2个取代。
在HLA-A01中，对于自N端起的第三个氨基酸的天冬氨酸和谷氨酸，和 对于C末端氨基酸的酪氨酸已知是对HLA-A01具有高结合亲和力的锚定残 基。此外，已知在HLA-A01的自N端起的2位有辅助性锚定残基，以及已知 苏氨酸和丝氨酸优选作为自N端起的第二个氨基酸(Kubo,R.T Journal of Immunology 1994,152:3913；Gambacorti-Passerini,C.Clinical Cancer Research 1997,3:675-83；Falk,K.Immunogenetics 1994,40:238-41)。因此， 为了维持或增强HLA-A01结合亲和力，有可能需要用天冬氨酸或谷氨酸取代 自N端起的第三个氨基酸，和/或用酪氨酸取代C-末端氨基酸。另一种可能性 是需要用苏氨酸或丝氨酸取代自N端起的第二个氨基酸。因此，具有CTL诱 导能力的包含以下氨基酸序列的肽包括在本发明的肽中：其中在选自SEQ ID 86,87,90,92,46,95和41的氨基酸序列中，自N端起的第二个氨基酸被取代为 苏氨酸或丝氨酸，自N端起的第三个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸，和/ 或C末端氨基酸被取代为酪氨酸。在优选的实施方案中，本发明的肽可以是 具有CTL诱导能力的由氨基酸序列组成的肽，其中在选自SEQ ID NOs:86,87, 90,92,46,95和41的氨基酸序列中，自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸 或丝氨酸，自N端起的第三个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸，和/或C末 端氨基酸被取代为酪氨酸。即，本发明的肽包括具有CTL诱导能力的包含氨 基酸序列的肽，其中将选自以下(a)至(c)的一个或多个取代引入选自SEQ ID NOs:86,87,90,92,46,95和41的氨基酸序列中：
(a)自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸或丝氨酸；
(b)自N端起的第三个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸；和
(c)C末端氨基酸被取代为酪氨酸。
在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸 序列组成的肽，其中将选自以上(a)至(c)的一个或多个取代引入选自SEQ ID NOs:86,87,90,92,46,95和41的氨基酸序列中。在本发明中，优选的取代数 目是选自以上(a)至(c)的1,2或3个取代。
此外，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的包含氨基酸序列的肽，其 中在选自SEQ ID NOs:86,87,90,92,46,95和41的氨基酸序列中，自N端起的 第三个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为酪氨 酸。优选地，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸序列组成的肽， 其中在SEQ ID NOs:86,87,90,92,46,95和41中，自N端起的第三个氨基酸被 取代为天冬氨酸或谷氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为酪氨酸。即，本发明 的肽包括具有CTL诱导能力的包含氨基酸序列的肽，其中将选自以下(a)和(b) 的一个或多个取代引入选自SEQ ID NOs:86,87,90,92,46,95和41的氨基酸 序列中：
(a)自N端起的第三个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸；和
(b)C末端氨基酸被取代为酪氨酸。
在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸 序列组成的肽，其中将选自以上(a)和(b)的一个或多个取代引入选自SEQ ID NOs:86,87,90,92,46,95和41的氨基酸序列中。
不仅可以在锚定位点处引入氨基酸取代，而且可以在肽的潜在T细胞受 体(TCR)识别位置处引入取代。数项研究已证明了具有氨基酸取代的肽可等 同于或好于原来功能的功能，例如CAP1、p53(264-272)、Her-2/neu(369-377)或gp100 (209-217)(Zaremba等人.CancerRes.57,4570-4577,1997,T.K.Hoffmann等人. J Immunol.(2002)；168(3):1338-47.,S.O.Dionne等人.Cancer Immunol immunother.(2003)52:199-206及S.O.Dionne等人.Cancer Immunology, Immunotherapy(2004)53,307-314)。
本发明还考虑也可以向本发明的肽(例如,由选自以下氨基酸序列组成 的肽：SEQID NOs:5,28,30,32,61,62,63,64,67,74,77,52,79,80,85,27, 86,87,90,92,46,95和41)的N末端和/或C末端添加1个、2个或数个氨基酸。 此类保留CTL诱导能力的修饰肽也包括在本发明中。例如，当肽与APC接触 时(所述肽中一个，两个或数个氨基酸被添加到选自由下组序列组成的肽的N 末端和/或C末端：SEQ ID NOs:32,64,67,77,27和86)，其掺入APC中并加工 成由选自SEQ ID NOs:32,64,67,77,27和86的氨基酸序列组成的肽。然后其 可以通过经由抗原呈递途径呈递在APC的细胞表面上诱导CTL。更具体地， 本发明的肽可以是其中在N末端和C末端的任一个或两者上添加一个，两个 或数个氨基酸的肽。
然而，当肽的氨基酸序列与具有不同功能的内源或外源蛋白质的氨基酸 序列的一部分相同时，可以诱导针对特定物质的自身免疫性疾病和/或过敏性 症状等副作用。因此，优选使用可用的数据库进行同源性搜索，以避免肽的 氨基酸序列与另一种蛋白质的氨基酸序列匹配的情况。当根据同源性搜索清 楚了不存在与目标肽相比仅有1个或2个氨基酸差异的肽时，可以修饰目标肽 以提高其与HLA抗原的结合亲和力，和/或提高其CTL诱导能力，而没有任何 发生此类副作用的危险。
预测其中本发明的肽的一个，两个或数个氨基酸被修饰的肽能够保留原 始肽的CTL诱导能力；然而优选验证修饰肽的CTL诱导能力。这里，“具有 CTL诱导能力(CTL可诱导性(CTL inducibility))的肽”指肽，其通过用肽刺激 的APC诱导CTLs。“CTL诱导”包括诱导分化成CTL，诱导CTL激活，诱导 CTL增殖，诱导CTL的细胞毒活性，诱导CTL介导的靶细胞溶解，和诱导CTL 的IFN-gamma产生增加。
CTL诱导能力的可通过如下来确认：用肽诱导并刺激保留HLA抗原的 APCs(例如B淋巴细胞，巨噬细胞和树突细胞)并将其与CD8阳性细胞混合； 然后测量由CTL针对靶细胞所释放的IFN-gamma。对于APCs，可以优选使用 人外周血单核细胞来源的树突细胞。作为反应系统，可使用已经制成以表达 HLA抗原的转基因动物。或者，例如可以用51Cr或此类放射性标记靶细胞， 并且可以自靶细胞释放的放射性计算肽-诱导的CTLs的细胞毒性活性。或者， 在肽刺激的APCs的存在下，可能通过以下评估CTL诱导能力：测量由CTLs 生成和释放的IFN-gamma，并使用抗IFN-gamma单克隆抗体显现培养基上的 抑制区。
除上述的修饰之外，还可将本发明的肽连接至其它肽，只要所得的连接 肽保留CTL诱导能力。与本发明的肽连接的适当肽的例子包括TAA衍生的 CTL诱导肽。此外，本发明的肽也可以彼此连接。用于连接肽的合适的接头 是本领域已知的，例如可以使用接头，如AAY(P.M.Daftarian等人,J Trans Med 2007,5:26),AAA,NKRK(SEQ ID NO:111)(R.P.M.Sutmuller等人,J Immunol.2000,165:7308-15)，或K(S.Ota等人,Can Res.62,1471-6,K.S. Kawamura等人,J Immunol.2002,168:5709-15)。肽可以以各种排列连接(例如，链状，重复等)，并且还可以连接三个或更多个肽。
本发明的肽还可连接至其它物质，只要所得的连接肽保留CTL诱导能 力。与本发明的肽连接的适当物质的例子包括，例如，肽、脂质、糖或糖链、 乙酰基，和天然的或合成的聚合物。本发明的肽可以进行如下修饰：糖基化、 侧链氧化、或磷酸化等等，只要不破坏它们的CTL诱导能力。还可以实施此 种类型的修饰以赋予额外的功能(例如，靶向功能和递送功能)或稳定所述肽。
例如，为了提高肽的体内稳定性，本领域已知引入D-氨基酸、氨基酸模 拟物或非天然氨基酸；此构思也可适用于本发明的肽。肽的稳定性可以以多 种方式测定。例如，可以通过使用肽酶以及各种生物介质例如人血浆和血清 来测试稳定性(参见例如Verhoef等人,Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11:291-302)。
此外，如上文所述，在上述取代、缺失、插入和/或添加了1个、2个或数 个氨基酸残基的修饰肽中，可以筛选或选择与原始肽相比活性相同或更高 者。因此，本发明还提供由于筛选或选择与原始肽相比活性相同或更高的修 饰肽的方法。具体地，本发明提供了筛选具有CTL诱导能力的肽的方法，其 中所述方法包括以下步骤：
(a)产生由对原始氨基酸序列通过取代、缺失、插入和/或添加一个、两 个或数个氨基酸残基而修饰得到的氨基酸序列组成的候选序列，其中所述原 始氨基酸序列选自SEQID NOs:5,28,30,32,61,62,63,64,67,74,77,52,79, 80,85,27,86,87,90,92,46,95和41的氨基酸序列组成；
(b)从在(a)中产生的候选序列中选择与KOC1之外的任何已知人基因产 物的肽均无显著同源性(或序列同源性)的候选序列；
(c)使由(b)中选择的候选序列组成的肽与APCs接触；
(d)使(c)的APCs与CD8阳性T细胞接触；和
(e)选择具有与由原始氨基酸序列组成的肽相等或更高的CTL诱导能力 的肽。
本文中，本发明的肽也被描述为“KOC1肽”或“KOC1多肽”。
III.本发明的肽的制备
本发明的肽可使用公知技术来制备。例如，可以使用重组DNA技术或化 学合成来制备本发明的肽。本发明的肽可独立地合成，或合成为包括两个或 更多个肽的较长多肽。本发明的肽可以在使用重组DNA技术在宿主细胞中产 生它们或者在化学合成它们之后从宿主细胞或合成反应产物分离。即，可以 纯化或分离本发明的肽，以使其基本上不含其它宿主细胞蛋白质及其片段， 或任何其它化学物质。
本发明的肽可含有修饰，诸如糖基化、侧链氧化、或磷酸化等，前提是 该修饰不破坏原始肽的生物学活性。其他示例性的修饰包括掺入一种或多种 D-氨基酸或其他可用的氨基酸模拟物，以便例如增加肽的血清半寿期。
可以根据选定的氨基酸序列，通过化学合成来获得本发明的肽。可以适 合于合成的常规肽合成方法的例子包括以下文献中描述的方法：
(i)Peptide Synthesis,Interscience,New York,1966；
(ii)The Proteins,Vol.2,Academic Press,New York,1976；
(iii)“Peptide Synthesis”(日文),Maruzen Co.,1975；
(iv)“Basics and Experiment of Peptide Synthesis”(in Japanese),MaruzenCo.,1985；
(v)“Development of Pharmaceuticals”(日文),Continued Vol.14(peptidesynthesis),Hirokawa,1991；
(vi)WO99/67288；和
(vii)Barany G.&Merrifield R.B.,Peptides Vol.2,Solid Phase PeptideSynthesis,Academic Press,New York,1980,100-118。
或者，可适用任何已知的遗传工程肽生产方法来获得本发明的肽(例如 MorrisonJ,J Bacteriology 1977,132:349-51；Clark-Curtiss&Curtiss,Methods in Enzymology(eds.Wu等人)1983,101:347-62)。例如，首先，制备包含处于 可表达形式(例如处于相当于启动子序列的调节序列下游)的编码目标肽的多 核苷酸的合适载体，并转化入合适的宿主细胞。本发明还提供了此类载体和 宿主细胞。然后培养宿主细胞以生成感兴趣的肽。也可以采用体外翻译系统 在体外生产本发明的肽。
IV.多核苷酸
本发明还提供编码任何本发明肽的多核苷酸。这些包括衍生自天然存在 的KOC1基因(例如GenBank登录号NM_006547(SEQ ID NO:109))以及具有 它们的保守修饰的核苷酸序列的多核苷酸。本文中，短语“保守修饰的核苷 酸序列”指编码相同或实质上相同的氨基酸序列的序列。由于遗传密码的简 并性，大量的功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、 GCC、GCG、和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子规定为丙氨酸 的任何位置处，该密码子可改变成任何相应所述密码子，而不改变所编码的 多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，是保守修饰变异的一种。本文中编码 肽的每一种核酸序列也描述该核酸的每一种可能的沉默变异。本领域普通技 术人员会认识到，核酸中的每一个密码子(AUG和TGG除外，AUG在正常情 况下是甲硫氨酸的唯一密码子，而TGG在正常情况下是色氨酸的唯一密码子) 都可以被修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码肽的核酸的每一种沉默 变异在每个公开的序列中隐含地描述。
本发明的多核苷酸可以由DNA、RNA、及其衍生物构成。DNA由诸如A， T，C和G的碱基适当地组成，并且在RNA中T被U取代。
本发明的多核苷酸可编码多个本发明肽，其中有或无居间氨基酸序列(intervening amino acid sequence)。例如，居间氨基酸序列可提供多核苷酸的 或所翻译的肽的切割位点(例如酶识别序列)。此外，多核苷酸可以包括编码 本发明的肽的编码序列的任何额外的序列。例如，多核苷酸可以是包括表达 肽所需要的调节序列的重组多核苷酸，或者可以是具有标志基因等等的表达 载体(如质粒)。一般而言，此类重组多核苷酸可通过常规重组技术操作多核 苷酸来制备，例如通过使用聚合酶和内切核酸酶。
重组和化学合成技术都可用来生成本发明的多核苷酸。例如，可以通过 插入在转染入感受态细胞后能表达的适宜载体来生成本发明的多核苷酸。或 者，可使用PCR技术或在合适宿主中表达来扩增多核苷酸(参见例如 Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989)。或者，可使用固相技术来合成多核苷酸，如 Beaucage SL&Iyer RP,Tetrahedron 1992,48:2223-311；Matthes等人,EMBO J 1984,3:801-5中记载的。
V.外来体(exosomes)
本发明进一步提供了称作外来体的细胞内囊泡，这些外来体在它们的表 面上呈递本发明肽与HLA抗原之间形成的复合体。外来体可以通过，例如在JPH11-510507和WO99/03499中详细描述的方法来制备，并可以用从作为治 疗和/或预防(防范)对象的患者获得的APC制备。本发明的外来体可以作为疫 苗以与本发明的肽相似的方式进行接种。
上述复合体中包含的HLA抗原的类型必须与需要治疗和/或预防(防范) 的受试者的类型匹配。例如，在亚洲人群中，HLA-A11(例如HLA-A*1101) 和HLA-A33(例如HLA-A*3303)是在亚洲人群中广泛和普遍见到的等位基 因，并且认为这些HLA抗原类型适合在亚洲患者中治疗。此外，HLA-A03(例 如HLA-A*0301)和HLA-A01(例如HLA-A*0101)是在白种人群体中广泛和 普遍见到的等位基因，并且这些HLA抗原类型被认为适合在白种人患者中治疗。典型地，在临床上，通过预先研究需要治疗的患者的HLA抗原类型，可 以选择合适的肽，其对特定HLA抗原具有高水平的结合亲和力，或者通过由 特异性HLA抗原介导的抗原呈递的CTL诱导能力。
本发明的外来体在其表面上呈递本发明的肽与HLA-A11，HLA-A33， HLA-A03或HLA-A01的复合物。当与本发明的肽形成复合物的HLA是 HLA-A11时，本发明的肽优选为具有选自SEQ ID NOs:5,28,30和32的氨基 酸序列的肽或其修饰的肽，并且更优选由选自SEQID NOs:5,28,30和32的 氨基酸序列组成的肽或其修饰的肽。此外，当与本发明的肽形成复合物的 HLA是HLA-A33时，本发明的肽优选是具有选自SEQ ID NOs:61,62,63,64, 67,74,77,52,79,80和85的氨基酸序列的肽或其修饰的肽，并且更优选由选 自SEQ ID NOs:61,62,63,64,67,74,77,52,79,80和85的氨基酸序列组成的 肽或其修饰的肽。此外，当与本发明的肽形成复合物的HLA是HLA-A03时， 本发明的肽优选为具有选自SEQ ID NO：27,30和52的氨基酸序列的肽或其 修饰的肽，并且更优选由选自SEQ ID NOs:27,30和52的氨基酸序列组成的 肽或其修饰肽。此外，当与本发明的肽形成复合物的HLA是HLA-A01时，本 发明的肽优选为具有选自SEQ ID NOs:86,87,90,92,46,95和41的氨基酸序 列或其修饰肽的肽，并且更优选由选自SEQ ID NOs:86,87,90,92,46,95和 41的氨基酸序列组成的肽或其修饰的肽。
VI.抗原呈递细胞(APC)
本发明还提供在其表面上呈递在HLA抗原与本发明肽之间形成的复合 物的APCs。或者本发明提供了在其表面上具有在HLA抗原与本发明肽之间 形成的复合物的APCs。本发明的APCs可以是分离的APCs。当在细胞(APCs， CTLs等)的语境中使用时，术语“分离的”意指细胞与另一类型的细胞分离。 本发明的APCs可以是从衍生自待经受治疗和/或预防(防范)的患者的APCs诱 导的APCs，并且可以作为疫苗自身或与其他药物(包括本发明的肽，外来体 或CTL)组合施用。
本发明的APCs不限于特定种类的细胞，并且包括抑制在其细胞表面呈 递蛋白质性质的抗原的细胞以通过淋巴细胞(例如树突细胞(DC)、Langerhans 细胞、巨噬细胞、B细胞、和活化的T细胞)识别。由于DC是APCs中具有最 强CTL诱导活性的代表性APC，可以优选使用DC作为本发明的APCs。本发 明中，优选的DC是源自人的分离的DC。此外，本发明的APCs不必须是均质 的，并且他们可以是具有抗原呈递功能的多种类型细胞的混合物，且可以是APCs的混合物，其中每种APC呈递不同类型的本发明的肽。
例如，可以通过从外周血单核细胞分离DC，然后在体外用本发明的肽 刺激它们来获得本发明的APCs。当对受试者施用本发明的肽时，在受试者 的身体中诱导出呈递本发明肽的APCs。因此在将本发明的肽施用至受试者 后，可以通过从受试者收集APCs来获得本发明的APCs。或者，可以通过使 从受试者收集而来的APCs与本发明的肽接触来获得本发明的APCs。
为了在受试者中诱导针对表达KOC1的癌细胞的免疫应答，本发明的 APC可以单独或者与其他药物(包括本发明的肽、外来体或CTL)组合施用给 受试者。例如，离体施用可包括下述步骤：
(a)自第一受试者收集APCs；
(b)使步骤(a)的APCs接触本发明的肽；和
(c)对第二受试者施用步骤(b)的APCs。
第一受试者和第二受试者可以是同一个体，或者可以是不同个体。当第 一受试者和第二受试者是不同个体时，优选第一受试者和第二受试者的HLA 是相同类型。获得自上述步骤(b)中的APC可以是用于癌症治疗和/或预防(防 范)的疫苗。
获得自如上描述方法的本发明的APCs具有CTL诱导能力。用于APC的语 境中的术语“CTL诱导能力(CTL可诱导性)”指APC与CD8阳性细胞接触时诱 导CTL的能力。此外，“CTL诱导能力(CTL可诱导性)”包括APC诱导CTL活 化的能力，APC诱导CTL增殖的能力，APC促进CTL介导的溶解靶细胞的能 力，和APC提高CTL介导的IFN-gamma生成的能力。由本发明的APC所诱导 的CTL是对KOC1特异性的CTL，并表现出对表达KOC1的细胞的特异性细胞 毒活性。
除了上述方法之外，可以通过在体外将编码本发明肽的多核苷酸导入至 APCs来制备本发明的APCs。待导入的多核苷酸可以是DNA或RNA的形式。 导入的方法并不特别限制，且其例子包括本领域中常规实施的各种方法，例 如脂质体转染、电穿孔和磷酸钙法。更具体的说，可以使用描述于Cancer Res 1996,56:5672-7；J Immunol 1998,161:5607-13；JExp Med 1996,184:465-72, 和JP2000-509281中的方法。通过将编码本发明的肽的多核苷酸导入APC，多 核苷酸在细胞中转录并翻译，然后产生的肽被MHC I类加工并通过呈递途径以将本发明的肽呈递在APC的细胞表面上。
在优选的实施方案中，本发明的APC在其细胞表面上呈递本发明的肽和 以下形成的复合物：HLA-A11(更优选地HLA-A*1101),HLA-A33(更优选地 HLA-A*3303),HLA-A03(更优选地HLA-A*0301)或HLA-A01(更优选地 HLA-A*0101)。当与本发明的肽形成复合物的HLA是HLA-A11时，本发明的 肽优选为具有选自SEQ ID NOs:5,28,30和32的氨基酸序列的肽或其修饰的 肽，并且更优选由选自SEQ ID NOs:5,28,30和32的氨基酸序列组成的肽。 当与本发明的肽形成复合物的HLA是HLA-A33时，本发明的肽优选是具有选 自SEQ ID NOs:61,62,63,64,67,74,77,52,79,80和85的氨基酸序列的肽或 其修饰的肽，并且更优选由选自SEQ ID NOs:61,62,63,64,67,74,77,52,79, 80和85的氨基酸序列组成的肽。当与本发明的肽形成复合物的HLA是 HLA-A03时，本发明的肽优选是具有选自SEQ ID NOs:27,30和52的氨基酸 序列的肽或其修饰肽，并且更优选由选自SEQ ID NOs:27,30和52的氨基酸 序列组成的肽。当与本发明的肽形成复合物的HLA是HLA-A01时，本发明的 肽优选是具有选自SEQ ID NOs:86,87,90,92,46,95和41的氨基酸序列的肽 或其修饰肽，并且更优选由选自SEQ ID NOs:86,87,90,92,46,95和41的氨 基酸序列组成的肽。
本发明的APC优选是通过包括下述(a)或(b)的步骤的方法诱导的APC：
(a)将APC与本发明的肽接触，所述APC表达至少一种选自HLA-A11(更 优选地HLA-A*1101),HLA-A33(更优选地HLA-A*3303),HLA-A03(更优选 地HLA-A*0301)和HLA-A01(更优选地HLA-A*0101)的HLA；或
(b)将编码本发明的肽的多核苷酸导入APC，所述APC表达至少一种选 自HLA-A11(更优选地HLA-A*1101),HLA-A33(更优选地HLA-A*3303), HLA-A03(更优选地HLA-A*0301)和HLA-A01(更优选地HLA-A*0101)的 HLA。
与表达HLA-A11的APC接触的本发明的肽优选是具有选自SEQ ID NOs: 5,28,30和32的氨基酸序列的肽或其修饰的肽，并且更优选由选自SEQ ID NOs:5,28,30和32的氨基酸序列组成的肽。
与表达HLA-A33的APC接触的本发明的肽优选是具有选自SEQ ID NOs: 61,62,63,64,67,74,77,52,79,80和85的氨基酸序列的肽或其修饰的肽，并 且更优选由选自SEQ IDNOs:61,62,63,64,67,74,77,52,79,80和85的氨基 酸序列组成的肽。
与表达HLA-A03的APC接触的本发明的肽优选是具有选自SEQ ID NOs: 27,30和52的氨基酸序列的肽或其修饰的肽，并且更优选由选自SEQ ID NOs: 27,30和52的氨基酸序列组成的肽。
与表达HLA-A01的APC接触的本发明的肽优选是具有选自SEQ ID NOs: 86,87,90,92,46,95和41的氨基酸序列的肽或其修饰的肽，并且更优选由选 自SEQ ID NOs:86,87,90,92,46,95和41的氨基酸序列组成的肽。
本发明提供了本发明的肽用于制备诱导具有CTL诱导能力的APC的药 物组合物的用途。另外，本发明提供了制备诱导具有CTL诱导能力的APC的 药物组合物的方法或过程。进一步地，本发明提供了用于诱导具有CTL诱导 能力的APC的本发明的肽。
VII.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)
由本发明的肽诱导的CTL可以与本发明的肽相似的方式用作疫苗用于 在体内增强靶向表达KOC1的细胞的免疫应答。因此本发明提供了CTLs，其 通过本发明的肽诱导或活化。本发明的CTLs是靶向本发明肽的CTLs，并且 能够结合至本发明的肽和HLA抗原的复合物。CTL与所述复合物的结合是经 由存在于CTL的细胞表面的T细胞受体(TCR)介导的。本发明的CTLs可以是 分离的CTLs。优选的CTLs是分离的人源CTLs。本发明的CTLs不需要是均质的，且可以是CTLs的混合物，其各自靶向不同类型的本发明肽。
本发明的CTLs可以获得自(1)向受试者施用本发明的肽，(2)体外用本发 明的肽刺激衍生自受试者的APCs和CD8阳性T细胞，或外周血单核细胞 (PBMCs)，(3)体外将CD8阳性T细胞或PBMCs与APCs或外来体接触，所述 APCs或外来体在它们的表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物，或(4) 将包含编码每种T细胞受体(TCR)亚基的多核苷酸的载体导入CD8阳性T细 胞，所述TCR能够结合由细胞表面上HLA抗原所呈递的本发明的肽。用于上 文(2)或(3)方法的外来体和APCs可以分别通过“V.外来体”和“VI.抗原呈递 细胞(APCs)”部分中描述的方法制备，且上文(4)的方法的详情将在“VIII.T 细胞受体(TCR)”部分中描述。
本发明的CTLs可以单独施用至经受治疗和/或预防(防范)的患者，或与其 他药物(包括本发明的肽、APC或外来体)组合施用以用于调节效果的目的。 进一步地，本发明的CTLs可以是诱导自CD8阳性T细胞的CTLs，所述CD8阳 性T细胞衍生自经受施用CTLs的患者。本发明的CTLs特异性作用于呈递本发 明肽的靶细胞，例如，用于诱导本发明CTLs的相同的肽。靶细胞可以是内源 表达KOC1的细胞，如癌细胞，或用KOC1基因转染的细胞。因肽的刺激而在 细胞表面上呈递本发明肽的细胞也可成为本发明CTLs的攻击靶标。本发明的 CTL靶向的细胞优选为对于HLA-A11(更优选地HLA-A*1101),HLA-A33(更 优选地HLA-A*3303),HLA-A03(更优选地HLA-A*0301),和HLA-A01(更优 选地HLA-A*0101)中的至少一种为阳性的细胞。
在优选的实施方案中，本发明的CTLs特异性靶向表达KOC1和选自 HLA-A11(更优选地HLA-A*1101),HLA-A33(更优选地HLA-A*3303), HLA-A03(更优选地HLA-A*0301),和HLA-A01(更优选地HLA-A*0101)中 至少一种的HLA的细胞。在本发明中，被CTLs靶向的细胞可以是纯合或杂 合地具有HLA-A11，HLA-A33，HLA-A03和HLA-A01的等位基因的任一种 的细胞。
本文中，CTL“靶向”细胞指CTL对在其细胞表面上呈递HLA和本发明 肽的复合物的细胞的识别，和表现出对该细胞的细胞毒性活性。进一步地， “特异性靶向”指CTLs表现出对这些细胞的细胞毒性活性，但未显示对其他 细胞的破坏活性。在CTL的语境中使用的表述“识别细胞”指经由其TCR结 合至呈递在细胞表面的HLA和本发明的肽的复合物，并表现出对该细胞的特 异性细胞毒性活性。因此，本发明的CTLs优选为能够经由TCR结合至呈递在 细胞表面上的复合物的CTLs，所述复合物在本发明的肽和HLA-A11(更优选 地HLA-A*1101),HLA-A33(更优选地HLA-A*3303),HLA-A03(更优选地 HLA-A*0301)或HLA-A01(更优选地HLA-A*0101)之间形成。
此外，本发明的CTLs优选是通过包括以下(a)或(b)中所述步骤的方法诱 导的CTLs：
(a)体外将CD8阳性T细胞与在其表面上呈递复合物的APCs或外来体接 触，所述复合物为本发明的肽和HLA-A11(更优选地HLA-A*1101),HLA-A33 (更优选地HLA-A*3303),HLA-A03(更优选地HLA-A*0301)或HLA-A01(更 优选地HLA-A*0101)的复合物；或
(b)将包含编码每种TCR的亚基的多核苷酸导入CD8阳性T细胞，所述 TCR能够结合通过HLA-A11(更优选地HLA-A*1101),HLA-A33(更优选地 HLA-A*3303),HLA-A03(更优选地HLA-A*0301)或HLA-A01(更优选地 HLA-A*0101)呈递在细胞表面的本发明的肽。
VIII.T细胞受体(TCR)
本发明还提供组合物以及使用该组合物的方法，所述组合物包含编码每 种TCR亚基的多核苷酸，所述TCR能够结合通过HLA抗原呈递在细胞表面的 本发明的肽。所述多核苷酸赋予CD8阳性T细胞针对表达KOC1的癌细胞的特 异性，这是通过表达能够结合通过HLA抗原呈递在细胞表面的本发明的肽的 TCR实现的。通过使用本领域已知的方法，可鉴定出通过本发明的肽诱导的 CTL中编码TCR亚基的alpha和beta链的多核苷酸(WO2007/032255及Morgan 等人,J Immunol,171,3288(2003))。例如，优选PCR方法用于TCR分析。不 限于此，用于分析的PCR引物可以是(例如)通过组合以下5'侧引物和3'侧引物 的用于扩增的引物组：
5’侧引物:
5’-R引物(5’-gtctaccaggcattcgcttcat-3’)(SEQ ID NO:105)
3’侧引物
TCR-alpha-链C-区-特异性
3-TRa-C引物(5’-tcagctggaccacagccgcagcgt-3’)(SEQ ID NO:106)
TCR-beta-链C1-区-特异性
3-TRb-C1引物(5’-tcagaaatcctttctcttgac-3’)(SEQ ID NO:107)或
TCR-beta-链C2-区-特异性
3-TR-beta-C2引物(5’-ctagcctctggaatcctttctctt-3’)(SEQ ID NO:108)
通过将鉴定的多核苷酸导入CD8阳性T细胞而形成的TCRs能够以高亲 合力结合呈递本发明的肽的靶细胞，并在体内和体外介导针对呈递本发明的 肽的靶细胞的高效杀伤。
可以将编码每种TCR亚基的多核苷酸掺入合适的载体，例如逆转录病毒 载体中。这些载体是本领域公知的。可以将所述多核苷酸或者包含它们的载 体导入CD8阳性T细胞，例如衍生自患者的CD8阳性T细胞。本发明提供一种 即配即用型组合物，其容许快速修饰患者自己的T细胞(或衍生自其他受试者 的T细胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌细胞杀伤特性的修饰型T细胞。
本文中，特异性TCR是当TCR呈递于CD8阳性T细胞的表面上时，能够 通过特异性识别呈递在靶细胞表面上的本发明的肽和HLA抗原的复合物,赋 予针对靶细胞特异性细胞毒活性的TCR。上述复合物的特异性识别可以通过 任何已知方法来确认，并且其优选的例子包括使用HLA分子和本发明的肽的 HLA多聚体染色分析，和ELISPOT测定方法。通过实施ELISPOT测定法，可 以确认由导入有上述多核苷酸的T细胞和细胞内信号转导的靶细胞的特异的 TCR介导的识别。当上述TCR呈递于CD8阳性T细胞表面上时，也可以通过 已知方法确认TCR是否能够赋予针对CD8阳性T细胞的靶细胞特异性细胞毒 性活性。优选的方法包括例如通过铬释放测定法等测定针对HLA阳性靶细胞 的细胞毒性活性。
在HLA-A11的背景下，本发明提供了通过用编码每种TCR亚基的多核苷 酸转化CD8阳性T细胞制备的CTL，所述TCR结合例如具有选自SEQ ID NOs: 5,28,30和32的氨基酸序列的肽。
在HLA-A33的背景下，本发明提供了通过用编码每种TCR亚基的多核苷 酸转化CD8阳性T细胞制备的CTL，所述TCR结合例如具有选自SEQ ID NOs: 61,62,63,64,67,74,77,52,79,80和85的氨基酸序列的肽。
在HLA-A03的背景下，本发明提供了通过用编码每种TCR亚基的多核苷 酸转化CD8阳性T细胞制备的CTL，所述TCR结合例如具有选自SEQ ID NOs: 27,30和52的氨基酸序列的肽。
在HLA-A01的背景下，本发明提供了通过用编码每种TCR亚基的多核苷 酸转化CD8阳性T细胞制备的CTL，所述TCR结合例如具有选自SEQ ID NOs: 86,87,90,92,46,95和41的氨基酸序列的肽。
经转化的CTLs在体内能够归巢(homing)，并且可以利用公知的体外培养 方法扩增(例如Kawakami等人,J Immunol.,142,3452-3461(1989))。可以利用 本发明的CTLs来形成免疫原性组合物，所述组合物有用于在需要治疗和/或 预防(防范)的患者中的疾病治疗或预防(防范)(对于参考文献 WO2006/031221，其内容通过提述并入本文)。
IX.药物组合物
本发明还提供了组合物或药物组合物，包含选自以下的至少一种活性成 分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)本发明的APC；
(d)本发明的外来体；和
(e)本发明的CTL。
除了上述活性成分之外，本发明的药物组合物可以根据需要包含载体， 赋形剂或通常用于药物中的此类而没有特别限制。可用于本发明的药物组合 物中的载体的例子包括无菌水，生理盐水，磷酸盐缓冲液，培养液等。因此， 本发明还提供了药物组合物，包含选自以下(a)至(e)的至少一种活性成分和药 学上可接受的载体：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)本发明的APC；
(d)本发明的外来体；和
(e)本发明的CTL。
此外，本发明的药物组合物可以根据需要包含稳定剂，混悬剂，防腐剂， 表面活性剂，增溶剂，pH调节剂，聚集抑制剂等。
与正常组织相比，癌细胞中KOC1表达显著上调。因此本发明的肽或编 码所述肽的多核苷酸可以用于治疗和/或预防癌症，和/或预防其术后复发。 因此本发明提供了用于治疗和/或预防癌症，和/或预防其术后复发的药物组 合物，其包含作为活性成分的一种或多种类型的本发明的肽或多核苷酸。或 者，可以制备本发明的肽以呈递在外来体或APCs的表面上用作为药物组合 物的用途。此外，靶向任一种本发明肽的本发明的CTLs也可用作本发明药物 组合物的活性成分。本发明的药物组合物可包含治疗有效量或药学有效量的 上述活性成分。
本发明的药物组合物还可以用作疫苗。在本发明的语境中，术语“疫苗” (也称为“免疫原性组合物”)指当接种到动物时具有诱导导致抗肿瘤作用的 免疫应答的功能的组合物。因此本发明的药物组合物可用于诱导导致抗肿瘤 作用的免疫应答。由本发明的肽，多肽，APC，CTL和药物组合物诱导的免 疫应答没有特别限制，只要其是导致抗肿瘤作用的免疫应答，并且例子包括 诱导癌细胞特异的CTL和诱导癌细胞特异的细胞毒性活性。
本发明的药物组合物可用于在人类受试者或患者中治疗和/或预防的癌 症，和/或预防其手术后复发。本发明的药物组合物可以优选用于对选自 HLA-A11，HLA-A33，HLA-A03和HLA-A01中的至少一种HLA阳性的受试 者。此外，本发明的药物组合物可优选用于治疗和/或预防表达KOC1和选自 HLA-A11，HLA-A33，HLA-A03和HLA-A01的至少一种HLA的癌症和/或预 防其术后复发。
在另一个实施方案中，本发明提供选自以下的活性成分在制备用于治疗 或预防癌症的药物组合物中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明进一步提供选自以下的活性成分，用于治疗或预防癌症：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明还提供制备用于治疗或预防癌症的药物组合物的方法或过 程，其中所述方法或过程包括用药学上或生理上可接受的载体配制至少一种 选自以下活性成分的步骤：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在另一个实施方案中，本发明还提供了制备用于治疗或预防癌症的药物 组合物的方法或过程，其中所述方法或过程包括将选自以下的活性成分与药 学上或生理上可接受的载体混合的步骤：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供了用于治疗或预防癌症的方 法，其包括向受试者施用至少一种选自以下的活性成分的步骤：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在本发明中，具有选自SEQ ID NOs:5,28,30和32的氨基酸序列的肽被 鉴定为可以诱导强效和特异性免疫应答的HLA-A11限制性表位肽。因此，包 含至少一种具有选自SEQID NOs:5,28,30和32的氨基酸序列的肽的本发明 的药物组合物特别适用于施用至具有HLA-A11(例如,HLA-A*1101)作为 HLA抗原的受试者。这同样适用于包含以下的药物组合物：编码这些肽中任 一种的多核苷酸(即本发明的多核苷酸)，呈递这些肽的APC或外来体(即本发 明的APC或外来体)，或靶向这些肽的CTL(即本发明的CTL)。也就是说，包 含与具有选自SEQ ID NOs:5,28,30和32的氨基酸序列的肽相关联的活性成 分的药物组合物适合施用于具有HLA-A11的受试者(即HLA-A11阳性受试 者)。在更优选的实施方案中，本发明的药物组合物是包含具有SEQ ID NO:32 的氨基酸序列的肽的药物组合物。
类似地，在本发明中，具有选自SEQ ID NOs:61,62,63,64,67,74,77,52, 79,80和85的氨基酸序列的肽被鉴定为可以诱导强效和特异性免疫应答的 HLA-A33限制性表位肽。因此，包含至少一种具有选自SEQ ID NOs:61,62, 63,64,67,74,77,52,79,80和85的氨基酸序列的肽的本发明的药物组合物特 别适用于施用至具有HLA-A33(例如,HLA-A*3303)作为HLA抗原的受试者。 这同样适用于包含以下的药物组合物：编码这些肽中任一种的多核苷酸(即 本发明的多核苷酸)，呈递这些肽的APC或外来体(即本发明的APC或外来 体)，或靶向这些肽的CTL(即本发明的CTL)。也就是说，包含与具有选自SEQ ID NOs:61,62,63,64,67,74,77,52,79,80和85的氨基酸序列的肽相关联的 活性成分的药物组合物适合施用于具有HLA-A33的受试者(即HLA-A33阳性 受试者)。在更优选的实施方案中，本发明的药物组合物是包含至少一种具 有SEQ ID NO:64,67,和77的氨基酸序列的肽的药物组合物。
类似地，在本发明中，具有选自SEQ ID NOs:27,30和52的氨基酸序列 的肽被鉴定为可以诱导强效和特异性免疫应答的HLA-A03限制性表位肽。因 此，包含至少一种具有选自SEQ ID NOs:27,30和52的氨基酸序列的肽的本 发明的药物组合物特别适用于施用至具有HLA-A03(例如,HLA-A*0301)作 为HLA抗原的受试者。这同样适用于包含以下的药物组合物：编码这些肽中 任一种的多核苷酸(即本发明的多核苷酸)。呈递这些肽的APC或外来体(即本 发明的APC或外来体)，或靶向这些肽的CTL(即本发明的CTL)。也就是说， 包含与具有选自SEQ ID NOs:27,30和52的氨基酸序列的肽相关联的活性成 分的药物组合物适合施用于具有HLA-A03的受试者(即HLA-A03阳性受试 者)。在更优选的实施方案中，本发明的药物组合物是包含具有SEQ ID NO:27 的氨基酸序列的肽的药物组合物。
类似地，在本发明中，具有选自SEQ ID NOs:86,87,90,92,46,95和41 的氨基酸序列的肽被鉴定为可以诱导强效和特异性免疫应答的HLA-A01限 制性表位肽。因此，包含至少一种具有选自SEQ ID NOs:86,87,90,92,46,95 和41的氨基酸序列的肽的本发明的药物组合物特别适用于施用至具有 HLA-A01(例如,HLA-A*0101)作为HLA抗原的受试者。这同样适用于包含以 下的药物组合物：编码这些肽中任一种的多核苷酸(即本发明的多核苷酸)。呈递这些肽的APC或外来体(即本发明的APC或外来体)，或靶向这些肽的 CTL(即本发明的CTL)。也就是说，包含与具有选自SEQ ID NOs:86,87,90,92, 46,95和41的氨基酸序列的肽相关联的活性成分的药物组合物适合施用于具 有HLA-A01的受试者(即HLA-A01阳性受试者)。在更优选的实施方案中，本 发明的药物组合物是包含具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的肽的药物组合 物。
通过本发明的药物组合物治疗和/或预防的癌症没有特别限制，只要它们 是表达KOC1的癌症，并包括膀胱癌，宫颈癌，胆管细胞癌，慢性髓性白血 病(chronic myeloidleukemia)(CML)，结肠癌，直肠癌，食管癌，弥漫性胃 癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，卵巢癌，肾癌，头颈癌， 软组织肿瘤，睾丸癌等。优选在纯合或杂合地具有选自HLA-A11，HLA-A33， HLA-A03和HLA-A01的HLA等位基因的受试者中使用本发明的药物组合物。
除了上述活性成分之外，本发明的药物组合物可以包含具有诱导针对癌 细胞的CTL的能力的其他肽(例如，其它TAA衍生的CTL诱导肽)，编码其他 肽的其他多核苷酸，呈递其他肽的其他细胞等。
本发明的药物组合物还可以任选地包含其它治疗物质作为活性成分，只 要它们不抑制上述活性成分(例如本发明的肽)的抗肿瘤作用即可。例如，本 发明的药物组合物可任选地包含抗炎组合物，镇痛药，化学治疗剂等。除了 将其它治疗物质包括在本发明的药物组合物本身以外，还可以与一种或多种 其它药物组合物顺序或同时施用本发明的药物组合物。本发明的药物组合物 和其它药物组合物的剂量取决于例如所使用的药物组合物的类型和所治疗 的疾病，以及施用时间安排(scheduling)和施用途径。
应当理解，考虑到制剂类型，除了本文明确提及的成分之外，本发明的 药物组合物可以包含本领域常规的其它组分。
本发明还提供包含本发明的药物组合物的制品或试剂盒。本发明的制品 或试剂盒可以包括容纳本发明的药物组合物的容器。适当的容器的例子包括 瓶，小瓶或试管，但不限于此。容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。 标签可以附着于容器，并且可以在标签中描述本发明的药物组合物所应用的 疾病或疾病状态。标签还可指明关于施用的指导等等。
除了容纳本发明的药物组合物的容器之外，优选地本发明的制品或试剂 盒还可以任选包含容纳药学上可接受的稀释剂的第二容器。本发明的制品或 试剂盒还可包括从商业立场和用户角度所需的其它材料，例如其它缓冲液， 稀释剂，过滤器，注射针，注射器，具有使用说明的包装插页。
根据需要，本发明的药物组合物可包装在药包或分配装置中提供，该药 包或分配装置可装有一个或多个含有活性成分的单位剂型。例如，药包可包 括例如金属或塑料箔，诸如泡罩包。药包或分配装置可附有施用说明书。
(1)包含肽作为活性成分的药物组合物
包含本发明的肽的药物组合物可以根据需要通过常规制剂方法配制。除 了本发明的肽之外，本发明的药物组合物可以包含通常用于药物中的载体， 赋形剂等，而没有特别限制。可用于本发明的药物组合物中的载体的例子包 括灭菌水(例如注射用水)，生理盐水，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲盐水，Tris 缓冲盐水，0.3％甘氨酸，培养液，等等。此外，本发明的药物组合物可根据 需要含有稳定剂、悬浮剂、防腐剂、表面活性剂、增溶剂、pH调节剂、聚集 抑制剂，等等。本发明的药物组合物可以诱导针对表达KOC1的癌细胞的特 异性免疫，因此可以用于癌症治疗或预防(防范)的目的。
例如，可以通过以下制备本发明的药物组合物：在药学上或生理上可接 受的水溶性载体中溶解，所述水溶性载体例如灭菌水(例如注射用水)，生理 盐水，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲盐水，和Tris缓冲盐水，并根据需要加入 稳定剂，悬浮剂，防腐剂，表面活性剂，增溶剂，pH调节剂，聚集抑制剂等， 然后灭菌肽溶液。对肽溶液进行灭菌的方法没有特别限定，优选通过过滤灭 菌进行。过滤灭菌可以使用(例如)孔径为0.22μm或以下的过滤灭菌过滤器进 行。过滤灭菌的肽溶液可以例如作为注射剂施用至受试者，但不限于此。本 发明的药物组合物可以通过冷冻干燥上述肽溶液制备为冷冻干燥制剂。冷冻 干燥制剂可以通过以下制备：将如上所述制备的肽溶液装入适当的容器，如 安瓿、小瓶或塑料容器中，随后冷冻干燥并用洗涤灭菌的橡胶塞等在压力回 收之后包封入容器中。冷冻干燥制剂可以在其再溶解于药学上或生理学上可 接受的水溶性载体后施用至受试者，所述水溶性载体例如灭菌水(例如注射 用水)，生理盐水，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲盐水，和Tris缓冲盐水等。本 发明的药物组合物的优选实例包括此类过滤灭菌的肽溶液的注射物和由冻 干该肽溶液所产生的冷冻干燥制剂。本发明还包括含有此类冷冻干燥制剂和 再溶解溶液的试剂盒。本发明还包括容纳冷冻干燥制剂(其是本发明的药物 组合物)的容器和容纳再溶解溶液的容器的试剂盒。
本发明的药物组合物可以包含两种或更多种类型的本发明肽的组合。肽 的组合可以采取混合的肽的鸡尾酒形式，或可以使用标准技术彼此缀合。例 如，可以将肽化学连接或表达成为单一融合多肽。通过施用本发明的肽，肽 被HLA抗原以高密度展示在APC上，然后诱导出与所展示的肽与HLA抗原之 间形成的复合物特异性起反应的CTL。或者，可以从受试者分离APCs(例如 DCs)，然后用本发明的肽刺激它们，来获得在其细胞表面上展示任何所述本 发明肽的APC。将这些APC重新施用给受试者以在受试者中诱导CTLs，结果， 可提高针对表达KOC1的癌细胞的攻击性。
本发明的药物组合物还可以包含已知用于有效建立细胞免疫的佐剂。佐 剂是指当与抗原一起(或连续)施用时增强针对具有免疫学活性的抗原的免疫 应答的化合物。可以使用描述于文献中的已知佐剂，例如Clin Microbiol Rev 1994,7:277-89。合适佐剂的例子包括铝盐(磷酸铝，氢氧化铝，羟基氧化铝 等),明矾,霍乱毒素,沙门氏菌毒素,IFA(不完全弗氏佐剂),CFA(完全弗氏 佐剂),ISCOMatrix,GM-CSF和其他免疫刺激细胞因子，含有CpG基序的寡脱 氧核苷酸(CpG7909等)，水包油乳液，皂苷或其衍生物(QS21等)，脂多糖例如脂质A或其衍生物(MPL,RC529,GLA,E6020等)，脂肽，乳铁蛋白，鞭毛 蛋白，双链RNA或其衍生物(poli IC等)，细菌DNA，咪唑并喹啉(Imiquimod, R848等)，C型凝集素配体(海藻糖-6,6’-二山嵛酸/酯(TDB)等)，CD1d配体 (alpha-半乳糖神经酰胺等)，角鲨烯乳液(MF59,AS03,AF03等),PLGA等，但 不限于此。在包含本发明的药物组合物的试剂盒中，佐剂可以包含在与包含 本发明的肽的药物组合物分开的另一容器中。在这种情况下，佐剂和药物组合物可以连续地施用于受试者，或者在施用给受试者之前立即混合在一起。 本发明还提供了包含含有本发明的肽药物组合物和佐剂的此类试剂盒。当本 发明的药物组合物是冷冻干燥制剂时，试剂盒还可以包含再溶解溶液。此外， 本发明提供试剂盒，其包括容纳本发明的药物组合物的容器和存储佐剂的容 器。试剂盒可以根据需要进一步包含储存再溶解溶液的容器。
当油佐剂用作佐剂时，本发明的药物组合物可以制备为乳液。例如，可 以通过混合并搅拌如上所述制备的肽溶液和油佐剂来制备乳液。肽溶液可以 是在冷冻干燥后再溶解的溶液。乳液可以是W/O型乳液和O/W型乳液，且 W/O型乳液优选用于获得高免疫应答增强效果。IFA可优选用作油佐剂，但 不限于此。乳剂的制备可以在施用受试者之前立即进行，且在这种情况下， 本发明的药物组合物可以作为包含本发明的肽溶液和油性佐剂的试剂盒提 供。当本发明的药物组合物是冷冻干燥制剂时，试剂盒可以进一步包含再溶 解溶液。
此外，本发明的药物组合物可以是其中包封了本发明肽的脂质体制剂、 其中肽结合至具有几微米直径的珠子的颗粒配制剂，或其中脂质结合至肽的 配制剂。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的肽还可以以药学上可接受的盐 的形式施用。优选的盐的实例包括与碱金属(锂，钾，钠等)的盐，与碱土金 属(钙，镁等)的盐，与其他金属(铜，铁，锌，锰等)的盐,与有机碱的盐,与 胺的盐,与有机酸(例如乙酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石 酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸等等)的盐,和与无机酸(例如 盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸、硝酸等等)的盐。本文中所用的短语“药学上 可接受的盐”是指保留所述化合物的生物学，生理学，药理学和药学上的有 效性和性质的盐。因此，包含本发明的肽的药学上可接受的盐的药物组合物 也包括在本发明内。此外，除了游离肽之外，“本发明的肽”还包括其药学 上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物可以进一步包括引发(prime) CTLs的成分。已经确认脂质是能够在体内引发针对病毒抗原的CTL的组分。 例如，可将棕榈酸残基连接至赖氨酸残基的ε-和α-氨基，然后连接至本发明 的肽。然后脂化肽可以在胶束或颗粒中直接施用，掺入脂质体，或在佐剂中 乳化。作为脂质引发CTL响应的其他例子，大肠杆菌脂蛋白，诸如三棕榈酰 基-S-甘油基半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)，当与适宜的肽共价连接时，可 用来引发CTL(参见例如Deres等人,Nature 1989,342:561-4)。
用于施用本发明的肽或药物组合物的合适方法的实例包括口服、皮内、 皮下、肌肉内、骨内、腹膜内和静脉内注射，以及全身施用或局部施用至靶 位点附近，但不限于此。优选的施用方法包括皮下注射到诸如腋窝或腹股沟 的淋巴结附近。施用可以通过单次施用进行或通过多次施用来强化。本发明 的肽可以以治疗或药学有效量施用于受试者以治疗癌症，或以治疗或药学有 效量以诱导针对表达KOC1的癌细胞的免疫(更具体地为CTLs)。本发明肽的 剂量可以依据要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等恰当加以 调整。对于本发明的每种肽，剂量通常是0.001mg-1000mg,例如0.01mg- 100mg，例如0.1mg-30mg，例如0.1mg-10mg，例如0.5mg-5mg。给药 间隔可以是每几天至几个月一次，且例如，可以每周一次的间隔进行给药。 本领域技术人员可以适当地选择合适的剂量(dose)(剂量(dosage))。
在优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含治疗有效量的本发明的 肽和药学上或生理学上可接受的载体。在另一个实施方案中，本发明的药物 组合物包含治疗有效量的本发明的肽，药学或生理学上可接受的载体和佐 剂。本发明的药物组合物可以包含0.001mg-1000mg,优选0.01mg-100mg, 更优选0.1mg-30mg，甚至更优选0.1mg-10mg，例如0.5mg-5mg的本发 明的肽。当本发明的药物组合物是注射剂时，其可以包含以下浓度的本发明 的肽：0.001mg/ml-1000mg/ml,优选0.01mg/ml-100mg/ml,更优选0.1 mg/ml-30mg/ml,甚至更优选0.1mg/ml-10mg/ml,例如0.5mg/ml-5 mg/ml。在这种情况下，例如，可以通过注射向受试者施用0.1至5ml,优选 0.5ml至2ml的本发明的药物组合物。
此外，本发明提供了治疗和/或预防癌症和/或预防其手术后复发的方法， 其包括向受试者施用治疗有效量的本发明的肽或本发明的药物组合物。如上 所述，本发明的肽可以以通常为以下量的单一剂量施用于受试者：0.001mg- 1000mg,例如,0.01mg-100mg,例如,0.1mg-30mg,例如,0.1mg-10mg, 或例如,0.5mg-5mg。在优选的实施方案中，本发明的肽与佐剂一起施用于 受试者。此外，给药间隔可以是每几天至几个月一次，优选每几天至每月一 次，例如每周一次或每两周一次。
(2)含有多核苷酸作为活性成分的药物组合物
本发明的药物组合物也可含有以可表达的形式编码本发明公开的肽的 多核苷酸。在本文中，短语“以可表达的形式”意味着多核苷酸在导入细胞 时会表达作为本发明的肽。在示例性的实施方案中，本发明的多核苷酸的序 列包括用于本发明的肽的表达所必需的调节元件。本发明的多核苷酸可具有 为实现稳定插入靶细胞的基因组所需的序列(关于同源重组盒载体的描述参 见例如Thomas KR&Capecchi MR,Cell 1987,51:503-12)。参见例如Wolff等 人,Science 1990,247:1465-8；美国专利号5,580,859,5,589,466,5,804,566, 5,739,118,5,736,524,5,679,647；和WO98/04720。基于DNA的投递技术的例 子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、聚合物、肽介导的)投递、阳离子脂质 复合物、和颗粒介导的(“基因枪”)或压力介导的投递(参见例如美国专利号5,922,687)。
本发明的肽还可用病毒或细菌载体来表达。表达载体的例子包括减毒病 毒宿主，诸如牛痘或禽痘。例如，可以使用牛痘病毒作为表达本发明的肽的 载体。在导入宿主后，重组牛痘病毒表达表达免疫原性肽，并由此引发免疫 应答。可用于免疫接种方案的牛痘载体和方法记载于例如美国专利号 4,722,848。另一种载体是BCG(Bacille CalmetteGuerin)。BCG载体描述于 Stover等人,Nature 1991,351:456-60。各种可用于治疗性施用或免疫接种的 其它载体是显而易见的，例如腺病毒和腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、去毒炭疽毒素载体等等。参见例如Shata 等人,Mol Med Today 2000,6:66-71；Shedlock等人.,J Leukoc Biol 2000,68: 793-806；Hipp等人.,In Vivo 2000,14:571-85。
本发明的多核苷酸投递至患者中可以是直接的，在这种情况下患者可以 直接暴露于携带本发明多核苷酸的载体，或者是间接的，在这种情况下首先 在体外用携带本发明多核苷酸的载体转化细胞，然后将细胞移植入患者。这 两种办法分别称作体内和离体基因疗法。
关于基因疗法的方法的一般综述参见Goldspiel等人,Clinical Pharmacy 1993,12:488-505；Wu和Wu,Biotherapy 1991,3:87-95；Tolstoshev,Ann Rev PharmacolToxicol 1993,33:573-96；Mulligan,Science 1993,260:926-32； Morgan&Anderson,AnnRev Biochem 1993,62:191-217；Trends in Biotechnology 1993,11(5):155-215。在Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY,1993；及Krieger,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY,1990中描述了可应用于 本发明的重组DNA技术领域的公知方法。
与肽的施用类似，多核苷酸的施用可以通过口服、皮内、皮下、静脉内、 肌肉内、骨内、或腹膜内注射等等进行。施用可以是系统施用或局部施用至 靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施，或者通过多次施用来强化。本 发明的多核苷酸可以以治疗或药学有效量施用于受试者，用于诱导针对表达 KOC1的癌细胞的免疫(更具体地，CTL)，或以治疗或药学有效量用于治疗癌 症。合适载体中的多核苷酸的剂量或使用编码本发明的肽的多核苷酸转化的 细胞中的多核苷酸的剂量可以依据要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用 的方法等等适当地调整，且通常是0.001mg-1000mg,例如,0.01mg-100 mg,例如,0.1mg-30mg,例如,0.1mg-10mg,或例如0.5mg-5mg。给药 间隔可以是每几天至几个月一次，例如，给药可以每周一次的间隔进行。本 领域技术人员可以适当地选择合适的剂量(dose)(剂量(dosage))。
X.使用肽、外来体、APC和CTL的方法
本发明的肽和多核苷酸可用于诱导APCs和CTLs。也可以使用本发明的 的外来体和APCs来诱导CTLs。肽、多核苷酸、外来体和APCs可以与任何其 它化合物组合使用，只要其CTL诱导能力不被抑制。因此，可以使用包含本 发明的任何肽，多核苷酸，APC和外来体的药物组合物来诱导本发明的CTL。 此外，可以使用包含本发明的肽或多核苷酸的药物组合物来诱导本发明的 APC。
(1)诱导APCs的方法
本发明提供了使用本发明的肽或多核苷酸诱导具有CTL诱导能力的 APCs的方法。
本发明的方法包括在体外、离体或体内使APC与本发明的肽接触的步 骤。例如，使APC与肽离体接触的方法可以包括以下步骤：
(a)从受试者收集APCs；和
(b)使步骤(a)的APCs与本发明的肽接触。
上述APCs不限于特定种类的细胞，并且可以使用已知在其细胞表面上 呈递蛋白质抗原以被淋巴细胞识别的细胞，例如DC，Langerhans细胞，巨噬 细胞，B细胞，和活化的T细胞。DCs在APCs中具有最强的CTL诱导能力，因 此优选使用DCs。本发明的任何肽均可以单独或与本发明的其它肽组合使用。 此外，本发明的肽可以与其它CTL诱导肽(例如，其它TAA衍生的CTL诱导肽) 组合使用。
同时，当将本发明的肽施用给受试者时，APCs在体内接触到所述肽， 结果，在受试者的身体中诱导出具有高CTL诱导能力的APCs。因此，本发明 的方法可包向受试者施用本发明的肽的步骤。类似地，当将可表达形式的本 发明的多核苷酸施用于受试者时，本发明的肽在体内表达，表达的肽在体内 与APCs接触，结果，在受试者的身体中诱导出具有高CTL诱导能力的APCs。 因此，本发明还可以包括向受试者施用本发明的多核苷酸的步骤。
为了诱导具有CTL诱导能力的APCs，本发明还包括将本发明的多核苷酸 导入APCs的步骤。例如，所述方法可以包括以下步骤：
(a)自受试者收集APCs；并
(b)将编码本发明肽的多核苷酸导入步骤(a)的APCs。
步骤(b)可如上文“VI.抗原呈递细胞(APC)”部分中所述来实施。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了诱导具有CTL诱导能力的APCs 的方法，其包含以下步骤(a)或(b)：
(a)使APCs与本发明的肽接触；并
(b)将编码本发明的肽的多核苷酸导入APCs中。
此外，本发明提供了制备具有CTL诱导能力的APCs的方法，其包含以下 步骤(a)或(b)：
(a)使APCs与本发明的肽接触；或
(b)将编码本发明的肽的多核苷酸导入APCs中。
上述方法可以在体外、离体或体内实施，并优选在体外或离体实施它们。 在上述方法中使用的APCs可以衍生自计划施用诱导的APCs的受试者，或者 它们可以衍生自不同的受试者。当使用来自与计划施用的受试者不同的受试 者(供体)的APCs时，施用受试者和供体必须具有相同的HLA类型。在本发明 的方法中，当具有选自SEQ ID NOs:5,28,30和32的氨基酸序列的肽或其修 饰肽用作本发明的肽时，在施用受试者和供体中HLA类型优选为HLA-A11(更优选HLA-A*1101)。或者，在上述方法中使用的APCs优选是表 达HLA-A11(更优选HLA-A*1101)的APCs。类似地，当具有选自SEQ ID NOs: 61,62,63,64,67,74,77,52,79,80和85的氨基酸序列的肽或其修饰肽用作本 发明的肽时，在施用受试者和供体中HLA类型优选为HLA-A33(更优选 HLA-A*3303)。或者，在上述方法中使用的APCs优选是表达HLA-A33(更优 选HLA-A*3303)的APCs。类似地，当具有选自SEQ ID NOs:27,30和52的氨 基酸序列的肽或其修饰肽用作本发明的肽时，在施用受试者和供体中HLA类 型优选为HLA-A03(更优选HLA-A*0301)。或者，在上述方法中使用的APCs 优选是表达HLA-A03(更优选HLA-A*0301)的APCs。类似地，当具有选自 SEQ ID NOs:86,87,90,92,46,95和41的氨基酸序列的肽或其修饰肽用作本 发明的肽时，在施用受试者和供体中HLA类型优选为HLA-A01(更优选 HLA-A*0101)。或者，在上述方法中使用的APCs优选是表达HLA-A01(更优 选HLA-A*0101)的APCs。在通过重力离心法等从供体收集的血液中分离PBMC之后，可以使用已知方法从PBMC制备APC。
在另一个实施方案中，本发明还提供了包含本发明的肽或编码该肽的多 核苷酸用于诱导具有CTL诱导能力的APC的药物组合物。
或者，本发明还提供了本发明的肽或编码该肽的多核苷酸在制备用于诱 导具有CTL诱导能力的APC的药物组合物中的用途。
或者，本发明还提供本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸，用于诱导具 有CTL诱导能力的APC。
或者，本发明进一步提供制备用于诱导APC的药物组合物的方法或过 程，其中所述方法或过程包括将本发明的肽或本发明的多核苷酸与药学上或 生理上可接受的载体进行配制的步骤。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供了制备用于诱导具有CTL诱导 能力的APC的药物组合物的方法或过程，其中所述方法或过程包括将本发明 的肽或本发明的多核苷酸与药学上或生理上可接受的载体相混合的步骤。
通过本发明的方法诱导的APCs可诱导对KOC1特异性的CTLs(即本发明 的CTLs)。
(2)诱导CTL的方法
本发明还提供了使用本发明的肽，多核苷酸，外来体或APC来诱导CTL 的方法。本发明还提供了使用一种或多种编码能够形成T细胞受体(TCR)的多 肽(即TCR亚基)的多核苷酸来诱导CTLs的方法，所述TCR能够识别本发明的 肽和HLA抗原的复合物。优选地，诱导CTLs的方法包含选自以下至少一个 步骤：
(a)使CD8阳性T细胞与抗原呈递细胞接触，所述抗原呈递细胞在其表面 上呈递有HLA抗原与本发明的肽的复合物；
(b)使CD8阳性T细胞与外来体接触，所述外来体在其表面上呈递有HLA 抗原与本发明的肽的复合物；和
(c)向CD8阳性T细胞导入一种或多种编码能够形成TCR的多肽的多核 苷酸，所述TCR能够识别本发明的肽和HLA抗原的复合物。
当本发明的肽、多核苷酸、APC或外来体施用至受试者后，在受试者的 身体中诱导CTLs，而且靶向表达KOC1的癌细胞的免疫应答的强度增强。因 此，本发明的方法可包括将本发明的肽、多核苷酸、APC或外来体施用于受 试者的步骤。
或者，也可在体外或离体使用它们来诱导CTLs。例如，本发明的方法可 以包括以下步骤：
(a)自受试者收集APCs；
(b)将步骤(a)的APCs与本发明的肽接触；和
(c)将步骤(b)的APCs与CD8阳性T细胞共培养。
诱导的CTL可以随后返回到受试者。
上文步骤(c)中要与CD8阳性T细胞共培养的APC也可通过将编码本发明 的肽的多核苷酸引入APC来制备，如上文“VI.抗原呈递细胞(APC)”部分所 述。然而，用于本发明的方法中的APC不限于此，并且可以使用在其表面上 呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的任何APC。
在本发明的方法中，除了此类APCs，也可以使用在其表面上呈递HLA 抗原和本发明肽形成的复合物的外来体。即，本发明的方法可以包括与在其 表面上呈递HLA抗原和本发明肽的复合物的外来体共培养的步骤。此类外来 体可通过上文“V.外来体”部分中描述的方法来制备。
此外，可通过将包含编码TCR的每种亚基的多核苷酸的载体导入CD8阳 性T细胞来诱导CTLs，所述TCR能够结合通过细胞表面上的HLA抗原呈递的 本发明的肽。此类转化可如上文“VIII.T细胞受体(TCR)”部分中所述来实 施。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了诱导CTLs的方法，包括选自以 下的步骤：
(a)将CD8阳性T细胞与APCs共培养，所述APCs在其表面呈递HLA抗原 和本发明肽的复合物；
(b)将CD8阳性T细胞与外来体共培养，所述外来体在其表面呈递HLA 抗原和本发明肽的复合物；和
(c)向CD8阳性T细胞导入包含编码TCR的每种亚基的多核苷酸的载体， 所述TCR能够结合通过细胞表面上的HLA抗原呈递的本发明的肽。
上述方法可以在体外，离体或体内实施，并且优选在体外或离体实施它 们。在上述方法中使用的APCs或外来体和CD8阳性T细胞可以衍生自计划施 用诱导的CTL的受试者，或者它们可以衍生自不同的受试者。当使用来自与 计划施用的受试者不同的受试者(供体)的APC或外来体和CD8阳性T细胞时， 施用对象和供体必须具有相同的HLA类型。例如，当具有选自SEQ ID NOs:5, 28,30和32的氨基酸序列的肽或其修饰肽用作为本发明的肽时，在施用对象 和供体中HLA类型优选为HLA-A11(更优选HLA-A*1101)。或者，上述方法 中使用的APC或外来体优选是在其表面上呈递HLA-A11(更优选 HLA-A*1101)和本发明的肽(具有选自SEQ ID NOs:5,28,30和32的氨基酸序 列的肽或其修饰肽)的复合物的APC或外来体。在这种情况下，诱导的CTLs 显示出针对呈递HLA-A11和本发明的肽的复合物的细胞(例如，表达KOC1 的HLA-A11阳性细胞)的细胞毒活性。或者，例如当具有选自SEQ ID NOs:61,62,63,64,67,74,77,52,79,80和85的氨基酸序列的肽或其修饰的肽作为本 发明的肽时，施用对象中的HLA和供体优选都是HLA-A33(更优选 HLA-A*3303)。或者上述方法中使用的APC或外来体优选是在其表面上呈递 HLA-A33(更优选HLA-A*3303)和本发明的肽(具有选自SEQ ID NOs:61,62, 63,64,67,74,77,52,79,80和85的氨基酸序列的肽或其修饰肽)的复合物的 APC或外来体。在这种情况下，诱导的CTLs显示出针对呈递HLA-A33和本 发明的肽的复合物的细胞(例如，表达KOC1的HLA-A33阳性细胞)的细胞毒 活性。或者，例如当具有选自SEQ ID NOs:27,30和52的氨基酸序列的肽或 其修饰的肽作为本发明的肽时，施用对象中的HLA和供体优选都是HLA-A03 (更优选HLA-A*0301)。或者上述方法中使用的APC或外来体优选是在其表面 上呈递HLA-A03(更优选HLA-A*0301)和本发明的肽(具有选自SEQ IDNOs: 27,30和52的氨基酸序列的肽或其修饰肽)的复合物的APC或外来体。在这种 情况下，诱导的CTLs显示出针对呈递HLA-A03和本发明的肽的复合物的细 胞(例如，表达KOC1的HLA-A03阳性细胞)的细胞毒活性。或者，例如当具 有选自SEQ ID NOs:86,87,90,92,46,95和41的氨基酸序列的肽或其修饰的 肽作为本发明的肽时，施用对象中的HLA和供体优选都是HLA-A01(更优选 HLA-A*0101)。或者上述方法中使用的APC或外来体优选是在其表面上呈递 HLA-A01(更优选HLA-A*0101)和本发明的肽(具有选自SEQ ID NOs:86,87, 90,92,46,95和41的氨基酸序列的肽或其修饰肽)的复合物的APC或外来体。 在这种情况下，诱导的CTLs显示出针对呈递HLA-A01和本发明的肽的复合 物的细胞(例如，表达KOC1的HLA-A01阳性细胞)的细胞毒活性。
在另一个实施方案中，本发明还提供了用于诱导CTL的组合物或药物组 合物，其包含至少一种选自以下的活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
在另一个实施方案中，本发明还提供选自以下的活性成分在制备用于诱 导CTL的组合物或药物组合物中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
或者，本发明进一步提供选自以下的活性成分用于诱导CTLs：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
或者，本发明进一步提供了制备用于诱导CTLs的组合物或药物组合物的 方法或过程，其是包括将选自以下的活性成分与药学上或生理上可接受的载 体进行配制的步骤的方法或过程：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供了制备用于诱导CTLs的组合物 或药物组合物的方法或过程，其实包括将选自以下的活性成分与药学上或生 理上可接受的载体混合的步骤的方法或过程：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
XI.诱导免疫应答的方法
本发明还提供了诱导针对表达KOC1的癌症的免疫应答的方法。适用的 癌症包括但不限于膀胱癌,宫颈癌，胆管细胞癌，慢性髓细胞性白血病(CML), 结肠癌，直肠癌，食管癌，弥漫性胃癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，淋巴 瘤，骨肉瘤，卵巢癌，肾癌，头颈部癌，软组织肿瘤，睾丸癌等。优选的是 癌症表达选自HLA-A11,HLA-A33,HLA-A03和HLA-A01中至少一种HLA。
本发明还提供了诱导针对表达KOC1的癌细胞的免疫应答的方法。KOC1 被认为在上述各种类型的癌症中过表达。因此，当诱导针对表达KOC1的癌 细胞的免疫应答时，结果抑制了癌细胞的增殖。因此，本发明还提供了抑制 表达KOC1的癌细胞增殖的方法。本发明的方法特别适用于抑制表达KOC1 和选自HLA-A11,HLA-A33,HLA-A03和HLA-A01中至少一种HLA的癌细胞 的增殖。
本发明的方法可以包括施用包含本发明的任何肽或编码所述肽的多核 苷酸的组合物的步骤。本发明的方法还涵盖施用呈递任何本发明的肽的APC 或外来体。关于详情参见“IX.药物组合物”部分，特别是描述本发明的药 物组合物作为疫苗的用途的部分。另外，可用于本发明的诱导免疫应答的方 法的外来体和APC详细描述于上文“V.外来体”、“VI.抗原呈递细胞(APC)”、 和“X.使用肽、外来体、APC和CTL的方法”的项(1)和(2)。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于诱导针对表达KOC1的癌症的 免疫应答的药物组合物或疫苗，其中所述药物组合物或疫苗包含选自以下的 活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明还提供了用于诱导针对表达KOC1的癌细胞的免疫应答的 药物组合物或疫苗，其中所述药物组合物或疫苗包含选自以下的活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明还提供了用于抑制表达KOC1的癌细胞增殖的药物组合物 或疫苗，其中所述药物组合物或疫苗包含选自以下的活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在另一个实施方案中，本发明提供了选自以下的活性成分在制备用于诱 导针对表达KOC1的癌症的免疫应答的药物组合物或疫苗中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明还提供选自以下的活性成分在制备用于诱导针对表达 KOC1的癌细胞的免疫应答的药物组合物或疫苗中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明进一步提供选自以下的活性成分在制备用于抑制表达 KOC1的癌细胞的增殖的药物组合物或疫苗中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
本发明还提供了用于制备诱导针对表达KOC1的癌症的免疫应答的药物 组合物的方法或过程，其中所述方法可以包括将本发明的肽或多核苷酸与药 学上可接受的载体进行混合或配制的步骤。
或者，本发明提供了抑制表达KOC1的癌细胞增殖的方法或诱导针对表 达KOC1的癌症的免疫应答的方法，其包括向受试者施用包含选自以下的活 性成分的疫苗或药物组合物的步骤：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在本发明的语境中，可以通过施用本发明的肽，多肽，APC，外来体和 /或CTL来治疗表达KOC1的癌症。或者通过施用本发明的肽，多肽，APC， 外来体和/或CTL可以诱导针对表达KOC1的癌症的免疫应答。此类癌症的例 子包括但不限于膀胱癌,宫颈癌，胆管细胞癌，慢性髓细胞性白血病(CML), 结肠癌，直肠癌，食管癌，弥漫性胃癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，淋巴 瘤，骨肉瘤，卵巢癌，肾癌，头颈部癌，软组织肿瘤，睾丸癌等，但不限于 此。此外，通过施用本发明的肽，多肽，APC，外来体和/或CTL可以诱导针 对表达KOC1的癌症的免疫应答。因此，在施用包含上述活性成分的疫苗或 药物组合物之前，优选确认待治疗的受试者中患病部位的KOC1表达水平是 否增加。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了在需要癌症治疗的患者中治疗 表达KOC1的癌症的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)测量从患有癌症的受试者的患病部位收集的生物样品中KOC1表达 的水平；
(ii)基于(i)中测量的KOC1表达水平鉴定具有表达KOC1的癌症的受试 者；和
(iii)向表达KOC1的癌症患者施用至少一种选自上述(a)至(e)组成的组 的成分。
或者，本发明进一步提供了疫苗和药物组合物，其包含至少一种选自由 以上(a)至(e)组成的组的活性成分，用于向具有表达KOC1的癌症患者施用。 本发明还提供鉴定或选择要用至少一种选自上述(a)至(e)的活性成分治疗的 受试者的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)测量从患有癌症的受试者的患病部位收集的生物样品中KOC1表达 的水平；
(ii)基于(i)中测量的KOC1表达水平鉴定具有表达KOC1的癌症的受试 者；和
(iii)鉴定或选择(ii)中鉴定的受试者作为可以用至少一种选自由(a)至(e) 组成的组的活性成分治疗的受试者。
在上述方法中从受试者收集的用于测量KOC1表达水平的生物样品没有 特别限制，并且例如，可以优选使用通过活组织检查等收集的含有癌细胞的 组织样品。生物样品中的KOC1表达水平可以通过已知方法测量，例如，可 以使用通过探针或PCR方法检测KOC1基因的转录产物的方法(例如cDNA微 阵列法，Northern印迹法，RT-PCR法等)、通过抗体等检测KOC1基因的翻译 产物的方法(例如，Western印迹法，免疫染色法等)，等等。此外，生物样品 可以是血液样品，在这种情况下，测量针对KOC1的抗体的血液水平，并且 可以基于血液水平来评估患病部位的KOC1表达水平。可以使用已知方法测 量针对KOC1或其片段的抗体的血液水平，例如，可以使用使用KOC1蛋白或 本发明的肽作为抗原的酶免疫测定(EIA)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射 免疫测定(RIA)等。
通常，在不表达KOC1的组织和细胞中，几乎没有检测到KOC1转录产物 和翻译产物。因此，当在从受试者收集的癌细胞或含有癌细胞的组织样品中 检测到KOC1的转录产物或翻译产物时，可以确定受试者的癌症表达KOC1。 在没有表达KOC1的癌症的受试者的血液样品中，几乎没有检测到针对KOC1 或其片段的抗体。因此，当在从受试者收集的血液样品中检测到针对KOC1 或其片段的抗体时，可以确定受试者的癌症表达KOC1。受试者的癌症是否 表达KOC1也可以通过与收集自受试者的非癌症部位的相同类型的生物材料 的测量结果相比较或与收集自未患有癌症的受试者的相同类型的生物材料 (正常对照样品)相比较。即，在与正常对照样品中的测量的靶水平(正常对照 水平)进行比较中，当测试受试者的生物样品中的水平升高时，受试者的癌 症被评估为表达KOC1。例如，当检测到的测量对象的量与正常对照水平相 比增加至少10％或更高时，可以评估受试者的癌症表达KOC1。期望的是， 检测到的测量目标的量优选地比正常对照水平高25％或更高，更优选50％或 更高。此外，检测到的KOC1的转录产物或翻译产物的量可以通过相对于检 测到的已知持家基因(例如β-肌动蛋白，甘油醛-3-磷酸脱氢酶或核糖体蛋白 P1)的量标准化来评价。
在优选的实施方案中，优选在施用至少一种选自由上述(a)至(e)组成的组 的活性成分之前确认受试者的HLA类型。例如，对于要施用与具有选自SEQ ID NOs:5,28,30和32的氨基酸序列的肽相关的活性成分的受试者，优选选择 HLA-A11阳性受试者。对于要施用与具有选自SEQ ID NOs:61,62,63,64,67, 74,77,52,79,80和85的氨基酸序列的肽相关的活性成分的受试者，优选选择 HLA-A33阳性受试者。对于要施用与具有选自SEQ ID NOs:27,30和52的氨 基酸序列的肽相关的活性成分的受试者，优选选择HLA-A03阳性受试者。对于要施用与具有选自SEQ ID NOs:86,87,90,92,46,95和41的氨基酸序列的 肽相关的活性成分的受试者，优选选择HLA-A01阳性受试者。
本发明还提供了本发明的肽与HLA的复合物。上述本发明的复合物可以 是单体或多聚体。当本发明的复合物为多聚体时，聚合的数目没有特别限制， 且可以是任何聚合数目的多聚体。例子包括但不限于四聚体，五聚体，六聚 体等。本发明的多聚体还包括dextramers(WO2002/072631)和streptamers (Knabel M等人,Nat Med.2002Jun；8(6):631-7.)。本发明的肽和HLA的复合物 可以根据已知方法制备(例如,Altman JD等人,Science.1996,274(5284):94-6； WO2002/072631；WO2009/003492；Knabel M,NatMed.2002 Jun；8(6):631-7 等)。例如，本发明的复合物可用于定量对本发明的肽特异的CTLs。例如， 从施用本发明的药物组合物的受试者收集血液样品，并且在分离PBMC之后 制备CD4阴性细胞并与本发明的荧光染料-缀合的复合物接触。然后，可以通 过流式细胞术分析测量对本发明的肽特异性的CTLs的百分比。例如，可以通 过在施用本发明的药物组合物之前，期间和/或之后测量针对本发明的肽的特 异性CTLs来监测本发明的药物组合物的免疫应答诱导作用。
XII.抗体
本发明进一步提供了与本发明的肽结合的抗体。优选的抗体特异性结合 本发明的肽且不会结合(或会微弱结合)不是本发明的肽。在另一个实施方案 中，此类抗体可以包括在HLA分子的背景下识别肽的抗体，即结合肽-MHC 复合物的抗体。抗体的结合特异性可以通过抑制测定来确认。也就是说，如 果在本发明的肽的存在下，待分析的抗体与全长KOC1多肽之间的结合被抑 制，则该抗体显示出特异性结合本发明的肽。针对本发明的肽的抗体可用于 疾病诊断和预后的测定，以及用于选择施用本发明的药物组合物的受试者选择和监测本发明的药物组合物。
本发明还提供了用于检测和/或定量本发明的肽或其片段的各种免疫测 定。此类免疫测定包括但不限于放射免疫测定，免疫色谱，酶联免疫吸附测 定(ELISA)，酶联免疫荧光测定(ELIFA)等，并且在本领域熟知的各种免疫测 定形式的范围内进行。
本发明的抗体可以用于可以检测表达KOC1癌症的免疫学成像方法，且 其实例包括但不限于使用本发明的标记抗体的放射性闪烁照相成像。此类测 定方法在临床上用于检测，监测和预后表达KOC1的癌症；且此类癌症的例 子包括但不限于膀胱癌,宫颈癌，胆管细胞癌，慢性髓细胞性白血病(CML), 结肠癌，直肠癌，食管癌，弥漫性胃癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，淋巴 瘤，骨肉瘤，卵巢癌，肾癌，头颈部癌，软组织肿瘤，睾丸癌等。
本发明的抗体可以以任何任意形式使用，例如单克隆或多克隆抗体，而 且还可包括通过用本发明的肽免疫动物(诸如家兔)而获得的抗血清，所有种 类的多克隆和单克隆抗体，人抗体，及通过遗传重组生成的嵌合抗体和人源 化抗体。
用作获得抗体的抗原的本发明的肽或其片段可以通过基于本文公开的 氨基酸序列通过化学合成或基因工程技术获得。
用作免疫抗原的肽可以是本发明的肽或本发明的肽的片段。此外，该肽 可以与载体结合或与载体缀合以增加免疫原性。匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载 体是公知的。用于将KLH结合至肽的方法也是本领域公知的。
可以用上述抗原免疫任何哺乳动物，且当产生单克隆抗体时优选考虑与 用于细胞融合的亲本细胞的相容性。通常，可使用啮齿目(Rodentia)、兔形目 (Lagomorpha)或灵长目(Primate)的动物。啮齿目动物包括例如小鼠、大鼠和 仓鼠。兔形目动物包括例如家兔。灵长目动物包括例如狭鼻猿(旧大陆猴(old world monkey))诸如食蟹猴(Macacafascicularis)、恒河猴、狒狒和黑猩猩。
用抗原免疫动物的方法是本领域已知的。腹膜内注射和皮下注射抗原是 免疫哺乳动物的标准方法。更具体的说，可以在适量的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)、生理盐水等中稀释和悬浮抗原。如果需要，可将抗原悬浮液与适量 的标准佐剂诸如弗氏(Freund)完全佐剂混合，制成乳状液，然后施用于哺乳 动物。然后，优选的是使用每4至21天施用数次与适量弗氏不完全佐剂混合 的抗原。可使用适宜的载体进行免疫。如上所述进行免疫后，可通过标准方 法检验血清中所需抗体的量的增加。
可以如下制备针对本发明肽的多克隆抗体：从哺乳动物中收集血液(其 已经在免疫后确认了所需抗体血清水平的增)，并通过任何常规方法从血液 中分离血清。多克隆抗体可以是包括含有多克隆抗体的血清，或可以从所述 血清中分离的，含有该多克隆抗体的级分。可以使用例如偶联有本发明肽的 亲和柱从仅识别本发明肽的级分中制备免疫球蛋白G或M，并进一步使用蛋 白A或蛋白G柱纯化该级分。
为了制备单克隆抗体，在确认免疫后所需抗体的血清水平增加时，从哺 乳动物收集免疫细胞并进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞可优选获自 脾。对于其他与上述免疫细胞融合的亲本细胞，例如，可以使用哺乳动物骨 髓瘤细胞，优选已获得融合细胞的药物选择性质的骨髓瘤细胞。
可根据已知的方法，例如Milstein等人(Galfre和Milstein,Methods Enzymol73:3-46(1981))的方法，将上述免疫细胞与骨髓瘤细胞进行融合。
对于由细胞融合得到的杂交瘤，可在标准选择培养基诸如HAT培养基(含 次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基)中培养以进行选择。在HAT培养基中继 续细胞培养足够的时间(例如，数天至数周)，以允许除了所需的杂交瘤之外 的所有其他细胞(非融合细胞)死亡。然后，通过标准有限稀释(standard limiting dilution)来筛选和克隆生成所需抗体的杂交瘤细胞。
除了上述用抗原免疫非人动物来制备杂交瘤的方法外，还可以在体外用 肽、表达肽的细胞或其溶胞物免疫人淋巴细胞，诸如那些感染了EB病毒的人 淋巴细胞。然后，可以使经过免疫的淋巴细胞与永生化的衍生自人的骨髓瘤 细胞诸如U266融合，以产生期望的生成能够与所述肽结合的人抗体的杂交瘤 (JPS63-17688)。
然后将所得杂交瘤移植入小鼠腹腔，并抽取腹水。所得的单克隆抗体可 通过例如硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析或偶联有本发 明肽的亲和柱进行纯化。
或者，可以通过癌基因永生化抗体产生免疫细胞(如免疫的淋巴细胞)， 并用于制备单克隆抗体。
如此获得的单克隆抗体也可以使用遗传工程技术来重组制备(参见例如Borrebaeck and Larrick,Therapeutic Monoclonal Antibodies,由MacMillanPublishers LTD在英国出版(1990))。例如，可以从免疫细胞诸如杂交瘤或经免 疫淋巴细胞克隆编码抗体的DNA，将该DNA插入合适的载体，并导入宿主 细胞以制备重组抗体。本发明还提供如上所述制备的重组抗体。
此外，本发明的抗体可以是抗体片段或经过修饰的抗体，只要它结合本 发明的肽。例如，期望抗体片段含有抗体的抗原结合位点。具体来说，抗体 片段可以是Fab、F(ab’)2、Fv或将来自H链和L链的Fv片段通过合适的接头连 接而成的单链Fv(scFv)(Huston等人.,Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-83 (1988))。更具体的说，可以通过用酶诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体来 生成抗体片段。或者，可以构建编码抗体片段的基因，将其插入表达载体， 并在合适的宿主细胞中表达(参见例如Co等人,J Immunol 152:2968-76(1994)；Better和Horwitz,Methods Enzymol 178:476-96(1989)；Pluckthun和 Skerra,Methods Enzymol 178:497-515(1989)；Lamoyi,Methods Enzymol 121: 652-63(1986)；Rousseaux等人,Methods Enzymol 121:663-9(1986)；Bird和 Walker,Trends Biotechnol9:132-7(1991))。
抗体可以通过与多种分子诸如聚乙二醇(PEG)缀合来修饰。本发明提供 了经过此类修饰的抗体。可通过化学修饰抗体来获得经过修饰的抗体。这些 修饰方法是本领域常规的。
或者，可以以衍生自非人抗体的可变区与衍生自人抗体的恒定区之间的 嵌合抗体或者包含衍生自非人抗体的互补决定区(CDR)、衍生自人抗体的框 架区(FR)及恒定区的人源化抗体的形式来获得本发明的抗体。此类抗体可依 照已知技术来制备。人源化可通过用非人抗体CDR序列取代人抗体的相应序 列来进行(参见例如Verhoeyen等人,Science239:1534-1536(1988))。因而，此 类人源化抗体是嵌合抗体，其中人可变域的一小部分已被来自非人物种的相 应序列所取代。
也可以使用完全的人抗体，这样的抗体除了人框架区和恒定区外还包含 人可变区。此类抗体可使用本领域已知的多种技术来制备。例如，体外方法 包括使用展示在噬菌体上的人抗体片段的重组文库(例如Hoogenboom& Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991))。类似的，可通过将人免疫球蛋白基因座 导入转基因动物，例如内源免疫球蛋白基因部分或完全灭活的小鼠，来生成 人抗体。该方法记载于例如美国专利号6,150,584；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425和5,661,016。
可以将如上获得的抗体纯化至同质。例如，可依照用于一般蛋白质的分 离和纯化方法进行抗体的分离和纯化。例如，可以通过适当选择和组合使用 柱层析诸如亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 和等电聚焦来分离和纯化抗体(Antibodies:A Laboratory Manual.Ed Harlow和 David Lane,Cold Spring HarborLaboratory(1988))，但并不局限于此。蛋白A 柱和蛋白G柱可以用作亲和柱。例示性的可使用的蛋白A柱包括例如Hyper D、POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。
除了亲和色谱，示例性的色谱包括，例如离子交换层析、疏水层析、凝 胶过滤、反相层析、吸附层析、等等(Strategies for Protein Purification和 Characterization:ALaboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak等人,Cold Spring HarborLaboratory Press(1996))。可以通过液相层析来进行层析程序， 诸如HPLC和FPLC。
例如，可通过使用吸光度测量、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶免疫 测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)和/或免疫荧光(IF)来测量本发明抗体的 抗原结合活性。在ELISA中，将本发明的抗体固定化在板上，将本发明的肽 施加到该板上，然后施加含有所需抗体的样品，诸如生成抗体的细胞的培养 物上清液或纯化的抗体。然后施加用酶(诸如碱性磷酸酶)标记的、识别第一 抗体的第二抗体，并将板温育。接着，在洗涤后，向板中加入酶底物，诸如 磷酸对硝基苯酯，并通过测量吸光度以评估样品的抗原结合活性。为了评估 抗体的结合活性，可以使用肽片段如C-末端或N-末端片段作为抗原。可以使 用BIAcore(Pharmacia)来评估本发明抗体的活性。
通过将本发明的抗体暴露于假定含有本发明的肽的样品，并检测或测量 在抗体和肽之间形成的免疫复合物，可以检测或测量使用以上方法的本发明 的肽。
例如，本发明的抗体可用于检测受试者的血液样品(例如，血清样品)中 存在的本发明的肽。或者，也可以使用本发明的肽来检测受试者血液样品(例 如，血清样品)中存在的本发明的抗体。在受试者的血液样品中测量本发明 的肽或本发明的抗体的结果可以用于受试者选择用于施用本发明的药物组 合物或监测药物组合物的功效。此外，已报道具有抗体(其针对作为疫苗施 用的肽)的患者可能对疫苗具有高的应答性。因此，当使用患者的抗体作为 指标(index)施用作为疫苗的本发明的肽时，本发明的肽可用作免疫测定抗原用于选择具有高应答性的患者。
XII.载体和宿主细胞
本发明提供包含编码本发明的肽的多核苷酸的载体和导入有所述载体 的宿主细胞。本发明的载体可以用于将本发明的多核苷酸保持在宿主细胞 中，以在宿主细胞中表达本发明的肽，或者以施用本发明的多核苷酸用于基 因疗法。
当大肠杆菌为宿主细胞且在大肠杆菌(例如JM109、DH5-alpha、HB101 或XL1-Blue)中大量扩增和生成载体时，载体需要具有用于在大肠杆菌中扩 增的“复制起点”和用于选择经过转化的大肠杆菌的标志基因(例如通过药 物诸如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素等进行选择的药物抗性基因)。 例如，可以使用M13系列载体、pUC系列载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script 等。另外，pGEM-T，pDIRECT和pT7可用于克隆以及以上载体。当载体用 于生产本发明的肽时，可以使用表达载体。例如，要在大肠杆菌中表达的表达载体应具备上述在大肠杆菌中扩增的特征。当使用大肠杆菌诸如JM109、 DH5-alpha、HB101或XL1-Blue作为宿主细胞时，载体应具有能在大肠杆菌 中高效表达所需基因的启动子，例如lacZ启动子(Ward等人,Nature 341:544-6 (1989)；FASEB J 6:2422-7(1989))、araB启动子(Better等人,Science 240: 1041-3(1988))、T7启动子等。在这方面，可以使用例如pGEX-5X-1 (Pharmacia)、“QIAexpress系统”(Qiagen)、pEGFP和pET(在这种情况中，宿主优选为表达T7 RNA聚合酶的BL21)来取代上述载体。另外，载体还可以包 含用于肽分泌的信号序列。指导肽分泌至大肠杆菌周质的例示性信号序列有 pelB信号序列(Lei等人,JBacteriol 169:4379(1987))。用于将载体导入靶宿主 细胞的手段包括例如氯化钙法和电穿孔法。
除了大肠杆菌外，还可以使用例如衍生自哺乳动物的表达载体(例如 pcDNA3(Invitrogen)和pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17):5322(1990))、 pEF、pCDM8)、衍生自昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC杆状病毒表 达系统”(GIBCO BRL)、pBacPAK8)、衍生自植物的表达载体(例如pMH1、 pMH2)、衍生自动物病毒的表达载体(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、衍生 自逆转录病毒的表达载体(例如pZIpneo)、衍生自酵母的表达载体(例如“毕 赤酵母表达试剂盒”(Invitrogen)、pNV11、SP-Q01)及衍生自枯草芽孢杆菌的 表达载体(例如pPL608、pKTH50)来生成本发明的多肽。
为了在动物细胞诸如CHO、COS或NIH3T3细胞中表达载体，载体应具 有在所述细胞中进行表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan等人, Nature 277:108(1979))、MMLV-LTR启动子、EF1-alpha启动子(Mizushima等 人,Nucleic Acids Res 18:5322(1990))、CMV启动子、等等，及优选用于选择 转化子的标志基因(例如通过药物(例如新霉素、G418)进行选择的药物抗性基 因)。具有这些特征的已知载体的例子包括例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、 pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。
下面基于上述说明例示本发明的实施方案；然而本发明不限于这些实施 方案。
[1]具有细胞毒性T细胞(CTL)诱导能力的少于15个氨基酸的肽，其包含 选自以下组的氨基酸序列：
(a)选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NOs:5,28,30,32,61,62,63,64,67, 74,77,52,79,80,85,27,86,87,90,92,46,95和41；以及
(b)选自下组的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了1、2或数个 氨基酸的氨基酸序列：SEQ ID NOs:5,28,30,32,61,62,63,64,67,74,77,52, 79,80,85,27,86,87,90,92,46,95和41。
[2][1]的肽，其选自以下组(i)至(iv)的氨基酸序列：
(i)包含氨基酸序列的肽，其中将选自下组(a)至(d)的一个或多个取代引 入到选自下组的氨基酸序列中：SEQ ID NOs:5,28,30和32：
(a)用选自由苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸 组成的组的氨基酸取代自N端起的第二个氨基酸；
(b)用选自由亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，异亮氨酸和丙氨酸组成的组 的氨基酸取代自N端起的第三个氨基酸；
(c)用选自由亮氨酸，异亮氨酸，酪氨酸，缬氨酸和苯丙氨酸组成的组 的氨基酸取代自N端起的第七个氨基酸；和
(d)用选自由赖氨酸和精氨酸组成的组的氨基酸取代C末端的氨基酸；
(ii)包含氨基酸序列的肽，其中将选自下组(a)至(c)的一个或多个取代引 入选自下组的氨基酸序列中：SEQ ID NOs:61,62,63,64,67,74,77,52,79, 80和85：
(a)用选自由天冬氨酸和谷氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第一 个氨基酸；
(b)用选自由苯丙氨酸，酪氨酸，丙氨酸，异亮氨酸，亮氨酸和缬氨酸 组成的组的氨基酸取代自N端起的第二个氨基酸；
(c)用选自由精氨酸和赖氨酸组成的组的氨基酸取代C末端的氨基酸；
(iii)包含氨基酸序列的肽，其中将选自下组(a)至(b)的一个或多个取代引 入选自下组的氨基酸序列中：SEQ ID NOs:27,30和52：
(a)用选自由亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丙氨酸，异亮氨酸，丝氨酸 和苏氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第二个氨基酸；和
(b)用选自由精氨酸，赖氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸组成的组的氨基酸取 代C末端的氨基酸；以及
(iv)包含氨基酸序列的肽，其中将选自下组(a)至(c)的一个或多个取代引 入选自下组的氨基酸序列中：SEQ ID NOs:86,87,90,92,46,95和41：
(a)用选自由苏氨酸和丝氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第二个 氨基酸；
(b)用选自由天冬氨酸和谷氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第三 个氨基酸；
(c)用酪氨酸取代C末端的氨基酸。
[3][1]的肽，其由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NOs:5,28,30,32, 61,62,63,64,67,74,77,52,79,80,85,27,86,87,90,92,46,95和41。
[4]多核苷酸，其编码[1]至[3]中任一项的肽。
[5]组合物，包含药学上可接受的载体和选自下组(a)至(e)的至少一种成 分：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一 项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽 与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复 合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[6][5]的组合物，其是用于诱导CTL的组合物，其中所述成分是选自下 组(a)至(d)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一 项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽 与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的 复合物。
[7][5]的组合物，其是药物组合物。
[8][7]的组合物，其用于选自下组的一种或多种用途：(i)癌症治疗,(ii) 癌症预防(防范(prophylaxis))和(iii)术后癌症复发的预防(防范)。
[9][7]的组合物，其用于诱导针对癌症的免疫应答。
[10][8]或[9]的组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组：膀胱癌，宫 颈癌，胆管细胞癌，慢性髓性白血病(CML)，结肠癌，直肠癌，食管癌，弥 漫性胃癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，卵巢癌，肾癌， 头颈部癌，软组织肿瘤和睾丸癌。
[11][5]至[10]中任一项的组合物，其配制为用于对至少一种选自下组的 HLA阳性的受试者施用：HLA-A11,HLA-A33,HLA-A03和HLA-A01。
[12]诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，其包含选自下组(a)和(b)的步 骤：
(a)体外，离体或体内将APC与[1]至[3]中任一项所述的肽接触；和
(b)将编码[1]至[3]中任一项的肽的多核苷酸导入APC。
[13]诱导CTL的方法，其包含选自下组的步骤：
(a)将CD8阳性T细胞与APC共培养，所述APC在其表面呈递HLA抗原与 [1]至[3]中任一项的肽的复合物；
(b)将CD8阳性T细胞与外来体共培养，所述外来体在其表面呈递HLA 抗原与[1]至[3]中任一项的肽的复合物；
(c)将多核苷酸导入CD8阳性T细胞，所述多核苷酸编码T细胞受体(TCR) 的每个亚基，所述T细胞受体能够结合细胞表面上由HLA抗原呈递的[1]至[3] 中任一项的肽。
[14]APC，其在其表面呈递HLA抗原与[1]至[3]中任一项的肽的复合物。
[15][14]的APC，其通过[12]的方法诱导。
[16]CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[17][16]的CTL，其通过[13]的方法诱导。
[18]诱导针对癌症的免疫应答方法，其包含向受试者施用选自下组(a) 至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一 项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽 与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的 复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[19]治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发的方法，包括向受试 者施用选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一 项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽 与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的 复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[20]抗体，其结合[1]至[3]中任一项的肽。
[21]筛选具有CTL诱导能力的肽的方法，其包含以下步骤：
(a)产生由氨基酸序列组成的候选序列，其中对由选自下组的氨基酸序 列组成的原始氨基酸序列取代，缺失，插入和/或添加一个、两个或数个氨基 酸残基：SEQ ID NOs:5,28,30,32,61,62,63,64,67,74,77,52,79,80,85,27, 86,87,90,92,46,95和41；
(b)从在(a)中产生的候选序列中选择除KOC1外与任何已知的人基因产 物不具有显著同源性(序列同一性)的候选序列；
(c)将APC与由在(b)中选择的候选序列组成的肽接触；
(d)将(c)的APC与CD8阳性T细胞接触；和
(e)选择与原始氨基酸序列组成的肽相比，具有相等或更高的CTL诱导 能力的肽。
[22]选自下组(a)至(e)中的至少一种成分在制备用于诱导针对癌症的免 疫应答的组合物中的用途：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一 项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与 HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复 合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[23]选自下组(a)至(e)中的至少一种成分在制备用于治疗和/或预防癌症 和/或预防其手术后复发的药物组合物中的用途：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一 项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与 HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复 合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[24]选自下组(a)至(e)中的至少一种成分在诱导针对癌症的免疫应答中 的用途：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一 项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复 合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[25]选自下组(a)至(e)中的至少一种成分，其用于治疗和/或预防癌症和/ 或预防其手术后复发：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一 项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与 HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复 合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[26]诱导针对表达KOC1的细胞的细胞毒性活性的方法，其包含向受试 者施用选自下组(a)至(e)中的至少一种成分的步骤：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一 项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与 HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复 合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[27]冷冻干燥制剂，其包含一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽。
[28]药物组合物，其通过包含如下的方法制备：将一种或多种类型的[1] 至[3]中任一项的肽溶解在水溶性载体中，并进行过滤灭菌。
[29]过滤灭菌水溶液，其是包含一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的 肽和水溶性载体的水溶液。
[30]乳剂，其包含一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽，水溶性载 体和油佐剂。
[31]试剂盒，其包含容纳[7]至[11]中任一项的药物组合物的容器和容纳 佐剂的容器。
[32]试剂盒，其包含储存包含[1]至[3]中任一项的肽的冷冻干燥制剂的 容器，储存佐剂的容器，和储存在溶解液冷冻干燥制剂的容器。
本文参考其具体实施方案在此详细解释本发明。然而，应当理解，上述 解释实际上是说明性和解释性解释，并且旨在解释本发明及其优选实施方 式。通过常规实验，本领域技术人员将容易地认识到，在不脱离本发明的精 神和范围的情况下，可以在其中进行各种改变和修改。因此，本发明不限于 上述说明，而是旨在由所附权利要求及其等同物限定。
在下文中，参照实施例更为详细地描述本发明。然而，虽然下述材料、 方法和实施例可以用来帮助普通技术人员进行和使用本发明的某些实施方 案，但是这些仅意图例示本发明的各方面，如此绝不限制本发明的范围。如 本领域普通技术人员会容易认可与本文中描述的那些类似或等同的方法和 材料可用于本发明的实施或测试。
本文引用的所有现有技术文献通过引用并入本说明书。
实施例
[实施例1]
材料和方法
细胞系
C1R，HLA-A阴性和HLA-B阴性人类B淋巴母细胞系，和COS7，非洲绿 猴肾细胞系购自ATCC。
具有稳定的HLA-A*1101表达的刺激细胞的生成
使用稳定表达HLA-A*1101的C1R(C1R-A11)作为刺激细胞。通过PCR 扩增编码HLA-A*1101的开放阅读框的cDNA，并克隆到表达载体中。用表达 载体转染C1R细胞，然后使用G418(Invitrogen)选择两周。将用G418选择的细 胞接种到含有添加有G418的培养基的96孔板的孔中，并进一步培养30天。通 过流式细胞术分析证实C1R细胞中外源的HLA-A*1101表达。
候选KOC1衍生肽的选择
使用结合预测服务器"NetMHC3.2"(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) (Buus等人,Tissue Antigens.2003 Nov,62(5):378-84；Nielsen等人,Protein Sci. 2003 May,12(5):1007-17,Bioinformatics.2004 Jun 12；20(9):1388-97)预测了 结合HLA-A*1101分子的KOC1衍生的9聚体和10聚体肽。
肽合成
通过Biosynthesis(Lewisville,Texas)根据标准固相合成法合成所述肽， 并通过反相高效液相色谱(HPLC)纯化。分别通过分析型HPLC和质谱分析法 来分析肽的纯度(>90％)和身份。将肽以20mg/ml溶解在二甲基亚砜中并保存 于-80℃。
体外CTL诱导
使用单核细胞衍生的树突细胞(DC)作为抗原呈递细胞来诱导针对呈递 在人白细胞抗原(HLA)上的肽的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。如在其他部 分所述，体外制备DC(Nakahara S等人,Cancer Res 2003,63(14):4112-8)。具 体地说，用Ficoll-Paque Plus(Pharmacia)溶液从健康志愿者(HLA-A*1101阳性) 分离的外周血单核细胞，通过粘附塑料组织培养盘(Becton Dickinson)加以分 离，并作为单核细胞级分加以浓缩。将单核细胞富集的群体在含2％热灭活 的自体血清(AS)的AIM-V培养基(Invitrogen)中，在1000IU/ml的粒细胞-巨噬 细胞集落刺激因子(R&D System)和1000IU/ml白介素(IL)-4(R&D System)的存在下培养。培养7天后，将经细胞因子诱导的DC在AIM-V培养基中在3微 克/mlβ2-微球蛋白存在下用20微克/ml每一种合成肽于37℃冲激3小时。所生 成的细胞表现出在它们的细胞表面上表达DC相关分子，诸如CD80、CD83、 CD86和HLA II类(数据未显示)。接着，将这些经肽冲激的DC用X射线放射(20 Gy)灭活，并以1:20比例与使用CD8阳性分离试剂盒(Dynal)通过阳性选择获 得的自体CD8+ T细胞混合。将这些培养产物接种于48孔板(Corning)中。制备 每个孔，以在0.5ml AIM-V/2％AS培养基中含有1.5x104个经肽冲激的DC、3 x105个CD8+ T细胞和10ng/ml IL-7(R&D System)。3天后，向这些培养物添 加终浓度为20IU/ml的IL-2(CHIRON)。在第7天和第14天，将这些T细胞用经 肽冲激的自体DC进一步刺激。DC每次通过与上文所述相同的方式来制备。 在第21天在第三次肽刺激后，通过人干扰素(IFN)-gamma酶联免疫斑点(ELISPOT)测定法来检测针对经肽冲激的C1R-A11细胞的CTLs(Tanaka H等人,Br J Cancer 2001,84(1):94-9；Umano Y等人,Br J Cancer 2001,84(8): 1052-7；Uchida N等人,Clin Cancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T等人, Cancer Sci 2006,97(5):411-9；Watanabe T等人,Cancer Sci 2005,96(8): 498-506)。
CTL扩增程序
使用与Riddell等人(Walter EA等人,N Engl J Med 1995 Oct 19,333(16):1038-44；Riddell SR等人,Nat Med 1996 Feb,2(2):216-23)公开的方法相似的 方法在培养中扩增CTLs。将CTLs与两种类型的经丝裂霉素C处理的人B淋巴 母细胞系在总共25ml的AIM-V培养基中共培养(5x106细胞/烧瓶)，所述培 养基含有含5％AS(AIM-V/5％AS)和40ng/ml抗-CD3抗体。开始培养后一天， 向培养物添加120IU/ml IL-2。在第5天、第8天和第11天，向培养物中添加含 有30IU/ml IL-2的新鲜AIM-V/5％AS培养基(Tanaka H等人,Br JCancer 2001,84(1):94-9；Umano Y等人,Br J Cancer 2001,84(8):1052-7；Uchida N等人,Clin Cancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T等人,Cancer Sci 2006,97(5): 411-9；Watanabe T等人,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)。
CTL克隆的建立
在96圆底微量滴定板(Nalge Nunc International)中进行CTLs稀释以制成 0.3、1和3个细胞/孔。在含有30ng/ml的抗CD3抗体和125IU/ml的IL-2的总共 150微升/孔的AIM-V/5％AS培养基中，将CTLs与两种类型的经丝裂霉素C处 理的人B淋巴母细胞系共培养(1x104细胞/孔)。10天后向培养基中加入50 微升/孔的IL-2以达到125IU/ml的终浓度。在第14天测试CTL活性，并使用如 上所述的相同方法扩增CTL克隆(Uchida N等人,ClinCancer Res 2004,10(24): 8577-86；Suda T等人,Cancer Sci 2006,97(5):411-9；Watanabe T等人,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)。
特异性CTL活性
为了检查特异性CTL活性，实施了IFN-gamma ELISPOT测定法和 IFN-gamma酶联免疫吸附测定法(ELISA)。具体地，制备经肽冲激的C1R-A11 (1x104细胞/孔)作为刺激细胞。使用诱导的CTLs(即CTL系和CTL克隆)用 作应答细胞。根据制造商的说明实施IFN-gammaELISPOT测定法和 IFN-gamma ELISA。
强迫表达靶基因和HLA-A*1101的靶细胞的建立
通过PCR来扩增编码靶基因或HLA-A*1101的开放阅读框的cDNA。将 PCR扩增产物克隆入表达载体。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)依照制造 商的说明将表达靶基因的载体和表达HLA-A*1101的载体之一或两者转染入 COS7(其是靶基因和HLA阴性的细胞系)。转染两天后，用Versene(Invitrogen) 收获经转染的细胞，并用作CTL活性测定法的靶细胞(5x104细胞/孔)。
结果
KOC1衍生的HLA-A*1101结合肽的预测
表1a和1b以结合亲和力的降序显示了已预测结合HLA-A*1101的KOC1 衍生的9聚体肽和10聚体肽。选择并检查了总共60种潜在具有HLA-A*1101 结合能力的肽以确定表位肽。
[表1a]
衍生自KOC1的HLA-A11结合9聚体肽
起始位置 氨基酸序列 Kd(nM) SEQ ID NO
258 KSILEIMHK 16 1
121 VVNVTYSSK 18 2
465 KAQGRIYGK 32 3
517 SSAEVVVPR 45 4
415 LSVGAIIGK 76 5
28 PVSGPFLVK 85 6
52 KAIEALSGK 92 7
142 FQLENFTLK 150 8
215 GATIRNITK 293 9
338 KAEEEIMKK 297 10
497 FAAGRVIGK 405 11
15 PSDLESIFK 451 12
536 VVKITGHFY 757 13
479 FVSPKEEVK 791 14
493 RVPSFAAGR 1100 15
272 KFTEEIPLK 1108 16
226 QSKIDVHRK 1125 17
330 KGNVETCAK 1835 18
544 YACQVAQRK 1841 19
220 NITKQTQSK 2617 20
301 KIEQDTDTK 2631 21
553 IQEILTQVK 3008 22
182 QGSPGSVSK 3293 23
559 QVKQHQQQK 3313 24
58 SGKIELHGK 4377 25
205 QFVGAIIGK 4472 26
[表1b]
衍生自KOC1的HLA-A11结合10聚体肽
起始位置 氨基酸序列 Kd(nM) SEQ ID NO
120 AVVNVTYSSK 13 27
414 ALSVGAIIGK 33 28
456 ITGPPEAQFK 73 29
204 TQFVGAIIGK 86 30
73 SVPKRQRIRK 103 31
14 APSDLESIFK 152 32
183 GSPGSVSKQK 165 33
496 SFAAGRVIGK 168 34
516 LSSAEVVVPR 169 35
552 KIQEILTQVK 214 36
431 LSRFAGASIK 342 37
181 RQGSPGSVSK 368 38
124 VTYSSKDQAR 437 39
225 TQSKIDVHRK 478 40
535 VVVKITGHFY 678 41
224 QTQSKIDVHR 711 42
57 LSGKIELHGK 904 43
141 GFQLENFTLK 911 44
568 ALQSGPPQSR 1065 45
312 ISPLQELTTLY 1262 46
441 IAPAEAPDAK 1570 47
27 IPVSGPFLVK 1622 48
570 QSGPPQSRRK 1777 49
95 EVLDSLLVQY 2124 50
336 CAKAEEEIMK 2194 51
281 ILAHNNFVGR 2264 52
466 AQGRIYGKIK 2595 53
160 AQQNPLQQPR 2689 54
420 IIGKQGQHIK 2763 55
558 TQVKQHQQQK 2862 56
257 CKSILEIMHK 3467 57
291 LIGKEGRNLK 3795 58
263 IMHKEAQDIK 4083 59
569 LQSGPPQSRR 4107 60
起始位置指示从KOC1的N端起的氨基酸残基的数目，解离常数[Kd(nM)] 来源于″NetMHC3.2″。
通过预测的KOC1衍生的HLA-A*1101限制性肽来诱导CTLs
依照如“材料和方法”中描述的方案生成针对KOC1衍生的肽的CTLs。 通过IFN-gamma ELISPOT测定法测量肽特异性CTL活性(图1)。与对照相比， 具有KOC1-A11-9-415(SEQ ID NO:5)的孔#6(a)，具有KOC1-A11-10-414 (SEQ ID NO:28)的孔#4(b)，具有KOC1-A11-10-204(SEQ ID NO:30)的孔 #5(c),和具有KOC1-A11-10-14(SEQ ID NO:32)的孔#8(d)中的CTLs显示出强 的IFN-gamma生成。与此同时，尽管示于表1a和1b中的其他肽潜在具有 HLA-A*1101结合活性，未检测到作为这些肽的刺激结果的特异性CTL活性。 典型阴性数据的实例是从用KOC1-A11-9-258(SEQ ID NO:1)刺激的CTLs中 未观察到特异性IFN-gamma产生(e)。结果，选择四种类型的KOC1衍生肽作 为能够诱导有效CTLs的肽。
针对KOC1衍生的HLA-A*1101限制性肽的CTL系和克隆的建立
通过增殖具有KOC1-A11-9-415(SEQ ID NO:5)的孔#6(a)，具有 KOC1-A11-10-204(SEQ ID NO:30)的孔#5中(b)，和具有KOC1-A11-10-14 (SEQ ID NO:32)的孔#8中(c)中的CTLs来建立CTL系，其在IFN-gamma ELISPOT测定法中显示出肽特异性CTL活性。通过IFN-gamma ELISA测量这 些CTL系的CTL活性(图2)。与没有用肽冲击的靶细胞相比，这些CTL系表现 出针对用相应肽冲击的靶细胞的强的IFN-gamma生成。此外，通过从如以上 “材料和方法”部分中描述的CTL系的有限稀释建立CTL克隆，并通过 IFN-gamma ELISA测量针对肽冲击的C1R-A11的来自CTL克隆的IFN-gamma 生成。在用KOC1-A11-9-415(SEQ ID NO:5)(a)和KOC1-A11-10-14(SEQ ID NO:32)(b)刺激的CTL克隆中观察到强的IFN-gamma生成(图3)。
针对表达KOC1和HLA-A*1101的靶细胞的特异性CTL活性
建立针对KOC1-A11-10-14(SEQ ID NO:32)的CTL克隆来研究其识别表 达KOC1和HLA-A*1101分子的靶细胞的能力。制备用全长的KOC1和 HLA-A*1101基因两者转染的COS7细胞(表达KOC1和HLA-A*1101基因的靶 细胞的特定模型)作为靶细胞。制备用全长KOC1或HLA-A*1101转染的 COS7细胞作为对照。KOC1-A11-10-14(SEQ ID NO:32)刺激的CTL克隆显示 针对表达KOC1和HLA-A*1101两者的COS7细胞的强的CTL活性(图4)。另一 方面，针对对照没有检出显著的特异性CTL活性。这些数据清楚证明 KOC1-A11-10-14(SEQ ID NO:32)是产生自KOC1内源性加工的肽，并与 HLA-A*1101分子呈递在靶细胞上，并被CTLs识别。这些结果表明了以下可 能性，即KOC1-A11-10-14(SEQ ID NO:32)作为癌症疫苗用于患有表达KOC1 的癌症的患者可以是合适的。
抗原肽的同源性分析
用KOC1-A11-9-415(SEQ ID NO:5),KOC1-A11-10-414(SEQ ID NO:28), KOC1-A11-10-204(SEQ ID NO:30),或KOC1-A11-10-14(SEQ ID NO:32)刺 激的CTLs显示出显著的特异性CTL活性。这些结果可能是因为 KOC1-A11-9-415(SEQ ID NO:5),KOC1-A11-10-414(SEQ ID NO:28), KOC1-A11-10-204(SEQ ID NO:30),和KOC1-A11-10-14(SEQ ID NO:32)序 列与衍生自已知敏化人免疫系统的其它分子的肽同源。为了排除此可能性， 通过使用BLAST算法(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查询这些肽的序列来进 行同源性分析。这一结果显示没有与KOC1-A11-9-415(SEQ ID NO:5), KOC1-A11-10-414(SEQ ID NO:28),KOC1-A11-10-204(SEQ ID NO:30),和 KOC1-A11-10-14(SEQ ID NO:32)序列具有显着同源性的序列。另一方面， KOC1-A11-10-204(SEQ ID NO:30)与在IMP-2(其是另一个IMP家族)中鉴定 的肽序列相同。之前已经报道IMP-2在除睾丸和胎儿肝脏之外的正常器官中 不表达(Hammer NA等人,Reproduction.2005；130(2):203-12)。它牵涉胶质 母细胞瘤癌干细胞的增殖(Janiszewska M等人,Genes Dev.2012；26(17): 1926-44)。IMP-2有望作为癌症免疫治疗的靶抗原。因此，根据本发明人的知 识，这些肽几乎不可能引发针对其他不相关分子的非预期免疫应答。总之， 鉴定了新的KOC1衍生的HLA-A11限制性表位肽。证明了KOC1衍生的表位肽 适用于癌症免疫治疗。
[实施例2]
材料和方法
细胞系
C1R，HLA-A阴性和HLA-B阴性人类B淋巴母细胞系，和COS7，非洲绿 猴肾细胞系购自ATCC。
具有稳定的HLA-A*3303表达的刺激细胞的生成
使用稳定表达HLA-A*3303的C1R(C1R-A33)作为刺激细胞。通过PCR 扩增编码HLA-A*3303的开放阅读框的cDNA，并克隆到表达载体中。用表达 载体转染C1R细胞，然后使用G418(Invitrogen)选择两周。将用G418选择的细 胞接种到含有添加有G418的培养基的96孔板的孔中，并进一步培养30天。通 过流式细胞术分析证实C1R细胞中外源的HLA-A*3303表达。
候选KOC1衍生肽的选择
使用结合预测服务器“NetMHCpan2.8” (www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)(Nielsen等人.,PLoS One.2007；29； 2(8):e796；Hoof等人.,Immunogenetics.2009；61(1):1-13)预测了结合 HLA-A*3303分子的KOC1衍生的9聚体和10聚体肽。
肽合成
通过Biosynthesis(Lewisville,Texas)根据标准固相合成法合成这些肽， 并通过反相高效液相色谱(HPLC)纯化。分别通过分析型HPLC和质谱分析法 来分析肽的纯度(>90％)和身份。将肽以20mg/ml溶解在二甲基亚砜中并保存 于-80℃。
体外CTL诱导
使用单核细胞衍生的树突细胞(DC)作为抗原呈递细胞来诱导针对呈递 在人白细胞抗原(HLA)上的肽的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。如在其他部 分所述，体外制备DC(Nakahara S等人,Cancer Res 2003,63(14):4112-8)。具 体地说，用Ficoll-Paque Plus(Pharmacia)溶液从健康志愿者(HLA-A*3303阳性) 分离的外周血单核细胞，通过粘附塑料组织培养盘(Becton Dickinson)加以分 离，并作为单核细胞级分加以浓缩。将单核细胞富集的群体在含2％热灭活 的自体血清(AS)的AIM-V培养基(Invitrogen)中，在1000IU/ml的粒细胞-巨噬 细胞集落刺激因子(R&D System)和1000IU/ml白介素(IL)-4(R&D System)的存在下培养。培养7天后，将经细胞因子诱导的DC在AIM-V培养基中在3微 克/mlβ2-微球蛋白存在下用20微克/ml每一种合成肽于37℃冲激3小时。所生 成的细胞表观上在它们的细胞表面上表达DC相关分子，诸如CD80、CD83、 CD86和HLA II类(数据未显示)。接着，将这些经肽冲激的DC用X射线放射(20 Gy)灭活，并以1:20比例与用CD8阳性分离试剂盒(Dynal)通过阳性选择获得 的自体CD8+ T细胞混合。将这些培养产物接种于48孔板(Corning)中。制备每 个孔，以在0.5ml AIM-V/2％AS培养基中含有1.5x104个经肽冲激的DC、3x 105个CD8+T细胞和10ng/ml IL-7(R&D System)。3天后，向这些培养物添加 终浓度为20IU/ml的IL-2(CHIRON)。在第7天和第14天，将这些T细胞用经肽 冲激的自体DC进一步刺激。DC每次通过与上文所述相同的方式来制备。在 第21天在第三次肽刺激后，通过人干扰素(IFN)-gamma酶联免疫斑点 (ELISPOT)测定法来检测针对经肽冲激的C1R-A33细胞的CTLs(Tanaka H等人,Br J Cancer 2001,84(1):94-9；Umano Y等人,Br J Cancer 2001,84(8): 1052-7；Uchida N等人,Clin Cancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T等人, Cancer Sci 2006,97(5):411-9；Watanabe T等人,Cancer Sci 2005,96(8): 498-506)。
CTL扩增程序
使用与Riddell等人(Walter EA等人,N Engl J Med 1995 Oct 19,333(16):1038-44；Riddell SR等人,Nat Med 1996 Feb,2(2):216-23)公开的方法相似的 方法在培养中扩增CTL。将CTLs与两种类型的经丝裂霉素C处理的人B淋巴 母细胞系在总共25ml的AIM-V培养基中共培养(5x106细胞/烧瓶)，所述培 养基含有含5％AS(AIM-V/5％AS)和40ng/ml抗-CD3抗体。开始培养后一天， 向培养物添加120IU/ml IL-2。在第5天、第8天和第11天，向培养物中添加含 有30IU/ml IL-2的新鲜AIM-V/5％AS培养基(Tanaka H等人,Br JCancer 2001,84(1):94-9；Umano Y等人,Br J Cancer 2001,84(8):1052-7；Uchida N等人,Clin Cancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T等人,Cancer Sci 2006,97(5): 411-9；Watanabe T等人,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)。
CTL克隆的建立
在96圆底微量滴定板(Nalge Nunc International)中进行CTLs稀释以制成 0.3、1和3个细胞/孔。在含有30ng/ml的抗CD3抗体和125IU/ml的IL-2的总共 150微升/孔的AIM-V/5％AS培养基中，将CTLs与两种类型的经丝裂霉素C处 理的人B淋巴母细胞系共培养(1x104细胞/孔)。10天后向培养基中加入50 微升/孔的IL-2以达到125IU/ml的终浓度。在第14天测试CTL活性，并使用如 上所述的相同方法扩增CTL克隆(Uchida N等人,ClinCancer Res 2004,10(24): 8577-86；Suda T等人,Cancer Sci 2006,97(5):411-9；Watanabe T等人,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)。
特异性CTL活性
为了检查特异性CTL活性，实施了IFN-gamma ELISPOT测定法和 IFN-gamma酶联免疫吸附测定法(ELISA)。具体地，制备经肽冲激的C1R-A33 (1x104细胞/孔)作为刺激细胞。使用诱导的CTLs(即CTL系和CTL克隆)用 作应答细胞。根据制造商的说明实施IFN-gammaELISPOT测定法和 IFN-gamma ELISA。
强迫表达靶基因和HLA-A*3303的靶细胞的建立
通过PCR来扩增编码靶基因或HLA-A*3303的开放阅读框的cDNA。将 PCR扩增产物克隆入表达载体。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)依照制造 商的说明将表达靶基因的载体和表达HLA-A*3303的载体之一或两者转染入 COS7(其是靶基因和HLA阴性的细胞系)。转染两天后，用Versene(Invitrogen) 收获经转染的细胞，并用作CTL活性测定法的靶细胞(5x104细胞/孔)。
结果
KOC1衍生的HLA-A*3303结合肽的预测
表2a和2b以结合亲和力的降序显示了已预测结合HLA-A*3303的KOC1 衍生的9聚体肽和10聚体肽。选择并检查了总共37种潜在具有HLA-A*3303 结合能力的肽以确定表位肽。
[表2a]
衍生自KOC1的HLA-A33结合9聚体肽
起始位置 氨基酸序列 Kd(nM) SEQ ID NO
543 FYACQVAQR 98 61
517 SSAEVVVPR 105 4
282 LAHNNFVGR 140 62
493 RVPSFAAGR 182 15
317 ELTLYNPER 260 63
485 EVKLEAHIR 278 64
125 TYSSKDQAR 467 65
461 EAQFKAQGR 555 66
286 NFVGRLIGK 933 67
225 TQSKIDVHR 1039 68
69 EVEHSVPKR 1453 69
161 QQNPLQQPR 1485 70
406 ETVHLFIPA 2340 71
73 SVPKRQRIR 2969 72
570 QSGPPQSRR 3001 73
121 VVNVTYSSK 3272 2
465 KAQGRIYGK 3308 3
142 FQLENFTLK 4063 8
34 LVKTGYAFV 4107 74
211 IGKEGATIR 4197 75
307 DTKITISPL 4676 76
[表2b]
衍生自KOC1的HLA-A33结合10聚体肽
起始位置 氨基酸序列 Kd(nM) SEQ ID NO
542 HFYACQVAQR 16 77
124 VTYSSKDQAR 201 39
224 QTQSKIDVHR 296 42
281 ILAHNNFVGR 320 52
72 HSVPKRQRIR 428 78
516 LSSAEVVVPR 467 35
496 SFAAGRVIGK 1710 34
543 FYACQVAQRK 2635 79
424 QGQHIKQLSR 2752 80
190 KQKPCDLPLR 3492 81
431 LSRFAGASIK 3726 37
568 ALQSGPPQSR 4478 45
210 IIGKEGATIR 4831 82
478 NFVSPKEEVK 4831 83
77 RQRIRKLQIR 4883 84
285 NNFVGRLIGK 4883 85
起始位置指示从KOC1的N端起的氨基酸残基的数目，解离常数[Kd(nM)] 来源于″NetMHCpan2.8″。
通过预测的KOC1衍生的HLA-A*3303限制性肽来诱导CTLs
依照如“材料和方法”中描述的方案生成针对KOC1衍生的肽的CTLs。 通过IFN-gamma ELISPOT测定法测量肽特异性CTL活性(图5)。与对照相比， 具有KOC1-A33-9-543(SEQ ID NO：61)的孔#1(a)，具有KOC1-A33-9-282 (SEQ ID NO：62)的孔#2(b)，具有KOC1-A33-9-317(SEQ ID NO：63)的孔 #3(c)，具有KOC1-A33-9-485(SEQ ID NO：64)的孔#8(d)，具有 KOC1-A33-9-286(SEQ ID NO：67)的孔#3(e)，具有KOC1-A33-9-34(SEQ ID NO：74)的孔#8(f)，具有KOC1-A33-10-542(SEQ ID NO：77)的孔#4(g)，具有 KOC1-A33-10-281(SEQID NO：52)的孔#3(h)，具有KOC1-A33-10-543(SEQ ID NO：79)的孔#6(i)，具有KOC1-A33-10-424(SEQ ID NO：80)的孔#1(j)，和 具有KOC1-A33-10-285(SEQ ID NO：85)的孔#5(k)显示出强的IFN-gamma生 成。与此同时，尽管示于表2a和2b中的其他肽潜在具有HLA-A*3303结合活 性，未检测到作为这些肽的刺激的结果的特异性CTL活性。典型阴性数据的 实例是从用KOC1-A33-9-517(SEQ ID NO:4)刺激的CTLs中未观察到特异性 IFN-gamma产生(l)。结果，选择11种类型的KOC1衍生肽作为能够诱导有效 CTL的肽。
针对KOC1衍生的HLA-A*3303限制性肽的CTL系和克隆的建立
通过增殖具有KOC1-A33-9-543(SEQ ID NO:61)的孔#1中(a),具有 KOC1-A33-9-282(SEQ ID NO:62)的孔#2中(b),具有KOC1-A33-9-485(SEQ ID NO:64)的孔#8中(c)，具有KOC1-A33-9-286(SEQ ID NO:67)的孔#3中(d), 具有KOC1-A33-10-542(SEQ ID NO:77)(e)的孔#4中，和具有 KOC1-A33-10-281(SEQ ID NO:52)的孔#3(f)中的CTLs来建立CTL系，其在 IFN-gamma ELISPOT测定法中显示出肽特异性CTL活性。通过IFN-gamma ELISA测量这些CTL系的CTL活性(图6)。与没有用肽冲击的靶细胞相比，这 些CTL系表现出针对用相应肽冲击的靶细胞的强的IFN-gamma生成。此外， 通过从如以上“材料和方法”部分中描述的CTL系的有限稀释建立CTL克隆， 并通过IFN-gamma ELISA测量针对肽冲击的C1R-A33的来自CTL克隆的 IFN-gamma生成。在用KOC1-A33-9-543(SEQ ID NO:61)(a), KOC1-A33-9-282(SEQID NO:62)(b),KOC1-A33-9-485(SEQ ID NO:64)(c), KOC1-A33-9-286(SEQ ID NO:67)(d),KOC1-A33-10-542(SEQ ID NO:77) (e),和KOC1-A33-10-281(SEQ ID NO:52)(f)刺激的CTL克隆中观察到强的 IFN-gamma生成(图7)。
针对表达KOC1和HLA-A*3303的靶细胞的特异性CTL活性
建立针对KOC1-A33-9-485(SEQ ID NO:64)(a),KOC1-A33-9-286(SEQ ID NO:67)(b),和KOC1-A33-10-542(SEQ ID NO:77)(c)的CTL系和CTL克隆 来研究它们识别表达KOC1和HLA-A*3303分子的靶细胞的能力。制备用全长 的KOC1和HLA-A*3303基因两者转染的COS7细胞(表达KOC1和 HLA-A*3303基因的靶细胞的特定模型)作为靶细胞。制备用全长KOC1或 HLA-A*3303转染的COS7细胞作为对照。用KOC1-A33-9-485(SEQ ID NO: 64)(a),KOC1-A33-9-286(SEQ ID NO:67)(b),或KOC1-A33-10-542(SEQ ID NO:77)(c)刺激的CTL克隆显示针对表达KOC1和HLA-A*3303两者的COS7 细胞的强的CTL活性(图8)。另一方面，针对对照没有检出显著的特异性CTL 活性。这些数据清楚证明KOC1-A33-9-485(SEQ ID NO:64), KOC1-A33-9-286(SEQ ID NO:67),和KOC1-A33-10-542(SEQ ID NO:77) 是产生自KOC1内源性加工的肽，并与HLA-A*3303分子呈递在靶细胞上，并 被CTLs识别。这些结果表明了以下可能性，即KOC1-A33-9-485(SEQ ID NO: 64),KOC1-A33-9-286(SEQ ID NO:67),和KOC1-A33-10-542(SEQ ID NO: 77)作为癌症疫苗用于患有表达KOC1的癌症的患者可以是合适的。
抗原肽的同源性分析
用KOC1-A33-9-543(SEQ ID NO:61),KOC1-A33-9-282(SEQ ID NO: 62),KOC1-A33-9-317(SEQ ID NO:63),KOC1-A33-9-485(SEQ ID NO:64), KOC1-A33-9-286(SEQ IDNO:67),KOC1-A33-9-34(SEQ ID NO:74), KOC1-A33-10-542(SEQ ID NO:77),KOC1-A33-10-281(SEQ ID NO:52), KOC1-A33-10-543(SEQ ID NO:79),KOC1-A33-10-424(SEQ IDNO:80),或 KOC1-A33-10-285(SEQ ID NO:85)刺激的CTLs显示出显著的特异性CTL 活性。这些结果可能是因为KOC1-A33-9-543(SEQ ID NO:61), KOC1-A33-9-282(SEQ ID NO:62),KOC1-A33-9-317(SEQ ID NO:63), KOC1-A33-9-485(SEQ ID NO:64),KOC1-A33-9-286(SEQID NO:67), KOC1-A33-9-34(SEQ ID NO:74),KOC1-A33-10-542(SEQ ID NO:77), KOC1-A33-10-281(SEQ ID NO:52),KOC1-A33-10-543(SEQ ID NO:79), KOC1-A33-10-424(SEQID NO:80),和KOC1-A33-10-285(SEQ ID NO:85) 序列与衍生自已知敏化人免疫系统的其它分子的肽同源。为了排除此可能 性，通过使用BLAST算法(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查询这些肽的序列 来进行同源性分析。这一结果证明了KOC1-A33-9-543(SEQID NO:61), KOC1-A33-9-317(SEQ ID NO:63),KOC1-A33-9-485(SEQ ID NO:64), KOC1-A33-9-34(SEQ ID NO:74),KOC1-A33-10-542(SEQ ID NO:77), KOC1-A33-10-543(SEQ IDNO:79),和KOC1-A33-10-424(SEQ ID NO:80) 序列是唯一的。另一方面，KOC1-A33-9-282(SEQ ID NO:62), KOC1-A33-9-286(SEQ ID NO:67),KOC1-A33-10-281(SEQ ID NO:52),和KOC1-A33-10-285(SEQ ID NO:85)与在IMP-1(其是另一个IMP家族)中鉴定 的肽序列相同。KOC1-A33-9-485(SEQ ID NO:64)与在IMP-2中鉴定的肽序列 相同。之前已经报道IMP-1在除睾丸，胎儿肝脏和胎盘之外的正常器官中不 表达(Hammer NA等人,Reproduction.2005；130(2):203-12)。据报道，它与 肺癌患者的肿瘤进展相关(Kato T等人.,Clin CancerRes.2007；13:434-42)。 之前已经报道IMP-2在除睾丸和胎儿肝脏之外的正常器官中不表达(Hammer NA等人,Reproduction.2005；130(2):203-12)。它牵涉胶质母细胞瘤癌干细胞的增殖(Janiszewska M等人,Genes Dev.2012；26(17):1926-44)。IMP-1和 IMP-2有望作为癌症免疫治疗的靶抗原。因此，根据本发明人的知识，这些 肽几乎不可能引发针对其他不相关分子的非预期免疫应答。总之，鉴定了新 的KOC1衍生的HLA-A33限制性表位肽。证明了KOC1衍生的表位肽适用于 癌症免疫治疗。
[实施例3]
材料和方法
细胞系
C1R，HLA-A阴性和HLA-B阴性人类B淋巴母细胞系，和COS7，非洲绿 猴肾细胞系购自ATCC。
具有稳定的HLA-A*0301表达的刺激细胞的生成
使用稳定表达HLA-A*0301的C1R(C1R-A03)作为刺激细胞。通过PCR 扩增编码HLA-A*0301的开放阅读框的cDNA，并克隆到表达载体中。用表达 载体转染C1R细胞，然后使用G418(Invitrogen)选择两周。将用G418选择的细 胞接种到含有添加有G418的培养基的96孔板的孔中，并进一步培养30天。通 过流式细胞术分析证实C1R细胞中外源的HLA-A*0301表达。
衍生的KOC1肽候选者的选择
使用结合预测服务器“NetMHC 3.2”(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) (Buus等人,Tissue Antigens.2003 Nov,62(5):378-84；Nielsen等人,Protein Sci. 2003 May,12(5):1007-17；Bioinformatics.2004 Jun 12:20(9):1388-97)预测了 结合HLA-A*0301分子的KOC1衍生的9聚体和10聚体肽。
肽合成
通过Biosynthesis(Lewisville,Texas)根据标准固相合成法合成这些肽， 并通过反相高效液相色谱(HPLC)纯化。分别通过分析型HPLC和质谱分析法 来分析肽的纯度(>90％)和身份。将肽以20mg/ml溶解在二甲基亚砜中并保存 于-80℃。
体外CTL诱导
使用单核细胞衍生的树突细胞(DC)作为抗原呈递细胞来诱导针对呈递 在人白细胞抗原(HLA)上的肽的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。如在其他部 分所述，体外制备DC(Nakahara S等人,Cancer Res 2003,63(14):4112-8)。具 体地说，用Ficoll-Paque Plus(Pharmacia)溶液从健康志愿者(HLA-A*0301阳性) 分离的外周血单核细胞，通过粘附塑料组织培养盘(Becton Dickinson)加以分 离，并作为单核细胞级分加以浓缩。将单核细胞富集的群体在含2％热灭活 的自体血清(AS)的AIM-V培养基(Invitrogen)中，在1000IU/ml的粒细胞-巨噬 细胞集落刺激因子(R&D System)和1000IU/ml白介素(IL)-4(R&D System)的存在下培养。培养7天后，将经细胞因子诱导的DC在AIM-V培养基中在3微 克/mlβ2-微球蛋白存在下用20微克/ml每一种合成肽于37℃冲激3小时。所生 成的细胞表观上在它们的细胞表面上表达DC相关分子，诸如CD80、CD83、 CD86和HLA II类(数据未显示)。接着，将这些经肽冲激的DC用X射线放射(20 Gy)灭活，并以1:20比例与用CD8阳性分离试剂盒(Dynal)通过阳性选择获得 的自体CD8+ T细胞混合。将这些培养产物接种于48孔板(Corning)中。制备每 个孔，以在0.5ml AIM-V/2％AS培养基中含有1.5x104个经肽冲激的DC、3x 105个CD8+T细胞和10ng/ml IL-7(R&D System)。3天后，向这些培养物添加 终浓度为20IU/ml的IL-2(CHIRON)。在第7天和第14天，将这些T细胞用经肽 冲激的自体DC进一步刺激。DC每次通过与上文所述相同的方式来制备。在 第21天在第三次肽刺激后，通过人干扰素(IFN)-gamma酶联免疫斑点 (ELISPOT)测定法来检测针对经肽冲激的C1R-A03细胞的CTLs(Tanaka H等人,Br J Cancer 2001,84(1):94-9；Umano Y等人,Br J Cancer 2001,84(8): 1052-7；Uchida N等人,Clin Cancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T等人, Cancer Sci 2006,97(5):411-9；Watanabe T等人,Cancer Sci 2005,96(8): 498-506)。
CTL扩增程序
使用与Riddell等人(Walter EA等人,N Engl J Med 1995 Oct 19,333(16):1038-44；Riddell SR等人,Nat Med 1996 Feb,2(2):216-23)公开的方法相似的 方法在培养中扩增CTL。将CTLs与两种类型的经丝裂霉素C处理的人B淋巴 母细胞系在总共25ml的AIM-V培养基中共培养(5x106细胞/烧瓶)，所述培 养基含有含5％AS(AIM-V/5％AS)和40ng/ml抗-CD3抗体。开始培养后一天， 向培养物添加120IU/ml IL-2。在第5天、第8天和第11天，向培养物中添加含 有30IU/ml IL-2的新鲜AIM-V/5％AS培养基(Tanaka H等人,Br JCancer 2001,84(1):94-9；Umano Y等人,Br J Cancer 2001,84(8):1052-7；Uchida N等人,Clin Cancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T等人,Cancer Sci 2006,97(5): 411-9；Watanabe T等人,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)。
CTL克隆的建立
在96圆底微量滴定板(Nalge Nunc International)中进行CTLs稀释以制成 0.3、1和3个细胞/孔。在含有30ng/ml的抗CD3抗体和125IU/ml的IL-2的总共 150微升/孔的AIM-V/5％AS培养基中，将CTLs与两种类型的经丝裂霉素C处 理的人B淋巴母细胞系共培养(1x104细胞/孔)。10天后向培养基中加入50 微升/孔的IL-2以达到125IU/ml的终浓度。在第14天测试CTL活性，并使用如 上所述的相同方法扩增CTL克隆(Uchida N等人,ClinCancer Res 2004,10(24): 8577-86；Suda T等人,Cancer Sci 2006,97(5):411-9；Watanabe T等人,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)。
特异性CTL活性
为了检查特异性CTL活性，实施了IFN-gamma ELISPOT测定法和IFN- gamma酶联免疫吸附测定法(ELISA)。具体地，制备经肽冲激的C1R-A03(1x 104细胞/孔)作为刺激细胞。使用诱导的CTLs(即CTL系和CTL克隆)用作应 答细胞。根据制造商的说明实施IFN-gammaELISPOT测定法和IFN-gamma ELISA。
强迫表达靶基因和HLA-A*0301的靶细胞的建立
通过PCR来扩增编码靶基因或HLA-A*0301的开放阅读框的cDNA。将PCR扩增产物克隆入表达载体。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)依照制造 商的说明将表达靶基因的载体和表达HLA-A*0301的载体之一或两者转染入 COS7(其是靶基因和HLA阴性的细胞系)。转染两天后，用Versene(Invitrogen) 收获经转染的细胞，并用作CTL活性测定法的靶细胞(5x104细胞/孔)。
结果
KOC1衍生的HLA-A*0301结合肽的预测
表3a和3b以结合亲和力的降序显示了已预测结合HLA-A*0301的KOC1 衍生的9聚体肽和10聚体肽。选择并检查了总共23种潜在具有HLA-A*0301 结合能力的肽以确定表位肽。
[表3a]
衍生自KOC1的HLA-A3结合9聚体肽
起始位置 氨基酸序列 Kd(nM) SEQ ID NO
121 VVNVTYSSK 84 2
258 KSILEIMHK 124 1
52 KAIEALSGK 496 7
28 PVSGPFLVK 613 6
465 KAQGRIYGK 650 3
142 FQLENFTLK 752 8
415 LSVGAIIGK 764 5
497 FAAGRVIGK 927 11
559 QVKQHQQQK 1152 24
[表3b]
衍生自KOC1的HLA-A3结合10聚体肽
起始位置 氨基酸序列 Kd(nM) SEQ ID NO
120 AVVNVTYSSK 17 27
414 ALSVGAIIGK 37 28
431 LSRFAGASIK 69 37
181 RQGSPGSVSK 104 38
456 ITGPPEAQFK 211 29
204 TQFVGAIIGK 211 30
496 SFAAGRVIGK 215 34
552 KIQEILTQVK 365 36
281 ILAHNNFVGR 459 52
73 SVPKRQRIRK 521 31
535 VVVKITGHFY 682 41
420 IIGKQGQHIK 858 55
141 GFQLENFTLK 1112 44
14 APSDLESIFK 1275 32
起始位置指示从KOC1的N端起的氨基酸残基的数目，解离常数[Kd(nM)] 来源于″NetMHC3.2″。
通过预测的KOC1衍生的HLA-A*0301限制性肽来诱导CTLs
依照如“材料和方法”中描述的方案生成针对KOC1衍生的肽的CTLs。 通过IFN-gamma ELISPOT测定法测量肽特异性CTL活性(图9)。与对照相比， 具有KOC1-A03-10-120(SEQ ID NO：27)的孔#5(a)，具有KOC1-A03-10-204 (SEQ ID NO：30)的孔#3(b)，和具有KOC1-A03-10-281(SEQ ID NO：52)的孔 #5(c)显示出强的IFN-gamma生成。与此同时，尽管示于表3a和3b中的其他肽 潜在具有HLA-A*0301结合活性，未检测到作为这些肽的刺激的结果的特异 性CTL活性。典型阴性数据的实例是从用KOC1-A03-10-414(SEQ ID NO：28) 刺激的CTLs中未观察到特异性IFN-gamma产生(d)。结果，选择三种类型的 KOC1衍生肽作为能够诱导有效CTL的肽。
针对KOC1衍生的HLA-A*0301限制性肽的CTL系和克隆的建立
通过增殖具有KOC1-A03-10-120(SEQ ID NO：27)的孔#5中的CTLs来建 立CTL系，其在IFN-gamma ELISPOT测定法中显示出肽特异性CTL活性。通 过IFN-gamma ELISA测量这些CTL系的CTL活性(图10)。与没有用肽冲击的 靶细胞相比，这些CTL系表现出针对用相应肽冲击的靶细胞的强的 IFN-gamma生成。此外，通过从如以上“材料和方法”部分中描述的CTL系 的有限稀释建立CTL克隆，通过IFN-gamma ELISA测量针对肽冲击的 C1R-A03的来自CTL克隆的IFN-gamma生成。在用KOC1-A03-10-120(SEQ ID NO:27)刺激的CTL克隆中观察到强的IFN-gamma生成(图11)。
针对表达KOC1和HLA-A*0301的靶细胞的特异性CTL活性
建立针对KOC1-A03-10-120(SEQ ID NO:27)的CTL克隆来研究其识别 表达KOC1和HLA-A*0301分子的靶细胞的能力。制备用全长的KOC1和 HLA-A*0301基因两者转染的COS7细胞(表达KOC1和HLA-A*0301基因的靶 细胞的特定模型)作为靶细胞。制备用全长KOC1或HLA-A*0301转染的 COS7细胞作为对照。KOC1-A03-10-120(SEQ ID NO:27)刺激的CTL克隆显 示针对表达KOC1和HLA-A*0301两者的COS7细胞的强的CTL活性(图12)。另 一方面，针对对照没有检出显著的特异性CTL活性。这些数据清楚证明 KOC1-A03-10-120(SEQ ID NO:27)是产生自KOC1内源性加工的肽，并与 HLA-A*0301分子呈递在靶细胞上，并被CTLs识别。这些结果表明了以下可 能性，即KOC1-A03-10-120(SEQ ID NO:27)作为癌症疫苗用于患有表达 KOC1的癌症的患者可以是合适。
抗原肽的同源性分析
用KOC1-A03-10-120(SEQ ID NO:27),KOC1-A03-10-204(SEQ ID NO: 30),或KOC1-A03-10-281(SEQ ID NO:52)刺激的CTLs显示出显著的特异性 CTL活性。这些结果可能是因为KOC1-A03-10-120(SEQ ID NO:27), KOC1-A03-10-204(SEQ ID NO:30)和KOC1-A03-10-281(SEQ ID NO:52)序 列与衍生自已知敏化人免疫系统的其它分子的肽同源。为了排除此可能性， 通过使用BLAST算法(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查询这些肽的序列来进 行同源性分析。这一结果显示出没有与KOC1-A03-10-120(SEQ ID NO:27) 序列具有显著同源性的序列。另一方面，KOC1-A03-10-204(SEQ ID NO:30) 与在IMP-2(其是另一个IMP家族)中鉴定的肽序列相同。KOC1-A03-10-281 (SEQ ID NO:52)与在IMP-1(其是另一个IMP家族)中鉴定的肽序列相同。之前 已经报道IMP-1在除睾丸，胎儿肝脏和胎盘之外的正常器官中不表达 (Hammer NA等人,Reproduction.2005；130(2):203-12)。据报道，它与肺癌 患者的肿瘤进展相关(Kato T等人.,Clin Cancer Res.2007；13:434-42)。之前已经报道IMP-2在除睾丸和胎儿肝脏之外的正常器官中不表达(Hammer NA 等人,Reproduction.2005；130(2):203-12)。它牵涉胶质母细胞瘤癌干细胞的 增殖(Janiszewska M等人,Genes Dev.2012；26(17):1926-44)。IMP-1和IMP-2 有望作为癌症免疫治疗的靶抗原。因此，根据本发明人的知识，这些肽几乎 不可能引发针对其他不相关分子的非预期免疫应答。总之，鉴定了新的KOC1 衍生的HLA-A03限制性表位肽。证明了KOC1衍生的表位肽适用于癌症免疫 治疗。
[实施例4]
材料和方法
细胞系
C1R，HLA-A阴性和HLA-B阴性人类B淋巴母细胞系，和COS7，非洲绿 猴肾细胞系购自ATCC。
具有稳定的HLA-A*0101表达的刺激细胞的生成
使用稳定表达HLA-A*0101的C1R(C1R-A01)作为刺激细胞。通过PCR 扩增编码HLA-A*0101的开放阅读框的cDNA，并克隆到表达载体中。用表达 载体转染C1R细胞，然后使用G418(Invitrogen)选择两周。将用G418选择的细 胞接种到含有添加有G418的培养基的96孔板的孔中，并进一步培养30天。通 过流式细胞术分析证实C1R细胞中外源的HLA-A*0101表达。
衍生的KOC1肽候选者的选择
使用结合预测服务器“NetMHC 3.2”(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) (Buus等人,Tissue Antigens.2003 Nov,62(5):378-84；Nielsen等人,Protein Sci. 2003May,12(5):1007-17；Bioinformatics.2004Jun 12:20(9):1388-97)预测 了结合HLA-A*0101分子的KOC1衍生的9聚体和10聚体肽。
肽合成
通过Biosynthesis(Lewisville,Texas)根据标准固相合成法合成这些肽， 并通过反相高效液相色谱(HPLC)纯化。分别通过分析型HPLC和质谱分析法 来分析肽的纯度(>90％)和身份。将肽以20mg/ml溶解在二甲基亚砜中并保存 于-80℃。
体外CTL诱导
使用单核细胞衍生的树突细胞(DC)作为抗原呈递细胞来诱导针对呈递 在人白细胞抗原(HLA)上的肽的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。如在其他部 分所述，体外制备DC(Nakahara S等人,Cancer Res 2003,63(14):4112-8)。具 体地说，用Ficoll-Paque Plus(Pharmacia)溶液从健康志愿者((HLA-A*0101阳性) 分离的外周血单核细胞，通过粘附塑料组织培养盘(Becton Dickinson)加以分 离，并作为单核细胞级分加以浓缩。将单核细胞富集的群体在含2％热灭活 的自体血清(AS)的AIM-V培养基(Invitrogen)中，在1000IU/ml的粒细胞-巨噬 细胞集落刺激因子(R&D System)和1000IU/ml白介素(IL)-4(R&D System)的 存在下培养。培养7天后，将经细胞因子诱导的DC在AIM-V培养基中在3微 克/mlβ2-微球蛋白存在下用20微克/ml每一种合成肽于37℃冲激3小时。所生 成的细胞表观上在它们的细胞表面上表达DC相关分子，诸如CD80、CD83、 CD86和HLA II类(数据未显示)。接着，将这些经肽冲激的DC用X射线放射(20 Gy)灭活，并以1:20比例与用CD8阳性分离试剂盒(Dynal)通过阳性选择获得 的自体CD8+ T细胞混合。将这些培养产物接种于48孔板(Corning)中。制备每 个孔，以在0.5ml AIM-V/2％AS培养基中含有1.5x104个经肽冲激的DC、3x 105个CD8+ T细胞和10ng/ml IL-7(R&D System)。3天后，向这些培养物添加 终浓度为20IU/ml的IL-2(CHIRON)。在第7天和第14天，将这些T细胞用经肽 冲激的自体DC进一步刺激。DC每次通过与上文所述相同的方式来制备。在 第21天在第三次肽刺激后，针对肽冲击的C1R-A01细胞来检测CTL活性 (Tanaka H等人,Br J Cancer 2001,84(1):94-9；Umano Y等人,Br JCancer 2001, 84(8):1052-7；Uchida N等人,Clin Cancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T等 人,Cancer Sci 2006,97(5):411-9；Watanabe T等人,Cancer Sci 2005,96(8):498-506).
CTL扩增程序
使用与Riddell等人(Walter EA等人,N Engl J Med 1995Oct 19,333(16):1038-44；Riddell SR等人,Nat Med 1996Feb,2(2):216-23)公开的方法相似的 方法在培养中扩增CTL。将CTLs与两种类型的经丝裂霉素C处理的人B淋巴 母细胞系在总共25ml的AIM-V培养基中共培养(5x106细胞/烧瓶)，所述培 养基含有含5％AS(AIM-V/5％AS)和40ng/ml抗-CD3抗体。开始培养后一天， 向培养物添加120IU/ml IL-2。在第5天、第8天和第11天，向培养物中添加含 有30IU/ml IL-2的新鲜AIM-V/5％AS培养基(Tanaka H等人,Br JCancer 2001,84(1):94-9；Umano Y等人,Br J Cancer 2001,84(8):1052-7；Uchida N等人,Clin Cancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T等人,Cancer Sci 2006,97(5): 411-9；Watanabe T等人,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)。
CTL克隆的建立
在96圆底微量滴定板(Nalge Nunc International)中进行CTLs稀释以制成1 或10个细胞/孔。在含有30ng/ml的抗CD3抗体和125IU/ml的IL-2的总共150 微升/孔的AIM-V/5％AS培养基中，将CTLs与两种类型的经丝裂霉素C处理的 人B淋巴母细胞系共培养(1x104细胞/孔)。10天后向培养基中加入50微升/ 孔的IL-2以达到125IU/ml的终浓度。在第14天测试CTL活性，并使用如上所 述的相同方法扩增CTL克隆(Uchida N等人,Clin Cancer Res2004,10(24): 8577-86；Suda T等人,Cancer Sci 2006,97(5):411-9；Watanabe T等人,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)。
特异性CTL活性
为了检查特异性CTL活性，实施了IFN-gamma ELISPOT测定法和 IFN-gamma酶联免疫吸附测定法(ELISA)。具体地，制备经肽冲激的C1R-A01 (1x104细胞/孔)作为刺激细胞。使用诱导的CTLs(即CTL系和CTL克隆)用 作应答细胞。根据制造商的说明实施IFN-gammaELISPOT测定法和 IFN-gamma ELISA。
强迫表达靶基因和HLA-A*0101的靶细胞的建立
通过PCR来扩增编码靶基因或HLA-A*0101的开放阅读框的cDNA。将 PCR扩增产物克隆入表达载体。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)依照制造 商的说明将表达靶基因的载体和表达HLA-A*0101的载体之一或两者转染入 COS7(其是靶基因和HLA阴性的细胞系)。转染两天后，用Versene(Invitrogen) 收获经转染的细胞，并用作CTL活性测定法的靶细胞(5x104细胞/孔)。
结果
KOC1衍生的HLA-A*0101结合肽的预测
表4a和4b以结合亲和力的降序显示了已预测结合HLA-A*0101的KOC1 衍生的9聚体肽和10聚体肽。选择并检查了总共27种潜在具有HLA-A*0101 结合能力的肽以确定表位肽。
[表4a]
衍生自KOC1的HLA-A1结合9聚体肽
起始位置 氨基酸序列 Kd(nM) SEQ ID NO
96 VLDSLLVQY 56 86
118 ETAVVNVTY 57 87
114 NTDSETAVV 453 88
273 FTEEIPLKI 528 89
404 ETETVHLFI 1528 90
536 VVKITGHFY 5589 13
15 PSDLESIFK 5882 12
143 QLENFTLKV 11578 91
402 QSETETVHL 13101 92
305 DTDTKITIS 13406 93
313 SPLQELTLY 21305 94
338 KAEEEIMKK 23866 10
301 KIEQDTDTK 24016 21
69 EVEHSVPKR 24734 69
[表4b]
衍生自KOC1的HLA-A1结合10聚体肽
起始位置 氨基酸序列 Kd(nM) SEQ ID NO
312 ISPLQELTLY 146 46
95 EVLDSLLVQY 498 50
402 QSETETVHLF 1737 95
9 LSENAAPSDL 2164 96
535 VVVKITGHFY 3359 41
.273 FTEEIPLKIL 4478 97
462 AQFKAQGRIY 6263 98
342 EIMKKIRESY 7665 99
252 GTSAACKSIL 9689 100
30 SGPFLVKTGY 17794 101
114 NTDSETAVVN 22411 102
305 DTDTKITISP 29728 103
17 DLESIFKDAK 35078 104
起始位置指示从KOC1的N端起的氨基酸残基的数目，解离常数[Kd(nM)] 来源于″NetMHC 3.2″。
通过预测的KOC1衍生的HLA-A*0101限制性肽来诱导CTLs
依照如“材料和方法”中描述的方案生成针对KOC1衍生的肽的CTLs。 通过IFN-gamma ELISPOT测定法测量肽特异性CTL活性(图13)。与对照相比， 具有KOC1-A01-9-96(SEQ ID NO：86)的孔#2(a)，具有KOCl-A01-9-118(SEQ ID NO：87)的孔#4(b)，具有KOC1-A01-9-404(SEQ ID NO：90)的孔#3(c)，具 有KOC1-A01-9-402(SEQ ID NO：92)的孔#4(d)，具有KOC1-A01-10-312(SEQ ID NO：46)的孔#7(e)，具有KOC1-A01-10-402(SEQ ID NO：95)的孔#1(f)，和 具有KOC1-A01-10-535(SEQ ID NO：41)的孔#1(g)，显示出强的IFN-gamma生成。与此同时，尽管示于表4a和4b中的其他肽潜在具有HLA-A*0101结合 活性，未检测到作为这些肽的刺激的结果的特异性CTL活性。典型阴性数据 的实例是从用KOC1-A01-9-536(SEQ ID NO：13)刺激的CTLs中未观察到特 异性IFN-gamma产生(h)。结果，选择7种类型的KOC1衍生肽作为能够诱导有 效CTL的肽。
针对KOC1衍生的肽的CTL系和克隆的建立
通过增殖具有KOC1-A01-9-96(SEQ ID NO:86)的孔#2(a),和具有 KOC1-A01-9-118(SEQ ID NO:87)的孔#4(b)中的CTLs来建立CTL系，其在 IFN-gamma ELISPOT测定法中显示出肽特异性CTL活性。通过IFN-gamma ELISA测量这些CTL系的CTL活性(图14)。与没有用肽冲击的靶细胞相比，这 些CTL系表现出针对用相应肽冲击的靶细胞的强的IFN-gamma生成。此外， 通过从如以上“材料和方法”部分中描述的CTL系的有限稀释建立CTL克隆， 通过IFN-gamma ELISA测量针对肽冲击的C1R-A01的来自CTL克隆的 IFN-gamma生成。在用KOC1-A01-9-96(SEQ ID NO:86)刺激的CTL克隆中观 察到强的IFN-gamma生成(图15)。
针对表达KOC1和HLA-A*0101的靶细胞的特异性CTL活性
建立针对KOC1-A01-9-96(SEQ ID NO:86)的CTL系和CTL克隆来研究 其识别表达KOC1和HLA-A*0101分子的靶细胞的能力。制备用全长的KOC1 和HLA-A*0101基因两者转染的COS7细胞(表达KOC1和HLA-A*0101基因的 靶细胞的特定模型)作为靶细胞。制备用全长KOC1或HLA-A*0101转染的 COS7细胞作为对照。KOC1-A01-9-96(SEQ ID NO:86)刺激的CTL克隆显示 针对表达KOC1和HLA-A*0101两者的COS7细胞的强的CTL活性(图16)。另一 方面，针对对照没有检出显著的特异性CTL活性。这些数据清楚证明 KOC1-A01-9-96(SEQ ID NO:86)是产生自KOC1内源性加工的肽，并与 HLA-A*0101分子呈递在靶细胞上，并被CTLs识别。这些结果表明了以下可 能性，即KOC1-A01-9-96(SEQ ID NO:86)作为癌症疫苗用于患有表达KOC1 的癌症的患者可以是合适的。
抗原肽的同源性分析
用KOC1-A01-9-96(SEQ ID NO:86),KOC1-A01-9-118(SEQ ID NO:87), KOC1-A01-9-404(SEQ ID NO:90),KOC1-A01-9-402(SEQ ID NO:92), KOC1-A01-10-312(SEQ ID NO:46),KOC1-A01-10-402(SEQ ID NO:95),或 KOC1-A01-10-535(SEQ ID NO:41)刺激的CTLs显示出显著的特异性CTL活 性。这些结果可能是因为KOC1-A01-9-96(SEQ ID NO:86),KOC1-A01-9-118 (SEQ ID NO:87),KOC1-A01-9-404(SEQ ID NO:90),KOC1-A01-9-402(SEQID NO:92),KOC1-A01-10-312(SEQ ID NO:46),KOC1-A01-10-402(SEQ ID NO:95),和KOC1-A01-10-535(SEQ ID NO:41)序列与衍生自已知敏化人免 疫系统的其它分子的肽同源。为了排除此可能性，通过使用BLAST算法 (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查询这些肽的序列来进行同源性分析。这一 结果显示出没有与KOC1-A01-9-96(SEQ ID NO:86),KOC1-A01-9-118(SEQ ID NO:87),KOC1-A01-9-404(SEQ ID NO:90),KOC1-A01-9-402(SEQ IDNO:92),KOC1-A01-10-312(SEQ ID NO:46),KOC1-A01-10-402(SEQ ID NO: 95),和KOC1-A01-10-535(SEQ ID NO:41)序列具有显著同源性的序列。另一 方面，KOC1-A01-9-118(SEQID NO:87)与在IMP-1和IMP-2(它们是其他的 IMP家族)中鉴定的肽序列相同。之前已经报道IMP-1在除睾丸，胎儿肝脏和 胎盘之外的正常器官中不表达(Hammer NA等人,Reproduction.2005；130(2): 203-12)。据报道，它与肺癌患者的肿瘤进展相关(Kato T等人.,Clin Cancer Res.2007；13:434-42)。之前已经报道IMP-2在除睾丸和胎儿肝脏之外的正常 器官中不表达(Hammer NA等人,Reproduction.2005；130(2):203-12)。它牵 涉胶质母细胞瘤癌干细胞的增殖(Janiszewska M等人,Genes Dev.2012； 26(17):1926-44)。IMP-1和IMP-2有望作为癌症免疫治疗的靶抗原。因此，根 据本发明人的知识，这些肽几乎不可能引发针对其他不相关分子的非预期免 疫应答。总之，鉴定了新的KOC1衍生的HLA-A01限制性表位肽。证明了 KOC1衍生的表位肽适用于癌症免疫治疗。
[实施例5]
乳液制剂的制备
将肽溶解在注射用溶剂或无菌生理盐水中，使其为1.0mg/ml至10.0 mg/ml，并收集到注射器中。这经由连接器连接至装有与注射溶剂或无菌生 理盐水等量的IFA的注射器，然后通过交替地推动两个连接的注射器的注射 器柱塞来混合。混合几分钟后，通过滴落试验法(drop test method)评价乳液 的完成。滴落试验法可以通过将一滴混合样品滴在水上进行。当滴在水上的 样品不立即在水中扩散时，评估乳液完成；并且当滴在水上的样品立即在水 中扩散时，该乳液被评估为未完成。当乳液被评估为不完全时，进行进一步混合以完成乳液。可以通过皮下注射将完成的乳剂施用于癌症患者。经受施 用的癌症患者可以选自受以下癌症影响的患者：膀胱癌，宫颈癌，胆管细胞 癌，慢性髓性白血病(CML)，结肠癌，直肠癌，食管癌，弥漫性胃癌，非小 细胞肺癌，小细胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，卵巢癌，肾癌，头颈部癌，软组 织肿瘤，睾丸癌等。
冷冻干燥制剂的制备
将肽溶解在注射用溶剂中，使其为1.0mg/ml至10.0mg/ml，并过滤灭菌。 将其装入灭菌的小瓶中，并用无菌橡胶塞半封闭。将该小瓶冷冻干燥后，将 其完全封闭并用铝盖缝合以产生冷冻干燥的制剂。当使用时，将注射溶剂或 无菌生理盐水注入小瓶中以重新溶解冷冻干燥的粉末。使用注射器收集小瓶 中的再溶解溶液，并且通过连接器将注射器与填充有与收集的再溶解溶液的 量相同量的IFA的注射器连接。通过交替地推动两个连接的注射器的注射器 柱塞来混合重新溶解的溶液和IFA。混合几分钟后，通过滴落试验法(droptest method)评价乳液的完成。可以通过皮下注射将完成的乳剂施用于癌症患者。 经受施用的癌症患者可以选自受以下癌症影响的患者：膀胱癌，宫颈癌，胆 管细胞癌，慢性髓性白血病(CML)，结肠癌，直肠癌，食管癌，弥漫性胃癌， 非小细胞肺癌，小细胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，卵巢癌，肾癌，头颈部癌， 软组织肿瘤，睾丸癌等。
工业应用性
本发明提供了KOC1衍生的新型HLA-A11限制性，HLA-A33限制性， HLA-A03限制性和HLA-A01限制性表位肽，其诱导强而特异性的抗肿瘤免疫 应答，并且因此具有广泛的癌症类型的可用性。本发明的肽，组合物，APCs 和CTLs可用作针对表达KOC1癌症的肽疫苗，例如膀胱癌，宫颈癌，胆管细 胞癌，慢性髓性白血病(CML)，结肠癌，直肠癌，食管癌，弥漫性胃癌，非 小细胞肺癌，小细胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，卵巢癌，肾癌，头颈部癌，软 组织肿瘤，睾丸癌。
尽管本文详细地并且关于其具体实施方案描述了本发明，但是应当理 解，前述描述本质上是示例性和解释性的，而且意图例示本发明及其优选实 施方案。经由常规实验，本领域技术人员会容易地认识到，可以对本发明进 行各种变化和修饰，而不偏离本发明的精神和范围，本发明的边界和范围由 所附权利要求来限定。
本发明提供了
1.具有细胞毒性T细胞(CTL)诱导能力的少于15个氨基酸的肽，其包含 选自以下组的氨基酸序列：
(a)选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NOs:5,28,30,32,61,62,63,64,67, 74,77,52,79,80,85,27,86,87,90,92,46,95和41；以及
(b)选自下组的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了1、2或数个 氨基酸的氨基酸序列：SEQ ID NOs:5,28,30,32,61,62,63,64,67,74,77,52, 79,80,85,27,86,87,90,92,46,95和41。
2.项1的肽，其选自下组(i)至(iv)：
(i)包含氨基酸序列的肽，其中将选自下组(a)至(d)的一个或多个取代引 入选自下组的氨基酸序列中：SEQ ID NOs:5,28,30和32：
(a)用选自由苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸 组成的组的氨基酸取代自N端起的第二个氨基酸；
(b)用选自由亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸和丙氨酸组成的组 的氨基酸取代自N端起的第三个氨基酸；
(c)用选自由亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸组成的组 的氨基酸取代自N端起的第七个氨基酸；和
(d)用选自由赖氨酸和精氨酸组成的组的氨基酸取代C末端的氨基酸；
(ii)包含氨基酸序列的肽，其中将选自下组(a)至(c)的一个或多个取代引 入选自下组的氨基酸序列中：SEQ ID NOs:61,62,63,64,67,74,77,52,79, 80和85：
(a)用选自由天冬氨酸和谷氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第一 个氨基酸；
(b)用选自由苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸 组成的组的氨基酸取代自N端起的第二个氨基酸；
(c)用选自由精氨酸和赖氨酸组成的组的氨基酸取代C末端的氨基酸；
(iii)包含氨基酸序列的肽，其中将选自下组(a)至(b)的一个或多个取代引 入选自下组的氨基酸序列中：SEQ ID NOs:27,30和52：
(a)用选自由亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、丝氨酸 和苏氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第二个氨基酸；和
(b)用选自由精氨酸、赖氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸组成的组的氨基酸取 代C末端的氨基酸；
(iv)包含氨基酸序列的肽，其中将选自下组(a)至(c)的一个或多个取代引 入选自下组的氨基酸序列中：SEQ ID NOs:86,87,90,92,46,95和41：
(a)用选自由苏氨酸和丝氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第二个 氨基酸；
(b)用选自由天冬氨酸和谷氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第三 个氨基酸；
(c)用酪氨酸取代C末端的氨基酸。
3.项1的肽，其由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NOs:5,28,30,32, 61,62,63,64,67,74,77,52,79,80,85,27,86,87,90,92,46,95和41。
4.多核苷酸，其编码项1至3中任一项的肽。
5.组合物，其包含药学上可接受的载体和选自下组(a)至(e)的至少一种 成分：
(a)一种或多种类型的项1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码项1至3中任一 项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递项1至3中任一项的肽与 HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递项1至3中任一项的肽与HLA抗原的 复合物；和
(e)CTL，其靶向项1至3中任一项的肽。
6.项5的组合物，其是用于诱导CTL的组合物，其中所述成分是选自下 组(a)至(d)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的项1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码项1至3中任一 项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递项1至3中任一项的肽与 HLA抗原的复合物；和
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递项1至3中任一项的肽与HLA抗原的 复合物。
7.项5的组合物，其是药物组合物。
8.项7的组合物，其用于选自下组的一种或多种用途：(i)癌症治疗,(ii) 癌症预防(防范(prophylaxis))和(iii)手术后癌症复发的预防(防范)。
9.项7的组合物，其用于诱导针对癌症的免疫应答。
10.项8或9的组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组：膀胱癌、宫 颈癌、胆管细胞癌、慢性髓性白血病(CML)、大肠癌(大腸がん)、直肠癌、 食管癌、弥漫性胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢 癌、肾癌、头颈癌、软组织肿瘤和睾丸癌。
11.项5至10中任一项的组合物，其配制为用于对至少一种选自下组的 HLA阳性的受试者施用：HLA-A11、HLA-A33、HLA-A03和HLA-A01。
12.诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，其包含选自下组的步骤：
(a)体外，离体或体内将APC与项1至3中任一项的肽接触；和
(b)将编码项1至3中任一项的肽的多核苷酸导入APC。
13.诱导CTL的方法，其包含选自下组的步骤：
(a)将CD8阳性T细胞与APC共培养，所述APC在其表面上呈递HLA抗原 与项1至3中任一项的肽的复合物；
(b)将CD8阳性T细胞与外来体共培养，所述外来体在其表面上呈递HLA 抗原与项1至3中任一项的肽的复合物；
(c)将多核苷酸引入CD8阳性T细胞，所述多核苷酸编码T细胞受体(TCR) 的每个亚基，所述T细胞受体能够结合细胞表面上由HLA抗原呈递的项1至3 中任一项的肽。
14.APC，其在其表面呈递HLA抗原与项1至3中任一项的肽的复合物。
15.项14的APC，其通过项12的方法诱导。
16.CTL，其靶向项1-3中任一项的肽。
17.项16的CTL，其通过项13的方法诱导。
18.诱导针对癌症的免疫应答方法，其包含向受试者施用选自下组(a)至 (e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的项1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码项1至3中任一 项的肽；
(c)APC，其在其细胞表面上呈递项1至3中任一项的肽与HLA抗原的复 合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递项1至3中任一项的肽与HLA抗原的 复合物；和
(e)CTL，其靶向项1至3中任一项的肽。
19.治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发的方法，所述方法包 括向受试者施用选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的项1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码项1至3中任一 项的肽；
(c)APC，其在其细胞表面上呈递项1至3中任一项的肽与HLA抗原的复 合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递项1至3中任一项的肽与HLA抗原的 复合物；和
(e)CTL，其靶向项1至3中任一项的肽。
20.抗体，其结合项1至3中任一项的肽。
21.筛选具有CTL诱导能力的肽的方法，其包含以下步骤：
(a)产生由氨基酸序列组成的候选序列，其中对由选自下组的氨基酸序 列组成的原始氨基酸序列取代、缺失、插入和/或添加一个，两个或数个氨基 酸残基：SEQ ID NOs:5,28,30,32,61,62,63,64,67,74,77,52,79,80,85,27, 86,87,90,92,46,95和41；
(b)从在(a)中产生的候选序列中选择除KOC1外的与任何已知的人基因 产物不具有显著同源性(序列同一性)的候选序列；
(c)将APC与由在(b)中选择出的候选序列组成的肽接触；
(d)将(c)的APC与CD8阳性T细胞接触；和
(e)选择与由原始氨基酸序列组成的肽相比，具有相等或更高的CTL诱 导能力的肽。
22.乳剂，其包含一种或多种类型的项1至3中任一项的肽，水溶性载体 和油佐剂。
23.试剂盒，其包含容纳项5至11中任一项的组合物的容器和容纳佐剂的 容器。
序列表
<110> 肿瘤疗法科学股份有限公司
<120> KOC1衍生的肽和包含它们的疫苗
<130> ONC-A1501P
<150> JP 2014-158919
<151> 2014-08-04
<150> JP 2014-158920
<151> 2014-08-04
<150> JP 2014-158921
<151> 2014-08-04
<160> 111
<170> PatentIn version 3.5
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<223> 衍生自KOC1的肽
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Gln Ser Gly Pro Pro Gln Ser Arg Arg
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Gln Gly Gln His Ile Lys Gln Leu Ser Arg
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Ile Ile Gly Lys Glu Gly Ala Thr Ile Arg
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Arg Gln Arg Ile Arg Lys Leu Gln Ile Arg
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<223> 衍生自KOC1的肽
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Asn Asn Phe Val Gly Arg Leu Ile Gly Lys
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<400> 91
Gln Leu Glu Asn Phe Thr Leu Lys Val
1 5
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自KOC1的肽
<400> 92
Gln Ser Glu Thr Glu Thr Val His Leu
1 5
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自KOC1的肽
<400> 93
Asp Thr Asp Thr Lys Ile Thr Ile Ser
1 5
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自KOC1的肽
<400> 94
Ser Pro Leu Gln Glu Leu Thr Leu Tyr
1 5
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自KOC1的肽
<400> 95
Gln Ser Glu Thr Glu Thr Val His Leu Phe
1 5 10
<210> 96
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自KOC1的肽
<400> 96
Leu Ser Glu Asn Ala Ala Pro Ser Asp Leu
1 5 10
<210> 97
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自KOC1的肽
<400> 97
Phe Thr Glu Glu Ile Pro Leu Lys Ile Leu
1 5 10
<210> 98
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自KOC1的肽
<400> 98
Ala Gln Phe Lys Ala Gln Gly Arg Ile Tyr
1 5 10
<210> 99
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自KOC1的肽
<400> 99
Glu Ile Met Lys Lys Ile Arg Glu Ser Tyr
1 5 10
<210> 100
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自KOC1的肽
<400> 100
Gly Thr Ser Ala Ala Cys Lys Ser Ile Leu
1 5 10
<210> 101
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自KOC1的肽
<400> 101
Ser Gly Pro Phe Leu Val Lys Thr Gly Tyr
1 5 10
<210> 102
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自KOC1的肽
<400> 102
Asn Thr Asp Ser Glu Thr Ala Val Val Asn
1 5 10
<210> 103
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自KOC1的肽
<400> 103
Asp Thr Asp Thr Lys Ile Thr Ile Ser Pro
1 5 10
<210> 104
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自KOC1的肽
<400> 104
Asp Leu Glu Ser Ile Phe Lys Asp Ala Lys
1 5 10
<210> 105
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TCR分析的PCR引物
<400> 105
gtctaccagg cattcgcttc at 22
<210> 106
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TCR分析的PCR引物
<400> 106
tcagctggac cacagccgca gcgt 24
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TCR分析的PCR引物
<400> 107
tcagaaatcc tttctcttga c 21
<210> 108
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TCR分析的PCR引物
<400> 108
ctagcctctg gaatcctttc tctt 24
<210> 109
<211> 4168
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (267)..(2006)
<400> 109
aagacttagg aagactggtg gatgcgtttg ggttgtagct aggctttttc ttttctttct 60
cttttaaaac acatctagac aaggaaaaaa caagcctcgg atctgatttt tcactcctcg 120
ttcttgtgct tggttcttac tgtgtttgtg tattttaaag gcgagaagac gaggggaaca 180
aaaccagctg gatccatcca tcaccgtggg tggttttaat ttttcgtttt ttctcgttat 240
ttttttttaa acaaccactc ttcaca atg aac aaa ctg tat atc gga aac ctc 293
Met Asn Lys Leu Tyr Ile Gly Asn Leu
1 5
agc gag aac gcc gcc ccc tcg gac cta gaa agt atc ttc aag gac gcc 341
Ser Glu Asn Ala Ala Pro Ser Asp Leu Glu Ser Ile Phe Lys Asp Ala
10 15 20 25
aag atc ccg gtg tcg gga ccc ttc ctg gtg aag act ggc tac gcg ttc 389
Lys Ile Pro Val Ser Gly Pro Phe Leu Val Lys Thr Gly Tyr Ala Phe
30 35 40
gtg gac tgc ccg gac gag agc tgg gcc ctc aag gcc atc gag gcg ctt 437
Val Asp Cys Pro Asp Glu Ser Trp Ala Leu Lys Ala Ile Glu Ala Leu
45 50 55
tca ggt aaa ata gaa ctg cac ggg aaa ccc ata gaa gtt gag cac tcg 485
Ser Gly Lys Ile Glu Leu His Gly Lys Pro Ile Glu Val Glu His Ser
60 65 70
gtc cca aaa agg caa agg att cgg aaa ctt cag ata cga aat atc ccg 533
Val Pro Lys Arg Gln Arg Ile Arg Lys Leu Gln Ile Arg Asn Ile Pro
75 80 85
cct cat tta cag tgg gag gtg ctg gat agt tta cta gtc cag tat gga 581
Pro His Leu Gln Trp Glu Val Leu Asp Ser Leu Leu Val Gln Tyr Gly
90 95 100 105
gtg gtg gag agc tgt gag caa gtg aac act gac tcg gaa act gca gtt 629
Val Val Glu Ser Cys Glu Gln Val Asn Thr Asp Ser Glu Thr Ala Val
110 115 120
gta aat gta acc tat tcc agt aag gac caa gct aga caa gca cta gac 677
Val Asn Val Thr Tyr Ser Ser Lys Asp Gln Ala Arg Gln Ala Leu Asp
125 130 135
aaa ctg aat gga ttt cag tta gag aat ttc acc ttg aaa gta gcc tat 725
Lys Leu Asn Gly Phe Gln Leu Glu Asn Phe Thr Leu Lys Val Ala Tyr
140 145 150
atc cct gat gaa atg gcc gcc cag caa aac ccc ttg cag cag ccc cga 773
Ile Pro Asp Glu Met Ala Ala Gln Gln Asn Pro Leu Gln Gln Pro Arg
155 160 165
ggt cgc cgg ggg ctt ggg cag agg ggc tcc tca agg cag ggg tct cca 821
Gly Arg Arg Gly Leu Gly Gln Arg Gly Ser Ser Arg Gln Gly Ser Pro
170 175 180 185
gga tcc gta tcc aag cag aaa cca tgt gat ttg cct ctg cgc ctg ctg 869
Gly Ser Val Ser Lys Gln Lys Pro Cys Asp Leu Pro Leu Arg Leu Leu
190 195 200
gtt ccc acc caa ttt gtt gga gcc atc ata gga aaa gaa ggt gcc acc 917
Val Pro Thr Gln Phe Val Gly Ala Ile Ile Gly Lys Glu Gly Ala Thr
205 210 215
att cgg aac atc acc aaa cag acc cag tct aaa atc gat gtc cac cgt 965
Ile Arg Asn Ile Thr Lys Gln Thr Gln Ser Lys Ile Asp Val His Arg
220 225 230
aaa gaa aat gcg ggg gct gct gag aag tcg att act atc ctc tct act 1013
Lys Glu Asn Ala Gly Ala Ala Glu Lys Ser Ile Thr Ile Leu Ser Thr
235 240 245
cct gaa ggc acc tct gcg gct tgt aag tct att ctg gag att atg cat 1061
Pro Glu Gly Thr Ser Ala Ala Cys Lys Ser Ile Leu Glu Ile Met His
250 255 260 265
aag gaa gct caa gat ata aaa ttc aca gaa gag atc ccc ttg aag att 1109
Lys Glu Ala Gln Asp Ile Lys Phe Thr Glu Glu Ile Pro Leu Lys Ile
270 275 280
tta gct cat aat aac ttt gtt gga cgt ctt att ggt aaa gaa gga aga 1157
Leu Ala His Asn Asn Phe Val Gly Arg Leu Ile Gly Lys Glu Gly Arg
285 290 295
aat ctt aaa aaa att gag caa gac aca gac act aaa atc acg ata tct 1205
Asn Leu Lys Lys Ile Glu Gln Asp Thr Asp Thr Lys Ile Thr Ile Ser
300 305 310
cca ttg cag gaa ttg acg ctg tat aat cca gaa cgc act att aca gtt 1253
Pro Leu Gln Glu Leu Thr Leu Tyr Asn Pro Glu Arg Thr Ile Thr Val
315 320 325
aaa ggc aat gtt gag aca tgt gcc aaa gct gag gag gag atc atg aag 1301
Lys Gly Asn Val Glu Thr Cys Ala Lys Ala Glu Glu Glu Ile Met Lys
330 335 340 345
aaa atc agg gag tct tat gaa aat gat att gct tct atg aat ctt caa 1349
Lys Ile Arg Glu Ser Tyr Glu Asn Asp Ile Ala Ser Met Asn Leu Gln
350 355 360
gca cat tta att cct gga tta aat ctg aac gcc ttg ggt ctg ttc cca 1397
Ala His Leu Ile Pro Gly Leu Asn Leu Asn Ala Leu Gly Leu Phe Pro
365 370 375
ccc act tca ggg atg cca cct ccc acc tca ggg ccc cct tca gcc atg 1445
Pro Thr Ser Gly Met Pro Pro Pro Thr Ser Gly Pro Pro Ser Ala Met
380 385 390
act cct ccc tac ccg cag ttt gag caa tca gaa acg gag act gtt cat 1493
Thr Pro Pro Tyr Pro Gln Phe Glu Gln Ser Glu Thr Glu Thr Val His
395 400 405
ctg ttt atc cca gct cta tca gtc ggt gcc atc atc ggc aag cag ggc 1541
Leu Phe Ile Pro Ala Leu Ser Val Gly Ala Ile Ile Gly Lys Gln Gly
410 415 420 425
cag cac atc aag cag ctt tct cgc ttt gct gga gct tca att aag att 1589
Gln His Ile Lys Gln Leu Ser Arg Phe Ala Gly Ala Ser Ile Lys Ile
430 435 440
gct cca gcg gaa gca cca gat gct aaa gtg agg atg gtg att atc act 1637
Ala Pro Ala Glu Ala Pro Asp Ala Lys Val Arg Met Val Ile Ile Thr
445 450 455
gga cca cca gag gct cag ttc aag gct cag gga aga att tat gga aaa 1685
Gly Pro Pro Glu Ala Gln Phe Lys Ala Gln Gly Arg Ile Tyr Gly Lys
460 465 470
att aaa gaa gaa aac ttt gtt agt cct aaa gaa gag gtg aaa ctt gaa 1733
Ile Lys Glu Glu Asn Phe Val Ser Pro Lys Glu Glu Val Lys Leu Glu
475 480 485
gct cat atc aga gtg cca tcc ttt gct gct ggc aga gtt att gga aaa 1781
Ala His Ile Arg Val Pro Ser Phe Ala Ala Gly Arg Val Ile Gly Lys
490 495 500 505
gga ggc aaa acg gtg aat gaa ctt cag aat ttg tca agt gca gaa gtt 1829
Gly Gly Lys Thr Val Asn Glu Leu Gln Asn Leu Ser Ser Ala Glu Val
510 515 520
gtt gtc cct cgt gac cag aca cct gat gag aat gac caa gtg gtt gtc 1877
Val Val Pro Arg Asp Gln Thr Pro Asp Glu Asn Asp Gln Val Val Val
525 530 535
aaa ata act ggt cac ttc tat gct tgc cag gtt gcc cag aga aaa att 1925
Lys Ile Thr Gly His Phe Tyr Ala Cys Gln Val Ala Gln Arg Lys Ile
540 545 550
cag gaa att ctg act cag gta aag cag cac caa caa cag aag gct ctg 1973
Gln Glu Ile Leu Thr Gln Val Lys Gln His Gln Gln Gln Lys Ala Leu
555 560 565
caa agt gga cca cct cag tca aga cgg aag taa aggctcagga aacagcccac 2026
Gln Ser Gly Pro Pro Gln Ser Arg Arg Lys
570 575
cacagaggca gatgccaaac caaagacaga ttgcttaacc aacagatggg cgctgacccc 2086
ctatccagaa tcacatgcac aagtttttac ctagccagtt gtttctgagg accaggcaac 2146
ttttgaactc ctgtctctgt gagaatgtat actttatgct ctctgaaatg tatgacaccc 2206
agctttaaaa caaacaaaca aacaaacaaa aaaagggtgg gggagggagg gaaagagaag 2266
agctctgcac ttccctttgt tgtagtctca cagtataaca gatattctaa ttcttcttaa 2326
tattccccca taatgccaga aattggctta atgatgcttt cactaaattc atcaaataga 2386
ttgctcctaa atccaattgt taaaattgga tcagaataat tatcacagga acttaaatgt 2446
taagccatta gcatagaaaa actgttctca gttttatttt tacctaacac taacatgagt 2506
aacctaaggg aagtgctgaa tggtgttggc aggggtatta aacgtgcatt tttactcaac 2566
tacctcaggt attcagtaat acaatgaaaa gcaaaattgt tccttttttt tgaaaatttt 2626
atatacttta taatgataga agtccaaccg ttttttaaaa aataaattta aaatttaaca 2686
gcaatcagct aacaggcaaa ttaagatttt tacttctggc tggtgacagt aaagctggaa 2746
aattaatttc agggtttttt gaggcttttg acacagttat tagttaaatc aaatgttcaa 2806
aaatacggag cagtgcctag tatctggaga gcagcactac catttattct ttcatttata 2866
gttgggaaag tttttgacgg tactaacaaa gtggtcgcag gagattttgg aacggctggt 2926
ttaaatggct tcaggagact tcagtttttt gtttagctac atgattgaat gcataataaa 2986
tgctttgtgc ttctgactat caatacctaa agaaagtgca tcagtgaaga gatgcaagac 3046
tttcaactga ctggcaaaaa gcaagcttta gcttgtctta taggatgctt agtttgccac 3106
tacacttcag accaatggga cagtcataga tggtgtgaca gtgtttaaac gcaacaaaag 3166
gctacatttc catggggcca gcactgtcat gagcctcact aagctatttt gaagattttt 3226
aagcactgat aaattaaaaa aaaaaaatta gactccacct taagtagtaa agtataacag 3286
gatttctgta tactgtgcaa tcagttcttt gaaaaaaaag tcaaaagata gagaatacaa 3346
gaaaagtttt tgggatataa tttgaatgac tgtgaaaaca tatgaccttt gataacgaac 3406
tcatttgctc actccttgac agcaaagccc agtacgtaca attgtgttgg gtgtgggtgg 3466
tctccaaggc cacgctgctc tctgaattga ttttttgagt tttgtttgta agatgatcac 3526
agtcatgtta cactgatcta aaggacatat atataaccct ttaaaaaaaa aatcactgcc 3586
tcattcttat ttcaagatga atttctatac agactagatg tttttctgaa gatcaattag 3646
acattttgaa aatgatttaa agtgttttcc ttaatgttct ctgaaaacaa gtttcttttg 3706
tagttttaac caaaaaagtg ccctttttgt cactggattc tcctagcatt catgattttt 3766
ttttcataca atgaattaaa attgctaaaa tcatggactg gctttctggt tggatttcag 3826
gtaagatgtg tttaaggcca gagcttttct cagtatttga tttttttccc caatatttga 3886
ttttttaaaa atatacacat aggtgctgca tttatatctg ctggtttaaa ttctgtcata 3946
tttcacttct agccttttag tatggcaaat catattttac ttttacttaa gcatttgtaa 4006
tttggagtat ctggtactag ctaagaaata attctataat tgagttttgt actcaccata 4066
tatggatcat tcctcatgta taatgtgccc caaatgcagc ttcattttcc agataccttg 4126
acgcagaata aattttttca tcatttaggt gcaaaaaaaa aa 4168
<210> 110
<211> 579
<212> PRT
<213> 智人
<400> 110
Met Asn Lys Leu Tyr Ile Gly Asn Leu Ser Glu Asn Ala Ala Pro Ser
1 5 10 15
Asp Leu Glu Ser Ile Phe Lys Asp Ala Lys Ile Pro Val Ser Gly Pro
20 25 30
Phe Leu Val Lys Thr Gly Tyr Ala Phe Val Asp Cys Pro Asp Glu Ser
35 40 45
Trp Ala Leu Lys Ala Ile Glu Ala Leu Ser Gly Lys Ile Glu Leu His
50 55 60
Gly Lys Pro Ile Glu Val Glu His Ser Val Pro Lys Arg Gln Arg Ile
65 70 75 80
Arg Lys Leu Gln Ile Arg Asn Ile Pro Pro His Leu Gln Trp Glu Val
85 90 95
Leu Asp Ser Leu Leu Val Gln Tyr Gly Val Val Glu Ser Cys Glu Gln
100 105 110
Val Asn Thr Asp Ser Glu Thr Ala Val Val Asn Val Thr Tyr Ser Ser
115 120 125
Lys Asp Gln Ala Arg Gln Ala Leu Asp Lys Leu Asn Gly Phe Gln Leu
130 135 140
Glu Asn Phe Thr Leu Lys Val Ala Tyr Ile Pro Asp Glu Met Ala Ala
145 150 155 160
Gln Gln Asn Pro Leu Gln Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gly Leu Gly Gln
165 170 175
Arg Gly Ser Ser Arg Gln Gly Ser Pro Gly Ser Val Ser Lys Gln Lys
180 185 190
Pro Cys Asp Leu Pro Leu Arg Leu Leu Val Pro Thr Gln Phe Val Gly
195 200 205
Ala Ile Ile Gly Lys Glu Gly Ala Thr Ile Arg Asn Ile Thr Lys Gln
210 215 220
Thr Gln Ser Lys Ile Asp Val His Arg Lys Glu Asn Ala Gly Ala Ala
225 230 235 240
Glu Lys Ser Ile Thr Ile Leu Ser Thr Pro Glu Gly Thr Ser Ala Ala
245 250 255
Cys Lys Ser Ile Leu Glu Ile Met His Lys Glu Ala Gln Asp Ile Lys
260 265 270
Phe Thr Glu Glu Ile Pro Leu Lys Ile Leu Ala His Asn Asn Phe Val
275 280 285
Gly Arg Leu Ile Gly Lys Glu Gly Arg Asn Leu Lys Lys Ile Glu Gln
290 295 300
Asp Thr Asp Thr Lys Ile Thr Ile Ser Pro Leu Gln Glu Leu Thr Leu
305 310 315 320
Tyr Asn Pro Glu Arg Thr Ile Thr Val Lys Gly Asn Val Glu Thr Cys
325 330 335
Ala Lys Ala Glu Glu Glu Ile Met Lys Lys Ile Arg Glu Ser Tyr Glu
340 345 350
Asn Asp Ile Ala Ser Met Asn Leu Gln Ala His Leu Ile Pro Gly Leu
355 360 365
Asn Leu Asn Ala Leu Gly Leu Phe Pro Pro Thr Ser Gly Met Pro Pro
370 375 380
Pro Thr Ser Gly Pro Pro Ser Ala Met Thr Pro Pro Tyr Pro Gln Phe
385 390 395 400
Glu Gln Ser Glu Thr Glu Thr Val His Leu Phe Ile Pro Ala Leu Ser
405 410 415
Val Gly Ala Ile Ile Gly Lys Gln Gly Gln His Ile Lys Gln Leu Ser
420 425 430
Arg Phe Ala Gly Ala Ser Ile Lys Ile Ala Pro Ala Glu Ala Pro Asp
435 440 445
Ala Lys Val Arg Met Val Ile Ile Thr Gly Pro Pro Glu Ala Gln Phe
450 455 460
Lys Ala Gln Gly Arg Ile Tyr Gly Lys Ile Lys Glu Glu Asn Phe Val
465 470 475 480
Ser Pro Lys Glu Glu Val Lys Leu Glu Ala His Ile Arg Val Pro Ser
485 490 495
Phe Ala Ala Gly Arg Val Ile Gly Lys Gly Gly Lys Thr Val Asn Glu
500 505 510
Leu Gln Asn Leu Ser Ser Ala Glu Val Val Val Pro Arg Asp Gln Thr
515 520 525
Pro Asp Glu Asn Asp Gln Val Val Val Lys Ile Thr Gly His Phe Tyr
530 535 540
Ala Cys Gln Val Ala Gln Arg Lys Ile Gln Glu Ile Leu Thr Gln Val
545 550 555 560
Lys Gln His Gln Gln Gln Lys Ala Leu Gln Ser Gly Pro Pro Gln Ser
565 570 575
Arg Arg Lys
<210> 111
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子肽
<400> 111
Asn Lys Arg Lys
1

Claims (23)

1.具有细胞毒性T细胞(CTL)诱导能力的少于15个氨基酸的肽，其包含选自以下组的氨基酸序列：
(a)选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:64、61、62、63、67、74、77、79、80和85；以及
(b)选自下组的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了1、2或数个氨基酸的氨基酸序列：SEQ ID NO:64、61、62、63、67、74、77、79、80和85。
2.权利要求1的肽，其包含氨基酸序列，其中将选自下组(a)至(c)的一个或多个取代引入选自下组的氨基酸序列中：SEQ ID NO:64、61、62、63、67、74、77、79、80和85：
(a)用天冬氨酸或谷氨酸取代自N端起的第一个氨基酸；
(b)用苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸取代自N端起的第二个氨基酸；和
(c)用精氨酸或赖氨酸取代C末端的氨基酸。
3.权利要求1的肽，其由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:64、61、62、63、67、74、77、79、80和85。
4.多核苷酸，其编码权利要求1至3中任一项的肽。
5.组合物，其包含药学上可接受的载体和选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1至3中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向权利要求1至3中任一项的肽。
6.权利要求5的组合物，其是用于诱导CTL的组合物，其中所述成分是选自下组(a)至(d)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1至3中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物。
7.权利要求5的组合物，其是药物组合物。
8.权利要求7的组合物，其用于选自下组的一种或多种用途：(i)癌症治疗，(ii)癌症预防(防范)和(iii)手术后癌症复发的预防(防范)。
9.权利要求7的组合物，其用于诱导针对癌症的免疫应答。
10.权利要求8或9的组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组：膀胱癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性髓性白血病(CML)、大肠癌、直肠癌、食管癌、弥漫性胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、肾癌、头颈癌、软组织肿瘤和睾丸癌。
11.权利要求5至10中任一项的组合物，其配制为用于对HLA-A33阳性的受试者施用。
12.诱导具有CTL诱导能力的APC的离体或体外方法，其包含选自下组的步骤：
(a)体外或离体将APC与权利要求1至3中任一项的肽接触；和
(b)将编码权利要求1至3中任一项的肽的多核苷酸导入APC。
13.诱导CTL的体外方法，其包含选自下组的步骤：
(a)将CD8阳性T细胞与APC共培养，所述APC在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1至3中任一项的肽的复合物；
(b)将CD8阳性T细胞与外来体共培养，所述外来体在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1至3中任一项的肽的复合物；
(c)将多核苷酸引入CD8阳性T细胞，所述多核苷酸编码T细胞受体(TCR)的每个亚基，所述T细胞受体能够结合细胞表面上由HLA抗原呈递的权利要求1至3中任一项的肽。
14.APC，其在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1至3中任一项的肽的复合物。
15.权利要求14的APC，其通过包括选自下组的步骤的方法诱导：
(a)体外或离体将APC与权利要求1至3中任一项的肽接触；和
(b)将编码权利要求1至3中任一项的肽的多核苷酸导入APC。
16.CTL，其靶向权利要求1-3中任一项的肽。
17.权利要求16的CTL，其通过包括选自下组的步骤的体外方法诱导：
(a)将CD8阳性T细胞与APC共培养，所述APC在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1至3中任一项的肽的复合物；
(b)将CD8阳性T细胞与外来体共培养，所述外来体在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1至3中任一项的肽的复合物；
(c)将多核苷酸引入CD8阳性T细胞，所述多核苷酸编码T细胞受体(TCR)的每个亚基，所述T细胞受体能够结合细胞表面上由HLA抗原呈递的权利要求1至3中任一项的肽。
18.选自下组(a)至(e)的至少一种成分在制备用于诱导针对癌症的免疫应答的方法中的用途，其中所述方法包含向受试者施用选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1至3中任一项的肽；
(c)APC，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向权利要求1至3中任一项的肽。
19.选自下组(a)至(e)的至少一种成分在制备用于治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发的方法的药物中的用途，其中所述方法包括向受试者施用选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1至3中任一项的肽；
(c)APC，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向权利要求1至3中任一项的肽。
20.抗体，其结合权利要求1至3中任一项的肽。
21.筛选具有CTL诱导能力的肽的方法，其包含以下步骤：
(a)产生由氨基酸序列组成的候选序列，在所述氨基酸序列中对由选自下组的氨基酸序列组成的原始氨基酸序列取代、缺失、插入和/或添加了一个，两个或数个氨基酸残基：SEQ ID NO:64、61、62、63、67、74、77、79、80和85；
(b)从在(a)中产生的候选序列中选择与除KOC1外的任何已知的人基因产物不具有显著同源性(序列同一性)的候选序列；
(c)将APC与由在(b)中选择出的候选序列组成的肽接触；
(d)将(c)的APC与CD8阳性T细胞接触；和
(e)选择与由原始氨基酸序列组成的肽相比，具有相等或更高的CTL诱导能力的肽。
22.乳剂，其包含一种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽，水溶性载体和油佐剂。
23.试剂盒，其包含容纳权利要求5至11中任一项的组合物的容器和容纳佐剂的容器。
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