CN112839950A - Cdca1衍生的肽和含有它们的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有诱导细胞毒性T细胞的能力的CDCA1衍生的表位肽。本发明还提供编码所述肽的多核苷酸，呈递所述肽的抗原呈递细胞，和靶向所述肽的细胞毒性T细胞，以及诱导抗原呈递细胞或CTL的方法。本发明还提供了含有它们作为活性成分的组合物和药物组合物。此外，本发明提供了使用本发明的肽、多核苷酸、抗原呈递细胞、细胞毒性T细胞或药物组合物来治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发的方法。还提供了诱导针对癌症的免疫应答的方法。

Description

CDCA1衍生的肽和含有它们的疫苗
技术领域
发明涉及生物科学领域，更具体的说涉及癌症治疗领域。具体而言，本发明涉及作为癌症疫苗有效的新肽，使用所述肽治疗和/或预防癌症的方法，以及包含所述肽的药物组合物。
发明背景
已知细胞毒性T细胞(CTL)可识别主要组织相容性复合物(MHC)I类分子上呈递的肿瘤相关抗原(TAA)所衍生的表位肽(其在肿瘤细胞表面上表达)，然后杀死肿瘤细胞。迄今为止，已经通过免疫学方法发现了包括黑素瘤抗原(MAGE)家族在内的许多TAA(NPL1:BoonT,Int J Cancer 1993,54(2):177-80；NPL2:Boon T&van der Bruggen P,J Exp Med1996,183(3):725-9)。靶向这些TAA的免疫疗法目前正在临床开发中。
在一些TAA中，鉴定了可以被CTL识别的表位肽，并且预期它们在用于各种癌症的免疫疗法上的应用(NPL3:Harris CC,J Natl Cancer Inst 1996,88(20):1442-55；NPL4:Butterfield LH et al.,Cancer Res 1999,59(13):3134-42；NPL5:Vissers JL et al.,Cancer Res 1999,59(21):5554-9；NPL6:van der Burg SH et al.,J Immunol 1996,156(9):3308-14；NPL7:Tanaka F et al.,Cancer Res 1997,57(20):4465-8；NPL8:Fujie Tet al.,Int J Cancer 1999,80(2):169-72；NPL9:Kikuchi M et al.,Int J Cancer1999,81(3):459-66；NPL10:Oiso M et al.,Int J Cancer 1999,81(3):387-94)。到目前为止，已经报道了使用这些TAA衍生的CTL表位肽进行癌症免疫疗法的几项临床试验。然而，不幸的是，在许多这些临床试验中，反应率不一定很高(NPL11:Belli F et al.,J ClinOncol 2002,20(20):4169-80；NPL12:Coulie PG et al.,Immunol Rev 2002,188:33-42；NPL13:Rosenberg SA et al.,Nat Med 2004,10(9):909-15)。因此，仍然需要鉴定可应用于癌症免疫治疗的新的表位肽。
CDCA1(细胞分裂周期相关蛋白1；也描述为NUF2、NDC80动粒复合物组分(NDC80kinetochore complex component):Nuf2；参考序列：GeneBank登录号NM_145697(SEQ IDNO:44)或GeneBank登录号NM_031423(SEQ ID NO:46))，已被鉴定为与CDC2、细胞周期蛋白、拓扑异构酶II和其它细胞周期基因共表达的基因的成员(NPL14:Walker et al.,CurrCancer Drug Targets 2001,1(1):73-83)。已经发现CDCA1与经历有丝分裂的HeLa细胞的着丝粒相关，并被认为是酵母Nuf2的功能同源物(NPL15:Wigge PA et al.,J Cell Biol2001,152(2):349-60)。同时，基于靶向27648个基因的全基因组cDNA微阵列的基因表达谱分析，已将CDCA1鉴定为在非小细胞肺癌中表达升高的基因(NPL16:Hayama et al.,CancerRes 2006,66(21):10339-48；PTL1:WO2007/013480；PTL2:WO2005/089735)。在肺癌组织和肺癌细胞系中观察到CDCA1表达，但是在除睾丸外的22个正常组织中几乎未观察到表达(NPL16；PTL1)。此外，由于siRNA介导的CDCA1表达的抑制，导致表达CDCA1的肺癌细胞系中细胞增殖的抑制(NPL16；PTL 1-2)。此外，在各种癌症如胆管细胞癌、膀胱癌和肾细胞癌中也观察到CDCA1的表达升高(NPL17:Harao M et al.,Int J Cancer 2008,123(11):2616-25)。
最近，已经鉴定了CDCA1衍生的HLA-A02限制性CTL表位肽(NPL17:Harao et al.,Int J Cancer.2008,123(11):2616-25；PTL3:WO2009/025117)，HLA-A24限制性CTL表位肽(PTL4:WO2009/153992)，HLA-A11限制性CTL表位肽(PTL5:WO2016/021508),HLA-A33限制性CTL表位肽(PTL5:WO2016/021508)和HLA-A03限制性CTL表位肽(PTL5:WO2016/021508)。这些肽的治疗作用在具有HLA-A02型、HLA-A24型、HLA-A11型、HLA-A33型或HLA-A03型的癌症患者中是预期的，但是对于具有除那些以外的HLA类型的癌症患者，期望与相应HLA类型相对应的肽。
[引用列表]
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发明概述
本发明涉及肽，其可以诱导对表达CDCA1的细胞特异性反应的细胞毒性T细胞(CTL)。当这些肽由人白细胞抗原(HLA)呈递在抗原呈递细胞(APC)上并由CD8阳性T细胞识别时，诱导显示出肽特异性细胞毒活性的CTL。迄今为止已鉴定出具有CTL诱导能力(CTL诱导力)的CDCA1衍生肽为HLA-A02限制性、HLA-A24限制性、HLA-A11限制性、HLA-A33限制性或HLA-A03限制性肽，并且当抗原呈递细胞不表达这些HLA时，该肽不能诱导CTL。因此，常规肽不适合对没有这些HLA的癌症患者(受试者)进行免疫疗法。HLA-A01是在高加索人中高度频繁观察到的HLA等位基因(Cao K et al.,Hum Immunol 2001,62(9):1009-30)。期望对HLA-A01阳性的癌症患者施用HLA-A01限制性肽。因此，本发明涉及CDCA1衍生肽，其具有对HLA-A01限制性的CTL诱导能力。基于本文公开的结果，已经证明本发明的肽是表位肽，其能够诱导针对表达CDCA1和HLA-A01的癌细胞的强力和特异性的免疫应答。
因此，本发明的目的之一是提供能够以HLA-A01限制性方式诱导CTL的CDCA1衍生肽。这些肽可以用于体外、离体或体内诱导CTL，或可用于施用至受试者用于诱导针对表达CDCA1的癌细胞的免疫应答的目的。优选的肽是包含选自以下氨基酸序列的肽：SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37；更优选的肽是九肽或十肽；和甚至更优选的肽是选自由以下氨基酸序列组成的肽：SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37。
本发明的肽包含以下肽，其中一个，两个或更多个氨基酸被取代，缺失，插入和/或添加，只要所得修饰肽保留了原始肽的CTL诱导能力。
本发明还提供了分离的多核苷酸，其编码本发明的任一种肽。与本发明的肽类似，这些多核苷酸可用于诱导具有CTL诱导能力的APC，并可施用至受试者用于诱导针对CDCA1表达的癌细胞的免疫应答。
本发明还提供了组合物，其包含本发明的一种或多种类型的肽，编码本发明的一种或多种类型的肽的一种一种或多种类型的多核苷酸，本发明的APC，呈递本发明肽的外来体，和/或本发明的CTL。本发明的组合物优选是药物组合物。本发明的药物组合物可用于治疗和/或预防癌症，以及防止其手术后复发。它们还可以用于诱导针对癌症的免疫应答。当施用于受试者时，本发明的肽呈递于APC的表面上，结果诱导了靶向肽的CTL。因此，本发明的另一个目的是提供用于诱导CTL的组合物，其中组合物包含一种或多种类型的本发明的肽，编码一种或多种类型的本发明的肽的一种或多种类型的多核苷酸，本发明的APC，和/或呈递本发明的肽的外来体。
本发明的另一个目的是提供诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，其中所述方法包括将本发明的一种或多种类型的肽与APC接触的步骤，或将编码本发明的任何一种肽的多核苷酸引入APC的步骤。
本发明还提供了诱导CTL的方法，包括将CD8-阳性T细胞与在其表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的APC共培养的步骤，将CD8-阳性T细胞与在其表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的外来体共培养的步骤，或将载体引入CD8-阳性T细胞的步骤，所述载体包含编码T细胞受体(TCR)的每个亚基的多核苷酸，所述TCR能够结合由细胞表面上的HLA抗原所呈递的本发明的肽。
本发明的另一个目的是提供分离的APC，在其表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物。本发明还提供靶向本发明肽的分离的CTL。这些APC和CTL可以用于针对表达CDCA1的癌症的免疫治疗。
本发明的另一个目的是提供在受试者中诱导针对癌症的免疫应答的方法，其中所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物包含本发明的肽，或编码所述肽的多核苷酸，本发明的APC，呈递本发明肽的外来体，和/或本发明的CTL的步骤。本发明的另一个目的是提供在受试者中治疗和/或预防癌症以及预防其手术后复发的方法，其中所述方法包括向受试者施用本发明的肽，编码所述肽的多核苷酸，本发明的APC，呈递本发明肽的外来体，和/或本发明的CTL的步骤。
除了上述之外，当结合附图和实施例阅读以下详细描述时，本发明的其它目的和特征将变得更加显而易见。然而，应当理解，本发明的前述概述和以下详细描述都是示例性实施方案，而对本发明或本发明的其它替代实施方案不是限制性的。特别地，尽管本文参照多个具体实施方案描述了本发明，但是应当理解，该描述是本发明的说明，而不构成对本发明的限制。在不脱离如所附权利要求所描述的本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可以想到各种修改和应用。同样地，本发明的其它目的，特征，益处和优点将从该概述和下面描述的某些实施方案中变得明显，并且对于本领域技术人员将是显而易见的。从上述结合所附实施例，数据，附图和从其中得出的所有合理推断，单独或与并入本文的参考文献一同考虑，此类目的，特征，益处和优点将是显而易见的。
附图简述
图1由照片(a)至(j)组成，其显示使用衍生自CDCA1的肽诱导的细胞进行的IFN-gamma酶联免疫斑点(ELISPOT)测定的结果。在图中，“+”显示针对用感兴趣的肽脉冲的靶细胞的IFN-gamma产生，而“-”显示针对尚未用任何肽脉冲的靶细胞的IFN-gamma产生(阴性靶标)。与阴性对照相比，在以下项中观察到了肽特异性的IFN-gamma产生：
具有CDCA1-A01-8-138(SEQ ID NO:1)的孔#1(a)，
具有CDCA1-A01-9-290(SEQ ID NO:25)的孔#7(b)，
具有CDCA1-A01-9-130(SEQ ID NO:33)的孔#5(c)，
具有CDCA1-A01-9-246(SEQ ID NO:34)的孔#7(d)，
具有CDCA1-A01-9-268(SEQ ID NO:35)的孔#1(e)，
具有CDCA1-A01-9-288(SEQ ID NO:37)的孔#3(f)，
具有CDCA1-A01-10-136(SEQ ID NO:8)的孔#2(g)，
具有CDCA1-A01-10-56(SEQ ID NO:10)的孔#6(h)，和
具有CDCA1-A01-10-48(SEQ ID NO:13)的孔#6(i)。
从照片中显示反应的带框的细胞中建立了CTL克隆。相比之下，显示了CDCA1-A01-10-66(SEQ ID NO:9)(j)作为典型阴性数据的实例，其中未观察到肽特异性的IFN-gamma产生。
图2由一系列线图(a)至(c)组成，其显示通过在CDCA1-A01-10-136(SEQ ID NO:8)、CDCA1-A01-10-56(SEQ ID NO:10)或CDCA1-A01-10-48(SEQ ID NO:13)诱导后通过有限稀释法建立的CTL克隆的IFN-gamma产生。这些结果显示CTL克隆的肽特异性IFN-gamma产生。在图中，“+”显示针对用感兴趣的肽脉冲的靶细胞的CTL克隆的IFN-gamma产生，而“-”显示针对尚未用任何肽脉冲的靶细胞的CTL克隆的IFN-gamma产生。R/S比率表示CTL克隆(应答细胞)的细胞数与刺激这些细胞的靶细胞(刺激细胞)的细胞数的比率。
图3是显示针对表达CDCA1和HLA-A*01:01两者的靶细胞的CTL克隆的IFN-gamma产生的线图。表达HLA-A*01:01或全长CDCA1基因的COS7细胞用作阴性对照。通过CDCA1-A01-10-136(SEQ ID NO:8)诱导后建立的CTL克隆在COS7细胞中显示IFN-gamma产生，在该COS7细胞中引入了CDCA1和HLA-A*01:01基因两者(黑色菱形)。同时，在引入HLA-A*01:01(三角形)或CDCA1(白色圆圈)的COS7细胞中未显示出明显的IFN-gamma产生。
发明详述
尽管在实施或检验本发明的实施方案中可使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料，现在描述优选的方法、装置和材料。然而，在描述本发明的材料和方法之前，应当理解，本发明不限于本文所描述的特定大小，形状，尺度，材料，方法学，方案等，因为这些可以根据常规实验和优化改变。还应当理解，本说明书中使用的术语仅用于描述特定版本或实施方案的目的，并且不旨在限定本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限定。
I.定义
除非另有明确说明，如本文中使用的词语“一个/种”、“该”、和“所述”意味着“至少一个/种”。
术语“分离的”和“纯化的”与物质(例如肽、抗体、多核苷酸等)相关使用时，指该物质基本上不含至少一种可以包括在天然来源中的物质。因此，分离的或纯化的肽指基本上不含另一种细胞材料，例如来自所述肽的细胞或组织来源的碳水化合物、脂质或其它污染性蛋白质。当化学合成肽时，分离或纯化的肽是指基本上不含有前体物质或另一种化学物质的肽。短语“基本上不含细胞物质”包括肽制备物，其中所述肽与分离出该肽的或重组产生该肽的细胞的细胞组分是分离的。如此，基本上不含细胞材料的肽包括肽制备物，其含有小于约30％,20％,10％,或5％,3％,2％或1％(以干重计)的其他细胞材料。当肽以重组方式生成时，分离或纯化的肽基本上不含有培养基，其包含肽制备物，所述肽制备物含有小于肽制备物体积的约20％,10％,或5％,3％,2％或1％(以干重计)的培养基。当通过化学合成产生肽时，分离或纯化的肽基本上不含有前体物质或其它化学物质，其含有肽制备物，所述肽制备物包含小于约30％,20％,10％,5％,3％,2％或1％(以干重计)肽制备物体积的前体物质或其它化学物质。可以通过例如在十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色或此类凝胶之后出现单一条带来确认肽制备物是分离的或纯化的。在优选的实施方案中，本发明的肽和多核苷酸是分离的或纯化的。
术语“多肽”，“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，并指氨基酸残基的聚合物。除天然存在的氨基酸聚合物外，这些术语也适用于非天然存在的氨基酸聚合物，其包含一种或多种非天然存在的氨基酸残基。非天然存在的氨基酸包括氨基酸类似物，氨基酸模拟物，以及此类。
本文所用的术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸发挥相似功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在氨基酸是细胞中那些通过遗传密码编码的，以及那些翻译后修饰的(例如羟脯氨酸，gamma-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸等)。短语“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(与氢结合的alpha碳，羧基，氨基和R基团)但具有修饰的R基团或修饰的骨架的化合物(如，高丝氨酸，正亮氨酸，甲硫氨酸亚砜，甲硫氨酸甲基锍等)。短语“氨基酸模拟物”是指与一般氨基酸具有不同结构但具有相似功能的化合物。氨基酸可以是L-氨基酸或D-氨基酸，并且本发明的肽优选是L-氨基酸聚合物。
术语“多核苷酸”，“寡核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，并且是指核苷酸的聚合物。
本说明书中使用的术语“组合物”旨在包括包含指定量的指定成分的产品，以及直接或间接由指定量的指定成分的组合产生的任何产品。当组合物是药物组合物时，术语“组合物”旨在包括活性成分和惰性成分的产品，以及从任何两种或多种成分的组合，络合或聚集，从一种或多种成分的离解，或从一种或多种成分的其它类型的反应或相互作用直接或间接产生的任何产品。因此，本发明的药物组合物包括通过将本发明的化合物或细胞与药学上或生理学上可接受的载体混合而制备的任何组合物。不限于此，本说明书中使用的术语“药学上可接受的载体”或“生理学上可接受的载体”包括液体或固体填充剂，稀释剂，赋形剂，溶剂和包封材料；并且是指药学或生理学上可接受的材料，组合物，物质或介质。
除非另有说明，术语“癌症”是指过表达CDCA1基因的癌症；且其实例包括膀胱癌，乳腺癌，宫颈癌，胆管细胞癌，慢性骨髓性白血病(CML)，食管癌，胃癌，非小细胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，前列腺癌，肾癌，小细胞肺癌，头颈部癌，软组织肿瘤，大肠癌等,但不限于此。在示例性实施方案中，“癌症”是表达CDCA1和HLA-A01的癌症。
除非另有说明，术语“细胞毒性T淋巴细胞”和“细胞毒性T细胞”和“CTL”在本文中可互换使用。除非另有明确说明，它们是指可识别非自身细胞(例如肿瘤/癌细胞，病毒感染的细胞)并诱导此类细胞的死亡的T淋巴细胞亚群。
除非另有说明，术语“HLA-A01(HLA-A1)”是指包括诸如HLA-A*01:01、HLA-A*01:02、HLA-A*01:03和HLA-A*01:04的亚型的HLA-A01型。
在受试者或患者的语境中，本文所用的短语“受试者(或患者)的HLA抗原是HLA-A01”是指受试者或患者具有纯合或杂合的HLA-A01抗原基因作为MHC(主要组织相容性复合物)I类分子,并且HLA-A01抗原在受试者或患者的细胞中作为HLA抗原表达。
只要本发明的方法和组合物在癌症“治疗”的语境中是有用的，则当其实现临床优势时，该治疗被认为是“有效的”，例如，在受试者中减少癌症的尺寸，扩散或转移能力，延缓癌症进展，减轻癌症的临床症状，延长存活期，抑制术后复发。当预防性地施用治疗时，“有效”是指治疗延迟或防止癌症形成，或防止或减轻癌症的临床症状。有效性是相对于任何公知的用于诊断或治疗特定肿瘤类型的方法来确定的。
只要本发明的方法和组合物用于癌症“预防(防范)”的语境中，本文中术语“预防(防范)”包括减轻与疾病相关的死亡率或发病率的负担的任何工作。预防(防范)可以在“初级，二级和三级预防(防范)水平”进行。尽管一级预防(防范)避免疾病的发展，在二级和三级水平的预防(防范)包括预防(防范)疾病进展和症状的出现，以及旨在通过恢复功能和减少疾病相关并发症来降低现有疾病的不良影响。或者，预防(防范)可以包括减轻特定病症的严重性，例如旨在减少肿瘤生长和转移的广泛的预防性治疗。
在本发明的语境中，癌症的治疗和/或预防(防范)和/或其手术后复发预防(防范)包括任一事件，例如抑制癌细胞增殖，肿瘤退化或消退，诱导癌症发展的缓解和抑制，肿瘤消退，以及减少或抑制转移，抑制癌症的术后复发和延长存活期。癌症的有效治疗和/或预防(防范)降低死亡率，改善患有癌症的个体的预后，降低肿瘤标志物的血液水平，并减轻与癌症相关的可检测的症状。例如，症状的缓解或改善构成有效的治疗和/或预防(防范)，并包括其中症状减轻或稳定10％、20％、30％或更多的病患。
在本发明的语境中，术语“抗体”是指与指定的蛋白质或其肽特异性反应的免疫球蛋白及其片段。抗体可以包括人抗体，灵长类化抗体，嵌合抗体，双特异性抗体，人源化抗体，与其他蛋白或放射性标记融合的抗体，和抗体片段。此外，本文中的“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体涵盖完整单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体，由两个或多个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展示所需的生物学活性。“抗体”可以是所有类别的抗体(例如IgA，IgD，IgE，IgG和IgM)。
除非另有说明，本文使用的技术术语和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的术语相同的含义。
II.肽
HLA-A01是在高加索人中常见的等位HLA基因(Cao et al.,Hum Immunol2001,62(9):1009-30)。因此，对于高加索人的大量群体，治疗表达CDCA1的癌症的有效方法可以通过提供限制于HLA-A01的CDCA1衍生的CTL诱导肽来提供。因此本发明提供了CDCA1衍生肽，其能够以HLA-A01限制性方式诱导CTL。
本发明的肽是CDCA1衍生肽，其能够以HLA-A01限制性方式诱导CTL。能够以HLA-A01限制性方式诱导CTL的肽包括具有选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列的肽。
具有对这些肽特异的细胞毒性活性的CTL可以通过用这些肽脉冲的树突细胞对T细胞体外刺激来建立。建立的CTL显示出针对用每种肽脉冲的靶细胞的特异性细胞毒性活性。
CDCA1基因在癌症细胞中过表达，例如在如膀胱癌，乳腺癌，宫颈癌，胆管细胞癌，慢性骨髓性白血病(CML)，食管癌，胃癌，非小细胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，前列腺癌，肾癌，小细胞肺癌，头颈癌，软组织肿瘤，大肠癌等中的癌细胞中，但在大多数正常器官中不表达。因此它是免疫治疗的极好的靶标。因此，本发明的肽可以适当地用于癌症免疫治疗。优选的肽是九肽(由9个氨基酸残基组成的肽)或十肽(由10个氨基酸残基组成的肽)，且更为优选的是由选自以下氨基酸序列组成的组的肽：SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37。例如具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的肽适于诱导显示针对表达HLA-A01和CDCA1细胞的特异细胞毒性活性的CTL，并可以适合用于HLA-A01阳性患者的癌症免疫治疗。在更优选的实施方案中，本发明的肽是由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成的肽。
对于本发明的肽，可以值得另外的氨基酸残基以附加(adjoin)本发明的肽的氨基酸序列，只要得到的肽保留原始肽的CTL诱导能力即可。另外的氨基酸残基可以由任何类型的氨基酸组成，只要它们不损害原始肽的CTL诱导能力即可。因此，本发明的肽包含具有CTL诱导能力的肽，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37。此类肽例如少于约40个氨基酸，在许多情况下少于约20个氨基酸，并通常少于约15个氨基酸。因此，如果原始肽是九肽，则本发明的肽包含10个氨基酸长或11-40个氨基酸长的肽，其通过将另外的氨基酸附加至所述肽产生。此外，如果原始肽是十肽，则本发明的肽包含11-40个氨基酸长的肽。此类肽可以是(例如)11-20个氨基酸长的肽或11-15个氨基酸长的肽。另外的氨基酸残基的优选实例为在CDCA1的全长氨基酸序列中邻接本发明的肽的氨基酸序列的氨基酸残基(例如SEQ ID NO:64)。因此，本发明的肽包括含有选自以下氨基酸序列的肽：SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37,且其中所述肽是CDCA1的肽片段并具有CTL诱导活性。
一般而言，某些肽中一个，两个或更多个氨基酸的修饰不会影响肽的功能，或在有些情况下甚至会增强原始蛋白质的期望功能。事实上，已知经过修饰的肽(即由与原始参照序列相比其中一个、两个或数个氨基酸残基修饰(即取代、添加、缺失和/或插入)的氨基酸序列构成的肽)保留原始肽的生物学活性(Mark等人.,Proc Natl Acad Sci USA 1984,81:5662-6；Zoller and Smith,Nucleic Acids Res 1982,10:6487-500；Dalbadie-McFarland等人.,Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13)。因此，在一个实施方案中，本发明的肽可以是包含以下氨基酸序列的肽，其中选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列的一个，两个或数个氨基酸残基被取代，缺失，插入和/或添加，并具有CTL诱导活性。
本领域技术人员可以认识到对氨基酸序列的个别取代(其改变了单个氨基酸或少数百分比的氨基酸)倾向于导致原始氨基酸侧链的特性的保留。因此，那些通常被称作“保守取代”或“保守修饰”；且通过“保守取代”或“保守修饰”对蛋白质的修饰可以导致修饰的蛋白具有与原蛋白相似的功能。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域公知的。功能上相似的氨基酸侧链特征的例子包括例如疏水性氨基酸(A,I,L,M,F,P,W,Y,V)、亲水性氨基酸(R,D,N,C,E,Q,G,H,K,S,T)、和具有以下共同官能团或特征的侧链：脂肪族侧链(G,A,V,L,I,P)；含羟基侧链(S,T,Y)；含硫原子侧链(C,M)；含羧酸和酰胺侧链(D,N,E,Q)；含碱侧链(R,K,H)；和含芳香侧链(H,F,Y,W)。另外，以下八组各自含有本领域认可互为保守替代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton,Proteins 1984)。
此类保守修饰肽也被包含在本发明的肽中。然而，本发明的肽不限于此，并可包括非保守修饰，只要该肽保留原始肽的CTL诱导能力。另外，经过修饰的肽不排除衍生自CDCA1的多态性变体、种间同源物、和等位基因的可诱导CTL的肽。
只要肽保留原始肽的CTL诱导能力，可以修饰(即取代，缺失，插入和/或添加)少数(例如，1个、2个或数个)或小百分比的氨基酸。这里，术语“数个”意指5个以下的氨基酸，如4个或3个或更少。被修饰的氨基酸的百分比优选为20％或更少，更优选15％或更少，进一步更优选10％或更少，例如1至5％。
当在癌症免疫疗法的语境中使用时，本发明的肽呈递在细胞或外来体的表面上，优选作为与HLA抗原的复合物。因此，优选的是本发明的肽拥有对HLA抗原的高结合亲和力。为此目的，可以对肽通过取代、缺失、插入和/或添加氨基酸残基来修饰以产生具有改善结合亲和力的修饰肽。由于通过结合HLA抗原而被展示的肽的序列规律是已知的(Falk etal.,Immunogenetics 1994,40 232-41；Chujoh,et al.,Tissue Antigens 1998,52:501-9；Takiguchi et al.,Tissue Antigens 2000,55:296-302.)，可将基于此类规律的修饰引入本发明的肽。
例如，在具有对HLA I类分子具有结合亲和力的肽中，自N端起的第二个氨基酸和C端氨基酸通常是参与结合至HLA I类的锚定残基(Rammensee HG,et al.,Immunogenetics.1995,41(4):178-228.)。例如，对于HLA-A01，N端的第三个氨基酸的天冬氨酸和谷氨酸以及C端氨基酸的酪氨酸被认为是对HLA-A01具有高结合亲和力的锚定残基。此外，在HLA-A01中，自N端的2位有辅助锚定残基；并且已知苏氨酸和丝氨酸优选作为自N端的第二个氨基酸(Kubo,R.T Journal of Immunology 1994,152:3913-24；Gambacorti-Passerini,C.Clinical Cancer Research 1997,3:675-83；Falk,K.Immunogenetics1994,40:238-41)。因此，为了增强HLA-A01结合亲和力，有可能期望用天冬氨酸或谷氨酸取代自N端起的第三个氨基酸，和/或用酪氨酸取代C端的氨基酸。此外，还可能期望用苏氨酸或丝氨酸取代自N端起的第二个氨基酸。因此，具有CTL诱导能力的肽涵盖在本发明的肽中，其包含下述氨基酸序列，其中在选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列中用苏氨酸或丝氨酸取代自N端的第二个氨基酸；用天冬氨酸或谷氨酸取代自N端的第三个氨基酸；和/或用酪氨酸取代C端氨基酸。在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的肽，其由下述氨基酸序列组成，其中在选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列中用苏氨酸或丝氨酸取代自N端的第二个氨基酸；用天冬氨酸或谷氨酸取代自N端的第三个氨基酸；和/或用酪氨酸取代C端氨基酸。即，本发明的肽涵盖具有CTL诱导能力的包含氨基酸序列的肽，其中所述氨基酸序列在选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列中具有选自以下(a)至(c)的一个或多个取代：
(a)自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸或丝氨酸；
(b)自N端起的第三个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸；和
(c)C端氨基酸被取代为酪氨酸。
在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸组成的肽，其中将选自以上(a)至(c)的一个或多个取代引入选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列中。在本发明中，优选的取代数目是选自以上(a)至(c)的1、2或3个取代。
此外，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的包含氨基酸序列的肽，其中在选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列中，自N端起的第三个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸，和/或C端氨基酸被取代为酪氨酸。优选地，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸序列组成的肽，其中在选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列中，自N端起的第三个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸，和/或C端氨基酸被取代为酪氨酸。即，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的包含氨基酸序列的肽，其中将选自以下(a)和(b)的一个或多个取代引入选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列中：
(a)自N端起的第三个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸；和
(b)C端氨基酸被取代为酪氨酸。
在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸序列组成的肽，其中将选自以上(a)至(b)的一个或多个取代引入选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列中。
不仅可以在锚定位点处引入氨基酸取代，而且可以在肽的潜在T细胞受体(TCR)识别位置处引入取代。数项研究已证明了具有氨基酸取代的肽可等同于或好于原来功能的功能，例如CAP1、p53(264-272)、Her-2/neu(369-377)或gp100(209-217)(Zaremba et al.CancerRes.1997,57,4570-7；T.K.Hoffmann et al.J Immunol.2002,168(3):1338-47；S.O.Dionne et al.Cancer Immunol immunother.2003,52:199-206；和S.O.Dionne etal.Cancer Immunology,Immunotherapy 2004,53,307-14)。
本发明还考虑也可以向本发明的肽(例如,由选自以下氨基酸序列组成的肽：SEQID NO:1、8、10、13、25、33至35和37)的N末端和/或C端添加1个、2个或数个氨基酸。此类保留CTL诱导能力的修饰肽也包括在本发明中。例如，当肽与APC接触时(所述肽中一个，两个或数个氨基酸被添加到由SEQ ID NO:8氨基酸序列组成的肽的N末端和/或C端)，其掺入APC中并加工成由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成的肽。然后其可以通过经由抗原呈递途径呈递在APC的细胞表面上诱导CTL。更具体地，本发明的肽可以是其中在N末端和C端的任一个或两者上添加一个，两个或数个氨基酸的肽。
在本发明的又一个实施方案中，提供了由氨基酸序列组成的肽，该氨基酸序列在每个SEQ ID NO所指的氨基酸序列中包含一个、两个或数个氨基酸取代，并且其进一步包含添加到带有取代的氨基酸序列的N端和C端的任一个或两者的一个、两个或数个氨基酸。
当本发明的肽包含氨基酸取代时，该取代的期望位置可以是例如在包含在本发明的所述肽中的由SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37所指的氨基酸序列中选自自N端起的位置2、自N端起的的位置3和C端的一个、两个或三个。
然而，当肽的氨基酸序列与具有不同功能的内源或外源蛋白质的氨基酸序列的一部分相同时，可以诱导针对特定物质的自身免疫性疾病和/或过敏性症状等副作用。因此，优选使用可用的数据库进行同源性搜索，以避免肽的氨基酸序列与另一种蛋白质的氨基酸序列匹配的情况。当根据同源性搜索清楚了不存在与目标肽相比仅有1个或2个氨基酸差异的肽时，可以修饰目标肽以提高其与HLA抗原的结合亲和力，和/或提高其CTL诱导能力，而没有任何发生此类副作用的危险。
预测其中本发明的肽的一个，两个或数个氨基酸被修饰的肽能够保留原始肽的CTL诱导能力；然而优选验证修饰肽的CTL诱导能力。这里，“具有CTL诱导能力(CTL可诱导性(CTL inducibility))的肽”指肽，其通过用肽刺激的APC诱导CTL。“CTL诱导”包括诱导分化成CTL，诱导CTL激活，诱导CTL增殖，诱导CTL的细胞毒活性，诱导CTL介导的靶细胞溶解，和诱导CTL的IFN-gamma产生增加。
CTL诱导能力的可通过如下来确认：用肽诱导并刺激保留HLA抗原的APC(例如B淋巴细胞，巨噬细胞和树突细胞)并将其与CD8阳性细胞混合；然后测量由CTL针对靶细胞所释放的IFN-gamma。对于APC，可以优选使用人外周血单核细胞来源的树突细胞。作为反应系统，可使用已经制成以表达HLA抗原的转基因动物。或者，例如可以用51Cr或此类放射性标记靶细胞，并且可以自靶细胞释放的放射性计算肽-诱导的CTL的细胞毒性活性。或者，在肽刺激的APC的存在下，可能通过以下评估CTL诱导能力：测量由CTL生成和释放的IFN-gamma，并使用抗IFN-gamma单克隆抗体显现培养基上的抑制区。
除上述的修饰之外，还可将本发明的肽连接至其它肽，只要所得的连接肽保留CTL诱导能力。与本发明的肽连接的适当肽的例子包括TAA衍生的CTL诱导肽。此外，本发明的肽也可以彼此连接。用于连接肽的合适的接头是本领域已知的，例如可以使用接头，如AAY(P.M.Daftarian等人,J Trans Med 2007,5:26),AAA,NKRK(SEQ ID NO:48)(R.P.M.Sutmuller et al.,J Immunol.2000,165:7308-15)或K(S.Ota et al.,CanRes.2002,62,1471-6；K.S.Kawamura et al.,J Immunol.2002,168:5709-15)。肽可以以各种排列连接(例如，链状，重复等)，并且还可以连接三个或更多个肽。
本发明的肽还可连接至其它物质，只要所得的连接肽保留CTL诱导能力。与本发明的肽连接的适当物质的例子包括，例如，肽、脂质、糖或糖链、乙酰基，和天然的或合成的聚合物。本发明的肽可以进行如下修饰：糖基化、侧链氧化、或磷酸化等等，只要不破坏它们的CTL诱导能力。还可以实施此种类型的修饰以赋予额外的功能(例如，靶向功能和递送功能)或稳定所述肽。
例如，为了提高肽的体内稳定性，本领域已知引入D-氨基酸、氨基酸模拟物或非天然氨基酸；此构思也可适用于本发明的肽。肽的稳定性可以以多种方式测定。例如，可以通过使用肽酶以及各种生物介质例如人血浆和血清来测试稳定性(参见例如Verhoef等人,Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11:291-302)。
此外，如上文所述，在上述取代、缺失、插入和/或添加了1个、2个或数个氨基酸残基的修饰肽中，可以筛选或选择与原始肽相比活性相等或更高者。因此，本发明还提供由于筛选或选择与原始肽相比活性相等或更高的修饰肽的方法。具体地，本发明提供了筛选具有CTL诱导能力的肽的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)产生由对原始氨基酸序列通过取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸残基而修饰得到的氨基酸序列组成的候选序列，其中所述原始氨基酸序列选自SEQ IDNO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列组成；
(b)从在(a)中产生的候选序列中选择与CDCA1之外的任何已知人基因产物的肽均无显著同源性(或序列同源性)的候选序列；
(c)使由(b)中选择的候选序列组成的肽与APC接触；
(d)使(c)的APC与CD8阳性T细胞接触；和
(e)选择具有与由原始氨基酸序列组成的肽相等或更高的CTL诱导能力的肽。
在本发明中，由SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37组成的所有肽均具有HLA-A01限制性CTL诱导活性。因此，为了从其氨基酸序列修饰的变体中选择具有CTL诱导能力的那些，期望上述步骤(c)中的APC是具有HLA-A01的细胞。
本文中，本发明的肽也被描述为“CDCA1肽”或“CDCA1多肽”。
III.本发明的肽的制备
本发明的肽可使用公知技术来制备。例如，可以使用重组DNA技术或化学合成来制备本发明的肽。本发明的肽可独立地合成，或合成为包括两个或更多个肽的较长多肽。本发明的肽可以在使用重组DNA技术在宿主细胞中产生它们或者在化学合成它们之后从宿主细胞或合成反应产物分离。即，可以纯化或分离本发明的肽，以使其基本上不含其它宿主细胞蛋白质及其片段，或任何其它化学物质。
本发明的肽可含有修饰，诸如糖基化、侧链氧化、或磷酸化等，前提是该修饰不破坏原始肽的生物学活性。其他示例性的修饰包括掺入一种或多种D-氨基酸或其他可用的氨基酸模拟物，以便例如增加肽的血清半寿期。
可以根据选定的氨基酸序列，通过化学合成来获得本发明的肽。可以适合于合成的常规肽合成方法的例子包括以下文献中描述的方法：
(i)Peptide Synthesis,Interscience,New York,1966；
(ii)The Proteins,Vol.2,Academic Press,New York,1976；
(iii)“Peptide Synthesis”(日文),Maruzen Co.,1975；
(iv)“Basics and Experiment of Peptide Synthesis”(in Japanese),MaruzenCo.,1985；
(v)“Development of Pharmaceuticals”(日文),Continued Vol.14(peptidesynthesis),Hirokawa,1991；
(vi)WO99/67288；和
(vii)Barany G.&Merrifield R.B.,Peptides Vol.2,Solid Phase PeptideSynthesis,Academic Press,New York,1980,100-118。
或者，可通过适用任何已知的遗传工程肽生产方法来获得本发明的肽(例如Morrison J,J Bacteriology 1977,132:349-51；Clark-Curtiss&Curtiss,Wu et al.,Methods in Enzymology 1983,101:347-62)。例如，首先，制备包含处于可表达形式(例如处于相当于启动子序列的调节序列下游)的编码目标肽的多核苷酸的合适载体，并转化入合适的宿主细胞。本发明还提供了此类载体和宿主细胞。然后培养宿主细胞以生成感兴趣的肽。也可以采用体外翻译系统在体外生产本发明的肽。
IV.多核苷酸
本发明还提供编码任何本发明肽的多核苷酸。这些包括衍生自天然存在的CDCA1基因(例如GenBank登录号NM_145697(SEQ ID NO:44)或GenBank登录号NM_031423(SEQ IDNO:46))以及具有它们的保守修饰的核苷酸序列的多核苷酸。本文中，短语“保守修饰的核苷酸序列”指编码相同或实质上相同的氨基酸序列的序列。由于遗传密码的简并性，大量的功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG、和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子规定为丙氨酸的任何位置处，该密码子可改变成任何相应所述密码子，而不改变所编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，是保守修饰变异的一种。本文中编码肽的每一种核酸序列也描述该核酸的每一种可能的沉默变异。本领域普通技术人员会认识到，核酸中的每一个密码子(AUG和TGG除外，AUG在正常情况下是甲硫氨酸的唯一密码子，而TGG在正常情况下是色氨酸的唯一密码子)都可以被修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码肽的核酸的每一种沉默变异在每个公开的序列中隐含地描述。
本发明的多核苷酸可以由DNA、RNA、及其衍生物构成。DNA由诸如A，T，C和G的碱基适当地组成，并且在RNA中T被U取代。
本发明的多核苷酸可编码多个本发明肽，其中有或无居间氨基酸序列(intervening amino acid sequence)。例如，居间氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻译的肽的切割位点(例如酶识别序列)。此外，多核苷酸可以包括编码本发明的肽的编码序列的任何额外的序列。例如，多核苷酸可以是包括表达肽所需要的调节序列的重组多核苷酸，或者可以是具有标志基因等等的表达载体(如质粒)。一般而言，此类重组多核苷酸可通过常规重组技术操作多核苷酸来制备，例如通过使用聚合酶和内切核酸酶。
重组和化学合成技术都可用来生成本发明的多核苷酸。例如，可以通过插入在转染入感受态细胞后能表达的适宜载体来生成本发明的多核苷酸。或者，可使用PCR技术或在合适宿主中表达来扩增多核苷酸(参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989)。或者，可使用固相技术来合成多核苷酸，如Beaucage SL&Iyer RP,Tetrahedron 1992,48:2223-311；Matthes等人,EMBO J 1984,3:801-5中记载的。
V.外来体(exosome)
本发明进一步提供了称作外来体的细胞内囊泡，这些外来体在它们的表面上呈递本发明肽与HLA抗原之间形成的复合体。外来体可以通过，例如在JPH11-510507和WO99/03499中详细描述的方法来制备，并可以用从作为治疗和/或预防(防范)对象的患者获得的APC制备。本发明的外来体可以作为疫苗以与本发明的肽相似的方式进行接种。
上述复合体中包含的HLA抗原的类型必须与需要治疗和/或预防(防范)的受试者的类型匹配。例如，HLA-A01(例如HLA-A*01:01)是在高加索人群体中高度频繁观察到的HLA等位基因，并且该HLA抗原类型被认为适合用于高加索人患者中的治疗。典型地，在临床上，通过预先研究需要治疗的患者的HLA抗原类型，可以选择合适的肽，其对特定HLA抗原具有高水平的结合亲和力，或者通过由特异性HLA抗原介导的抗原呈递的CTL诱导能力。
本发明的外来体在其表面上呈递本发明的肽与HLA-A01的复合物。当与本发明的肽形成复合物的HLA是HLA-A01时，本发明的肽优选为具有选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列的肽或其修饰的肽，并且更优选由选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列组成的肽或其修饰的肽。
VI.抗原呈递细胞(APC)
本发明还提供在其表面上呈递在HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物的APC。或者本发明提供了在其表面上具有在HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物的APC。本发明的APC可以是分离的APC。当在细胞(APC，CTL等)的语境中使用时，术语“分离的”意指细胞与另一类型的细胞分离。本发明的APC可以是从衍生自待经受治疗和/或预防(防范)的患者的APC诱导的APC，并且可以作为疫苗自身或与其他药物(包括本发明的肽，外来体或CTL)组合施用。
本发明的APC不限于特定种类的细胞，并且包括抑制在其细胞表面呈递蛋白质性质的抗原的细胞以通过淋巴细胞(例如树突细胞(DC)、Langerhans细胞、巨噬细胞、B细胞、和活化的T细胞)识别。由于DC是APC中具有最强CTL诱导活性的代表性APC，可以优选使用DC作为本发明的APC。
例如，可以通过从外周血单核细胞诱导DC，然后在体外、离体或体内用本发明的肽刺激它们来获得本发明的APC。当对受试者施用本发明的肽时，在受试者的身体中诱导出呈递本发明肽的APC。因此在将本发明的肽施用至受试者后，可以通过从受试者收集APC来获得本发明的APC。或者，可以通过使从受试者收集而来的APC与本发明的肽接触来获得本发明的APC。
为了在受试者中诱导针对表达CDCA1的癌细胞的免疫应答，本发明的APC可以单独或者与其他药物(包括本发明的肽、外来体或CTL)组合施用给受试者。例如，离体施用可包括下述步骤：
(a)自第一受试者收集APC；
(b)使步骤(a)的APC接触本发明的肽；和
(c)对第二受试者施用步骤(b)的APC。
第一受试者和第二受试者可以是同一个体，或者可以是不同个体。当第一受试者和第二受试者是不同个体时，优选第一受试者和第二受试者的HLA是相同类型。获得自上述步骤(b)中的APC可以是用于癌症治疗和/或预防(防范)的疫苗。
获得自如上描述方法的本发明的APC具有CTL诱导能力。用于APC的语境中的术语“CTL诱导能力(CTL可诱导性)”指APC与CD8阳性细胞接触时诱导CTL的能力。由本发明的APC所诱导的CTL是对CDCA1特异性的CTL，并表现出对表达CDCA1的细胞的特异性细胞毒活性。
除了上述方法之外，可以通过在体外将编码本发明肽的多核苷酸导入至APC来制备本发明的APC。待导入的多核苷酸可以是DNA或RNA的形式。导入的方法并不特别限制，且其例子包括本领域中常规实施的各种方法，例如脂质体转染、电穿孔和磷酸钙法。更具体的说，可以使用描述于Cancer Res 1996,56:5672-7；J Immunol 1998,161:5607-13；J ExpMed 1996,184:465-72,和JP2000-509281中的方法。通过将编码本发明的肽的多核苷酸引入APC，多核苷酸在细胞中转录并翻译，然后产生的肽被MHC I类加工并通过呈递途径以将本发明的肽呈递在APC的细胞表面上。
在优选的实施方案中，本发明的APC是在其细胞表面上呈递HLA-A01(更优选HLA-A*01:01)和本发明的肽之间形成的复合物的APC。当与本发明的肽形成复合物的HLA是HLA-A01时，本发明的肽优选为具有选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列的肽或其修饰的肽，并且更优选由选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列组成的肽。
本发明的APC优选是通过包括下述(a)或(b)的步骤的方法诱导的APC：
(a)将表达HLA-A01(更优选HLA-A*01:01)的APC与本发明的肽接触；或
(b)将编码本发明的肽的多核苷酸引入表达HLA-A01(更优选HLA-A*01:01)的APC。
与表达HLA-A01的APC接触的本发明的肽优选是具有选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列的肽或其修饰的肽，并且更优选由选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列组成的肽。
本发明提供了本发明的肽用于制备诱导具有CTL诱导能力的APC的药物组合物的用途。另外，本发明提供了制备诱导具有CTL诱导能力的APC的药物组合物的方法或过程。进一步地，本发明提供了用于诱导具有CTL诱导能力的APC的本发明的肽。
VII.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)
由本发明的肽诱导的CTL可以与本发明的肽相似的方式用作疫苗，因为其在体内增强靶向表达CDCA1的癌细胞的免疫应答。因此本发明提供了CTL，其通过本发明的肽诱导或活化。本发明的CTL是靶向本发明肽的CTL，并且能够结合至本发明的肽和HLA抗原的复合物。CTL与所述复合物的结合是经由存在于CTL的细胞表面的T细胞受体(TCR)介导的。本发明的CTL可以是分离的CTL。
本发明的CTL可以获得自(1)向受试者施用本发明的肽，(2)体外用本发明的肽刺激衍生自受试者的APC和CD8阳性T细胞，或外周血单核细胞(PBMC)，(3)体外将CD8阳性T细胞或PBMC与APC或外来体接触，所述APC或外来体在它们的表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物，或(4)将包含编码每种T细胞受体(TCR)亚基的多核苷酸的载体导入CD8阳性T细胞，所述TCR能够结合由细胞表面上HLA抗原所呈递的本发明的肽。用于上文(2)或(3)方法的外来体和APC可以分别通过“V.外来体”和“VI.抗原呈递细胞(APC)”部分中描述的方法制备，且上文(4)的方法的详情将在“VIII.T细胞受体(TCR)”部分中描述。
本发明的CTL可以单独施用至经受治疗和/或预防(防范)的患者，或与其他药物(包括本发明的肽、APC或外来体)组合施用以用于调节效果的目的。进一步地，本发明的CTL可以是诱导自CD8阳性T细胞的CTL，所述CD8阳性T细胞衍生自经受施用CTL的患者。本发明的CTL特异性作用于呈递本发明肽的靶细胞，例如，用于诱导本发明CTL的相同的肽。靶细胞可以是内源表达CDCA1的细胞，如癌细胞，或用CDCA1基因转染的细胞。因肽的刺激而在细胞表面上呈递本发明肽的细胞也可成为本发明CTL的攻击靶标。本发明的CTL靶向的细胞优选为对于HLA-A01(更优选HLA-A*01:01)阳性的细胞。
在优选的实施方案中，本发明的CTL特异性靶向表达HLA-A01(更优选HLA-A*01:01)和CDCA1两者的HLA的细胞。本文中，CTL“靶向”细胞指CTL对在其细胞表面上呈递HLA和本发明肽的复合物的细胞的识别，和表现出对该细胞的细胞毒性活性。进一步地，“特异性靶向”指CTL表现出对这些细胞的细胞毒性活性，但未显示对其他细胞的破坏活性。在CTL的语境中使用的表述“识别细胞”指经由其TCR结合至呈递在细胞表面的HLA和本发明的肽的复合物，并表现出对该细胞的特异性细胞毒性活性。因此，本发明的CTL优选为可以经由TCR结合细胞表面上呈递的HLA-A01(更优选HLA-A*01:01)和本发明的肽之间形成的复合物的CTL。
此外，本发明的CTL优选是通过包括以下(a)或(b)中所述步骤的方法诱导的CTL：
(a)体外将CD8阳性T细胞与在其表面上呈递复合物的APC或外来体接触，所述复合物为HLA-A01(更优选HLA-A*01:01)和本发明的肽的复合物；或
(b)将编码TCR的各个亚基的多核苷酸导入CD8阳性T细胞，所述TCR能够结合通过HLA-A01(更优选HLA-A*01:01)呈递在细胞表面上的本发明的肽。
VIII.T细胞受体(TCR)
本发明还提供组合物以及使用该组合物的方法，所述组合物包含编码每种TCR亚基的多核苷酸，所述TCR能够结合通过HLA抗原呈递在细胞表面的本发明的肽。所述多核苷酸赋予CD8阳性T细胞针对表达CDCA1的癌细胞的特异性，这是通过表达在细胞表面能够结合通过HLA抗原呈递在细胞表面的本发明的肽的TCR实现的。通过使用本领域已知的方法，可鉴定出通过本发明的肽诱导的CTL中编码TCR亚基的alpha和beta链的多核苷酸(WO2007/032255和Morgan et al.,J Immunol,2003,171,3288)。例如，优选PCR方法用于TCR分析。用于分析的PCR引物可以是，例如5’-R引物(5’-gtctaccaggcattcgcttcat-3’)(SEQ ID NO:40)作为5’侧引物；和对TCR-alpha链C区具有特异性的3-TRa-C引物(5’-tcagctggaccacagccgcagcgt-3’)(SEQ ID NO:41)，对TCR-beta链C1区具有特异性的3-TRb-C1引物(5’-tcagaaatcctttctcttgac-3’)(SEQ ID NO:42)，或对TCR-beta链C2区具有特异性的3-TRb-C2引物(5’-ctagcctctggaatcctttctctt-3’)(SEQ ID NO:43)作为3’侧引物，但不限于此。通过将鉴定的多核苷酸导入CD8阳性T细胞而形成的TCR能够以高亲合力结合呈递本发明的肽的靶细胞，并在体内和体外介导针对呈递本发明的肽的靶细胞的高效杀伤。
可以将编码每种TCR亚基的多核苷酸掺入合适的载体，例如逆转录病毒载体中。这些载体是本领域公知的。可以将所述多核苷酸或者包含它们的载体导入CD8阳性T细胞，例如衍生自患者的CD8阳性T细胞。本发明提供一种即配即用型组合物，其容许快速修饰患者自己的T细胞(或衍生自其他受试者的T细胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌细胞杀伤特性的修饰型T细胞。
本文中，特异性TCR是当TCR呈递于CD8阳性T细胞的表面上时，能够通过特异性识别呈递在靶细胞表面上的本发明的肽和HLA抗原的复合物,赋予针对靶细胞特异性细胞毒活性的TCR。上述复合物的特异性识别可以通过任何已知方法来确认，并且其优选的例子包括使用HLA分子和本发明的肽的HLA多聚体染色分析，和ELISPOT测定方法。通过实施ELISPOT测定法，可以确认由导入有上述多核苷酸的T细胞和细胞内信号转导的靶细胞的特异的TCR介导的识别。当上述TCR呈递于CD8阳性T细胞表面上时，也可以通过已知方法确认TCR是否能够赋予针对CD8阳性T细胞的靶细胞特异性细胞毒性活性。优选的方法包括例如通过铬释放测定法等测定针对HLA阳性靶细胞的细胞毒性活性。
在HLA-A01的背景下，本发明提供了通过用编码每种TCR亚基的多核苷酸转化CD8阳性T细胞制备的CTL，所述TCR结合例如具有选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列的肽。
经转化的CTL在体内能够归巢(homing)，并且可以利用公知的体外培养方法扩增(例如Kawakami et al.,J Immunol.,1989,142,3452-61)。可以利用本发明的CTL来形成免疫原性组合物，所述组合物有用于在需要治疗和/或预防(防范)的患者中的疾病治疗或预防(防范)(对于参考文献WO2006/031221，其内容通过提述并入本文)。
IX.药物组合物
本发明还提供了组合物或药物组合物，包含选自以下的至少一种活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)本发明的APC；
(d)本发明的外来体；和
(e)本发明的CTL。
除了上述活性成分之外，本发明的药物组合物可以根据需要包含载体，赋形剂或通常用于药物中的此类而没有特别限制。可用于本发明的药物组合物中的载体的例子包括无菌水，生理盐水，磷酸盐缓冲液，培养液等。因此，本发明还提供了药物组合物，包含选自以下(a)至(e)的至少一种活性成分和药学上可接受的载体：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)本发明的APC；
(d)本发明的外来体；和
(e)本发明的CTL。
此外，本发明的药物组合物可以根据需要包含稳定剂，混悬剂，防腐剂，表面活性剂，增溶剂，pH调节剂，聚集抑制剂等。
与正常组织相比，癌细胞中CDCA1表达显著上调。因此本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸可以用于治疗和/或预防癌症，和/或预防其术后复发。因此本发明提供了用于治疗和/或预防癌症，和/或预防其术后复发的药物组合物，其包含作为活性成分的一种或多种类型的本发明的肽或多核苷酸。或者，可以制备本发明的肽以呈递在外来体或APC的表面上用作为药物组合物的用途。此外，靶向任一种本发明肽的本发明的CTL也可用作本发明药物组合物的活性成分。本发明的药物组合物可包含治疗有效量或药学有效量的上述活性成分。
本发明的药物组合物还可以用作疫苗。在本发明的语境中，术语“疫苗”(也称为“免疫原性组合物”)指当接种到动物时具有诱导导致抗肿瘤作用的免疫应答的功能的组合物。因此本发明的药物组合物可用于诱导导致抗肿瘤作用的免疫应答。由本发明的肽，多核苷酸，APC，CTL和药物组合物诱导的免疫应答没有特别限制，只要其是导致抗肿瘤作用的免疫应答，并且例子包括诱导癌细胞特异的CTL和诱导癌细胞特异的细胞毒性活性。
本发明的药物组合物可用于在人类受试者或患者中治疗和/或预防的癌症，和/或预防其手术后复发。本发明的药物组合物可以优选用于对HLA-A01阳性的受试者。此外，本发明的药物组合物可优选用于治疗和/或预防表达HLA-A01和CDCA1的癌症和/或预防其术后复发。
在另一个实施方案中，本发明提供选自以下的活性成分在制备用于治疗或预防表达HLA-A01和CDCA1的癌症的药物组合物中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明进一步提供选自以下的活性成分，用于治疗或预防表达HLA-A01和CDCA1的癌症：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明还提供制备用于治疗或预防表达HLA-A01和CDCA1的癌症的药物组合物的方法或过程，其中所述方法或过程包括用药学上或生理上可接受的载体配制至少一种选自以下活性成分的步骤：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在另一个实施方案中，本发明还提供了制备用于治疗或预防表达HLA-A01和CDCA1的癌症的药物组合物的方法或过程，其中所述方法或过程包括将选自以下的活性成分与药学上或生理上可接受的载体混合的步骤：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供了用于治疗或预防表达HLA-A01和CDCA1的癌症的方法，其包括向受试者施用至少一种选自以下的活性成分的步骤：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在本发明中，具有选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列的肽被鉴定为可以诱导强效和特异性免疫应答的HLA-A01限制性表位肽。因此，包含至少一种具有选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列的肽的本发明的药物组合物特别适用于施用至具有HLA-A11(例如,HLA-A*1101)作为HLA抗原的受试者。这同样适用于包含以下项的药物组合物：编码这些肽中任一种的多核苷酸(即本发明的多核苷酸)，呈递这些肽的APC或外来体(即本发明的APC或外来体)，或靶向这些肽的CTL(即本发明的CTL)。也就是说，包含与具有选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列的肽相关联的活性成分的药物组合物适合施用于具有HLA-A01(更优选HLA-A*01:01)作为HLA抗原的受试者。这同样适用于包含以下的药物组合物：编码这些肽中任一种的多核苷酸(即本发明的多核苷酸)。呈递这些肽的APC或外来体(即本发明的APC或外来体)，或靶向这些肽的CTL(即本发明的CTL)。也就是说，包含与具有选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列的肽相关联的活性成分的药物组合物适合施用于具有HLA-A01的受试者(即HLA-A01阳性受试者)。在更优选的实施方案中，本发明的药物组合物是包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的肽的药物组合物。
通过本发明的药物组合物治疗和/或预防的癌症没有特别限制，只要它们是表达CDCA1的癌症，并包括各种癌症，膀胱癌，乳腺癌，宫颈癌，胆管细胞癌，慢性髓性白血病(chronic myeloid leukemia)(CML)，食管癌，胃癌，非小细胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，前列腺癌，肾癌，小细胞肺癌，头颈癌，软组织肿瘤，大肠癌等。
除了上述活性成分之外，本发明的药物组合物可以包含具有诱导针对癌细胞的CTL的能力的其他肽(例如，其它TAA衍生的CTL诱导肽)，编码其他肽的其他多核苷酸，呈递其他肽的其他细胞等。
本发明的药物组合物还可以任选地包含其它治疗物质作为活性成分，只要它们不抑制上述活性成分(例如本发明的肽)的抗肿瘤作用即可。例如，本发明的药物组合物可任选地包含抗炎组合物，镇痛药，化学治疗剂等。除了将其它治疗物质包括在本发明的药物组合物本身以外，还可以与一种或多种其它药物组合物顺序或同时施用本发明的药物组合物。本发明的药物组合物和其它药物组合物的剂量取决于例如所使用的药物组合物的类型和所治疗的疾病，以及施用时间安排(scheduling)和施用途径。
应当理解，考虑到制剂类型，除了本文明确提及的成分之外，本发明的药物组合物可以包含本领域常规的其它组分。
本发明还提供包含本发明的药物组合物的制品或试剂盒。本发明的制品或试剂盒可以包括容纳本发明的药物组合物的容器。适当的容器的例子包括瓶，小瓶或试管，但不限于此。容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。标签可以附着于容器，并且可以在标签中描述本发明的药物组合物所应用的疾病或疾病状态。标签还可指明关于施用的指导等等。
除了容纳本发明的药物组合物的容器之外，优选地本发明的制品或试剂盒还可以任选包含容纳药学上可接受的稀释剂的第二容器。本发明的制品或试剂盒还可包括从商业立场和用户角度所需的其它材料，例如其它缓冲液，稀释剂，过滤器，注射针，注射器，具有使用说明的包装插页。
根据需要，本发明的药物组合物可包装在药包或分配装置中提供，该药包或分配装置可装有一个或多个含有活性成分的单位剂型。例如，药包可包括例如金属或塑料箔，诸如泡罩包。药包或分配装置可附有施用说明书。
(1)包含肽作为活性成分的药物组合物
包含本发明的肽的药物组合物可以根据需要通过常规制剂方法配制。除了本发明的肽之外，本发明的药物组合物可以包含通常用于药物中的载体，赋形剂等，而没有特别限制。可用于本发明的药物组合物中的载体的例子包括灭菌水(例如注射用水)，生理盐水，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲盐水，Tris缓冲盐水，0.3％甘氨酸，培养液，等等。此外，本发明的药物组合物可根据需要含有稳定剂、悬浮剂、防腐剂、表面活性剂、增溶剂、pH调节剂、聚集抑制剂，等等。本发明的药物组合物可以诱导针对表达CDCA1的癌细胞的特异性免疫，因此可以用于癌症治疗或预防(防范)的目的。
例如，可以通过以下制备本发明的药物组合物：在药学上或生理上可接受的水溶性载体中溶解，所述水溶性载体例如灭菌水(例如注射用水)，生理盐水，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲盐水，和Tris缓冲盐水，并根据需要加入稳定剂，悬浮剂，防腐剂，表面活性剂，增溶剂，pH调节剂，聚集抑制剂等，然后灭菌肽溶液。对肽溶液进行灭菌的方法没有特别限定，优选通过过滤灭菌进行。过滤灭菌可以使用(例如)孔径为0.22μm或以下的过滤灭菌过滤器进行。过滤灭菌的肽溶液可以例如作为注射剂施用至受试者，但不限于此。本发明的药物组合物可以通过冷冻干燥上述肽溶液制备为冷冻干燥制剂。冷冻干燥制剂可以通过以下制备：将如上所述制备的肽溶液装入适当的容器，如安瓿、小瓶或塑料容器中，随后冷冻干燥并用洗涤灭菌的橡胶塞等在压力回收之后包封入容器中。冷冻干燥制剂可以在其再溶解于药学上或生理学上可接受的水溶性载体后施用至受试者，所述水溶性载体例如灭菌水(例如注射用水)，生理盐水，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲盐水，和Tris缓冲盐水等。本发明的药物组合物的优选实例包括此类过滤灭菌的肽溶液的注射物和由冻干该肽溶液所产生的冷冻干燥制剂。本发明还包括含有此类冷冻干燥制剂和再溶解溶液的试剂盒。本发明还包括容纳冷冻干燥制剂(其是本发明的药物组合物)的容器和储存再溶解溶液的容器的试剂盒。
本发明的药物组合物可以包含两种或更多种类型的本发明肽的组合。肽的组合可以采取混合的肽的鸡尾酒形式，或可以使用标准技术彼此缀合。例如，可以将肽化学连接或表达成为单一融合多肽。通过施用本发明的肽，肽被HLA抗原以高密度展示在APC上，然后诱导出与所展示的肽与HLA抗原之间形成的复合物特异性起反应的CTL。或者，可以从受试者分离APC(例如DCs)，然后用本发明的肽刺激它们，来获得在其细胞表面上展示任何所述本发明肽的APC。将这些APC重新施用给受试者以在受试者中诱导CTL，结果，可提高针对表达CDCA1的癌细胞的攻击性。
本发明的药物组合物还可以包含已知用于有效建立细胞免疫的佐剂。佐剂是指当与抗原一起(或连续)施用时增强针对具有免疫学活性的抗原的免疫应答的化合物。可以使用描述于文献中的已知佐剂，例如Clin Microbiol Rev 1994,7:277-89。合适佐剂的例子包括铝盐(磷酸铝，氢氧化铝，羟基氧化铝等),明矾,霍乱毒素,沙门氏菌毒素,IFA(不完全弗氏佐剂),CFA(完全弗氏佐剂),ISCOMatrix,GM-CSF和其他免疫刺激细胞因子，含有CpG基序的寡脱氧核苷酸(CpG7909等)，水包油乳液，皂苷或其衍生物(QS21等)，脂多糖例如脂质A或其衍生物(MPL,RC529,GLA,E6020等)，脂肽，乳铁蛋白，鞭毛蛋白，双链RNA或其衍生物(poli IC等)，细菌DNA，咪唑并喹啉(Imiquimod,R848等)，C型凝集素配体(海藻糖-6,6’-二山嵛酸/酯(TDB)等)，CD1d配体(alpha-半乳糖神经酰胺等)，角鲨烯乳液(MF59,AS03,AF03等)，PLGA等，但不限于此。这些佐剂通常可以以有效增强或加强抗原的免疫原性的量与具有免疫活性的抗原(即本发明的肽)混合。在包含本发明的药物组合物的试剂盒中，佐剂可以包含在与包含本发明的肽的药物组合物分开的另一容器中。在这种情况下，佐剂和药物组合物可以连续地施用于受试者，或者在施用给受试者之前立即混合在一起。本发明还提供了包含含有本发明的肽药物组合物和佐剂的此类试剂盒。当本发明的药物组合物是冷冻干燥制剂时，试剂盒还可以包含再溶解溶液。此外，本发明提供试剂盒，其包括容纳本发明的药物组合物的容器和存储佐剂的容器。试剂盒可以根据需要进一步包含储存再溶解溶液的容器。
当油佐剂用作佐剂时，本发明的药物组合物可以制备为乳液。例如，可以通过混合并搅拌如上所述制备的肽溶液和油佐剂来制备乳液。肽溶液可以是在冷冻干燥后再溶解的溶液。乳液可以是W/O型乳液和O/W型乳液，且W/O型乳液优选用于获得高免疫应答增强效果。IFA可优选用作油佐剂，但不限于此。乳剂的制备可以在施用受试者之前立即进行，且在这种情况下，本发明的药物组合物可以作为包含本发明的肽溶液和油性佐剂的试剂盒提供。当本发明的药物组合物是冷冻干燥制剂时，试剂盒可以进一步包含再溶解溶液。
此外，本发明的药物组合物可以是其中包封了本发明肽的脂质体制剂、其中肽结合至具有几微米直径的珠子的颗粒配制剂，或其中脂质结合至肽的配制剂。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的肽还可以以药学上可接受的盐的形式施用。优选的盐的实例包括与碱金属(锂，钾，钠等)的盐，与碱土金属(钙，镁等)的盐，与其他金属(铜，铁，锌，锰等)的盐,与有机碱的盐,与胺的盐,与有机酸(例如乙酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸等等)的盐,和与无机酸(例如盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸、硝酸等等)的盐。因此，包含本发明的肽的药学上可接受的盐的药物组合物也包括在本发明内。此外，除了游离肽之外，“本发明的肽”还包括其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物可以进一步包括引发(prime)CTL的成分。已经确认脂质是能够在体内引发针对病毒抗原的CTL的组分。例如，可将棕榈酸残基连接至赖氨酸残基的ε-和α-氨基，然后连接至本发明的肽。然后脂化肽可以在胶束或颗粒中直接施用，掺入脂质体，或在佐剂中乳化。作为脂质引发CTL响应的其他例子，大肠杆菌脂蛋白，诸如三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)，当与适宜的肽共价连接时，可用来引发CTL(参见例如Deres等人,Nature 1989,342:561-4)。
用于施用本发明的肽或药物组合物的方法的实例包括口服、皮内、皮下、肌肉内、骨内、腹膜内和静脉内注射，以及全身施用或局部施用至靶位点附近，但不限于此。优选的施用方法包括皮下注射到诸如腋窝或腹股沟的淋巴结附近。施用可以通过单次施用进行或通过多次施用来强化。本发明的肽可以以治疗或药学有效量施用于受试者以治疗癌症，或以治疗或药学有效量以诱导针对表达CDCA1的癌细胞的免疫(更具体地为CTL)。本发明肽的剂量可以依据要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等恰当加以调整。对于本发明的每种肽，剂量通常是0.001mg-1000mg,例如0.01mg-100mg，例如0.1mg-30mg，例如0.1mg-10mg，例如0.5mg-5mg。给药间隔可以是每几天至几个月一次，且例如，可以每周一次的间隔进行给药。本领域技术人员可以适当地选择合适的剂量。
在优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含治疗有效量的本发明的肽和药学上或生理学上可接受的载体。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物包含治疗有效量的本发明的肽，药学或生理学上可接受的载体和佐剂。本发明的药物组合物可以包含0.001mg-1000mg,优选0.01mg-100mg,更优选0.1mg-30mg，甚至更优选0.1mg-10mg，例如0.5mg-5mg的本发明的肽。当本发明的药物组合物是注射剂时，其可以包含以下浓度的本发明的肽：0.001mg/ml-1000mg/ml,优选0.01mg/ml-100mg/ml,更优选0.1mg/ml-30mg/ml,甚至更优选0.1mg/ml-10mg/ml,例如0.5mg/ml-5mg/ml。在这种情况下，例如，可以通过注射向受试者施用0.1至5ml,优选0.5ml至2ml的本发明的药物组合物。
此外，本发明提供了治疗和/或预防癌症和/或预防其手术后复发的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本发明的肽或本发明的药物组合物。如上所述，本发明的肽可以以通常为以下量的单一剂量施用于受试者：0.001mg-1000mg,例如,0.01mg-100mg,例如,0.1mg-30mg,例如,0.1mg-10mg,或例如,0.5mg-5mg。在优选的实施方案中，本发明的肽与佐剂一起施用于受试者。此外，给药间隔可以是每几天至几个月一次，优选每几天至每月一次，例如每周一次或每两周一次。
本发明的CDCA1肽具有HLA-A01限制性CTL诱导活性。因此，其治疗租用在HLA-A01阳性受试者中也是有效的。因此，在本发明的优选实施方案中，可以在施用本发明的CDCA1肽之前预先选择HLA-A01阳性受试者。此外，由于本发明的CDCA1的治疗作用是CDCA1特异性的，因此期望的情况是受试者的癌症正在表达CDCA1。也就是说，在施用CDCA1肽之前，本发明的治疗癌症的方法可以包括选择HLA-A01阳性受试者的步骤和选择具有表达CDCA1的癌症的受试者的步骤。
(2)含有多核苷酸作为活性成分的药物组合物
本发明的药物组合物也可含有以可表达的形式编码本发明公开的肽的多核苷酸。在本文中，短语“以可表达的形式”意味着多核苷酸在导入细胞时会表达作为本发明的肽。在示例性的实施方案中，本发明的多核苷酸的序列包括用于本发明的肽的表达所必需的调节元件。本发明的多核苷酸可具有为实现稳定插入靶细胞的基因组所需的序列(关于同源重组盒载体的描述参见例如Thomas KR&Capecchi MR,Cell 1987,51:503-12)。参见例如Wolff等人,Science 1990,247:1465-8；美国专利号5,580,859,5,589,466,5,804,566,5,739,118,5,736,524,5,679,647；和WO98/04720。基于DNA的投递技术的例子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、聚合物、肽介导的)投递、阳离子脂质复合物、和颗粒介导的(“基因枪”)或压力介导的投递(参见例如美国专利号5,922,687)。
本发明的肽还可用病毒或细菌载体来表达。表达载体的例子包括减毒病毒宿主，诸如牛痘或禽痘。例如，可以使用牛痘病毒作为表达本发明的肽的载体。在导入宿主后，重组牛痘病毒表达表达免疫原性肽，并由此引发免疫应答。可用于免疫接种方案的牛痘载体和方法记载于例如美国专利号4,722,848。另一种载体是BCG(Bacille Calmette Guerin)。BCG载体描述于Stover等人,Nature 1991,351:456-60。各种可用于治疗性施用或免疫接种的其它载体是显而易见的，例如腺病毒和腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、去毒炭疽毒素载体等等。参见例如Shata等人,Mol Med Today2000,6:66-71；Shedlock等人.,J Leukoc Biol 2000,68:793-806；Hipp等人.,In Vivo2000,14:571-85。
本发明的多核苷酸投递至患者中可以是直接的，在这种情况下患者可以直接暴露于携带本发明多核苷酸的载体，或者是间接的，在这种情况下首先在体外用携带本发明多核苷酸的载体转化细胞，然后将细胞移植入患者。这两种办法分别称作体内和离体基因疗法。
关于基因疗法的方法的一般综述参见Goldspiel等人,Clinical Pharmacy 1993,12:488-505；Wu和Wu,Biotherapy 1991,3:87-95；Tolstoshev,Ann Rev PharmacolToxicol 1993,33:573-96；Mulligan,Science 1993,260:926-32；Morgan&Anderson,AnnRev Biochem 1993,62:191-217；Trends in Biotechnology 1993,11(5):155-215。在Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY,1993；及Krieger,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY,1990中描述了可应用于本发明的重组DNA技术领域的公知方法。
施用方法可以是口服、皮内、皮下或静脉内注射等。使用系统施用或局部施用至靶定的位点附近。施用可以通过单次施用来实施，或者通过多次施用来强化。本发明的多核苷酸可以以治疗或药学有效量施用于受试者，用于诱导针对表达CDCA1的癌细胞的免疫(更具体地，CTL)，或以治疗或药学有效量用于治疗癌症。合适载体中的多核苷酸的剂量或使用编码本发明的肽的多核苷酸转化的细胞中的多核苷酸的剂量可以依据要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等适当地调整，且通常是0.001mg-1000mg,例如,0.01mg-100mg,例如,0.1mg-30mg,例如,0.1mg-10mg,或例如0.5mg-5mg。给药间隔可以是每几天至几个月一次，例如，给药可以每周一次的间隔进行。本领域技术人员可以适当地选择合适的剂量。
X.使用肽、外来体、APC和CTL的方法
本发明的肽和多核苷酸可用于诱导APC和CTL。也可以使用本发明的的外来体和APC来诱导CTL。肽、多核苷酸、外来体和APC可以与任何其它化合物组合使用，只要其CTL诱导能力不被抑制。因此，可以使用包含本发明的任何肽，多核苷酸，APC和外来体的药物组合物来诱导本发明的CTL。此外，可以使用包含本发明的肽或多核苷酸的药物组合物来诱导本发明的APC。
(1)诱导APC的方法
本发明提供了使用本发明的肽或多核苷酸诱导具有CTL诱导能力的APC的方法。
本发明的方法包括在体外、离体或体内使APC与本发明的肽接触的步骤。例如，使APC与肽离体接触的方法可以包括以下步骤：
(a)从受试者收集APC；和
(b)使步骤(a)的APC与本发明的肽接触。
上述APC不限于特定种类的细胞，并且可以使用已知在其细胞表面上呈递蛋白质抗原以被淋巴细胞识别的DC，Langerhans细胞，巨噬细胞，B细胞，和活化的T细胞。DCs在APC中具有最强的CTL诱导能力，因此优选使用DCs。本发明的任何肽均可以单独或与本发明的其它肽组合使用。此外，本发明的肽可以与其它CTL诱导肽(例如，其它TAA衍生的CTL诱导肽)组合使用。
同时，当将本发明的肽施用给受试者时，APC在体内接触到所述肽，结果，在受试者的身体中诱导出具有高CTL诱导能力的APC。因此，本发明的方法可包向受试者施用本发明的肽的步骤。类似地，当将可表达形式的本发明的多核苷酸施用于受试者时，本发明的肽在体内表达，表达的肽在体内与APC接触，结果，在受试者的身体中诱导出具有高CTL诱导能力的APC。因此，本发明还可以包括向受试者施用本发明的多核苷酸的步骤。
为了诱导具有CTL诱导能力的APC，本发明还包括将本发明的多核苷酸引入APC的步骤。例如，所述方法可以包括以下步骤：
(a)自受试者收集APC；并
(b)将编码本发明肽的多核苷酸导入步骤(a)的APC。
步骤(b)可如上文“VI.抗原呈递细胞(APC)”部分中所述来实施。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，其包含以下步骤(a)或(b)：
(a)使APC与本发明的肽接触；或
(b)将编码本发明的肽的多核苷酸引入APC中。
此外，本发明提供了制备具有CTL诱导能力的APC的方法，其包含以下步骤(a)或(b)：
(a)使APC与本发明的肽接触；或
(b)将编码本发明的肽的多核苷酸引入APC中。
上述方法可以在体外、离体或体内实施，并优选在体外或离体实施它们。在上述方法中使用的APC可以衍生自计划施用诱导的APC的受试者，或者它们可以衍生自不同的受试者。当使用来自与计划施用的受试者不同的受试者(供体)的APC时，施用受试者和供体必须具有相同的HLA类型。在本发明的方法中，当具有选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列的肽或其修饰肽用作本发明的肽时，在施用受试者和供体中HLA类型优选为HLA-A01(更优选HLA-A*01:01)。或者，在上述方法中使用的APC优选是表达HLA-A01(更优选HLA-A*01:01)的APC。在通过重力离心法等从供体收集的血液中分离PBMC之后，可以使用已知方法从PBMC制备APC。
在另一个实施方案中，本发明还提供了包含本发明的肽或编码该肽的多核苷酸用于诱导具有CTL诱导能力的APC的药物组合物。
或者，本发明还提供了本发明的肽或编码该肽的多核苷酸在制备用于诱导具有CTL诱导能力的APC的药物组合物中的用途。
或者，本发明还提供本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸，用于诱导具有CTL诱导能力的APC。
或者，本发明进一步提供制备用于诱导APC的药物组合物的方法或过程，其中所述方法或过程包括将本发明的肽或本发明的多核苷酸与药学上或生理上可接受的载体进行配制的步骤。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供了制备用于诱导具有CTL诱导能力的APC的药物组合物的方法或过程，其中所述方法或过程包括将本发明的肽或本发明的多核苷酸与药学上或生理上可接受的载体相混合的步骤。
通过本发明的方法诱导的APC可诱导对CDCA1特异性的CTL(即本发明的CTL)。
(2)诱导CTL的方法
本发明还提供了使用本发明的肽，多核苷酸，外来体或APC来诱导CTL的方法。
当本发明的肽、多核苷酸、APC或外来体施用至受试者后，在受试者的身体中诱导CTL，而且靶向表达CDCA1的癌细胞的免疫应答的强度增强。因此，本发明的方法可包括将本发明的肽、多核苷酸、APC或外来体施用于受试者的步骤。
或者，也可在体外或离体使用它们来诱导CTL。例如，本发明的方法可以包括以下步骤：
(a)自受试者收集APC；
(b)将步骤(a)的APC与本发明的肽接触；和
(c)将步骤(b)的APC与CD8阳性T细胞共培养。
诱导的CTL可以随后返回到受试者。
上文步骤(c)中要与CD8阳性T细胞共培养的APC也可通过将编码本发明的肽的多核苷酸引入APC来制备，如上文“VI.抗原呈递细胞(APC)”部分所述。然而，用于本发明的方法中的APC不限于此，并且可以使用在其表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的任何APC。
在本发明的方法中，除了此类APC，也可以使用在其表面上呈递HLA抗原和本发明肽形成的复合物的外来体。即，本发明的方法可以包括与在其表面上呈递HLA抗原和本发明肽的复合物的外来体共培养的步骤。此类外来体可通过上文“V.外来体”部分中描述的方法来制备。
此外，可通过将包含编码TCR的每种亚基的多核苷酸的载体导入CD8阳性T细胞来诱导CTL，所述TCR能够结合通过细胞表面上的HLA抗原呈递的本发明的肽。此类转化可如上文“VIII.T细胞受体(TCR)”部分中所述来实施。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了诱导CTL的方法，包括选自以下的步骤：
(a)将CD8阳性T细胞与APC共培养，所述APC在其表面呈递HLA抗原和本发明肽的复合物；
(b)将CD8阳性T细胞与外来体共培养，所述外来体在其表面呈递HLA抗原和本发明肽的复合物；和
(c)向CD8阳性T细胞导入包含编码TCR的每种亚基的多核苷酸的载体，所述TCR能够结合通过细胞表面上的HLA抗原呈递的本发明的肽。
上述方法可以在体外，离体或体内实施，并且优选在体外或离体实施它们。在上述方法中使用的APC或外来体和CD8阳性T细胞可以衍生自计划施用诱导的CTL的受试者，或者它们可以衍生自不同的受试者。当使用来自与计划施用的受试者不同的受试者(供体)的APC或外来体和CD8阳性T细胞时，施用对象和供体必须具有相同的HLA类型。例如，当具有选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列的肽或其修饰肽用作为本发明的肽时，在施用受试者和供体中HLA类型优选为HLA-A01(更优选HLA-A*01:01)。或者，上述方法中使用的APC或外来体优选是在其表面上呈递HLA-A01(更优选HLA-A*01:01)和本发明的肽(具有选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列的肽或其修饰肽)的复合物的APC或外来体。在这种情况下，诱导的CTL显示出针对呈递HLA-A01和本发明的肽的复合物的细胞(例如，表达CDCA1的HLA-A01阳性细胞)的特异性细胞毒活性。
在另一个实施方案中，本发明还提供了用于诱导CTL的组合物或药物组合物，其包含至少一种选自以下的活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
在另一个实施方案中，本发明还提供选自以下的活性成分在制备用于诱导CTL的组合物或药物组合物中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
或者，本发明进一步提供选自以下的活性成分用于诱导CTL：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
或者，本发明进一步提供了制备用于诱导CTL的组合物或药物组合物的方法或过程，其是包括将选自以下的活性成分与药学上或生理上可接受的载体进行配制的步骤的方法或过程：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供了制备用于诱导CTL的组合物或药物组合物的方法或过程，其实包括将选自以下的活性成分与药学上或生理上可接受的载体混合的步骤的方法或过程：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
XI.诱导免疫应答的方法
本发明还提供了诱导针对表达CDCA1的癌症的免疫应答的方法。适用的癌症包括但不限于膀胱癌,乳腺癌，宫颈癌，胆管细胞癌，慢性髓细胞性白血病(CML)，食管癌，胃癌，非小细胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，前列腺癌，肾癌，小细胞肺癌，头颈部癌，软组织肿瘤，大肠癌等。优选的是癌症表达HLA-A01。
本发明还提供了诱导针对表达CDCA1的癌细胞的免疫应答的方法。CDCA1被认为在上述各种类型的癌症中过表达。因此，当诱导针对表达CDCA1的癌细胞的免疫应答时，结果抑制了癌细胞的增殖。因此，本发明还提供了抑制表达CDCA1的癌细胞增殖的方法。本发明的方法特别适用于抑制表达CDCA1和HLA-A01的癌细胞的增殖。
本发明的方法可以包括施用包含本发明的任何肽或编码所述肽的多核苷酸的组合物的步骤。本发明的方法还涵盖施用呈递任何本发明的肽的APC或外来体。关于详情参见“IX.药物组合物”部分，特别是描述本发明的药物组合物作为疫苗的用途的部分。另外，可用于本发明的诱导免疫应答的方法的外来体和APC详细描述于上文“V.外来体”、“VI.抗原呈递细胞(APC)”、和“X.使用肽、外来体、APC和CTL的方法”的项(1)和(2)。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于诱导针对表达CDCA1和HLA-A01的癌症的免疫应答的药物组合物或疫苗，其中所述药物组合物或疫苗包含选自以下的活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明还提供了用于诱导针对表达CDCA1和HLA-A01的癌细胞的免疫应答的药物组合物或疫苗，其中所述药物组合物或疫苗包含选自以下的活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明还提供了用于抑制表达CDCA1和HLA-A01的癌细胞增殖的药物组合物或疫苗，其中所述药物组合物或疫苗包含选自以下的活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在另一个实施方案中，本发明提供了选自以下的活性成分在制备用于诱导针对表达CDCA1和HLA-A01的癌症的免疫应答的药物组合物或疫苗中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明还提供选自以下的活性成分在制备用于诱导针对表达CDCA1和HLA-A01的癌细胞的免疫应答的药物组合物或疫苗中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明进一步提供选自以下的活性成分在制备用于抑制表达CDCA1和HLA-A01的癌细胞的增殖的药物组合物或疫苗中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
本发明还提供了用于制备诱导针对表达CDCA1和HLA-A01的癌症的免疫应答的药物组合物的方法或过程，其中所述方法可以包括将本发明的肽与药学上可接受的载体进行混合或配制的步骤。
或者，本发明提供了抑制在由血管生成介导的疾病的患病部位中表达CDCA1和HLA-A01的癌细胞的增殖的方法或诱导针对癌症的免疫应答的方法，其包括向受试者施用包含选自以下的活性成分的疫苗或药物组合物的步骤：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在本发明的语境中，可以通过施用本发明的肽，多核苷酸，APC，外来体和/或CTL来治疗表达CDCA1和HLA-A01的癌症。或者通过施用本发明的肽，多核苷酸，APC，外来体和/或CTL可以诱导针对表达CDCA1的癌症的免疫应答。此类癌症的实例包括但不限于膀胱癌,乳腺癌，宫颈癌，胆管细胞癌，慢性髓细胞性白血病(CML)，食管癌，胃癌，非小细胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，前列腺癌，肾癌，小细胞肺癌，头颈部癌，软组织肿瘤，大肠癌等，但不限于此。此外，通过施用本发明的肽，多核苷酸，APC，外来体和/或CTL可以诱导针对表达CDCA1和HLA-A01的癌症的免疫应答。因此，在施用包含上述活性成分的疫苗或药物组合物之前，优选确认待治疗的受试者中患病部位的CDCA1表达水平是否增加。类似地，还期望确认待治疗的受试者是HLA-A01阳性。即，在一个优选的实施方案中，本发明可以选择HLA-A01阳性并且患有表达CDCA1的癌症的受试者，并且向所选择的受试者施用本发明的疫苗或药物组合物。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了在需要癌症治疗的患者中治疗表达CDCA1和HLA-A01的癌症的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)测量从患有癌症的HLA-A01阳性受试者的患病部位收集的生物样品中CDCA1表达的水平；
(ii)基于(i)中测量的CDCA1表达水平鉴定具有表达CDCA1的癌症的受试者；和
(iii)向与正常对照相比过表达CDCA1的癌症患者施用至少一种选自上述(a)至(e)组成的组的成分。
或者，本发明进一步提供了疫苗或药物组合物，其包含至少一种选自由以上(a)至(e)组成的组的活性成分，用于向具有表达CDCA1的癌症的HLA-A01阳性受试者施用。本发明还提供鉴定或选择要用至少一种选自上述(a)至(e)的活性成分治疗的受试者的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)测量从患有癌症的HLA-A01阳性受试者的患病部位收集的生物样品中CDCA1表达的水平；
(ii)基于(i)中测量的CDCA1表达水平鉴定具有表达CDCA1的癌症的受试者；和
(iii)鉴定或选择(ii)中鉴定的受试者作为可以用至少一种选自由(a)至(e)组成的组的活性成分治疗的受试者。
在上述方法中从受试者收集的用于测量CDCA1表达水平的生物样品没有特别限制，并且例如，可以优选使用通过活组织检查等收集的含有癌细胞的组织样品。生物样品中的CDCA1表达水平可以通过已知方法测量，例如，可以使用通过探针或PCR方法检测CDCA1基因的转录产物的方法(例如cDNA微阵列法，Northern印迹法，RT-PCR法等)、通过抗体等检测CDCA1基因的翻译产物的方法(例如，Western印迹法，免疫染色法等)，等等。此外，生物样品可以是血液样品，并且在这种情况下，测量针对CDCA1的抗体的血液水平，并且可以基于血液水平来评估患病部位的CDCA1表达水平。可以使用已知方法测量针对CDCA1的抗体的血液水平，并且例如，可以使用使用CDCA1蛋白或本发明的肽作为抗原的酶免疫测定(EIA)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)等。或者，可以通过检测对本发明的肽特异的CTL来评估患病部位的CDCA1表达水平。对本发明的肽特异的CTL水平可以例如通过以下方法测量：从收集自受试者的血液中分离PBMC，并测量针对用本发明的肽脉冲的靶细胞的细胞毒活性。细胞毒活性可以例如通过干扰素-gamma释放的量来测量。此外，以下描述的本发明的肽和HLA的复合物也可以用于测量CTL水平。可以通过与从没有癌症的受试者收集的相同类型的生物材料中的测量结果进行比较，确定受试者的癌症是否表达CDCA1。也就是说，如果相对于从没有癌症的另一名受试者收集的相同类型的生物材料中的水平(正常对照水平)，从患有癌症的受试者中收集的生物样品中的待测物质的水平升高，则可以确定患有癌症的受试者的癌症表达CDCA1。
在优选的实施方案中，优选在施用至少一种选自由上述(a)至(e)组成的组的活性成分之前确认受试者的HLA类型。例如，优选选择HLA-A01阳性受试者作为待施用活性成分的受试者，所述活性成分与具有选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列的肽有关。通过用HLA-A01特异性抗体以免疫学方式检测从受试者收集的细胞表面上的HLA，可以确认受试者的HLA。或者，可以通过分析从收集自受试者的细胞获得的基因组DNA或mRNA的遗传信息来确定受试者的HLA。如果受试者是HLA-A01阳性，则在本发明中可以期望有效的治疗。换句话说，具有纯合或杂合HLA-A01的受试者可以是施用的靶标。
本发明还提供了本发明的肽与HLA的复合物。上述本发明的复合物可以是单体或多聚体。当本发明的复合物为多聚体时，聚合的数目没有特别限制，且可以是任何聚合数目的多聚体。例子包括但不限于四聚体，五聚体，六聚体等。本发明的多聚体还包括dextramers(WO2002/072631)和streptamers(Knabel M et al.,Nat Med.2002；8(6):631-7.)。本发明的肽和HLA的复合物可以根据已知方法制备(例如,Altman JD等人,Science.1996,274(5284):94-6；WO2002/072631；WO2009/003492；Knabel M et al.,NatMed.2002；8(6):631-7等)。例如，本发明的复合物可用于定量对本发明的肽特异的CTL。例如，从施用本发明的药物组合物的受试者收集血液样品，并且在分离PBMC之后调整CD4阴性细胞并与本发明的荧光染料-缀合的复合物接触。然后，可以通过流式细胞术分析测量对本发明的肽特异性的CTL的百分比。例如，可以通过在施用本发明的药物组合物之前，期间和/或之后测量针对本发明的肽的特异性CTL来监测本发明的药物组合物的免疫应答诱导作用。
XII.抗体
本发明进一步提供了与本发明的肽结合的抗体。优选的抗体特异性结合本发明的肽且不会结合(或会微弱结合)不是本发明的肽。抗体的结合特异性可以通过抑制测定来确认。也就是说，如果在本发明的肽的存在下，待分析的抗体与全长CDCA1多肽之间的结合被抑制，则该抗体显示出特异性结合本发明的肽。针对本发明的肽的抗体可用于疾病诊断和预后的测定，以及用于选择施用本发明的药物组合物的受试者选择和监测本发明的药物组合物。
本发明还提供了用于检测和/或定量本发明的肽或其片段的各种免疫测定。此类免疫测定包括但不限于放射免疫测定，免疫色谱，酶联免疫吸附测定(ELISA)，酶联免疫荧光测定(ELIFA)等，并且在本领域熟知的各种免疫测定形式的范围内进行。
本发明的抗体可以用于可以检测表达CDCA1疾病的免疫学成像方法，且其实例包括但不限于使用本发明的标记抗体的放射性闪烁照相成像。此类测定方法在临床上用于检测，监测和预后表达CDCA1的癌症；且此类癌症的例子包括但不限于膀胱癌,乳腺癌，宫颈癌，胆管细胞癌，慢性髓细胞性白血病(CML),食管癌，胃癌，非小细胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，前列腺癌，肾癌，小细胞肺癌，头颈部癌，软组织肿瘤，大肠癌等。
本发明的抗体可以以任何任意形式使用，例如单克隆或多克隆抗体，而且还可包括通过用本发明的肽免疫动物(诸如家兔)而获得的抗血清，所有种类的多克隆和单克隆抗体，人抗体，及通过遗传重组生成的嵌合抗体和人源化抗体。
用作获得抗体的抗原的本发明的肽或其片段可以通过基于本文公开的氨基酸序列通过化学合成或基因工程技术获得。
用作免疫抗原的肽可以是本发明的肽或本发明的肽的片段。此外，该肽可以与载体结合或与载体缀合以增加免疫原性。匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载体是公知的。用于将KLH结合至肽的方法也是本领域公知的。
可以用上述抗原免疫任何哺乳动物，且当产生单克隆抗体时优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的相容性。通常，可使用啮齿目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)或灵长目(Primate)的动物。啮齿目动物包括例如小鼠、大鼠和仓鼠。兔形目动物包括例如家兔。灵长目动物包括例如狭鼻猿(旧大陆猴(old world monkey))诸如食蟹猴(Macacafascicularis)、恒河猴、狒狒和黑猩猩。
用抗原免疫动物的方法是本领域已知的。腹膜内注射和皮下注射抗原是免疫哺乳动物的标准方法。更具体的说，可以在适量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水等中稀释和悬浮抗原。如果需要，可将抗原悬浮液与适量的标准佐剂诸如弗氏(Freund)完全佐剂混合，制成乳状液，然后施用于哺乳动物。然后，优选的是使用每4至21天施用数次与适量弗氏不完全佐剂混合的抗原。可使用适宜的载体进行免疫。如上所述进行免疫后，可通过标准方法检验血清中所需抗体的量的增加。
可以如下制备针对本发明肽的多克隆抗体：从哺乳动物中收集血液(其已经在免疫后确认了所需抗体血清水平的增)，并通过任何常规方法从血液中分离血清。多克隆抗体可以是包括含有多克隆抗体的血清，或可以从所述血清中分离的，含有该多克隆抗体的级分。可以使用例如偶联有本发明肽的亲和柱从仅识别本发明肽的级分中制备免疫球蛋白G或M，并进一步使用蛋白A或蛋白G柱纯化该级分。
为了制备单克隆抗体，在确认免疫后所需抗体的血清水平增加时，从哺乳动物收集免疫细胞并进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞可优选获自脾。对于其他与上述免疫细胞融合的亲本细胞，例如，可以使用哺乳动物骨髓瘤细胞，优选已获得融合细胞的药物选择性质的骨髓瘤细胞。
可根据已知的方法，例如Milstein等人(Galfre and Milstein,Methods Enzymol73:1981,3-46)的方法，将上述免疫细胞与骨髓瘤细胞进行融合。
对于由细胞融合得到的杂交瘤，可在标准选择培养基诸如HAT培养基(含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基)中培养以进行选择。通常，在HAT培养基中继续细胞培养足够的时间(例如，数天至数周)，以允许除了所需的杂交瘤之外的所有其他细胞(非融合细胞)死亡。然后，通过标准有限稀释(standard limiting dilution)来筛选和克隆生成所需抗体的杂交瘤细胞。
除了上述用抗原免疫非人动物来制备杂交瘤的方法外，还可以在体外用肽、表达肽的细胞或其溶胞物免疫人淋巴细胞，诸如那些感染了EB病毒的人淋巴细胞。然后，可以使经过免疫的淋巴细胞与永生化的衍生自人的骨髓瘤细胞诸如U266融合，以产生期望的生成能够与所述肽结合的人抗体的杂交瘤(JPS63-17688)。
然后将所得杂交瘤移植入小鼠腹腔，并抽取腹水。所得的单克隆抗体可通过例如硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析或偶联有本发明肽的亲和柱进行纯化。
或者，可以通过癌基因永生化抗体产生免疫细胞(如免疫的淋巴细胞)，并用于制备单克隆抗体。
如此获得的单克隆抗体也可以使用遗传工程技术来重组制备(参见例如Borrebaeck and Larrick,Therapeutic Monoclonal Antibodies,由MacMillanPublishers LTD在英国出版(1990))。例如，可以从免疫细胞诸如杂交瘤或经免疫淋巴细胞克隆编码抗体的DNA，将该DNA插入合适的载体，并导入宿主细胞以制备重组抗体。本发明还提供如上所述制备的重组抗体。
此外，本发明的抗体可以是抗体片段或经过修饰的抗体，只要它结合本发明的肽。例如，抗体片段可以是Fab、F(ab’)2、Fv或将来自H链和L链的Fv片段通过合适的接头连接而成的单链Fv(scFv)(Huston et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1988,85:5879-83)。更具体的说，可以通过用酶诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体来生成抗体片段。或者，可以构建编码抗体片段的基因，将其插入表达载体，并在合适的宿主细胞中表达(参见例如Co etal.,J Immunol 1994,152:2968-76；Better and Horwitz,Methods Enzymol 1989,178:476-96；Pluckthun and Skerra,Methods Enzymol 1989,178:497-515；Lamoyi,MethodsEnzymol 1986,121:652-63；Rousseaux et al.,Methods Enzymol 1986,121:663-9；Birdand Walker,Trends Biotechnol 1991,9:132-7)。
抗体可以通过与多种分子诸如聚乙二醇(PEG)缀合来修饰。本发明提供了经过此类修饰的抗体。可通过化学修饰抗体来获得经过修饰的抗体。这些修饰方法是本领域常规的。
或者，可以以衍生自非人抗体的可变区与衍生自人抗体的恒定区之间的嵌合抗体或者包含衍生自非人抗体的互补决定区(CDR)、衍生自人抗体的框架区(FR)及恒定区的人源化抗体的形式来获得本发明的抗体。此类抗体可依照已知技术来制备。人源化可通过用非人抗体CDR序列取代人抗体的相应序列来进行(参见例如Verhoeyen et al.,Science1988,239:1534-6)。因而，此类人源化抗体是嵌合抗体，其中人可变域的一小部分已被来自非人物种的相应序列所取代。
也可以使用完全的人抗体，这样的抗体除了人框架区和恒定区外还包含人可变区。此类抗体可使用本领域已知的多种技术来制备。例如，体外方法包括使用展示在噬菌体上的人抗体片段的重组文库(例如Hoogenboom&Winter,J.Mol.Biol.1991,227:381)。类似的，可通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物，例如内源免疫球蛋白基因部分或完全灭活的小鼠，来生成人抗体。该方法记载于例如美国专利号6,150,584；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425和5,661,016。
可以将如上获得的抗体纯化至同质。例如，可依照用于一般蛋白质的分离和纯化方法进行抗体的分离和纯化。例如，可以通过适当选择和组合使用柱层析诸如亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦来分离和纯化抗体(Antibodies:A Laboratory Manual.Ed Harlow和David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但并不局限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作亲和柱。例示性的可使用的蛋白A柱包括例如Hyper D、POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。
除了亲和色谱，示例性的色谱包括，例如离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析、等等(Strategies for Protein Purification和Characterization:ALaboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak等人,Cold Spring HarborLaboratory Press(1996))。可以通过液相层析来进行层析程序，诸如HPLC和FPLC。
例如，可通过使用吸光度测量、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)和/或免疫荧光(IF)来测量本发明抗体的抗原结合活性。在ELISA中，将本发明的抗体固定化在板上，将本发明的肽施加到该板上，然后施加含有所需抗体的样品，诸如生成抗体的细胞的培养物上清液或纯化的抗体。然后施加用酶(诸如碱性磷酸酶)标记的、识别第一抗体的第二抗体，并将板温育。接着，在洗涤后，向板中加入酶底物，诸如磷酸对硝基苯酯，并通过测量吸光度以评估样品的抗原结合活性。为了评估抗体的结合活性，可以使用肽片段如C-末端或N-末端片段作为抗原。可以使用BIAcore(Pharmacia)来评估本发明抗体的活性。
通过将本发明的抗体暴露于假定含有本发明的肽的样品，并检测或测量在抗体和肽之间形成的免疫复合物，可以检测或测量使用以上方法的本发明的肽。
例如，本发明的抗体可用于检测受试者的血液样品(例如，血清样品)中存在的本发明的肽。或者，也可以使用本发明的肽来检测受试者血液样品(例如，血清样品)中存在的本发明的抗体。在受试者的血液样品中测量本发明的肽或本发明的抗体的结果可以用于受试者选择用于施用本发明的药物组合物或监测药物组合物的功效。
XII.载体和宿主细胞
本发明提供包含编码本发明的肽的多核苷酸的载体和导入有所述载体的宿主细胞。本发明的载体可以用于将本发明的多核苷酸保持在宿主细胞中，以在宿主细胞中表达本发明的肽，或者以施用本发明的多核苷酸用于基因疗法。
当大肠杆菌为宿主细胞且在大肠杆菌(例如JM109、DH5-alpha、HB101或XL1-Blue)中大量扩增和生成载体时，载体需要具有用于在大肠杆菌中扩增的“复制起点”和用于选择经过转化的大肠杆菌的标志基因(例如通过药物诸如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素等进行选择的药物抗性基因)。例如，可以使用M13系列载体、pUC系列载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，pGEM-T，pDIRECT和pT7可用于克隆以及以上载体。当载体用于生产本发明的肽时，可以使用表达载体。例如，要在大肠杆菌中表达的表达载体应具备上述在大肠杆菌中扩增的特征。当使用大肠杆菌诸如JM109、DH5-alpha、HB101或XL1-Blue作为宿主细胞时，载体应具有能在大肠杆菌中高效表达所需基因的启动子，例如lacZ启动子(Ward et al.,Nature 1989,341:544-6；FASEB J.1989,6:2422-7)、araB启动子(Better et al.,Science 1988,240:1041-3)、T7启动子等。在这方面，可以使用例如pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpress系统”(Qiagen)、pEGFP和pET(在这种情况中，宿主优选为表达T7 RNA聚合酶的BL21)来取代上述载体。另外，载体还可以包含用于肽分泌的信号序列。指导肽分泌至大肠杆菌周质的例示性信号序列有pelB信号序列(Lei et al.,JBacteriol.1987,169:4379)。用于将载体导入靶宿主细胞的手段包括例如氯化钙法和电穿孔法。
除了大肠杆菌外，还可以使用例如衍生自哺乳动物的表达载体(例如pcDNA3(Invitrogen)和pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 1990,18(17):5322)、pEF、pCDM8)、衍生自昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(GIBCO BRL)、pBacPAK8)、衍生自植物的表达载体(例如pMH1、pMH2)、衍生自动物病毒的表达载体(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、衍生自逆转录病毒的表达载体(例如pZIpneo)、衍生自酵母的表达载体(例如“毕赤酵母表达试剂盒”(Invitrogen)、pNV11、SP-Q01)及衍生自枯草芽孢杆菌的表达载体(例如pPL608、pKTH50)来生成本发明的多肽。
为了在动物细胞诸如CHO、COS或NIH3T3细胞中表达载体，载体应具有在所述细胞中进行表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan et al.,Nature 1979,277:108)、MMLV-LTR启动子、EF1-alpha启动子(Mizushima et al.,Nucleic Acids Res.1990,18:5322)、CMV启动子、等等，及优选用于选择转化子的标志基因(例如通过药物(例如新霉素、G418)进行选择的药物抗性基因)。具有这些特征的已知载体的例子包括例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。
下面基于上述说明例示本发明的实施方案；然而本发明不限于这些实施方案。
[1]具有细胞毒性T细胞(CTL)诱导能力的少于15个氨基酸的肽，其包含选自以下组的氨基酸序列：
(a)选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37；以及
(b)选自下组的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了一个、两个、三个或数个氨基酸的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37。
[2][1]的肽，其包含将选自以下(a)至(c)的一个或多个(即一个、两个或三个)取代引入选自下组的氨基酸序列中的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37：
(a)用选自由苏氨酸和丝氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第二个氨基酸；
(b)用选自由天冬氨酸和谷氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第三个氨基酸；和
(c)用酪氨酸取代C端的氨基酸。
[3][1]的肽，其由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37。
[4]多核苷酸，其编码[1]至[3]中任一项的肽。
[5]组合物，包含药学上可接受的载体和选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[6][5]的组合物，其是用于诱导CTL的组合物，其中所述成分是选自下组(a)至(d)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物。
[7][5]的组合物，其是药物组合物。
[8][7]的组合物，其是用于选自下组的一种或多种用途的药物组合物：(i)癌症治疗,(ii)癌症预防(防范(prophylaxis))和(iii)术后癌症复发的预防(防范)。
[9][7]的组合物，其用于诱导针对癌症的免疫应答。
[10][8]或[9]的组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组：膀胱癌，乳腺癌，宫颈癌，胆管细胞癌，慢性髓性白血病(CML)，食管癌，胃癌，非小细胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，前列腺癌，肾癌，小细胞肺癌，头颈部癌，软组织肿瘤和大肠癌。
[11][5]至[10]中任一项的组合物，其配制为用于对HLA-A01阳性的受试者施用。
[12]诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，其包含选自下组的步骤：
(a)体外，离体或体内将APC与[1]至[3]中任一项所述的肽接触；和
(b)将编码[1]至[3]中任一项的肽的多核苷酸引入APC。
[13]诱导CTL的方法，其包含选自下组的步骤：
(a)将CD8阳性T细胞与APC共培养，所述APC在其表面呈递HLA抗原与[1]至[3]中任一项的肽的复合物；
(b)将CD8阳性T细胞与外来体共培养，所述外来体在其表面呈递HLA抗原与[1]至[3]中任一项的肽的复合物；
(c)将多核苷酸导入CD8阳性T细胞，所述多核苷酸编码T细胞受体(TCR)的每个亚基，所述T细胞受体能够结合细胞表面上由HLA抗原呈递的[1]至[3]中任一项的肽。
[14]APC，其在其表面呈递HLA抗原与[1]至[3]中任一项的肽的复合物。
[15][14]的APC，其通过[12]的方法诱导。
[16]CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[17][16]的CTL，其通过[13]的方法诱导。
[18]诱导针对癌症的免疫应答方法，其包含向受试者施用选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[19]治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发的方法，包括向受试者施用选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[20]抗体，其结合[1]至[3]中任一项的肽。
[21]筛选具有CTL诱导能力的肽的方法，其包含以下步骤：
(a)产生由氨基酸序列组成的候选序列，其中对由选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列组成的原始氨基酸序列取代，缺失，插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸残基；
(b)从在(a)中产生的候选序列中选择除CDCA1外与任何已知的人基因产物不具有显著同源性(序列同一性)的候选序列；
(c)将APC与由在(b)中选择的候选序列组成的肽接触；
(d)将(c)的APC与CD8阳性T细胞接触；和
(e)选择与原始氨基酸序列组成的肽相比，具有相等或更高的CTL诱导能力的肽。
[22]选自下组(a)至(e)中的至少一种活性成分在制备用于诱导针对癌症的免疫应答的组合物中的用途：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[23]选自下组(a)至(e)中的至少一种成分在制备用于治疗和/或预防癌症和/或预防其手术后复发的药物组合物中的用途：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[24]选自下组(a)至(e)中的至少一种成分在诱导针对癌症的免疫应答中的用途：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[25]选自下组(a)至(e)中的至少一种成分，其用于治疗和/或预防癌症和/或预防其手术后复发：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[4]中任一项的肽。
[26]诱导针对表达CDCA1的细胞的细胞毒性活性的方法，其包含向受试者施用选自下组(a)至(e)中的至少一种成分的步骤：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[27]冷冻干燥制剂，其包含一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽。
[28]药物组合物，其通过包含如下的方法制备：将一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽溶解在水溶性载体中，并进行过滤灭菌。
[29]过滤灭菌水溶液，其是包含一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽和水溶性载体的水溶液。
[30]乳剂，其包含一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽，水溶性载体和油佐剂。
[31]试剂盒，其包含容纳[5]至[11]中任一项的组合物的容器和储存佐剂的容器。
[32]试剂盒，其包含储存包含[1]至[3]中任一项的肽的冷冻干燥制剂的容器，储存佐剂的容器，和储存用于冷冻干燥制剂的再溶解液的容器。
优选地，本发明的试剂盒还另外包含HLA-A01检测试剂。
本文参考其具体实施方案在此详细解释本发明。然而，应当理解，上述解释实际上是说明性和解释性解释，并且旨在解释本发明及其优选实施方式。通过常规实验，本领域技术人员将容易地认识到，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在其中进行各种改变和修改。因此，本发明不限于上述说明，而是旨在由所附权利要求及其等同物限定。
在下文中，参照实施例更为详细地描述本发明。然而，虽然下述材料、方法和实施例可以用来帮助普通技术人员进行和使用本发明的某些实施方案，但是这些仅意图例示本发明的各方面，如此绝不限制本发明的范围。如本领域普通技术人员会容易认可与本文中描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明的实施或测试。
实施例
材料和方法
细胞系
C1R，HLA-A阴性和HLA-B阴性人类B成淋巴细胞样细胞系，和COS7，非洲绿猴肾细胞系购自ATCC。
具有组成型HLA-A*01:01表达的靶细胞的生成
组成型表达HLA-A*01:01的C1R细胞(C1R-A01)用作刺激CTL的细胞。通过PCR扩增编码HLA-A*01:01基因的cDNA，并将其引入表达载体。在药物选择下，用含有G418(Invitrogen)的培养基将用HLA-A*01:01基因表达载体掺入的C1R细胞培养2周。稀释G418抗性C1R细胞悬液后，将细胞接种到96孔板中，并用含G418的培养基再选择性培养30天。通过流式细胞术分析验证了C1R细胞中HLA-A*01:01的表达。
CDCA1衍生肽的选择
使用结合预测服务器“NetMHC 3.2”(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC-3.2/)(Buus et al.,Tissue Antigens.2003,62(5):378-84；Nielsen et al.,ProteinSci.2003,12(5):1007-17；Lundegaard C et al.,Bioinformatics.2008,24(11):1397-98)，“BIMAS”(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)(Parker KC et al.,JImmunol 1994,152(1):163-75)和“SYFPEITHI”(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)(Rammensee HG et al.,Immunogenetics 1999,50(3-4):213-9)确定了预期与HLA-A*01:01结合的CDCA1衍生的8聚体、9聚体和10聚体肽。
肽合成
根据标准固相合成方法，由American Peptide Company(Sunnyvale,CA)以化学方式合成肽，并通过反相高效液相色谱法(HPLC)进行纯化。HPLC和质谱保证了肽的质量(纯度为90％或更高)。将肽溶解在二甲亚砜中(最终浓度：20mg/ml)，并在-80摄氏度下保存。
体外CTL诱导
单核细胞衍生的树突状细胞(DC)用作抗原呈递细胞，以诱导对人白细胞抗原(HLA)上呈递的肽具有特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。如文献中已报道的，DC是在体外制备的(Nakahara S et al.,Cancer Res 2003,63(14):4112-8)。具体而言，将从健康志愿者(HLA-A*01:01阳性)收集的外周血单个核细胞(PBMC)与Ficoll-Paque plus溶液(Pharmacia)接种到塑料组织培养皿(Corning)中，以允许将PBMC中的单核细胞附着到培养皿。然后，将细胞在1000IU/ml粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(R&D System)和1000IU/ml白介素(IL)-4(R&D System)的存在下培养7天。作为培养基，使用了含有灭活的AB型血清(MPBiomedicals)的AIM-V培养基(Invitrogen)(2％ABS/AIM-V培养基)。分别以20微克/ml的每种合成肽脉冲(37摄氏度，持续3小时)通过细胞因子诱导从单核细胞分化的DC。在AIM-V培养基中进行肽脉冲。这些肽脉冲的DC通过X射线照射(20Gy)失活，并与通过使用CD8阳性分离试剂盒(Invitrogen)获得的自体CD8阳性T细胞以1:20比例混合(1.5x104个DC和3x105个CD8阳性T细胞)，并在48孔板中培养(Corning)。2％ABS/AIM-V培养基的体积为每1孔0.5ml，并向孔中添加IL-7(R&D System)(终浓度：10ng/ml)。培养开始后两天，向其中加入IL-2(Novartis)(终浓度：20IU/ml)。在培养的第7天和培养的第14天，用肽脉冲的DC进一步刺激CD8阳性T细胞。在使用之前，通过与上述相同的方法制备DC。在第21天或之后(第三次DC刺激后)，通过酶联免疫斑点(ELISPOT)测定证实了针对肽脉冲的C1R-A01的CD8阳性T细胞的IFN-gamma产生(Tanaka H et al.,Br J Cancer 2001,84(1):94-9；Umano Y et al.,Br JCancer 2001,84(8):1052-7；Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006,97(5):411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)。
CTL增殖程序
使用类似于Riddell等人报道的方法繁殖CTL(Walter EA et al.,N Engl J Med1995,333(16):1038-44；Riddell SR et al.,Nat Med 1996,2(2):216-23)。在用于组织培养的烧瓶(FALCON)中，将CTL与用丝裂霉素C和抗CD3抗体(BD biosciences，终浓度：40ng/ml)处理的两种类型的人B淋巴母细胞样细胞系(各5x106个细胞)在5％ABS/AIM-V培养基(培养液体积：25ml/烧瓶)中进行培养。在开始培养的第二天，将IL-2加入培养物中(IL-2终浓度：120IU/ml)。在第5、8和11天，将培养基换成含有60IU/ml IL-2(IL-2终浓度：30IU/ml)的5％ABS/AIM-V培养基(Tanaka H et al.,Br J Cancer 2001,84(1):94-9；Umano Y etal.,Br J Cancer 2001,84(8):1052-7；Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006,97(5):411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)。
CTL克隆的建立(限制稀释法)
体外诱导CTL后，将CTL以1个细胞/孔或10个细胞/孔接种在96孔圆底微孔板(Corning)中。将CTL与用丝裂霉素C、抗CD3抗体(终浓度：30ng/ml)和IL-2(终浓度：125IU/ml)处理的两种类型的人B淋巴母细胞样细胞系(各1x104个细胞)在5％ABS/AIM-V培养基(培养液体积：150μl/孔)中进行培养。10天后，将50μl的含500IU/ml IL-2的5％ABS/AIM-V培养基添加到培养物中。第14天后，通过上述方法繁殖在ELISPOT测定法中显示出肽特异性IFN-gamma产生的CTL(Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda Tet al.,Cancer Sci 2006,97(5):411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)。
IFN-gamma产生的确认
进行IFN-gamma ELISPOT测定法和IFN-gamma ELISA以确认由肽诱导的CTL的肽特异性IFN-gamma产生。制备用肽脉冲的C1R-A01作为靶细胞。根据测定试剂盒制造商推荐的程序进行IFN-gamma ELISPOT测定法和IFN-gammaELISA。
强制表达CDCA1和HLA-A*01:01的靶细胞的建立
通过PCR扩增编码CDCA1或HLA-A*01:01基因的cDNA。将每种PCR扩增产物掺入表达载体中。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，根据制造商推荐的程序，将CDCA1基因表达载体和HLA-A*01:01基因表达载体中的一个或两个导入HLA阴性细胞系COS7。基因导入的第二天，使用Versene(Invitrogen)分离COS7细胞并将其用作靶细胞。
结果
衍生自CDCA1的HLA-A*01:01结合肽的选择
表1a、表1b和表1c显示了衍生自CDCA1的8聚体、9聚体和10聚体肽，其分别由“NetMHC 3.2”预测以降序的结合亲和力与HLA-A*01:01结合。表2a和表2b显示了衍生自CDCA1的9聚体和10聚体肽，其由“BIMAS”预测以降序的结合得分与HLA-A*01:01结合。表3a和表3b显示了衍生自CDCA1的9聚体和10聚体肽，其由“SYFPEITHI”预测以降序的结合得分与HLA-A*01:01结合。每个表中的起始位置的数字表示从CDCA1蛋白的N端计数时该肽的第一个氨基酸的位置。总共可能具有HLA-A*01:01结合能力的39个肽成为表位肽候选者。
[表1a]
通过NetMHC3.2预测与HLA-A*01：01结合的CDCA1衍生的8聚体肽
起始位置 氨基酸序列 亲和力(nM) SEQ ID NO
138 YMEFLWQY 50 1
[表1b]
通过NetMHC3.2预测与HLA-A*01：01结合的CDCA1衍生的9聚体肽
起始位置 氨基酸序列 亲和力(nM) SEQ ID NO
1 83 LSDGIQELQ 2486 2
49 YMRALQIVY 2570 3
325 ESDESELKK 3358 4
303 LSDNREKLA 6648 5
57 YGIRLEHFY 6700 6
380 VQEKRGAVY 8200 7
[表1c]
通过NetMHC3.2预测与HLA-A*01：01结合的CDCA1衍生的10聚体肽
起始位置 氨基酸序列 亲和力(nM) SEQ ID NO
136 ETYMEFLWQY 92 8
66 MMPVNSEVMY 455 9
56 VYGIRLEHFY 1040 10
121 LSGIINFIHF 2410 11
287 PSCQLEVQLY 2630 12
48 IYMRALQIVY 2933 13
325 ESDESELKKL 4331 14
436 GIEKAAEDSY 4636 15
379 KVQEKRGAVY 4867 16
129 HFREACRETY 7569 17
335 KTEENSFKRL 8751 18
424 LNLKTALEKY 9039 19
451 KTAELKRKMF 9261 20
146 KSSADKMQQL 9961 21
[表2a]
通过BIMAS预测与HLA-A*01：01结合的CDCA1衍生的9聚体肽
起始位置 氨基酸序列 得分 SEQ ID NO
335 KTEENSFKR 112.5 22
41 KPEVLHMIY 56.25 23
25 GADGKNLTK 50 24
290 QLEVQLYQK 36 25
244 IVDSPFKLK 10 26
[表2b]
通过BIMAS预测与HLA-A*01：01结合的CDCA1衍生的10聚体肽
起始位置 氨基酸序列 得分 SEQ ID NO
452 TAELKRKMFK 90 27
91 HLDSFLPICR 25 28
323 QIESDESELK 18 29
290 QLEVQLYQKK 18 30
447 KIDEKTAELK 10 31
106 TADILCPKAK 10 32
[表3a]
通过SYFPEITHI预测与HLA-A*01：01结合的CDCA1衍生的9聚体肽
起始位置 氨基酸序列 得分 SEQ ID NO
130 FREACRETY 24 33
246 DSPEKLKNY 19 34
268 ARQEVVEKY 18 35
1 METLSFPRY 18 36
288 SCQLEVQLY 18 37
[表3b]
通过SYFPEITHI预测与HLA-A*01：01结合的CDCA1衍生的10聚体肽
起始位置 氨基酸序列 得分 SEQ ID NO
303 LSDNREKLAS 18 38
245 VDSPEKLKNY 18 39
HLA-A*01：01限制性CDCA1衍生肽诱导CTL
根据“材料和方法”中所述的方案诱导了对衍生自CDCA1的肽具有特异性的CTL。通过IFN-gamma ELTSPOT测定法测量肽特异性IFN-gamma产生(图1)。在以下项中观察相对于对照孔的肽特异性IFN-gamma产生：
具有CDCA1-A01-8-138(SEQ ID NO：1)的孔#1(a)，
具有CDCA1-A01-9-290(SEQ ID NO：25)的孔#7(b)，
具有CDCA1-A01-9-130(SEQ ID NO：33)的孔#5(c)，
具有CDCA1-A01-9-246(SEQ ID NO：34)的孔#7(d)，
具有CDCA1-A01-9-268(SEQ ID NO：35)的孔#1(e)，
具有CDCA1-A01-9-288(SEQ ID NO：37)的孔#3(f)，
具有CDCA1-A01-10-136(SEQ ID NO：8)的孔#2(g)，
具有CDCA1-A01-10-56(SEQ ID NO：10)的孔#6(h)，和
具有CDCA1-A01-10-48(SEQ ID NO：13)的孔#6(i)。
同时，未观察到对表1b、表1c、表2a、表2b、表3a和表3b中所示的其他肽具有特异性的IFN-gamma产生。未观察到对CDCA1-A01-10-66(SEQ ID NO:9)具有特异性的IFN-gamma产生(典型阴性数据的实例)(j)。每种肽都可能与HLA-A*01:01结合，但结果选择了衍生自CDCA1的9种肽作为具有强CTL诱导能力的肽。
对CDCA1衍生的HLA-A*01:01限制性肽具有特异性的CTL克隆的建立
通过有限稀释法，从在IFN-gamma ELISPOT测定法中显示对CDCA1-A01-10-136(SEQ ID NO:8)具有特异性的IFN-gamma产生的孔#2(图1g)、显示对CDCA1-A01-10-56(SEQID NO:10)具有特异性的IFN-gamma产生的孔#6(图1h)、显示对CDCA1-A01-10-48(SEQ IDNO:13)具有特异性的IFN-gamma产生的孔#6(图1i)中的细胞建立CTL克隆。通过ELISA测量IFN-gamma的结果是，CDCA1-A01-10-136(SEQ ID NO:8)、CDCA1-A01-10-56(SEQ ID NO:10)或CDCA1-A01-10-48(SEQ ID NO:13)刺激的CTL克隆显示出肽特异性的IFN-gamma产生(图2)。
针对表达CDCA1和HLA-A*01:01的靶细胞的CTL的IFN-gamma产生
验证了针对表达CDCA1和HLA-A*01:01的靶细胞的对CDCA1-A01-10-136(SEQ IDNO:8)具有特异性的CTL克隆的IFN-gamma产生。制备同时表达CDCA1和HLA-A*01:01的COS7细胞作为靶细胞。制备表达CDCA1或HLA-A*01:01的COS7细胞作为阴性对照细胞。对CDCA1-A01-10-136(SEQ ID NO:8)具有特异性的CTL克隆显示出针对表达CDCA1和HLA-A*01:01两者的COS7细胞的IFN-gamma产生(图3)。相反，未观察到针对阴性对照细胞的明显的IFN-gamma产生。从上面清楚地证明，CDCA1-A01-10-136(SEQ ID NO:8)是通过抗原加工产生的肽，并且与HLA-A01分子一起在细胞表面上呈递并被CTL识别。结果表明，CDCA1-A01-10-136(SEQ ID NO:8)可用作靶向具有升高的CDCA1表达的癌症患者的癌症疫苗。
抗原肽的同源性分析
确认了CDCA1-A01-8-138(SEQ ID NO:1)、CDCA1-A01-9-290(SEQ ID NO:25)、CDCA1-A01-9-130(SEQ ID NO:33)、CDCA1-A01-9-246(SEQ ID NO:34)、CDCA1-A01-9-268(SEQ ID NO:35)、CDCA1-A01-9-288(SEQ ID NO:37)、CDCA1-A01-10-136(SEQ ID NO:8)、CDCA1-A01-10-56(SEQ ID NO:10)和CDCA1-A01-10-48(SEQ ID NO:13)能够诱导显示肽特异性IFN-gamma产生的CTL。因此，为了确认CDCA1-A01-8-138(SEQ ID NO:1)、CDCA1-A01-9-290(SEQ ID NO:25)、CDCA1-A01-9-130(SEQ ID NO:33)、CDCA1-A01-9-246(SEQ ID NO:34)、CDCA1-A01-9-268(SEQ ID NO:35)、CDCA1-A01-9-288(SEQ ID NO:37)、CDCA1-A01-10-136(SEQ ID NO:8)、CDCA1-A01-10-56(SEQ ID NO:10)和CDCA1-A01-10-48(SEQ ID NO:13)仅衍生自CDCA1，使用BLAST算法(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行了肽序列的同源性分析。结果显示仅在CDCA1中观察到CDCA1-A01-8-138(SEQ ID NO:1)、CDCA1-A01-9-290(SEQ ID NO:25)、CDCA1-A01-9-130(SEQ ID NO:33)、CDCA1-A01-9-246(SEQ IDNO:34)、CDCA1-A01-9-268(SEQ ID NO:35)、CDCA1-A01-9-288(SEQ ID NO:37)、CDCA1-A01-10-136(SEQ ID NO:8)、CDCA1-A01-10-56(SEQ ID NO:10)和CDCA1-A01-10-48(SEQ ID NO:13)的序列。因此，就本发明人所知，这些肽对于CDCA1是独特的，并且被认为几乎不可能引起针对除CDCA1(已知其使人免疫系统敏感)以外的分子的意外免疫应答。总之，鉴定出了衍生自CDCA1的新的HLA-A*01:01限制性表位肽，并被证明可应用于癌症免疫疗法。
工业适用性
本发明提供了CDCA1衍生的新的HLA-A01限制性表位肽，其诱导有效且特异性的抗肿瘤免疫应答，并因此适用于广泛的癌症类型。本发明中的肽、组合物、APC和CTL可以用作用于表达CDCA1的癌症的肽疫苗，所述癌症例如，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性髓样白血病(CML)、食道癌、胃癌、非小细胞肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾癌、小细胞肺癌、头颈癌、软组织肿瘤和结肠癌。
尽管本文详细地并且关于其具体实施方案描述了本发明，但是应当理解，前述描述本质上是示例性和解释性的，而且意图例示本发明及其优选实施方案。经由常规实验，本领域技术人员会容易地认识到，可以对本发明进行各种变化和修饰，而不偏离本发明的精神和范围，本发明的边界和范围由所附权利要求来限定。
序列表
<110> 肿瘤疗法科学股份有限公司
<120> CDCA1衍生的肽和含有它们的疫苗
<130> ONC-A1801P
<150> JP 2018-145607
<151> 2018-08-02
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
<400> 1
Tyr Met Glu Phe Leu Trp Gln Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
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<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
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<223> 从CDCA1衍生的肽
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Val Tyr Gly Ile Arg Leu Glu His Phe Tyr
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<213> 人工序列
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<223> 从CDCA1衍生的肽
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Leu Ser Gly Ile Ile Asn Phe Ile His Phe
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<223> 从CDCA1衍生的肽
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Pro Ser Cys Gln Leu Glu Val Gln Leu Tyr
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<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
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Glu Ser Asp Glu Ser Glu Leu Lys Lys Leu
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<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
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Gly Ile Glu Lys Ala Ala Glu Asp Ser Tyr
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<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
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Lys Val Gln Glu Lys Arg Gly Ala Val Tyr
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<223> 从CDCA1衍生的肽
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His Phe Arg Glu Ala Cys Arg Glu Thr Tyr
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<223> 从CDCA1衍生的肽
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Lys Thr Glu Glu Asn Ser Phe Lys Arg Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
<400> 19
Leu Asn Leu Lys Thr Ala Leu Glu Lys Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
<400> 20
Lys Thr Ala Glu Leu Lys Arg Lys Met Phe
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
<400> 21
Lys Ser Ser Ala Asp Lys Met Gln Gln Leu
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
<400> 22
Lys Thr Glu Glu Asn Ser Phe Lys Arg
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
<400> 23
Lys Pro Glu Val Leu His Met Ile Tyr
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
<400> 24
Gly Ala Asp Gly Lys Asn Leu Thr Lys
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
<400> 25
Gln Leu Glu Val Gln Leu Tyr Gln Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
<400> 26
Ile Val Asp Ser Pro Glu Lys Leu Lys
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
<400> 27
Thr Ala Glu Leu Lys Arg Lys Met Phe Lys
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<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
<400> 28
His Leu Asp Ser Phe Leu Pro Ile Cys Arg
1 5 10
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
<400> 29
Gln Ile Glu Ser Asp Glu Ser Glu Leu Lys
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
<400> 30
Gln Leu Glu Val Gln Leu Tyr Gln Lys Lys
1 5 10
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
<400> 31
Lys Ile Asp Glu Lys Thr Ala Glu Leu Lys
1 5 10
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
<400> 32
Thr Ala Asp Ile Leu Cys Pro Lys Ala Lys
1 5 10
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
<400> 33
Phe Arg Glu Ala Cys Arg Glu Thr Tyr
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
<400> 34
Asp Ser Pro Glu Lys Leu Lys Asn Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
<400> 35
Ala Arg Gln Glu Val Val Glu Lys Tyr
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
<400> 36
Met Glu Thr Leu Ser Phe Pro Arg Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
<400> 37
Ser Cys Gln Leu Glu Val Gln Leu Tyr
1 5
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
<400> 38
Leu Ser Asp Asn Arg Glu Lys Leu Ala Ser
1 5 10
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从CDCA1衍生的肽
<400> 39
Val Asp Ser Pro Glu Lys Leu Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TCR分析的PCR引物
<400> 40
gtctaccagg cattcgcttc at 22
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TCR分析的PCR引物
<400> 41
tcagctggac cacagccgca gcgt 24
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TCR分析的PCR引物
<400> 42
tcagaaatcc tttctcttga c 21
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TCR分析的PCR引物
<400> 43
ctagcctctg gaatcctttc tctt 24
<210> 44
<211> 1989
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (301)..(1695)
<400> 44
gcggaatggg gcgggacttc cagtaggagg cggcaagttt gaaaagtgat gacggttgac 60
gtttgctgat ttttgacttt gcttgtagct gctccccgaa ctcgccgtct tcctgtcggc 120
ggccggcact gtaggtgagc gcgagaggac ggaggaagga agcctgcaga cagacgcctt 180
ctccatccca aggcgcgggc aggtgccggg acgctgggcc tggcggtgtt ttcgtcgtgc 240
tcagcggtgg gaggaggcgg aagaaaccag agcctgggag attaacagga aacttccaag 300
atg gaa act ttg tct ttc ccc aga tat aat gta gct gag att gtg att 348
Met Glu Thr Leu Ser Phe Pro Arg Tyr Asn Val Ala Glu Ile Val Ile
1 5 10 15
cat att cgc aat aag atc tta aca gga gct gat ggt aaa aac ctc acc 396
His Ile Arg Asn Lys Ile Leu Thr Gly Ala Asp Gly Lys Asn Leu Thr
20 25 30
aag aat gat ctt tat cca aat cca aag cct gaa gtc ttg cac atg atc 444
Lys Asn Asp Leu Tyr Pro Asn Pro Lys Pro Glu Val Leu His Met Ile
35 40 45
tac atg aga gcc tta caa ata gta tat gga att cga ctg gaa cat ttt 492
Tyr Met Arg Ala Leu Gln Ile Val Tyr Gly Ile Arg Leu Glu His Phe
50 55 60
tac atg atg cca gtg aac tct gaa gtc atg tat cca cat tta atg gaa 540
Tyr Met Met Pro Val Asn Ser Glu Val Met Tyr Pro His Leu Met Glu
65 70 75 80
ggc ttc tta cca ttc agc aat tta gtt act cat ctg gac tca ttt ttg 588
Gly Phe Leu Pro Phe Ser Asn Leu Val Thr His Leu Asp Ser Phe Leu
85 90 95
cct atc tgc cgg gtg aat gac ttt gag act gct gat att cta tgt cca 636
Pro Ile Cys Arg Val Asn Asp Phe Glu Thr Ala Asp Ile Leu Cys Pro
100 105 110
aaa gca aaa cgg aca agt cgg ttt tta agt ggc att atc aac ttt att 684
Lys Ala Lys Arg Thr Ser Arg Phe Leu Ser Gly Ile Ile Asn Phe Ile
115 120 125
cac ttc aga gaa gca tgc cgt gaa acg tat atg gaa ttt ctt tgg caa 732
His Phe Arg Glu Ala Cys Arg Glu Thr Tyr Met Glu Phe Leu Trp Gln
130 135 140
tat aaa tcc tct gcg gac aaa atg caa cag tta aac gcc gca cac cag 780
Tyr Lys Ser Ser Ala Asp Lys Met Gln Gln Leu Asn Ala Ala His Gln
145 150 155 160
gag gca tta atg aaa ctg gag aga ctt gat tct gtt cca gtt gaa gag 828
Glu Ala Leu Met Lys Leu Glu Arg Leu Asp Ser Val Pro Val Glu Glu
165 170 175
caa gaa gag ttc aag cag ctt tca gat gga att cag gag cta caa caa 876
Gln Glu Glu Phe Lys Gln Leu Ser Asp Gly Ile Gln Glu Leu Gln Gln
180 185 190
tca cta aat cag gat ttt cat caa aaa acg ata gtg ctg caa gag gga 924
Ser Leu Asn Gln Asp Phe His Gln Lys Thr Ile Val Leu Gln Glu Gly
195 200 205
aat tcc caa aag aag tca aat att tca gag aaa acc aag cgt ttg aat 972
Asn Ser Gln Lys Lys Ser Asn Ile Ser Glu Lys Thr Lys Arg Leu Asn
210 215 220
gaa cta aaa ttg tcg gtg gtt tct ttg aaa gaa ata caa gag agt ttg 1020
Glu Leu Lys Leu Ser Val Val Ser Leu Lys Glu Ile Gln Glu Ser Leu
225 230 235 240
aaa aca aaa att gtg gat tct cca gag aag tta aag aat tat aaa gaa 1068
Lys Thr Lys Ile Val Asp Ser Pro Glu Lys Leu Lys Asn Tyr Lys Glu
245 250 255
aaa atg aaa gat acg gtc cag aag ctt aaa aat gcc aga caa gaa gtg 1116
Lys Met Lys Asp Thr Val Gln Lys Leu Lys Asn Ala Arg Gln Glu Val
260 265 270
gtg gag aaa tat gaa atc tat gga gac tca gtt gac tgc ctg cct tca 1164
Val Glu Lys Tyr Glu Ile Tyr Gly Asp Ser Val Asp Cys Leu Pro Ser
275 280 285
tgt cag ttg gaa gtg cag tta tat caa aag aaa ata cag gac ctt tca 1212
Cys Gln Leu Glu Val Gln Leu Tyr Gln Lys Lys Ile Gln Asp Leu Ser
290 295 300
gat aat agg gaa aaa tta gcc agt atc tta aag gag agc ctg aac ttg 1260
Asp Asn Arg Glu Lys Leu Ala Ser Ile Leu Lys Glu Ser Leu Asn Leu
305 310 315 320
gag gac caa att gag agt gat gag tca gaa ctg aag aaa ttg aag act 1308
Glu Asp Gln Ile Glu Ser Asp Glu Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Thr
325 330 335
gaa gaa aat tcg ttc aaa aga ctg atg att gtg aag aag gaa aaa ctt 1356
Glu Glu Asn Ser Phe Lys Arg Leu Met Ile Val Lys Lys Glu Lys Leu
340 345 350
gcc aca gca caa ttc aaa ata aat aag aag cat gaa gat gtt aag caa 1404
Ala Thr Ala Gln Phe Lys Ile Asn Lys Lys His Glu Asp Val Lys Gln
355 360 365
tac aaa cgc aca gta att gag gat tgc aat aaa gtt caa gaa aaa aga 1452
Tyr Lys Arg Thr Val Ile Glu Asp Cys Asn Lys Val Gln Glu Lys Arg
370 375 380
ggt gct gtc tat gaa cga gta acc aca att aat caa gaa atc caa aaa 1500
Gly Ala Val Tyr Glu Arg Val Thr Thr Ile Asn Gln Glu Ile Gln Lys
385 390 395 400
att aaa ctt gga att caa caa cta aaa gat gct gct gaa agg gag aaa 1548
Ile Lys Leu Gly Ile Gln Gln Leu Lys Asp Ala Ala Glu Arg Glu Lys
405 410 415
ctg aag tcc cag gaa ata ttt cta aac ttg aaa act gct ttg gag aaa 1596
Leu Lys Ser Gln Glu Ile Phe Leu Asn Leu Lys Thr Ala Leu Glu Lys
420 425 430
tac cac gac ggt att gaa aag gca gca gag gac tcc tat gct aag ata 1644
Tyr His Asp Gly Ile Glu Lys Ala Ala Glu Asp Ser Tyr Ala Lys Ile
435 440 445
gat gag aag aca gct gaa ctg aag agg aag atg ttc aaa atg tca acc 1692
Asp Glu Lys Thr Ala Glu Leu Lys Arg Lys Met Phe Lys Met Ser Thr
450 455 460
tga ttaacaaaat tacatgtctt tttgtaaatg gcttgccatc ttttaatttt 1745
ctatttagaa agaaaagttg aagcgaatgg aagtatcaga agtaccaaat aatgttggct 1805
tcatcagttt ttatacactc tcataagtag ttaataagat gaatttaatg taggctttta 1865
ttaatttata attaaaataa cttgtgcagc tattcatgtc tctactctgc cccttgttgt 1925
aaatagtttg agtaaaacaa aactagttac ctttgaaata tatatatttt tttctgttac 1985
tatc 1989
<210> 45
<211> 464
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Met Glu Thr Leu Ser Phe Pro Arg Tyr Asn Val Ala Glu Ile Val Ile
1 5 10 15
His Ile Arg Asn Lys Ile Leu Thr Gly Ala Asp Gly Lys Asn Leu Thr
20 25 30
Lys Asn Asp Leu Tyr Pro Asn Pro Lys Pro Glu Val Leu His Met Ile
35 40 45
Tyr Met Arg Ala Leu Gln Ile Val Tyr Gly Ile Arg Leu Glu His Phe
50 55 60
Tyr Met Met Pro Val Asn Ser Glu Val Met Tyr Pro His Leu Met Glu
65 70 75 80
Gly Phe Leu Pro Phe Ser Asn Leu Val Thr His Leu Asp Ser Phe Leu
85 90 95
Pro Ile Cys Arg Val Asn Asp Phe Glu Thr Ala Asp Ile Leu Cys Pro
100 105 110
Lys Ala Lys Arg Thr Ser Arg Phe Leu Ser Gly Ile Ile Asn Phe Ile
115 120 125
His Phe Arg Glu Ala Cys Arg Glu Thr Tyr Met Glu Phe Leu Trp Gln
130 135 140
Tyr Lys Ser Ser Ala Asp Lys Met Gln Gln Leu Asn Ala Ala His Gln
145 150 155 160
Glu Ala Leu Met Lys Leu Glu Arg Leu Asp Ser Val Pro Val Glu Glu
165 170 175
Gln Glu Glu Phe Lys Gln Leu Ser Asp Gly Ile Gln Glu Leu Gln Gln
180 185 190
Ser Leu Asn Gln Asp Phe His Gln Lys Thr Ile Val Leu Gln Glu Gly
195 200 205
Asn Ser Gln Lys Lys Ser Asn Ile Ser Glu Lys Thr Lys Arg Leu Asn
210 215 220
Glu Leu Lys Leu Ser Val Val Ser Leu Lys Glu Ile Gln Glu Ser Leu
225 230 235 240
Lys Thr Lys Ile Val Asp Ser Pro Glu Lys Leu Lys Asn Tyr Lys Glu
245 250 255
Lys Met Lys Asp Thr Val Gln Lys Leu Lys Asn Ala Arg Gln Glu Val
260 265 270
Val Glu Lys Tyr Glu Ile Tyr Gly Asp Ser Val Asp Cys Leu Pro Ser
275 280 285
Cys Gln Leu Glu Val Gln Leu Tyr Gln Lys Lys Ile Gln Asp Leu Ser
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Asp Asn Arg Glu Lys Leu Ala Ser Ile Leu Lys Glu Ser Leu Asn Leu
305 310 315 320
Glu Asp Gln Ile Glu Ser Asp Glu Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Thr
325 330 335
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340 345 350
Ala Thr Ala Gln Phe Lys Ile Asn Lys Lys His Glu Asp Val Lys Gln
355 360 365
Tyr Lys Arg Thr Val Ile Glu Asp Cys Asn Lys Val Gln Glu Lys Arg
370 375 380
Gly Ala Val Tyr Glu Arg Val Thr Thr Ile Asn Gln Glu Ile Gln Lys
385 390 395 400
Ile Lys Leu Gly Ile Gln Gln Leu Lys Asp Ala Ala Glu Arg Glu Lys
405 410 415
Leu Lys Ser Gln Glu Ile Phe Leu Asn Leu Lys Thr Ala Leu Glu Lys
420 425 430
Tyr His Asp Gly Ile Glu Lys Ala Ala Glu Asp Ser Tyr Ala Lys Ile
435 440 445
Asp Glu Lys Thr Ala Glu Leu Lys Arg Lys Met Phe Lys Met Ser Thr
450 455 460
<210> 46
<211> 1843
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (155)..(1549)
<400> 46
gcggaatggg gcgggacttc cagtaggagg cggcaagttt gaaaagtgat gacggttgac 60
gtttgctgat ttttgacttt gcttgtagct gctccccgaa ctcgccgtct tcctgtcggc 120
ggccggcact gtagattaac aggaaacttc caag atg gaa act ttg tct ttc ccc 175
Met Glu Thr Leu Ser Phe Pro
1 5
aga tat aat gta gct gag att gtg att cat att cgc aat aag atc tta 223
Arg Tyr Asn Val Ala Glu Ile Val Ile His Ile Arg Asn Lys Ile Leu
10 15 20
aca gga gct gat ggt aaa aac ctc acc aag aat gat ctt tat cca aat 271
Thr Gly Ala Asp Gly Lys Asn Leu Thr Lys Asn Asp Leu Tyr Pro Asn
25 30 35
cca aag cct gaa gtc ttg cac atg atc tac atg aga gcc tta caa ata 319
Pro Lys Pro Glu Val Leu His Met Ile Tyr Met Arg Ala Leu Gln Ile
40 45 50 55
gta tat gga att cga ctg gaa cat ttt tac atg atg cca gtg aac tct 367
Val Tyr Gly Ile Arg Leu Glu His Phe Tyr Met Met Pro Val Asn Ser
60 65 70
gaa gtc atg tat cca cat tta atg gaa ggc ttc tta cca ttc agc aat 415
Glu Val Met Tyr Pro His Leu Met Glu Gly Phe Leu Pro Phe Ser Asn
75 80 85
tta gtt act cat ctg gac tca ttt ttg cct atc tgc cgg gtg aat gac 463
Leu Val Thr His Leu Asp Ser Phe Leu Pro Ile Cys Arg Val Asn Asp
90 95 100
ttt gag act gct gat att cta tgt cca aaa gca aaa cgg aca agt cgg 511
Phe Glu Thr Ala Asp Ile Leu Cys Pro Lys Ala Lys Arg Thr Ser Arg
105 110 115
ttt tta agt ggc att atc aac ttt att cac ttc aga gaa gca tgc cgt 559
Phe Leu Ser Gly Ile Ile Asn Phe Ile His Phe Arg Glu Ala Cys Arg
120 125 130 135
gaa acg tat atg gaa ttt ctt tgg caa tat aaa tcc tct gcg gac aaa 607
Glu Thr Tyr Met Glu Phe Leu Trp Gln Tyr Lys Ser Ser Ala Asp Lys
140 145 150
atg caa cag tta aac gcc gca cac cag gag gca tta atg aaa ctg gag 655
Met Gln Gln Leu Asn Ala Ala His Gln Glu Ala Leu Met Lys Leu Glu
155 160 165
aga ctt gat tct gtt cca gtt gaa gag caa gaa gag ttc aag cag ctt 703
Arg Leu Asp Ser Val Pro Val Glu Glu Gln Glu Glu Phe Lys Gln Leu
170 175 180
tca gat gga att cag gag cta caa caa tca cta aat cag gat ttt cat 751
Ser Asp Gly Ile Gln Glu Leu Gln Gln Ser Leu Asn Gln Asp Phe His
185 190 195
caa aaa acg ata gtg ctg caa gag gga aat tcc caa aag aag tca aat 799
Gln Lys Thr Ile Val Leu Gln Glu Gly Asn Ser Gln Lys Lys Ser Asn
200 205 210 215
att tca gag aaa acc aag cgt ttg aat gaa cta aaa ttg tcg gtg gtt 847
Ile Ser Glu Lys Thr Lys Arg Leu Asn Glu Leu Lys Leu Ser Val Val
220 225 230
tct ttg aaa gaa ata caa gag agt ttg aaa aca aaa att gtg gat tct 895
Ser Leu Lys Glu Ile Gln Glu Ser Leu Lys Thr Lys Ile Val Asp Ser
235 240 245
cca gag aag tta aag aat tat aaa gaa aaa atg aaa gat acg gtc cag 943
Pro Glu Lys Leu Lys Asn Tyr Lys Glu Lys Met Lys Asp Thr Val Gln
250 255 260
aag ctt aaa aat gcc aga caa gaa gtg gtg gag aaa tat gaa atc tat 991
Lys Leu Lys Asn Ala Arg Gln Glu Val Val Glu Lys Tyr Glu Ile Tyr
265 270 275
gga gac tca gtt gac tgc ctg cct tca tgt cag ttg gaa gtg cag tta 1039
Gly Asp Ser Val Asp Cys Leu Pro Ser Cys Gln Leu Glu Val Gln Leu
280 285 290 295
tat caa aag aaa ata cag gac ctt tca gat aat agg gaa aaa tta gcc 1087
Tyr Gln Lys Lys Ile Gln Asp Leu Ser Asp Asn Arg Glu Lys Leu Ala
300 305 310
agt atc tta aag gag agc ctg aac ttg gag gac caa att gag agt gat 1135
Ser Ile Leu Lys Glu Ser Leu Asn Leu Glu Asp Gln Ile Glu Ser Asp
315 320 325
gag tca gaa ctg aag aaa ttg aag act gaa gaa aat tcg ttc aaa aga 1183
Glu Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Thr Glu Glu Asn Ser Phe Lys Arg
330 335 340
ctg atg att gtg aag aag gaa aaa ctt gcc aca gca caa ttc aaa ata 1231
Leu Met Ile Val Lys Lys Glu Lys Leu Ala Thr Ala Gln Phe Lys Ile
345 350 355
aat aag aag cat gaa gat gtt aag caa tac aaa cgc aca gta att gag 1279
Asn Lys Lys His Glu Asp Val Lys Gln Tyr Lys Arg Thr Val Ile Glu
360 365 370 375
gat tgc aat aaa gtt caa gaa aaa aga ggt gct gtc tat gaa cga gta 1327
Asp Cys Asn Lys Val Gln Glu Lys Arg Gly Ala Val Tyr Glu Arg Val
380 385 390
acc aca att aat caa gaa atc caa aaa att aaa ctt gga att caa caa 1375
Thr Thr Ile Asn Gln Glu Ile Gln Lys Ile Lys Leu Gly Ile Gln Gln
395 400 405
cta aaa gat gct gct gaa agg gag aaa ctg aag tcc cag gaa ata ttt 1423
Leu Lys Asp Ala Ala Glu Arg Glu Lys Leu Lys Ser Gln Glu Ile Phe
410 415 420
cta aac ttg aaa act gct ttg gag aaa tac cac gac ggt att gaa aag 1471
Leu Asn Leu Lys Thr Ala Leu Glu Lys Tyr His Asp Gly Ile Glu Lys
425 430 435
gca gca gag gac tcc tat gct aag ata gat gag aag aca gct gaa ctg 1519
Ala Ala Glu Asp Ser Tyr Ala Lys Ile Asp Glu Lys Thr Ala Glu Leu
440 445 450 455
aag agg aag atg ttc aaa atg tca acc tga ttaacaaaat tacatgtctt 1569
Lys Arg Lys Met Phe Lys Met Ser Thr
460
tttgtaaatg gcttgccatc ttttaatttt ctatttagaa agaaaagttg aagcgaatgg 1629
aagtatcaga agtaccaaat aatgttggct tcatcagttt ttatacactc tcataagtag 1689
ttaataagat gaatttaatg taggctttta ttaatttata attaaaataa cttgtgcagc 1749
tattcatgtc tctactctgc cccttgttgt aaatagtttg agtaaaacaa aactagttac 1809
ctttgaaata tatatatttt tttctgttac tatc 1843
<210> 47
<211> 464
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Met Glu Thr Leu Ser Phe Pro Arg Tyr Asn Val Ala Glu Ile Val Ile
1 5 10 15
His Ile Arg Asn Lys Ile Leu Thr Gly Ala Asp Gly Lys Asn Leu Thr
20 25 30
Lys Asn Asp Leu Tyr Pro Asn Pro Lys Pro Glu Val Leu His Met Ile
35 40 45
Tyr Met Arg Ala Leu Gln Ile Val Tyr Gly Ile Arg Leu Glu His Phe
50 55 60
Tyr Met Met Pro Val Asn Ser Glu Val Met Tyr Pro His Leu Met Glu
65 70 75 80
Gly Phe Leu Pro Phe Ser Asn Leu Val Thr His Leu Asp Ser Phe Leu
85 90 95
Pro Ile Cys Arg Val Asn Asp Phe Glu Thr Ala Asp Ile Leu Cys Pro
100 105 110
Lys Ala Lys Arg Thr Ser Arg Phe Leu Ser Gly Ile Ile Asn Phe Ile
115 120 125
His Phe Arg Glu Ala Cys Arg Glu Thr Tyr Met Glu Phe Leu Trp Gln
130 135 140
Tyr Lys Ser Ser Ala Asp Lys Met Gln Gln Leu Asn Ala Ala His Gln
145 150 155 160
Glu Ala Leu Met Lys Leu Glu Arg Leu Asp Ser Val Pro Val Glu Glu
165 170 175
Gln Glu Glu Phe Lys Gln Leu Ser Asp Gly Ile Gln Glu Leu Gln Gln
180 185 190
Ser Leu Asn Gln Asp Phe His Gln Lys Thr Ile Val Leu Gln Glu Gly
195 200 205
Asn Ser Gln Lys Lys Ser Asn Ile Ser Glu Lys Thr Lys Arg Leu Asn
210 215 220
Glu Leu Lys Leu Ser Val Val Ser Leu Lys Glu Ile Gln Glu Ser Leu
225 230 235 240
Lys Thr Lys Ile Val Asp Ser Pro Glu Lys Leu Lys Asn Tyr Lys Glu
245 250 255
Lys Met Lys Asp Thr Val Gln Lys Leu Lys Asn Ala Arg Gln Glu Val
260 265 270
Val Glu Lys Tyr Glu Ile Tyr Gly Asp Ser Val Asp Cys Leu Pro Ser
275 280 285
Cys Gln Leu Glu Val Gln Leu Tyr Gln Lys Lys Ile Gln Asp Leu Ser
290 295 300
Asp Asn Arg Glu Lys Leu Ala Ser Ile Leu Lys Glu Ser Leu Asn Leu
305 310 315 320
Glu Asp Gln Ile Glu Ser Asp Glu Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Thr
325 330 335
Glu Glu Asn Ser Phe Lys Arg Leu Met Ile Val Lys Lys Glu Lys Leu
340 345 350
Ala Thr Ala Gln Phe Lys Ile Asn Lys Lys His Glu Asp Val Lys Gln
355 360 365
Tyr Lys Arg Thr Val Ile Glu Asp Cys Asn Lys Val Gln Glu Lys Arg
370 375 380
Gly Ala Val Tyr Glu Arg Val Thr Thr Ile Asn Gln Glu Ile Gln Lys
385 390 395 400
Ile Lys Leu Gly Ile Gln Gln Leu Lys Asp Ala Ala Glu Arg Glu Lys
405 410 415
Leu Lys Ser Gln Glu Ile Phe Leu Asn Leu Lys Thr Ala Leu Glu Lys
420 425 430
Tyr His Asp Gly Ile Glu Lys Ala Ala Glu Asp Ser Tyr Ala Lys Ile
435 440 445
Asp Glu Lys Thr Ala Glu Leu Lys Arg Lys Met Phe Lys Met Ser Thr
450 455 460
<210> 48
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 48
Asn Lys Arg Lys
1

Claims (23)

1.具有细胞毒性T细胞(CTL)诱导能力的少于15个氨基酸的肽，其包含选自以下组的氨基酸序列：
(a)选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37；以及
(b)在选自下组的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了一个、两个、或数个氨基酸的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37。
2.权利要求1的肽，其包含将选自以下(a)至(c)的一个或多个取代引入选自下组的氨基酸序列中的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37：
(a)用选自由苏氨酸和丝氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第二个氨基酸；
(b)用选自由天冬氨酸和谷氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第三个氨基酸；和
(c)用酪氨酸取代C端的氨基酸。
3.权利要求1的肽，其由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37。
4.多核苷酸，其编码权利要求1至3中任一项的肽。
5.组合物，其包含药学上可接受的载体和选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1至3中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向权利要求1至3中任一项的肽。
6.权利要求5的组合物，其是用于诱导CTL的组合物，其中所述成分是选自下组(a)至(d)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1至3中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物。
7.权利要求5的组合物，其是药物组合物。
8.权利要求7的组合物，其用于选自下组的一种或多种用途：(i)癌症治疗，(ii)癌症预防(防范(prophylaxis))和(iii)手术后癌症复发的预防(防范)。
9.权利要求7的组合物，其用于诱导针对癌症的免疫应答。
10.权利要求8或9的组合物，其中所述癌症选自下组：膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性髓性白血病(CML)、食管癌、胃癌、非小细胞肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾癌、小细胞肺癌、头颈癌、软组织肿瘤和大肠癌(大腸がん)。
11.权利要求5至10中任一项的组合物，其配制为用于对HLA-A01阳性的受试者施用。
12.诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，其包含选自下组的步骤：
(a)体外、离体或体内将APC与权利要求1至3中任一项的肽接触；和
(b)将编码权利要求1至3中任一项的肽的多核苷酸引入APC。
13.诱导CTL的方法，其包含选自下组的步骤：
(a)将CD8阳性T细胞与APC共培养，所述APC在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1至3中任一项的肽的复合物；
(b)将CD8阳性T细胞与外来体共培养，所述外来体在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1至3中任一项的肽的复合物；
(c)将多核苷酸引入CD8阳性T细胞，所述多核苷酸编码T细胞受体(TCR)的每个亚基，所述T细胞受体能够结合细胞表面上由HLA抗原呈递的权利要求1至3中任一项的肽。
14.APC，其在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1至3中任一项的肽的复合物。
15.权利要求14的APC，其通过权利要求12的方法诱导。
16.CTL，其靶向权利要求1-3中任一项的肽。
17.权利要求16的CTL，其通过权利要求13的方法诱导。
18.诱导针对癌症的免疫应答的方法，其包含向受试者施用选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1至3中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向权利要求1至3中任一项的肽。
19.治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发的方法，所述方法包括向受试者施用选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1至3中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向权利要求1至3中任一项的肽。
20.抗体，其结合权利要求1至3中任一项的肽。
21.筛选具有CTL诱导能力的肽的方法，其包含以下步骤：
(a)产生由氨基酸序列组成的候选序列，其中对由选自SEQ ID NO:1、8、10、13、25、33至35和37的氨基酸序列组成的原始氨基酸序列取代、缺失、插入和/或添加一个，两个或数个氨基酸残基；
(b)从在(a)中产生的候选序列中选择与除CDCA1外的任何已知的人基因产物不具有显著同源性(序列同一性)的候选序列；
(c)将APC与由在(b)中选择的候选序列组成的肽接触；
(d)将(c)的APC与CD8阳性T细胞接触；和
(e)选择与由原始氨基酸序列组成的肽相比，具有相等或更高的CTL诱导能力的肽。
22.乳剂，其包含一种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽、水溶性载体和油佐剂。
23.试剂盒，其包含容纳权利要求5至11中任一项的组合物的容器和容纳佐剂的容器。
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