EA005948B1 - Применение cd2-связывающего агента для избирательного снижения числа cd45ro-позитивных эффекторных т-лимфоцитов памяти в организме пациента - Google Patents

Abstract

Это изобретение относится к применению CD2-связывающего агента для избирательного снижения числа CD45RO-позитивных эффекторных Т-лимфоцитов памяти у субъекта в случае необходимости.

Description

Это изобретение относится к способам применения ингибиторов взаимодействия СП2/ЬРА-3 при лечении болезней, обусловленных наличием активированных Т-клеток у млекопитающих, включая человека. Такими болезнями являются воспалительные заболевания кишечника, псориатический артрит, ревматоидный артрит и рассеянный склероз.

Антигенпредставляющие клетки (АРС) экспрессируют на своей поверхности антиген главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II с высокой степенью плотности. Молекулы МНС класса II связывают пептиды, полученные из подвергаемого эндоцитозу антигена, и распознаются главным образом Т-лимфоцитами-хелперами. Рецептор Т-клетки, расположенный на ее поверхности, распознает антиген в виде пептидного фрагмента, связанного с молекулами на поверхности клетки, кодированными МНС (8ртшдег, Абйекюп Весер!огк оГ 1Нс Iттиηе 8у51ст. №11игс. 346, рр. 425-27 (1990)).

Помимо взаимодействия рецептора Т-клеток и МНС, происходят многочисленные взаимодействия между молекулами, экспрессированными на поверхности таких АРС, и поверхностью Т-клеток. Эти поверхностные молекулы, часто именуемые адгезивными молекулами, участвуют в выполнении ряда функций, включающих в себя межклеточную адгезию, распознавание антигена, костимулирующую передачу сигнала при активации Т-клеток и стимуляцию эффекторов Т-клеточной цитотоксичности (АбНекюп Мо1еси1ек ίη Όίαβηοδίδ апб Ттеа1теп1 оГ [пПаттаЮгу ПЦеакек. ТНе Ьапсе!, 336, рр. 1351-52 (1990)). Такая межклеточная адгезия, по-видимому, активирует пролиферацию Т-клеток в процессе иммунного ответа (НидНек е! а1., ТНе Епбо1йейа1 Се11 ак а Кеди1а!ог оГ Т-се11 Рипсбоп, Iттиηο1. Веу., 117, рр. 85-102 (1990)).

Одним способом активации Т-клеток является связывание рецепторов антигенспецифических Тклеток с комплексами пептид -МНС на поверхности антигенпредставляющих клеток, таких как макрофаги. Активация Т-клеток стимулирует пролиферацию и дифференцировку функциональных Т-клеток двух типов: клеток-хелперов, которые стимулируют пролиферацию и созревание антителопродуцирующих Влимфоцитов, и клеток-киллеров, которые лизируют клетки-мишени (В1егет е! а1., А Мопос1опа1 ЛпбЬобу !о ЬЕА-3, !Не СЭ2 Ыдапб, 8ресШса11у IттοЬ^1^ζек Ма)ог Н1к!осотрабЬ11бу Сотр1ех Рго!е1П8, Еиг. 1. Иптипо1. 19: рр. 661-65 (1989); 8рппдег Аббекюп Весер!огк оГ 1йе Iттиηе 8ук!ет, №!иге, 346, рр. 425-34 (1990)).

Существует много заболеваний, вызываемых нарушением иммунных ответов, и многие из этих заболеваний обусловлены, в частности, повышенной активацией Т-клеток. Т-клетки играют важную роль в иммунном ответе в результате взаимодействия с клетками-мишенями и антигенпредставляющими клетками. Например, уничтожение клеток-мишений, опосредованное Т-клетками, представляет собой многостадийный процесс, включающий первоначальную адгезию цитолитических Т-клеток (эффекторных клеток) с клетками-мишенями. Кроме того, Т-клетки-хелперы инициируют иммунный ответ в результате адгезии с антигенпредставляющими клетками.

Такие взаимодействия Т-клеток с клетками-мишенями и антигенпредставляющими клетками являются в высшей степени специфическими и зависят от распознавания антигена на поверхности клеткимишени или АРС одним из многочисленных рецепторов специфического антигена на поверхности Тклеток.

Взаимодействие между рецептором и антигеном Т-клеток и других клеток облегчается наличием разных белков на поверхности Т-клеток, например, антигенрецепторного комплекса СЭЛ, и дополнительных адгезивных молекул, таких как СО4, ЬРА-1, СЭ8 и СЭ2. Это взаимодействие облегчается также такими дополнительными адгезивными молекулами, как ЬРА-3, ШАМН и МНС, которые экспрессированы на поверхности клеток-мишеней и антигенпредставляющих клеток. Например, ЬРА-1 и его противорецептор ШАМН или ГСАМ^, а также СЭ2 и его противорецептор ЬРА-3 участвуют в межклеточной адгезии и активации Т-клеток. Известно, что взаимодействия ЬРА-1ДСАМ и СП2/ЬРА-3 не зависят друг от друга. Целый ряд других молекул, представленных на покоящихся Т-клетках, также участвуют в адгезии Т-клеток, включая Е2 (МГС2), УЬА-4 (СП49б), СЭ44 (Негтек, Р§р-2, ЕСМВШ) и Η19(Ν4) (см., МакдоЬа е! а1., ТНе СП2-ЬРА-3 апб ЬРА-ЫСАМ Ра!11\таук: Ве1еуапсе !о Т-се11 Весодгабоп, Iттиηο1. Тобау, 10, рр. 417-22 (1989)).

Взаимодействие между СЬ2 и ЬРА-3 плохо изучено с точки зрения повышения активности Тклеток. Недавние исследования позволяют предположить, что между СЬ2 (адгезивная молекула Тклетки) и ЬРА-3 (адгезивная молекула клетки-мишени и АРС) происходит специфическое взаимодействие, которым опосредована адгезия Т-клеток с клетками-мишенями и антигенпредставляющими клетками. Эта межклеточная адгезия инициирует функциональные реакции Т-клеток (Όιικ!ίΐ'ΐ е! а1., Рипйеб Ьутр1юсу!е Рипсбоп Аккос1а!еб Апбдеп 3 Вшбк !о СЭ2 апб Меб1а!ек Т Ьутр1юсу!е Аббекюп, 1. Ех-р. Меб., 165, рр. 677-92 (1987); 8рбпдег е! а1., ТНе Ьутр1юсу!е Рипсбоп-аккос1а!еб ЬРА-1, СО2, апб ЬРА-3 Мо1еси1ек: Се11 Аббекюп Весер!огк оГ 1йе Iттиηе 8ук!ет, Апп. Веу. Iттиηο1., 5, рр. 223-52 (1987)).

ЬРА-3, обнаруженный на поверхности целого ряда клеток, включая эритроциты человека, стал предметом многочисленных исследований, целью которых является дальнейшее изучение его роли в разных взаимодействиях Т-клеток (см., например, Кгепкку е! а1., ТНе Рипсбопа1 81дшйсапсе, ПЦбтЬибоп, апб 81гисЦ1ге оГ ЬРА-1, ЬРА-2, апб ЬРА-3: Се11 8игГасе Апбдеп Аккос1а!еб \\6Н СТЬ-Татде! Iηΐе^асбοηк. 1. Iттиηο1., 131(2), рр. 611-16 (1983); 8На\\' е! а1., Т\то АпбдепНпберепбеп! Аббекюп Ра!11\таук Икеб Ьу Ни

- 1 005948 тап Су!о!ох1с Т-се11 С1опек, Ыа!иге, 323, рр. 262-64 (1986)).

Идентифицированы две природные формы ББЛ-3. Одна форма ББЛ-3 (трансмембранный ББЛ-3) связана в клеточной мембране трансмембранным гидрофобным доменом. кДНК, кодирующая эту форму ББЛ-3. клонирована и секвенирована (см., например, Аа11пег е! а1., Рйшету 8!гис!иге оГ БутрЬосуЗе Рипс1юп-Л55ос1а1ек Ап!1деп-3 (БЕА-3), 1. Ехр. Мек., 166, рр. 923-32 (1987)). Другая форма БЕЛ-3 связана в клеточной мембране ковалентной связью с фосфатидилинозитол (Р1)-содержащим гликолипидом. Эта последняя форма получила название Р1-связанный ^ЕА-3, и кДНК, кодирующая эту форму ^ЕА-3, также клонирована и секвенирована (Аа11пег е! а1., публикация заявки РСТ АО 90/02181).

Молекула СЭ2 человека является поверхностным гликопротеином в длиной 50 кДа, экспрессированным на >95% тимоцитах и фактически на всех Т-лимфоцитах периферической крови. Биохимические анализы, выполняемые с использованием специфических моноклональных антител, позволяют предположить, что СО 2 специфичен для линии Т-клеток и присутствует на поверхности клетки в нескольких по-разному гликозилированных формах (Но^атк е! а1., А Нитап Т БутрЬосуЗе О1ГГегеп(1а(1оп Магкег Эейпек Ьу Мопос1опа1 АпкЬоФек !Ьа! В1оск Е-Кокеке Еоттакоп, 1. 1ттипо1., 126, рр. 2117-22 (1981); Вго\\'П е! а1., т Беикосу!е Туртд III, ек. МсМюЬаек ОхГогк Ишуегкйу Ргекк, рр. 110-12 (1987); 8ауте е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд апк Ехргеккюп оГ Т11 сОЫАк Реуеак а РесерЮг-Блке 8!гис!иге оп Нитап Т БутрЬосу!ек, Ргос. Ν!1. Асак. δοΐ. И8А, 84, рр. 2941-45 (1987)).

Описана последовательность гена С’Э2 человека (8еек апк АтиЕГо, Мо1еси1аг С1ошпд оГ !Ье С’Э2 Апкдеп, !Ье Т-се11 Ету1йтосу!е Ресер!ог, Ьу а Рар1к 1тпшпоке1ес!юп Ргосекиге, Ргос. Νη!1. Асак. 8сБ И8А, 84, рр. 3365-69 (1987); 8ауге е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд апк Ехргеккюп оГ Т11 с^NΛκ Ретеа1 а Ресер!ог-11ке 81тис!иге оп Нитап Т ^утр1юсуЗеκ. Ргос. №Й. Асак. 8сБ И8А, 84, рр. 2941-45 (1987)). Клоны кДНК СЭ2 позволяют предположить наличие расщепленного сигнального пептида, состоящего из 24 аминокислотных остатков, внеклеточного сегмента, состоящего из 185 остатков, трансмембранного домена, состоящего из 25 остатков, и цитоплазматической области, состоящей из 117 остатков (8ауте е! а1., см. выше (1987); 8е^е11 е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд оГ!Ье Нитап Т-БутрЬосуЗе 8ийасе С’Э2 (Т11) Апкдеп, Ргос. №11. Асак. 8сБ И8А, 83, рр. 8718-22 (1986); 8еек апк Агийо, см. выше (1987); С1ау!оп е! а1., Еиг. 1. 1ттип., 17, рр. 1367-70 (1987)). Описаны растворимые полипептиды СО2, имеющие домен связывания ЕЕА-3 (заявка РСТ АО 90/08187). Кроме того, описаны моноклональные антитела к СЭ2, например, Т82/18, Т11₁, Т11₂, Т11₃, и к ΕΡΛ-.Ι, например, Т82/9 (см., например, НидЬек е! а1., ТЬе Епко!11еПа1 Се11 ак а Реди1а!ог оГ ТСе11 Еипс!юп, 1ттипо1. Веу1е№, 117, рр. 85-102 (1990); Меиег, Ап А1!егпакуе РаИ^ау оГ Т-Се11 Аскуакоп: А Еипс!юпа1 Ро1е Гог Не 50 кО Т11 8Ьеер Егу!Ьгосу!е Ресер!ог Рто!ет, Се11, 36, рр.897-906 (1984)).

Связывание рецепторов антигенспецифических Т-клеток с комплексами пептид - МНС на поверхности антигенпредставляющих клеток вызывает образование так называемых клеток памяти, которые обычно образуются во время адаптивного иммунного ответа, требующего контактирования с антигеном и увеличения количества антигенспецифических клеток памяти. Память Т-клеток, вероятно, зависит от повторяющейся стимуляции антигеном. Т-клетки памяти усиливают авидность связывания с антигенпред-ставляющими клетками благодаря повторяющейся экспрессии СО2, ЕЕА-3 и других дополнительных адгезивных молекул. Действительно, важное фенотипическое изменение изоформы лейкоцитарного антигена СЭ45Р позволяет отличить необученные Т-клетки, экспрессирующие СО45К, от Т-клеток памяти, взаимодействующих с низкомолекулярной формой СЭ45КО.

Понимание того, что большинство, если не все, клеток памяти подвергается повторяющейся бомбардировке антигеном, позволяет предположить, что большая часть особенностей, характерных для субпопуляции СО45КО, фактически является проявлением эффекторных Т-клеток. В научной литературе все чаще появляются сведения о том, что эффекторные Т-клетки памяти СО45КО имеют непосредственное отношение к разным воспалительных заболеваниям, таким как воспалительные заболевания кишечника, включая болезнь Крона и неспецифический язвенный колит (НописЫ е! а1., 1. 1арап. 8ос. Со1о. Ргос!о1., 45: 391-393 (1992)); псориатический артрит (Уеа1е е! а1., Апп. РЬеит. Ώίκ. 53: 450-454 (1994)); ревматоидный артрит (Ми11ег е! а1. , Аи!о1ттипйу 14: 37-43 (1992); увеит (О1!а е! а1., Сигг. Еуе Рек., 15: 299-306 (1996), нефрит (Рокгидпех-Роегех е! а1., Ат. 1. №рйтоБ, 15: 386-391 (1995); и рассеянный склероз (Стиаап е! а1., С1ш Э1ад. БаЬ. 1ттипо1., 2: 249-252 (1995), БеЬтапп е! а1., С1ш. 1ттипо1. 1ттипора1Ьо1., 85: 202-209 (Ь997), Ми11ег е! а1., Аи!о1ттипйу 14: 37-43 (1992). От е! а1., 1. С1т. 1ттипо1., 13: 152-161 (1993).

В связи с возможным участием этих эффекторных Т-лимфоцитов памяти в патогенезе существует необходимость создания усовершенствованных способов модуляции этих клеток у субъектов, страдающих такими заболеваниями.

Настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения заболеваний, обусловленных инфильтрацией эффекторных Т-лимфоцитов памяти в какой-либо орган млекопитающего. При осуществлении этих способов нуждающемуся субъекту вводят СО2-связывающий агент, способный модулировать количество и/или распределение зффекторных Т-лимфоцитов памяти. Способы согласно изобретению превосходят ранее известные методы лечения этих заболеваний по многим причинам, в частности, потому, что эти способы являются более избирательными, и следовательно, менее иммуносупрессивными по сравнению с существующими методами лечения и характеризуются меньшей общей токсич

- 2 005948 ностью.

В соответствии со способом согласно настоящему изобретению можно использовать любую молекулу, которая является СБ2-связывающим агентом. К таким агентам относятся молекулы или другие химические частицы, которые модулируют взаимодействие СБ2/БЕА-3. Указанный агент предпочтительно выбирают из группы, включающей в себя гомологи антител против ЬЕА-3, гомологи антител против СБ2, растворимые полипептиды ЬЕЛ-3, растворимые полипептиды СБ2, агенты, имитирующие СБ2 или ЬЕЛ-3 (в частности, мелкие органические молекулы), и их производные.

Одним объектом данного изобретения является способ избирательной модуляции эффекторных Тлимфоцитов памяти у субъекта, нуждающегося в этом, который включает в себя введение указанному субъекту эффективного количества СБ2-связывающего агента. Т-лимфоциты памяти могут проникать в орган-мишень этого субъекта. Эффекторные Т-лимфоциты памяти предпочтительно являются Тлимфоцитами СБ45ПО. СБ 2-связывающий агент выбирают из группы, включающей в себя гомологи антител против ЬЕЛ-3, гомологи антител против СБ2, растворимые полипептиды ЬЕЛ-3, растворимые полипептиды СБ2, агенты, имитирующие СБ2, и агенты, имитирующие ЬЕЛ-3. Другой способ согласно изобретению относится к лечению заболевания, обусловленного эффекторными Т-лимфоцитами памяти, участвующими в патогенезе, который включает в себя введение нуждающемуся субъекту эффективного количества СБ2-связывающего агента. Указанное заболевание относится к группе, включающей в себя псориатический артрит, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, атопический дерматит, увеит, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит и Т-клеточную лимфому кожи.

Другим способом согласно изобретению является способ модуляции эффекторных Т-лимфоцитов памяти у млекопитающего, применяемый в том случае, когда в каком-либо органе млекопитающего находятся инфильтрирующие эффекторные Т-лимфоциты памяти. Этот способ включает в себя введение млекопитающему СБ2-связывающего агента в количестве, достаточном для избирательной модуляции эффекторных Т-лимфоцитов памяти в указанном органе. При этом млекопитающее страдает заболеванием, выбираемым из группы, включающей в себя псориатический артрит, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, атопический дерматит, увеит, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит и Т-клеточную лимфому кожи.

Композиции согласно изобретению содержат популяцию эффекторных Т-лимфоцитов памяти, полученных у млекопитающего, страдающего заболеванием, обусловленным присутствием инфильтрирующих зффекторных Т-лимфоцитов памяти в каком-либо органе данного млекопитающего, в сочетании с СБ2-связывающим агентом.

На фиг. 1 изображен график, на котором показано избирательное сокращение количества эффекторных Т-клеток памяти по сравнению с необученными Т-клетками у пациентов, страдающих псориазом, при лечении СБ2-связывающим агентом, ЬЕА3-Т1Р. Горизонтальным прямоугольником, расположенным над осью X, обозначена продолжительность лечения, которое было прекращено примерно через 80 дней. Кривые соответствуют среднему подсчету лимфоцитов у 57 пациентов в каждой лечебной группе. На этом графике показаны статистически значимые лечебные и временные результаты воздействия на Т-клетки памяти (СБ45 ПО+), а не на необученные Т-клетки (СБ45 КА+). Подсчеты Т-клеток при лечении разными СБ2-связывающими агентами свидетельствуют о сокращении их количества, приближающегося к некоторой относительно постоянной величине в течение 80-дневного периода введения. После окончания лечения количество эффекторных Т-клеток памяти начинает увеличиваться.

Определения.

В используемом здесь значении термины эффекторный Т-лимфоцит, эффекторные Т-клетки, эффекторный Т-лимфоцит/клетка памяти или подобные термины имеют взаимозаменяемое значение и относятся к Т-лимфоцитам, подвергнутым воздействию антигена (т.е. это клетки, которые не являются необученными). В частности, эти термины означают Т-лимфоциты СБ45ПО в отличие от необученных Т-лимфоцитов СБ45КА.

В используемом здесь значении термин СБ2 означает полипептид СБ2, связывающийся с природным полипептидом ЬЕА-3 и кодируемый (а) природной последовательностью ДНК СБ2 млекопитающего (например, 8ЕО 1Б № 5); (Ь) последовательностью ДНК, вырожденной относительно природной последовательности ДНК СБ2; или (с) последовательностью ДНК, гибридизирующейся с одной из вышеуказанных последовательностей ДНК при температуре около 20-27°С ниже температуры плавления и в присутствии 1 М раствора хлорида натрия.

В используемом здесь значении термин ЬЕА-3 означает полипептид ЬЕА-3, связывающийся с природным полипептидом СБ2 и кодируемый (а) природной последовательностью ДНК ЬЕА-3 млекопитающего (например, 8ЕО 1Б № 1 или 8ЕО 1Б № 3); (Ь) последовательностью ДНК, вырожденной относительно природной последовательности ДНК ЬЕА-3; или (с) последовательностью ДНК, гибридизирующейся с одной из вышеуказанных последовательностей ДНК в стандартных условиях гибридизации, описанных ниже.

В используемом здесь значении термин СБ2-связывающий агент означает молекулу, соединение или другую химическую частицу, которая модулирует взаимодействие СБ2/БЕА3 и/или передачу сигна

- 3 005948 ла СЭ2. Этот термин относится к гомологам антител против ЬЕЛ-3, гомологам антител против СЭ2. растворимым полипептидам ЬЕЛ-3, растворимым полипептидам СЭ2. агентам, имитирующим СЭ2 или ЬЕЛ-3, и их производным. Термин модулирует означает, что СЭ2-связывающий агент изменяет (предпочтительно уменьшает) интенсивность передачи сигнала СЭ2 и/или изменяет способность СЭ2 связываться с ЬЕЛ3, хотя увеличение указанной интенсивности и/или способности связываться также входит в определение этого термина. СЭ2-связывающие агенты модулируют также эффекторные Т-лимфоциты памяти (то есть СЭ45КО), и в этом смысле термин модулировать означает, что связывающие агенты изменяют количество и/или распределение эффекторных Т-лимфоцитов памяти у субъекта, принимающего СЭ2-связывающие агенты. В соответствии с предпочтительными способами связывающие агенты избирательно модулируют такие эффекторные Т-лимфоциты памяти, и это означает, что эффекторные Т-лимфоциты памяти модулированы по сравнению с необученными Т-лимфоцитами (например, Тлимфоцитами СЭ45ВЛ).

В используемом здесь значении термин растворимый полипептид ЬЕЛ-3 или растворимый полипептид СЭ2 означает полипептид ЬЕЛ-3 или СЭ2, не способный связываться с мембраной.

Такими растворимыми полипептидами являются, например, полипептиды СЭ2 и ЬЕЛ-3, у которых отсутствует значительная часть мембранного домена, предназначенного для связывания полипептида, или которые модифицированы так, что мембранный домен является нефункциональным. В используемом здесь значении растворимые полипептиды ЬЕЛ-3 включают в себя непроцессированный или процессированный (например, с внутренними делециями) Р1-связанный ЬЕЛ-3.

В используемом здесь значении гомолог антитела означает белок, содержащий один или несколько полипептидов, выбираемых из легких цепей иммуноглобулина, тяжелых цепей иммуноглобулина и их антигенсвязывающих фрагментов, способных связываться с одним или несколькими антигенами. Составляющие полипептиды гомолога антитела, состоящего более чем из одного полипептида, могут быть необязательно связаны дисульфидной связью или какой-либо другой ковалентной поперечной связью. Гомологи антител включают в себя интактные иммуноглобулины типов 1дЛ, 1дС, 1дЕ, 1дО, 1дМ (а также их подтипы), в которых легкие цепи иммуноглобулина могут относиться к типам каппа или лямбда. Гомологи антител включают в себя также части интактных иммуноглобулинов, которые сохраняют антигенсвязывающую специфичность, например, ЕаЬ-фрагменты, ЕаЬ'-фрагменты, Е(аЬ')2-фрагменты, Е(у)фрагменты, мономеры или димеры с тяжелыми цепями, мономеры или димеры с легкими цепями, димеры, состоящие из одной тяжелой и одной легкой цепи, и тому подобные.

В используемом здесь значении термин гомолог очеловеченного рекомбинантного антитела означает гомолог антитела, полученный методом рекомбинантных ДНК, в котором некоторые или все аминокислоты легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина человека, которые не нужны для связывания антигена, заменены соответствующими аминокислотами из легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина млекопитающего, не являющегося человеком.

В используемом здесь значении термин гомолог химерного рекомбинантного антитела означает гомолог антитела, полученный методом рекомбинантных ДНК, в котором все или часть шарнирных и константных областей легкой цепи, тяжелой цепи или обеих цепей иммуноглобулина заменены соответствующими областями из другой легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина.

Способы согласно изобретению можно использовать для лечения любого млекопитающего, предпочтительно человека.

Термин аминокислота означает мономерное звено пептида, полипептида или белка. В природных пептидах, полипептидах и белках обнаружено двадцать аминокислот, все из которых являются Ьизомерами. Этот термин относится также к аналогам аминокислот и Ό-изомерам белковых аминокислот и их аналогам.

Термин белок означает любой полимер, состоящий в основном из любых 20 аминокислот. Хотя термин полипептид часто используется для обозначения относительно длинных полипептидов и термин пептид часто используется для обозначения коротких полипептидов, значения этих терминов иногда перекрываются один другим. Термин белок в используемом здесь значении означает пептиды, белки и полипептиды за исключением особо оговоренных случаев.

Термин слияние означает колинейную связь двух или более белков или их фрагментов, образуемую остовами отдельных пептидов благодаря генетической экспрессии полинуклеотидной молекулы, кодирующей эти белки, или при помощи методов синтеза белков. Желательно, чтобы белки или их фрагменты были получены из разных источников. Так, предпочтительные слитые белки включают в себя СЭ2-связывающий агент, представляющий собой белок или фрагмент, ковалентно связанный со второй частью, которая является другим СЭ2-связывающим агентом или вообще не является СЭ2-связывающим агентом. В частности, термин слияние белка СЭ2-связывающего агента/1д означает получение белка, содержащего СЭ2-связывающий агент согласно изобретению или его фрагмент, связанный с Ν-концом цепи иммуноглобулина, в котором часть Ν-конца иммуноглобулина заменена СЭ2-связывающим агентом.

Термин мутант означает любое изменение в генетическом материале организма, в частности, любое изменение (т.е. делецию, замену, присоединение или изменение) в полинуклеотидной последова

- 4 005948 тельности дикого типа или любое изменение в белке дикого типа.

Термин стандартные условия гибридизации означает, что используемая соль и температурные условия эквивалентны использованию 0,5-5-кратного объема раствора хлорида и цитрата натрия (88С) и температуры, равной 65°С, для гибридизации и промывки. Таким образом, термин стандартные условия гибридизации в используемом здесь значении является рабочим определением и включает в себя целый ряд условий гибридизации. Более строгие условия могут, например, включать в себя гибридизацию с использованием буфера для скрининга бляшек (0,2% поливинил-пирролидона, 0,2% Ρίεοίΐ 400; 0,2% бычьего сывороточного альбумина, 50 мМ трис-НС1 (рН 7,5); 1 М ЫаС1; 0,1% пирофосфата натрия; 1% 8Ό8); 10% сульфата декстрана и 100 мкг/мл денатурированной, обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося, при 65°С в течение 12-20 ч и промывку 75 мМ ЫаС1/7,5 мМ цитрата натрия (0,5 х 88С)/1% 8Ό8 при 65°С. Менее строгие условия могут, например, включать в себя гибридизацию с использованием буфера для скрининга бляшек, 10% сульфата декстрана и 110 мкг/мл денатурированной, обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося, при 55°С в течение 12-20 ч и промывку 300 мМ ЫаС1/30 мМ цитрата натрия (2,0 х 88С)/1% 8Ό8 при 55°С. См. также Сштеп! РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг Βίοίοβν. Ιοίιη \УПеу & 8ои5, 1пс., Ыете ΥογΚ 8ес!юп§ 6.3.1-6.3.6 (1989).

Термин контролирующая экспрессию последовательность означает последовательность полинуклеотидов, которая контролирует и регулирует экспрессию генов, будучи функционально связанной с этими генами.

Термин функционально связанная означает, что полинуклеотидная последовательность (ДНК, РНК) функционально связана с контролирующей экспрессию последовательностью, когда контролирующая экспрессию последовательность контролирует или регулирует транскрипцию и трансляцию указанной полинуклеотидной последовательности. Термин функционально связанная включает в себя наличие соответствующего инициирующего сигнала (например, АТС) перед экспрессируемой полинуклеотидной последовательностью и сохранение правильной рамки считывания, обеспечивающей экспрессию полинуклеотидной последовательности под контролем контролирующей экспрессию последовательности и продуцирование требуемого полипептида, кодируемого указанной полинуклеотидной последовательностью.

Термин экспрессирующий вектор означает полинуклеотид, такой как ДНК-содержащая плазмида или фаг (наряду с другими типичными примерами), который обеспечивает экспрессию по крайней мере одного гена при введении экспрессирующего вектора в клетку-хозяина. Этот вектор может реплицироваться или не реплицироваться в клетке.

Термин выделенный (используемый взаимозаменяемо с термином по существу чистый) применительно к нуклеиновой кислоте, то есть полинуклеотидным последовательностям, кодирующим полипептиды, означает полинуклеотид РНК или ДНК, часть геномного полинуклеотида, кДНК или синтетический полинуклеотид, который благодаря своему происхождению или соответствующей обработке (ί) не ассоциирован со всем полинуклеотидом, с которым он ассоциирован в природе (например, присутствует в клетке-хозяине в виде экспрессирующего вектора или его части); (ίί) связан с нуклеиновой кислотой или другой химической частицей, отличающейся от той, с которой он связан в природе; или (ίίί) не встречается в природе. Термин выделенный далее означает полинуклеотидную последовательность, которая: (ί) амплифицирована ίη νί!το, например, при помощи полимеразной цепной реакции (РСК.); (ίί) химически синтезирована; (ίίί) получена методом рекомбинантных ДНК путем клонирования; или (ίν) очищена расщеплением и разделением в геле.

Термин по существу чистая нуклеиновая кислота означает нуклеиновую кислоту, которая не является смежной с одной или обеими кодирующими последовательностями, с которыми она обычно соседствует в природном геноме организма, из которого выделена эта нуклеиновая кислота.

Термин выделенный (используемый взаимозаменяемо с термином 'по существу чистый) применительно к полипептидам означает полипептид или его часть, который благодаря своему происхождению или соответствующей обработке (ί) присутствует в клетке-хозяине в виде продукта экспрессии части экспрессирующего вектора; (ίί) связан с белком или другой химической частицей, отличающейся от той, с которой он связан в природе; или (ίίί) не встречается в природе. Термин выделенный далее означает белок, который (ί) химически синтезирован; (ίί) экспрессирован в клетке-хозяине и очищен от ассоциированных белков. Этот термин обычно означает полипептид, отделенный от других белков и нуклеиновых кислот, с которыми он существует в природе. Этот полипептид предпочтительно отделен также от таких веществ, как антитела или гелевые матрицы (полиакриламид), которые используются для его очистки.

Термин гетерологичный промотор в используемом здесь значении означает промотор, который в природе не ассоциирован с геном или очищенной нуклеиновой кислотой.

Термин гомологичный в используемом здесь значении является синонимом термина идентичный и означает сходство последовательностей у двух полипептидов, молекул или двух нуклеиновых кислот. Когда в одинаковых положениях обеих сравниваемых последовательностей находятся одинаковые основания или мономерные субъединицы аминокислоты (например, когда в одинаковых положениях

- 5 005948 обеих молекул ДНК находится аденин или в одинаковых положениях обоих полипептидов находится лизин), тогда эти молекулы являются гомологичными в данном положении. Процентное значение гомологии между двумя последовательностями определяется количеством согласующихся или гомологичных положений, имеющихся в обеих последовательностях, деленным на число сравниваемых положений и умноженным на 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях являются согласованными или гомологичными, то эти две последовательности гомологичны на 60%. В качестве примера можно отметить, что последовательности ДНК СТОАСТ и САССТТ характеризуются 50% гомологией (согласуются 3 из 6 имеющихся в них положений) . Как правило, сравнение производят после упорядочения двух последовательностей для достижения максимальной гомологии. Такое упорядочение можно произвести, например, методом Нидлмана и др. (№еб1етаи е! а1., 1. Μοί. ΒίοΙ., 48: 443-453 (1970) с использованием компьютерных программ, таких как программа А1щп (ΩΝΑκΙαΓ. 1пс.). Гомологичные последовательности имеют идентичные или подобные аминокислотные остатки, где подобные остатки являются консервативными заменами или допустимыми точковыми мутациями соответствующих аминокислотных остатков в упорядоченной эталонной последовательности. В связи с этим термин консервативная замена остатка в эталонной последовательности означает такую замену, которая физически или функционально подобна соответствующим эталонным остаткам, например, имеющим одинаковый размер, форму, электрический заряд, химические свойства, включая способность образовывать ковалентные или водородные связи, и тому подобные. Особенно предпочтительными консервативными заменами являются замены, удовлетворяющие критерию, установленному для приемлемой точковой мутации Дейхоффом и др. (ОауйоГГе! а1., 5: А!1ак оГ Рто!ет 8ес.|иепсе апб 8!тис!иге, 5: 8ирр1. 3, сйар!ет 22: 354-352, Να!. Вютеб. Век. Еоипбабоп, ^акЫпд!оп, Э.С. (1978).

Термины гомология и идентичность означают сходство между двумя полипептидыми последовательностями, выявляемое в результате более строгого сравнения. Гомологию и идентичность можно установить, сравнивая положения в обеих последовательностях, которые могут быть упорядочены в целях сравнения. Когда в одинаковых положениях сравниваемых последовательностей находятся одинаковые аминокислотные остатки, тогда эти полипептиды можно считать идентичными в этом положении; когда эквивалентные сайты занимают одинаковые аминокислоты (например, идентичные) или подобные аминокислоты (например, подобные в пространственном и/или электронном отношении), тогда эти молекулы можно считать гомологичными в этом положении. Процентное значение гомологии или идентичности между последовательностями определяется количеством согласующихся или гомологичных положений, имеющихся в этих последовательностях. Неродственная или негомологичная последовательность характеризуется менее чем 40% идентичностью, предпочтительно менее чем 25% идентичностью, с последовательностью аминокислотных остатков согласно изобретению.

Можно использовать разные алгоритмы и/или программы упорядочения, включая ЕА8ТА, ВЬА8Т или ΕΝΓΚΕΖ. ЕА8ТА и ВЬА8Т являются частью пакета программ для анализа последовательности ОСО (Висконсинский Университет, Мадисон, шт. Висконсин) и могут использоваться с установками по умолчанию. ΕΝΊΚΕΖ можно приобрести в Национальном центре биотехнологической информации, Национальной медицинской библиотеке, Национальном институте здравоохранения, Бетеста, шт. Мэрилэнд. В одном варианте осуществления изобретения процентное значение идентичности двух последовательностей можно определить при помощи программы ОСО с массой разрыва, равной 1, для чего каждый разрыв аминокислоты взвешивают, как если бы он был единственным несоответствием аминокислоты или нуклеотида в двух последовательностях.

Термины пептид (пептиды), белок (белки) и полипептид (полипептиды) использованы в данном описании во взаимозаменяемом значении. Термины полинуклеотидная последовательность и нуклеотидная последовательность использованы здесь также во взаимозаменяемом значении.

Молекулу согласно изобретению используют в эффективном количестве, то есть в количестве, которое обеспечивает достижение положительного результата или ослабление симптомов подлежащего лечению заболевания.

Термин полимер означает более крупную молекулу, состоящую из нескольких более мелких структурных единиц, именуемых мономерами, которые связаны друг с другом любыми возможными способами. Когда для создания более крупной молекулы используется только один вид мономера, полученный продукт именуется гомополимером, и этот термин имеет взаимозаменяемое значение с термином полимер. Если цепи полимера состоят из нескольких разных мономеров, полученное вещество имеет общее название гетерополимер. Полимерная часть, к которой присоединяют СО2-связывающий агент, фрагмент или вариант, предпочтительно является полиалкиленгликолем, но для этой цели можно использовать остов любого полимера, наиболее предпочтительно водорастворимые, нетоксичные и неиммуногенные полимеры.

За исключением особо оговоренных случаев, при осуществлении настоящего изобретения используют обычные методы клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК, химии белков и иммунологии, которые хорошо известны в этой области. Такие методы описаны в научной литературе. См., например, Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2^пб ебйюп (8атЬтоок, Етйксй апб Машабк, ебк.), Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, 1989; ΌΝΑ С1ошпд,

- 6 005948

Уо1итек I апб II (Ό.Ν. С1оуег, ей), 1985; ОКдопискокйе 8уп!йекк (М.1. Сай, ей.), 1984; патент США № 4683195 (МиШк е! а1.); №с1ек Ас1й НуЬпй|/а1кп (Β.Ό. Натек апй 8.1. Шддшк, ейк.), 1984; Тгапкспркоп апй Тгапк1айоп (Β.Ό. Натек апй 8.1. Ηί§§ίηκ. ейк.), 1984; СиНиге о! Ашта1 Се11к (К.1. РгекЬпеу, ей) , А1ап В. Ыкк. 1пс., 1987; 1ттоЫ1|/ей Се11к апй Епхутек. 1КЬ Ргекк, 1986; А РгасГка1 Сшйе 1о Мо1еси1аг С1ошпд (Β. РегЬаТ), 1984; МеГйойк ш Епхутокду, Уо1итек 154 апй 155 (\Уи е1 а1., ейк), Асайетк Ргекк, Νον Уогк; Сепе ТгапкГег Уес1огк Гог Маттакап Се11к (кН. МШег апй М.Р.Са1ок, ейк.), 1987, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу; 1ттипосйетка1 МеГйойк ш Се11 апй Мо1еси1аг Вю1оду (Мауег апк ^а1кег, ейк.), Асайетк Ргекк, Ьопйоп, 1987; НапйЬоок оГ Ехрептеп! 1ттипо1оду, Уо1итек 1-1У (Э.М. \Уей апй С.С. В1аск\\'е1Г ейк.), 1986; Машри1аГшд Не Мойке ЕтЬгуо, Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк, 1986.

Не желая связывать себя какой-либо теорией, авторы данного изобретения считают, что СЭ2связывающие агенты, используемые в соответствии со способами согласно изобретению, оказывают профилактическое и терапевтическое действие при лечении вышеуказанных заболеваний благодаря тому, что они модулируют взаимодействие ЬРА3/СЭ2 и/или передачу сигнала СЭ2, вследствие чего наряду с прочим подавляется пролиферация и активация Т-клеток и, в частности, изменяется число и/или распределение эффекторных Т-лимфоцитов памяти.

Авторы данного изобретения считают, что заболевания вышеописанного типа возникают вследствие такой пролиферации и активации Т-клеток. Авторы данного изобретения полагают, что способы согласно изобретению превосходят ранее известные методы лечения этих заболеваний по ряду причин, в том числе благодаря подавлению антигенспецифических взаимодействий всех имеющихся антигенов, подавлению активации Т-клеток, отсутствию общей иммуносупрессии и, возможно, индукции толерантности. В частности, авторы данного изобретения считают, что применение способов согласно изобретению позволит более целенаправленно воздействовать на Т-клетки на начальной стадии поражения, не влияя на эффекторные механизмы, опосредованные полиморфноядерными лейкоцитами или макрофагами. Поэтому пациент будет менее восприимчив к инфекциям, чем при использовании стероидов или других иммуносупрессивных средств широкого спектра действия. Таким образом, рассматриваемые способы подавления активации Т-клеток оказывают профилактическое и лечебное действие на указанные кожные заболевания.

СП2-связывающие агенты

СО2-связывающие агенты, используемые при осуществлении способов согласно изобретению, обладают только им присущими свойствами, а именно способностью модулировать передачу сигнала СЭ2, изменять и предпочтительно подавлять взаимодействие СО2/ЬРА-3. Данный СО2-связывающий агент способен выполнять обе эти функции. Такие агенты включают в себя гомологи антител против ЬРА-3, гомологи антител против СЭ2, растворимые полипептиды ЬРА-3, растворимые полипептиды СЭ2, агенты, имитирующие ЬРА-3 и СЭ2, и их производные. Предпочтительными СО2-связывающими агентами являются растворимые полипептиды СЭ2 и ЬРА-3, гомологи антител против СО 2 и агенты, имитирующие ЬРА-3 и СЭ2.

Возможность применения при осуществлении способов согласно изобретению конкретных растворимых полипептидов СО2, растворимых полипептидов ЬРА-3, гомологов антител против ЬРА-3, гомологов антител против СО2 или агентов, имитирующих СО2 и ЬРА-3, можно определить, анализируя их способность модулировать взаимодействие ЬРА-3/СО2. Эту способность можно определить при помощи простого анализа связывания клеток, который позволяет производить визуальную (под микроскопом) оценку способности предполагаемого СО2-связывающего агента подавлять взаимодействие между ЬРА3 и СЭ2 на клетках, имеющих эти молекулы. Клетки 1шка1 предпочтительны в качестве субстрата для СО2+ и эритроциты овцы или клетки 1Υ человека предпочтительны в качестве субстрата для ЬРА-3+. Характеристики связывания растворимых полипептидов, гомологов антител и миметических агентов, пригодных для данного изобретения, можно исследовать несколькими известными методами, такими как мечение радиоактивными изотопами гомолога антитела, полипептида или агента (например, 358 или 1251) и последующее контактирование меченого полипептида, миметического агента или гомолога антитела с клетками СО2+ или ЬРА-3+. Характеристики связывания можно также исследовать, используя соответствующее вторичное антитело, меченное ферментом. Можно также использовать методы конкурентного розеткообразования, описанные Сидом и др. (8еей е! а1., Ргос. №И. Асай. 8ск И8А, 84, рр. 336569 (1987).

А. Гомологи антител против ЬРА-3 и СЭ2.

При осуществлении способов согласно изобретению можно использовать многие типы гомологов антител против ЬРА-3 или СЭ2. К ним относятся моноклональные антитела, рекомбинантные антитела, химерные рекомбинантные антитела, очеловеченные рекомбинантные антитела, а также антигенсвязывающие части вышеуказанных антител.

Среди гомологов антител против ЬРА-3 предпочтительными являются моноклональные антитела против ЬРА-3. Более предпочтительным является моноклональное антитело против ЬРА-3, продуцируемое гибридомой, выбираемой из группы гибридом с №№ доступа АТСС НВ 10693 (1Е6), АТСС НВ 10694 (НС-1В11), АТСС НВ 10695 (7А6) и АТСС НВ 10696 (8В8), или моноклональное антитело, известное как Т82/9 (8апс11ех-Майпй е! а1., ТНгее 01к(1пс1 АпЦдепк Аккоаакй νίΐΗ Нитап Т-Ьутр1юсу1е

- 7 005948

Меб1а!еб Су!о1у818: ЬЕА-1, ЬЕА-2 апб ЬЕА-3, Ргос. ЫаО. Асаб. 8οΐ. И8А, 79, рр. 7489-93 (1982)). Моноклональное антитело против ЬЕЛ-3 наиболее предпочтительно продуцируют гибридомой, выбираемой из группы гибридом с №№ доступа АТСС НВ 10695 (7А6) и АТСС НВ 10693 (ΙΕ6).

Среди гомологов антител против СЭ2 предпочтительными являются моноклональные антитела против СЭ2, такие как моноклональные антитела против СЭ2, известные как антидетерминантные антитела Т11, включая Т82/18 (8апс11ех-Мабпб е! а1., Ынее 01зНпс1 АШщещ Аббос1а!еб \νί11ι Нитап ТЬутрйосу!е-Меб1а!еб СуЮЕъЕ: ЬЕЛ-1, ЬЕЛ-2 апб ЬЕЛ-3, Ргос. №111. Асаб. 8сг И8Л, 79, рр. 7489-93 (1982)).

Технология продуцирования моноклональных антител хорошо известна. Ее можно коротко охарактеризовать следующим образом: иммортализованную линию клеток (обычно миеломных клеток) подвергают слиянию с лимфоцитами (обычно спленоцитами), полученными у млекопитающего, иммунизированного препаратом, содержащим данный антитен, и из культуральных супернатантов полученных клеток гибридомы выделяют антитела против данного антигена. См. КоЫег е! а1., ЫаШге, Сопбпиоиб Си1!игеб о£ Еизеб Се11б 8есгебпд АпбЬобу о£ Ргебейпеб 8ресШсйу, 256, рр. 495-97 (1975). Полезными иммуногенами в соответствии с целями данного изобретения являются СЭ2- или ЬЕЛ-3-содержащие клетки, а также бесклеточные препараты, содержащие ЬЕЛ-3, СЭ2 или их фрагменты, связывающиеся с противорецепторами (например, фрагменты СЬ2. которые связываются с ЬЕЛ-3, или фрагменты ЬЕЛ-3, которые связываются с СЭ2).

Иммунизацию можно производить стандартными методами. Величина однократной дозы и схема иммунизации зависят от вида иммунизируемого млекопитающего, его иммунного статуса, массы тела и т.д. У иммунизированных млекопитающих обычно берут кровь, и в каждой пробе крови исследуют сыворотку на наличие определенных антител при помощи приемлемых методов анализа. Например, полезные антитела против ЬЕЛ-3 или СЭ2 можно идентифицировать, исследуя способность иммунной сыворотки блокировать перестройку клеток 1игка! под действием эритроцитов овцы благодаря наличию ЬЕА3 и СЭ2 соответственно на поверхностях этих клеток. Лимфоциты, используемые для продуцирования клеток гибридомы, обычно выделяют из иммунизированных млекопитающих, сыворотка которых дала положительный результат на наличие требуемых антител при выполнении таких методов анализа.

Иммортализованную линию клеток (например, линию миеломных клеток) обычно выделяют у того же вида млекопитающих, что и лимфоциты. Предпочтительными иммортализованными линиями клеток являются линии миеломных клеток мыши, которые чувствительны к культуральной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда НАТ). НАТ-чувствительные миеломные клетки мыши обычно подвергают слиянию со спленоцитами мыши, используя полиэтиленгликоль (РЕС) 3350. Клетки гибридомы, полученные в результате слияния, отбирают, используя среду НАТ, которая уничтожает неслитые и непродуктивно слитые миеломные клетки (неслитые спленоциты погибают через несколько дней, поскольку они не трансформированы). Гибридомы, продуцирующие требуемое антитело, обнаруживают, исследуя супернатанты культуры гибридомы, например, в отношении способности связываться с соответствующими противорецептором или способности блокировать адгезию клеток 1шка! с эритроцитами овцы. Для обеспечения моноклональности субкультуры гибридом обычно субклонируют с ограниченным разведением.

Чтобы получить моноклональные антитела против ЬЕА-3 или СЭ2, клетки гибридомы, давшие положительный результат при выполнении таких анализов, культивируют в питательной среде в условиях и в течение времени, необходимых для секреции клетками гибридомы моноклональных антител в культуральную среду. Методы получения культуры ткани и культуральных сред, приемлемых для клеток гибридомы, хорошо известны. Супернатант кондиционированной культуры гибридомы собирают и требуемые антитела далее необязательно очищают хорошо известными методами.

Альтернативно требуемое антитело можно получить, инъецируя клетки гибридомы в брюшную полость мыши, примированной пристаном. Клетки гибридомы пролиферируют в брюшной полости, секретируя антитело, которое накапливается в виде асцитной жидкости. Антитело собирают, удаляя асцитную жидкость из брюшной полости шприцем.

Гомологи антител против СЭ2 и ЬЕА-3, пригодные для настоящего изобретения, могут быть также рекомбинантными антителами, продуцируемыми клетками-хозяевами, трансформированными ДНК, кодирующей легкие и тяжелые цепи иммуноглобулина требуемого антитела. Рекомбинантные антитела можно получить известными методами рекомбинантных ДНК. См., например, патент США № 4816397, который включен в это описание изобретения в качестве ссылки. Например, рекомбинантные антитела можно получить, клонируя кДНК или геномную ДНК, кодирующую легкие и тяжелые цепи иммуноглобулина требуемого антитела из клетки гибридомы, которая продуцирует гомолог антитела, пригодный для данного изобретения. кДНК или геномную ДНК, кодирующую эти полипептиды, затем вводят в экспрессирующие векторы так, чтобы оба гена были функционально связаны с их собственными транскрипционными и трансляционными контролирующими экспрессию последовательностями. Экспрессирующий вектор и контролирующие экспрессию последовательности выбирают с учетом их совместимости с используемой экспрессирующей клеткой-хозяином. Оба гена обычно вводят в один и тот же экспрессирующий вектор. Можно использовать прокариотические или эукариотические клетки-хозяева.

- 8 005948

Эукариотические клетки используют для экспрессии потому, что такие клетки гораздо лучше, чем прокариотические клетки, поддаются сборке и секретируют иммунологически активное антитело с правильно уложенной цепью. Однако любое продуцируемое антитело, которое является инертным вследствие неправильной укладки цепи, можно ренатурировать хорошо известными методами (К1ш аиб Ва1бтеш, 8рссШс 1п1сгтсШа1с5 ίη Шс Ροϊάίη^ Яеасйоик οί 8ша11 РгоЮпъ апб 1йс Мссйапщш οί Рго1сш Ροϊάίη^. Апп. Неу. ВюсНст.. 51, рр. 459-89 (1982)). Клетки-хозяева могут продуцировать части интактных антител, такие как димеры с легкой или тяжелой цепью, которые также являются гомологами антител согласно изобретению.

Следует отметить, что при осуществлении настоящего изобретения можно использовать варианты вышеуказанного метода. Например, можно трансформировать клетку-хозяина при помощи ДНК, кодирующей легкую или тяжелую цепь (но не обе цепи) гомолога антитела. Можно также использовать метод рекомбинантных ДНК для удаления части или всей ДНК, кодирующей одну или обе легкие и тяжелые цепи, которая является необязательной для связывания СБ2 или ЬРА-3 с противорецептором. При осуществлении способов согласно изобретению можно использовать молекулы, экспрессированные из молекул процессированной ДНК. Кроме того, могут быть получены бифункциональные антитела, в которых одни тяжелые и легкие цепи являются гомологами антител против СБ2 или ЬРА-3 и другие тяжелые и легкие цепи специфичны для антигена, не являющегося СБ2 или ЬРА-3 либо другим эпитопом СБ2 или ЬРА-3.

Гомологи химерных рекомбинантных антител против ЬРА-3 или СБ2 можно получить, трансформируя клетку-хозяина приемлемым экспрессирующим вектором, содержащим ДНК, кодирующую требуемые легкие и тяжелые цепи иммуноглобулина, в которых вся или часть ДНК, кодирующей шарнирные и константные области тяжелой и/или легкой цепи, заменена ДНК из соответствующей области легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина других видов. Когда исходное рекомбинантное антитело не принадлежит человеку и СБ2-связывающий агент предполагается вводить человеку, желательно произвести замену соответствующими последовательностями человека. Типичное химерное рекомбинантное антитело имеет вариабельные области [иммуноглобулина] мыши и шарнирные и константные области [иммуноглобулина] человека. См, например, патент США № 4816397 и ΜοΓΠδοπ с1 а1., СЫшспс Нишап А πηδούν ΜοΚαιΚδ: Μοιι^ Апйдсп-Вшбшд Βοπιππίδ \νί(1ι Нишап СопЧагИ Рсдюп ^οта^И5. Ргос. Νπ11. Асаб. 8сг И8А, 81, рр. 6851-55 (1984). Очеловеченные рекомбинантные антитела против ЬРА-3 или СБ2 можно получить, трансформируя клетку-хозяина приемлемым экспрессирующим вектором, содержащим ДНК, кодирующую требуемые легкие и тяжелые цепи иммуноглобулина, не принадлежащего человеку, в которых вся или часть ДНК, кодирующей аминокислоты, не участвующие в связывании антигена, заменены ДНК из соответствующей области требуемой легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина человека. См., например, ίοικδ с1 а1., Кср1асшд 111с Сοшр1сшсηΐаπίу-^сΐс^т^шηд Ксдюпк ш а Нишап Λΐ'ΐΙίδούν \νί11ι Т1ю5с Рюш а ΜοιίδΝ'. №1игс, 321, рр. 522-25 (1986).

Гомологи антител против СБ2 и ЬРА-3, которые не являются интактными антителами, также могут быть использованы в данном изобретении. Такие гомологи можно получить из любых вышеописанных гомологов антител. Например, для использования в настоящем изобретении пригодны антигенсвязывающие фрагменты, а также непроцессированные мономерные, димерные или тримерные полипептиды, выделенные из вышеописанных антител. Приемлемыми гомологами антител этого типа являются РаЬфрагменты, РаЬ'-фрагменты, Р(аЬ')2-фрагменты, Р(у)-фрагменты, мономеры или димеры с тяжелыми цепями, мономеры или димеры с легкими цепями, димеры, состоящие из одной тяжелой и одной легкой цепи, и тому подобное. Тяжелые цепи против ЬРА-3 являются предпочтительными фрагментами антитела против ЬРА-3.

Фрагменты антител можно также получить химическими методами, например, расщепляя интактное антитело протеазой, такой как пепсин или папаин, и производя необязательную обработку расщепленного продукта восстановителем. Альтернативно требуемые фрагменты можно получить, используя клетки-хозяева, трансформированные процессированными генами тяжелой и/или легкой цепи. Мономеры с тяжелыми и легкими цепями можно получить, обрабатывая интактное антитело восстановителем, таким как дитиотреитол, с последующей очисткой для разделения цепей. Мономеры с тяжелой и легкой цепью можно также получить, используя клетки-хозяева, трансформированные ДНК, кодирующей требуемую тяжелую цепь или легкую цепь, но не обе цепи. См., например, \Уагб с1 а1., Вшбшд АсИуШск οί а Βсрс^ιο^^с οί 8шд1с Iтшиηοд1οЬи1^η УапаЫс Βοπιππίδ 8ссгс1сб Ггош ЕксйспсЫа сο1^, №1игс, 341, рр. 54446 (1989); 8а§йу с1 а1., οί 1Нс Iшшиηο1οд^са1 Βсрс^ιο^^с ш ЕксйспсЫа сο1^ &г Сспсга1юп οί Μοιιοскпа1 Са1а1уПс А^^бЕк: οί а Нсауу Сйаш УапаЫс К.сдюп-8рссШс с^NΛ ЫЬгагу, Ргос.

Νίώ. Асаб. 8сЕ И8А, 86, рр. 572832 (1989).

В. Растворимые полипептиды СБ2 и ЬРА-3.

При осуществлении способов согласно изобретению можно использовать растворимые полипептиды ЬРА-3 или СБ2, которые модулируют взаимодействие ЬРА-3 и СБ2. Растворимые полипептиды ЬРА3 являются предпочтительными.

Растворимые полипептиды ЬРА-3 можно получить из трансмембранной формы ЬРА-3, в частности, из внеклеточного домена (например, АА 1-АА187 8ЕО ГБ № 2). Такие полипептиды описаны в патентах

- 9 005948

США №№ 4956281 и 5547853 (которые имеют общего правопреемника с настоящей заявкой на патент), которые включены в это описание изобретения в качестве ссылки. Предпочтительными растворимыми полипептидами ЬЕА-3 являются полипептиды, содержащие АА 1-АА 92 8ЕО Ш № 2, АА 1-АА 80 8ЕО Ш № 2, АА 50-АА 65 8ЕО Ш № 2 и АА 20-АА 80 8ЕО Ш № 2. Вектор, содержащий последовательность ДНК (8ЕО Ш № 1), которая кодирует аминокислоты 8ЕО Ш № 2, включен в Американскую коллекцию типовых культур, Роквиль, шт. Мэрилэнд, под № доступа 75107.

Наиболее предпочтительными белками этого типа являются слитые белки, содержащие 92 аминоконцевые аминокислоты зрелого ЬРА-3, 10 С-концевых аминокислот шарнирной области 1дС1 человека, имеющей два остатка цистеина, которые, по-видимому, участвуют в образовании дисульфидной связи между цепями, и области СН2 и СН3 константной области тяжелой цепи 1дО1 человека (например, 8ЕО Ш № 8). Этот слитый белок определяется здесь как ЬРА3Т1Р. Плазмида р8АВ152, кодирующая типичный белок ЬРА3Т1Р, включена в Американскую коллекцию типовых культур, Роквиль, шт. Мэрилэнд, под № доступа АТСС 68720. Последовательность ДНК вставки р8АВ152 является последовательностью 8ЕО Ш № 7. Этот рекомбинантный белок предназначен для модуляции иммунных ответов в результате взаимодействия с рецептором СЭ2. Часть ЬРА-3 этого слитого белка связывается с рецептором СП2 на Т-лимфоцитах. Часть 1дО1 связывается с рецепторами ЕсдаттаКб (макрофаг) и ЕсдаттаКШ (клетки ΝΚ и нейтрофилы). Известно, что взаимодействие ЬЕА3Т1Р с СЭ2 подавляет ίη νίίτο реакции Т-лимфоцита. См, патенты США №№ 5728677 и 5547853. Один способ получения ЬРА3Т1Р, предназначенного для использования при осуществлении способов согласно изобретению, описан в патенте США № 5547853.

Кондиционированную культуральную среду клеток СО87 или СНО, трансфицированных р8АВ 152, концентрируют при помощи системы со спиральной кассетой АΜIСОN 81 Υ3 0 (ΛΜΚ.ΌΝ. ΌαηνοίΈ. Ма§касйикебк) и хроматографируют на белке А-8ерйато5е 4В (81дта, 8ΐ. Ьошк, Мккоип). Связанные белки элюируют и подвергают гель-фильтрации на 8ирето8е-12 (Рйаттас1а/ЬКВ, Р18-са1а^ау, №е\т 1ет§еу). Фракции 8ирето5е-12, содержащие ЬРА3Т1Р с наименьшим количеством загрязняющих белков, которые определяют при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (8Ό8РАОЕ) и вестерн-блоттинга (см., например, То\\'Ьт е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, 74, рр. 4350-54 (1979); АпйЬоФек: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, рр. 474-510 (Со1б 8рппд НатЬот ЬаЬогаЮгу (1988), собирают и концентрируют в устройстве СеШпсоп ΥΜ30 (АМ1СО№). ЬРА3Т1Р детектируют в вестерн-блотах, используя поликлональную антисыворотку против ЬРА-3 и затем меченый 1дО козы против кролика. Очищенный ЬЕА3Т1Р клеток СО87 или СНО является димером двух мономерных слитых белков ЬЕА-3-1д, связанных дисульфидными связями.

Другой предпочтительный слитый белок содержит первый и второй внеклеточные домены ЬЕА-3, слитые с шарнирными областями СН2 и СН3 1дС1 человека, и определяется здесь как ЬЬЕА3-1д.

Растворимые полипептиды ЬЕА-3 можно также получить из Р1-связанной формы ЬЕА-3, как это описано в заявке на патент РСТ № XVО 90/02181. Вектор, содержащий последовательность ДНК, кодирующую Р1-связанный ЬЕА-3 (то есть 8ЕО Ш № 3), включен в Американскую коллекцию типовых культур, Роквиль, шт. Мэрилэнд, под № доступа 68788. Следует отметить, что Р1-связанная форма ЬЕА-3 и трансмембранная форма ЬЕА-3 имеют идентичные аминокислотные последовательности во всем внеклеточном домене.

Аналогичным образом предпочтительные Р1-связанные полипептиды ЬЕА-3 соответствуют трансмембранной форме ЬЕА-3. Растворимые полипептиды СП2 можно получить из непроцессированного СИ2, в частности, из внеклеточного домена (например, АА 1-АА 185 8ЕО Ш № 6). Такие полипептиды могут содержать весь или часть внеклеточного домена СП 2. Типичные растворимые полипептиды СП2 описаны в заявке на патент РСТ VО 90/08187, которая включена в это описание изобретения в виде ссылки.

Растворимые полипептиды, пригодные для использования в данном изобретении, можно получить разными методами, известными в этой области. Например, эти полипептиды можно выделить из молекул интактного транс-мембранного ЬЕА-3 или СИ2 или из молекулы интактного Р1-связанного ЬЕА-3 протеолизом, используя специфические эндопептидазы в сочетании с экзопептидазами, расщеплением по Эдману или обоими этими методами. Молекулу интактного ЬЕА-3 или СИ2 можно очистить от ее природного источника известными методами. Альтернативно интактный ЬЕА-3 или СП 2 можно получить известными методами рекомбинантных ДНК, используя кДНК (см., например, патент США № 4956281, выданный νηΠι^ι· е! а1.; Агийо апб 8ееб, Ргос. №111. Асаб. 8сЕ, 84, рр. 2941-45 (1987); 8ауге е! а1., Ргос. N311. Асаб. 8с1. И8А, рр. 2941-45 (1987)).

Растворимые полипептиды, используемые в настоящем изобретении, предпочтительно получают прямым методом, благодаря чему не нужно использовать в качестве исходного материала всю молекулу ЬЕА-3 или СП2. Для этого используют обычные методы химического синтеза или хорошо известные методы рекомбинантных ДНК, в соответствии с которыми в трансформированных клетках-хозяевах экспрессируют только те последовательности ДНК, которые кодируют требуемые пептиды. Например, ген, кодирующий требуемый растворимый полипептид ЬЕА-3 или СИ2, можно синтезировать химическими средствами в синтезаторе олигонуклеотидов. Такие олигонуклеотиды конструируют на основе аминокислотной последовательности требуемого растворимого полипептида ЬЕА-3 или СП2. Специфические

- 10 005948 последовательности ДНК, кодирующие требуемый пептид, можно также получить из непроцессированной последовательности ДНК путем выделения специфических фрагментов эндонуклеазы рестрикции или синтеза указанной области при помощи РСК.

Стандартными методами можно синтезировать ген, кодирующий растворимый полипептид ЬРА-3 или СБ2. пригодный для данного изобретения. Например, для конструирования транслированного в обратном направлении гена можно использовать полную аминокислотную последовательность. Олигомер ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую растворимый полипептид ЬРЛ-3 или СБ 2, пригодный для данного изобретения, можно синтезировать одностадийным методом. Альтернативно можно синтезировать и затем лигировать несколько олигонуклеотидов меньшей длины, кодирующих части требуемого полипептида. Растворимый полипептид ЬРЛ-3 или СБ2, используемый в данном изобретении, предпочтительно синтезируют в виде нескольких отдельных олигонуклеотидов, которые затем связывают между собой. Отдельные олигонуклеотиды обычно содержат 5'- или З'-концевые избыточные для комплементарной сборки последовательности на одной цепи ДНК. Предпочтительные гены в собранном виде имеют последовательности, которые распознаются эндонуклеазами рестрикции (включая уникальные сайты рестрикции для прямой сборки в клонирующем или экспрессирующем векторе), предпочтительные кодоны, учитывающие экспрессирующую систему хозяина, и последовательность, которая в транскрибированном виде позволяет получить стабильную, эффективно транслированную мРНК. Правильность сборки можно подтвердить секвенированием нуклеиновой кислоты, рестрикционным картированием и экспрессией биологически активного полипептида в приемлемом хозяине.

Специалистам в этой области должно быть понятно, что вследствие вырожденности генетического кода молекулы ДНК, содержащие многие другие нуклеотидные последовательности, также способны кодировать растворимые полипептиды ЬРЛ-3 и СБ2, кодированные вышеописанными специфическими последовательностями ДНК. Эти вырожденные последовательности также кодируют полипептиды, используемые в данном изобретении.

Последовательности ДНК могут быть экспрессированы в одноклеточных хозяевах. Как хорошо известно в этой области, чтобы получить высокие уровни экспрессии трансфицированного гена в хозяине, этот ген должен быть функционально связан с транскрипционными и трансляционными контролирующими экспрессию последовательностями, которые являются функциональными в выбранном хозяине экспрессии. Контролирующие экспрессию последовательности и представляющий интерес ген предпочтительно находятся в экспрессирующем векторе, который далее содержит бактериальный селектируемый маркер и ориджин репликации. Если хозяин экспрессии является эукариотической клеткой, экспрессирующий вектор должен далее содержать дополнительный маркер экспрессии, предназначенный для данного хозяина экспрессии. Последовательности ДНК, кодирующие требуемые растворимые полипептиды, могут кодировать или не кодировать сигнальную последовательность . Если хозяин экспрессии является прокариотической клеткой, желательно, чтобы эта последовательность ДНК не кодировала сигнальную последовательность. Если хозяин экспрессии является эукариотической клеткой, желательно, чтобы сигнальная последовательность была кодирована. Аминоконцевой метионин может присутствовать или отсутствовать в экспрессированном продукте. Если концевой метионин не расщеплен хозяином экспрессии, при желании его можно удалить стандартными химическими методами.

Можно использовать разные комбинации хозяина/вектора экспрессии. Полезными экспрессирующими векторами для эукариотических клеток-хозяев являются, например, векторы, содержащие контролирующие экспрессию последовательности из 8У40, вируса папилломы крупного рогатого скота, аденовируса и цитомегаловируса. Полезными экспрессирующими векторами для бактериальных хозяев являются известные бактериальные плазмиды, в частности, плазмиды из Е. сой, включая со1 Е1, РСКЙ, рВК322, рМВ9 и их производые, плазмиды с более широким спектром хозяев, такие как КР4, ДНКсодержащие фаги, например, многочисленные производные лямбда-фага, например, ΝΜ989, и другие ДНК-содержащие фаги, такие как М13 и нитчатые фаги, содержащие одноцепочечную ДНК. Полезными экспрессирующими векторами для дрожжевых клеток являются 2 мкм плазмида и ее производные. Полезным вектором для клеток насекомых является рУЬ 941. Кроме того, в этих векторах можно использовать любые контролирующие экспрессию последовательности. Такими полезными контролирующими экспрессию последовательностями являются контролирующие экспрессию последовательности, ассоциированные со структурными генами вышеуказанных экспрессирующих векторов. Примерами полезных контролирующих экспрессию последовательностей являются, например, ранние и поздние промоторы 8У40 или аденовирус, 1ас-система, йр-система, ТАС или ТКС система, основные операторные и промоторные области лямбда-фага, регулирующие области йб-белка оболочки, промотор 3фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, промоторы кислой фосфатазы, например, Р1ю5, промоторы дрожжевой системы а-спаривания и другие последовательности, которые, как известно, регулируют экспрессию генов прокариотических или эукариотических клеток или их вирусов, и разные комбинации указанных последовательностей.

Можно использовать разных одноклеточных хозяев. Этими хозяевами являются хорошо известные эукариотические и прокариотические хозяева, такие как штаммы Е. сой, Ркеибошопак, ВасШик, 81гср1отусек, грибы, дрожжи, клетки насекомых, такие как 8робор1ега йгидрегба (8Р9), животные клетки, такие

- 11 005948 как клетки яичника китайского хомячка и клетки мыши, клетки африканской зеленой мартышки, такие как СО8 1, СО8 7, В8С 1, В8С 40 и ВМТ 10, и клетки человека, а также растительные клетки в культуре ткани. Для экспрессии в животной клетке предпочтительно используют клетки С140 и СО8 7. Следует отметить, что, конечно, не все векторы и контролирующие экспрессию последовательности одинаково хорошо экспрессируют описанные здесь последовательности ДНК. И не все хозяева дают одинаково хорошие результаты при использовании одной и той же экспрессирующей системы. Однако специалист в этой области может выбирать среди этих векторов, контролирующих экспрессию последовательностей и хозяев, не прибегая к ненужному экспериментированию. Например, выбирая вектор, необходимо принять во внимание характеристики хозяина, так как вектор должен реплицироваться в нем. Необходимо также учесть число копий вектора, способность контролировать это число копий и вероятность экспрессии любых других белков, кодируемых этим вектором, таких как антибиотические маркеры.

Выбирая контролирующую экспрессию последовательность, нужно также принять во внимание целый ряд факторов. Этими факторами являются, например, относительная прочность последовательности, ее управляемость и совместимость с рассматриваемыми здесь последовательностями ДНК, особенно с потенциальными вторичными структурами. При выборе одноклеточных хозяев необходимо учитывать их совместимость с выбранным вектором, токсичность продукта, кодированного последовательностями ДНК, характеристики секреции, их способность производить правильную укладку цепи растворимых полипептидов, требования, предъявляемые ими к ферментации или культуре, и простоту очистки продуктов, кодированных этими последовательностями ДНК. С учетом этих параметров специалист в данной области может выбрать разные комбинации вектора/контролирующей экспрессию последовательности/хозяина, которые экспрессируют требуемые последовательности ДНК в процессе ферментации или в крупномасштабной культуре животных клеток, содержащей, например, клетки СНО или СО8 7.

Растворимые полипептиды ЬРА-3 и СЭ2 можно выделить из сбраживаемой среды или культуры клеток и очистить при помощи разных известных методов. Специалист в этой области может выбрать наиболее приемлемые методы выделения и очистки.

Методы рекомбинантных ДНК предпочтительно используют для получения приемлемых растворимых полипептидов СЭ2 или ЬРЛ-3, имеющих последовательность, состоящую более чем из 20 аминокислот, и при помощи обычных методов химического синтеза предпочтительно получают более короткие полипептиды СЭ2 или ЬРЛ-3, имеющие менее 20 аминокислот. Полипептиды, пригодные для данного изобретения, можно получить синтетическим путем с очень большими выходами и легко очистить. Такие растворимые полипептиды СЭ2 или ЬРЛ-3 предпочтительно синтезируют методом синтеза полипептидов в жидкой или твердой фазе и необязательно гидрируют карбоксипептидазой (чтобы удалить Сконцевые аминокислоты) или расщепляют по Эдману (чтобы удалить Ν-концевые аминокислоты). Правильную укладку цепи полипептидов производят в окислительных условиях, которые способствуют образованию дисульфидного мостика, как это описано Кентом (Кеи1, С11С1шса1 8уп111С5Й ой Ро1урерйбе5 аиб РгсИсшб. Апп. Кеу. Вюсйеш., 57, рр. 95789 (1988)). Полипептиды, полученные таким образом, можно очистить методами разделения, хорошо известными в этой области, предпочтительно при помощи ВЭЖХ с обращенной фазой. При осуществлении синтеза в жидкой фазе можно производить прямое введение конкретных производных аминокислот, таких как О-сульфатный сложный эфир тирозина, для роста полипептидной цепи. Таким образом можно избежать следующей стадии получения производного для модификации какого-либо остатка полипептидов, пригодных для данного изобретения.

С. Агенты, имитирующие ЬРА-3 и СЭ2.

При осуществлении способов согласно изобретению можно также использовать агенты, имитирующие ЬРА-3 и СЭ2. Эти агенты, которые могут быть пептидами, полупептидными соединениями или непептидными соединениями, являются СО2-связывающими агентами, модулирующими передачу сигнала СЭ2 и/или взаимодействие СЭ2/ЬРА-3. Наиболее предпочтительные агенты, имитирующие СЭ2 и ЬРА-3, подавляют взаимодействие СЭ2/ЬРА-3 практически так же, как моноклональное антитело против ЬРА-3 7А6 или моноклональное антитело против СЭ2 Т82/18 (описанное выше). Такие миметические агенты можно получить, синтезируя несколько пептидов (например, длиной 520 аминокислот), полупептидных соединений или непептидных органических соединений и исследуя эти соединения в отношении их способности подавлять взаимодействие СЭ2/ЬРА-3. См. патент США № 4833092, 8ео11 аиб 8ιηί11ι. 8еатсЫид йог Рерйбе ЫдаибБ \νί11ι аи Ерборе ЫЬтату, 8с1еисе, 249, рр. 386-90 (1990), аиб Όονίίη е1 а1., Каибот Рерйбе ЫЬгапсБ: А 8оитсе ой 8ресШс Рго1еш Вшбшд Мо1еси1е5, 8с1еисе, 249, рр. 40407 (1990), которые включены в это описание изобретения в виде ссылки.

Ό. Производные СО2-связывающие агенты.

При осуществлении способов согласно изобретению можно также использовать производные СЭ2связывающие агенты, такие как модуляторы взаимодействия СЭ2/ЬРА-3, в которых любые гомологи антител, растворимые полипептиды СЭ2 и ЬРА-3 или агенты, имитирующие СЭ2 и ЬРА-3, функционально связаны (при помощи химической связи, генетического слияния или тому подобного) с одним или несколькими членами, независимо выбираемыми из группы, включающей в себя гомологи антител против ЬРА-3 или СЭ2. растворимые полипептиды ЬРА-3 и СЭ2. агенты, имитирующие СЭ2 и ЬРА-3, цитотоксические и фармацевтические средства. Один тип производного СО2-связывающего агента полу

- 12 005948 чают, сшивая два или более СИ2-связывающих агентов (одного или разных типов). Приемлемыми сшивающими агентами являются гетеробифункциональные вещества, имеющие две реакционноспособные группы, отделенные друг от друга соответствующим спейсером (например, сложный эфир ммалеимидобензоил-Ы-гидроксисукцинимида) или гомобифункциональные вещества (например, дисукцинимидилсуберат). Такие линкеры можно приобрести в компании йегее Сйеш1са1 Сотрапу, Рокфорд, шт. Иллинойс. В соответствии с другим способом сшивания используют сигнальную последовательность ΡΙ-связи в ΡΙ-связанном ЬРЛ-3 или ее фрагменты. В частности ДНК, кодирующую сигнальную последовательность ΡΙ-связи (например, АА 162-АА 212 8ЕО ΙΌ № 4) лигируют в прямом направлении [от 5' к 3'] ДНК, кодирующей требуемый полипептид, предпочтительно растворимый полипептид ЬРА-3. Если эту конструкцию экспрессировать в соответствующей эукариотической клетке, эта клетка распознает сигнальную последовательность ΡΙ-связи и ковалентно свяжет ΡΙ с этим полипептидом. Гидрофобное свойство ΡΙ затем можно использовать для получения мицеллярных агрегатов полипептидов.

Кроме того, можно использовать СИ2-связывающие агенты, связанные с одним или несколькими цитотоксическими или фармацевтическими средствами. Полезными фармацевтическими средствами являются биологически активные пептиды, полипептиды и белки, в частности, гомологи антител, специфичные к полипептиду человека, не являющемуся СИ2 или ЬРА-3, или их части. Полезные фармацевтические и цитотоксические средства включают в себя также циклоспорин А, преднизон, РК506, метотрексат, стероиды, ретиноиды, интерферон и азотистое соединение горчицы.

Предпочтительными СИ2-связывающими агентами, полученными с использованием фармацевтического средства, являются полипептиды, созданные методами рекомбинантных ДНК, в которых растворимый полипептид ЬРА-3, растворимый полипептид СИ2 или агент, имитирующий пептидил-СИ2 или пептидил-ЬРА-3, слит со всей или частью шарнирной области тяжелой цепи иммуноглобулина и со всей или частью константной области тяжелой цепи. Предпочтительными полипептидами для получения таких слитых белков являются растворимые полипептиды ЬРА-3. Особенно предпочтительны слитые белки, содержащие АА 1-АА 92 из ЬРА-3 (например, 8ЕО ΙΌ № 2), слитые с частью шарнирной области Ι§01 человека (включая десять С-концевых аминокислот шарнирной области, содержащей два остатка цистеина, которые, по-видимому, участвуют в образовании дисульфидной связи между цепями) и с областями СН2 и СН3 константной области тяжелой цепи !цС 1. Предполагается, что такие слитые белки обладают длительным временем полужизни в кровяном русле и обеспечивают димеризацию СИ2связывающего агента.

Другими производными СИ2-связывающими агентами, которые, по-видимому, также характеризуются длительным временем полужизни в кровяном русле, являются СИ2-связывающие агенты, наиболее предпочтительно связанные с одним или несколькими полимерами, такими как полиалкиленгликоль. Считается, что этот полимер избирательно взаимодействует со свободной аминогруппой или другими реакционноспособными группами в СИ2-связывающем агенте, причем теоретически присоединение этих полимеров происходит у любых имеющихся аминогрупп, таких как α-аминогруппы или ε-аминогруппы лизина, или группы -8Н цистеинов. Свободные карбоксильные группы, должным образом активированные карбонильные группы, гидроксил, гуанидил, окисленные углеводородные части и меркаптогруппы СИ2-связывающего агента (если они имеются) можно также использовать в качестве сайтов присоединения.

В частности, если СИ2-связывающий агент является белком, химическую модификацию любого цистеина (например, внутреннего или Ν-концевого цистеина) для защиты тиола с сопутствующей конъюгацией с полиалкиленгликольной частью (то есть полиэтиленгликолем или ΡΕΟ) можно выполнить разными способами. См. патент США № 4179337. Сульфгидрильная часть с ионом тиолата в качестве активного компонента является наиболее реакционноспособной функциональной группой в белке. Существует много реагентов, которые быстрее взаимодействуют с тиолом, чем с любыми другими группами. См. СНешЩгу оГ ΡΐΌ^ίη С’опщдаЕоп апб Сгокк-Ьшкшд (8.8. \¥опд. СЯС ΡΐΌ55. Воса Яа!оп, РЬ, 1991).

В качестве других примеров связывания полиалкиленгликоля с цистеином можно привести реакции с использованием других α-галогенацетильных соединений, ртутьорганических соединений, дисульфидных реагентов и других Ν-замещенных имидов малеиновой кислоты. Многие производные этих активных компонентов можно приобрести коммерческим путем (например, этилиодацетат (А1бпс1г Мйтеаикее, ^Ι), фенилдисульфид (АШг1сН) и Ν-пиренмалеимид (Мо1еси1аг Ριό^κ, Еидепе ОЯ) ) или легко синтезировать (например, Ν-алкилиодацетамиды, Ν-алкилмалеимиды и ртутьорганические соединения). Поскольку не существует простого химического метода целенаправленного связывания полиалкиленгликоля, такого как ΡΕΟ, с СИ2-связывающим агентом, необходимо генетическим путем создать сайт, который можно использовать для целенаправленного связывания полимерной части, например, при помощи сайт-направленного мутагенеза. Например, введение Сук в сайт, расположенный у С-конца белкового СИ2-связывающего агента, обеспечивает специфическую модификацию с использованием полиалкиленгликоля (например, ΡΕΟ), активированного имидом малеиновой кислоты, винилсульфоном или галогенацетатом. Эти реакции можно выполнить любым приемлемым методом, используемым для осуществления взаимодействия биологически активных веществ с инертными полимерами.

- 13 005948

Этот способ обычно включает в себя получение активированного полимера (который может иметь по меньшей мере одну концевую гидроксильную группу) и последующее взаимодействие белка с активированным полимером, что дает растворимый белок, пригодный для изготовления композиции. Вышеуказанную модификацию можно произвести разными способами, состоящими из одной или нескольких стадий. В соответствии с настоящим изобретением полиалкиленгликольные остатки С1-С4 алкилполиалкиленгликолей, предпочтительно полиэтиленгликоля (РЕС), или поли(окси)алкиленгликольные остатки таких гликолей вводят в представляющие интерес полимерные системы. Таким образом, полимер, к которому присоединен белок, может быть гомополимером полиэтиленгликоля (РЕС) или полиоксиэтилированным полиолом, при условии, что полимер растворяется в воде при комнатной температуре. Неограничивающими примерами таких полимеров являются гомополимеры полиалкиленоксида, такие как РЕС или полипропиленгликоли, полиоксиэтиленированные гликоли, их сополимеры и блок-сополимеры, при условии, что блок-сополимер остается водорастворимым.

Примерами полиоксиэтилированных полиолов являются полиоксиэтилированный глицерин, полиоксиэтилированный сорбит, полиоксиэтилированная глюкоза и тому подобные. Глицериновый остов полиоксиэтилированного глицерина аналогичен природному остову, имеющемуся, например, в моно-, ди- и триглицеридах животных и человека. Поэтому такое ветвление необязательно следует рассматривать как чужеродный агент в организме.

В качестве альтернативы полиалкиленоксидам можно использовать декстран, поливинилпирролидоны, полиакриламиды, поливиниловые спирты, полимеры на основе углеводородов и тому подобное. Кроме того, можно использовать гетерополимеры (т.е. полимеры, состоящие из мономеров нескольких видов, такие как сополимеры), описанные в патенте США № 5359030 (например, белки, конъюгированные с полимерами, содержащими полиалкиленгликольную часть и одну или несколько жирных кислот). Специалистам в этой области должно быть понятно, что приведенный выше список носит иллюстративный характер, и в объем данного изобретения входят все полимерные материалы, обладающие описанными здесь свойствами.

Кроме того, в соответствии с другим объектом изобретения можно использовать производный СБ2связывающий агент, ковалентно связанный с полимерным компонентом, в котором характер конъюгации предполагает наличие расщепляемых ковалентных химических связей. Это позволяет контролировать период времени, в течение которого полимер может быть отщеплен от СБ2-связывающего агента. Эта ковалентная связь может быть расщеплена химической или ферментативной реакцией. Продукт, состоящий из полимера и СБ2-связывающего агента, сохраняет приемлемую степень активности. Вместе с этим в конъюгируемом полимере присутствуют части полиэтиленгликоля, которые сообщают конъюгату полимера и СБ2-связывающего агента высокую растворимость в воде и способность длительное время циркулировать в кровотоке.

Благодаря этим улучшенным характеристикам настоящее изобретение делает возможным парентеральное, аэрозольное и пероральное введение конъюгата активного полимера и СБ2-связывающего агента, и вслед за гидролитическим расщеплением обеспечивает биологическую доступность самого СБ2связывающего агента при применении ίη νίνο.

Фармацевтические композиции и способы согласно изобретению

Это изобретение относится к предпочтительному способу профилактики или лечения заболевания у млекопитающего, обусловленного инфильтрацией в один или несколько органов млекопитающего эффекторных Т-лимфоцитов памяти и/или опосредованного такими Т-лимфоцитами. Этот способ включает в себя введение млекопитающему одного или нескольких СБ2-связывающих агентов, таких как ингибиторы взаимодействия СБ2/БЕА-3, или их производных форм, способных избирательно модулировать эффекторные Т-лимфоциты памяти, не воздействуя на необученные Т-лимфоциты. Нуждающемуся в этом субъекту вводят эффективное количество СБ2-связывающего агента или его производной формы. Эффективное количество означает количество, позволяющее замедлить распространение или сделать менее тяжелыми описываемые здесь заболевания.

Специалисту в этой области должно быть понятно, что эффективное количество СБ2связывающего агента зависит, среди прочего, от схемы введения, величины однократной дозы, использования СБ2-связывающего агента в сочетании с другими лекарственными средствами, иммунного статуса и состояния здоровья пациента, терапевтической активности конкретного СБ2-связывающего агента и времени полужизни в кровяном русле.

СБ2-связывающий агент или фармацевтическую композицию можно использовать в разных формах. Такими формами являются, например, твердые, полутвердые и жидкие лекарственные формы, такие как таблетки, пилюли, порошки, жидкие растворы, дисперсии или суспензии, липосомы, суппозитории, инъекционные и инфузионные растворы и препараты для местного применения. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического назначения. Предпочтительными формами являются инъекционные или инфузионные растворы. СБ2-связывающий агент или фармацевтическую композицию можно использовать для внутривенного, внутримышечного, подкожного, внутрисуставного, подоболочечного, периостального, внутриопухолевого вливания, введения в очаг поражения и рядом с очагом поражения, а также перорального и местного применения или ингаляции. Подкожное,

- 14 005948 внутримышечное или внутривенное введение является предпочтительным. Подкожное введение является наиболее предпочтительным. СО2-связывающие агенты можно вводить в виде перорального, трансбуккального, парентерального, ректального и вагинального препарата, путем аэрозольного впрыскивания в нос, внутрилегочной ингаляции или другими способами. В частности, лекарственные средства согласно изобретению могут быть получены в виде аэрозоля для ингаляции с использованием распыляемого раствора или порошка, инъекционного раствора (например, для подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного или внутриполостного введения), инфузионного раствора или препарата для перорального введения и могут представлять собой однократные лекарственные формы в ампулах или таблетках или многократные лекарственные формы в пробирках или других упаковках с добавлением консерванта. Эти композиции могут быть получены в виде суспензий, растворов, эмульсий или гелей в масляных или водных носителях и могут содержать вспомогательные средства, в частности суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Альтернативно активный ингредиент может быть получен в виде порошка и/или в лиофилизованной форме для непосредственного применения или для смешивания перед использованием с приемлемым носителем (таким как стерильная, апирогенная вода, нормальный физиологический раствор или 5% декстроза).

Унифицированную дозу предпочтительно вводят один-три раза в неделю или один-три раза в день. Более предпочтительно ее вводят один-три раза в день в течение примерно 3-7 дней или один-три раза в день в течение примерно 3-7 дней ежемесячно. Однако следует отметить, что можно использовать более низкие или более высокие дозы и другие схемы введения. СО2-связывающий агент предпочтительно вводят в дозе примерно от 0,001 до 50 мг СО2-связывающего агента на кг массы тела, более предпочтительно, примерно от 0,01 до 10 мг СО2-связывающего агента на кг массы тела, наиболее предпочтительно, примерно от 0,1 до 4 мг СО2-связывающего агента на кг массы тела.

Например, 002-связывающий агент согласно изобретению (растворимый полипептид ЬЕЛ-3 ЬЕЛ3Т1Р) предпочтительно хранят в виде замороженного раствора в пробирках, содержащих 10 мг/мл рекомбинантного слитого белка ЬЕЛ-3/1дО1 и наполнители (хлорид натрия, одноосновный фосфат калия и двухосновный фосфат натрия) . Содержимое пробирок оттаивают в холодильнике или при комнатной температуре, разводят 0,9% хлоридом натрия до конечного объема 5 мл и используют для внутривенной инъекции ударной дозы вещества. ЬЕЛ3Т1Р получают в соответствии с описанием, приведенным в статье МШег е1 а1. (1993) 1. Ехр. Меб. 1 78:211, которая включена в это описание изобретения в виде ссылки, и очищают от культуральной среды, содержащей линии трансфицированных клеток СНО (яичника китайского хомячка), производя абсорбцию на белке-А Зерйатозе 4В (Рйаттааа) и элюирование 50 мМ глицина, 250 мМ №1С1 (рН 3,0). Фракции, содержащие белок, собирают и подвергают гель-фильтрации на 8ирегозе-6® (РйаттаОа) в физиологическом растворе с фосфатным буфером (РВ8). Максимальные фракции собирают и анализируют на чистоту при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии 12% додецилсульфата натрия в восстановительных и невосстановительных условиях.

В соответствии с типичной схемой лечения пациенту делают одну внутривенную инъекцию ударной дозы вещества в количестве, которое предпочтительно превышает 0,025 мг/кг и может составлять примерно 0,075-0,150 мг/кг. Дозу этого СЬ2-связывающего агента определяют с учетом массы тела нуждающегося в этом субъекта. Другая схема лечения может включать в себя одну внутримышечную инъекцию в дозе не менее 0,005 мг/кг, причем предпочтительная доза составляет до 0,025 мг/кг, и наиболее предпочтительные дозы выбирают из 0,05, 0,075, 0,1125 и 0,165 мг/кг.

Унифицированные дозы необходимо вводить до достижения положительного результата. Эффективность лечения можно измерить разными методами. В случае рассеянного склероза (М8) лечебное действие можно измерить стандартными методами магнитного резонанса. В случае воспалительного заболевания кишечника (ΙΒΌ) оценивают степень болей в брюшной полости, заживление свищей, частоту стула и другие показатели, в случае псориатического артрита определяют изменения в припухлости суставов и объем движений. Специалисты в области медицины могут легко определить клинический эффект по любому из описанных здесь симптомов, прибегнув к хорошо известным медицинским методам.

СЬ2-связывающие агенты или их производные формы предпочтительно вводят в составе композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель. Термин фармацевтически приемлемый носитель означает носитель, который не вызывает аллергической реакции или другого вредного действия у пациентов, которым его вводят. Приемлемыми фармацевтически приемлемыми носителями являются, например, вода, физиологический раствор, физиологический раствор с фосфатным буфером, декстроза, глицерин, этанол и тому подобные, а также их сочетания. Фармацевтически приемлемые носители могут далее содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие средства, консерванты или буферы, которые увеличивают срок годности или эффективности СЬ2-связывающего агента.

Фармацевтическую композицию или СО2-связывающий агент можно вводить вместе с другими лечебными или профилактическими средствами. Такими средствами являются, например, циклоспорин А, стероиды, ретиноиды, азотистое соединение горчицы, интерферон, метотрексат, антибиотики и антигистаминные средства. Эти средства можно вводить в виде однократной лекарственной формы вместе с СО2-связывающим агентом (т.е. в составе одной фармацевтической композиции), многократной лекар

- 15 005948 ственной формы отдельно от СО2-связывающего агента, но одновременно с ним, или многократной лекарственной формы, в которой два компонента вводят отдельно и последовательно. Альтернативно СЭ2связывающий агент и другой активный агент можно получить в виде одной конъюгированной молекулы. Конъюгацию двух компонентов производят стандартными методами сшивания, хорошо известными в этой области. Одна молекула может также представлять собой рекомбинантный слитый белок. Кроме того, СО2-связывающие агенты или фармацевтические композиции, пригодные для настоящего изобретения, можно использовать в сочетании с другими терапевтическими методами, такими как химиотерапия. Применяя такие комбинированные терапевтические методы, можно успешно использовать более низкие дозы лекарственных средств.

Генная терапия

Это изобретение далее относится к генной терапии, используемой для доставки СО2-связывающих агентов в виде продуктов экспрессии последовательности нуклеиновых кислот в организм млекопитающего. Предпочтительная системная доставка ех νίνο генных продуктов предполагает использование рекомбинантного вирусного или невирусного вектора, трансфекцию ίη νί!το специфических популяций клеток млекопитающего, выделение и очистку трансфицированных клеток и введение их пациенту. Генная терапия ίη νίνο предполагает аналогичное использование вектора и трансфекцию без удаления клеток или ткани у пациента. Специфические популяции клеток, используемые в качестве мишеней для трансфекции рекомбинантным вектором, содержащим представляющую интерес последовательность нуклеиновых кислот, включают в себя, не ограничиваясь ими, (1) популяции клеток костного мозга, содержащие кроветворные клетки-предшественники; (2) популяции лейкоцитов периферической крови, предпочтительно популяции лейкоцитов крови СЭ34+, которые обогащены кроветворными клетками и могут быть использованы для возврата трансфицированных кроветворных клеток в организм пациента без иссечения ткани;

(3) популяции лимфоцитов периферической крови; (4) миобласты, которые можно снова трансплантировать хозяину после трансфекции ίη νί!το представляющей интерес последовательности нуклеиновых кислот; (5) после чего рекомбинантный вирусный или невирусный вектор, содержащий представляющую интерес последовательность нуклеиновых кислот, или саму последовательность нуклеиновых кислот вводят пациенту при помощи внутримышечной инъекции.

Специалистам в данной области должен быть известен метод использования ех νίνο костного мозга с кроветворными клетками-предшественниками, содержащими вектор, способный кодировать в результате экспрессии СО2-связывающий агент. Этот метод можно коротко описать следующим образом: клетки костного мозга удаляют, инфицируют рекомбинантным вирусом и вновь вводят млекопитающему-хозяину. Таким образом ген или фрагмент гена системно распределяется в организме млекопитающего-хозяина, при этом происходит экспрессия этой последовательности ДНК, ведущая к системной доставке генного продукта в организм млекопитающего-хозяина.

Периферическая кровь является источником клеток млекопитающего, используемых для инфицирования вирусными векторами. В частности, лейкоциты крови, особенно популяция СЭ34+, которые содержат циркулирующие кроветворные стволовые клетки, можно использовать в качестве клетокмишеней для заражения вирусом, которые затем возвращают в костный мозг млекопитающего-хозяина без иссечения ткани (Кагкбющ е! а1., 1993, Βοικ Магго\у Тгащрк-иП. 11 (кирр. 1): 124-127). Кроме того, лимфоциты можно также использовать в качестве клеток-мишеней для стимуляции системной доставки представляющей интерес последовательности нуклеиновых кислот. Лимфоциты удаляют из периферической крови хозяина, культивируют известными методами и используют в качестве популяции клетокмишеней для инфицирования вирусными векторами, содержащими представляющую интерес последовательность нуклеиновых кислот. Инфицированные лимфоциты затем инъецируют млекопитающемухозяину (см., например, ΑηάδΓδοη, е! а1., 1990, Нитаη Сене Тйегару, 1: 331-361). Дополнительную популяцию клеток-мишеней составляют миобласты. Кровоток, поступающий в относительно большую массу скелетных мышц, делает эту ткань локализованным депо для представляющей интерес последовательности нуклеиновых кислот. Поэтому инфицирование ίη νίίτο и повторное введение миобластов млекопитающему-хозяину создает в хозяине локальную мишень, которая обеспечивает системную доставку продукта СЭ2. Для культивирования, инфицирования и повторного введения миобластов хозяину используют известные методы (см., например, Иа1, е! а1., 1992, Ргос. №111. Асай. 8ст И8А 89: 10892-10895).

В этой связи следует отметить, что прямая инъекция ίη νίνο в клетки или ткань является еще одним дополнительным методом локальной доставки молекулы вектора, кодирующей СИ2-связывающий агент. Прямая инъекция после экспрессии генного продукта обеспечивает системную доставку лекарственного продукта в организм млекопитающего-хозяина (^ο1ίί, е! а1., 1990, 8с1еисе 247: 1465-1468; Ка/, е! а1., 1993, Ргос. №111. Асай. 8ст И8А 90: 4523-4527). В этом режиме локализованной доставки используют прямую инъекцию депротеинизированной ДНК, предпочтительного невирусного вектора, такого как плазмидная ДНК.

Для конструирования плазмидного вектора можно использовать любую эукариотическую промоторную и/или энхансерную последовательность, имеющуюся в распоряжении специалиста в этой области, которая, как известно, может регулировать экспрессию представляющей интерес нуклеиновой кисло

- 16 005948 ты, включая, но не ограничиваясь ими, промотор цитомегаловируса (СМУ), промотор вируса саркомы Рауса (В8У), промотор вируса лейкемии мышей (МЬУ), промотор β-актина, а также любую специфичную к клеткам эукариотическую промоторную последовательность, которая должна быть активной в клетке, предназначенной для трансдукции. Кроме того, можно использовать любые методы, используемые в данной области, для введения полинуклеотидных последовательностей в вектор. См., например, 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу, Со1б 8рппд НагЬог, ΝΥ (1989) апб АикиЬе1 е! а1., Сштеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1. У11еу & 8опк, ΝΥ (1992). Обычные векторы содержат приемлемые транскрипционные/трансляционные контролирующие сигнальные последовательности, функционально связанные с полинуклеотидной последовательностью для конкретного интерферона. Промоторы/энхансеры можно также использовать для регулирования экспрессии интерферонов (см. раздел III).

Экспрессирующие векторы, совместимые с клетками-хозяевами млекопитающего, предназначенными для использования в генной терапии клеток, включают в себя, например, плазмиды; векторы на основе ретровирусов птиц, мышей и человека; векторы на основе аденовирусов; векторы на основе вируса герпеса; парвовирусы и нереплицирующиеся поксвирусы. В частности, рекомбинантные вирусы с дефектом репликации можно генерировать в линиях упаковочных клеток, которые продуцируют только вирусы с дефектом репликации. См. Сиггеп! Рго!осо1к ΐπ Мо1еси1аг Вю1оду: 8ес!юпк 9.10-9.14 (АикиЬе1 е! а1., ебк.) , Огеепе РиЬНкЫпд Аккоаа!ек, 1989.

В настоящее время созданы специфические вирусные векторы, предназначенные для использования в системах переноса генов. См., например, Мабхак е! а1., I. Оеп. У1го1. 73: 1533-36 (1992) (паповавирус 8У40); Вегкпег е! а1., Сигг. Тор. МюгоЬюк 1ттипо1., 158: 39-61 (1992) (аденовирус); Мокк е! а1., Сшт. Тор. МюгоЬюк 1ттипо1., 158: 25-38 (1992) (вирус коровьей оспы); Михусхка, Сигг. Тор. МюгоЬюк 1ттипо1., 158: 97-123 (1992) (аденоассоциированный вирус); Магди1ккее, Сигг. Тор. МюгоЬюк 1ттипо1., 158: 67-93 (1992) (вирус простого герпеса (Н8У) и вирус Эпштейна-Барра (НВУ)); МШег, Сшт. Тор. МюгоЬюк 1ттипо1., 158: 1-24 (1992) (ретровирус); Вгапбуорабкуау е! а1., Мо1. Се11. Вю1., 4: 749-754 (1984) (ретровирус); МШет е! а1., №ιΙιιιό, 357: 455-450 (1992) (ретровирус); Апбегкоп, 8с1епсе, 256: 808-813 (1992) (ретровирус).

Предпочтительными векторами являются ДНК-содержащие вирусы, к которым относятся аденовирусы (предпочтительно векторы на основе Аб-2 или Аб-5), вирусы герпеса (предпочтительно векторы на основе вируса простого герпеса) и парвовирусы (предпочтительно векторы на основе дефектного или неавтономного парвовируса, более предпочтительно векторы на основе аденоассоциированного вируса, наиболее предпочтительно векторы на основе ААУ-2). См., например, А11 е! а1., Оепе Ткегару 1: 367-384, 1994; патенты США №№ 4797368 и 5399346 и приведенное ниже описание. Аденовирусные векторы обеспечивают чрезвычайно высокие уровни доставки трансгена фактически ко всем типам клеток независимо от митотического состояния. Высокие титры (10¹¹ бляшкообразующих единиц/мл) рекомбинантного вируса можно легко генерировать в клетках 293 (трансформированная аденовирусом линия комплементарных эмбриональных клеток почки человека; АТСС СВЕ1573) и хранить в криостате в течение длительного времени без значительных потерь. Эффективность этой системы доставки лечебного трансгена ш у|уо, восстанавливающего генетический дисбаланс, продемонстрирована на моделях животных, страдающих разными заболеваниями. См. Υ. Уа!апаЬе, А1кегокс1егок1к. 36: 261-268 (1968); К. Тапха\та е! а1., ЕΕΒ8 Ьейетк, 118(1):81-84 (1980); кЬ. Оо1ак!еп е! а1., Хем Εβ§1. I. Меб., 309 (11983); 288-296 (1983); 8. 1кЫЬакЫ е! а1., I. СНп. 1пуек!., 92:883-893 (1993); апб 8. 1кЫЬакЫ е! а1., I. СНп. 1пуек!., 93: 1889-1893 (1994). Рекомбинантный аденовирус с дефектом репликации, кодирующий кДНК для трансмембранного регулятора муковисцидоза (СЕТВ), признан пригодным для применения в генной терапии в результате выполнения нескольких клинических исследований муковисцидоза. См., например, I. ХУПкои, №!ите, 365: 691692 (Ос!., 21, 1993). Дальнейшим подтверждением безопасности рекомбинантных аденовирусов для генной терапии является широкое применение живых аденовирусных вакцин для вакцинации людей.

Аденоассоциированные вирусы (ААУ) находят применение в качестве векторов для соматической генной терапии. ААУ представляет собой вирус, содержащий короткую одноцепочечную ДНК, с простой геномной организацией (4,7 т.п.н.), что делает его идеальным субстратом для генетической инженерии. Две открытые рамки считывания кодируют ряд гер- и сар-полипептидов. Вер-полипептиды (гер78, гер68, гер62 и гер40) участвуют в репликации, спасении и интеграции генома ААУ. Кэппирующие белки (УР1, УР2 и УР3) образуют капсид вириона. Открытые рамки считывания гер- и сар-полипептидов у 5'- и 3'-концов фланкируют инвертированные концевые повторы длиной 145 п.н. (1ТВ), у которых первые 125 п.н. способны образовывать Υ- или Т-образные дуплексные структуры. Важное значение для получения векторов на основе ААУ имеет то, что гер- и сар-домены могут быть полностью вырезаны и заменены лечебным или репортерным трансгеном. См. В.1. Саг!ег, ш НапбЬоок оГ Ратуоуиикек, еб., Р. Туккет, СВС Ргекк, рр. 155-168 (1990). Установлено, что инвертированные концевые повторы (1ТВ) представляют собой минимальную последовательность, необходимую для репликации, спасения, упаковки и интеграции генома ААУ. Известно, что высокая степень экспрессии гена из ААУ у мышей сохраняется в течение по меньшей мере 1,5 лет. См. Х1ао, Ы апб 8ати1кк1 (1996) 1оита1 оГ Упо1оду 70, 8089-8108. Поскольку нет данных, свидетельствующих о вирусной токсичности или иммунном ответе клетки-хозяина, можно счи

- 17 005948 тать, что преодолены эти ограничения, присущие вирусной генной терапии. Фишер и др. (ЕЬНег с1 а1., №11игс Мейюте (1997) 3, 306-312) сообщили об устойчивой экспрессии гена у мышей после внутримышечной инъекции ААУ. Снова было подтверждено, что этот вирус является безопасным. Не было обнаружено клеточной или гуморальной иммунной реакции на введение вируса или чужеродного генного продукта.

Животные модели. СБ2-связывающие агенты и описанные способы можно испытать, используя приемлемые модели животных, страдающих разными заболеваниями (такие как хорошо известная модель ЕАЕ для рассеянного склероза). В нижеследующих примерах описано несколько моделей животных.

Культуры, включенные в коллекции

Клетки гибридомы мышей и антитела против ЬЕА-3 согласно изобретению проиллюстрированы культурами, включенными в Американскую коллекцию типовых культур, Роквиль, шт. Мэрилэнд, США, 5 марта 1991 г. в соответствии с Будапештским договором, и идентифицированы следующим образом:

Обозначение Номер доступа АТСС

1Е6 НВ10693

НС-1В11 НВ10694

7А6 НВ10695

8В8 НВ10696

Бактериофаг, несущий плазмиду, кодирующую трансмембранный ЬЕА-3, зарегистрирован компанией Ιη νίίτο 1п1егпа11опа1, 1пс., Ып1Ысит, Магу1апй, США, 28 мая 1987 г. под № доступа ΐνΐ-10133 в соответствии с Будапештским договором. Эта культура перенесена в Американскую коллекцию типовых культур (10801 ЬшуегкЦу В1уй, Мапаккак, νίΓβίηία 20110-2209, ИшГей 81а1ек) 20 июня 1991 г. и идентифицирована следующим образом:

Обозначение Номер доступа АТСС

ХНТ16[ХдГ10/ЬЕА-3] 75107

Культура Е. со11, трансформированная плазмидой, кодирующей ΡΙ-связанный ЬЕА-3, зарегистрирована компанией 1п νίίτο 1п1егпа11опа1, 1пс., 22 июля 1988 г. под № доступа ΐνΐ-10180 в соответствии с Будапештским договором. Эта культура перенесена в Американскую коллекцию типовых культур (настоящий адрес: 10801 ЬшуегкЦу Β1νά, Мапаккак, ^гд1ша, И8А) 20 июня 1991 г. и идентифицирована следующим образом:

Обозначение Номер доступа АТСС р24 68788

Последовательности

Далее приведен краткий перечень последовательностей, указанных в списке последовательностей:

8ЕО ΙΌ № 1: последовательность ДНК трансмембранного ЬЕА-3

8ЕО ΙΌ № 2: аминокислотная последовательность трансмембранного ЬЕА-3

8ЕО ΙΌ № 3: последовательность ДНК ΡΙ-связанного ЬЕА-3

8ЕО ΙΌ № 4: аминокислотная последовательность РЬсвязанного ЬЕА-3

8ЕО ΙΌ № 5: последовательность ДНК СБ2

8ЕО ΙΌ № 6: аминокислотная последовательность СБ2

8ЕО ΙΌ № 7: последовательность ДНК ЬЕА3Т!Р

8ЕО ΙΌ № 8: аминокислотная последовательность ЬЕА3Т!Р

Для лучшего понимания изобретение далее проиллюстрировано примерами. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Модуляция эффекторных Т-лимфоцитов памяти.

Этот пример показывает, что конкретный СБ2-связывающий агент, ЬЕА3 ТГР (8ЕО ΙΌ № 8), избирательно модулирует эффекторные Т-лимфоциты памяти у млекопитающих, страдающих псориазом.

Вещества и способы

Авторы данного изобретения исследовали ЬЕА3Т[Р рандомизированным, двойным слепым методом в фазе ΙΙ с параллельным построением опыта в четырех сериях с контролем при помощи плацебо, в котором участвовали пациенты, страдающие хроническим бляшкообразным псориазом. Главной целью исследования было определение клинической реакции на дозы от 0,025 до 0,15 мг/кг массы тела. В 22 пунктах на территории Соединенных Штатов было зарегистрировано 229 субъектов в возрасте от 18 до 70 лет. Критерием для участия в этом исследовании было наличие бляшкообразного псориаза на протяжении по меньшей мере одного года с поражением более 10% площади поверхности и не поддающегося лечению местными средствами. Средняя продолжительность заболевания составила 16 лет (от 1 года до 62 лет). Фототерапия и системное лечение были прекращены за один месяц до начала исследования. НЕСТЕР хранили в виде замороженного раствора в пробирках, содержащих по 10 мг/мл слитого белка и наполнители (хлорид натрия, одноосновный фосфат калия и двухосновный фосфат натрия). Пробирки хранили при -70°С (-94°Е), оттаивали в холодильнике или при комнатной температуре, разводили 0,9% хлоридом натрия до конечного объема, равного 5 мл, и использовали для внутривенной инъекции удар

- 18 005948 ной дозы вещества.

СЭ2-связывающий агент вводили один раз в неделю в виде внутривенной инъекции ударной дозы вещества в течение 12 недель; за субъектами продолжали вести наблюдение в течение 12 недель после введения последней дозы. Тяжесть заболевания определяли на основании глобальной врачебной оценки и индекса активности и тяжести псориаза (РА81), причем конечные результаты первичной эффективности определяли через 2 недели после введения последней дозы исследуемого лекарственного средства.

У пациентов брали пробу периферической крови и отделяли лимфоциты при помощи центрифугирования в градиенте плотности гипакфиколла. Клетки (примерно 3 х 10⁵) анализировали при помощи проточной цитометрии (РАС8ТАК РЬи8, Вее1ои ΩίοΚιηδοη. 8аи 1о5С. СА). Было зарегистрировано десять тысяч показателей.

Результаты

Авторы данного изобретения обнаружили статистически значимую разницу между БРА3Т1Р и плацебо в целом ряде конечных результатов, включая уменьшение оценки ΡΑ8Ι в случае введения двух более высоких доз БРА3Т1Р. Клинические реакции на лекарственное средство становятся более выраженными при увеличении концентрации БРА3Т1Р (данные не представлены). Кроме того, лечение этим СЭ2связывающим агентом вызывает уменьшение Т-лимфоцитов периферической крови СЭ4+ и СЭ8+ и природных клеток-киллеров. Наблюдается избирательное уменьшение эффекторных Т-клеток памяти СЭ4 5ΚΌ+ по сравнению с необученными клетками СЭ4+ и СЭ8+, именуемыми СЭ45ВА+. При помощи проточной цитометрии выявлено более значительное уменьшение Т-клеток высокой плотности с фенотипами клеток памяти/эффекторов (ί.Ό4-ί.Ό45ΒΘ и ί.Ό8-ί.Ό45ΒΘ) по сравнению с Т-клетками СЭ2 низкой плотности с фенотипами необученных клеток (СП4-СП45К.А и СО8-СЭ45ВА). На фиг. 1 изображен график, показывающий избирательное уменьшение эффекторных Т-клеток памяти по сравнению с необученными Т-клетками у пациентов, страдающих псориазом, которым вводили БРА3Т1Р. Горизонтальным прямоугольником, расположенным над осью X, обозначена продолжительность лечения, которое было прекращено примерно через 80 дней. Кривые соответствуют среднему подсчету абсолютной субпопуляции лимфоцитов у 57 пациентов в каждой лечебной группе. Уменьшение эффекторных Тклеток памяти (СЭ45 НО+) является статистически значимым в зависимости от дозы. Не наблюдалось каких-либо изменений количества необученных Т-клеток периферической крови (СЭ45 НА+) независимо от схемы лечения. Подсчеты Т-клеток в разных схемах лечения СЭ2-связывающим агентом свидетельствуют о сокращении их количества, приближающегося к некоторой относительно постоянной величине в течение 80-дневного периода введения. После окончания лечения количество эффекторных Тклеток памяти начинает увеличиваться.

ЬРА3Т1Р характеризуется хорошей переносимостью и не вызывает серьезных вредных эффектов. Незначительное временное зависящее от дозы уменьшение абсолютного числа лимфоцитов периферической крови по сравнению с уровнями, предшествующими вливанию, наблюдалось у всех субъектов, которым вводили БРА3Т1Р. Это уменьшение относится к общему числу лимфоцитов СЭ2, СЭ4 и СЭ8, но не затрагивает лимфоциты СЭ19.

Пример 2. Лечение ревматоидного артрита.

Для эксперимента по лечению СЭ2-связывающим агентом, таким как ЬРА3-Т1Р, были отобраны пациенты, страдающие ревматоидным артритом (НА). Это вещество получали и хранили аналогично примеру 1 и вводили пациентам в дозах примерно от 7,5 до 10 мг один раз в неделю в течение 12-24 недель. Для определения оптимальной дозы и схемы введения выполняли параллельные исследования с использованием вышеуказанных разных схем лекарственного лечения. У пациентов брали пробы периферической крови и отделяли лимфоциты при помощи центрифугирования в градиенте плотности гипакфиколла. Клетки (примерно 3 х 10⁵) анализировали при помощи проточной цитометрии (РАС8ТАК РЬи8, Вее1оп ΌίεΤίηδοη, 8аи 1о8е, СА), как указывалось выше. Состояние пациентов контролировали по нескольким показателям, включая оценки припухлости и болезненности суставов, которые являются частью стандартизированных исследований АСН 20. См. Рекощ Э.Т. е1 а1., Ашепсап Со 11 еде о£ ННеита1о1оду Соге 8е1 о£ Э^еаке АсИуйу Меакигетепй £ог Кйеита1о1б АгИпЩ СБшса1 Тг1а1к, АгИ. Кйеит., 26: 729-740 (1993).

Пример 3. Лечение воспалительного заболевания кишечника (1ВР), болезни Крона и колита.

Воспалительное заболевание кишечника является общим термином, относящимся к группе хронических воспалительных поражений желудочно-кишечного тракта неизвестной этиологии. Неспецифический язвенный колит (ИС) и болезнь Крона, две основные формы идиопатического воспалительного заболевания кишечника (ΙΒΌ) у человека, являются широко распространенными и плохо изученными заболеваниями (К1Г8пег, 1.В., е1 а1., еб§., 1иПатта1огу Во\\с1 Э^еаке: 3^гб еб., Беа апб РеЫдег, РЫ1абе1рЫа (1988); 6о1бпег, Р.Н., е1 а1., 1бюра1Ыс 1пПатта1огу Во\\с1 Э^еаке, ίη 81ет, 1.Н., еб., 1п!егпа1 Мебкте, Ьй11е Вго\уп & Со., Войоп, рр. 369-380 (1990); Се11о, ГР., е1 а1., и1сегабуе СоШЦ ίη 81ещепдег, М.Н., е1 а1., еб§., 6а81гот!е81та1 Э^еаке: Ра1йорйу8ю1оду Эха^мы^ Мада^етет, XV.В. 8аш1бег5 Со., РЫ1абе1рЫа, р. 1435 (1989)). Поскольку причины возникновения воспалительного заболевания кишечника неизвестны, возможными этиологическими причинами считаются инфекционные, иммунологические, наследствен

- 19 005948 ные или психологические факторы. При хроническом воспалительном заболевании кишечника часто имеют место вторичные внекишечные проявления, такие как артрит и перихолангит. Фармакотерапия воспалительного заболевания кишечника включает в себя введение противовоспалительных средств, таких как сульфасалазин (активное соединение, являющееся 5-аминосалицилатом, по-видимому, подавляет синтез простагландина) и глюкокортикоиды.

Болезнь Крона или региональный илеит представляет собой заболевание, характеризующееся воспалением части тонкого кишечника. Это заболевание обычно сопровождается коликами в области брюшной полости, аномалией кишечника, потерей веса и небольшой лихорадкой. Живот обычно вздут, и кишечник на ощупь уплотнен. Может возникнуть непроходимость кишечника, и в этом случае необходима срочная операция. Причина возникновения этого заболевания неизвестна. Первичным поражением является гиперплазия лимфоидной ткани в подслизистой основе кишечника и лимфатических узлах. Болезнь Крона является хроническим заболеванием желудочно-кишечного тракта и поражает чаще всего подвздошную кишку, толстую кишку или обе эти кишки. Это заболевание можно отличить от неспецифического язвенного колита дифференциальной диагностикой.

Патология неспецифического язвенного колита обычно относится к более поверхностному поражению слизистой оболочки, в отличие от болезни Крона, которая проникает в глубь слизистой оболочки и трещин кишечника (К1ббе11, К.Н., еб., Ра!1о1оду ой Эгид-тбисеб апб Тох1с Пйеакек, СкитсЬШ ЫутдкЮпе, №\ν Уогк (1982); Моткоп, В.С., е! а1., ебк., 6ак1тот!еккпа1 Ра!ко1оду, 2б еб., Ьопбоп (1979); РеподйоРге1кег, С.М., е! а1., ебк., Сак1го-1п1екНпа1 Ра!1о1оду: Ап А11ак апб Тех!. Кауеп Ргекк, №\ν Уогк (1989); Со1бтап, Н., е! а1., Нит. Ра!1о1. 13:981-1012 (1982)). Неспецифический язвенный колит обычно поражает прямую кишку и приближается, не проникая внутрь, к непораженным сегментам, которые являются признаками болезни Крона.

Приемлемые животные модели для 1ВЭ можно разделить на природные и экспериментально созданные животные модели. К сожалению, имеется всего несколько спонтанных и редко встречающихся моделей воспаления кишечника, возникающих вследствие генетического дефекта; большинство моделей не являются идиопатическими, а вызваны бактериями или другими инфекциями (например, гиперплазия, криптические абсцессы, язвы у мышей, зараженных ВасШик ркуШогттк, и хомяков, зараженных палочковидными бактериями) (81тоЬет, Ωίβ. Э|к. 8ст 33 8ирр1.: 38-108 (1988)). Редкие формы спонтанного неспецифического язвенного колита и гранулематозного энтероколита также встречаются у крыс и лошадей. Кроме того, в качестве спонтанной модели неспецифического язвенного колита и аденокарциномы кишечника используют игрунков и тамаринов (С1арр, Ν.Κ., е! а1., ебк., Όί§. Э1к. 8ск 33 8ирр1.: 18-1588 (1988)). Экспериментальные животные модели неспецифического язвенного колита получают, включая в корм токсические вещества, фармакологические средства или другие химические вещества, присутствующие в окружающей среде, вводя животным вещества, полученные у пациентов, или манипулируя иммунной системой животного (8!гоЬег, Όί§. О1к. 8ск 33 8ирр1.: 38-108 (1988); Веекап, ХУ.Ь., Ехрептеп!а1 1пйатта!огу Ьо\те1 Шкеаке, т: Кйкпег, кВ., е! а1., ебк., 1пй1атта!огу Во\те1 П1кеаке, Ьеа апб РеЫдег, РЫ1абе1рЫа, рр. 37-49 (1988); Опбегбопк, А.В., Ωίβ. Όί^ 8ск 33 8ирр1.: 408-448 (1988)).

Потенциальную терапевтическую эффективность и механизмы действия СО2-связывающего агента при лечении болезни Крона можно исследовать при помощи животной модели с использованием тамаринов. См., например, 1. Мабага е! а1., С11агас1епха1юп ой 8роп!апеоик Со1Шк ш Со!!оп-Тор Татапп (8адшпик оеб1рик) апб 1!к Кекропке !о 8и1Гака1а/1пе, 6ак!гоеп!его1оду, 88, рр. 13-19 (1985). Получают исходный раствор СО2-связывающего агента (например, БРА3Т1Р) в стерильном физиологическом растворе и плацебо в качестве контрольного вещества (только физиологический раствор) и вводят их десяти тамаринам (СТТ) с симптомами спонтанного колита (такими как диарея и другие; см. выше, Мабага е! а1.). Одной группе из пяти тамаринов внутривенно вводят СО2-связывающий агент, а другой группе из пяти тамаринов внутривенно вводят плацебо. Тамаринов, получающих СО2-связывающий агент, инъецируют 1 мг агента в день (то есть около 2 мг/кг/день из расчета массы тела тамарина, равной примерно 1/2 кг) в течение восьми дней (в 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 дни испытания). Образцы ткани толстой кишки берут у животных на биопсию через день (в 0, 2, 4, 6, 8 и 10 дни испытания). Данные биопсии используют для определения индекса острого воспаления у каждого животного, что позволяет произвести полуколичественный анализ течения колита. (См. выше Мабага е! е1.). У животных берут пробы периферической крови и отделяют лимфоциты центрифугированием в градиенте плотности гипакфиколла. Клетки (примерно 3 х 10⁵) анализируют при помощи проточной цитометрии (РАС8ТАК РЬи8, Вес!оп Оюкткоп, 8ап 1оке, СА), как указывалось выше. Полученные результаты свидетельствуют об избирательном уменьшении эффекторных Т-клеток памяти и показывают, что лечение СО2-связывающим агентом вызывает значительное (р <0,01) снижение индекса острого воспаления.

В эксперименте с участием людей для лечения СО2-связывающим агентом, таким как ЬРА3-Т1Р, выбирают субъектов, страдающих 1ВЭ. Это вещество получают и хранят аналогично примеру 1 и вводят пациентам в дозах примерно от 7,5 до 10 мг в неделю в течение 12-24 недель. Для определения оптимальной дозы и схемы введения выполняют параллельное исследование, используя вышеуказанные разные схемы введения. У пациентов берут пробы периферической крови и отделяют лимфоциты центри

- 20 005948 фугированием в градиенте плотности гипакфиколла. Клетки (примерно 3 х 10⁵) анализируют при помощи проточной цитометрии (ЕАС8ТАК РЬИ8, Вес!оп О|ск|п5оп, 8ап 1о§е, СА), как указывалось выше. Состояние пациентов контролируют по нескольким показателям, включая индекс активности болезни Крона (К]е1б5еп, 1. апб 8с11аПа1Цхку бе Мискабе11, О.В., 8сапб. 1. Са51гоеп1его1. 28: 1-9 (1993).

Пример 4. Лечение увеита.

Увеит является заболеванием, поражающим разные части глаза, в том числе переднюю и заднюю камеры глаза, а также стекловидное тело. Увеит, воспаление сосудистой оболочки глазного яблока, является причиной ухудшения зрения примерно у 10% населения в Соединенных Штатах. Панувеит представляет собой воспаление всей увеальной (сосудистой) оболочки глаза. Увеит задней камеры диагностируется как хориоретинит, и увеит передней камеры диагностируется как иридоциклит. Продукты воспалительного процесса, то есть клетки, фибрин, избыток белка, обычно присутствуют в жидком теле глаза, включая переднюю камеру, заднюю камеру и стекловидное тело, а также ткани, подвергающиеся воспалительному процессу. Увеит может возникнуть после хирургического или травматического повреждения глаза в качестве одного из элементов аутоиммунного нарушения, такого как ревматоидный артрит, болезнь Бехчета, анкилозирующий спондилоартрит, саркоидоз, а также как обособленное обусловленное иммунной реакцией заболевание глаза, то есть паропланит, иридодиклит и т.д., причина которого до сих пор неизвестна и которое возникает вследствие конкретных системных заболеваний, вызывающих отложение комплексов антиген-антитело в увеальных тканях. Все вместе эти нарушения определяются как неинфекционный увеит.

Лечение млекопитающих

В этом эксперименте использовали трех павианов. Животных анестезировали кетамином (30 мг/кг) при выполнении всех процедур. Специальное устройство, содержащее 6 мг БЕА3-Т1Р, имплантировали в правый глаз, а контрольное устройство, содержащее только полимер, имплантировали в левый глаз. У обезьян была хорошо выраженная форма увеита, поэтому криоскопию не производили. Все устройства имплантировали на расстоянии 3 мм от края в нижнем височном квадранте. Животных анестезировали через 1 неделю, 2 недели, 4 недели, 2 месяца, 4 месяца и 6 месяцев и обследовали при помощи обратной офтальмоскопии и электроретинографии. Электроретинографию выполняли в соответствии с описанием, за исключением того, что получали средние значения 5 реакций с помощью клинического усредняющего устройства №со1е1 СА-1000 (Мабщоп, Αίδ.) и импульсной лампы СКА СапхГе1б (СабйегаЬигд, Мб.). По истечении 6 мес. пробу крови анализировали ВЭЖХ с целью обнаружения циклоспорина (предел обнаружения = 25 нг/мл). Через 6 месяцев животных умерщвляли высокой дозой пентобарбитала и через левый желудочек сердца сразу же вливали формалин с 10% буфера. Глаза помещали в фиксатив и затем в парафин, рассекали и исследовали в хирургических масках с целью обнаружения признаков токсичности. Брали пробу периферической крови и отделяли лимфоциты центрифугированием в градиенте плотности гипакфиколла. Клетки (примерно 3 х 10⁵) анализировали при помощи проточной цитометрии (ЕАС8ТАК РЬи8, ВесЮп Пккткоп, 8ап 1о§е, СА).

Фармакокинетика

В этом эксперименте использовали двадцать четыре животных (группа 1). СО2-связывающий агент смешивали с исходными растворами этанола и воды в соотношении 50:50 в концентрации 1 мкг/20 мкл и 10 мкг/20 мкл. В исходный раствор добавляли также меченный тритием СО2-связывающий агент (1 мкС1/20 мл). Животных анестезировали кетамином (60 мг) и ксилазином (20 мг) и расширяли зрачок, закапывая в глаз одну каплю гидрохлорида фенилэфрина (2,5%) и тропикамида (1%). СЭ2-связывающий агент вводили инъекционной иглой № 30 в стекловидное тело через верхнюю прямую мышцу на расстоянии примерно 5 мм от края. Первой группе из двенадцати животных вводили дозу, равную 1 мкг в 20 мкл, и второй группе из 12 животных вводили дозу, равную 10 мкг в 20 мкл. Инъекцию делали в среднюю часть стекловидного тела с особой осторожностью, чтобы не повредить хрусталик. В первой группе, которой вводили 1 мкг дозу, по 3 животных умерщвляли через 0,5, 3,6 и 24 ч. Во второй группе, которой вводили 10 мкг дозу, по 3 животных умерщвляли через 0,5, 6, 24 и 48 ч. Глаза удаляли и сразу же замораживали при -70°С.

Ткани для анализа получали так, как описано ниже. Период полувыведения из стекловидного тела и объем распределения определяли, выполняя регрессионный анализ с построением графика концентрации в зависимости от времени.

Лечение

В этом эксперименте использовали одиннадцать животных. СО2-связывающий агент, находящийся в устройстве с пролонгированным высвобождением, вводили в правый глаз. Устройство, содержащее только полимеры, вводили в левый глаз. Прежде чем ввести указанные устройства в глаза, выполняли офтальмоскопию и электроретинографию (ЕКС). Скотопические и фотопические электроретинограммы (ЕКС) регистрировали для обоих глаз, используя электроды в контактных линзах (ЕКС-1е!) с двухканальным клиническим устройством усреднения сигналов (Саб^е11 5200, Кеппе'Мск, Аакк.) и импульсную установку СапхГе1б (Саб\\'е11 УРА-10, Кеппетаск, Аакк.). Электроретинограммы адаптированного к темноте глаза получали после темновой адаптации в течение по меньшей мере 30 мин при 0,33 Гц и ус

- 21 005948 редняли данные для 20 стимулирующих вспышек. Электроретинограммы адаптированного к свету глаза получали при 2,8 Гц после световой адаптации в течение по крайней мере 5 мин и также усредняли данные для 20 вспышек. У полученных волн определяли амплитуды и время ожидания. Чтобы максимально уменьшить влияние индивидуальных и ежедневных изменений (13-15), реакции ЕКС оценивали, используя отношение амплитуды экспериментального глаза (правого) к амплитуде контрольного глаза (левого). При одинаковых амплитудах экспериментального и контрольного глаза отношение равно 1. Уменьшение указанного отношения отражает относительное уменьшение амплитуды экапериментального глаза.

Исследования повторяли в 1, 7, 14 день и затем через каждые две недели в течение последующих 6 месяцев. Трех животных умерщвляли через 6 недель и двух животных умерщвляли через 16 недель. Для оценки обратимой токсичности устройство удаляли у 3 животных через 16 недель. Этих животных обследовали каждую неделю в течение двух месяцев и затем умерщвляли. Оставшихся двух животных умерщвляли через 26 недель. Сразу же после умерщвления животным вливали фиксатив (формалин с 10% буфера или 6% глутаральдегид) через левый желудочек сердца. Глаза удаляли и помещали в фиксатив. Три образца размером 3 мм х 6 мм, полученных из заднего полюса глазного яблока, помещали в парафин или пластик и делали срезы. Один срез из каждого образца исследовали в хирургических масках с целью обнаружения признаков токсичности.

Пример 5. Лечение псориатического артрита.

В этом примере дано описание клинических результатов и реакции ткани на воздействие СЭ2связующего агента у субъектов, страдающих псориатическим артритом.

Псориатический артрит возникает у 5-8% пациентов, страдающих псориазом, и является обычным хроническим ревматическим заболеванием, которое может привести к сильному поражению суставов, если его не лечить. Недавно выполненные клинические исследования были направлены на выявление неблагоприятных прогностических признаков. Инвазивный метод лечения на ранней стадии рекомендован пациентам со значительным воспалением суставов и наличием определенных антигенов НЬА. Псориаз и псориатический артрит считаются типичными заболеваниями, опосредованными Т-клетками. Иммунопатогенные данные позволили установить, что эта болезнь обусловлена НЬА класса I и важная роль в ней принадлежит Т-клеткам СЭ8+.

Построение исследования

В этом примере описано экспериментальное исследование в фазе II типичного СО2-связывающего агента с участием пациентов, страдающих псориатическим артритом.

Это исследование охватывает трехмесячный период лечения, в течение которого пациентам делают еженедельные внутривенные инъекции СО2-связывающего агента. Влияние этого агента на псориатические поражения кожи и артрит измеряют клиническими и лабораторными методами в начале, в середине и в конце периода лечения. До начала лечения через 4 недели и после окончания лечения производят биопсию синовиальной жидкости для иммуногистологических исследований стандартизированными методами. До начала лечения через 4 и 12 недель и после трехмесячного лечения производят биопсию кожи для иммуногистологических исследований стандартизированными методами.

Группа больных, участвующих в исследовании Число обследуемых субъектов

Субъектов, страдающих псориатическим артритом, обследуют с целью отбора пациентов для участия в исследовании, при этом они должны удовлетворять нижеследующим критериям:

1) Мужчины или женщины в возрасте от 18 до 70 лет включительно.

2) Женщины не должны быть способны к деторождению (стерилизованы хирургическим путем или в возрасте по меньшей мере через один год после наступления менопаузы) или должны иметь отрицательную пробу на наличие беременности во время обследования и пользоваться эффективными противозачаточными средствами в течение по меньшей мере одного месяца до введения испытуемого лекарственного средства, во время исследования и в течение 6 месяцев после лечения.

3) Пациенты должны удовлетворять критериям диагностики псориатического артрита.

4) Пациенты должны иметь клинически выраженную картину артрита по меньшей мере одного коленного сустава и 3 других суставов, утреннюю тугоподвижность суставов, длящуюся по меньшей мере 30 мин, и реакцию оседания эритроцитов (РОЭ), равную по меньшей мере 28 мм.

5) Пациентам должен быть поставлен диагноз бляшкообразного псориаза более чем за 12 месяцев до введения первой дозы лекарственного средства.

6) Показатель РА81 у пациентов должен быть равен 12 или больше.

7) Пациенты должны прекратить прием всех иммуномодулирующих лекарственных средств, таких как метотрексат, циклоспорин и кортикостероиды, и всех других соединений, используемых для лечения псориаза и/или псориатического артрита, за исключением средств нестероидной противовоспалительной терапии (Ν8ΑΙΌ) по меньшей мере за четыре недели до обследования.

8) Абсолютный подсчет лимфоцитов СЭ4+ у пациентов должен соответствовать или быть выше нижнего предела нормального количества в течение 14 дней до введения первой дозы.

Схема лечения

СО2-связывающий агент вводят в виде внутривенной инъекции ударной дозы, равной 7,5 мг, один

- 22 005948 раз в неделю, причем общее количество вводимого средства равно 12 дозам.

Изменение схемы лечения

Следующая доза исследуемого лекарственного средства может быть введена субъекту, удовлетворяющему нижеследующим требованиям:

абсолютное количество лимфоцитов периферической крови у субъекта через 24 ч после введения первой дозы должно превышать 67% нижнего предела нормального показателя, превышающего 50% исходного измерения у данного субъекта;

абсолютное количество лимфоцитов СЭ4+, измеренное до введения предыдущей дозы, должно превышать 300 клеток/мм³.

При несоответствии любому из вышеуказанных критериев введение очередной дозы субъекту отменяют, и этого субъекта подвергают повторному обследованию на следующей неделе. Если у субъекта наблюдается продолжительное уменьшение абсолютного количества лимфоцитов периферической крови или абсолютного количества лимфоцитов СЭ4+ в течение более 28 дней, введение испытуемого лекарственного средства полностью прекращают.

Прекращение введения испытуемого лекарственного средства и выведение субъектов из исследования

В следующих разделах описаны критерии для прекращения введения испытуемого лекарственного средства и критерии для выведения субъектов из исследования.

График событий Испытания и оценки

Все пробы крови для гематологического анализа и анализа субпопуляции лимфоцитов берут в одно и то же время дня, чтобы предотвратить влияние изменений, происходящих в течение суток.

Нижеследующие испытания и оценки должны быть выполнены в указанные периоды времени до введения каждой дозы испытуемого лекарственного средства, за исключением особо оговоренных случаев.

Полное физикальное обследование выполняют во время 5, 9 и 13 посещения.

Измерение показателей жизненно важных функций производят во время 1-13 и 15-17 посещений.

Массу тела измеряют во время 1-13 и 15-17 посещений.

Анализ мочи проводят во время 5, 9, 13 и 17 посещения.

Химический анализ крови выполняют во время 5, 9, 13 и 17 посещения.

Гематологическое исследование выполняют во время 1-17 посещений. Первый лабораторный анализ выполняют за 48 ч до введения первой дозы испытуемого лекарственного средства. Все другие исследования выполняют за 24 ч до введения каждой дозы.

Анализ субпопуляции лимфоцитов выполняют во время 1-17 посещений.

Тест на наличие беременности и анализ мочи у женщин выполняют во время 5, 13 и 17 посещения.

Количественное измерение иммуноглобулинов 1дС, 1дА и 1дМ выполняют во время 13-го посещения.

РА81 определяют во время 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13-17 посещений.

Ногти исследуют во время 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13-17 посещений.

81Ь-2К и 5СЭ27 измеряют во время 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13-17 посещений.

Пункционную биопсию кожи пораженного участка, не подвергающегося воздействию солнечного света, выполняют во время 1, 5, 13 посещения и необязательную биопсию выполняют во время 17-го посещения.

Основные показатели по программе АСК измеряют во время 1, 5, 9, 13 и 17 посещения.

Критерии улучшения показателей по программе АСК определяют во время 5, 9, 13 и 17 посещения.

Артроскопическую биопсию синовиальной оболочки колена производят во время 1, 5 и 13 посещения.

Оценка эффективности

Клиническая оценка эффективности.

Артрит.

Все оценки эффективности лечения артрита должны быть выполнены одним исследователем/ревматологом для каждого обследуемого субъекта: измерение основных показателей и их улучшения по программе АСК.

Поражение кожи.

Все оценки эффективности лечения поражения кожи должны быть выполнены одним исследователем/дерматологом для каждого обследуемого субъекта:

Оценка РА81.

Исследование ногтей.

Лабораторная оценка эффективности.

Артроскопическая биопсия синовиальной оболочки.

Иммуногистологическое исследование синовиальной оболочки.

Сывороточные маркеры активности псориаза.

- 23 005948

Биопсия кожи.

Иммуногистологическое исследование кожи.

Оценка безопасности.

Клиническая оценка безопасности.

Физикальное обследование.

Показатели жизненно важных функций (температура, частота сердечных сокращений, частота дыхания и кровяное давление в положении лежа на спине).

Масса тела.

Наблюдение с целью выявления инфекции.

Наблюдение за неблагоприятными показателями.

Лабораторная оценка безопасности.

Гематология: клинический анализ крови с определением лейкоцитарной формулы и подсчетом тромбоцитов выполняют через 24 ч после введения дозы, и результаты анализа контролирует исследователь в каждом научно-исследовательском центре.

Химический анализ крови: натрий, калий, хлорид, бикарбонат, азот мочевины крови, креатинин, кальций, фосфат, альбумин, общий белок, щелочная фосфатаза, общий билирубин, АГАТ, А8АТ и гамма-глутамилтрансаминаза.

Анализ мочи.

Оценка безвредности продукта и безопасности испытания.

Количественное определение субпопуляции лимфоцитов периферической крови при помощи проточной цитометрии с использованием хорошо выраженных маркеров субпопуляции для Т-лимфоцитов (СБ4, СБ8).

Статистический отчет и аналитический план

Величина группы обследуемых субъектов.

Экспериментальное исследование с участием 10 субъектов считается достаточным для оценки безопасности и эффективности. Данные, полученные при испытании СО2-связывающих агентов, таких как слитый белок ^РА-3/Iд^₁, свидетельствуют о значительном влиянии на общее количество лимфоцитов и субпопуляции СЭ4 и СЭ8.

Описание конечных точек исследования.

Конечные точки первичного клинического исследования эффективности испытуемого лекарственного средства при лечении артрита и псориаза соответствуют концу лечения через 12 недель. Промежуточные конечные точки клинического исследования эффективности соответствуют 4 и 8 неделям лечения. Конечная точка первичного исследования безопасности соответствуют концу периода наблюдения после окончания лечения продолжительностью 3 месяца. Промежуточные конечные точки определения иммуногистологических изменений состояния кожи и синовиальной оболочки соответствуют двум периодам времени: через 4 недели и через 12 недель лечения.

Статистические методы, используемые при выполнении объективных анализов.

Общий метод анализа заключается в установлении различий между параметрами клинического и лабораторного исследования, измеренными до начала и в конце лечения. Для этого используют, например, односторонний дисперсионный анализ или анализ ковариансы либо логистическую регрессию. Реакции должны быть преобразованы до выполнения анализа. В случае необходимости можно использовать непараметрические методы.

Клинические анализы эффективности.

Определяют количественное отношение субъектов, характеризующихся 20% улучшением на основании измерения основных показателей по программе АСК. Определяют количественное отношение субъектов, характеризующихся 50% ухудшением показателей по сравнению с исходными данными на основании оценки РА81. Другие измерения эффективности включают в себя минимальную оценку РА81, общую оценку эритемы, общую оценку уплотнения, общую оценку шелушения и оценку состояния ногтей.

Лабораторные анализы эффективности.

Иммуногистологические исследования синовиальной оболочки и кожи и определение уровней сыворотки в маркерах активности псориаза позволяют получить данные, которые сравнивают с исходными показателями.

Несмотря на то, что авторы изобретения описали несколько вариантов осуществления изобретения, очевидно, что основные варианты могут быть изменены для получения других вариантов, при осуществлении которых применяются способы согласно данному изобретению. Поэтому должно быть понятно, что в объем данного изобретения входят все альтернативные варианты осуществления изобретения и модификации, которые приведены в вышеизложенном описании изобретения и в прилагаемой формуле изобретения; это изобретение не ограничивается конкретными вариантами его осуществления, приведенными здесь в качестве примера.

Claims (35)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение эффективного количества СИ2-связывающего агента для избирательного снижения числа СП45КО-позитивных эффекторных Т-лимфоцитов памяти в организме пациента при производстве фармацевтической композиции для лечения заболевания, выбранного из группы, включающей в себя псориатический артрит, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, атопический дерматит, увеит, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит и Т-клеточную лимфому кожи.
2. 2. Применение по п.1, где СИ2-связывающий агент выбран из группы, состоящей из гомологов антитела против ЬЕА-3, гомологов антитела против 0Ό2. растворимых полипептидов ЬЕА-3, растворимых полипептидов 0Ό2, агентов, имитирующих 0Ό2, и агентов, имитирующих ЬЕА-3.
3. 3. Применение по п.2, где СИ2-связывающий агент является растворимым полипептидом ЬЕА-3, содержащим аминокислотную последовательность, которая выбрана из группы, включающей в себя

   - 34 005948 (а) аминокислоты 1-92 последовательности 8Е0 ΙΌ № 2;

   (б) аминокислоты 1-80 последовательности 8ЕО ΙΌ № 2;

   (в) аминокислоты 50-65 последовательности 8ЕО ΙΌ № 2 и (г) аминокислоты 20-80 последовательности 8ЕО ΙΌ № 2.
4. 4. Применение по п.2, где растворимый полипептид ЬЕА-3 является слитым белком, содержащим 92 аминоконцевые аминокислоты зрелого ЬЕА-3 и 10 С-концевых аминокислот шарнирной области !дС1 человека.
5. 5. Применение по п.4, где растворимый слитый белок ЬЕА-3 дополнительно содержит области СН2 и СН3 константного домена тяжелой цепи !дС1 человека.
6. 6. Способ лечения заболевания, выбранного из группы, включающей в себя псориатический артрит, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, атопический дерматит, увеит, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит и Т-клеточную лимфому кожи, заключающийся во введении пациенту эффективного количества СБ2-связывающего агента для избирательного снижения числа СБ45КО-позитивных эффекторных Т-лимфоцитов памяти.
7. 7. Способ по п.6, согласно которому эффективное количество СБ2-связывающего агента составляет примерно от 0,001 до 50 мг в расчете на кг массы тела пациента.
8. 8. Способ по п.6, согласно которому эффективное количество СБ2-связывающего агента составляет примерно от 0,025 до 0,15 мг в расчете на кг массы тела пациента.
9. 9. Способ по п.6, согласно которому эффективное количество СБ2-связывающего агента составляет 0,05, 0,075, 0,1125 или 0,165 мг в расчете на кг массы тела пациента.
10. 10. Применение СБ2-связывающего агента для избирательного снижения числа СБ45КОпозитивных эффекторных Т-лимфоцитов памяти в организме пациента при производстве фармацевтической композиции для лечения рассеянного склероза, увеита, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, неспецифического язвенного колита или Т-клеточной лимфомы кожи.
11. 11. Применение по п.10, где СБ2-связывающий агент является растворимым полипептидом ЬЕА-3, содержащим аминокислотную последовательность, которая выбрана из группы, включающей в себя (а) аминокислоты 1-92 последовательности 8ЕО ΙΌ № 2;

    (б) аминокислоты 1-80 последовательности 8ЕО ΙΌ № 2;

    (в) аминокислоты 50-65 последовательности 8ЕО ΙΌ № 2 и (г) аминокислоты 20-80 последовательности 8ЕО ΙΌ № 2.
12. 12. Применение по п.11, где растворимый полипептид ЬЕА-3 является слитым белком, содержащим 92 аминоконцевые аминокислоты зрелого ЬЕА-3 и 10 С-концевых аминокислот шарнирной области !дС1 человека.
13. 13. Применение по п.12, где растворимый слитый белок ЬЕА-3 дополнительно содержит области СН2 и СН3 константного домена тяжелой цепи !дС1 человека.
14. 14. Применение по п.2, где СБ2-связывающий агент является растворимым полипептидом ЬЕА-3.
15. 15. Применение по п.1, где пациентом является человек.
16. 16. Способ лечения ревматоидного артрита, заключающийся во введении пациенту эффективного количества растворимого полипептида ЬЕА-3 для избирательного снижения числа СБ45КО-позитивных эффекторных Т-лимфоцитов памяти и метотрексата.
17. 17. Способ по п.16, согласно которому полипептид ЬЕА-3 и метотрексат вводятся в составе единой лекарственной формы.
18. 18. Способ по п.16, согласно которому лечение заключается в одновременном введении полипептида ЬЕА-3 и метотрексата.
19. 19. Способ по п.16, согласно которому лечение заключается в последовательном введении полипептида ЬЕА-3 и метотрексата.
20. 20. Способ по п.16, согласно которому полипептид ЬЕА-3 и метотрексат вводятся в форме совместного конъюгата.
21. 21. Способ по п.16, согласно которому растворимый полипептид ЬЕА-3 содержит аминокислотную последовательность, которая выбрана из группы, включающей в себя (а) аминокислоты 1-92 последовательности 8ЕО ΙΌ № 2;

    (б) аминокислоты 1-80 последовательности 8ЕО ΙΌ № 2;

    (в) аминокислоты 50-65 последовательности 8ЕО ΙΌ № 2 и (г) аминокислоты 20-80 последовательности 8ЕО ΙΌ № 2.
22. 22. Способ по п.16, согласно которому растворимый полипептид ЬЕА-3 является слитым белком, содержащим 92 аминоконцевые аминокислоты зрелого ЬЕА-3 и 10 С-концевых аминокислот шарнирной области !дС1 человека.
23. 23. Способ по п.16, согласно которому растворимый слитый белок ЬЕА-3 дополнительно содержит области СН2 и СН3 константного домена тяжелой цепи !дС1 человека.
24. 24. Способ по п.17, согласно которому доза полипептида ЬЕА-3 составляет примерно от 0,001 до 50 мг в расчете на кг веса тела пациента.
25. 25. Способ лечения псориатического артрита, рассеянного склероза, атопического дерматита, увеи- 35 005948 та, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, неспецифического язвенного колита и Тклеточной лимфомы кожи, заключающийся во введении пациенту эффективного количества растворимого полипептида ЬРА-3 для избирательного снижения числа СВ45ЯО-позитивных эффекторных Тлимфоцитов памяти, и метотрексата.
26. 26. Способ лечения ревматоидного артрита, псориатического артрита, рассеянного склероза, атопического дерматита, увеита, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, неспецифического язвенного колита и Т-клеточной лимфомы кожи, заключающийся во введении пациенту эффективного количества растворимого полипептида ЬРА-3 для избирательного снижения числа СВ45ЯО-позитивных эффекторных Т-лимфоцитов памяти, и циклоспорина А.
27. 27. Применение по любому из пп.1-5, где заболеванием является псориатический артрит.
28. 28. Применение по любому из пп.1-5, где заболеванием является ревматоидный артрит.
29. 29. Применение по любому из пп.1-5, где заболеванием является рассеянный склероз.
30. 30. Применение по любому из пп.1-5, где заболеванием является атопический дерматит.
31. 31. Применение по любому из пп.1-5, где заболеванием является увеит.
32. 32. Применение по любому из пп.1-5, где заболеванием является воспалительное заболевание кишечника.
33. 33. Применение по любому из пп.1-5, где заболеванием является болезнь Крона.
34. 34. Применение по любому из пп.1-5, где заболеванием является неспецифический язвенный колит.
35. 35. Применение по любому из пп.1-5, где заболеванием является Т-клеточная лимфома кожи.