CZ2001725A3 - Použití CD2 vazebného činidla pro výrobu léku k modulaci paměťových T buněk - Google Patents

Description

Použití CD2 vazebného činidla pro výrobu léku k modulaci paměťových T buněk

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká přípravků působících jako inhibitory interakce CD2/LFA-3 k léčeni nemocí charakterizovaných přítomností aktivovaných T buněk u savců, včetně člověka. K takovým nemocem patří zánětlivá střevní choroba, psoriatická artritida, revmatoidní artritida a roztroušená skleróza mozkomíšní.

Dosavadní stav techniky

Buňky prezentující antigen (APC) exprimují na svém povrchu ve vysoké hustotě antigen hlavního histokompatibilního komplexu (MHC) II. třídy. Molekuly MHC II. třídy na sebe váži peptidy, které pocházejí z antigenů, které se dostaly do buňky endocytózou a jsou rozpoznávány primárně pomocnými T lymfocyty. Receptory T buněk na povrchu T buněk rozpoznávají antigen jako peptidový fragment navázaný na molekuly na buněčném povrchu kódované MHC (Springer, Adhesion Receptors of the Immune Systém, Nátuře, 346, pp. 425-27 (1990)).

Kromě interakcí receptorů T buněk s MHC existuje ještě řada interakcí mezi molekulami expr linovanými na povrchu APC a na povrchu T buněk. Takové molekuly na povrchu buněk, často nazývané adhezní molekuly, se podílejí na celé řadě buněčných funkcí jako např. buněčné adhezi, rozpoznávání antigenů, • · • ·

- 2 ko-stimulační signalizace při aktivaci T buněk a stimulace efektorů cytotoxických T buněk (Adhesion Molecules in Diagnosis and Treatment of Inflammatorý Diseases, The Lancet,. 336, pp. 1351-52 (1990)). Buněčná adheze se zřejmě podílí na aktivaci proliferace T buněk při vzniku imunitní reakce (Hughes et al., The Endothelial Cell as a Regulátor of T-cell

Function, Immunol. Rev., 117, pp. 85-102,( 1990)).

Jedna cesta, kterou jsou T buňky aktivovány, je ta, že se svými antigenně specifickými T buněčnými receptory naváží na MHC-peptidové komplexy na povrch antigen prezentujících buněk jako jsou např. makrofágy. Aktivace

T buněk stimuluj e proliferaci a diferenciaci dvou typů funkčních

T buněk:

pomocných buněk, které podporují proliferaci zráni

B lymfocytů produkujících protilátky, zabij ečských buněk, které lyžují cílové buňky (Bierer et al.,

A Monoclonal

Antibody to LFA-3, the CD2 Ligand,

Specifically Immobilizes

Major Histocompatibility Complex Proteins”, Eur. J. Immunol.

19: pp. 661-65 (1989); Springer Adhesion Receptors of the

Immune Systém, Nátuře, 346, pp. 425-34 (1990)).

Existuje řada nemocí, které jsou charakteristické abnormální imunitní odpovědi a mnohé- z nich jsou zvláště charakteristické zvýšenou aktivací T buněk. T buňky hrají hlavní roli v imunitní reakci .tím, že interaguji' s cílovými buňkami prezentujícími antigen. Tak např. T buňkami zprostředkované usmrcení cílové buňky je mnohakrokový proces, který obsahuje v počáteční fázi, adhezi cytolytických T buněk (tj . efektorových buněk) ha Cílové buňky. Také pomocné. T buňky iniciují imunitní reakci adhezi na buňky prezentující antigen.

Tyto interakce T buněk s cílovými buňkami a s buňkami prezentujícími antigen jsou vysoce specifické a jsou závislé na • o • · • ·

- 3 rozpoznáni antigenu na povrchu cílové buňky . a buňky prezentující antigen (APC) jedním z mnoha antigenně specifických receptoru na povrchu T buněk.

Interakce antigen-receptor T buněk s dalšími buňkami jsou usnadněny také pomocí. 15 různých proteinů na povrchu T buněk, např. antigen-receptorový komplex CĎ3 a pomocně adhezní molekuly jako jsou např. CD4, LFA-1, CD8, a CD2. Jsou také usnadněny díky dalším pomocným adhezním molekulám jako jsou LFA-3, ICAM- I a MHC, které jsou exprimována na povrchu cílových buněk nebo buněk prezentujících anti.gen. Tak např. LFA-I a jeho protireceptor ICAM-I nebo ICAM-2, stejně jako CD2 a jeho protireceptor LFA-3 se podílejí na buněčné adhezi· a aktivaci T buněk. Je známo, že interakce LFA-I/ICAM a CD2/LFA-3 jsou nezávislé. Řada dalších molekul přítomných na klidových T buněk se také podílí na. adhezi T buněk, jde např. o E2 (MIC2), VLA-4 (CD49d), CD44 (Hermes, Pgp-1, ECMRIII) a H19 (N4) (viz Makgoba et al., The CD2-LFA-3 and LFA-l-ICAM Pathways: Relevance to T-cell Recognition, Immunol. Today, 10, pp. 417-22 (1989)). .

Interakce mezi CD2 a LFA-3 nejsou dosud dobře známy z hlediska významu pro aktivaci T buněk. Současné výzkumy předpokládají, že existuje specifická interakce mezi CD2 (adhezní molekula T buněk) a LFA-3 (adhezní molekula cílových buněk a buněk prezentujících antigen), která zprostředkovává adhezi T antigen.

buněk na cílové buňky a nebo buňky prezentující

Má se za to, že tato adheze buněk, tj . interakce buňka-buňka, se podílí na iniciaci funkční odpovědi T buněk

(Dustin	et al.,	Purified	Lymphocyte	Functión	Associated
Antigen	3 Binds to	CD2 and	Mediates T	Lymphocyte	Adhesion.
J. Exp.	Med., 165,	pp. 677-92 ( 1987);	Springer et	al., The

Lymphocyte Function-associated LFA-1, CD2, and LFA-3 Molecules:· Cell Adhesion Receptors of the Immune Systém, Ann. Rev. Immunol., 5, pp. 223-52 5 (1987)).

LFA-3, který byl nalezen na povrchu mnoha druhů buněk, včetně lidských erytrocytů, je předmětem celé řady výzkumů, které usiluji o objasněni jeho role v interakcích T buněk (viz např. Krensky et al., The Functional Šignificance, Distribution, and Structure of LFA-1, LFA-2, and LFA-3: Cell Surface Antigen Associated with CTL-Target Interactions. J. Immunol., 131(2), pp. 611-16 (1983); Shaw et al., Two AntigenIndependent Adhesion Pathways Ušed by Human Cytotoxic T-cell Clones, Nátuře, 323, pp. 262-64 ( 1986)).

Byly identifikovány dvě přírodní formy LFA-3. Jedna forma LFA-3 (transmembránový LFA-3) je ukotvena v buněčné membráně transmembránovou hydrofóbni doménou. cDNA kódující tuto formu LFA-3 již byla klonována a se.kvencována (viz Wallner et al., Primary Structure of Lymphocyte Function-Associated Antigen-3 (LFA-3), J. Exp. Med., 166, pp. 923-32 ( 1987)). Jiná forma LFA-3 je ukotvena k membráně prostřednictvím kovaleňtní vazby k fosfatidylinositolu (PI-obsahující glykolipiď). Tato druhá forma byla pojmenována, jako Pl-vázaný LFA-3 a cDNA kódující tuto formu LFA-3 byla také klonována a sekvencována (Wallner et al., PCT přihláška WO 90/02181).

Lidská molekula CD2 je povrchový glykoprotein velikosti 50 kDa exprimovaný na více než 95 % thymocytů a v podstatě na všech periferních T lymfocytech. Biochemické analýzy užívající specifické monoklonálni protilátky ukázaly, že CD2 je specifický pro T-buněčnou řadu a vyskytuje· se na povrchu T buněk v několika různě glykosylovaných formách (Howard et al., A Human T Lymphocyte Differentíation Markér Defined by

- 5 ······ ·· · ···· ·· ·· ···· ·· 999

Monoclonal Antibodies that Block E-Rosette Formation,

J. Immunol., 12 6, pp.

2117-22 (1981); Brown et al., in

Leukocyte Typing III, ed. McMichael, Oxford University Press,.

al., Molecular

Cloning and

Expression of Til cDNAs Reveals a Receptor-Like

Structure on.

Human T Lymphocytes, Proč. Nati, (1987)). .

Acad, Sci. USA,

84, pp. 2941Sekvence lidského genu pro CD2 byla publikována (viz Seed and Aruffo,

Molecular

Cloning of the CD2 Antigen, the T-cell

Erythrocyte

Proč. Nati.

Receptor, by a

Acad. Sci. USA, al., Molecular Cloning and a Receptor-like Structure on

Rapid Immunoselection Proceduře.

Expression of TI' 1 cDNAs

Reveal

Human T Lymphocytes,

Acad, Sci, USA, 84, pp. 2941-45 (1987)).

Proč.

Nati.

CD2

CDNA umožnily predikci složení aminokyselinových

CD2 ze signálního který zbytků, extracelulárniho segmentu ze transmembránové domény a cytoplazmatického úseku ze

117 (Sayre et al. , viz výše

Cloning of the Human

Proč. Nati.

Acad. Sci

Aruffo, supra (1987) ;

klony peptidu velikosti je odštěpován, aminokyselinových aminokyselinových aminokyselinových

Sewell et

T-Lymphocyte Surface CD2

Clayton et al.. · Eur.

J.

zbytků, zbytků zbytků al·., Molecular immun.,

17, pp.

1367-70 (1987)). Rozpustné polypeptidy vazebnou doménu byly popsány (PCT přihláška 90/08187).

Monoklonálni protilátky k CD2,

CD2 mající LFA-3 publikovaná jako WO např. TS2/18, Tll_x, ·

Tli, Tll₃,

Hughes et al., Tbe

Function.

Immunol,

Endothelial Cell as a Regulátor of T-Cell

Reviews, 117, pp. 85-102 (1990) ; Meuer, Tin

Alternativě Pathway of T-Cell Activation: A Functional Role for • · • ···

- 6 the 50 kD Til Sheep Erythrocyte Receptor Protein. Cell, 36, pp. 897 - 906 ( 1984) ) .

Vazba antigenně specifických receptoru T buněk na MHC-peptidové komplexy na povrchu buněk prezentujících antigen se také podílí na vytváření tzv. paměťových buněk, které se obecně tvoří v průběhu adaptivní imunitní reakce vyžadující kontakt s antigenem a pak expanzi .antigenně-specifických paměťových buněk. T-buněčná paměť je pravděpodobně závislá na opakované stimulaci antigenem. Paměťové buňky zvětšují svou vazebnou aviditu pro antigen prezentující buňky prostřednictvím zvýšené exprese CD2, LFA-3 a dalších pomocných adhezních molekul. A skutečně důležitá fenotypová změna v isoformě leukocytového antigenu CD45R dovoluje rozlišit naivní T buňky, které exprimují CD45R, od paměťových T buněk, které reagují s formou CD45RO s nízkou molekulární hmotností.

Zjištěni, že většina, pokud ne vůbec všechny, paměťových buněk je vystavena opakovanému bombardování antigeny posiluje pravděpodobnost toho, že většina vlastností spojených se subpopulací CD4SRO je ve skutečnosti projevem efektorových T buněk. Existuje stále rostoucí a inspirující literatura, která popisuje asociaci CD45RO paměťových efektorových buněk s přítomností různých zánětlivých nemocí jako jsou zánětlivé nemoci střev včetně nemocí jako je Crohnova nemoc a ulcerativní kolitida (Horiuchi et al., J. Japan. Soc. Colo. Proctol., 45: 391-393 (1992)), psoriatická artritida (Veale et al., Ann. Rheum. Dis. 53: 450-454 (1994), revmatoidní artritida (Muller et al. . AutoimmunitY 14: 37-43 (1992), uveitida (Ohta et al., Curr. Eye Res., 15: 299-306 (1996)-, nefritida (Rodruguez-Poerez et al., Am. J. Nephrol., 15: 386-391 (1995) a roztroušená skleróza mozkomíšní (Crucian et al., Clin. Diag. Lab.

- 7 Immunol. 2: 249-252 (1995), Lehmann et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 85: 202-209 (1997), Muller et al.> Autoimmunity 14: 37-43 (199?), Qin et al., J. Clin. Immunol.,. 13:152-161 (1993) .

Vzhledem k možné úloze paměťových efektorových T lymfocytů v patogenezi, existuje potřeba zlepšit způsoby, jak modulovat tyto buňky u pacientů trpících výše zmíněnými nemocemi.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká způsobu prvence a léčeni nemocí, které jsou charakterizovány infiltrací paměťových efektorových >T lymfocytů v orgánu savce. Podstatou je, že se savci podává CD2 vazebné činidlo, které je schopné modulovat množství a/nebo distribuci paměťových efektorových T lymfocytů. Takové terapie, založené na předkládaném vynálezu, jsou z mnoha důvodů lepší než dosavadní, např. proto, že jsou mnohem vice selektivní, tudíž mají mnohem menši imunosupresivni účinek než dosavadní terapie a menší všeobecnou toxicitu.

K látkám, které lze užít ve vynálezu, patří jakékoliv molekuly, které jsou vazebným činidlem pro CD2 (CD2 vazebným činidlem). Patří sem tedy molekuly nebo jiné chemické entity, které modulují interakce CD2/LFA-3. Výhodně je činidlo vybráno ze skupiny obsahující homology protilátek anti-LFA-3, homology protilátek an'ti-CD2, rozpustné polypeptidy LFA-3, rozpustné polypeptidy CD2, LFA-3 nebo CD2 mimetická činidla (jako např. malé organické molekuly) a jejich deriváty. i

Jeden aspekt vynálezu se týká selektivní modulace φφφ · φφ φ φφφ φφφφ φ φ φ φφ • φφ φ φφ φφ φ φφφφ φφ ·· φφφφ ·· φφφ paměťových efektorových Τ lymfocytů u nemocného subjektu, který spočívá v tom, že se subjektu podává · účinné množství CD2 vazebného činidla. Paměťové T lymfocyty infiltrují cílový orgán subjektu. Výhodně paměťové T lymfocyty' jsou CD45RO lymfocyty. CD2 vazebné činidlo je vybráno ze skupiny obsahující homology anti-LFA-3 protilátek, homology anti-CD2-protilátek, rozpustné polypeptidy LFA-3, rozpustné polypeptidy CD2, CD2 mimetická činidla a LFA-3 mimetická činidla. Vynález se týká léčeni nemocí u subjektu, které jsou charakterizovány tím, že paměťové efektorové T lymfocyty se účastní patogeneze, přičemž léčení spočívá v tom, že se subjektu podává účinné množství CD2 vazebného činidla.

Nemoci patří do skupiny obsahující psoriatickou artritidu, revmatoidní artritidu, roztroušenou sklerózu mozkomí.šní, atopickou dermatitidu, uveitidu, zánětlivou nemoc střev,

Crohnovú nemoc, ulcerativní kolitidu a kutánní T-buněčný lymfom.

Dále se vynález týká také způsobu modulace paměťových efektorových T lymfocytů u savců, kteří jsou charakterizováni výskytem infiltrace paměťových efektorových T lymfocytů do orgánů savce. Způsob spočívá v tom, že se subjektu podává účinné množství CD2 vazebného činidla, které je dostatečné k modulaci paměťových efektorových T lymfocytů v příslušném orgánu. 'Takový savce trpí nemocí patřící do skupiny, která obsahuje psoriatickou artritidu, revmatoidní artritidu, roztroušenou sklerózu mozkomíšní, atopickou dermatitida, uveitidu, zánětlivou nemoc střev, Crohnovú nemoc, ·ulcerativní kolitidu a kutánní T-buněčný lymfom.

Přípravky podle, vynálezu obsahují populaci paměťových efektorových T lymfocytů, kterou lze získat ze savce trpícího, nemocí, která je charakterizována přítomností infiltrujících

- 9 paměťových efektorových T lymfocytů v orgánu, přičemž tato populace jev kombinaci s CD2 vazebným .činidlem.

Popis obrázků

Obr. 1 je. graf ukazující selektivní redukci paměťových efektorových T lymfocytů vzhledem k naivním T buňkám u pacientů s psoriázou, kteří se podrobili léčení CD2 vazebným činidlem, a sice LFA-3-TIP. Horizontální úsečky na osou X představují trvání léčení, které bylo zastaveno asi po 80 dnech. Křivky představují průměrný počet lymfocytů u 57 pacientů v každé pokusné skupině. Existují zde statisticky významná ošetření a dočasné účinky pokud jde o paměťové T buňky (CD45R0+), avšak nikoliv ve vztahu k. naivním T buňkám (CD45RA+). Počet T buněk při různých způsobech ošetření CD2 vazebným činidlem vykazuje snížení a v průběhu 80 dní trvajícího léčeni se blíží se jisté relativně konstantní hodnotě. PO tom, co bylo léčení ukončeno, počet T buněk se začal navracet na výchozí hodnotu.

Definice termínů v popisu vynálezu

Termíny efektorový T lymfocyt, efektorová T buňka, paměťový efektorový T lymfocyt/buňka' a podobné termíny se v předkládaném popisu vynálezu používají zaměnitelně a označují takové T lymfocyty, které již přišly do styku s antigenem (jinými slovy nejsou to již naivní lymfocyty). . Specificky termín znamená T lymfocyty CD45R0 v protikladu k naivním T lymfocytům CD45RA..

I • φ · φ φ φ φ φφφ • · ·φ · φ φ φ φ φφφ φ φ φ φφφ

Φ·ΦΦ φφ φφ «φφφ φφ φφφ

- 10 Termín CD2 označuje polypeptid CD2, který se váže k přírodní formě polypeptidu LFA-3 . a který je kódován: a) přirozeně se vyskytující DNA sekvencí pro CD2 u savců (viz_ např. sekvence id. č. 5), b) DNA sekvencí, která je degenerovaná vzhledem k přírodní sekvenci DNA CD2 nebo c) DNA sekvencí, která hybridizuje s jednou z předchozích sekvencí za podmínek ekvivalentních teplotě o 20 až 27 °C nižší než Tm a 1M koncentraci chloridu sodného.

Termín LFA-3 se v popisu· užívá k označení polypeptidu LFA-3, který se váže na přírodní formu polypeptidu CD2 a který je kódován: a) přirozeně se vyskytující DNA sekvencí pro LFA-3 u savců (viz např. sekvence id., č. 1 nebo 3), b) DNA sekvencí, která je degenerovaná vzhledem k přírodní sekvenci DNA LFA-3 nebo c) DNA sekvencí, která hybridizuje s jednou z předchozích sekvencí za standardních podmínek, jak jsou v popisu definovány.

Termín CD2 vazebné činidlo označuj e molekulu, sloučeninu nebo jinou chemickou entitu, která moduluje interakci CD2/LFA-3 a/nebo moduluje CD2 signalizaci. Termín zahrnuje homology protilátek anti-LFA-3, homology protilátek anti-CD2, rozpustné polýpeptidy LFA-3, rozpustné polypeptidy CD2, LFA-3 nebo CD2 mimetická činidla (jako např. malé organické molekuly) a jejich deriváty. Přičemž termín moduluje znamená, že CD2 vazebné činidlo mění (výhodně snižuje) intenzitu CD2 signalizace a/nebo ruší schopnost CD2 vázat LFA-3, i když zvýšení této intenzity a/nebo schopnosti vázat nejsou vyloučeny z této definice. CD2 vazebná činidla také modulují paměťové efektorové T lymfocyty (tj. CD45RO) a v tomto kontextu termín moduluje znamená, že vazebné činidlo mění počet a/nebo distribuci paměťových efektorových

T lymfocytů u subjektu, kterému . je podáváno CD2 vazebné činidlo. Ve výhodném provedení vynálezu vazebné činidlo selektivně . moduluje paměťové efektorové T lymfocyty, což znamená, že jsou selektivně modulovány paměťové efektorové T lymfocyty na rozdíl od naivních T lymfocytů (např. T lymfocytů CD45RA).

Termíny rozpustný polypeptid LFA-3 a rozpustný polypeptid CD2 označují polypeptidy LFA-3 a CD2, které nejsou schopné ukotveni v membráně. K takovým rozpustným polypeptidům patří např. takové polypeptidy LFA-3 a CD2, které postrádají dostatečný· úsek domény procházející membránou pro ukotveni polypeptidů, a nebo jsou modifikovány, takže jejich membránová doména je nefunkční.

PI-vázané LFA-3 plné delecemi).

K rozpustným polypeptidům LFA-3 délky nebo zkrácené (např.

patří s vnitřními protilátek znamená

Termín homology jeden nebo více polypeptidů vybraných ze lehké řetězce imunoglobulinu, těžké protein skupiny obsahuj ící obsahuj ící řetězce imunoglobulinu a jejich fragmenty vázající antigen, které jsou schopné vázat jeden nebo více antígenů. Polypeptidové složky homologu protilátky, který je složen z více než jednoho polypeptidů, mohou být volitelně vázány disulfidickými můstky nebo jinak kovalentně zesítěny. Tudíž k homologům protilátek patří intaktní imunoglobuliny typů IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (včetně jejich subtypů), přičemž lehké řetězce těchto imunoglobulinu jsou typů kappa nebo lambda. K homologům protilátek patří také části intaktních .imunoglobulinu, které si ponechávají antigenně-vazebnou specifitu, např. fragmenty Fab, Fab'a F(ab')2, fragmenty F(v), monomery nebo dimery těžkých řetězců, monomery nebo dimery lehkých řetězců, dimery složené

- 12 z jednoho lehkého a jednoho těžkého řetězce apod.

Termín homolog humanizované rekombinantni protilátky označuje homolog protilátky, připravené s využitím technologie rekombinantni DNA, ve které některé nebo všechny aminokyseliny těžkého nebo lehkého řetězce imunoglobulinu savce jiného než člověka, které nejsou nutné pro vazbu antigenu, byly substituovány odpovídajícími aminokyselinami těžkého nebo lehkého lidského imunoglobulinu.

Termín homolog chimérické rekombinantni protilátky označuje homolog protilátky, připravené s využitím technologie rekombinantni DNA, ve které celý kloubový úsek nebo jeho část a konstantní úsek těžkého nebo lehkého řetězce nebo obou byly nahrazeny odpovídajícím úseky z lehkého nebo těžkého, řetězce jiného imunoglobulinu.

Vynález lze . aplikovat u jakýchkoliv savců, výhodně u lidí.

Aminokyselina je monomerní jednotka peptidů, polypeptidu nebo proteinu. V přirozeně se vyskytujících peptidech, polypeptidech a proteinech bylo nalezeno 20 aminokyselin, které jsou všechny L-isomery. Pojem aminokyselina zahrnuje také analogy aminokyselin a D-isomery aminokyselin vyskytujících se v proteinech a jejich analogy.

Protein je polymer obsahující kterékoliv z dvaceti aminokyselin. Ačkoliv termín polypeptid se často užívá k označení relativně velkého polypeptidu a termín peptid označuje často malý polypeptid,' užívání těchto termínu se často překrývá a je různé. Proto termín protein se v předkládaném popisu užívá k označení peptidů, polypeptidů a proteinů, pokud není uvedeno jinak.

Fúze označuje kolineární spojení dvou nebo více proteinů

- 13 ·· ·« ·« ♦· ·· • · · · · ♦· • · · · · · · ·· • 9 9 9 9 9 9 99

9999 99 99 9999 99999 nebo jejich fragmentů prostřednictvím jejich peptidové kostry pomocí exprese polynukleotidové molekuly kódující tyto proteiny nebo pomocí metod syntézy proteinů. Je výhodné, když fúzované fragmenty pocházejí z různých druhů. K výhodným fúzním proteinům patří CD2 vazebné činidlo, což je protein nebo jeho fragment kovalentně vázaný ke druhému,, což je buďto jiné CD2 vazebné činidlo nebo to naopak vůbec není CD2 vazebné činidlo. Specificky fúze proteinové CD2 vazebné činidlo/Ig je protein obsahující CD2 vazebné činidlo podle vynálezu nebo jeho fragment kovalentně navázané na N-konec imunoglobulinového řetězce, kde úsek N-konce imunoglobulinu byl nahrazen CD2 vazebným činidlem.

Mutanta označuje jakoukoliv změnu v genetickém materiálu organismu, zejména jakoukoliv změnu (tj . deleci, substituci, adici nebo alteraci) polynukleotidové sekvence divokého typu nebo jakoukoliv změnu v proteinu divokého typu.

hybridizační solí a teplotou

5xSSC a 65 °C

Termín standardní proto operační definice stringencí (p pro

0,2% pH .Standardní koncentrací 0,5xSSC až promýváni. užívaný je

Podmínky s vysokou hybridizaci v pufru •0,2% polyvinylpyrrolidon, albumin, 50mM Tris-HCl', fosforečnan sodný,. 1 % SDS) denáturované sonikované DNA až 20 hodin a promýváni (0,5xSSC)/l% SDS při 65 °C. např. zahrnovat hybridizaci podmínky jsou podmínky určené v podstatě shodné s podmínkami jak pro vlastní hybridizaci tak hybridizační podmínky zde zahrnující řadu hybridizaci.

řísností) mohou např. zahrnovat screening plaků (obsahuje

Ficoll 400, 0,2% bovinní sérový

7,.5,. 1M. NaCl, 0,1% hydrogen10% dextransulfátem a 100 pg/ml lososího spermatu při 65 °C po 12 v 75mM NaCl/7,5mM citrát sodný Podmínky s nízkou stringencí mohou v pufru pro screening plaků s 10% dextransulfátem a 110 pg/ml denaturované sonikované DNA lososího spermatu při 55 °C po v 300mM NaCl/30mM citrát sodný až 20 hodin a promývání (2xSSC)/l% SDS při 55 °C_r podrobněji viz Ausubel et

Current Protocols in Molecular

Biology,

John Willey Sons,

Inc.,1989, kapitoly. 6.3.1 až

6.3.6.

Expresní kontrolní sekvence je sekvence nukleotidů, která řídi a reguluje expresi genů, se kterými je operativně spojena.

Operativně spojena znamená, že polynukleotidové sekvence (DNA, RNA) je operativně spojena s expresní kontrolní sekvencí, když expresní kontrolní sekvence řídí a . reguluje transkripci a translaci této polynukleotidové sekvence. Termín operativně spojena znamená, že před polynukleotidovou sekvencí, která má být exprimována, je vhodný startovací signál (např. ATG) , a že sekvence je ve správném čtecím rámci, který dovoluje expresí polynukleotidové sekvence pod kontrolou expresní kontrolní sekvence, a tudíž produkci požadovaného polypeptidu kódovaného izolovanou polynukleotidovou sekvencí.

Expresní vektor je polynukleotid, 'většinou DNA plazmid nebo fág (nejobvyklejší případy), který dovoluje expresi alespoň jednoho genu, když je vektor vnesen do hostitelské buňky. Vektor může ale nemusí být schopen replikace v hostitelské buňce.

Termín izolovaný (plně zaměnitelný s termínem v podstatě čistý), pokud se týká nukleových kyselin, tj .

polynukleotidových sekvencí kóduj icích polypeptidy, znamená RNA nebo DNA polynukleotid, část genomového polynukleotidu, cDNA nebo syntetický polynukleotid, který v důsledku svého původu nebo zacházení s ním: I) není spojen se všemi polynukleotidy.se

··	··		··	• 0		··		•
• ·	0	0	•	0 ·	•		•	··
•	···	•	•	•	•		•	•
•	• ·	. ·	•	•	•		•	•
····	··		··	····		··		···

kterými je spojen v přírodě (např. je přítomen buňce jako expresní vektor nebo jeho část) , nebo s nukleovou v hostitelské odlišují od nevyskytuje polynukleotidová např.

kyselinou nebo jinou chemickou těch, se kterými je spojen se v přírodě. Jako

II) je spojen skupinou, které se v přírodě, nebo III) izolovaná se dále metodou klonováním nebo separací.

V kyselina, celek) s sekvence, která polymerázové chemicky, III) IV) purifikovaná, je I) amplifikovaná řetězové reakce podstatě čistá nukleová která není bezprostředně rekombinantně např. štěpením označuj e in vi tro připravená gelovou kyselina je spojena (netvoří jednou nebo dvěma sekvencemi, se kterými je nukleová souvislý normálně

v. spojena v přirozeně kterého je izolována.

se vyskytujícím genomu organismu, ze

Izolovaný (plně čistý), pokud se týká jeho část, zaměnitelný s termínem v podstatě polypeptidů, znamená polypeptid npbo který v důsledku svého původu nebo zacházení s ním: buňce jako expresní produkt části je spojen s odlišují od

I) je přítomen v hostitelské expresního vektoru), nebo II) chemickou skupinou, které se spojen v přírodě, nebo III) nevyskytuj e proteinem nebo jinou těch, se kterými je se v přírodě. Jako izolovaný se dále označuje protein, který je I) chemicky syntetizovaný nebo II) exprimovaný v hostitelské buňce a purifikován od asociovaných proteinů. Termín obecně znamená polypeptid, který byl separován od ostatních proteinů a nukleových kyselin, se kterými je v přírodním stavu asociován. Výhodně je polypeptid separován i od látek jako jsou např. protilátky nebo gelová matrice (např. polyakrylamid), které byly užity k purifikaci.

- 16 Heterologní promotor zde označuje promotor, který v přírodním stavu není asociován s daným genem nebo purifikovanou nukleovou kyselinou.

Termín homologní je zde užíván jako synonymum s identický a týká se sekvenční podobnosti dvou polypeptidů nebo molekul nukleové kyseliny. Když je jedna určitá pozice ve dvou srovnávaných sekvencích' obsazena stejnou baží nebo aminokyselinou (např. pozice ve dvou molekulách DNA je obsazena adeninem nebo pozice ve dvou polypeptidech je obsazena lysinem) , pak dvě srovnávané molekuly jsou v této pozici homologní. Procento homologie mezi dvěma sekvencemi je' funkcí počtu shodných nebo homologních pozic sdílených dvěma sekvencemi dělený celkovým počtem pozic a vynásobený 100. Tak např. jestliže 6 z 10 pozic je shodných nebo-li homologních, pak tyto sekvence jsou z 60 % homologní. Nebo např. DNA. sekvence CTGACT a CAGGTT sdílejí 50% homologii (3 pozice ze 6 se shodují). Obecně se srovnání provádí, když jsou sekvence vzájemně přiřazeny tak, aby bylo dosaženo maximální homologie. Takové přiřazení a srovnání lze provést metodou podle Needleman et al. (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970), která je standardně implementována v příslušných počítačových programech jako je např. program Align (DNAstar, lne.). Homologní sekvence sdílejí shodné nebo podobné zbytky aminokyselin, kde podobné aminokyselinové zbytky jsou konzervativní substituce nebo povolené bodové mutace odpovídajících aminokyselinových ♦

zbytků vzhledem k přiřazené referenční sekvenci. V tomto smyslu konzervativní substituce aminokyselinového zbytku v referenční sekvenci znamená substituci aminokyselinou, která je fyzicky nebo funkčně podobná odpovídajícímu referenčnímu zbytku, tedy např. má podobnou velikost, tvar, elektrický • ·

- 17 • · • · ·· náboj, chemické vlastnosti včetně schopnosti vytvářet kovalentni nebo vodíkové vazby apod. Zvláště výhodné jsou kovalentni substituce, které splňuji kritéria definovaná jako přijatelné bodové mutace v publikaci Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure 5, Suppl. 3, Chapter 22: 352354, NAt. Biomed- Res. foundation, Washington D.C., 1978.

Homologie i identita se týkají podobnosti dvou polypeptidových sekvencí, přičemž identita vyjadřuje přísnější srovnání. Homologie i identita mohou být stanoveny srovnáním pozic v každé sekvenci, které jsou pro účel srovnání navzájem přiřazeny. Pokud je pozice ve srovnávaných sekvencích obsazena shodným aminokyselinovým zbytkem, pak jsou polypeptidy v této pozici identické, pokud je ekvivalentní pozice obsazena stejnou aminokyselinou (tj.

identickou) nebo podobnou aminokyselinou (např. podobnou z hlediska sterické a/nebo elektronové povahy), pak jsou polypeptidy v této pozici je funkcí homologní. Procento homologie nebo identity shodných nebo homoiogních pozic sdílených oběma sekvencemi; Nepříbuzné nebo nehomologní sekvence sdílejí méně než 40% počtu identitu, výhodně méně než 25% identitu s AR sekvencí podle vynálezu.

Různé přiřazovací algoritmy a/nebo programy mohou být využity. K takovým programům patří FASTA, BLAST nebo ENTREZ. Programy FASTA a BLAST jsou dostupné jako součást souboru programů pro analýzy sekvencí GCG ((University of Wisconsin. Madison, Wis.) a mohou být použity např. s původním nastavením parametrů. Program ENTREZ je přístupný prostřednictvím· NCBI (National Center for Biotechnology Information,· National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, MD) . V jednom provedení vynálezu bylo procento identity dvou • · • · · · · · . · · ···· ·· ·····* · ·.

- 18 sekvencí stanoveno programy GCG s nastavením váhy pro mezeru 1, kdy každá chybějící aminokyselina je vážena jako kdyby· šlo o neshodnou pozici jedné aminokyseliny nebo nukleotidu mezi dvěma sekvencemi.

Termín peptid(y), protein, (y) a polypeptid(y) jsou zde užívány zcela zaměnitelně. Také termíny polynukleotidová sekvence a nukleotidová sekvence jsou užívány zaměnitelně.

Molekula podle vynálezu je v účinném množství, když je v takovém množstvím, které vede k požadovanému výsledku nebo alespoň k ovlivnění určité nemoci, která se léčí.

Termín polymer označuje velkou molekulu sestavenou z mnoha malých strukturních jednotek, tj . monomerů, které jsou spojeny jakýmkoliv možným způsobem. Pokud je k sestavení větší molekuly použit jen jeden typ monomeru, pak se produkt označuje jako homopolymer, přičemž termín se užívá zaměnitelně s termínem polymer. Pokud jsou řetězce sestaveny z více různých monomerů, pak se výsledný materiál genericky nazývá heteropolymer. Polymer, na který je vázáno CD2 vazebné činidlo nebo jeho fragment nebo jeho varianta, je výhodně polyalkylenglykolový · polymer, avšak v podstatě může být použit jakákoliv polymerová kostra, výhodně takový polymer, který je rozpustný ve vodě, není toxický a není imunogenní.

Provedení . předkládaného vynálezu využívá, pokud není specificky uvedeno jinak, konvenční metody molekulární a buněčné biologie, buněčných kultur, mikrobiologie, rekombinantní DNA, proteinové chemie a imunologie, které patři ke standardním znalostem a schopnostem odborníka. Tyto metody jsou např. popsány v příručkách. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. (Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, '1989; DNA Cloning, Volumes

- 19 I and II (D.N. Glover, ed) , 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, ed.), 1984; U.S. Patent No. 4,683,195 (Mullis et al.,); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames and S.J. Higgins,. eds.), 1984; Transcription and Translation (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, ed) . Alan R. Liss, lne., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu et al., eds), Academie Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos, eds.),1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.), Academie Press. London, 1987; Handbook of Experiment Irnmunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouše Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 19861

Aniž by byly vázáni různými teoriemi, původci vynálezu věří, že použití CD2 vazebných činidel podle vynálezu má profylaktické a léčebné účinky na výše uvedené nemoci, neboť tato činidla buďto modulují interakce CD2/LFA-3 a/nebo modulují siganlizaci CD2, což vede, mimo jiné, k'inhibici proliferace a aktivace T buněk, a zejména k modulaci počt a/nebo distribuce paměťových efektorových T lymfocytů.

Původci také věří, že škodlivé účinky výše uvedených nemocí jsou způsobeny právě proliferací a aktivaci T buněk. Tudíž také věří, že' terapie založená na předkládaném vynálezu je lepší než dosud dostupné terapie, a to z mnoha důvodů, např. že vede k inhibici antigenně specifických interakcí pro všechny přítomné antigeny a k inhibici aktivace T buněk, a naopak nezpůsobuje celkovou imunosupresi a ani možnou indukci

tolerance. Původci zejména věří, že terapie založená na vynálezu povede ke specifičtějšímu cílení terapie na T buňky v počátečních stadiích nemoci bez účinků na efektorové. mechanismy zprostředkované polymorfonukleárními leukocyty nebo makrofágy. Tudíž pacienty budou méně náchylní k infekcím než při použití steroidů nebo jiných léčiv vedoucích k celkové imunosupresi. Tudíž inhibice aktivace T buněk podle předkládaného vynálezu má profylaktické nebo léčebné účinky pro výše uvedené kožní nemoci.

CD2 vazebná činidla

CD2 vazebná činidla užitečná podle vynálezu mají význačné vlastnosti, a sice schopnost modulovat CD2 signální dráhu, a také modulovat, výhodně inhibovat, interakce CD2/LFA-3. CD2 vazebné činidlo podle vynálezu má schopnost provádět obě tyto funkce. K takovým činidlům patří homology protilátek anti-LFA-3, homology protilátek anti-CD2, rozpustné polypeptidy LFA-3, rozpustné polypeptidy CD2, LFA-3 a CD2 mimetická činidla, a jejich deriváty. Výhodná CD2 vazebná činidla jsou rozpustné polypeptidy LFA-3, rozpustné polypeptidy CD2.,· homology protilátek anti-CD2 a LFA-3 a CD2 mimetická činidla.

Užitečnost specifických rozpustných polypeptidů LFA-3, rozpustných polypeptidů CD2, homologů protilátek anti-CD2 a homologů protilátek a LFA-3 a CD2 mimetických činidel může být určena např. pomocí testování jejich schopnosti modulovat interakce CD2/LFA-3. Tato schopnost se může testovat např. jednoduchým buněčným vazebným testem, který dovoluje vizuální (při zvětšení) vyhodnocení schopnosti potenciálního CD2 činidla inhibovat interakci mezi LFA-3 a CD2 na buňkách nesoucích tyto

0·· *

0 · ♦

0 0 0

0000 00 • * .

molekuly. Výhodné buňky jakožto CD2+ substrát jsou buňky Jurkat a výhodným substrátem LFA-3+ jsou buďto ovčí červené krvinky Vazebné charakteristiky rozpustných protilátek a mimetických . činidel mohou být testovány nebo lidské buňky .JY. polypeptidů, homologů mnoha různými radioaktivním činidel (např. přivedením značených polypeptidů, užitečných ve vynálezu způsoby, které jsou odborníkům známy, např. značením protilátek, homologů, polypeptidů nebo užitím ³⁵S nebo ¹²⁵I) a pak mimetických činidel nebo homologů do kontaktu s.buňkami CD2+

LFA-3+ podle potřeby, vazebný charakteristiky mohou být testovány pomocí vhodně značené sekundární protilátky, se také použít rozetový kompetiční test, jak byl popsán v publikaci Seed et al. (Proč, Nati. Acad, Sci. USA, 84, pp.

nebo také

Může

A. Homology protilátek anti-LFA-3 a anti-CD2

Homology protilátek anti-LFA-3 a anti-CD2 mohou být využity v monoklonální rekombinantní protilátky, protilátky, různého typu patří k nim rekombinantní protilátky, humanizované rekombinantní předkládaném vynálezu.

chimérické včetně všech protilátek jejich fragmentů vázajících antigen. jsou výhodné monoklonální anti-LFA-3 anti-LFA-3.

Výhodněj ší produkované

10693 (1E6) hybridomem , ATCC HB a ATCC HB 10696 (8B8) , označením protilátky '

Z homologů protilátky jsou monoklonální protilátky vybraným ze skupiny hybridomů ATCC HB

10694 (HC-1B11), ATCC HB 10695 (7A6) anti-LFA-3 nebo monoklonální protilátka známá pod

TS2/9 (Sanchez-Madrid et al., Three Distinct

Antige.ns Associated with Human T-Lymphocyte-Mediated Cytolysis:

LFA-I, LFA-2 . and LFA-3, Proč. Nati Acad. Sci USA, 79, pp.

9 9 9 9 9 9 9 99

9 99 9 9 9 . ♦· « · · 9 9 9 9 99

9 9 9 99 99 9999 99999

- 22 7489-93 (1982)). Nejvýhodněji je monoklonálni anti-LFA-3 protilátka produkována hybridomem vybraným ze skupiny obsahující hybridomy ATCC HB 10695 (7A6j a ATCC HB 10693 (IE6)..

i

Z homologů protilátky anti-CD2 jsou výhodné monoklonálni protilátky anti-CD2, jako jsou např. monoklonálni protilátky epitopu Til, včetně protilátky TS2/18 (Sanchez-Madrid et al.., Three Distinct Antigens Associated with Human T-LymphocyteMediated Cytolysis: LFA- 1, LFA-2 and LFA-3 , Proč, Nati. Acad. Sci. USA, 79, pp. 7489-93 .( 1982)).

Technologie přípravy monoklonálních protilátek je odborníků dobře známa. Stručně shrnuto, nesmrtelná buněčná linie (typicky myelomové buňky) je fúzována s lymfocyty (typicky splenocyty) ze savce imunizovaného přípravkem obsahujícím daný antigen, supernatant z kultivace výsledných hybridomových buněk se pak testuje na přítomnost, protilátek proti danému antigenu. Viz obecný přehled Kohler et al., Nátuře, Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity, 256, pp. 495-97 (1975) . K vhodným imunogenům podle vynálezu patří buňky nesoucí CD2 nebo LFA-3 a také bezbuněčné preparáty CD2 a LFA-3 nebo receptorové vazebné protifragmenty (tedy např. fragmenty CD2, které se váží na LFA-3 nebo fragmenty LFA-3, které se váží k CD2).

Imunizace se provádí ' standardními metodami v oboru známými. Jednotkové dávky a režim imunizace závisí na druhu použitého savce, stavu jeho imunity, tělesné hmotnosti apod. Typicky je imunizovanému savci odebrána krev a sérum z každého vzorku se testuje na přítomnost konkrétních protilátek užitím vhodných testů. Tak např. užitečné protilátky anti-LFA-3 nebo anti-CD2 mohou být identifikovány tak, že se testuje schopnost imunního séra blokovat vytváření rozet ovčích krvinek a buněk • ·

- 23 Jurkat, které je důsledkem přítomnosti LFA-3 nebo CD2 na povrchu těchto buněk. Lymfocyty použité pro přípravu hybridomových buněk s izolují z imunizovaných savců, v jejichž séru již byla testem potvrzena přítomnost požadovaných protilátek.

Typicky nesmrtelná buněčná linie (např. linie myelomových buněk) pochází ze stejného druhu savce jako lymfocyty. Výhodnou nesmrtelnou buněčnou linii jsou myši myelomové buněčné linie, které jsou citlivé na kultivační médium obsahující hypoxanthin, aminopterin a thymidin (médium ΗΆΤ). Typicky HAT-senzitivní myší myelomové buňky jsou fúzovány s myšími splenocyty užitím polyethylenglkyolu (PEG) 3350. Hybridomové buňky vzniklé z této fúze jsou pak selektovány v médiu HAT, která usmrtí nefúzované buňky a neproduktivně fúzované myelomové buňky (nefúzované splenocyty odumírají po několika dnech, protože nejsou transformovány). Hybridomy produkující požadované protilátky jsou detekovány screeningem supernatantů z hybridomových kultur, např. na schopnost vázat se např. na odpovídající protireceptor, nebo na schopnost blokovat adhezi buněk Jurkat na ovčí červené krvinky. Subklonování hybridomových kultur limitním ředěním se provádí proto, aby byla zaručena monoklonálnost.

Pro produkci monoklonálních protilátek' anti-LFA-3 nebo anti-CD2 se hybridomové buňky, které. byly pozitivní ve výše zmíněných testech, kultivují v živném médiu za takových podmínek a po takovou dobu, které jsou dostatečné k tomu, aby hybridomové buky secernovaly monoklonální protilátky do kultivačního média. Techniky tkáňových kultur a živná média vhodná pro hybridomové buňky jsou . známy. Kondicionovaný supernatant z hybridomové kultury se odebere a požadované • · ·

-24-.

protilátky se mohou dále purifikovat známými metodami, pokud je to potřeba.

Alternativně se požadované protilátky produkuji injekcí hybridomových buněk do peritoneálni dutiny myši premedikované přistáném. Hybridomové buňky pak proliferuji v peritoneálni dutině a secernují protilátky, které se akumuluji v ascitu. Protilátky se pak izoluji odebráním tekutiny z ascitu pomoci injekční stříkačky.

Homology protilátek anti-CD2 a anti-LFA-3 užitečné ve vynálezu mohou být i rekombinantni protilátky získané z hostitelských buněk transformovaných DNA kódující lehké a těžké řetězce imunoglobulinu pro požadovanou protilátku. Rekombinantni protilátky mohou být připraveny užitím metod genového inženýrství, viz např. .patent USA 4,816,397, který je zde zahrnut formou odkazu, např. rekombinantni protilátky mohou být připraveny klonováním cDNA nebo genomové DNA kódující lehké a těžké řetězce požadované protilátky z hybridomové linie, která produkuje homology protilátek . užitečných ve vynálezu. cDNA nebo genomová DNA kódující tyto polypeptidy je pak vložena do expresních vektorů,' takže oba geny jsou operativně spojeny se svými vlastními sekvencemi řídícími expresi, tj. transkripci a translaci. Expresní vektor a sekvence řídící expresi jsou vybrány tak, aby byly kompatibilní s expresí vybraného hostitele. Typicky jsou oba geny vloženy do stejného expresního vektoru. Mohou být užity jak prokaryotické tak i .eukaryotické hostitelské buňky. Avšak výhodná je exprese v eukaryotických buňkách, protože u těchto buněk je ve srovnání s prokaryotickými buňkami mnohem větší pravděpodobnost, že budou exprimovat a secernovat správně sestavenou a imunologicky aktivní protilátku. Avšak protilátka, která je neaktivní díky ··

- 25 nesprávnému sestaveni (tj. uspořádání prostorové.struktury), se může renaturovat užitím známých metod (Kim and Baldwin, Specific Intermediates in the Folding Reactions of Smáli Proteins and the Mechanism of Protein Folding. Ann, Rev. Biochem.,' 5 1, pp. 45989 (1982)). je možné, že hostitelské buňky tvoří části ' intaktních protilátek jako např. dimery lehkých řetězců nebo dimery těžkých řetězců, což jsou také homology protilátek podle předkládaného vynálezu.

Je zřejmé, že variace postupů výše popsaných jsou užitečné. tak např. , může být potřebné transformovat hostitelskou buňku DNA kódující buďto lehký nebo těžký řetězec (ale nikoliv oba) homologu protilátky. technologie rekombinantní DNA může být využita k odstranění některých nebo všech DNA, které kódují jeden z lehkých nebo těžkých řetězců nebo oba, které nejsou potřebné pro protireceptorovou vazbu CD2' nebo LFA-3. Molekuly exprimované z takových zkrácených DNA jsou užitečné v předkládaném vynálezu. Kromě toho mohou být připraveny bifunkční protilátky, kde jeden lehký a jeden těžký řetězec jsou homology anti-CD2 nebo anti-LFA-3 protilátky a druhý těžký a lehký řetězec jsou specifické pro antigen odlišný od CD2 nebo LFA-3 nebo jiný epitop CD2 a LFA-3..

Chimérické rekombinantní homology protilátek anti-LFA-3 nebo anti-CD2 mohou být připraveny transformací hostitelských buněk vhodným expresním vektorem, který obsahuje DNA kódující požadované lehké a těžké řetězce imuno globu linu·, kde celá nebo část DNA kódující kloubový úsek a konstantní úseky těžkého a/nebo lehkého řetězce byla nahrazena DNA pro odpovídající úsek lehkého nebo těžkého řetězce imunoglobulinu z jiného biologického druhu. Když je původní rekombinantní protilátka jiná než lidská a přitom CD2 vazebné činidlo se má podávat ♦ ·

- 26 člověku, pak je výhodná náhrada příslušnými lidskými sekvencemi. Příkladem chimérické rekombinantní protilátky je protilátka, která obsahuje myší variabilní úseky a lidský kloubový úsek a konstantní úseky (viz např. patent USA 4,816,397 a Morrison et al., Chimeric Human Antibody Molecules: Mouše Antigen Binding Domains With Human Constant Region Domains. Proč. Nati. Acad. Sci USA, 8 1, pp. 6851-55 (1984). Humanizované rekombinantní protilátky anti-LFA-3 nebo anti-CD2 se mohou připravovat transformací hostitelských buněk vhodným expresním vektorem, který obsahuje DNA kódující požadované těžké a lehké řetězce imunoglobulinu jiného původu než lidského, kde všechna nebo část DNA kódující aminokyseliny, které se neúčastní vazby antigenu, byla nahrazena DNA z odpovídajících úseků lehkého nebo těžkého řetězce lidského imunoglobulinu (viz Jones et al., Replacing the' Complementarity Determining Regions in a Human Antibody with Those from a Mouše, Nátuře, 321, pp. 522-25 (1986).

Homology protilátek anti~CD2 a anti-LFA-3, které nejsou intaktními protilátkami, jsou také užitečné v předkládaném vynálezu. Takové homology mohou být odvozeny z jakýchkoli homologů protilátek popsaných výše. Tak např. antigen vázající fragmenty a momomerní, dimerní nebo trimerní .polypeptidy plné délky získané z výše popsaných protilátek jsou samy užitečné. K vhodným protilátkovým homologům tohoto typu patří fragmenty Fab, Fab', F(ab)' a F(v), monomery nebo dimery těžkých řetězců, monomery nebo dimery lehkých řetězců, dimery složené z jednoho lehkého a jednoho těžkého řetězce 'apod. Výhodným fragmenty protilátek anti-LFA-3 jsou těžké řetězce anti-LFA-3.

Fragmenty protilátek mohou být také připraveny chemickými metodami, např. štěpením . intaktnich protilátek proteázami jako je pepsin nebo papain a případně působením redukčních činidel na štěpné, produkty. Alternativně lze užitečné fragmenty připravit pomoci hostitelských buněk transformovaných zkráceným genem pro těžká a/nebo lehký řetězec. Monomery těžkého a lehkého řetězce lze připravit působení redukčních činidel na intaktní protilátky, např. působením dithiotreitolu, po kterém následuje separace řetězců. Monomery těžkého a lehkého řetězce lze také připravit pomocí hostitelských buněk transformovaných DNA, která kóduje buďto požadovaná lehký řetězec nebo požadovaný těžký řetězec, ale nikoliv oba (viz např. Ward et al., Binding_l Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted from Escherichia coli, Nátuře, 341, pp. 544-46 (1989); Sastry et al., Cloning of the Immunological Repertoire in’ Escherichia. coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNA Library, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86, pp. 572832 (1989).

B. Rozpustné polypeptidy CD2 a LFA-3

Rozpustné polypeptidy LFA-3 a rozpustné polypeptidy CD2, které moduluji interakce LFA-3 a CD2 jsou užitečné v předkládaném vynálezu. Výhodné jsou rozpustné polypeptidy LFA-3.

Rozpustné pQlypeptidy z transmembránové formy

LFA-3,

AA187

LFA-3 zejména mohou být z extracelulárni získány domény polypeptidy byly např.

a 5, 547, 853 (stejného přihláška), které jsou sekvence id. č.

popsány v patentech USA přihlašovatele jako zahrnuty formou odkazu.

Takové

4, 956, 281 předkládaná

K výhodným

04	4«		44	··	00	•
• 0	4	•	0	4 4	•	9	0 0
•	004	0	0	0	4	0	0 9
•	0 0	0	0	0	0 9	9
0000	40		• 4	0044	9 9	99 9

rozpustným polypeptidům LFA-3 patří polypeptidy tvořené aminokyselinami AA1 až AA92 sekvence id. č. 2, AA1 až AA80 sekvence id. č. 2, AA50 až AA65 sekvence id. č. 2 a AA20 až AA 80 sekvence id. č. 2. Vektor obsahující sekvenci DNA (sekvence id. č'. 1), která kóduje aminokyselinovou sekvenci id. č. 2, byl uložen v Americké sbírce mikroorganismů (ATCC, Rockville, Maryland) pod číslem ATCC 75107.

Nejvýhodnější proteiny tohoto typu jsou fúzní proteiny obsahující aminokoncový úsek 92 aminokyselin ze zralého LFA-3, C-koncový úsek 10 aminokyselin kloubového úseku lidského IgGl, který obsahuje dva cysteinové zbytky podílející se na disulfidických meziřetězcových vazbách, a úseky CH2 a CH3 z konstantní domény těžkého řetězce lidského IgGl (např. sekvence id. č. 8) . Tento fúzní protein je zde označován jako LFA3TIP. Plazmid ,pSAB152, kódující příkladné provedení LFA3TIP, byl uložen v Americké sbírce mikroorganismů (ATCC, Rockville, Maryland) pod číslem ATCC 68720. DNA sekvence inzertu v plazmidu pSAB152 je zde uvedena jako sekvence id. č. 7. Tento rekombinantní protein byl připraven proto, aby moduloval imunitní reakci prostřednictvím interakce s receptorem CD2. LFA-3 úsek fúzního proteinu se váže na receptor CD222 na T lymfocytech. IgGl úsek se váže na receptory FcgammaRI (makrofágy) a FcgammaRIII (NK buňky a neutrofily). Bylo ukázáno, že interakce LFA3TIP s CD2 inhibuje v podmínkách in vitro reakce lidských T lymrocytů (viz patenty USA č. 5,728.677 a 5,547,853). Jeden způsob, jak připravit LFA3TIP pro použití ve vynálezu byl popsán v patentu USA č. 5,547,853.

Obecně shrnuto, kondiciované médium z kultivace buněk COS7 nebo CHO transfekovaných pSAB152 bylo koncentrováno 'užitím spirální filtrační patrony AMICON SIY30 (AMICON, ♦ · ·· • · · · • · ·

- 29 .·· « · · • ··· • · · ···· ·· • · · ·· ····

··	• -
• ·	··
« ·	•
	•
• ·	•
··	···

Danvers, Massachusetts) a pak čištěno chromatografii na Protein Ά-Sepharose 4B (Sigma, St. Louis, Missouri). Navázaný protein byl eluován a pak čištěn gelovou filtrační chromatografií na Superose-12 (Pharmacia/LKB, Piscataway, New Jersey). Frakce obsahující LFA3TIP s co nejmenšim množstvím, kontaminujicích proteinů, což bylo ověřeno analýzou na SDS-PAGE gelech a Westernovým přenosem (viz např. Towbin 'et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74, pp. 4350-54 (1979) : Antibodies: A Laboratory Manual, pp. 474-510 (Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), byly sloučeny a koncentrovány užitím YM30 Centricon (AMICON). LFA3TIP byl detekován Westernovým blotem užitím králičího polyklonálního séra anti-LFA-3 po kterém následoval detekovatelně značený kozí anti-králičí IgG. Purifikovaný LFA3TIP z buněk COS7 nebo CHO je dimersložený ze dvou monomerů fúzního proteinu LFA-3-Ig spojených disulfidickými vazbami.

Jiný výhodný fúzní protein, zde označovaný LLFA3-Ig, se skládá z první a třetí extracelulární domény fúzované ke kloubové oblasti CH2 a CH3 lidského IgGl.

Rozpustné polypeptidy LFA-3 mohou být také získány z PIvázaných forem LFA-3, jako jsou formy popsané např. v PCT patentové přihlášce WO 90/02181. Vektor obsahující DNA sekvenci

PI-vázaného LFA-3 (sekvence id. č. 3) byl uložen v Americké sbírce mikroorganismů (ATCC, ' Rockville, Maryiand) pod číslem ATCC 68788. přitom PI-vázané formy LFA-3 a transmembránové formy LFA-3 mají identické aminokyselinové sekvence v celé extracelulární doméně.

Tudíž výhodné

PI-vázané

LFA-3 polypeptidy jsou shodné .

s transmembránovými formami LFA-3. Rozpustné polypeptidy CD2 mohou být získány z CD2 plné délky, zejména extracelulární doména (např. AA1 až AA185 sekvence id. č. 6).

Takové • «

- 30 polypeptidy obsahují celou extracelulární doménu CD2 nebo její část. Příklady rozpustných CD2 polypeptidů byly popsány v PCT přihlášce WO 90/08187, které je formou odkazu součástí předkládané přihlášky.

Produkce rozpustných polypeptidů užitečných v předkládaném vynálezu může být dosažena řadou metod, které jsou v oboru známy. Tak např. polypeptidy mohou být získány z intaktních transmembránových molekul· CD2 nebo LFA-3 nebo intaktních PI-vázaných LFA-3 proteolýzou užitím specifických endopeptidáz v kombinaci s exopeptidázami, Edmanovým odbouráváním nebo s obojím. Intaktní molekula LFA-3 nebo CD2 může být izolována ze svého přirozeného prostředí metodami, které jsou odborníkům známy. Alternativně Intaktní molekula LFA-3 nebo CD2 může být připravena známými technikami rekombinantni DNA užitím cDNA (viz např. patent USA 4,956,281 původce Wallner et al.; Aruffo and Seed, Proč. Nati. Acad. Sci., 84, pp. 2941-45 (1987); Sayre et al., Proč. Nati. Acad, Sci. USA, 84, pp. 2941-45 (1987)).

Výhodně se rozpustné polypeptidy podle vynálezu připraví přímo, čímž se odstraní potřeba celé molekuly LFA-3 nebo CD2 jakožto výchozího materiálu. Lze toho dosáhnout konvenční chemickou syntézou nebo známými technikami rekombinantni DNA, kdy pouze specifické sekvence kódující požadované peptidy jsou exprimovány v transformovaném hostiteli. např.' gen, který kóduje požadovaný rozpustný polypeptid LFA-3 nebo rozpustný polypeptid CD2 může být syntetizován chemickým způsobem pomocí syntetizátoru oligonukleotidů. Takové oligonukleotidy jsou navrženy na základě aminokyselinové sekvence požadovaného rozpustného polypeptidu LFA-3 nebo CD2. Specifická sekvence DNA kódující požadovaný peptid může být také získána ze. sekvence • · • · • · · · · · 9 9

9999 99' 99 ···· ··

- 31-DNA plné délky izolaci specifických fragmentů získaných restrikčními endonukleázami nebo syntézou specifického úseku pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR).

Standardní metody lze použít, k syntéze genu kódujícího rozpustný polypeptid LFA-3 nebo CD2 vhodný podle vynálezu, tak např. úplná aminokyselinová sekvence' se může využít pro konstrukci zpětně translatovaného genu. DNA oligomer obsahující nukleotidovou sekvenci kódující rozpustný polypeptid LFA-3 nebo CD2 podle vynálezu může být syntetizován v jediném kroku. Alternativně může být syntetizováno několik menších oligonukleotidů kódujících části požadovaného polypeptidu a pak spojeno (ligováno). Výhodně rozpustný polypeptid LFA-3 nebo CD2 užitečný podle vynálezu je syntetizován z několika samostatných oligonukleotidů, které jsou následně spojeny. Jednotlivé oligonukleotidy obvykle obsahují přesahující úseky na 5'nebo 3'konci pro spojení s využitím komplementarity. Po sestavení jsou výhodné geny charakterizovány tím, že obsahují sekvence rozpoznávaní restrikčními endonukleázami (včetně jedinečných restrikčních míst pro přímé vložení do klonovacího nebo expresního vektoru), přičemž výhodné kodony berou do úvahy, který hostitelský expresní systém byl užit a jaká sekvence, když je transkribována, produkuje stálou, účinně translatovanou mRNA. Správné sestaveni může být potvrzeno sekvencováním nukleotidové sekvence, restrikčnim mapováním a také expresí, biologicky aktivního polypeptidu ve vhodném hostiteli.

Odborníkovi je přitom zřejmé, že díky degeneraci genetického kódu molekuly DNA obsahující mnohé jiné nukleotidové sekvence budou schopny také kódovat rozpustné molekuly LFA-3 a CD2 polypeptidu, které jsou kódovány specifickými sekvencemi popsanými výše. Tyto degenerované • · • *

- 32 sekvence také kódují polypeptidy užitečné podle předkládaného vynálezu.

Sekvence DNA jsou exprimovány v jednobuněčném hostiteli^ Jak je v oboru dobře známo, pro dosažení vysoké hladiny exprese transfekovaného genu v hostiteli, gen musí být operativně spojen se sekvencí řídící transkripci a translaci (expresní kontrolní sekvenci), která je funkční ve zvoleném hostiteli. Výhodně expresní kontrolní sekvence a sekvence požadovaného genu jsou obsaženy v expresním Vektoru, který dále obsahuje bakteriální selekční markér a počátek replikace. Pokud je exprimujícím hostitelem eukaryotická buňka, expresní vektor dále obsahuje ještě další expresní markér užitečný právě v daném hostiteli. D.NA sekvence kódující požadované rozpustné polypeptidy může ale nemusí kódovat také signální sekvence. Když je exprimujícím hostitelem prokaryotická buňka, je obecně výhodné, když sekvence DNA nekóduje signální sekvenci. Když je exprimujícím hostitelem eukaryotická.buňka, je obecně výhodné, když sekvence DNA kóduje signální sekvenci. Aminokoncový methionin může být nebo nemusí součástí exprimovaného produktu. Pokud koncový methionin není odštěpen hostitelem, může být odstraněn chemicky standardními způsoby.

Je možně využít celou řadu kombinací expresní hostitel/vektor. K vhodným expresním vektorům pro eukaryotické hostitele patří např. vektory obsahující expresní kontrolní sekvence z SV40, hovězího papilloma' viru, adenoviru nebo cytomegaloviru. K vhodným expresním vektorům pro bakteriální hostitele patří např. známé bakteriální plazmidy jako jsou např. plazmidy z E. coli colEl, PCRI, pBR322, pMB9 a jejičh deriváty, plazmidy s širokým spektrem hostitelů jako jsou RP4, fágové DNA, např. četné deriváty fágu lambda, např. NM989, jiné c ·

- 33 DNA fágy jako např. M13 a vláknité jednořetězcové DNA fágy.

K užitečným expresním vektorům pro kvasinkové buňky jakožto hostitele patří plazmid 2μ a jeho deriváty. K vhodným vektorům pro hmyzí buňky patří pVL941.

Navíc lze v těchto vektorech využít celou řadu kontrolních sekvencí.

K vhodným expresním kontrolním sekvencím patří expresní kontrolní sekvence asociované se strukturními geny výše uvedených expresních vektorů. K příkladům užitečných expresních kontrolních- sekvencí patří např. časné a pozdní promotory SV40 nebo adenovirů, systém lac, systém trp, systém TAC nebo TRC, hlavní operátorové a promotorové úseky fága lambda, kontrolní úseky fd obalového proteinu, promotor 3-fosfoglyc.erátkinázy nebo jiného enzymu glykolýzy, promotor kyselé fosfatázy, např. Pho5, promotory genů kvasinkového a-konjugačního systému a další sekvence, o kterých je známo, že řídí expresi genů prokaryotických nebo eukaryotických buněk nebo jejich virů,· a jejich různé kombinace.

Může být využita celá řada jednobuněčných hostitelských, •buněk. K takovým patří mnohé již dobře známé eukaryotické a prokaryotické buňky, jako jsou kmeny E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, houby, kvasinky, hmyzí buňky jako buňky Spodoptera frugiperda (SF9) , živočišné buňky jako např. CHO buňky nebo myší buňky, buňky z makaků jako např. linie COSI, COS7 a BSC1, .BSC40 a mBTIO, a- také lidské buňky, stejně jako rostlinné buňky a pletiva. Pro expresi v živočišných buňkách jsou výhodné buňky COS140 a COS 7. Přitom je však samozřejmé, že ne všechny vektory a kontrolní expresní sekvence budou fungovat stejně dobře pro expresi DNA sekvence podle vynálezu. Zrovna tak nebudou všichni hostitelé fungovat stejně dobře, se stejným expresním - systémem. Avšak odborník může vybrat ··

» z dostupných vektorů, kontrolních expresních sekvencí a hostitelů rutinním, postupem bez nadměrného experimentování. Ták např. při výběru vektoru je třeba brát v úvahu hostitele,protože vektor se musí v hostiteli replikovat. Je třeba také brát v úvahu počet kopií vektoru, schopnost vektoru kontrolovat tento počet, a také expresi jakéhokoliv, dalšího proteinu kódovaného vektorem, jako je např. markér rezistence k antibiotiku.

Při výběru expresní kontrolní sekvence je třeba zvažovat také různé faktory. Patří k nim např. relativní síla sekvence, její kontro.lovatelnost a kompatibilita se sekvencemi zmíněnými výše, zejména pokud jde o potenciální sekundární struktury, jednobuněční hostitelé by se měli vybírat s ohledem na jejich kompatibilitu se zvoleným vektorem, toxicitu produktu kódovaného DNA sekvenci, sekreční vlastnosti, schopnost správného prostorového sestavení rozpustného polypeptidu, kultivační a fermentační požadavky a také snadnost purifikace výsledného produktu kódovaného sekvencí DNA. V rámci těchto parametrů odborník vybere různé kombinace vektory/expresní kontrolní sekvence/hostitel, které exprimují požadované sekvence DNA při fermentaci nebo v kultuře živočišných buněk průmyslovém měřítku, např. buněk CHO nebo COS 7.

Rozpustné polypeptidy LFA-3 a CD2 se pak izolují z fermentačních nebo buněčných kultur a purifikují se pomocí známých metod. Odborník- snadno vybere nejvhodnější způsob izolace a purifikace.

Zatímco techniky rekombinantni DNA jsou výhodné pro přípravu rozpustných polypeptidu CD2 nebo LFA-3 majících sekvenci delší než 20 aminokyselin, kratší polypeptidy CD2 nebo LFA-3 mající méně než 20 aminokyselin se výhodně připravují « · to · ··· · · to «··· · · · * · » · · · · · ·· · ···· ·· ·· ···· toto to·® konvenčními technikami chemické syntézy. Syntetické polypeptidy užitečné podle vynálezu se výhodně připravují s mimořádně vysokým výtěžkem a mohou se snadno purifikovat. Výhodně se takové rozpustné polypeptidy CD2 nebo LFA-3 syntetizují postupy chemické syntézy polypeptidů v kapalné fázi nebo na pevném nosiči a případně se štěpí karboxypeptidázou (pro odstranění.Ckoncových aminokyselin) nebo se degradují Edmanovou degradací (pro odstranění N-koncových aminokyselin). Správné sestavení (tj. sestavení prostorové struktury) polypeptidů lze dosáhnout v oxidativních podmínkách, které jsou vhodné pro vytváření disulfidických vazeb, jak popsal Kent Chemical Syntehsis of Polypeptides and Proteins, Ann. Rev. Biochem. 57, pp. 95789 (1988). Polypeptidy připravené tímto způsobem se pak purifikují užitím separačních technik, které jsou v oboru známy, výhodně užitím HPLC s reverzní fázi.. Použití syntézy polypeptidu v kapalné fázi je výhodné tím, že dovoluje přímo přidat určité derivatizované aminokyseliny k rostoucímu polypeptidovému řetězci, jako je např. O-sulfátester tyrosinu. Tím se odstraňuje nutnost následného derivatizačního kroku pro modifikaci kteréhokoliv aminokyselinového zbytku v polypeptidu podle vynálezu.

C. LFA-3 a CD2 mimetická činidla

Podle vynálezu lze také využít LFA-3 a CD2 mimetická činidla. Tato činidla mohou být .peptidy, semi-peptidové sloučeniny nebo sloučeniny jiné povahy než . peptidové (nepeptidové sloučeniny), která, jsou CD2 vazebnými činidly, která modulují signalizaci CD2 a/nebo interakce CD2/LFA-3. Nej výhodnější LFA-3 a CD2 mimetická činidla inhibují interakce CD2/LFA-3 alespoň stejně jako anti-LFA-3 monoklonální ·· · · · · ·· ·· · • · · ········ • · ·· · · · · ·· ·· * · · 9 · · · ♦· « · · . · ♦· · ·· ······ ·· ···· 9 9999

- 36 protilátka 7A6 nebo anti-CD2 monoklonální protilátka TS2/18 (popsaná výše). Taková mimetická činidla mohou být připravena syntézou řady peptidů (např. délky 520 aminokyselin) semipeptidových sloučenin nebo nepeptidových organických sloučenin a pak provedením screeningu těchto sloučenin na jejich schopnost inhibovat interakci CD2/LFA-3. Viz Patent US č. 4, 833, 092 a publikace Scott a Smith, „Searching for peptide Ligands with an Epitope Libraray, Science 248, pp. 386-90 (1990) a Devlin et al., „Random Peptide Libraries: A Source of , Specific Protein . Binding Molecules, Science, 249, pp. 40407 (1990), které jsou formou odkazu součásti přihlášky.

D. Derivatizovaná CD2 vazebná činidla

Derivatizovaná CD2 vazebná činidla jsou také užitečná ve vynálezu. Jde o činidla jako -jsou např. modulátory interakcí CD2/LFA-3, ve kterých např. kterýkoliv ze zde popsaných homologů protilátek, rozpustných polypeptidu CD2 nebo LFA-3 nebo CD2 nebo LFA-3 mimetických činidel je funkčně spojen (chemickou vazbou, genovou fúzí nebo jinak) s jedním nebo více členy nezávisle vybranými ze skupiny obsahující homology protilátek anti-LFA-3 a anti-CD2, rozpustné polypeptidy CD2 a LFA-3, CD2 a LFA-3 mimetická činidla, cytotoxická činidla a farmaceutická činidla. Jeden typ derivatizovaného vazebného činidla se připraví zesítěním dvou nebo více CD2 vazebných činidel (buďto stejného typu nebo různých typů). K vhodným zesíťovacim činidlům patři heterobifunkční činidla, mající dvě odlišně reaktivní skupiny separované vhodným oddělovačem (např. m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysukcimidester) nebo homobifunkční činidla (např. disukcinimidylsuberát). Takové linkery jsou

- 37 komerčně dostupné např. od Pierce CHemical Company, Rockford, Illinois. Jiná možnost zesítění využívá PI vazebné signální sekvence v PI-vázaném LFA-3 nebo jejích fragmentů. Specificky DNA kódující PI vazebnou signální sekvenci (např. AA162 až AA212 v sekvenci id. č. 4) je ligována „downstream (po směru transkripce) od DNA kódující požadovaný polypeptid, výhodně rozpustný LFA-3 polypeptid. Když je tento konstrukt exprimován ve vhodné eukaryotické buňce, buňka rozpoznává PI vazebnou signální sekvenci a kovalentně naváže PI na polypeptid. hydrofóbní vlastnosti PI se pak mohou využít k vytvoření micelárních agregátů z polypeptidů.

Užitečná jsou také CD2 vazebná činidla navázaná na jedno nebo více cytotoxických nebo farmaceutických činidel. K vhodným farmaceutickým činidlům patří biologicky aktivní peptidy, polypeptidy a proteiny, jako jsou např. homology protilátek specifické pro lidskp polypeptidy. jiné než CD2 nebo LFA-3, nebo jejich části. K vhodným farmaceutickým a cytotoxickým činidlům patří také cyklosporin A, prednison, FK506, me.totrexat, steroidy, retinoidy, interferon a dusíkatý yperit.

K výhodným CD2 vazebným činidlům derivatizovaným farmaceutickými činidly patří rekombinantně . připravené polypeptidy, kde rozpustný LFA-3 polypeptid nebo rozpustný CD2 polypeptid nebo CD2 peptidylové nebo LFA-3 peptidylové mimetické činidlo tvoří fúzi s celým nebo částí kloubového úseku těžkého řetězce imunoglobulinu a celým nebo částí konstantního úseku těžkého řetězce. Výhodné polypeptidy pro přípravu takových fúzí jsou rozpustné polypeptidy LFA-3. nejvýhodnější jsou fúzní proteiny obsahující AA1 až AA92 z LFA-3 (např. sekvence id. č. 2) fúzované k části kloubového úseku lidského imunoglobulinu IgGl (včetně C-koncových • ·

- 38 10 aminokyselin obsahujících dva. cysteinové zbytky, které se zřejmě podílejí na meziřetězcové disulfidické vazbě) a úseků CH2‘ a CH3 konstantní domény těžkého řetězce IgGI. Lze očekávat, že takové fúzní proteiny budou mít prodloužený sérový poločas a umožni dimerizaci CD2 vazebného činidla.

Další derivatizovaná CD2 vazebná činidla, která mají prodloužený sérový poločas, jsou CD2 vazebná činidla navázaná nej výhodněji k jednomu nebo více polymerům obsahujícím polyalkylenglykolový polymer. Má se za to, že polymer selektivně reaguje s volnými amonoskupinami nebo jinými reaktivními skupinami CD2 vazebného činidla a teoreticky polymer reaguje tak, že k navázání dojde na kterékoliv dostupné aminoskupině jako je např.

alfa aminoskupina nebo epsilon aminóskupina lysinu nebo

-SH skupiny cysteinu.

Volné karboxylové skupiny, hydroxylová skupiny, vhodně aktivované karbonylové skupiny, guanidylová skupina, oxidované cukerné skupiny a merkaptoskupiny CD2 vazebného činidla (pokud jsou k dispozici) mohou být také využity jako místa pro připojení.

Zvláště jestliže CD2 vazebné činidlo je protein, chemická modifikace jakéhokoliv cysteinu (např. vnitřního nebo N-koncového cysteinu) pro ochranu thiolové skupiny, s následnou konjugací s polyalkylenglykolovou skupinou (tj. polyethylenglykol, PEG) může být odborníkem snadno provedena různými

Patent US 4,179,337). Sulfhydrylová skupina s thiolátovým reaktivní funkční skupina iontem jakožto aktivní skupinou je v proteinu. Existuje mnoho činidel, která reagují s thiolovou jinou skupinou. Viz S.

skupinou rychleji než s kteroukoliv

S. Wong, „Chemistry of protein

Conjugation and Cross-Linking, CRC Press, Bocca Raton, FL (1991).

• φ • φ

- 39 Další příklady metod, které poskytují spojení mezi polyalkylenglykolem a cysteinem jsou reakce s jinými alfa haloacetylovými sloučeninami, organickými sloučeninami rtuti,disulfidovýmí činidly Mnohé deriváty těchto a j inými aktivních

N-substituovanými maleimidy. látek jsou komerčně dostupné (např. ethyljodoacetát,

Aldrich,

Milwaukee WI, fenyldisulfid,

Aldrich a

N-pyrenmaleimid, Molecular

Probes,

Eugene OR) nebo mohou být snadno syntetizovány N-alkylmaleimidy a organické

Zatímco není jednoduchá chemická strategie acetamidy, (např.

sloučeniny

N-alkyljodoj ak navázat poylalkylenglykolový polymer jako je PEG na činidlo, je relativně snadné geneticky upravit může sloužit k zacílení polymerové složky, např. místně cílenou mutagenezí. Tak např. inkorporace cysteinu do místa, které je přímo na C-konci proteinového CD2 vazebného specifickou modifikaci užitím maleimidu, v blízkosti a nebo činidla, dovoluje vinylsulfonu nebo (např. PEG). Reakce se může haloacetátem vhodným pro reakci biologicky polymery.

Obecně způsob obsahuje (který má alespoň reakci proteinu rozpustný protein

CD2 vazebné místo, které aktivovaného polyalkylenglykolu uskutečnit jakýmkoliv aktivních materiálů s přípravu aktivovaného jednu koncovou hydroxylovou s aktivovaným polymerem, vhodný pro formulaci do zmíněná metodami, modifikační reakce může být které obsahují jeden nebo více způsobem inertními polymeru skupinu) a pak čímž se vytvoří přípravku. Výše provedena několika kroků. V příkladech provedení předkládaného vynálezu polyalkylenglykolové alkylpolyalkylenglykolů s alkylovou skupinou obsahující výhodně polyethylenglykolové (PEG) atomy uhlíku, zbytky nebo póly(oxy)alkylenglykolové zbytky těchto glykolů jsou výhodně • · • ·

- 40 součásti polymerových systémů podle vynálezu. Takže polymer, na který je protein navázán, je homopolymer polyethylenglykolu (PEG) nebo polyoxyethylovaný polyol, ve všech případech za předpokladu, že polymer je rozpustný ve vodě při teplotě místnosti. K příkladům takových polymerů,· přičemž tento výčet není omezující, patří homopolymery polyalkylenoxidu jako je PEG nebo polypropylenglykoly, polyoxyethylenované glykoly, jejich kopolymery a blokové kopolymery, za předpokladu, že blokové kopolymery si uchovávají rozpustnost ve vodě.

K příkladům polyoxyethylovaných polyolů patří polyoxyethylovaný polyoxyethylovaná glycerol, glukóza a polyoxyethylováného glycerolu polyoxyethylovaný sorbitol, pod.- Glycerolová kostra je shodná s přírodně se vyskytující kostrou mono-, di- a triglyceridů u zvířat a lidí.

Tudíž takové rozvětvení by nebylo nutně vnímáno v tle jako cizorodé.

Alternativně k polyalkylenoxidům se mohou užít dextran, polyvinylpirolidony, polyakrylamidy, polyvinylakoholy,. polymery založené na cukrech a pod. Navíc mohou být užity heteropolymery (tj. polymery složené z více než jednoho druhu monomeru jako je kopolymer) popsané v Patentu US 5,359,030 (např. proteiny konjugované š polymery obsahující polyalkylenglykolovou složku a jednu nebo více mastných kyselin.· Odborníkovi je jasné, že předcházející výčet byl pouze ilustrativní a že lze užít jakýkoliv polymerní materiál splňující popsané vlastnosti.

Navíc v jiném aspektu vynálezu se může využít derivatizované CD2 vazebné činidlo kovalentně navázané na polymerní složku, kde povaha vazby je taková, že obsahuje štěpitelné chemické vazby. To umožňuje kontrolu ve smyslu časového průběhu, kdy může být polymer odštěpen od CD2 • 4

- 41 444444 444

44 4 44 4 4444 •444 44 · 444

444 · 4 44 44

4 4 4 4 4 4 ··

4444 44 44 ···· ····· vazebného činidla. Tato kovalentni vazba může být štěpena pomocí chemické nebo enzymatické reakce. Produkt polymer - CD2 vazebné činidlo si zachovává přijatelné množství aktivity.. Naprotí tomu části polyethylenglykolu jsou přítomny v konjugujícím polymeru a poskytují tak konjugátu polymer CD2 vazebné činidlo vysokou rozpustnost ve vodě a prodlouženou možnost cirkulace v krevním systému. V důsledku těchto zlepšených charakteristik lze předpokládat využití vynálezu pro in vivo aplikaci parenterálním, aerosolovým nebo perorálním podáváním u obou druhů aktivních přípravků polymer - CD2 vazebné činidlo, které po hydrolytickém štěpení.· vede k biologické dostupnosti samotného CD2 vazebného činidla.

Farmaceutické přípravky podle vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje a léčení nemocí savců, které prostředky k prevenci j sou následujícími‘ znaky: infiltrace jednoho nebo efektorovými T lymfocyty a/nebo asociace charakterizovány více orgánů savce těchto lymfocytů s nemocí.

Savci se pro vazebných

CD2/LFA-3, činidel podle nebo jejich léčení podává jedno nebo vynálezu, např. inhibitory derivatizovaných forem, která jsou schopna selektivně modulovat paměťové efektorové T lymfocyty ve více CD2 interakce srovnání s naivními T lymfocyty. Výhodně se podává účinné množství CD2 vazebného činidla nebo jeho derivatiz.ované formy. Termínem účinné množství se rozumí takové množství, které je schopné zmírnit rozsah nebo závažnost onemocnění zde popsaných.

Odborníkovi je přitom zřejmé, že účinné množství CD2 vazebného činidla bude záviset, kromě jiného, na režimu podávání, na podávaných dávkách, na tom, zda je CD2 vazebné

00 00 00 00

000 000 0 000 ·00 0 0 · · 0

00 000 0* 0000 00 00 0000 00 činidlo podáváno v kombinaci s jinými terapeutickými činidly, na celkovém zdravotním' a imunitním stavu pacienta, na terapeutické aktivitě a sérovém poločasu použitého konkrétního CD2 vazebného činidla.

CD2 vazebné činidlo nebo farmaceutický přípravek mohou být v celé řadě forem. K těm patří např. tuhé, polotuhé nebo tekuté léková forma, jako jsou např. tablety, pilulky, prášky, roztoky, tekuté disperze nebo suspenze, liposomy, čípky, roztoky pro injekce nebo infúze a topické přípravky. Výhodné formy jsou závislé na předpokládaném terapeutickém využití a zamýšleném způsobu podávání. Výhodné formy jsou roztoky pro injekce a infúze. CD2 vazebná činidla nebo farmaceutické přípravky mohou být podávány intravenózně, intramuskulárně, subkutánně, intraartikulárně, intrathekálně, perostálně, intratumorálně, intralézním nebo perilézním způsobem pomocí infúze, perorálně, topicky nebo inhalací. Výhodné je podáváni subkutánní, intramuskulární nebo intravenózní. nej výhodnější je subkutánní podáváni. CD2 vazebná činidla se také mohou podávat perorálně, bukálně, parenterálně, rektálně, vaginálně, inhalací intranazáiního spreje, intrapulmonárni inhalací nebo i jinými způsoby. Činidla podle vynálezu mohou být zejména formulována pro inhalaci spreje nebo prášku, pro injekci (např. subkutánní, intramuskulární, intravenózní, intraartikulární nebo intracisternální) , pro infúzi nebo pro perorální podávání, a sice do jednotkové lékové formy, kterou jsou např. ampule nebo tablety, nebo také do multidávkových lahviček nebo jiných nádobek, do kterých se přidá' konzervační činidlo. Přípravky mohou být ve formě suspenzí, roztoků, emulzí, gelů v nosiči, kterým je voda nebo olej, a mohou obsahovat další pomocné látky jako jsou suspendující a/nebo dispergujíci činidla a ·· ·· ·· ·· ·· • · · · · · · · · · •··· · · · · · ··· · · · · · ···· ·· ·· ···· ·· · stabilizátory. Alternativně je aktivní složka ve formě prášku a/nebo je v lyofilizované formě pro přímé podávání nebo pro rekonstituci přípravku s vhodným nosičem (např. sterilní apyrogenni vodou, fyziologickým roztokem nebo 5% roztokem dextrózy) před použitím.

Výhodně se jednotková dávka podává jedenkrát až třikrát za týden. Výhodněji se podává jedenkrát až třikrát za den po dobu 3 až 7 dnů, nebo jednou za měsíc jedenkrát až třikrát za den po dobu 3 až 7 dnů. Je zřejmé, že lze užít také 'nižší či vyšší dávky a jiné léčebné režimy. Výhodně se CD2 vazebné činidlo podává v dávce 0,001 až 50 mg na 1 kg tělesné hmotnosti, výhodněji v dávce 0,01 až 10 mg a nejvýhodněji v dávce 0,1 až 4 mg CD2 vazebného činidla na 1 kg tělesné hmotnosti.

Tak např. pro podávání CD2 vazebného činidla podle vynálezu (tj. rozpustného polypeptidu LFA3TIP) . pacientovi, výhodné CD2 vazebné činidlo je zabaleno jako zmrazený roztok v lahvičkách obsahujících 10 mg/ml rekombinantního fúzního .proteinu LFA-3/IgGl a excipienty (chlorid sodný, hydrogenfosforečnan a dihydrogensfosforečnan draselný). Lahvičky se před použitím ponechají roztát v lednici nebo při buněk (buňky vajecniku čínského obsahující Protein A -Sepharose roztokem obsahujícím 50mM glycin, obsahujíc protein byly sloučeny teplotě místnosti a naředí se užitím roztoku 0,9% chloridu sodného na výsledný objem 5 ml pro použití jako IV bolus. LFA3TIP byl připraven, jak bylo popsáno v publikaci Miller et al.(1993), J. Exp. Med. 178:211, která je vložena formou odkazu, a purifikován z kultivačního média transfekovaných CHOkřečka) absorpcí na koloně 4B (Pharmacia) a eluován 250mM NaCl (pH 3,0). Frakce a pak purifikovány gelovou filtraci na koloně Superose-R® (Pharmacia) v pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS). Vrcholové frakce byly sloučeny a analyzovány na čistotu elektroforézou na 12% redukujícím a neredukujícím SDS-PAGE.

Podle jednoho vzorového protokolu dostával pacient IV bolus jedenkrát týdně v dávce, která byla výhodně vyšší než 0,025 mg/kg a může být až 0,075 až 0,150 mg/kg. Dávkování CD2 vazebného činidla bylo založeno na základní tělesné hmotnosti pacienta. Jiný dávkovači režim nap. · obsahoval_s jednu intramuskulární (IM) injekci v dávce ne menší než 0,005 mg/kg, přičemž výhodná dávka byla 0,025 mg/kg a nejvýhodnější dávka byly vybrány z dávek 0, 05, 0, 075, 0, 1125 a 0,165 mg/kg..

Jednotkové dávky se podávají, dokud není dosaženou pozorovatelného účinku. Účinek lze zhodnotit mnoha různými metodami.

V případě

MS lze terapeutický účinek hodnotit standardní metodou magnetické rezonance.

V případě IBD vyšetření zahrnuj e posouzení abdominální bolesti, hojení píštělů, frekvenci artritidy stolice apod., v případě psoriatické se vyšetřují otoky kloubů a rozsah hybnosti. Běžný odborník v medicíně je schopen zhodnotit klinické účinky pro kteroukoliv z indikací výše zmíněných užitím v medicíně známých postupů.

CD2 vazebná činidla nebo jejich derivátizované formy se výhodně podávají ve farmaceutických přípravcích, které obsahují farmaceuticky přijatelný nosič. Termínem farmaceuticky přijatelný nosič se přitom míní nosič, který nevyvolává alergickou reakci ani jiné nežádoucí účinky u'pacienta, kterému je podáván. K vhodným farmaceuticky přijatelným nosičům patří např. voda/ solný roztok, solný roztok pufrovaný fosfátem, dextróza, glycerol, ethanol .apod. a také jejich kombinace.

Farmaceuticky přijatelné nosiče mohou obsahovat ještě malá množství vedlejších pomocných látek, jako jsou zvlhčovadla nebo emulgátory, konzervační nebo pufrující činidla, které prodlužují dobu použitelnosti přípravku nebo účinnost CD2 vazebného činidla.

Farmaceutické přípravky nebo CD2 vazebná činidla se mohou podávat společně s dalšími terapeutickými nebo profylaktickými činidly. Patří k nim např. cyklosporin A, steroidy, retinoidy, dusíkatý yperit, interferon, methotrexat, antibiotika a antihistaminika. Tato činidla se mohou podávat v jednotkové lékové formě společně s CD2 vazebným činidlem (tj. jako složka jednoho farmaceutického přípravku), vícečetné lékové formě odděleně od CD2 vazebného činidla a přitom současně, a nebo také ve vícečetné lékové formě, kdy se obě složky podávají odděleně a postupně. Alternativně mohou být CD2 vazebné činidlo a další účinná látka ve formě jediné konjugované molekuly. Konjugace dvou složek lze dosáhnout standardním způsoby zesitění, které jsou v oboru známy. Jediná molekula může být také ve formě rekombinantního fúzního proteinu. Navíc CD2 vazebná činidla nebo farmaceutické přípravky užitečné podle vynálezu se mohou užít v kombinaci s jiným terapiemi, např. s chemoterapií. Takové kombinované terapie mají výhodu, že lze užít nižších dávek jednotlivých terapeutických činidel.

Genová terapie

Předkládaný vynález se dále týká poskytování CD2 vazebného činidla formou genové terapie jakožto expresního prodúktu sekvence nukleové kyseliny v savčím hostiteli. Výhodné systémové podávání ex vivo genových produktů využívá • 9 ·· ·· ·· ·♦ · • « ········ ···· · · · · · · ······ ··· i *«··»· ······ ·· ··· . ί·

- 46 rekombinantnich virových nebo nevirových vektorů užitím in vitro transfekce vhodných populací specifických savčích buněk, izolace a purifikace transfekovaných buněk a jejich podání pacientovi. Genová terapie in vivo užívá v podstatě stejně vektor a transfekci, aniž by však byly buňky nebo tkáně odebrány z pacienta. Ke specifickým buněčným populacím, které jsou vhodné jako cíle pro transfekci rekombinantnim vektorem obsahujícím požadovanou nukleovou kyselinu, patří (aniž by vak výčet byl omezující): 1) populace buněk kostní dřeně obsahující prekurzory hematopoetických buněk, 2) populace leukocytů periferní krve, výhodně populace CD34+ leukocytů,, které jsou ' obohaceny hematopoetickými buňkami a lze je. užít . k repopulaci transfekovaných hematopoetických buněk po vnesení, do pacienta bez ablace, 3) populace periferních leukocytů, 4) myoblasty, které mohou být transplantovány zpět hostiteli po té, co byly in vitro transfekovány požadovanou nukleovou kyselinou, a 5) je také možné podat rekombinantní virový nebo nevirový . vektor obsahující požadovanou nukleovou kyselinu, nebo samotnou požadovanou, sekvenci nukleové kyseliny, přímo intramuskulární injekcí.

Tak např. ex vivo použití prekurzorů hematopoetických buněk kostní dřeně obsahujících .vektor, který kóduje CD2 vazebné činidlo, je zcela v souladu s dnešním stavem techniky. Stručně shrnuto, buňky kostní dřeně' se odeberou, 'infikují rekombinantnim virem a podají zpět savčímu příjemci. Takže gen nebo genový fragment je systémově rozptýlen v příjemci, jeho exprese pak vede k systémovému podání genového produktu příjemci.

Periferní krev je zdrojem savčích buněk, které jsou pak infikovány prostřednictvím virových vektorů. Konkrétněji,

·· • · •	♦ · • • ··	·«	·· 9 9 9	99 9 9 9 9	• 9
• •	9 9
•	• ·	9	«	9	9 9
	• ·		• ·	9999	9 9	9 9

leukocyty z krve, zejména populace CD34+, která obsahuje cirkulující hematopoetické buňky, se užije jakožto cílové buňky pro virovou infekci, příjemce bez ablace pak následuje repopulace dřeně savčího (Karlsson, et al., 1993, Bone Marrow

Transplant. 11 (supp. 1): 124-127)

Navíce se lymfocyty užijí jakožto cílové buňky pro podporu systémového podání požadované sekvence nukleové kyseliny, lymfocyty se. odeberou z periferní krve příjemce, kultivují se známým způsobem a pak se užijí jako cílová populace pro infekci virovým vektorem, který obsahuje požadovanou sekvenci nukleové kyseliny. Infikované lymfocyty se pak injikují zpět příjemci (viz např. Anderson, et al., 1990, Human Gene Therapy 1: 331-361). Další cílovou buněčnou populací jsou myoblasty. Přítok krve do relativně velkého objemu kosterního svalstva činí z této tkáně lokalizovaný zdroj požadované sekvence nukleové kyseliny. Takže i~n vitro infekce a zpětné podání myoblastů savčímu hostiteli poskytuje lokální cíl v hostiteli, který umožňuje systémové podání CD přípravku. Kultivace myoblastů, infekce a zpětné vnesení do hostitele jsou známé způsoby a byly popsány např. Dai, et al ., 1992, Proč.

Nati. Acad. Sci. USA 89: 10892-10895).

Také přímá injekce in vivo do buněk nebo tkáně je další metodou lokálního podání vektorové molekuly kódující CD2 vazebné činidlo. Přímá injekce savčímu příjemci nakonec vede, po . expresi genového produktu, k systémovému podání terapeutického produktu (Wolff, et al, 1990, Science 247: 14651468; Raz, et al., 1993, Proč. Nati. .Acad. Sci. USA_90:45234527) . Při tomto způsobu lokalizovaného podáni se užívá přímá injekce nahé DNA, výhodně ve formě nevirového vektoru jako je např. plazmidová DNA.

Jakýkoliv eukaryotický promotor a/nebo enhancerová

·· • · •	• « ··	··	• · •	• 9 t * • ·	• ·
	• •
•	• ·	•	•	. ·	• ·
«···	··		··	< * · ·	• ·	··

sekvence odborníkovi známá, která zvyšuje expresi požadované nukleové kyseliny, se může využít při konstrukci plazmidových vektorů,., včetně (bez omezení) promotoru cytomegaloviru (CMV) ,. promotoru ' viru Rousova sarkomu (RSV), promotoru myšího leukemického viru (MLV), promotoru beta-aktinu, a jakéhokoliv buněčně specifického promotoru, o kterém je známo, že je aktivní v cílové buňce pro transdukci. Navíc lze vložení polynukleotidové sekvence do vektoru užít jakoukoliv v oboru známou metodu (viz např. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spr.ing Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY ( 1992) . Konvenční vektory se skládají z vhodných tranSkripčních/translačnich kontrolních signálů operativně spojených s polynukleotidovou sekvencí kódující požadovaný produkt. Také proitiotory/enhancery se užijí pro řízení exprese požadovaného produktu.

K vhodným expresním vektorům kompatibilním se savčími hostitelskými buňkami pro použití při genové terapii patří např. plazmidy, retrovirové vektory z ptačích, myších a lidských retrovirů, adenovirové vektory, vektory z herpetických virů, parvovirů a nereplikujících se virů neštovic. Zejména replikačně defektní rekombinantni viry mohou být připraveny ve sbalovacích buněčných liniích, které produkují pouze právě replikačně defektní viry (viz Current Protocols in Molecular Biology: Sections 9.10-9.,14 (Ausubel et al., eds. ) , Greene Publishing Associcat.es, 1989.

Specifické virové vektory pro použití v systémech pro přenos genů byly připraveny, viz např. Madzak et al., J. Gen. Virol., 73: 1533-3.6 (1992) (papovavirus SV40) ; Berkner et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 39-61 (1992) (adenovirus);

·· φ * •	»» ···	• Φ • Φ • ·	·· • · ' ·	• Φ φ φ • ♦	• • Φ φ
•	Φ ·	• Φ	φ	φ 'φ	•
ΦΦΦΦ	··	φφ	• ΦΦΦ	• Φ	···

Moss et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 25-38 (1992) (virus vakcínie); Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 97-123 (1992) (adeno-associated virus); Margulskee, Curr.

Top. Microbiol. Immunol., 158: 67-93 (1992) (Herpes simplex virus (HSV) a virus Epsteina a Barrové (HBV)); Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:. 1-24 (1992) (retrovirus);

Brandyopadhyay et al., Mol. Cell. Biol. 4: 749-754 (1984) (retrovirus); Miller et al., Nátuře 357: 455-450 (1992) (retrovirus); Anderson, Science 256:808-813 (1992) (retrovirus).

Výhodné vektory jsou DNA viry, ke kterým patři adenoviry (výhodně vektory založené na Ad-2 nebo Ad-5), herpetické viry (výhodně vektory založené na viru Herpes simplex) a parvoviry (výhodně vektory založené defektnich nebo neautonomních parvovirech), výhodnější jsou vektory založené na adeno-asociovaných virech, nejvýhodnější jsou vektory založené na AAV-2 (viz např. Ali et al., Gene Therapy 1 :367-384, 1994;

U.S. Patent 4,797,368 a 5,399,346. Adenovirové vektory poskytují velmi vysokou hladinu transgenu prakticky do všech buněčných typů bez ohledu na mitotický stav. Vysoké titry (10¹¹ pfu, tj. plaky tvořících jednotek/ml) rekombinantního viru mohou být snadno připraveny v buňkách 293 (adenovirem transformované komplementační buňky z lidských embryonálních ledvin, ATCC CRL 1573) a dlouhodobě uchovány v zamraženém stavu ' bez viditelných ztrát. Účinnost těchto přenosových systémů při in vivo přenosu terapeutických transgenu, které komplementuji genetickou poruchu byla demonstrována na zvířecích modelech různých nemoci (viz např. Y. Watanabe, Atherosclerosis, 36: 261-268 (1986); K. Tanzawa et al, FEBS Letters, 118(1):81-84 (1980); J.L. Golasten et al, New En21.J. Med., 309 (11983):

288-296 (1983): S. Ishibashi et al, J. Clin. Invest., 92: 883- • li • ·

893 (1993); a S. Ishibashi et al, J. Clin. Invest., 93: 18891893 (1994). A skutečně rekombinantní replikačně defektní adenovirus kódující cDNA pro transmembránový regulátor cystické fibrózy (CTFR) byl již schválen pro použití v několika klinických zkouškách léčení CF (viz např. J. Wilson, Nátuře, 365: 691-692 (Oct., 21, 1993) . Rozsáhlé zkušenosti s živými adenovirovými vakcínami u lidských populací jsou další podporou bezpečnosti rekombinantních adenovirů pro genové terapie.

Adeno-asociované viry (AAV). byly také užity jako vektory pro somatickou genovou terapii. AAV je malý virus obsahující jednořetězcovou DNA (ssDNA) velmi jednoduchou organizací genomu (4,7 kb), což z něj činí ideální substrát genového inženýrství. Dva otevřené čtecí rámce kódují sérii polypeptidů rep a cap. Polypeptidy Rep (rep78, rep68, rep 62 a rep 40) se účastní replikace, uvolnění virové částice a integrace genomu AAV. Proteiny cap (VP1, VP2 a VP3) vytvářejí kapsidu virionu. Otevřené čtecí rámce rep a cap obklopují na 5'- a 3'-konci 145 bp dlouhé invertované terminální repetice (ITR), ve kterých prvních 125 bp je schopno vytvářet duplexní struktury tvaru Y nebo T. Důležitou skutečností pro vývoj AAV vektorů je to, že celé domény rep a cap mohou být vystřiženy a nahrazeny reportérovým nebo terapeutickým genem (viz B.J. Carter, in Handbook of Parvoviruses, ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155168 (1990). bylo již ukázáno, že ITR představují nejmenší sekvenci nutnou pro replikaci, uvolnění, sbalení a integraci

AAV genomu. Bylo ukázáno, že vysoká hladina exprese z AAV přetrvává u myši alespoň 1,5 -roku (viz Xiao, Li and Samulski (1996) Journal of Virology 70, 8089-8108). Jelikož nejsou žádné důkazy virové toxicity nebo buněčné imunitní reakce hostitele, tato omezení genové terapie zde nejsou. Fisher et al. (Nátuře • 9 99 99 99 999 • · 9 9 99 9 9 99*

9 9 9 9 9 '9 9 **

9 9 999 999

9999 99 99 9999 9·999

- 51 Medicine (1997) 3, 306-312) popsali stálou genovou expresi u myší po injekci AAV do svalu. A opět byl virus bezpečný. Nebyla detekována žádná buněčná či humorální imunitní reakce proti viru nebo cizorodému genovému produktu.

Zvířecí modely )

Existence vhodných zvířecích modelů výše uvedených nemocí (jako je např. známý model EAE pro roztroušenou sklerózu) umožňuje testovat CD2 vazebná činidla podle vynálezu. Některé zvířecí modely jsou také popsány v příkladech.

Deposit vzorků

Myší hybridomové buňky a příklady anti-LFA-3 protilátky

užitečné podle	vynálezu byly 5. března 1991 v souladu
. s Budapešťskou	smlouvou uloženy v Americké sbírce

mikroorganismů (Američan Type Culture Collection, Rockville,

Maryland, U.S.A.)	jako následující vzorky:
Označení:	číslo ATCC:
1E6	HB 10693
HC-1B11	HB 10694
7A6	HB 10695
8B8	HB 10696
Bakteriofág	nesoucí plazmid kódující transmembránový

LFA-3 byl uložen 28. května 1987 v souladu . s Budapešťskou smlouvou ve sbírce In Vitro International, lne., Linthicum, Maryland, USA, jako vzorek č. IVI-10133. Tento depozit byl přenesen 20. června 1991 do Americké sbírky mikroorganismů « e

- ⁵² (Američan Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209, U.S.A.) jako vzorek:

Označení: ATCC číslo:

λΗΤ16 [XgtlO/LFA-3] 75107

E. coli transformované plazmidem kódujícím PI-vázaný LFA-3 byly uloženy 22. července 1988 v souladu s Budapešťskou smlouvou ve sbírce In Vitro International, lne., Linthicum, Maryland, USA, jako vzorek IVI-10180. Tento depozit byl přenesen 20. června 1991 do Americké sbírky mikroorganismů (Američan Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209, U.S.A.) jako vzorek:

Označení: ATCC číslo:

p2 4 ' 68788 '

V následujícím seznamu sekvencí jsou popsány tyto sekvence:

Sekvence	id.	č.	1:	DNA sekvence transmembránového LFA-3
Sekvence	id.	č.	. 2	: Aminokyselinová sekvence transmembránového
LFA-3
Sekvence	id.	č.	3 :	DNA sekvence PI-vázaného LFA-3
Sekvence	id.	č.	4 :	Aminokyselinová sekvence PI-vázaného LFA-3
Sekvence	id.	č.	5:	DNA sekvence CD2
Sekvence	id.	č:	6:	Aminokyselinová sekvence CD2
Sekvence	id.	č.	7 :	DNA sekvence LFA3TIP
Sekvence	id.	č.	8 :	Aminokyselinová sekvence LFA3TIP

Pro lepší porozumění vynálezu jsou uvedeny následující ····

- 53 příklady. Příklady jsou pouze ilustrační a v žádném případě nijak neomezují rozsah vynálezu.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Modulace paměťových'efektorových T lymfocytů

Tento příklad ilustruje, že konkrétní

CD2 vazebné činidlo, a sice LFA3TIP (sekvence id.

8) , selektivně moduluje paměťové efektorové T lymfocyty u savců psoriázou.

Materiály a metody

Byly provedena klinická studie' II.

fáze, randomi zováná, dvojitě slepá, paralelní, kontrolou, s LFA3.TIP u se čtyřmi pacientů větvemi a chronickou placebo plakovou psoriázou.

Primárním cílem studie bylo stanovení klinické reakce na dávky v rozmezí 0,025 až

0,15 mg/kg tělesné hmotnosti.

Studie se uskutečnila na místech

V USA a účastnilo se jí 229 subjektů ve věku 18 kritériím patřila plaková psoriáza po dobu rozsahem větším než 10 % povrchového plochy podávanými činidly. Průměrná délka nemoci byla .nebo systémová terapie až let. K nejméně 1 vstupním roku, s

Fototerapie byly přerušeny 1 měsíc před zaháj ením studie. . LFA3TIP byl balen ve formě zmraženého roztoku v lahvičce obsahujícího lOmg/ml fúzního excipienty (chlorid sodný, hydrogenfosforečnan proteinu a a dihydrogensfosforečnan draselný). Lahvičky jsou skladovány v -70 °C a před použitím se ponechají roztát v lednici nebo při teplotě místnosti a naředí se užitím roztoku 0,9% chloridu sodného na výsledný objem 5 ml pro použití jako IV bolus.

CD2 vazebné činidlo bylo podáváno jedenkrát týdně jako i.v. bolus po dobu 12 týdnů, subjekty byly sledovány dalších 12 týdnů po poslední dávce. Závažnost onemocnění byla hodnocena celkovým fyzikálním vyšetřením a také ¹ užitím Indexu aktivity a závažnosti psoriázy (PAŠI), přičemž primární koncové hodnocení účinnosti bylo provedeno 2 týdny po poslední dávce studovaného léku.

Pacientům byla odebrána periferní krev a lymfocyty byly separovány centrifugací na gradientu ficoll-hypaque. Buňky (přibližně 3 x 10⁵) byly testovány průtokovou cytometrií (FACSTAR PLUS, Becton Dickinson, San Jose, CA) . Monitorováno bylo deset tisíc bodů.

Výsledky

Statisticky významné rozdíly byly patrné mezi LFA3TIP a placebem v řadě koncových bodů, včetně redukce skóre .PAŠI při dvou nejvyšších dávkách LFA3TIP. Míra klinické reakce se zvyšovala s rostoucí koncentrací LFA3TIP

Kromě toho léčení tímto CD2 vazebným lymfocytů CD4+ cytotoxických s redukcí periferhích (data nejsou uvedena), činidlem bylo spojeno buněk a CD8+ a NK

T lymfocytů).

pozorována selektivní

Byla redukce paměťových efektorových

T lymfocytů CD45RO+ ve srovnání s naivními CD45RA+ CD4+ a CD8+ buňkami. Průtoková cytometrie specificky odhalila větší redukci u T buněk s vysokou hustotou s paměťovým/efektorovým fenotypem (CD4-CD45RO a CD8-CD45RO) než u CD2 T buněk s naivním fenotypem (CD4-CD45RA a CD8-CD45RA) . Na obr. 1 je ukázán graf demonstrující selektivní redukci paměťových efektórových T lymfocytů vzhledem k naivním T buňkám u pacientů s psoriázou, kteří byly léčeni LFA3TIP. Horizontální úsečky nad osou X představují trvání chronického léčení, které bylo zastaveno asi po 80 dnech. Křivky představující průměrnou hodnotu absolutního počtu subpopulace lymfocytů u 57 pacientů v každé skupině. Bylo zde staticky významné, na dávce závislé, snížení paměťových efektorových T lymfocytů (CD45RO+). Bez ohledu na typ léčení, nebyly pozorovány žádné změny periferních naivních T buněk (CD45RA+). Počet T buněk při léčení různými CD2 vazebnými činidly vykazoval pokles, a v průběhu 80 denního léčeni se přiblížil určité relativně konstantní hodnotě. Po ukončení léčení se počet paměťových efektorových T lymfocytů začal opět zvyšovat.

LFA3TIP byl dobře snášen bez vážných vedlejších účinků způsobených léčivem. U všech subjektů léčených LFA3TIP byla pozorována dočasná mírná a na dávce závislá redukce absolutního počtu periferních lymfocytů. Tato redukce se týkal celkově CD2, CD4 a CD8 lymfocytů, nikoliv však CD19 lymfocytů.

Příklad 2

Léčení revmatoidní artritidy

Pacienti s revmatoidní artritidou (RA) . byli vybráni pro léčení podáváním CD2 vazebného činidla,· a sice LFA3TIP. Lék byl připraven a balen stejně jako v příkladu 1 a pacientům byl podáván v dávkách 7,5 až 10 mg týdně po dobu 12 až 24 týdnů. Pro stanovení optimální dávky a léčebného režimu byla provedena paralelní studie s různým režimy. Pacientům byla odebrána periferní- krev / a lymfocyty byly separovány centrifugací na gradientu ficoll-hypaque. Buňky (přibližně 3 x 10⁵) byly testovány průtokovou cytometrií (FACSTAR PLUS, Becton Dickinson, San Jose, CA), jak bylo popsáno již výše. Pacienti byli sledování také na další kritéria jako např. otoky kloubů nebo skóre křehkosti, což jsou standardní součásti studií „ACR 20 (viz Felson, D.T. e.t al., „Američan College of Rheumatology Core Set of Desease Activity Measurement for Rheumatoid Arthritis Clinical Trials, Arth. Rheum. 26: 729-740, 1993.)

Příklad 3

Léčení zánětlivé nemoci střev (IBD), Crohnovy nemoci a kolitidy

Zánětllvá nemoc střev je generický termín týkající se skupiny chronických zánětlivých nemocí neznámé etiologie, postihujících trávicí trakt. Ulcerativní kolitida (UC) a Crohnova nemoc, dvě hlavní formy idiopatické zánětlivé nemoci střev (IBD) u lidí, jsou široce rozšířeny a přitom nedokonal poznány (viz Kirsner, J.B. et al., eds., Inflammatory- Bowel Disease, 3rd. ed., Lea and Febiger, Philadelphia, 1988, Goldner, F.H. et al.Idiopatic Inflammatory Bowel Disease, in Stein, J.H., ed., Internal Medicine, Little Brown and Co., Boston, pp. 369-380, 18990, Cello, J.P. et al., Ulcerativ.e Colitis , in Sleisenger, M.H. et al., eds., Gastróintestinal Disease: Pathophysiology Diagnosis Management, W.B.Saunders Co., Philadelphia, p. 1435, 1989). Přestože příčiny zánětlivé nemoci střev nejsou známy, k možným etiologickým faktorům patří • ·

- 57 infekce, imunita, rodinné nebo psychické faktory. Sekundární extraintestinální projevy jako je artritida nebo pericholangitida se často projevují v průběhu chronické zánětlivé nemoci střev., K lékové terapii zánětlivé nemoci střev patří podávání protizánětlivých léků, sulfasalzinu (účinnou látkou je zřejmě 5-aminosalicylát, s největší pravděpodobností inhibuje syntézu prostaglandinů) a glukokortikoidů.

Crohnova nemoc nebo regionální ileitida jsou termíny užívané v případě, že se jedná o zánětlivé, oblasti tenkého střeva. Ty jsou zpravidla doprovázeny břišními bolestmi jako při kolice, nepravidelností střev, ztrátou hmotnosti a slabými teplotami. Břicho je obecně zvětšené a jsou cítit hutnější vnitřnosti. Dochází k obstrukcím zúženého střevního kanálu, což vyžaduje okamžitou operaci. Příčina nemoci je neznámá. Primární lézi je hyperplázie lymfatické tkáně v submukóze střev a lymfatických uzlinách. Crohnova. nemoc je chronická nemoc gastrointestinálního traktu a postihuje obvykle ileum, tračník nebo oboje. Diferenciální diagnostikou ji lze odlišit od ulcerativní kolitidy.

Onemocněni zvané ulcerativní kolitida se týká onemocnění povrchové mukózy, na rozdíl od Crohnovy nemoci, která se týká hlubších oblastí, často s poškozením přesahujícím sliznici a fisurami (Riddel, R.H., Pathology of Drug Induced and Toxic Deseases, Churchill Livingstone, New York, 1982,.’ Morrison, B.C. et al., eds., Gastrointestinal Pathology, 2nd ed., London 1979, Fenoglio-Preiser, C.M. et al., eds., Gastrointestinal Pathology: Antigen Atlas and Text, Raven Press, New York, 1989, Goldman, H. et al., Hum. Pathol. 13: 981-1012, 1982. Ulcerativní kolitida typicky zasahuje rektum a šíří se proximálně, aniž by vznikala „vynechaná místa, která jsou

9*0 · 9 · ·*0* •00* 0 0 · 0 0

09 9.90 ··0

00*0 *0 99 «··· ·***· typickým znakem Crohnovy nemoci.

Dostupné zvířecí modely pro IBD lze rozdělit na přirozené a experimentálně indukované zvířecí modely. Bohužel jé k dispozici jen velmi málo spontánních a zřídka se vyskytujících modelů zánětl.ivé nemoci střev, která je důsledkem genetického defektu, přičemž mnohé z nich nejsou idiopatické, ale jsou ¹ důsledkem bakteriální nebo jiné infekce (např.

hyperplázie, kryptický psyliformis u myší nebo absces a vředy způsobené Bacillus tyčinkovitými bakteriemi

Sci. 33, ulcerativní u křečků, viz

Strober, W. Dig. formy spontánní enterokolitidy se se užívají dva Callithricideae (marmoset a tamarin) jako také objevují druhy opic

Π

Suppl. 3S-1OS, kolitidy a u potkanů a z čeledi granulomatózni koní. Kromě toho kosmánovitých, spontánní modely ulcerativní kolitidy a adenokarcinomu tlustého střeva (Clapp,

N.K. et al., eds., Dig. Dis. Sci. .33 Suppl. 1S-158S, 1988.

Exprimetálně indukované zvířecí modely ulcerativní kolitidy jsou obvykle vyvolány expozicí toxickým látkám potravy, farmakologickými přípravky a dalšími chemikáliemi zevního prostředí nebo podáváním materiálů pocházejících od pacientů nebo manipulaci imunitního systému zvířat (Strober, W., Dig. Dis. Sci., 33, suppl.: 3S-10S, 1988, Beekan, W.L. Experimental inflammatory bowel disease, v: Kirsner, J.B., et al., vyd., Inf larnmatory Bowel Disease, Lea a Febiger, Philadelphia, ss. 37-49, 1988, Onderdonk, A.B., Dig. Dis. Sci., 33, suppl.: 40S44S, 1988) .

Lze vyšetřit potenciální terapeutickou účinnost a mechanismy působení CD.2 .vazebného činidla v léčbě Crohnovy nemoci s použitím modelu kosmanů (viz například J. Madara et al., „Characterization of Spontaneous Colitis in Cotton-Top

0 0 0 0 0 0 · 0 0 • ··· . 0 · 0 · · •••0 0* 00 0000 ·« 000

Tamarin (Saguinus oedipus) and Its Response to Sulfasalazine, Gastroenterology, 88, ss. 13-19, 1985). Zásobní roztok CD2 vazebného činidla ve sterilním fyziologickém roztoku (např.LFA3TIP) a placebo kontrola (pouze fyziologický roztok) jsou připraveny pro podávání deseti kosmanům (CTT) projevujících příznaky spontánní kolitidy (tj. průjem apod., viz Madara et al., výše) . Pět opic dostalo CD2 vazebné činidlo a pět dostalo placebo, intravenózní injekcí, CTT, které dostávaly CD2 vazebné činidlo, dostávaly injekce 1 m<j činidla denně (tj . přibližně 2 mg/kg/den, založené na přibližně půl kilogramové hmotnosti CTT) po osm dnů (dny 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 a 7· pokusu) . Vzorky tkáně tračníku získávané od zvířat byly odebírány pomocí biopsie každý druhý den (dny 0, 2, 4, 6, 8 a 10 pokusu) data z biopsií jsou používána k určení akutního zánětlivého indexu pro každé zvíře, dávající semikvantitativní analýzu průběhu kolitidy (viz Madara et al., výše) . Byla odebírána periferní krev a odděleny lymfocyty s použitím centrifugace na gradientu ficoll-hypaque. Buňky (přibližně 3 χ 10⁵) byly testovány průtokovou cytometrii (FACSTAR PLUS, Becton Dickinson, San Jose, CA), jak již bylo uvedeno výše. Výsledky ukázaly selektivní snížení paměťových efektorových T buněk a prokázaly, že léčba CD2 činidlem má za následek významné (p < 0,01) snížení • zánětlivého indexu.

vazebným akutního

Pacienti s IBD vybráni pro léčbu s použitím CD2 vazebným činidlem, jako například LFA3-TIP.

Tento materiál je a zabalen jak popsáno v příkladu v dávkách přibližně 7, 5 až 10 mg týdnů. Aby prováděla odlišných se určila optimální byl týdně po dávka a podáván období schéma se paralelní studie s použitím výše režimů. Pacientům je odebírána připraven pacientům až 24 podávání, uvedených periferní krev ♦ 4 4 44*·44·

4444 4 · 444

44 ·4 · · ··

444-4 44 44 ···· 44444 a lymfocyty jsou separovány s použitím centrifugace na gradientu ficoll-hypaque. Buňky (přibližně 3 x 10⁵) jsou testovány průtokovou cytometrií (FACSTAR PLUS, Becton Dickinson, San Jose, CA), jak bylo uvedeno výše. Pacienti jsou sledováni s použitím několika znaků, včetně indexu aktivity Crohnovy nemoci (Kjeldsen, J. a Schaffalitzky de Muckadell, O.B., Scand. J. Gastroenterol., 28, 1-9, 1993).

Příklad 4

Léčení uveitidy

Uveitida je onemocnění oka, které může být lokalizováno v oku včetně zadní a přední komory oční, jakož i v tělese sklivce. Uveitida, zánět uvey, je zodpovědná za přibližně 10 % zhoršení zraku ve Spojených Státech. Panuveitidou se nazývá zánět celé uveálni (veskulární) vrstvy oka. Zadní uveitida se obecně nazývá chorioretinitida a přední uveitida se nazývá íridocyklitida. Zánětlivé produkty, tj . buňky, fibrin, nadměrný protein, těchto zánětů jsou obvykle nalézány v prostorech oka s tekutinou, včetně přední komory, zadní komory a prostoru sklivce, a také v tkáni zapojené do zánětlivé reakce. Uveitida může nastat po chirurgickém výkonu na oku nebo po traumatickém poranění oka, revmatoidní jako složka autoimunitní artritidy, Behcetovy poruchy sarkoidózy, spondylitidy, zprostředkovaná oční choroba, j ako tj. pars nemoci, izolovaná jako například ankylozuj ící imunitně planitis, iridocyclitis apod., nespojená se známými etiologiemi a následující určité systémové choroby, které způsobují komplexy antigen-protilátka ukládané do uveálních tkání. Dohromady tyto choroby představují uveitidy neinfekčniho původu.

Léčení savců

Ve studii byly použity opice (makakové). Zvířatům je podána anestézie s použitím ketaminu. (30 mg/kg) při všech procedurách. Zařízení obsahující 6 mg LFA3-TIP jsou implantována do pravého oka. a kontrolní zařízení skládající se ze samotného polymeru jsou implantována do levého oka, jak popsáno. Opice mají dobře vyvinutou pars plana, takže byla nezbytná kryopexie. Všechna zařízení jsou implantována 3 mm posteriorně k limbu spodního temporálního kvadrantu. Zvířatům je podávána anestézie 1 týden, 2 týdny, 4 týdny, 2 měsíce, 4 měsíce a 6 měsíců po implantaci a podstupují vyšetření nepřímou oftalmoskopií a elektroretinografií. Elektroretinografie je prováděna tak, jak popsáno, s výjimkou, že průměry 5 odpovědí jsou získávány přístrojem pro klinické průměry· (clinical averager Nicolet CA-1000, Madison, Wis.) a s přístrojem CKA Ganzfeld Flash (Gaithersburg, Md.) . V 6 měsících je analyzován vzorek krve prostřednictvím HPLC na cyclosporin (detekční limit = 25 ng/ml). Po 6 měsících jsou zvířata utracena předávkováním pentobarbitalu a pak jsou okamžitě perfundována přes levou komoru 10% pufrovaným formalinem. Oči jsoů uloženy do fixativu a pak jsou zalita do parafinu, neřezána a vyšetřena anonymně na známky toxicity. Byla odebrána periferní krev a lymfocyty separovány pomocí centrifugace na gradientu ficoll-hypaque. Buňky (přibližně 3 x 10⁵) jsou testovány průtokovou cytometrií (FACSTAR PLUS, Becton Dickinson, San Jose, CA).

Farmakokinětiká

Bylo použito dvacet čtyři zvířat (skupina 1) . CD2 vazebné činidlo je zamícháno do zásobních roztoků v poměru 50:50 ethanol:voda v koncentraci 1 pg/20 μΐ a 10 pg/20 μΐ. K zásobnímu roztoku bylo také přidáno CD2 vazebné činidlo s tritiem (1 pCi/20 ml). Zvířatům je podána anestézie ketaminem (60 mg) a xylazinem (20 mg) a zornice jsou dilatovány jednou kapkou ' fenylefrinhydrochloridu (2,5%) a tropikamidu (.1%) . Pak je podávána injekce do sklivce CD2 vazebného činidla přes musculus rectus superior přibližně 500 posteriorně k limbu s použitím jehly o kalibru 30. Dvanáct zvířat dostalo dávku 1 pg ve 20 μΐ a 12 zvířat dostalo dávku 10 pg ve 20 μΐ. Injekce je podávána doprostřed do dutiny sklivce a věnuje se pozornost tomu, aby se nepoškodila čočka. Ve skupině, která dostala 1 pg, jsou 3 zvířata usmrcena v 0,5, 3, 6a 24 hodinách. Ve skupině, která dostala 10 pg, jsou 3 zvířata usmrcena v 0,5, 6, 24 a 48 hodinách. Oči jsou . enukleovány a pak okamžitě zmraženy v -70 °C. Tkáně jsou připraveny pro test, jak je popsán níže. Intravitreální poločas a distribuční objem jsou určovány z grafu regresní analýzy 1 n koncentrace versus čas.

Léčení

Bylo použito jedenáct zvířat. CD2 vazebné činidlo obsažené v zařízení s prodlouženým uvolňováním je implantováno do pravého oka. Zařízení obsahující pouze polymery je implantováno do levého oka. Před implantací zařízení je provedeno vyšetření skládající se z oftalmoskopie a elktroretinografie (EŘG). Z obou očí jsou zaznamenávány skotopické a fotopické elektroretinogramy (ERG) s použitím elektrod v kontaktních • · · ······· • ··· · · · ♦ · • · · ··· ··· ····«· ······ 9 9 999 čočkách (ERG-Jet) s dvoukanálovým klinickým přístrojem pro zprůmerování signálu (Cadwell 5200, Kennewick, Wash.) a přístrojem Ganzfeld Flash Unit (Cadwell VPA-10, Kennewick,Wash.). ERG po adaptaci na tmu, prováděné po alespoň 30 minutách adaptace na tmu, jsou vyvolávány v 0,33 Hz a jsou průměry 20 prezentací stimulu. ERG adaptované na světlo jsou prováděny ve 2,8 Hz po alespoň 5 minutách světelné adaptace a jsou také průměrem 20 stimulů. Výsledné vlny jsou hodnoceny na amplitudu a latenci. Aby se minimalizoval účinek individuální a denní variace (13-15), jsou ERG reakce vyhodnocovány s použitím poměru experimentální amplitudy (vpravo) ke kontrolní amplitudě (vlevo). Když jsou amplitudy experimentálního a kontrolního oka stejné, poměr se rovná 1. Snížení poměru odráží relativní pokles amplitudy experimentálního oka.

Vyšetření jsou opakována ve dnech 1, 7, 14 a pak každé dva týdny po dalších 6 měsíců. Tři zvířata jsou usmrcena v 6 týdnech a dvě zvířata jsou usmrcena v 16 týdnech. Aby se vyhodnotila reverzibilní toxicita, je zařízení 3 zvířatům odstraněno v 16 týdnech. Tato zvířata jsou vyšetřována v týdenních intervalech dva měsíce a pak utracena. Zbývající dvě zvířata jsou utracena ve 26 týdnech. Po utracení jsou zvířata perfundována fixativem (buď 10= pufrovaným formalinem nebo 6% glutaraldehydem pufrovaným fosfátem) přes levou komoru. Oči jsou enukleovány a umístěny ve fixativu. Tří 3 mm až 6 mm vzorky ze zadního pólu jsou pak zality buď do parafinu nebo do umělé hmoty a jsou nařezány. Jeden řez každého vzorku je vyšetřován anonymně na známky toxicity.

·· φ· . φφ φ φ • · · φ φ φ φ φ ••ΦΦ φφ · φ · · φ φ · · φ φ · · · ···· φφ φφ φφφφ φφ Φ·Φ

- 64 Příklad 5

Léčeni psoriatické artritidy

Tento příklad poskytuje protokol pro testování klinických účinků a tkáňové odpovědi CD2 vazebného činidla, u pacientů s psoriatickou artritidou.

Psoriatická artritida se vyskytuje u 5 až 8 % pacientů s psoriázou a je obecnou chronickou revmatickou nemocí, které může mít za následek značné poškození kloubů, když se ponechá neléčena. Současné klinické studie se zaměřily na identifikace faktorů špatné prognózy. Časná útočná léčba je indikována u pacientů s významným zánětem kloubů a určitými antigeny HLA. Psoriáza a psoriatická artritida jsou považovány za typické nemoci zprostředkované T buňkami. Důkazy o imunopatogénitě ukazují na nemoc zprostředkovanou HLA třídy I, možná s důležitou úlohou CD8+ T buněk.

Návrh studie

Jednalo se o dvoufázovou pilotní studii na příkladu CD2 vazebného činidla u pacientů s psoriatickou artritidou.

Studie se skládala ze tříměsíčního období léčeni s týdně podávanými injekcemi CD2 vazebného činidla. Účinek na psoriatické kožní léze a na artritidu byl měřen klinickými a rutinními laboratorními metodami na začátku léčebného období, v jeho průběhu a po ukončení. Těsně před, započetím období léčby, po čtyřech týdnech a po ukončení léčby byly odebírány synoviální biopsie pro imunohistologická vyšetření s použitím standardizovaných metod. Před léčbou, po 4 a 12 týdnech a po

léčení na konci 3 měsíců byly odebírány kožní biopsie pro imunohistologická vyšetření s použitím standardizovaných metod.

Populace ve studii

Počet subjektů

Pacienti s psoriatickou artritidou byly vyšetřeni, aby se vybrali pacienti pro studii, kteří splnili všechna následující kritéria pro zahrnutí do studie:

1) pacienti mužského nebo ženského pohlaví mezi 18 a 70 lety věku včetně,

2) pacienti ženského pohlaví musí být v nereprodukčnim stavu (chirurgicky sterilní nebo alespoň jeden.rok po menopauze) nebo měly.negativní těhotenský test při provádění vyšetření a dodržovaly účinnou antikoncepční metodu alespoň jeden měsíc před studií s podáváním léku, během studie a v období 6 měsíců po podávání,

3) pacienti musí splnit kritéria pro. diagnózu jednoznačné psoriatické artritidy,

4) pacienti musí mít klinicky zjevnou artritidu alespoň jednoho kolenního kloubu a 3 dalších kloubů, ranní ztuhlost alespoň 30 minut a rychlost sedimentace krvinek (ESR) alespoň 28 mm,

5) pacienti musí mít diagnózu psoriázy plakového typu delší než 12 měsíců před první dávkou studovaného léčiva,

6) pacienti musí mít skóre PAŠI 12 nebo větší,

7) pacienti musí přestat brát všechny imunomodulační léky, jako například metotrexát, cyklosporin a kortikosteroidy a všechny další sloučeniny používané k léčbě psoriázy a/nebo psoriatické artritidy kromě nesteroidních protizánětlivých.

·· 9· 99 ·999

9 9 · 9 · · 9 99 • * · · 9 9 9 99 • 99 9 9 ·999 • 9. ♦ · 99 99 ··♦· ··999 léků (NSAIDs), alespoň čtyři týdny před provedením vyšetřeni,

8.) pacienti musí mít absolutní počet CD4+ lymfocytů na spodním limitu normálu nebo vyšší 14 dnů před podáním první dávky.

Léčebné schéma

CD2 vazebné činidlo bylo podáváno jako intravenózní bolus

7,5 mg fixní dávky, podávané jednou každý týden do celkem dvanácti dávek.

Modifikace léčebného schématu

Aby pacient dostal další dávku studovaného léčiva, musí nastat následující:

absolutní počet periferních lymfocytů zjištěný pro každého pacienta v okamžiku do 24 po podávání musí být větší než 67 % spodního limitu normálního OR a větší než 50 % naměřené výchozí hodnoty pacienta,

- absolutní počet CD4+ lymfocytů zjištěný před předcházejicí dávkou musí být vyšší·než 300 buněk/mm³.

Jestliže nebylo splněno jakékoliv z výše uvedených kritérií, byla pacientova dávka pozdržena a pacient se vrátil následující týden pro opakované hodnocení. Jestliže některý pacient prodělal setrvalé snížení absolutního počtu periferních lymfocytů po více než 28 dnů, bylo podávání studovaného léčiva trvale přerušeno.

Přerušení podávání studovaného léčiva a odvolání pacientů

Následující část popisuje kritéria pro přerušení podávánístudovaného léčiva a kritéria pro odvolání pacientů ze studie.

·· ·· «· ···· « • · · · · · · · ·· · • ··· «to · · ·· « · · · · « ··· • ••to ·· ·· ···· .·····

Prováděcí schéma

Testy a hodnoceni

Všechny krevní vzorky pro hematologickou analýzu a analýzu subpopulací lymfocytů byly odebírány e stejnou denní dobu, aby se zabránilo artefaktům způsobeným denním kolísáním.

Následující testy a hodnocení byly prováděny v uvedených časových bodech před každou dávkou studovaného léčiva, pokud není jinak uvedeno:

- . kompletní fyzikální vyšetření bylo prováděno při návštěvách

5, 9 a 13,

- měření vitálních příznaků bylo prováděno při návštěvách 1 až 13 a návštěvách 15 až 17, zaznamenávání tělesné hmotnosti bylo prováděno při návštěvách 1 až 13 a návštěvách 15 až 17, vyšetření moči bylo prováděno při návštěvách 5, 9, 13 a 17, biochemické vyšetření krve bylo prováděno při návštěvách 5, 9, 13 a 17, hematologické vyšetření bylo prováděno při návštěvách 1 až 17. První laboratorní test byl prováděn během 48 hodin před podáním první dávky studovaného léčiva. Všechny další testy byly prováděny během 24 hodin před každou dávkou, analýza subpopulací lymfocytů byla prováděna při návštěvách 1 až 17, těhotenský test (z moče) byl prováděn u žen při návštěvách 5, 13 a 17,

• «	··		• *	' ··		·*
	•	•	•	• ·	•	• ·
•		•	•	•	.·	·'
•	• ·	•	•	•	•	•
·»··	··		··	····		·« ·

- kvantitativní měřeni imunoglobulinů IgG, IgA a IgM bylo prováděno při návštěvě 13, skórování PAŠI bylo prováděno při návštěvách 1, 3, 5, 7, 9 a 13 až 17,

- měření sIL-2R a SCD27 při návštěvách 1/ 3, 5, 7, 9, 11 a 13 .až 17, kožní bodová biopsie postižené, necílené léze z oblasti nevystavené slunečnímu světlu byla prováděna při návštěvách 1, 5, 13 s volitelnou biopsií při návštěvě 17, test ACR Core Set byl vyhodnocen při návštěvách 1, 5, 9, 13 a 17, ' kritéria zlepšení ACR byla vyhodnocena při návštěvách 5, 9, a 17, artroskopická biopsie synovie kolenního kloubu byla prováděna při návštěvách 1, 5 a 13.

Hodnocení účinnosti

Klinické hodnocení účinnosti

Artritida

Všechna hodnocení účinnosti léčiva na artritidu byla prováděna stejným badatelem/revmatologem u každého pacienta: test ACR Core Set a vyšetření kritérií zlepšení.

Kožní léze '

Všechna hodnocení účinnosti léčiva na kožní léze byla prováděna stejným badatelem/dermátologem u každého pacienta: skóre PAŠI, ·· ·· ·· ·· « 9 · · · · · • ··· · · · ·····« · · • · · · · · ···· ·· ·· ···· ·· *· •· •· •· ·· vyšetřen.! nehtů.

Laboratorní hodnoceni účinnosti artroskopická biopsie synovie, imunohistologické studie synovie, sérové ukazatele aktivity nemoci u psoriázy, kožní biopsie,

- 'imunohistologické studie kůže.

Hodnocení bezpečnosti '

Klinické hodnocení bezpečnosti fyzikální vyšetření, vitální příznaky (teplota, srdeční frekvence, dechová frekvence a krevní tlak vleže na zádech), tělesná hmotnost, sledování známek infekce, sledování vedlejších příznaků

Laboratorní hodnocení bezpečnosti hematologie: kompletní krevní obraz s-diferenciálním rozpočtem krvinek a počtem trombocytů byl prováděn během 24 , hodin po podání dávky a sledován badatelem v každém místě, profil biochemického vyšetření krve: sodík, draslík, chlorid, hydrouhličitan, dusík močoviny v krvi, kreatinin, vápník, fosfát, albumin, celkový protein, alkalická fosfatáza, celkový bilirubin, ALAT, ASAT a gamma-glutamyltransferáza, vyšetření moči.

- 70 Specifické hodnoceni bezpečnosti pro produkt/studie kvantifikace subpopulací periferních lymfocytů s použitím průtokové cytometrie s dobře definovanými markéry pro subpopulace T lymfocytů (CD4, CD8) .

Statistické údaje a analytický plán

Hodnocení velikosti vzorku

Pilotní studie s 10 pacienty je považována za přiměřenou pro vyhodnocení bezpečnosti a účinnosti.

Poslední zkušenost.

s CD2 vazebným činidlem, jako

LFA-3/IgGl, prokázala souhlasný například účinek . na s fúzním proteinem celkové lymfocyty a subpopulace CD4 a CD8.

Popis koncových bodů

Primární koncové body klinické účinnosti pro artritidu a psoriázu se vztahuj i koncové body a 8 týdnů.

klinické k ukončení léčby po 12 týdnech, účinnosti se vztahují k léčbě

Náhradní trvaj ící

Primární koncové body bezpečnosti se vztahuj i k ukončení pozorovacího období koncové body imunohistologických změn v kůži a synovii se dvěma časovým bodům: po 4 týdnech a po 12 týdnech měsíce po léčbě.

Náhradní vztahují ke léčby.

Statistické metody používané v objektivních analýzách

Obecná metoda analýzy .stanoví odlišnosti klinických a laboratorních parametrů mezi hodnotami výchozími a na konci léčby. To se· provádělo například s·použitím jednofaktorové analýzy variance nebo kovariance nebo logistické regrese. Před • ·

- 71 analýzou byly reakce eventuálně transformovány. Podle potřeby byly použity neparametrické metody.

Analýzy klinické účinnosti

Byl Určen pódii pacientů vykazujících 20% zlepšení v testu ACR Core Set. Byl určen podíl pacientů s alespoň 50% snížením PAŠI skóre oproti výchozím hodnotám·. Další míry účinnosti zahrnují minimální PAŠI skóre, celkové skóre erytému, celkové skóre indurace, celkové skóre deskvamace a skóre postižení nehtů.

Analýzy laboratorní účinnosti

Imunohistologické studie synovie a kůže a sérové hladiny ukazatelů psoriatické aktivity poskytly data, která byla srovnána s výchozími hodnotami.

Zatímco původci popsali celou řadu provedení vynálezu, je zjevné, že základní provedení původců mohou být modifikována, aby poskytla další provedení, které jsou však založena na předkládaném vynálezu. Tudíž je zřejmé, že předmět vynálezu zahrnuje všechna alternativní provedení a variace, které jsou definovány ve výše uvedeném popise a připojených patentových nárocích, a že vynález není nijak omezen specifickými provedeními, která zde byla uvedena formou příkladů.

• · * · ·· • 3 • · • · ··· · ·· • · · ·

· ···

SEZNAM SEKVENCÍ <210> 1 <211> 7'53 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggttgctg ggagcgacgc ggggcgggcc ctgggggtcc tcagcgtggt ctgcctgctg60 cactgctttg gtttcatcag ctgtttttcc caacaaatat atggtgttgt gtatgggaat120 gtaactttcc atgtaccaag caatgtgcct ttaaaagagg tcctatggaa aaaacaaaag180 gataaagttg cagaactgga aaattctgaa ttcagagctt tctcatcttt taaaaatagg240 gtttatttag acactgtgtc aggtagcctc actatctaca acttaacatc atcagatgaa300 gatgagtatg aaatggaatc gccaaatatt actgatacca tgaagttctt tctttatgtg360 cttgagtctc ttccatctcc cacactaact tgtgcattga ctaatggaag cattgaagtc420 caatgcatga' taccagagca ttacaacagc catcgaggac ttataatgta ctcatgggat480 tgtcctatgg agcaatgtaa acgtaactca accagtatat attttaagat ggaaaatgat540 cttccacaaa aaatacagtg tactcttagc aatccattat ttaatacaac atcatcaatc600 attttgacaa cctgtatccc aagcagcggt cattcaagac acagatatgc acttataccc660 ataccattag cagtaattac aacatgtatt gtgctgtata tgaatggtat tctgaaatgt720 gacagaaaac cagacagaac caactccaat tga753 <210> 2 <211> 249 <212> PRT <213> Homo sapiens * · • · • ·

- 73 <400> 2

Met 1

Val

Ala Gly

Ser Asp 5

Ala Gly Arg

Ala 10

Leu

Gly

Val

Leu

Ser 15

Val

Val

Cys

Leu

Leu

His

Cys

Phe

Gly

Phe

Ile

Ser

Cys

Phe

Ser

Gin

Gin

20

25

30

Ile

Gly

Val

Val

Tyr

Gly

Asn

Val

Thr

Phe

His

Val

Pro

Ser

Asn

Val

35

40

45

Pro

Leu

Lys

Glu

Val

Leu

Trp

Lys

Lys

Gin

Lys

Asp

Lys

Val

Ala

Glu

5 0

55

60

Leu

Glu

Asn

Ser

Glu

Phe

Arg

Ala

Phe

Ser

Ser

Phe

Lys

Asn

Arg

Val

65

70

75

80

Tyr

Leu

Asp

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Leu

Thr

Ile

Tyr

Asn

Leu

Thr

Ser

85

90

95

Ser

Asp

Glu

Asp

Glu

Tyr

Glu

Met

Glu

Ser

Pro

Asn

Ile

Thr

Asp

Thr

100

105

110

Met

Lys

Phe

Phe

Leu

Tyr

Val

Leu

Glu

Ser

Leu

Pro

Ser

Pro

Thr

Leu

115

120

125

Thr

Cys

Ala

Leu

Thr

Asn

Gly

Ser

Ile

Glu

Val

Gin

Cys

Met

Ile

Pro

130

135

140

Glu

His

Tyr

Asn

Ser

His

Arg

Gly

Leu

Ile

Met

Tyr

Ser

Trp

Asp

Cys

145

150

155

160

Pro

Met

Glu

Gin

Cys

Lys

Arg

Asn

Ser

Thr

Ser

Ile

Tyr

Phe

Lys

Met

165

170

175

Glu

Asn

Asp

Leu

Pro

Gin

Lys

Ile

Gin

Cys

Thr

Leu

Ser

Asn

Pro

Leu

180

185

190

Phe

Asn

Thr

Thr

Ser

Ser

Ile

Ile

Leu

Thr

Thr

Cys

Ile

Pro

Ser

Ser

195

200

205

Gly

His

Ser

Arg

His

Arg

Tyr

Ala

Leu

Ile

. Pro

Ile

Pro

Leu

Ala

Val

210

215

220

Ile

Thr

Thr

Cys

Ile

Val

Leu

Tyr

Met

Asn

Gly

Ile

Leu

Lys

Cys

Asp

225

230

235

240

4 4 4 4 44» « » 4 4 4 44

4 4 4 · 44 «4 4 4 4 ·*

4·*«44 «4 4 4 «4 4 ·4444

44 • 44 4 : :í é4

44 4 4

- Ί4 Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn

245 <210> 3 <211> 723 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3

atggttgctg	ggagcgacgc	ggggcgggcc	ctgggggtcc	tcagcgtggt	ctgcctgctg	60
cactgctttg	gtttcatcag	ctgtttttcc	caacaaatat	atggtgttgt	gtatgggaat	120
gtaactttcc	atgtaccaag	caatgtgcct	ttaaaagagg	tcctatggaa	aaaacaaaag	180
gataaagttg	cagaactgga	aaattctgaa	ttcagagctt	tctcatcttt	taaaaatagg	'240
gtttatttag	acactgtgtc	aggtagcctc	actatctaca	acttaacatc	atcagatgaa	300
gatgagtatg	aaatggaatc	gccaaatatt	actgatacca	tgaagttctt	tctttatgtg	360
cttgagtctc	ttccatctcc	cacactaact	tgtgcattga	ctaatggaag	cattgaagtc	420
caatgcatga	taccagagca	ttacaacagc	catcgaggac	ttataatgta	ctcatgggať	480
tgtcctatgg	agcaatgtaa	acgtaactca	accagtatat	attttaagat	ggaaaatgat	540
cttccacaaa	aaatacagtg	tactcttagc	aatccattat	ttaatacaac	atcatcaatc	600
attttgacaa	cctgtatccc	aagcagcggt	cattcaagac	acagatatgc	acttataccc	660
ataccattag	cagtaattac	aacatgtatt	gtgctgtata	tgaatggtat	gtatgctttt	720

taa ' 723 <210> 4 <211> 240 <212> PRT <213> Homo sapiens φ φ

- 75 <400> 4

Met 1

Val

Ala

Gly Ser 5

Asp Ala

Gly

Arg

Ala 10

Leu

Gly

Val

Leu

Ser Val 15

Val

Cys

Leu

Leu

His

Cys

Phe

Gly

Phe

Ile

Ser

Cys

Phe

Ser

Gin

Gin

20

25

30

Ile

Tyr

Gly

Val

Val

Tyr

Gly

Asn

Val

Thr

Phe

His

Val

Pro

Ser

Asn

35

40

4 5

Val

Pro

Leu

Lys

Glu

Val

Leu

Trp

Lys

Lys

Gin

.Lys

Asp

Lys

Val

Ala

50

55

60

Glu

Leu

Glu

Asn

Ser

Glu

Phe

Arg

Ala

Phe

Ser

Ser

Phe

Lys

Asn

Arg

65

70

75

80

Val

Tyr

Leu

Asp

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Leu

Thr

Ile

Tyr

Asn

Leu

Thr

85

90

95

Ser

Ser

Asp

Glu

•Asp

Glu

Tyr

Glu

Met

Glu

Ser

Pro

Asn

Ile

Thr

Asp

100

105

110

Thr

Met

Lys

Phe

Phe

Leu

Tyr

Val

Leu

Glu

Ser

Leu

Pro

Ser

Pro

Thr

115

120

125

Leu

Thr

Cys

Ala

Leu

Thr

Asn

Gly

Ser

Ile

Glu

Val

Gin

Cys

Met

Ile

130'

135

140

Pro

Glu

His

Tyr

Asn

Ser

His

Arg

Gly

Leu

Ile

Met

Tyr

Ser

Trp

Asp

145

150

155.

160

Cys

Pro

Met

Glu

Gin

Cys

Lys

Arg

Asn

Ser

Thr

Ser

Ile

Tyr

Phe

Lys

165

170

175

Met

Glu

Asn

Asp

Leu

Pro

Gin

Lys

Ile

Gin

Cys

Thr

Leu

Ser

Asn

Pro

180

185

190

Leu

Phe

Asn

Thr

Thr

Ser

Ser

Ile

Ile

Leu

Thr

Thr

Cys

Ile

Pro

Ser

195

200

205

Ser

Gly

His

Ser

Arg

His

Arg

Tyr

Ala

Leu

Ile

Pro

Ile

Pro

Leu

Ala

210

215

220

Val

Ile

Thr

Thr Cys

Ile

Val

Leu

Tyr

Met

Asn

Gly

Met

Tyr

Ala

Phe

225

230

235

240

• · φ φ φ φ

- 76 <210> 5 <211> 1056 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> .5

atgagctttc	catgtaaatt	tgtagccagc	ttccttctga	ttttcaatgt	ttcttccaaa	60
ggtgcagtct	ccaaagagat	tacgaatgcc	ttggaaacct	ggggtgcctt	gggtcaggac	120
atcaacttgg	acattcctag	ttttcaaatg	agtgatgata	ttgacgatat	aaaatgggaa	180
aaaacttcag	acaagaaaaa	gattgcacaa	ttcagaaaag	agaaagagac	tttcaaggaa	240
aaagatacat	ataagctatt	taaaaatgga	actctgaaaa	ttaagcatct	gaagaccgat	300
gatcaggata	tctacaaggt	atcaatatat	gatacaaaag	gaaaaaatgt	gttggaaaaa	360
atatttgatt	tgaagattca	agagagggtc	tcaaaaccaa	agatctcctg	gacttgtatc	420
aacacaaccc	tgacctgtga	ggtaatgaat	ggaactgacc	ccgaattaaa	cctgtatcaa	480
gatgggaaac	atctaaaact	ttctcagagg	gtcatcacac	acaagtggac	caccagcctg	540
agtgcaaaat	tcaagtgcac	agcagggaac	aaagtcagca	aggaatccag	tgtcgagcct	600
gtcagctgtc	cagagaaagg	tctggacatc	tatctcatca	ttggcatatg	tggaggaggc	660
agcctcttga	tggtctttgt	ggcactgctc	gttttctata	tcaccaaaág	gaaaaaacag	720
aggagtcgga	gaaatgatga.	ggagctggag	acaagagccc	acagagtagc	tactgaagaa	780
aggggccgga	agccccacca	aattccagct	tcaacccctc	agaatccagc	aacttcccaa	840
catcctcctc	caccacctgg	tcatcgttcc	caggcaccta	gtcatcgtcc	cccgcctcct	900
ggacaccgtg	ttcagcacca	gcctcagaag	aggcctcctg	ctccgtcggg	cacacaagtt	960
caccagcaga 1020	aaggcccgcc	cctccccaga	cctcgagttc	agccaaaacc	tccccatggg

gcagcagaaa actcattgtc cccttcctct aattaa

1056

<210>	6
<211>	351
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	6

Met 1

Ser

Phe

Pro

Cys 5

Lys

Phe

Val Ala

Ser 10

Phe

Leu

Leu

Ile

Phe 15

Asn

Val

Ser

Ser

Lys

Gly

Ala

Val

Ser

Lys

Glu

Ile

Thr

Asn

Ala

Leu

Glu

20

25

30

Thr

Trp

Gly

Ala

Leu

Gly

Gin

Asp

Ile

Asn

Leu

Asp

Ile

Pro

Ser

Phe

35

40

45

Gin

Met

Ser

Asp

Asp

Ile

Asp

Asp

Ile

Lys

Trp

Glu

Lys

Thr

Ser

Asp

50

55

60

Lys

Lys

Lys

Ile

Ala

Gin

Phe

Arg

Lys

Glu

Lys

Glu

Thr

Phe

Lys

Glu

65

70

75

80

Lys

Asp

Thr

Tyr

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Gly

Thr

Leu

Lys

Ile

Lys

His

85

90

95

Leu

Lys

Thr

Asp

Asp

Gin

Asp

Ile

Tyr

Lys

Val

Ser

Ile

Tyr

Asp

Thr

100

105

110

Lys

Gly

Lys

Asn

Val

Leu

Glu

Lys

Ile

Phe

Asp

Leu

Lys

Ile

Gin

Glu

115

120

125

Arg

Val

Ser

Lys

Pro

Lys

Ile

Ser

Trp

Thr

Cys

Ile

Asn

Thr

Thr

Leu

130

135

140

Thr

Cys

Glu

Val

Met

Asn

Gly

Thr

Asp

Pro

Glu

Leu

Asn

Leu

Tyr

Gin

145

150

155

160

Asp

Gly

Lys

His

Leu

Lys

Leu

Ser

Gin

Arg

Val

Ile

Thr

His

Lys

Trp

165

170

175 1

Thr

Thr

Ser

Leu

Ser

Ala

Lys

Phe

Lys

Cys

Thr

Ala

Gly

Asn

Lys .

Val

180

185

190

Ser

Lys

Glu

Ser

Ser

Val

Glu

Pro

Val

Ser

Cys

Pro

Glu

Lys

Gly

Leu

195

200

205 .

Asp

Ile

Tyr

Leu

Ile

Ile

Gly

Ile

Cys

Gly

Gly

Gly

Ser

Leu

Leu

Met

210

215

220

Val 225

Phe

Val

Ala

Leu

Leu 230

Val

Phe

Tyr

Ile

Thr 235

Lys

Arg

Lys

Lys

Gin 240

Arg

Ser

Arg

Arg

Asn

Asp

Glu

Glu

Leu

Glu

Thr

Arg

Ala

His

Arg

Val

245

.250

255

Ala

Thr

Glu

Glu

Arg

Gly

Arg

Lys

Pro

His

Gin

Ile

Pro

Ala

Ser

Thr

260

X

265

270

Pro

Gin

Asn

Pro

Ala

Thr

Ser

Gin

His

Pro

Pro

Pro

Pro

Pro

Gly

His

275

280

285

Arg

Ser

Gin

Ala

Pro

Ser

His

Arg

Pro

Pro

Pro

Pro

Gly

His

Arg

Val

290

295

300

Gin

His

Gin

Pro

Gin

Lys

Arg

Pro

Pro

Ala

Pro

Ser

Gly

Thr

Gin

Val

305

310

315

320

His

Gin

Gin

Lys

Gly

Pro

Pro

Leu

Pro

Arg

Pro

Arg

Val

Gin

Pro

Lys

325

330

335

Pro

Pro

His

Gly

Ala

Ala

Glu

Asn

Ser

Leu

Ser

Pro

Ser

Ser

Asn

340

345

350

<210>	7
<211>	1050
<212>	DNA
<213>	Horno sapiens
<400>	7

atggttgctg	ggagcgacgc	ggggcgggcc	ctgggggtcc	tcagcgtggt	ctgcctgctg	60
cactgctttg	gtttcatcág	ctgtttttcc	caacaaatat	atggtgttgt	gtatgggaat	120
gtaactttcc	atgtaccaag	caatgtgcct	ttaaaagagg	tcctatggaa	aaaacaaaag	180
gataaagttg	cagaactgga	aaattctgaa	ttcagagctt	tctcatcttt	taaaaatagg	240
gtttatttag	acactgtgtc	aggtagcctc	actatctaca	acttaacatc	atcagatgaa	3 00
gatgagtatg	aaatggaatc	gccaaatatt	actgatacca	tgaagttctt	tctttatgtc	360
gacaaaactc	acacatgccc	accgtgccca	gcacctgaac	tcctgggggg	accgtcagtc	420

• · · ·

ttcctcttcc	ccccaaaacc	caaggacacc	ctcatgatct	cccggacccc	tgaggtcaca	480
tgcgtggtgg	tggacgtgag	ccacgaagac	cctgaggtca	agttcaactg	gtacgtggac	540
ggcgtggagg	tgcataatgc	caagacaaag	ccgcgggagg	agcagtacaa	cagcacgtac	600
cgggtggtca	gcgt.cctcac	cgtcctgcac	caggactggc	tgaaťggcaa	ggagtacaag	660
tgcaaggtct	ccaacaaagc	cctcccagcc	cccatcgaga	aaaccatctc	caaagccaaa	720
gggcagcccc	gagaaccaca	ggtgtacacc	ctgcccccat	cccgggatga	gctgaccaag	780
aaccaggtca	gcctgacctg	cctggtcaaa	ggcttctatc	ccagcgacat	cgccgtggag	840
tgggagagca	atgggcagcc	ggagaacaac	tacaagacca	cgcctcccgt	gctggactcc	900
gacggctcct	tcttcctcta	cagcaagctc	accgtggaca	agagcaggtg	gcagcagggg	960
aacgtcttct	catgctccgt	gatgcatgag	gctctgcaca	accactacac	gcagaagagc

1020 ctctccctgt ctccgggtaa atgagtgcgg

1050 <210> 8 <211> 347 <212> PRT <213> Herno sapiens <400> 8

Met 1	Val	Ala	Gly	Ser 5	Asp	Ala	Gly
Val	' Cys	Leu	Leu 20	His	Cys	Phe	Gly
Ile	Tyr	Gly 35	Val	Val	Tyr	Gly	Asn 40
Val	Pro 50	Leu	Lys	Glu	Val	Leu 55	Trp
Glu 65	Leu	Glu	Asn	Ser	Glu 70	Phe	Arg

Arg	Ala 10	Leu	Gly	Val	Leu	Ser 15	Val
Phe 25	Ile	Ser	Cys	Phe	Ser 30	Gin	Gin
Val	Thr	Phe	His	Val 45	Pro	Ser	Asn
Lys	Lys	Gin	Lys 60	Asp	Lys	Val	Ala
Ala	Phe	Ser 75	Ser	Phe	Lys	Asn	Arg 8 0

• 9

9 · ·

Val

Tyr

Leu

Asp

Thr Val 85

. Ser

Gly Ser

Leu 90

Thr

Ile

Tyr

Asn

Leu 95

Thr

Ser

Ser

Asp

Glu

Asp

Glu

Tyr

Glu

Met

Glu

Ser

Pro

Asn

Ile

Thr

Asp

100

105

110

Thr

Met

Lys

Phe

Phe

Leu

Tyr

Val

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

115

12 0

125

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

130

135

140

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr.

145

150

155

160

Cys

Val

Val

Val

Ašp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

165

17 0

175

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

180

185

190

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

195

200

205

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

210

215

220

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

225

230

235

240

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

245

250

.255

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

260

265

270

Tyr

‘Pro.

Ser

Asp

Ile

Ala .

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

275

280

285

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

290

295

300

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

305

310

315

320

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

325

330

335

• · • · ·· φ ··

ΦΦ·· ·· ·· ···· Φ· ···

Claims (38)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použiti CD2 vazebného činidla pro výrobu léku k selektivní modulaci paměťových efektorových T lymfocytů u subjektu trpícího nemocí vybranou ze skupiny obsahující psoriatickou artritidu, revmatoidní artritidu, roztroušenou sklerózu mozkomíšní, atopickou dermatitidu, uveitidu, zánětlivou nemoc střev, Crohnovu nemoc, ulcerativní kolitidu a kožní T buněčný lymfom, přičemž lék se podává v účinném množství představovaném dávkou 0,001 až 50 mg CD2 važebného činidla na 1 kg tělesné hmotnosti.
2. 2. Použití podle nároku 1, kde paměťové efektorové T lymfocyty jsou CD45RO pozitivní lymfocyty.
3. 3. Použití podle nároku 1, kde CD2 vazebné činidlo je vybráno ze skupiny obsahující homology protilátek anti-LFA-3, homology protilátek anti-CD2, rozpustné polypeptidy LFA-3, rozpustné polypeptidy CD2, CD2 mimetická činidla a LFA-3 mimetická ^;činidla.
4. 4. Použití podle nároku 3, kde CD2 vazebné činidlo je rozpustný polypeptid LFA-3 obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující: a) aminokyselinu 1 až aminokyselinu 92 ze sekvence id. č. 2, b) aminokyselinu 1 až aminokyselinu 80 ze sekvence id. č. 2, c) aminokyselinu 50 až aminokyselinu 65 ze sekvence id. č. 2 a d) aminokyselinu 20 až aminokyselinu 80 ze sekvence id. č. 2.
5. 5. Použiti, podle nároku 3, kde rozpustný polypeptid LFA-3 je fúzní protein obsahující 92 aminokyselin amino-konce zralého

   LFA-3 a 10 aminokyselin C-konce kloubové oblasti lidského

   IgGl.
6. 6. Použití podle nároku 5, kde rozpustný fúzní protein LFA-3 dále obsahuje úseky CH2 a CH3 z konstantní domény těžkého řetězce lidského IgGl.
7. 7. Použití rozpustného polypeptidu LFA-3, který má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující:

   a) aminokyselinu 1 až aminokyselinu 92 .ze sekvence id. č. 2,

   b) aminokyselinu 1 až aminokyselinu 80 ze sekvence id. č. 2,

   c) aminokyselinu 50 až aminokyselinu 65 ze sekvence id. č. 2 a d) aminokyselinu 20 až aminokyselinu 80 ze sekvence id. č. 2 pro výrobu léku k selektivní modulaci paměťových efektorových T lymfocytů u subjektu trpícího nemocí vybranou ze skupiny obsahující psoriatickou artritidu, revmatoidní artritidu, roztroušenou sklerózu mozkomíšní, atopickou dermatitidu, uveitidu, zánětlivou nemoc střev, Crohnovu nemoc, ulcerativní kolitidu a kožní T buněčný lymfom, přičemž lék se podává v účinném množství představovaném dávkou 0,001 až 50 mg polypeptidu na 1 kg tělesné hmotnosti.
8. 8. Použití podle nároku 7, kde rozpustný polypeptid LFA-3 je fúzní protein obsahující 92 aminokyselin amino-konce zralého LFA-3 a 10 aminokyselin C-konce kloubové oblasti lidského IgGl.
9. 9. Použiti podle nároku 8, dále obsahuje úseky CH2 kde rozpustný fúzní protein LFA-3 a CH3 z konstantní domény těžkého řetězce lidského IgGl.

   10 . Použití CD2 vazebného činidl a pro výrobu léku, který obsahuj e CD2 vazebné činidlo v množství účinném pro léčení roztroušené sklerózy mozkomíšní u savce. 11. Použití podle nároku 10, kde CD2 vazebné činidlo je v

   množství dostatečném pro selektivní modulaci paměťových efektorových T lymfocytů u savce.
10. 12. Použití podle nároku 11, kde CD2 vazebné činidlo je rozpustný polypeptid LFA-3 obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahujícíma) aminokyselinu 1 až aminokyselinu 92 ze sekvence id. č. 2, b) aminokyselinu 1 až aminokyselinu 80 ze sekvence id. č. 2, c) aminokyselinu 50 až aminokyselinu 65 ze sekvence id. č. 2 a

    d) aminokyselinu 20 až aminokyselinu 80 ze sekvence id. č. 2. '
11. 13. Použití podle nároku 12, kde rozpustný polypeptid LFA-3 je fúzní protein obsahující 92 aminokyselin amino-konce zralého LFA-3 a 10 aminokyselin C-konce kloubové oblasti lidského IgGl. .
12. 14. Použití podle nároku 13, kde rozpustný fúzní protein LFA-3 dále obsahuje úseky CH2 a CH3 z konstantní domény těžkého řetězce lidského IgGl.

    • · •
13. 15. Použiti CD2 vazebného činidla pro výrobu léku, který obsahuje CD2 vazebné činidlo v množství účinném pro léčení uveitidy u savce. . .
14. 16. Použití podle nároku 15, kde CD2 vazebné činidlo je v množství dostatečném pro selektivní modulaci paměťových efektorových T lymfocytů u savce.
15. 17. Použití podle nároku 16, kde CD2 vazebné činidlo je rozpustný polypeptid LFA-3 obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující: a) aminokyselinu 1 až aminokyselinu 92 ze sekvence id. č. 2, b) aminokyselinu 1 až aminokyselinu 80 ze sekvence id. č. 2, c) aminokyselinu 50 až aminokyselinu 65 ze sekvence id. č. 2 a d) aminokyselinu 20 až aminokyselinu 80 ze sekvence id. č. 2.
16. 18. Použití podle nároku 17, kde rozpustný polypeptid LFA-3 je fúzní protein obsahující 92 aminokyselin amino-konce zralého LFA-3 a 10 aminokyselin C-konce kloubové oblasti lidského igGi.
17. 19. Použití podle nároku 18, kde rozpustný fúzní protein LFA-3 dále obsahuje úseky CH2 a CH3 z konstantní domény těžkého řetězce lidského IgGl.
18. 20. Použití CD2 vazebného činidla pro výrobu léku, ' který obsahuje CD2 vazebné činidlo v množství účinném pro léčení zánětlivé nemoci střev u savce.

    • · · ·

    - 86 -.

    • ·

    21. Použití podle nároku 20, kde CD2 vazebné činidlo je v množství dostatečném pro selektivní modulaci paměťových efektorových T lymfocytů u savce. - 22. Použití podle nároku 21, kde CD2 vazebné činidlo je

    rozpustný polypeptid LFA-3 obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující: a) aminokyselinu 1 až aminokyselinu 92 ze sekvence id. č. 2, b) aminokyselinu 1 až aminokyselinu . 80 ze sekvence id. č. 2, č) aminokyselinu 50 až aminokyselinu 65 ze sekvence id. č. 2 a d) aminokyselinu 20 až aminokyselinu 80 ze sekvence id.

    2.
19. 23. Použití podle nároku 22, kde rozpustný polypeptid’LFA-3 je fúzní protein obsahující 92 aminokyselin amino-konce zralého LFA-3 a 10 aminokyselin C-konce kloubové oblasti lidského .IgGl.
20. 24. Použití podle nároku 23, kde rozpustný fúzní protein LFA-3 dále obsahuje úseky CH2 a CH3 z konstantní domény těžkého řetězce lidského IgGl.
21. 25. Použití CD2 vazebného činidla pro výrobu léku, který obsahuje CD2 vazebné činidlo v množství účinném pro léčení

    Crohnovy nemoci u savce.
22. 26. Použití podle nároku 25, kde CD2 vazebné . činidlo je v množství dostatečném pro selektivní modulaci paměťových efektorových T lymfocytů u savce.
23. 27. Použití podle nároku 26, kde CD2 vazebné činidlo je rozpustný polypeptid LFA-3 obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující: a) aminokyselinu 1až aminokyselinu 92 ze sekvence id. č. 2, b) aminokyselinu 1 až aminokyselinu 80 ze sekvence id. č. 2, c.) aminokyselinu

    50 až aminokyselinu 65 ze sekvence id. č. 2 a d) aminokyselinu 20 až aminokyselinu 80 ze sekvence id. č. 2'.
24. 28. Použití. podle nároku 27, kde rozpustný polypeptid LFA-3 je fúzní protein obsahující 92 aminokyselin amino-konce zralého LFA-3 a 10 aminokyselin C-konce kloubové oblasti lidského IgGl.
25. 29. Použiti podle nároku 28, kde rozpustný fúzní protein LFA-3 dále obsahuje, úseky CH2 a CH3 z konstantní domény těžkého řetězce lidského IgGl.
26. 30. Použití CD2 vazebného činidla pro výrobu léku, který obsahuje CD2 vazebné činidlo v množství účinném pro léčeni ulcerativní kolitidy u savce.
27. 31. Použití podle nároku 30, kde CD2 vazebné činidlo je v množství dostatečném pro selektivní modulaci paměťových efektorových T lymfocytů u savce.
28. 32. Použití podle nároku 31, kde CD2 vazebné· činidlo je rozpustný polypeptid LFA-3 obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující: a) aminokyselinu 1 až aminokyselinu 92 ze sekvence id. č. 2, b) aminokyselinu 1 • ·

    - 88 až aminokyselinu 80 ze sekvence id. č. 2, c) aminokyselinu 50 až aminokyselinu 65 ze sekvence id. č. 2 a d) aminokyselinu 20 až aminokyselinu 80 ze sekvence id.

    ₄ č. 2 .
29. 33. Použiti podle nároku 32, kde rozpustný polypeptid LFA-3 je fúzni protein obsahující 92 aminokyselin amino-konce zralého LFA-3 a 10 aminokyselin C-konce kloubové oblasti lidského IgGl.,
30. 34. Použiti podle nároku 33, kde rozpustný fúzni protein LFA-3 dále obsahuje úseky CH2· a CH3 z konstantní domény těžkého řetězce lidského IgGl.
31. 35. Použití CD2 vazebného činidla pro výrobu léku, který obsahuje CD2 vazebné činidlo v množství účinném pro léčení kožního T buněčného lymfomu u savce.

    36. Použití podle nároku 35, kde GD2 vazebné činidlo je v množství dostatečném pro selektivní modulaci paměťových efektorových T lymfocytú u savce. 37 . Použití podle. nároku 3 6, kde CD2 vazebné činidlo je

    rozpustný polypeptid LFA-3 obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující: a) aminokyselinu 1 až aminokyselinu 92 ze sekvence id. č. 2, b) aminokyselinu' 1 až aminokyselinu. 80 ze sekvence id. č. 2, c) aminokyselinu 50 ' až . aminokyselinu 65 ze sekvence id. č. 2 a d) aminokyselinu 20 až aminokyselinu 80 ze sekvence id. č. 2.

    ··

    - 8 9 -
32. 38. Použití podle nároku 37, kde rozpustný polýpeptid LFA-3 je fúzní protein obsahující 92 aminokyselin amino-konce zralého LFA-3 a 10 aminokyselin C-konce kloubové oblasti lidského IgGl.
33. 39. Použití podle nároku 38, kde rozpustný fúzní protein LFA-3 dále obsahuje úseky CH2 a CH3 z konstantní domény těžkého řetězce lidského IgGl.
34. 40. Populace paměťových efektorových T lymfocytů, připravitelná ze savce trpícího nemocí, která je· charakterizovaná přítomností infiltrujících paměťových efektorových T lymfocytů v orgánu savce, přičemž populace T buněk >je v kombinaci s CD2 vazebným činidlem.
35. 41. Populace buněk podle nároku 40, kde C2 vazebné činidlo je rozpustný polýpeptid LFA-3 obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující: a)· aminokyselinu 1 až aminokyselinu 92 ze sekvence id. č. 2, b) aminokyselinu 1 až aminokyselinu 80 ze sekvence id. č. 2, c) aminokyselinu 50 až aminokyselinu 65 ze sekvence id. č. 2 a d) aminokyselinu 20 až aminokyselinu 80 ze sekvence id. č. 2.
36. 42. Populace buněk podle nároku 41, kde rozpustný polýpeptid LFA-3 je fúzní protein obsahující 92 aminokyselin amino-konce zralého LFA-3 a 10 aminokyselin C-konce kloubové oblasti lidského IgGl.

    44 44

    4, 4 4 4

    4 4 4 • 4 ·♦

    4 4 4

    0 444

    4 4 4

    4 4

    4 4 ···· 44

    4 4 4 ·

    44 4444

    4 4

    44 4

    - 9.0 -
37. 43. Populace buněk podle nároku 41, kde rozpustný fúzní protein LFA-3 dále obsahuje úseky CH2 a CH3 z konstantní domény těžkého řetězce lidského IgGl.
38. 44. Populace buněk podle nároku 40, kde buňky jsou připravitelné ze savce trpícího nemoci, která je vybrána ze skupiny obsahující psoriatickou artritidu, revmatoidní artritidu, roztroušenou sklerózu mozkomišni,. atopickou dermatitiďu, uveitidu, zánětlivou nemoc střev, Crohnovu nemoc, ulcerativní kolitidu a kožní T buněčný lymfom.