CZ298238B6 - Pouzití CD2 vazebného cinidla pro výrobu léku k modulaci pametových T bunek - Google Patents

Abstract

Resení poskytuje pouzití CD2 vazebného cinidla pro prípravu léku k modulaci pametových efektorovýchT lymfocytu. Lék je urcen pro pacienty mající psoriatickou artritidu, revmatoidní artritidu, roztrousenou sklerózu mozkomísní, atopickou dermatitidu,uveitidu, zánetlivou nemoc strev, Crohnovu nemoc,ulcerativní kolitidu nebo kozní T bunecný lymfom.

Description

Řešení poskytuje použití CD2 vazebného činidla pro přípravu léku k modulaci paměťových cíéktorových T lymíbcytu. Lék je určen pro pacienty mající psoriatickou artritidu, revmatoidní artritidu, roztroušenou sklerózu nio/komišní. atopíckou dernialilidu, uveitidu, zánětlivou nemoc střev, Crohnovu nemoc, ulcerativní kolitidu nebo kožní 1’ buněčný lyrnlbm.

Použití CD2 vazebného činidla pro výrobu léku k modulaci paměťových T buněk

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká přípravků působících jako inhibitory interakce CD2/LFA-3 k léčení nemoci charakterizovaných přítomnosti aktivovaných T buněk u savců, včetně člověka. K takovým nemocem patří zánětlivá střevní choroba, psoriatická artritida, revmatoidní artritida a roztroušená skleróza mozkomíšní.

Dosavadní stav techniky

Buňky prezentující antigen (APC) exprimují na svém povrchu ve vysoké hustotě antigen hlavního histokompalibilního komplexu (M1IC) II. třídy. Molekuly MHC 11. třídy na sebe váží peptidy, které pocházejí z antigenů, které sc dostaly do buňky endocytózou a jsou rozpoznávány primárně pomocnými T lymfocyty. Receptory T buněk na povrchu T buněk rozpoznávají antigen jako peptidový fragment navázaný na molekuly na buněčném povrchu kódované MHC (Springcr. Adhesion Rcceptors ofthe Immune Systém. Nátuře, 346. pp. 425-27 (1990)).

Kromě interakcí receptorů T buněk s MHC existuje ještě řada interakci mezi molekulami exprimovanými na povrchu APC a na povrchu T buněk. Takové molekuly na povrchu buněk, často nazývané adhezní molekuly, se podílejí na cele řadě buněčných funkcí jako např, buněčné adhezi. rozpoznávání antigen ů, ko—stimulační signalizace při aktivaci T buněk a stimulace efektorů cytotoxických T buněk (Adhesion Molecules in Diagnosis and Treatmcnt of Inflaminatory Discascs, The Lancet, 336, pp. I 351-52 (1990)). Buněčná adheze se zřejmě podílí na aktivaci proliferace T buněk při vzniku imunitní reakce (Hughes et al., Thc Endothelial Cell as a Regulátor ot f cell Function, Immunol. Rcv„ 117, pp. 85-102. ( 1990)).

Jedna cesta, kterou jsou T buňky aktivovány, je ta, že sc svými antigennč specifickými T buněčnými receptory' naváží na MHC-peptidové komplexy na povrch antigen prezentujících buněk jako jsou např. makroIagy. Aktivace T buněk stimuluje proliferaci a diferenciaci dvou typů funkčních T buněk: pomocných buněk, které podporují proliferaci a zrání B lymfocytů produkujících protilátky, a zabiječských buněk, které lyžují cílové buňky (Bierer et al„ A Monoclonal Antibody to LFA-3, thc CD2 Ligand, Specifically lmmobilizes Major Histocompatibility Conipíex Proteins, Eur. J. Immunol. 19: pp. 661-65 (1989); Springer Adhesion Receptors of the Immune Systém, Nátuře. 346, pp. 425 34 (1990)).

Existuje řada nemocí, které jsou charakteristické abnormální imunitní odpovědí a mnohé z nich jsou zvláště charakteristické zvýšenou aktivací T buněk. 1 buňky hrají hlavní roli v imunitní reakci tím. že interagují s cílovými buňkami prezentujícími antigen. Tak např. T buňkami zprostředkované usmrcení cílové buňky je mnohakrokový proces, který obsahuje v počáteční fázi, adhezi cytolytických T buněk (tj. efektorových buněk) na cílové buňky. Také pomocné T buňky iniciují imunitní reakci adhezi na buňky prezentující antigen.

lyto interakce T buněk s cílovými buňkami a s buňkami prezentujícími antigen jsou vysoce specifické a jsou závislé na rozpoznání antigenu na povrchu cílové buňky a buňky prezentující antigen (APC) jedním z mnoha antigennč specifických receptorů na povrchu T buněk.

Interakce antigen-receptor T buněk s dalšími buňkami jsou usnadněny také pomocí 15 různých proteinů na povrchu T buněk, např. antigen-rcceptorový komplex CD3 a pomocně adhezní molekuly jako jsou např. CD4, LFA-1. CD8, a CD2. Jsou také usnadněny díky dalším pomocným adhezním molekulám jako jsou LFA-3. 1CAM- 1 a MHC, které jsou exprimovány na povrchu cílových buněk nebo buněk prezentujících antigen. Tak např. LEA-1 a jeho protircceptor ICAM-1 nebo 1CAM-2. stejně jako CD2 a jeho prolireceptor LFA -3 se podílejí na buněčné

- I CZ 298238 B6 adhezi a aktivaci T buněk. Je známo, že interakce LFA-1/1CAM a CD2/LFA-3 jsou nezávisle.

Řada dalších molekul přítomných na klidových 1 buněk sc také podílí na adhezi T buněk, jde např. o E2 (M1C2), VLA-4 k’D49d). CD44 (Hermes. Pgp-1- ECMRII1) a H19 (N4) (viz

Makgoba et al., The CD2-LFA-3 and LFA-l-ICAM Pathways: Relevance to T cell

Recognition”, Immunol. Today, 10. pp. 417-22 (1989)).

Interakce mezi CD2 a LFA-3 nejsou dosud dobře známy z hlediska významu pro aktivaci T buněk. Současné výzkumy předpokládají, že existuje specifická interakce mezi CD2 (adhezní molekula T buněk) a LFA-3 (adhezní molekula cílových buněk a buněk prezentujících antigen). která zprostředkovává adhezi T buněk na cílové buňky a nebo buňky prezentující antigen. Má se za to, že tato adheze buněk, tj. interakce buňka-buňka. sc podílí na iniciaci funkční odpovědi T buněk (Dustin et al., Purtficd Lymphocyte Funě li on Associated Antigen 3 Binds to CD2 and Mediates T Lymphocyte Adhesion. J. Exp. Med., 165, pp. 677-92 ( 1987); Springer et al., The Lymphocyte Function-associated LEA-1, CD2. and LFA-3 Molecules: Cell Adhesion Receptors of the Immune Systém'¹, Ann. Rev. Immunol., 5. pp. 223-52 5 (1987)).

LFA-3. který byl nalezen na povrchu mnoha druhů buněk, včetně lidských erytrocytů, je předmětem celé řady výzkumů, které usilují o objasnění jeho role v interakcích T buněk (viz např. Krensky cl al.. The Functional Significance, Distribution, and Structure of LFA I. LFA-2. and LFA-3: Cell Surfacc Antigen Associated witli CTL-Target lnteractions. J. Immunol., 131(2), pp. 611 16 (1983); Shaw et al., Two Anligen-lndependcnt Adhesion Pathways Ušed by Human Cytotoxic T cell clonek. Nátuře. 323, pp. 262-64 ( 1986)).

Byly identifikovány dvě přírodní formy LFA-3. Jedna forma LFA-3 (transnicinbránový LFA 3) je ukotvena v buněčné membráně transmembránovou hydrofóbní doménou, cDNA kódující tuto formu LFA-3 již byla klonována a sekvencována (viz Wallncr et al., Přimáry Structure of Lymphocyte Function-Associated Antigen-3 (LFA-3), J. Exp. Med., 166, pp. 923 32 (1987)). Jiná forma LFA-3 je ukotvena k membráně prostřednictvím kovalentní vazby k fosfatidylinositolu (PI-obsahující glykolipid). l ato druhá forma byla pojmenována jako PI-vázaný LFA-3” a cDNA kódující tuto formu LFA 3 by la takc klonována a sekvencována (Wallncr et al., PCT přihláška WC) 90/02 181).

Lidská molekula CD2 je povrchový glykoprotein velikosti 50 kDa exprimovaný na více než 95 % thymocytů a v podstatě na všech periferních T lymfocytech. Biochemické analýzy užívající specifické monoklonální protilátky ukázaly, že CD2 je specifický pro T buněčnou řadu a vyskytuje sc na povrchu T buněk v několika různě glykosylovaných formách (Howard et al.. A Human T Lymphocyte Diffcrentiation Markér Defined by Monoclonal Antibodics lhát Block E-Rosette Formation, J. Immunol,. 126, pp. 2117-22 (1981); Brown et al.. in Leukocytc Typing 111. ed. McMichael, Oxford University Press,. pp. 110-12 (1987); Sayre et al., Molecular Cloning and Express ion of TI 1 cDNAs Rcveals a Recept or-Like Structure on Human T Lymphocytes. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84, pp, 2941 45 (1987)).

Sekvence lidského genu pro CD2 byla publikována (viz Seed and Aruffo. Molecular Cloning of the CD2 Antigen, the T -cell Erythrocyte Receptor. by a Rapid Immunosclcction Proceduře. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84. pp. 3365 69 (1987); Sayre et al., Molecular Cloning and Expression of TI I cDNAs Reveal a Receptor-like Structure on Human T Lyniphocytcs. Proč. Nati. Acad, Sci. USA. 84, pp. 2941-45 (1987)). CD2 cDNA klony umožnily predikci složení CD2 ze signálního peptidu velikosti 24 aminokyselinových zbytků, který Je odštěpován, extracelulárního segmentu ze 185 aminokyselinových zbytků, transmembránové domény z 25 aminokyselinových zbytků a cytoplazmatického úseku ze 117 aminokyselinových zbytků (Sayre et al., viz výše (1987); Sewcll et al.. Molecular Cloning of the Human T Lymphocyte Surface CD2 (Til) Antigen, Proč. Nati, Acad. Sci. USA, 83, pp. 8718 22 (1986); Seed and Aruffo, supra (1987); Clayton et al.. Eur. J. immun., 17, pp. 1367-70 (1987)). Rozpustné polypeptidy CD2 mající LFA-3 vazebnou doménu byly popsány (PCT přihláška publikovaná jako WO 90/08 187). Monoklonální protilátky k CD2, např. TS2/18. 111TI,, TI K a k LI A3, např. I S2/9 byly také _ i popsány (viz např. Hughes et al., Tbe Endothelial Cell as a Regulátor of T—Cell Function.

Immunol. Reviews, 117, pp. 85-102 (1990); Meuer. An Alternativě Pathway of T—Cell

Activation: A Functional Role for the 50 kD T11 Sheep Erythrocyte Receptor Protein. Cell. 36.

pp. 897 906(1984)).

Vazba antigenné specifických receptorů T buněk na Ml IC-peptidové komplexy na povrchu buněk prezentujících antigen se takc podílí na vytváření tzv. paměťových buněk, které se obecně tvoří v průběhu adaptivní imunitní reakce vyžadující kontakt s antigenem a pak expanzi antigcnně-specifických paměťových buněk. T-bunččná paměť je pravděpodobně závislá na opakované stimulaci antigenem. Paměťové buňky zvětšují svou vazebnou avidilu pro antigen prezentující buňky prostřednictvím zvýšené exprese CD2. LFA-3 a dalších pomocných adhezních molekul. A skutečně důležitá fenotypová změna v izoformě leukocytového antigenů CD45R dovoluje rozlišit naivní T buňky, které exprimují CT)45R, od paměťových T buněk, které reagují s formou CD45RO s nízkou molekulární hmotností.

Zjištěni, že většina, pokud ne vůbec všechny, paměťových buněk je vystavena opakovanému bombardování antigeny posiluje pravděpodobnost toho, že většina vlastností spojených se subpopulací CD4SRO je ve skutečnosti projevem efektorových T buněk. Existuje stále rostoucí a inspirující literatura, která popisuje asociaci CD45RO paměťových efektorových buněk s přítomností různých zánětltvých nemocí jako jsou zánětlivé nemoci střev včetně nemocí jako je Crohnova nemoc a ulcerativní kolitida (Horiuchi et al., J. Japan. Soc. Colo. Proclol.. 45: 391-393 (1992)). psoriatická artritida (Veale et al.. Ann. Rlieum. Dis. 53: 450- 151 (1994). revniatoidní artritida (Muiler et al.. AutoimmunitY 14: 37^3 (1992), uveitida (Ohia et al. . Curr. Fyc Res., 15: 299-306 (1996). nefritida (Rodruguez-Poerez et al., Am. J. Nephrol., 15: 386-391 (1995) a roztroušená skleróza mozkomíšní (Crucian et al., Clin. Diag. Lab. Immunol. 2: 249-252 (1995), Lehmann et al.. din. Immunol. Immunopathol., 85: 202-209 (1997), Muiler et al., Autoimmunity 14: 37^43 (199?), Qinetal., J. Clin. Immunol... 13:152-161 (1993).

Vzhledem k možné úloze paměťových efektorových T lymfocytů v patogenezi. existuje potřeba zlepšit způsoby, jak modulovat tyto buňky u pacientů trpících výše zmíněnými nemocemi.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká způsobu prvence a léčení nemoci, které jsou charakterizovány infiltrací paměťových efektorových I lymfocytů v orgánu savce. Podstatou je. že se savci podává CD2 vazebné činidlo, které je schopné modulovat množství a/nebo distribuci paměťových efektorových T lymfocytů. Takové terapie, založené na předkládaném vynálezu, jsou z mnoha důvodů lepší než dosavadní, např. proto, že jsou mnohem více selektivní, tudíž mají mnohem menší imunosupresivní účinek než dosavadní terapie a menší všeobecnou toxicitu.

K látkám, které lze užít ve vynálezu, patří jakékoliv molekuly, které jsou vazebným činidlem pro CD2 (C'D2 vazebným činidlem). Patří sem tedy molekuly nebo jiné chemické entity, které modulují interakce CD2/LFA-3. Výhodně je činidlo vybráno ze skupiny obsahující homology protilátek anti-LFA-3, homology protilátek anti-CD2, rozpustné polypeptidy LFA 3. rozpustné polypeptidy CD2. LFA-3 nebo CD2 mim etická činidla (jako např. malé organické molekuly) a jejich deriváty.

Jeden aspekt vynálezu se týká selektivní modulace paměťových efektorových T lymfocytů u nemocného subjektu, který spočívá v tom, že se subjektu podává účinné množství CD2 vazebného činidla. Paměťové T lymfocyty infiltrují cílový orgán subjektu. Výhodně paměťové T lymfocyty jsou CD45RO lymfocyty. CD2 vazebné činidlo je vybráno ze skupiny obsahující homology anti LFA-3 protilátek, homology anti-CD2--protilátek, rozpustné polypeptidy LFA-3. rozpustné polypeptidy CD2, CD2 mimetická činidla a LFA-3 mimctická činidla. Vynález se týká léčení nemocí u subjektu, které jsou charakterizovány tím. že paměťové efektorove T lymfocyty

- j CZ 29823« B6 sc účastní patogcneze. přičemž léčení spočívá v tom. že se subjektu podává účinné množství CD2 vazebného činidla. Nemoci patří do skupiny obsahující psorialickou artritidu, revmatoidní artritidu, roztroušenou sklerózu mozkomíšní. atopickou dermatitidu, uveitidu, zánětlivou nemoc střev.

Crohnovu nemoc, ulcerativní kolitidu a kutánní T-buněčný lymfom.

Dále se vynález tyká také způsobu modulace paměťových efektorových T lymfocytů u savců, kteří jsou charakterizováni výskytem infiltrace paměťových efektorových T lymfocytů do orgánů savce. Způsob spočívá v tom. že sc subjektu podává účinné množství CD2 vazebného činidla, které je dostatečné k modulaci paměťových efektorových T lymfocytů v příslušném orgánu. io lakový savec trpí nemocí patřící do skupiny, která obsahuje psoriatickou artritidu, revmatoidní artritidu, roztroušenou sklerózu mozkomíšní. atopickou dermatitida. uveitidu. zánětlivou nemoc střev. Crohnovu nemoc, ulcerativní kolitidu a kutánní T-buněčný lymfom.

Přípravky podle vynálezu obsahují populaci paměťových efektorových T lymfocytů, kterou lze 15 získat zc savce trpícího nemocí, která je charakterizována přítomností infiltrujících paměťových efektorových T lymfocytů v orgánu, přičemž tato populace jev kombinaci s CD2 vazebným činidlem.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. I je graf ukazující selektivní redukci paměťových efektorových T lymfocytů vzhledem k naivním T buňkám u pacientů s psoriázou, kteří se podrobili léčení CD2 vazebným činidlem, a sice LFA-3-TIP. Horizontální úsečky na osou X představují trvání léčení, které bylo zastaveno 25 asi po 80 dnech. Křivky představují průměrný počet lymfocytů u 57 pacientů v každé pokusné skupině. Existují zde statisticky významná ošetření a dočasné účinky pokud jde o paměťové T buňky (CD45RO+), avšak nikoliv ve vztahu k naivním T buňkám (CD45PA+). Počet T buněk při různých způsobech ošetření CD2 vazebným činidlem vykazuje snížení a v průběhu 80 dní trvajícího léčení se blíží sc jisté relativně konstantní hodnotě. Potom, co bylo léčení ukončeno, 30 počet T buněk se začal navracet na výchozí hodnotu.

Definice termínů v popisu vynálezu

Termíny efektorový T lymfocyt. efektorová T buňka, paměťový efektorový T lymfocyt/buňka a podobné termíny se v předkládaném popisu vynálezu používají zaměnitelně a označují 35 takové T lymfocyty, které již přišly do styku s antigenem (jinými slovy nejsou to již naivní lymfocyty). Specificky termín znamená T lymfocyty CD45RO v protikladu k naivním T lymfocytům CD45RA.

Termín CD2 označuje polypeptid CD2. který se váže k přírodní formě polypeptidu LFA-3 a 40 který jc kódován: a) přirozeně se vyskytující DNA sekvencí pro CD2 u savců (viz např. sekvence id. č. 5), b) DNA sekvencí, která jc degenerovaná vzhledem k přírodní sekvenci DNA C'D2 nebo c) DNA sekvencí, která hybridizuje s jednou z předchozích sekvencí za podmínek ekvivalentních teplotě o 20 až 27 °C nižší než Tm a 1M koncentraci chloridu sodného.

Termín LFA-3 se v popisu užívá k označení polypeptidu LFA-3, který se váže na přírodní formu polypeptidu CD2 a který je kódován: a) přirozeně sc vyskytující DNA sekvencí pro LFA-3 u savců (viz např. sekvence id. č. I nebo 3), b) DNA sekvenci, která je degenerovaná vzhledem k přírodní sekvenci DNA LFA-3 nebo c) DNA sekvencí, která hybridizuje sjednou z předchozích sekvencí za standardních podmínek, jak jsou v popisu definovány.

Termín CD2 vazebné činidlo označuje molekulu, sloučeninu nebo jinou chemickou entitu, která moduluje interakci CD2/LFA-3 a/nebo moduluje CD2 signalizaci. Termín zahrnuje honiology protilátek anti-LFA-3. homology protilátek anti -CD2, rozpustné polypeptidy LFA- 3, rozpustné polypeptidy CD2, LFA-3 nebo CD2 mimetická činidla (jako např. malé organické

-4CZ 298238 B6 molekuly) a jejich deriváty, Přičemž termín moduluje znamená, že CD2 sazebně činidlo mění (výhodně snižuje) intenzitu CD2 signalizace a/nebo ruší schopnost C'D2 vázat LFA-3. i když zvýšení této intenzity a/nebo schopnosti vázat nejsou vyloučeny z této definice. CD2 vazebná činidla také modulují paměťové efektorové T lymfocyty (tj. CD45RO) a v tomto kontextu termín s moduluje znamená, že vazebné činidlo mění počet a/nebo distribuci paměťových efektorových

T lymťocytů u subjektu, kterému je podáváno CD2 vazebné činidlo. Vc výhodném provedení vynálezu vazebné činidlo ''selektivně’¹ moduluje paměťové efektorové T lymfocyty. což znamená. že jsou selektivně modulovány paměťové efektorové T lymfocyty na rozdíl od naivních T lymťocytů (např. T lymťocytů CD45RA).

lil

Termíny rozpustný polypeptid LFA-3 a rozpustný polypeptid CD2 označují polypeptidy LFA-3 a CD2. které nejsou schopné ukotvení v membráně. K takovým rozpustným polypeptid iím patří např. takové polypeptidy LFA-3 a CD2, kterc postrádají dostatečný úsek domény procházející membránou pro ukotvení polypeptidu. a nebo jsou modifikovány; takže jejich 15 membránová doména je nefunkční. K rozpustným polypcptidům LFA-3 patří Pl-vázanč LFA-3 plně délky nebo zkrácené (např. s vnitřními dclccemi).

Termín homology protilátek znamená protein obsahující jeden nebo více polypeptidu vybraných ze skupiny obsahující lehkc řetězce imunoglobulinu. těžkc řetězce imunoglobulinu a jejich 20 fragmenty vázající antigen. které jsou schopné vázat jeden nebo více antigenů. Polypcptidové složky homologů protilátky, který je složen z více než jednoho polypeptidu, mohou být volitelně vázány disulfidíckými můstky nebo jinak kovalentnč zesíleny; Tudíž k homologúm protilátek patří intaktní imunoglobuliny typů lgA, IgG, IgE. IgD. IgM (včetně jejich subtypů), přičemž lehké řetězce těchto imunoglobulinu jsou typu kappa nebo lambda. K homologúm protilátek patří 2? také části intaktních imunoglobulinu, které si ponechávají antigennč-vazebnou spécifitu, např.

fragmenty Fab, Fab’a F(ab')2, fragmenty F(v), monomery nebo dimery těžkých řetězců, monomery nebo dimery' lehkých řetězců, dimery složené z jednoho lehkého a jednoho těžkého řetězec apod.

Termín homolog humanizované rekombinantní protilátky označuje homolog protilátky, připralo véně s využitím technologie rekombinantní DNA. ve kterc některé nebo všechny aminokyseliny těžkého nebo lehkého řetězce imunoglobulinu savce jiného než člověka, které nejsou nutné pro vazbu antigenu. byly substituovány odpovídajícími aminokyselinami těžkého nebo lehkého lidského imunoglobulinu.

Termín homolog chimérické rekombinantní protilátky označuje homolog protilátky; připravené s využitím technologie rekombinantní DNA, vc které celý kloubový úsek nebo jeho část a konstantní úsek těžkého nebo lehkého řetězce nebo obou byly nahrazeny odpovídajícím úseky z lehkého nebo těžkého řetězce jiného imunoglobulinu.

Vynález lze aplikovat u jakýchkoliv savců, výhodně u lidí.

Aminokyselina je monomerní jednotka peptidu, polypeptidu nebo proteinu. V přirozeně se vyskytujících peptidech. polypeptidcch a proteinech bylo nalezeno 20 aminokyselin, které jsou všechny L-isomery. Pojem aminokyselina zahrnuje také analogy aminokyselin a D-isomery 45 aminokyselin vyskytujících sc v proteinech a jejich analogy.

Protein jc polymer obsahující kterékoliv z dvaceti aminokyselin. Ačkoliv termín polypeptid se často užívá k označení relativně velkého polypeptidu a termín peptid označuje často malý polypeptid, užíváni těchto termínů se často překrývá a je různé. Proto termín protein se v před5« kládaném popisu užívá k označení peptidu, polypeptidu a proteinů, pokud není uvedeno jinak.

Fúze označuje kolincární spojení dvou nebo více proteinů nebo jejich fragmentů prostřednictvím jejich peptidové kostry pomocí exprese pólynukleotidové molekuly kódující tyto proteiny nebo pomocí metod syntézy proteinů. Jc výhodné, když fúzované fragmenty pocházejí

- 5 CZ 298238 B6 l různých druhů. K výhodným fúzním proteinům patří CD2 vazebné činidlo, což je protein nebo jeho fragment kovalentně vázaný ke druhému, což je buďto jiné CD2 vazebné činidlo, nebo to naopak vůbec není CD2 vazebné činidlo. Specificky fúze proteinové CD2 vazebné činídlo/lg je protein obsahující CD2 vazebné činidlo podle vy nálezu nebo jeho fragment kovalentně navázané 5 na N-konec imunoglobul i nového řetězce, kde úsek N-konce imunoglobulinu byl nahrazen CD2 vazebným činidlem.

Mutanta označuje jakoukoliv změnu v genetickém materiálu organismu, zejména jakoukoliv změnu (tj. deleci. substituci, adici nebo altcraci) polynuklcotidové sekvence divokého typu nebo 10 jakoukoliv změnu v proteinu divokého typu.

Standardní hybridizační podmínky jsou podmínky určené koncentrací solí a teplotou v podstatě shodné s podmínkami 0.5xSSC až SxSSC a 65 °C jak pro vlastní hybridizaci. tak promývání. Termín standardní hybridizační podmínky zde užívaný je proto operační definice zahrnující 15 řadu hybridizaci. Podmínky s vysokou stringencí (přísností) mohou např. zahrnovat hy bridizaci v pufru pro sereening plaků (obsahuje 0,2 % polyvinylpyrrolidon. 0,2 % Ficoll 400, 0,2 % bov i líní sérový albumin, 5()mM Tris-HCI, pH 7,5, IM NaCl, 0,1 % hydrogen-fosforečnan sodný, 1 % SDS) s 10 % dextransulfátem a 100 gg/ml denaturované sonikované DNA lososího spermatu při 65 °C po 12 až 20 hodin a promývání v 75mM NaCI/7,5mM citrát sodný (0.5xSSC)/l % SDS při 20 65 ^tíC. Podmínky s nízkou stringencí mohou např, zahrnovat hybridizaci v pufru pro sereening plaků s 10 % dextransulfátem a 110 pg/ml denaturované sonikované DNA lososího spermatu při 55 °C po 12 až 20 hodin a promývání v 300mM NaCl/30rnM citrát sodný (2xSSC)/l % SDS při 55 °C, podrobněji viz Ausubel et al.. Current Protocois in Molecular Biology. John Willey & Sons. lne, 1989, kapitoly 6.3.1 až 6.3.6.

Expresní kontrolní sekvence je sekvence nukleotidů, která řídí a reguluje expresi genů, se kterými je operativně spojena.

Operativně spojena, znamená, že polynukleotidová sekvence (DNA, RNA) je operativně 30 spojena s expresní kontrolní sekvencí, když expresní kontrolní sekvence řídí a reguluje transkripci a translaci této polynukleotidovc sekvence. Termín operativně spojena znamená, že před polynukleotidovou sekvenci, která má být exprimována, jc vhodný startovací signál (např. ATG), a že sekvence je vc správném čtecím rámci, který' dovoluje expresi polynukleotidovc sekvence pod kontrolou expresní kontrolní sekvence, a tudíž produkci požadovaného polypeptidů 35 kódovaného izolovanou polynukleotidovou sekvencí.

Expresní vektor je polynukleotid. většinou DNA plazmid nebo tág (nejobvyklejší případy), který' dovoluje expresi alespoň jednoho genu, když je vektor vnesen do hostitelské buňky. Vektor může ale nemusí být schopen replikace v hostitelské buňce.

4(1

Termín izolovaný (plně zaměnitelný s termínem v podstatě čistý), pokud se týká nukleových kyselin, tj. polynukleotidových sekvencí kódujících polypcptidy. znamená RNA nebo DNA polynukleotid, část genomového polynukleotidu, cDNA nebo syntetický polynukleotid. který v důsledku svého původu nebo zacházení s ním: I) není spojen se všemi polynuklcotidy se 45 kterými je spojen v přírodě (např. je přítomen v hostitelské buňce jako expresní vektor nebo jeho část), nebo 11) je spojen s nukleovou kyselinou nebo jinou chemickou skupinou, které se odlišují od těch, se kterými je spojen v přírodě, nebo 111) nevyskytuje sc v přírodě. Jako izolovaná se dále označuje polynukleotidová sekvence, která je I) amplifikovaná in vitro např. metodou polymerázové řetězové reakce (PCR), II) syntetizovaná chemicky. III) rckombinantnč připravená 50 klonováním nebo IV) puntíkovaná, např. štěpením a gelovou separací.

V podstatě čistá nukleová kyselina je nukleová kyselina, která není bezprostředně spojena (netvoří souvislý celek) s jednou nebo dvěma sekvencemi, sc kterými je normálně v spojena v přirozeně sc vyskytujícím genomu organismu, ze kterého je izolována.

-6CZ 298238 B6

Izolovaný (plně zaměnitelný s termínem v podstatě čistý), pokud se týká polypeptidu. znamená polypeptid nebo jeho část, který v důsledků svého původu nebo zacházeni s ním: 1) je přítomen v hostitelské buňce jako expresní produkt části expresního vektoru), nebo II) je spojen s proteinem nebo jinou chemickou skupinou, které se odlišují od těch, se který mi je spojen v přírodě, 5 nebo III) nevyskytuje se v přírodě. Jako izolovaný se dále označuje protein, který jc I) chemicky syntetizovaný nebo H) exprimovaný \ hostitelské buňce, a purifikován od asociovaných proteinů. Termín obecně znamená polypeptid. který' byl separován od ostatních proteinu a nukleových kyselin, se kterými je v přírodním stavu asociován. Vý hodně je polypeptid separován i od látek jako jsou např. protilátky nebo gelová matrice (např. polvakrylamid). které byly užity io k purifikaci.

Heterologní promotor zde označuje promotor, který v přírodním stavu není asociován s daným genem nebo puntíkovanou nukleovou kyselinou.

Termín homologní je zde užíván jako synonymum s identický a týká se sekvenční podobnosti dvou polypeptidu nebo molekul nukleové kyseliny . Když je jedna určitá pozice vc dvou srovnávaných sekvencích obsazena stejnou bází nebo aminokyselinou (např. pozice ve dvou molekulách DNA jc obsazena adeninem nebo pozice ve dvou polypcptidech je obsazena lysinem). pak dvě srovnávané molekuly jsou v této pozici homologní. Procento homologie mezi dvěma sekven2(i cemi jc Funkcí počtu shodných nebo homologních pozic sdílených dvěma sekvencemi dělený celkovým počtem pozic a vynásobený 100. Tak např. jestliže 6 z 10 pozic jc shodných nebo-li homologních. pak tyto sekvence jsou /60 % homologní. Nebo např. DNA sekvence CTGACT a CAGGTT sdílejí 50 % homologii (3 pozice ze 6 se shodují). Obecně sc srovnání provádí, když jsou sekvence vzájemně přiřazeny tak, aby bylo dosaženo maximální homologie. Takové přiřa25 zení a srovnání lze provést metodou podle Needleman et al. (J. Mol. Biol. 48: 443^153, 1970), která je standardně implementována v příslušných počítačových programech jako je např. program Align (DNAstar, lne.). Homologní sekvence sdílejí shodné nebo podobné zbytky aminokyselin, kde podobné aminokyselinové zbytky jsou konzervativní substituce nebo povolené¹ bodové mutace odpovídajících aminokyselinových zbytků vzhledem k přiřazené referenční 30 sekvenci. V tomto smyslu konzervativní substituce aminokyselinového zbytku v referenční sekvenci znamená substituci aminokyselinou, která je fyzicky nebo funkčně podobná odpovídajícímu referenčnímu zbytku, tedy např. má podobnou velikost, tvar, elektrický náboj, chemické vlastnosti včetně schopnosti vytvářet ková len tni nebo vodíkové vazby apod. Zvláště výhodné jsou kovalentní substituce, které splňují kriteria definovaná jako přijatelné bodové mutace 3? v publikaci Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structurc 5. Suppl. 3, Chapter 22: 352-354. NAt. Biomed. Res. foundation, Washington D.C., 1978.

Homologie i identita se týkají podobnosti dvou polypeptidových sekvencí, přičemž identita vyjadřuje přísnější srovnání. Homologie i identita mohou být stanoveny srovnáním pozic v každé 40 sekvenci, které jsou pro účel srovnání navzájem přiřazeny. Pokud je pozice vc srovnávaných sekvencích obsazena shodným aminokyselinovým zbytkem, pak jsou polypeptidy v teto pozici identické, pokud je ekvivalentní pozice obsazena stejnou aminokyselinou (tj. identickou) nebo podobnou aminokyselinou (např. podobnou z hlediska sterické a/nebo elektronové povahy ), pak jsou polypeptidy v léto pozici homologní. Procento homologie nebo identity je funkcí počtu 45 shodných nebo homologních pozic sdílených oběma sekvencemi. Nepříbuzné nebo neliomologní sekvence sdílejí méně než 40 % identitu, výhodně méně než 25 % identitu s AR sekvencí podle vynálezu.

Různé přiřazovací algoritmy a/nebo programy mohou být využity. K takovým programům patří

FASTA. BLAST nebo ENTREZ, Programy FASTA a BLAST jsou dostupné jako součást souboru programů pro analýzy sekvenci GCG ((University of Wisconsin. Madison, Wis.) a mohou být použity např. s původním nastavením parametrů. Program ENTREZ je přístupný prostřednictvím NCBI (National Center for Biotechnology In formát ion, National Library of Medicine, National Inslitutes of Hcalth, Bethesda, MD). V jednom provedení vynálezu bylo procento identity dvou sekvencí stanoveno programy GCG s nastavením váhy pro mezeru 1, kdy

-7CZ 298238 B6 každá chybějící aminokyselina je vážena jako kdyby šlo o neshodnou pozici jedné aminokyseliny nebo nukleotidu mezi dvěma sekvencemi.

Termín peptid(y). protein(y) a polypeptid(y) jsou zde užívány zcela, zaměnitelně. Také termíny polynuklcotidová sekvence a nukleotidová sekvence jsou užívány zaměnitelně.

Molekula podle vynálezu je v účinném množství, když je v takovém množstvím které vede k požadovanému výsledku nebo alespoň k ovlivnění určité nemoci, která se léčí.

Termín polymer označuje velkou molekulu sestavenou z mnoha malých strukturních jednotek, tj. monomerů, které jsou spojeny jakýmkoliv možným způsobem. Pokud je k sestavení větší molekuly použit jen jeden typ monomeru, pak se produkt označuje jako homopolvmer, přičemž, termín se užívá zaměnitelné s termínem polymer. Pokud jsou řetězce sestaveny z více různých monomerů, pak se výsledný materiál genericky nazývá heteropolymer. Polymer, na který je vázáno CD2 vazebné činidlo nebo jeho fragment nebo jeho varianta jc výhodně polvalkylenglykolový polymer, avšak v podstatě muže být použít jakákoliv polymerová kostra, výhodně takový polymer, který je rozpustný ve vodě, není toxický a není iniunogenní.

Provedení předkládaného vynálezu využívá, pokud není specificky uvedeno jinak, konvenční metody molekulární a buněčné biologie, buněčných kultur, mikrobiologie, rekombinantní DNA, proteinové chemie a imunologie, které patří ke standardním znalostem a schopnostem odborníka. Tylo metody jsou např. popsány v příručkách Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd cd i lion. (Sambrook. Fritsch and Maniatis, cds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes I and II (D.N. Glover, ed). 1985; Oligonuclcotide Synthcsis. (M.J. Gait. ed.), 1984; Patent US 4 683 195 (Mullis et al.,); Nuclcic Acid llybridization (B.D. Hames and S.J. Higgins.. eds.), 1984; Transcription and Translation (B.D. Hames and S.J. Higgins, cds.). 1984; Culture of Animal Cells (R.L freshney, ed). Alan R. Liss, lne., 1987; Immobilized Celíš and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal). 1984; Methods in Enzymology. Volumes 154 and 155 (Wu et al., eds). Academie Press. New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.1L Miller and M.P. Calos, eds ), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; ímmunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Maycr and Walker, eds.). Akademie Press. London. 1987; Handbook of Experiment Immunology. Volumes 1 IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.). 1986; Manipulating the Mouše Embryo. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1986.

Aniž by byly vázáni různými teoriemi, původci vynálezu věří, že použití CD2 vazebných činidel podle vynálezu má profylaktické a léčebné účinky na výše uvedené nemoci, neboť tato činidla buďto modulují interakce CD2/LFA-3 a/nebo modulují signalizaci CD2, což vede mimo jiné, k inhibici proliferacc a aktivace T buněk, a zejména k modulaci počtu a/nebo distribuce paměťových efektorových T lymfocytů.

Původci také věří, že škodlivé účinky výše uvedených nemocí jsou způsobeny právě prolifcrací a aktivací T buněk. Tudíž také věří, že terapie založená na předkládaném vynálezu je lepší než. dosud dostupné terapie, a to z mnoha důvodů, např. že vede k inhibici a nt i gen ně specifických interakcí pro všechny přítomné antigeny a k inhibici aktivace T buněk, a naopak nezpůsobuje celkovou imunosupresi a ani možnou indukci tolerance. Původci zejména věří, že terapie založená na vynálezu povede ke specifičtějšímu cílení terapie na T buňky v počátečních stadiích nemoci bez účinků na efektorové mechanismy zprostředkované polymorfonukleárními Icukocyty nebo makrofágy. Tudíž pacienty budou méně náchy lní k infekcím než při použití steroidů nebo jiných léčiv vedoucích k celkové imunosupresi. Tudíž inhibice aktivace T buněk podle předkládaného vynálezu má profylaktické nebo léčebné účinky pro výše uvedené kožní nemocí.

-8CZ 298238 B6

CD2 vazebná činidla

CD2 vazebná činidla užitečná podle vynálezu mají význačné vlastnosti. a sice schopnost modulovat CD2 signální dráhu, a také modulovat, výhodně inhibovat. interakce CD2/LFA.-3. CD2 vazebné činidlo podle vynálezu má schopnost provádět obě tyto funkce. K takovým činidlům patři homology protilátek anti-LFA-3, homology protilátek anti-CD2. rozpustné polypeptidy LFA-3. rozpustné polypeptidy CD2. LFA-3 a CD2 mimctická činidla, a jejich deriváty. Výhodná CD2 vazebná činidla jsou rozpustné polypeptidy LFA-3, rozpustné polypeptidy CD2. homology protilátek anli-CD2 a LFA-3 a CD2 mimetická činidla.

Užitečnost specifických rozpustných polypeptidů I.FA-3. rozpustných polypeptidu CD2, hotnologú protilátek anti-CD2 a homologů protilátek a LFA-3 a CD2 mimctických činidel může být určena např. pomocí testování jejich schopnosti modulovat interakce CD2/LFA-3. Tato schopnost sc může testovat např. jednoduchým buněčným vazebným testem, který dovoluje vizuální (při zvětšení) vyhodnocení schopnosti potenciálního CD2 činidla inhibovat interakci mezi LFA-3 a CD2 na buňkách nesoucích tyto molekuly. Výhodné buňky jakožto CD2-t substrát jsou buňky Jurkat a výhodným substrátem LFA-3+jsou buďto ovčí červené krvinky, nebo lidské buňky JY. Vazebné charakteristiky rozpustných polypeptidů, homologů protilátek a mimetických činidel užitečných ve vynálezu mohou být testovány mnoha různými způsoby, které jsou odborníkům známy, např. radioaktivním značením protilátek, homologů, polypeptidu nebo činidel (např. užitím ^lsS nebo ^,2S|) a pak přivedením značených polypeptidů, mimctických činidel nebo homologů do kontaktu s buňkami CD2+ nebo LFA-31- podle potřeby, vazebný charakteristiky mohou být také testovány pomocí vhodně značené sekundární protilátky. Může sc také použít rozetový kom pct i ční test, jak byl popsán v publikaci Seed et al. (Proč, Nati. Acad, Sci. USA, 84, pp. 336569(1987)).

A. Homology protilátek anti-LFA-3 a anti-CD2

Homology protilátek anti-LFA 3 a anti-CD2 různého typu mohou být využity v předkládaném vynálezu, patři k nim monoklonální protilátky, rekombinantní protilátky, chimérické rekombinantní protilátky, humanizované rekombinantní protilátky včetně všech jejich fragmentů vázajících antigen. Z homologů protilátek anti-LFA 3 jsou výhodné monoklonální protilátky antiLFA 3. Výhodnější jsou monoklonální protilátky anti-LFA-3 produkované hybridomem vybraným ze skupiny hybridomů ATCC HB 10693 (1E6), ATCC HB 10694 (HC-IB11), ATCC HB 10695 (7A6) a ATCC HB 10696 (8B8), nebo monoklonální protilátka známá pod označením TS2/9 (Sanchcz-Madrid et al.. Three. Distinct Antigens Associated vvith Human T-Lymphocyte-Mcdiated Cytolysis: LFA-1. LFA-2 and LFA-3’¹, Proč. Nati Acad. Sci USA, 79, pp. 7489-93 (1982)). Nejvýhodněji je monoklonální anti-LFA-3 protilátka produkována hybridomem vybraným ze skupiny obsahující livbridomy ATCC HB 10695 (7A6) a ATCC HB 10693 (IE6).

Z homologů protilátky anti-CD2 jsou výhodné monoklonální protilátky anti CD2. jako jsou např. monoklonální protilátky epítopu Til, včetně protilátky TS2/18 (Sanchez-Madrid et al., Three Distinct Antigens Associated with Human T-Lymphocyte Mediatcd Cytolysis: LFA-I, LFA-2 and LFA-3’’, Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 79, pp. 7489-93 (1982)).

Technologie přípravy monoklonálních protilátek je odborníkům dobře známa. Stručně shrnuto, nesmrtelná buněčná linie (typicky myelomové buňky) je fúzována s lymfocyty (typicky splcnocyty) zc savce imunizovaného přípravkem obsahujícím daný antigen, supernatant z kultivace výsledných hybridomových buněk se pak testuje na přítomnost protilátek proti danému antigenu. Viz obecný přehled Kobler et al„ Nátuře, Continuous Cultures of Fused Celíš Secreting Antibody of Predcfined Spccificity. 256, pp. 495-97 (1975). K vhodným imunogcniim podle vynálezu patří buňky nesoucí CD2 nebo LFA-3 a také bezbuněčné preparáty CD2 a I .FA-3 nebo rcccptorové vazebné protifragmenty (tedy např. fragmenty CD2, které se váží na LFA-3 nebo fragmenty LFA-3, které sc váží k CD2).

-9CZ 298238 Β6

Imunizace se provádí standardními metodami v oboru známými. Jednotkové dávky a režim imunizace závisí na druhu použitého savce, stavu jeho imunity, tělesné hmotnosti apod. Typicky je imunizovanému savci odebrána krev a sérum z každého vzorku se testuje na přítomnost konkrétních protilátek užitím vhodných testů. Tak např. užitečné protilátky anti LFA-3 nebo anti-CD2 mohou být identifikovány tak, žc se testuje schopnost imunního séra blokovat vytváření rozet ovčích krvinek a buněk Jurkat, které je důsledkem přítomnosti LFA-3 nebo CD2 na povrchu těchto buněk. Lymfocyty použité pro přípravu hybridomových buněk se izolují z imunizovaných savců, v jejichž séru již byla testem potvrzena přítomnost požadovaných protilátek.

typicky nesmrtelná buněčná linie (např. linie myelomových buněk) pochází ze stejného druhu savce jako lymfocyty. Výhodnou nesmrtelnou buněčnou linií jsou myší myelomové buněčné linie, které jsou citlivé na kultivační médium obsahující hypoxanthin, aniinopterin a thymidin (médium ΗΛΤ). Typický HA'T—senzitivní myši myelomové buňky jsou fúzovány s myšími splenocyty užitím polyethylenglykolu (PEG) 3350. Hybridomové buňky vzniklé z této fúze jsou pak selektovány v médiu HAT, která usmrtí nefúzované buňky a neproduktivně fúzované myelomové buňky (nefúzované splenocyty odumírají po několika dnech, protože nejsou transformovány). Hybridomy produkující požadované protilátky jsou detekovány sereeningem supernatantů z hybridomových kultur, např. na schopnost vázat se např. na odpovídající protireceptor. nebo na schopnost blokovat adhezi buněk Jurkat na ovčí červené krvinky. Subklonování hybridomových kultur limitním ředěním se provádí proto, aby byla zaručena monokIonálnosí.

Pro produkci monoklonálních protilátek anti LFA-3 nebo anti-CD2 sc hybridomové buňky, které byly pozitivní vc výše zmíněných testech, kultivují v živném médiu za takových podmínek a po takovou dobu, které jsou dostatečné, k tomu, aby hybridomové buky seccrnovaly monoklonálni protilátky do kultivačního média. Techniky tkáňových kultur a živná média vhodná pro hybridomové buňky jsou známy. Kondicionovaný supernatant z hybridomové kultury se odebere a požadované protilátky se mohou dále puriílkovat známý mi metodami, pokud je to potřeba.

Alternativně sc požadované protilátky produkují injekcí hybridomových buněk do peritoncální dutiny myši premedikované přistáném. Hybridomové buňky pak proliferují v peritoncální dutině a sccernují protilátky, kterc se akumulují v ascitu. Protilátky se pak izolují odebráním tekutiny z ascitu pomocí injekční stříkačky.

Homology protilátek anti-CD2 a anti-LFA-3 užitečné ve vynálezu mohou být i rekombinantní protilátky získané z hostitelských buněk transformovaných DNA kódující lehké a těžké řetězce imunoglobulinu pro požadovanou protilátku. Rekombinantní protilátky mohou být připraveny užitím metod genového inženýrství, viz např. patent US 4 816 397, který je zde zahrnut formou odkazu, např. rekombinantní protilátky mohou být připraveny klonováním cDNA nebo gc lioni ové DNA kódující lehké a těžké řetězce požadované protilátky z hybridomové linie, která produkuje homology protilátek užitečných ve vynálezu. cDNA nebo genomová DNA kódující tyto polypeptidy je pak vložena do expresních vektorů, takže oba geny jsou operativně spojeny se svými vlastními sekvencemi řídicími expresi, tj. transkripci a translaci. Expresní vektor a sekvence řídicí expresi jsou vybrány tak, aby byly kompatibilní s expresí vybraného hostitele Typicky jsou oba geny vloženy do stejného expresního vektoru. Mohou být užity jak prokaryotic ké, tak i cukaryotickc hostitelské buňky. Avšak výhodná je exprese v cukaryotických buňkách protože u těchto buněk je ve srovnání s prokaryotickými buňkami mnohem větší pravděpodob nosí, žc budou exprimovat a secemovat správně sestavenou a imunologicky aktivní protilátku Avšak protilátka, která je neaktivní diky nesprávnému sestavení (tj. uspořádání prostorové struktury), se může renaturovat užitím známých metod (Kim and Baldwin. Spécifc Inter mediates in the holding Reactions of Smáli Proteins and the Meclianism of Protein Folding” Ann, Rev. Biochem., 5 I, pp. 45989 (1982)). Jc možné, že hostitelské buňky tvoří části intaktních protilátek jako např. dúnery lehkých řetězců nebo dimery těžkých řetězců, což jsou také homology protilátek podle předkládaného vynálezu.

- 10CZ 29823« B6

Je zřejmé, že variace postupů výše popsaných jsou užitečné, tak např. muže být potřebné transformovat hostitelskou buňku DNA kódující buďto lehký, nebo těžký řetězec (ale nikoliv oba) homologu protilátky, technologie rekombinantní DNA může být \vizita k odstranění některých nebo všech DNA, které kódují jeden z lehkých nebo těžkých řetězců nebo oba, které 5 nejsou potřebné pro protireceptorovou vazbu CD2 nebo LFA-3. Molekul) exprimované z takových zkrácených DNA jsou užitečné v předkládaném vynálezu. Kromě toho mohou být připraveny bifunkční protilátky, kde jeden lehký u jeden těžký řetězec jsou homology anti-CD2 nebo anti-LFA-3 protilátky a druhý těžký a lehký řetězec jsou specifické pro antigen odlišný od CD2 nebo LFA- 3 nebo jiný cpitop CD2 a LFA-3.

m

Chimérické rekombinantní homology protilátek anti LFA-3 nebo anti-CD2 mohou být připraveny transformací hostitelských buněk vhodným expresním vektorem, který obsahuje DNA kódující požadované lehké a těžké řetězce imunoglobulinu, kde celá nebo část DNA kódující kloubový úsek a konstantní úseky těžkého a/nebo lehkého řetězce byla nahrazena DNA pro 15 odpovídající úsek lehkého nebo těžkého řetězce imunoglobulinu z jiného biologického druhu.

Když je původní rekombinantní protilátka jiná než lidská a přitom CD2 vazebné činidlo se má podávat člověku, pak je výhodná náhrada příslušnými lidskými sekvencemi. Příkladem chimérické rekombinantní protilátky je protilátka, která obsahuje myši variabilní úseky a lidský kloubový úsek a konstantní úseky (viz např. patent US 4 816 397 a Morrison et al., Chimeric Human 20 Antibody Molccules: Mouše Antigen Binding Domains With Human Constant Region Domains.

Proč. Nati. Acad. Sci USA, 8 I. pp. 6851-55 (1984), Humanizované rekombinantní protilátky anti-LFA-3 nebo anti-CD2 se mohou připravovat transformací hostitelských buněk vhodným expresním vektorem, který obsahuje DNA kódující požadované těžké a lehké řetězce imunoglobulinu jiného původu než lidského, kde všechna nebo část DNA kódující aminokyseliny, které 25 sc neúčastní vazby antigenu, byla nahrazena DNA z odpovídajících úseků lehkého nebo těžkého řetězce lidského imunoglobulinu (viz Joncs et al., Replacing the Complementarity Determining Rcgions in a Human Antibody with Those from a Mouše, Nátuře. 321, pp. 522-25 (1986).

Homology protilátek anti-CD2 a anti-LFA-3, které nejsou intaktními protilátkami, jsou také 30 užitečné v předkládaném vynálezu. Takové homology mohou být odvozeny z jakýchkoli homologů protilátek popsaných výše. Tak např. antigen vázající fragmenty a momomerní. dimerní nebo trimerní polypeptid) plné délky získané z výše popsaných protilátek jsou samy užitečné.

K vhodným proti látkovým homologum tohoto typu patří fragmenty Fab. Fab'. F(ab)' a F(v), monomer) nebo dimery těžkých řetězců, monomer) nebo dimery lehkých řetězců, dimery 35 složené z jednoho lehkého a jednoho těžkého řetězce apod. Výhodným fragmenty protilátek anti-LFA 3 jsou těžké řetězce anli-LFA-3.

Fragmenty' protilátek mohou být také připraveny chemickými metodami, např. štěpením intaktních protilátek proteázami jako je pepsin nebo papain a případně působením redukčních činidel 40 na štěpné produkty. Alternativně lze užitečné fragmenty připravit pomocí hostitelských buněk transformovaných zkráceným genem pro těžký a/nebo lehký řetězec. Monomery těžkého a lehkého řetězce lze připravit působení redukčních činidel na intaktní protilátky, např. působením dithiotreitolu, po kterém následuje separace řetězců. Monomer) těžkého a lehkého řetězce lze také připravit pomocí hostitelských buněk transformovaných DNA. která kóduje buďto požado45 váný lehký řetězec, nebo požadovaný těžký řetězec, ale nikoliv oba (viz např. Ward et al..

Binding Activitics of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secrctcd from Escherichia coli. Nátuře, 341, pp. 544 46 (1989); Sastry et al., Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia coli for Gencration of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNA Library. Proč. Nati, Acad. Sci. USA, 86, pp. 50 572832 (1989).

B. Rozpustné polypeptidy CD2 a LFA-3

Rozpustné polypeptidy LFA-3 a rozpustné polypeptidy CD2. které modulují interakce LFA-3 a CD2 jsou užitečné v předkládaném vynálezu. Výhodné jsou rozpustné polypeptidy LEA-3.

Rozpustné polypeptidy LFA-3 mohou být získány z transmernbránové formy LFA-3, zejména z cxtracelulární domény LFA-3 (např. AA1 až ΑΛΙ87 sekvence id. č. 2), Takové polypeptidy bvly např. popsány v patentech US 4 956 281 a US 5 547 853 (stejného přihlašovatele jako předkládaná přihláška), které jsou zahrnuty formou odkazu. K vý hodný m rozpustný m polypcptidům LFA-3 patří polypeptidy tvořené aminokyselinami AA1 až AA92 sekvence id. č. 2. AA1 až AA80 sekvence id. č. 2. AA50 až AA65 sekvence id. č. 2 a AA20 až AA 80 sekvence id. č. 2. Vektor obsahující sekvenci DNA (sekvence id. č. 1), která kóduje aminokyselinovou sekvenci id. č. 2, byl uložen v Americké sbírce mikroorganismu (ATCC. Rockville. Maryland) pod číslem ATC(^Z75l07.

Nejvýhodnější proteiny tohoto typu jsou fúzní proteiny obsahující aminokoncový úsek 92 aminokyselin ze zralého LFA-3. C' koncový úsek 10 aminokyselin kloubového úseku lidského lgGI. který obsahuje dva cystě i nové zbytky podílející sc na disulfidických mezi řetězcových vazbách, a úseky CTI2 a CTI3 z konstantní domény těžkého řetězce lidského IgGl (např. sekvence id. č. 8). Tento fúzní protein je zde označován jako LFA3TIP. Plazmid pSAB152, kódující příkladné provedení LFA3TIP, byl uložen v Americké sbírce mikroorganismů (ATCC, Rockville. Maryland) pod číslem ATCC 68720. DNA sekvence inzertu v plazmidu pSAB 152 je zde uvedena jako sekvence id. č. 7. Tento rekombinantní protein byl připraven proto, aby moduloval imunitní reakci prostřednictvím interakce s receptářem CD2. LFA-3 úsek fúzního proteinu sc váže na rcccplor CD222 na T lymfocytcch. IgGl úsek sc váže na receptory FcgammaRl (niakrofágy) a FcgammaRIIl (NK buňky a neutrofily). Bylo ukázáno, že interakce LFA3TIP sCD2 inhibujc v podmínkách w vilro reakce lidských T lymfocytů (viz patenty US 5 728 677 a US 5 547 853). Jeden způsob, jak připravit LFA3TIP pro použití ve vynálezu byl popsán v patentu US 5 547 853.

Obecně shrnuto, kondiciovanc médium z kultivace buněk COS? nebo CHO transfekovaných pSAB152 bylo koncentrováno užitím spiráluí filtrační patrony AMICON SIY30 (AMICON, Dan verš, Massachusetts) a pak čištěno chromatografií na Protein A-Sepharose 4B (Sigma. St. Louis, Missouri). Navázaný protein byl eluován a pak čištěn gelovou filtrační chromatografií na Superose-12 (Pharmacia/1 KB. Piscataway. New Jersey). Frakce obsahující LFA3TIP s co nej menším množstvím kontaminujících proteinů, což bylo ověřeno analýzou na SDS-PAGE gelech a Westernovým přenosem (viz např. Towbin et al„ Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74, pp. 4350 54 (1979); Antibodies: A Laboratory' Manuaf, pp. 474-510 (Cold Spring Ffarbor Laboratory' (1988)), byly sloučeny a koncentrovány užitím YM30 Centricon (AMICON). LFA3TIP byl detekován Westernovým blotcm užitím králičího polyklonálního séra anli-LFA-3 po kterém následoval detekovatelně značený kozí anti—králičí IgG. Purifikovaný LFA3TIP z buněk COS7 nebo CHO je dimer složený ze dvou monomerů fúzního proteinu LFA-3-lg spojených d isu 1 fid ickým i vazbam i.

Jiný výhodný fúzní protein, zde označovaný LLFA3-lg. se skládá z první a třetí cxtracelulární domény fúzované ke kloubové oblasti CH2 a CH3 lidského IgGl.

Rozpustné polypeptidy LFA-3 mohou být také získány z Pl vázaných forem LFA-3. jako jsou formy popsané např. v PCI patentové přihlášce WO 90/02 181. Vektor obsahující DNA sekvenci Pl-vázaného LFA-3 (sekvence id. č. 3) byl uložen v Americké sbírce mikroorganismu (ATCC, Rockville, Maryland) pod číslem AIGC 68788. Přitom Pl-vázané formy [.FA—3 a transmembránovc formy LFA-3 mají identické aminokyselinové sekvence v celé cxtracelulární doméně.

Tudíž výhodné Pl-vázané LFA-3 polypeptidy jsou shodné s transmembránovými formami LFA 3. Rozpustné polypeptidy CD2 mohou být získány z CD2 plné délky, zejména extracelulární doména (např. AA1 až ΛΑ 185 sekvence id. č. 6). Takové polypeptidy obsahují celou cxtracelulární doménu CD2 nebo její část. Příklady rozpustných CD2 polypeptidů byly popsány v PCT přihlášce WO 90/08 187, které je formou odkazu součástí předkládané přihlášky .

- 12CZ 298238 B6

Produkce rozpustných pólypeptidů užitečných v předkládaném vynálezu může být dosažena řadou metod, které jsou v oboru známy. Tak např. polypeptidy mohou být získány z intaktních transmembránových molekul CD2 nebo LFA-3 nebo intaktních PF vázaných LFA-3 proteoš lýzou užitím specifických endopeptidáz v kombinaci s cxopeptidázami, Edmanovým odbouráváním nebo $ obojím, lntaktní molekula LFA-3 nebo CD2 může být izolována ze svého přirozeného prostředí metodami, které jsou odborníkům známy. Alternativně lntaktní molekula LFA 3 nebo CD2 může být připravena známými technikami rckombinantní DNA užitím cDNA (viz např. patent US 4 956 281 původce Wallner et al.; Aruffo and Seed. Proč, Nati. Acad. Sci.. 84. 10 pp. 2941U5 (1987); Sayrc et al.. Proč. Nati. Acad, Sci. USA, 84, pp. 2941-45 (1987)).

Výhodné sc rozpustné polypeptidy podle vynálezu připraví přímo, čímž se odstraní potřeba celé molekuly LFA-3 nebo CD2 jakožto výchozího materiálu. Lze toho dosáhnout konvenční chemickou syntézou nebo známými technikami rekombinantní DNA, kdy pouze specifické 15 sekvence kódující požadované peptidy jsou exprimovány v transformovaném hostiteli, např. gen.

který kóduje požadovaný rozpustný polypeptid LFA-3 nebo rozpustný polypeptid CD2 může být syntetizován chemickým způsobem pomocí svntctizátoru oligonukleotidů. Takové oligonukleot idy jsou navrženy na základě aminokyselinové sekvence požadovaného rozpustného polypeptidu LFA-3 nebo CD2. Specifická sekvence DNA kódující požadovaný peptid může být také získána 20 ze sekvence DNA plné délky izolaci specifických fragmentů získaných restrikčními endonu kleázam i nebo syntézou specifického úseku pomocí polymerázovc řetězové reakce (PCR).

Standardní metody lze použít k syntéze genu kódujícího rozpustný polypeptid LFA-3 nebo CD2 vhodný podle vynálezu, tak např. úplná aminokyselinová sekvence sc může využít pro konstrukci 25 zpětně translatovaného genu. DNA oligomer obsahující nukleotidovou sekvenci kódující rozpustný polypeptid LFA-3 nebo CD2 podle vynálezu může být syntetizován v jediném kroku. Alternativně může být syntetizováno několik menších oligonukleotidů kódujících části požadovaného polypeptidu a pak spojeno (ligováno). Výhodně rozpustný polypeptid LFA-3 nebo CD2 užitečný podle vynálezu je syntetizován z několika samostatných oligonukleotidů. které jsou 30 následně spojeny. Jednotlivé oligonukleotidy obvykle obsahují přesahující úseky na 5'nebo 3' konci pro spojení s využitím komplementarity. Po sestavení jsou výhodné geny charakterizovány tím, Žc obsahují sekvence rozpoznávaní restrikčními endonukleázaini (včetně jedinečných restrikčních míst pro přímé vložení do klonovacího nebo expresního vektoru), přičemž výhodné kodony berou do úvahy, který hostitelský expresní systém byl užil a jaká sekvence, když je 35 transkribována. produkuje stálou, účinně translatovanou mRNA. Správné sestavení může být potvrzeno sekvencováním nukleotidové sekvence, restrikčním mapováním a také expresí biologicky aktivního polypeptidu ve vhodném hostiteli.

Odborníkovi je přitom zřejmé, že díky degeneraci genetického kódu molekuly DNA obsahující 46 mnohé jiné nukleotidové sekvence budou schopny také kódovat rozpustné molekuly LFA-3 a

CD2 polypeptidu, které jsou kódovány specifickými sekvencemi popsanými výše. Tyto degenerované sekvence také kódují polypeptidy užitečné podle předkládaného vynálezu.

Sekvence DNA jsou exprimovány v jednobuněčném hostiteli. Jak je v oboru dobře známo, pro 45 dosažení vysoké hladiny exprese transfekovancho genu v hostiteli, gen musí být operativně spojen sc sekvencí řídicí transkripci a translaci (expresní kontrolní sekvencí), která je funkční ve zvoleném hostiteli. Výhodně expresní kontrolní sekvence a sekvence požadovaného genu jsou obsaženy v expresním vektoru, který' dále obsahuje bakteriální selekční markér a počátek replikace. Pokud jc exprimujícím hostitelem eukaiy etická buňka, expresní vektor dále obsahuje ještě 50 další expresní markér užitečný právě v daném hostiteli. DNA sekvence kódující požadované rozpustné polypeptidy může ale nemusí kódovat také signální sekvence. Když je exprimujícím hostitelem prokaryotická buňka, je obecně výhodné, když sekvence DNA nekóduje signální sekvenci. Když je exprimujícím hostitelem eukaryotická buňka, jc obecně výhodné, když sekvence DNA kóduje signální sekvenci. Aminokoncový methionin může být nebo nemusí součástí

- 13CZ 298238 B6 exprimovaného produktu. Pokud koncový metliionin není odštěpen hostitelem, muže být odstraněn chemicky standardními způsoby.

Je možně využít celou řadu kombinací expresní hostitcl/vektor. K vhodným expresním vektorům pro eukaryotické hostitele patří např. vektore obsahující expresní kontrolní sekvence z SV40. hovězího papilloma víru, adenoviru nebo cytomegaloviru. K vhodným expresním vektorům pro bakteriální hostitele patří např. známé bakteriální plazmidy jako jsou např. plazmidy z E. coli colEL PCRL pBR322, pMB9 a jejich deriváty, plazmidy s širokým spektrem hostitelů jako jsou RP4, fágové DNA. např. četné deriváty fágu lambda, např. NM989, jiné DNA lágyjako např.

Ki Ml3 a vláknité jcdnořetězcové DNA fágy. K užitečným expresním vektorům pro kvasinkové buňky jakožto hostitele patří plazmid 2 μ. a jeho deriváty. K vhodným vektorům pro hmyzí buňky patří pVL941. Navíc lze v těchto vektorech využit celou řadu kontrolních sekvencí. K vhodným expresním kontrolním sekvencím patří expresní kontrolní sekvence asociované se strukturními geny výše uvedených expresních vektorů. K příkladům užitečných expresních 15 kontrolních sekvencí patří např. časné a pozdní promotory SV40 nebo adenoviru. systém lac. systém trp, systém TAC nebo TRC, hlavní operátorové a promotorové úseky fága lambda, kontrolní úseky fd obalového proteinu, promotor 3-fosfoglycerátkinázy nebo jiného enzymu glvkolýzy. promotor kysele fosfatázy, např. Pho5, promotory genu kvasinkového a-konjugačního systému a další sekvence, o kterých je známo, žc řídí expresi genů prokar}etických nebo 20 eukaryotických buněk nebo jejich virů, a jejich různé kombinace.

Může být využita celá řada jednobuněčných hostitelských buněk. K takovým patří mnohé jíž dobře známé eukaryotické a prokaryotické buňky, jako jsou kmeny E. coli. Pseudomonas. Bacillus. Sireptomyces. houby, kvasinky , hmyzí buňky jako buňky Spodopterafrugiperda (SF9), 25 živočišné buňky jako např. CHO buňky nebo myší buňky, buňky z makaků jako např. linie COSI, COS7 a BSCL BSC40 a mBTIO. a také lidské buňky, stejně jako rostlinné buňky a pletiva. Pro expresi v živočišných buňkách jsou výhodné buňky COS 140 a COS 7. Přitom je však samozřejmé, že ne všechny vektory a kontrolní expresní sekvence budou fungovat stejně dobře pro expresi DNA sekvence podle vynálezu. Zrovna tak nebudou všichni hostitelé fungovat stejně 30 dobře se stejným expresním systémem. Avšak odborník může vybrat z dostupných vektorů, kontrolních expresních sekvencí a hostitelů rutinním postupem bez nadměrného experimentování. Tak např. při výběru vektoru jc třeba brát v úvahu hostitele, protože vektor se musí v hostiteli replikovat. Je třeba také brát v úvahu počet kopií vektoru, schopnost vektoru kontrolovat tento počet, a také expresi jakéhokoliv dalšího proteinu kódovaného vektorem, jako je např. markér 35 rezistence k antibiotiku.

Při výběru expresní kontrolní sekvence je třeba zvažovat také různé faktory. Patří k ním např. relativní síla sekvence, její kontrolovalelnost a kompatibilita se sekvencemi zmíněnými výše, zejména pokud jde o potenciální sekundární struktury. Jednobuněční hostitelé by se měli vybíral s 40 ohledem na jejich kompatibilitu se zvoleným vektorem, toxicitu produktu kódovaného DNA sekvencí, sekreční vlastnosti, schopnost správného prostorového sestavení rozpustného poly peptidu, kultivační a fermentační požadavky a také snadnost purifikace výsledného produktu kódovaného sekvencí DNA. V rámci těchto parametrů odborník vybere různé kombinace vektory/expresní kontrolní sckvence/hostitel, které exprimují požadované sekvence DNA při fermcntaci nebo v 45 kultuře živočišných buněk průmyslovém měřítku, např. buněk CHO nebo COS 7.

Rozpustné polypeptidy LFA-3 a CD2 se pak izolují z fermentačních nebo buněčných kultur a piirifikují se pomocí známých metod. Odborník snadno vybere nej vhodnější způsob izolace a purifikace.

51)

Zatímco techniky rekombinantní DNA jsou výhodné pro přípravu rozpustných polypeptidu CD2 nebo LFA-3 majících sekvenci delší než 20 aminokyselin, kratší polypeptidy CD2 nebo I.FA 3 mající méně než 20 aminokyselin se výhodně připravují konvenčními technikami chemické syntézy. Syntetické polypeptidy užitečné podle vynálezu se výhodně připravují s mimořádně 55 vysokým výtěžkem a mohou se snadno purifikoval. Výhodně se takové rozpustné polypeptidy

- 14CZ 298238 B6

CD2 nebo LFA-3 syntetizují postupy chemické syntézy póly peptidů v kapalné fázi nebo na pevném nosiči a případně se štěpí karboxvpeptidázou (pro odstranění C-koncových aminokyselin) nebo se degradují Edmanovou degradací (pro odstranění N-koncovych aminokyselin). Správné sestavení (tj. sestavení prostorové struktury) polypeptidů lze dosáhnout v oxidativních podmín? kách. které jsou vhodné pro vytváření disulfidických vazeb, jak popsal Keni Chemical Syntehsis of Polypeptides and Proteins, Ann. Rev. Biochem. 57, pp. 95789 (1988). Polypeptidy připravené tímto způsobem se pak purifíkují užitím separačních technik, které jsou v oboru známy, výhodně užitím HPLC s reverzní fází. Použití syntézy polypeptidů v kapalné fázi je výhodné tím. že dovoluje přímo přidat určité dcrivatizovanc aminokyseliny k rostoucímu polypeplidovému řetězit) ci, jako jc např. 0-sulfátester tyrosinu. l im sc odstraňuje nutnost následného derivatizačního kroku pro modifikaci kteréhokoliv aminokyselinového zbytku v polypeptidů podle vynálezu.

C. LFA-3 a CD2 mimctická činidla

Podle vynálezu lze také využít LFA-3 a CD2 mimctická činidla. l ato činidla mohou být peplidy. 15 semi-peptidové sloučeniny nebo sloučeniny jiné povahy než peptidové (nepeptidové sloučeniny), která jsou C’D2 vazebnými činidly, která modulují signalizaci CD2 a/nebo interakce CD2/LFA-3. Nejvýhodnější LFA-3 a CD2 mimctická činidla inhibují interakce CD2/LFA-3 alespoň stejně jako anti-LFA-3 monoklonální protilátka 7A6 nebo anti-CD2 monoklonální protilátka TS2/18 (popsaná výše), laková mimetická činidla mohou být připravena syntézou řady peptidů (např. 20 délky 520 aminokyselin), semipeptidových sloučenin nebo ncpeptidových organických sloučenin a pak provedením screeningti těchto sloučenin na jejich schopnost inhibovat interakci CD2/LFA3. Viz Patent US 4 833 092 a publikace Scott a Smith, Scarching for peptide Ligands with an Epitopc Libraray, Science 248, pp. 386-90 (1990) a Devlin et al.. Randem Peptide Libraries: A Source of Specific Protein Binding Molecules, Science. 249, pp. 40407 (1990). které jsou 25 formou odkazu součástí přihlášky.

D. Derivatizovaná CD2 vazebná činidla

Derivatizovaná CD2 vazebná činidla jsou také užitečná ve vy nálezu. Jde o činidla jako jsou např. modulátory interakci CD2/LFA-3, ve kterých např. kterýkoliv zc zde popsaných homologů proti30 látek, rozpustných polypeptidů CD2 nebo LFA 3 nebo CD2 nebo LEA 3 mimctiekých činidel je funkčně spojen (chemickou vazbou, genovou fúzí nebo jinak) s jedním nebo více členy nezávisle vybranými zc skupiny obsahující homology protilátek anti LFA-3 a anti-CD2, rozpustné polypeptidy CD2 a LFA-3, CD2 a ΕΓΑ-3 mimetická činidla, cytotoxická činidla a farmaceutická činidla. Jeden typ derivatizovaného vazebného činidla se připraví zesílením dvou nebo více CD2 35 vazebných činidel (buďto stejného typu, nebo různých typů). K vhodným zesilovacím činidlům patří heterobifunkční činidla, mající dvč odlišně reaktivní skupiny separované vhodným oddělovačem (např. m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysukcimidesicr) nebo homobifunkční činidla (např, disukcinimidylsuberát). Takové linkery jsou komerčně dostupné např. od Pierce Chemical Company. Rockford. Illinois. Jiná možnost zesílení využívá Pl vazebné signální sekvence v Pl40 vázaném LFA-3 nebo jejich fragmentů. Specificky DNA kódující Pl vazebnou signální sekvenci (např. ΛΛ162 až AA212 v sekvenci id. č. 4) je ligována downstream (po směru transkripce) od DNA kódující požadovaný polypeptid. výhodně rozpustný LFA-3 polypeptid. Když je tento konstrukt exprimován vc vhodné cukaryotické buňce, buňka rozpoznává Pl vazebnou signální sekvenci a kovalentně naváže Pl na polypeptid. Hydrofóbní vlastnosti Pl se pak mohou využít 45 k vytvoření micelárních agregátů z polypeptidů.

Užitečná jsou také CD2 vazebná činidla navázaná najedno nebo více cytotoxickýcb nebo farmaceutických činidel. K vhodným farmaceutickým činidlům patři biologicky aktivní peptidy, polypeptidy a proteiny, jako jsou např. homology protilátek specifické pro lidské polypeptidy jiné než 50 CD2 nebo LFA-3, nebo jejich části. K vhodným farmaceutickým a cytotoxickým činidlům patří takc cyklosporin A. prednison, FK506. mctolrexat steroidy, retinoidy. interferon a dusíkatý yperit.

- 15CZ 298238 B6

K výhodným CD2 vazebným činidlům derivatizovaným farmaceutickými činidly patří rekombinantně připravené polypeptidy; kde rozpustný LFA-3 polypeptid nebo rozpustný CD2 polypeptid nebo CD2 pcptidylové nebo LFA 3 peptidylové mimetické činidlo tvoří fúzi s celým nebo částí kloubového úseku těžkého řetězce imunoglobulinu a celým nebo částí konstantního úseku tčžké5 ho řetězce. Výhodné polypeptidy pro přípravu takových fúzi jsou rozpustné polypeptidy LFA·-3.

Nejvýhodnější jsou fúzní proteiny obsahující AA1 až AA92 z LFA-3 (např. sekvence id. č, 2) fúzované k části kloubového úseku lidského imunoglobulinu IgGl (včetně C koncových 10 aminokyselin obsahujících dva cvsteinové zbytky, které, se zřejmě podílejí na meziřctězcové disulfidické vazbě) a úseků CH2 a CH3 konstantní domény těžkého řetězce IgGL Lze očekávat. io žc takové fúzní proteiny budou mít prodloužený sérový poločas a umožní dimerizaci CD2 vazebného činidla.

Další derivátizovaná CD2 vazebná činidla, která mají prodloužený sérový poločas, jsou CD2 vazebná činidla navázaná nejvýhodněji k jednomu nebo více polymerům obsahujícím poly15 alkylenglykolový polymer. Má se za to. že polymer selektivně reaguje s volnými aminoskupinami nebo jinými reaktivními skupinami CD2 vazebného činidla a teoreticky polymer reaguje tak. Že k navázání dojde na kterékoliv dostupné aminoskupině jako je např. alfa aminoskupina nebo epsilon aminoskupina lysinu nebo -SH skupiny cysteinu. Volné karboxylové skupiny; vhodně aktivované karbony love skupiny; hydroxylová skupiny, guanidylová skupina, oxidované cukerné 2o skupiny a merkaptoskupiny CD2 vazebného činidla (pokud jsou k dispozici) mohou byl také využity jako místa pro připojení.

Zvláště jestliže CD2 vazebné činidlo je protein, chemická modifikace jakéhokoliv cysteinu (např. vnitřního nebo N koncového cysteinu) pro ochranu thiolovc skupiny; s následnou konjugací s 25 polyalkylcnglykolovou skupinou (tj. polyethylen-glykol, PEG) může být odborníkem snadno provedena různými způsoby (viz Patent US 4 179 337). Sulfhydrylová skupina s thiolátovým iontem jakožto aktivní skupinou je nejvíce reaktivní funkční skupina v proteinu. Existuje mnoho činidel, která reagují s thiolovou skupinou rychleji než s kteroukoliv jinou skupinou. Viz S.S. Wong, Chemistry of protein Conjugation and Gross-Linking, CRC Prcss, Bocca Raton, EL (1991).

Další příklady metod, které poskytují spojení mezi póly a Ikylengly kolem a cysteinem jsou reakce s jinými alfa lialoacetylovými sloučeninami, organickými sloučeninami rtuti, disulfidovými činidly a jinými N-substituovanými maleimidy. Mnohé deriváty těchto aktivních látek jsou 35 komerčně dostupné (např. ethyljodoacetát, Aldrich. Milwaukcc Wl, fenyldisulfid. Aldrich a

N-pyrenmaleimid. Molecular Probes, Eugene OR) nebo mohou být snadno syntetizovány (např. N-alkyljodoacetamidy; N-alkylmaleimidy a organické sloučeniny rtuti). Zatímco není jednoduchá chemická strategie jak navázat polyalkylcnglykolový polymer jako je PEG na CD2 vazebné činidlo, je relativně snadné geneticky upravit místo, které může sloužit k zacílení polymerové to složky, např. místně cílenou mutagenezí. Tak např. inkorporace cy steinu do místa, kterc jc v blízkosti a nebo přímo na C-konci proteinového CD2 vazebného činidla, dovoluje specifickou modifikaci užitím maleimidu, vinylsulfonu nebo haloacetátem aktivovaného polyalkylenglykolu (např. PEG). Reakce sc může uskutečnit jakýmkoliv způsobem vhodným pro reakci biologicky aktivních materiálů s inertními polymery;

Obecně způsob obsahuje přípravu aktivovaného polymeru (který má alespoň jednu koncovou hydroxylovou skupinu) a pak reakci proteinu s aktivovaným polymerem, čímž se vytvoří rozpustný protein vhodný pro formulaci do přípravku. Výše zmíněná modifikační reakce může být provedena několika metodami, které obsahují jeden nebo více kroků. V příkladech provedeni 50 předkládaného vynálezu polyalkylenglykolové zbytky alkylpolyalkylcnglykolů s alkylovou skupinou obsahující I až 4 atomy uhlíku, výhodně polyethylenglykolove (PEG) nebo poly(oxy )alkylenglykolové zbytky těchto glykolú jsou výhodně součástí polymerových systémů podle vynálezu. Takže polymer, na který je protein navázán, je homopolymcr polyethylcnglvkolu (PEG) nebo polyoxyethylovaný polyol. ve všech případech za předpokladu, že polymer je rozpustný ve vodě 5? při teplotě místnosti. K příkladům takových polymerů, přičemž tento výčet není omezující, patří

- 16CZ 298238 B6 homopolymery polyalkvlenoxidu jako je PEG nebo pólypropylenglykoly. polyOxyethylenované glykoly. jejich kopolymery a blokové kopolymery. za předpokladu, že blokové kopolymery si uchovávají rozpustnost ve vodč.

? K příkladům polyoxyelhylovaných polyolů patří polyoxyethylovany glycerol, polyoxyethylovaný sorbitol, polyoxvethylovaná glukóza a pod. Glycerolová kostra polyoxycthylovaného glycerolu jc shodná s přírodně se vyskytující kostrou mono-, di- a triglyceridú u zvířat a lidi. Tudíž takové rozvětvení by nebylo nutně vnímáno v těle jako cizorodé.

Alternativně k polyalkylenoxidům se mohou užít dextran, polyvinylpirolidony, polyakrjlamidy. polyvinylakoholy, polymery založené na cukrech a pod. Navíc mohou být užity heteropolymery (tj. polymery' složené z více než jednoho druhu monomeru jako je kopolymer) popsané v Patentu US 5 359 030 (např. proteiny konjugované s polymery obsahující polyalky lenglykolovou složku a jednu nebo více mastných kyselin. Odborníkovi je jasné, že předcházející výčet byl pouze 15 ilustrativní a žc lze užít jakýkoliv póly měrní materiál splňující popsané vlastnosti.

Navíc v jiném aspektu vynálezu se může využít derivatizované CD2 vazebné činidlo kovalentnč navázané na polymeruí složku, kde povaha vazby je taková, žc obsahuje štěpitelné chemické vazby. To umožňuje kontrolu ve smyslu časového průběhu, kdy může být polymer odštěpen od 2o CD2 vazebného činidla. Tato kovalentní vazba může byt štěpena pomocí chemické nebo enzymatické reakce. Produkt polymer - CD2 vazebné činidlo si zachovává přijatelné množství aktivity. Naproti tomu části polycthylenglykolu jsou přítomny v konjugujícím polymeru a poskytují tak konjugátu polymer-CD2 vazebné činidlo vysokou rozpustnost ve vodě a prodlouženou možnost cirkulace v krevním systému. V důsledku těchto zlepšených charakteristik lze před25 pokládat využití vynálezu pro in vivo aplikaci parentcrálním. aerosolovým nebo perorálním podáváním u obou druhů aktivních přípravků polymer - CD2 vazebné činidlo, které po hydrolytickém štěpení vede k biologické dostupnosti samotného CD2 vazebného činidla.

Farmaceutické přípravky podle vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje prostředky k prevenci a léčení nemocí savců, které jsou charakterizovány následujícími znaky: infiltrace jednoho nebo více orgánů savce c rektorovým i T lymfocyty a/nebo asociace těchto lymfocytů s nemocí. Savci sc pro léčení podává jedno nebo více CD2 vazebných činidel podle vynálezu, např. inhibitory interakce CD2/EFA -3, nebo jejich derivatizovaných forem, která jsou schopna selektivně modulovat paměťové efektorové T lymfo35 cyty ve srovnání s naivními T lymfocyty. Výhodně sc podává účinné množství CD2 vazebného činidla nebo jeho derivatizované formy. Termínem účinné množství se rozumí takové množství, které jc schopné zmírnit rozsah nebo závažnost onemocnění zde popsaných.

Odborníkovi jc přitom zřejmé, že účinné množství 01)2 vazebného činidla bude záviset, kromě 40 jiného, na režimu podávání, na podávaných dávkách, na tom. zda je CT)2 vazebné činidlo podáváno v kombinaci s jinými terapeutickými činidly, na celkovém zdravotním a imunitním stavu pacienta, na terapeutické aktivitě a sérovém poločasu použitého konkrétního CD2 vazebného činidla.

CD2 vazebné činidlo nebo farmaceutický přípravek mohou být v celé řadě forem. K těm patří např. tuhé, polotuhé nebo tekuté léková forma, jako jsou např. tablety, pilulky, prasky roztoky, tekuté disperze nebo suspenze, liposomy, čípky, roztoky pro injekce nebo infúze a topieke přípravky. Výhodné formy jsou závislé na předpokládaném terapeutickém využití a zamýšleném způsobu podávání. Výhodné formy jsou roztoky pro injekce a infúze. CO2 vazebná činidla nebo 50 farmaceutické přípravky mohou být podávány intravenóznč, i n tramtiskulárně, subkutánně, intraartikulárnč, intrathekálně. peroslálně, intratumorálnč, intralézním nebo peří lezní m způsobem pomocí infúze. perorálnč. topickv nebo inhalací. Výhodné je podávání subkutánní, intramuskulární nebo intravenózní. Nejvýhodnčjší je subkutánní podávání. CD2 vazebná činidla se také mohou podávat perorálnč. bukálně. parenterálně. rektálně, vaginálně, inhalací intranazálniho

- 17CZ 298238 Β6 spreje, intrapulmonární inhalací nebo i jinými způsoby. Činidla podle vynálezu mohou být zejména formulována pro inhalaci spreje nebo prášku, pro injekci (např. subkutánní. intramuskulárni. intravenózní. intraartikulární nebo intracistcrnální). pro infúzi nebo pro perorální podávání, a sice do jednotkové lékové formy, kterou jsou např. ampulc nebo tablety, nebo také do muhidávkových lahviček nebo jiných nádobek, do kterých se přidá konzervační činidlo. Přípravky mohou být ve formě suspenzí, roztoku, emulzí, gelů v nosiči, kterým je voda nebo olej, a mohou obsahovat další pomocné látky jako jsou suspendující a/nebo dispergující činidla a stabilizátory. Alternativně jc aktivní složka ve formě prášku a/nebo je v lyofilizované formě pro přímé podávání nebo pro rekonstituci přípravku s vhodným nosičem (např. sterilní apyrogenní vodou, fyziologickým roztokem nebo 5 % roztokem dextrózv) před použitím.

Výhodně se jednotková dávka podává jedenkrát až třikrát za týden. Výhodněji se podává jedenkrát až třikrát za den po dobu 3 až 7 dnů. nebo jednou za měsíc jedenkrát až třikrát za den po dobu 3 až 7 dnů. Je zřejmé, že lze užít také nižší či vyšší dávky a jiné léčebné režimy. Výhodně se CD2 vazebné činidlo podává v dávce, 0.001 až 50 mg na I kg tělesné hmotnosti, výhodněji v dávce 0,01 až 10 mg a nej výhodněji v dávce OJ až 4 mg CD2 vazebného činidla na 1 kg tělesné hmotnosti.

Tak např. pro podávání CD2 vazebného činidla podle vynálezu (tj. rozpustného polypeptidů LFA3T1P) pacientovi, výhodné CD2 vazebné činidlo je zabaleno jako zmrazený roztok v lahvičkách obsahujících 10 mg/ml rckombinantního fůzního proteinu LEA-3/IgGl a excipicntv (chlorid sodný, hydrogenfosforečnan a dihydrogensfosforečnan draselný). Lahvičky se před použitím ponechají roztát v lednici nebo při teplotě místnosti a naředí se užitím roztoku 0,9 % chloridu sodného na výsledný objem 5 ml pro použití jako IV bolus. LFA3TIP byl připraven, jak bylo popsáno v publikaci Miller et al.( 1993), J, Exp. Med. 178:211, která je vložena formou odkazu, a purifíkován z kultivačního média transfekovaných Cl 10 buněk (buňky vaječníků čínského křečka) absorpcí na koloně obsahující Protein A -Sepharose 4B (Pharmacia) a eluován roztokem obsahujícím 50mM glycin. 250mM NaCI (pH 3.0). Frakce obsahující protein byly sloučeny a pak purifikovány gelovou filtrací na koloně Superose-R® (Pharmacia) v pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS). Vrcholové frakce byly sloučeny a analyzovány na čistotu elektroforézou na 12 % redukujícím a nercdukujícím SDS PAGI

Podle jednoho vzorového protokolu dostával pacient IV bolus jedenkrát týdně v dávce, která byla výhodně vyšší než 0,025 mg/kg a může být až 0,075 až 0,150 mg/kg. Dávkování CD2 vazebného činidla bylo založeno na základní tělesné hmotnosti pacienta. Jiný dávkovači režim obsahoval jednu intramuskulární (IM) injekci v dávce ne menší než 0.005 mg/kg. přičemž výhodná dávka byla 0,025 mg/kg a nejvýhodnější dávka byly vybrány z dávek 0,05, 0,075. 0,1125 a 0,165 mg/kg.

Jednotkové dávky se podávají, dokud není dosaženou pozorovatelného účinku. Účinek lze zhodnotit mnoha různými metodami. V případě MS lze terapeutický účinek hodnotit standardní metodou magnetické rezonance. V případě IBD vyšetření zahrnuje posouzení abdominální bolesti, hojení píštělů, frekvenci stolice apod,, v případě psoriatické artritidy se vyšetřuji otoky kloubů a rozsah hybnosti. Běžný odborník v medicíně je schopen zhodnotit klinické účinky pro kteroukoliv z indikací výše zmíněných užitím v medicíně známých postupů.

CD2 vazebná činidla nebo jejich derivatizované formy se výhodně podávají ve farmaceutických přípravcích, které obsahují farmaceuticky přijatelný nosič. Termínem farmaceuticky přijatelný nosič sc přitom míní nosič, který' nevyvolává alergickou reakci ani jiné nežádoucí účinky u pacienta, kterému jc podáván. K vhodným farmaceuticky přijatelným nosičům patří např. voda, solný roztok, solný roztok pufrovaný fosfátem, dextróza. glycerol, ethanol apod. a také jejich kombinace. Farmaceuticky přijatelné nosiče mohou obsahovat ještě malá množství vedlejších pomocných látek, jako jsou zvlhčovadla nebo emulgátory, konzervační nebo pufrujicí činidla, kterc prodlužují dobu použitelnosti přípravku nebo účinnost CD2 vazebného činidla.

- 18CZ 298238 B6

Farmaceutické přípravky nebo CD2 vazebná činidla se mohou podášat společně s dalšími terapeutickými nebo profylaktickými činidly. Patří k nim např. cyklosporiii A. steroidy. retinoidy. dusíkatý yperit. interfcron. methotrcxat. antibiotika a antihistaminika. Tato činidla se mohou podávat v jednotkové lékové formě společně s CD2 vazebným činidlem (tj. jako složka jednoho > farmaceutického přípravku), viccčctné lékové formě odděleně od CD2 vazebného činidla a přitom současně, a nebo také ve víccčetné lékové formě, kdy se obě složky podávají oddělené a postupně. Alternativně mohou být CD2 vazebné činidlo a další účinná látka ve formě jediné konjugované molekuly. Konjugace dvou složek lze dosáhnout standardním způsoby zesílení, které jsou v oboru známy. Jediná molekula může být také vc formě rekombinantního fúzního io proteinu. Navíc CD2 vazebná činidla nebo farmaceutické přípravky užitečné podle vynálezu se mohou užít v kombinaci s jiným terapiemi, např. s chemoterapií. Takové kombinované terapie mají výhodu, že lze užít nižších dávek jednotlivých terapeutických činidel.

Genová terapie i? Předkládaný vynález se dále týká poskytování CD2 vazebného činidla formou genové terapie jakožto expresního produktu sekvence nukleové kyseliny v savčím hostiteli. Výhodné systémové podávání v/vo genových produktů využívá rekombinanlních virových nebo nevirových vektorů užitím in viiro transfckce vhodných populací specifických savčích buněk, izolace a purifikace transfckovaných buněk a jejich podání pacientovi. Genová terapie in vivo užívá v podstatě stejně 20 vektor a transfekci, aniž by však byly buňky nebo tkáně odebrány z pacienta. Ke specifickým buněčným populacím, které jsou vhodné jako cíle pro transfekci rckombinatitiiím vektorem obsahujícím požadovanou nukleovou kyselinu, patří (aniž by vak výčet byl omezující): 1) populace buněk kostní dřeně obsahující prekurzory hematopoetických buněk, 2) populace lcukocytu periferní krve, výhodně populace CD34+ leukocytů. které jsou obohaceny hematopoetickými buňkami a 25 lze je užít k repopulaci transfckovaných hematopoetických buněk po vnesení do pacienta bez ablace. 3) populace periferních lcukocytu. 4) myoblastv, které mohou být transplantovány zpět hostiteli poté, co byly in vitro transfekovány požadovanou nukleovou kyselinou, a 5) jc také možné podat rekombinantní virový nebo nevirový vektor obsahující požadovanou nukleovou kyselinu. nebo samotnou požadovanou sekvenci nukleové kyseliny, přímo intramuskulární injekcí.

Tak např. cr vjvo použili prekurzorů hematopoetických buněk kostní dřeně obsahujících vektor, který kóduje GD2 vazebné činidlo, jc zcela v souladu s dnešním stavem techniky. Stručně shrnuto, buňky kostní dřeně sc odeberou, infikují rekoinbinantním virem a podají zpět savčímu příjemci. Takže gen nebo genový fragment je systémově rozptýlen v příjemci, jeho exprese pak 35 vede k systémovému podání genového produktu příjemci.

Periferní krev je zdrojem savčích buněk, které jsou pak infikovány prostřednictvím virových vektorů. Konkrétněji, leukocyty z krve, zejména populace CD34+. která obsahuje cirkulující hematopoetieke buňky, sc užije jakožto cílové buňky pro virovou infekci, pak následuje re pop u40 láce dřeně savčího příjemce bez ablace (Karisson. et al., 1993, Bone Marrovv Transplant. I 1 (supp. 1): 124 127). Navíce se lymfocyty užijí jakožto cílové buňky pro podporu systémového podání požadované sekvence nukleové kyseliny, lymfocyty sc odeberou z periferní krve příjemce, kultivují se známým způsobem a pak se užijí jako cílová populace pro infekci virovým vektorem, který obsahuje požadovanou sekvenci nukleové kyseliny. Infikované lymfocyty sc pak 45 injikují zpět příjemci (viz např. Anderson, et al.. 1990, Human Gene Thcrapy 1: 331-361). Další cílovou buněčnou populací jsou myoblasty. Přítok krve do relativně velkého objemu kosterního svalstva činí z této tkáně lokalizovaný zdroj požadované sekvence nukleové kyseliny. Takže in viiro infekce a zpětné podání myoblastů savčímu hostiteli poskytuje lokální cíl v hostiteli, který umožňuje systémové podání CD přípravku. Kultivace myoblastů, infekce a zpětné vnesení do 50 hostitele jsou známé způsoby a byly popsány např, Dai. et al.. 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10892-10895).

Také přímá injekce in vivo do buněk nebo tkáně jc další metodou lokálního podání vektorové molekuly kódující CD2 vazebné činidlo. Přímá injekce savčímu příjemci nakonec vede, po

- 19 CZ ZV8Z35 B6 expresi genového produktu, k systémovému podání terapeutického produktu (Wolff, et al, 1990, Science 247: 1465-1468; Raz, et al., 1993, Proč. Nati., Acad. Sci. USAJ>0:4523^l527). Při tomto způsobu lokalizovaného podání se užívá přímá injekce nahé DNA, výhodně ve formě nevirového vektoru jako je např. plazmidová DNA.

Jakýkoliv eukaryotický promotor a/nebo enhancerová sekvence odborníkovi známá, která zvyšuje expresi požadované nukleové kyseliny, se může využít při konstrukci plazmidových vektorů, včetně (bez omezení) promotoru cytomegaloviru (CMV), promotoru viru Rousova sarkomu (RSV), promotoru myšího leukemického viru (MLV), promotoru beta-aktinu, a jakéhokoliv 10 buněčně specifického promotoru, o kterém je známo, zeje aktivní v cílové buňce pro transdukcí.

Navíc lze vložení polynukleotidové sekvence do vektoru užít jakoukoliv v oboru známou metodu (viz např. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and Ausubel et al., Current Protocois in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY ( 1992). Konvenční vektory se skládají z vhodných trans15 kripčních/translačních kontrolních signálů operativně spojených s polynukleotidovou sekvencí kódující požadovaný produkt. Také promotory/enhancery se užijí pro řízení exprese požadovaného produktu.

K vhodným expresním vektorům kompatibilním se savčími hostitelskými buňkami pro použití 20 při genové terapii patří např. plazmidy, retrovirové vektory z ptačích, myších a lidských retrovirů, adenovirové vektory, vektory z herpetických virů, parvovirů a nereplikujících se virů neštovic, Zejména replikačně defektní rekombinantní viry mohou být připraveny ve sbalovacích buněčných liniích, které produkují pouze právě replikačně defektní viry (viz Current Protocois in Molecular Biology: Sections 9,10-9.14 (Ausubei et ai., eds.), Greene Publishing Associcates, 25 1989.

Specifické virové vektory pro použití v systémech pro přenos genů byly připraveny, viz např. Madzak et al., J. Gen. Virol, 73: 1533-36 (1992) (papovavirus SV40); Berkner et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 39-61 (1992) (adenovirus); Moss et ak, Curr. Top. Microbiol, Immunol., 158: 25-38 (1992) (virus vakcinie); Muzyczka, Curr. Top. Microbiol, Immunol., 158: 30 97-123 (1992) (adeno-associated virus); Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol, 158: 67---93 (1992)· (Herpes simplex virus' (HSV) a virus Epsteina a Barrové (HBV)); Milleř, Curr. Top.

Microbiol, Immunol., 158: 1—24 (1992) (retrovirus); Brandyopadhyay et al. Mok Cell Biol, 4: 749-754 (1984) (retrovirus); Milleř et al, Nátuře 357: 455-450 (1992) (retrovirus); Anderson, Science 256:808-813 (1992)(retrovirus).

Výhodné vektory jsou DNA viry, ke kterým patří adenoviry (výhodně vektory založené na Ad-2 nebo Ad-5), herpetické viry (výhodně vektory založené na viru Herpes simplex) a parvoviry (výhodně vektory založené defektních nebo neautonomních parvovirech), výhodnější jsou vektory založené na adeno-asociovaných virech, nejvýhodnější jsou vektory založené na AAV-2 40 (viz např. Ali et al, Gene Therapy 1: 367-384, 1994; Patent US 4 797 368 a US 5 399 346.

Adenovirové vektory poskytují velmi vysokou hladinu transgenu prakticky do všech buněčných typů bez ohledu na mitotický stav. Vysoké titry (10ⁿ pfu, tj. plaky tvořících jednotek/ml) rekombinantního viru mohou být snadno připraveny v buňkách 293 (adenovirem transformované komplementační buňky z lidských embryonálních ledvin, ATCC CRL 1573) a dlouhodobě 45 uchovány v zamrazeném stavu bez viditelných ztrát. Účinnost těchto přenosových systémů při in vivo přenosu terapeutických transgenu, které komplementují genetickou poruchu byla demonstrována na zvířecích modelech různých nemocí (viz např. Y. Watanabe, Atheróscierosis, 36: 261268 (1986); K. Tanzawa et al, FEBS Letters, 118(1):81-84 (1980); J.L. Golasten et al, New En21.J. Med., 309 (11983): 288-296 (1983): S. Ishibashi et al, J, Clin. ínvest, 92: 883- 893 50 (1993); a S, Ishibashi et al, J. Clin. ínvest., 93: 1889-1893 (1994). A skutečně rekombinantní replikačně defektní adenovirus kódující cDNA pro transmembránový regulátor cystické fibrózy (CTFR) byl již schválen pro použití v několika klinických zkouškách léčení CF (viz např.

J, Wilson, Nátuře, 365: 691-692 (Oct., 21, 1993). Rozsáhlé zkušenosti s živými adenovirovými

-20C.7. 298238 B6 vakcínami u lidských populací jsou další podporou bezpečnosti rekombinantních adenoviru pro genové terapie.

Adcno-asociované viry (AAV) byly také užity jako vektory' pro somatickou genovou terapii.

AAV je malý virus obsahující jcdnořetézcovou DNA (ssDNA) velmi jednoduchou organizací genomu (4,7 kb), což z něj činí ideální substrát genového inženýrství. Dva otevřené čtecí rámce kódují sérii polypeptidů rep a cap. Polypcptidy -Rep (řep 78, rep 68. rep 62 a rep 40) se účastní replikace, uvolnění virové částice a integrace genomu AAV. Proteiny cap (VP1, VP2 a VP3) vytvářejí kapsidu virionu. Otevřené čtecí rámce řep a cap obklopují na 5- a 3-konci 145 bp io dlouhé invertované terminální repetice (ITR). ve kterých prvních 125 bp je schopno vvtvářet duplexní struktury tvaru Y nebo T. Důležitou skutečností pro vývoj AAV vektorů je to. že celé domény rep a cap mohou být vystřiženy a nahrazeny reportérovým nebo terapeutickým genem (viz B..I. Carter. in Handbook of Parvoviruses. ed.. P. Tijsser, CRC Press, pp. 155-168 (1990). By Io již ukázáno, že ITR představují nejmenší sekvenci nutnou pro replikaci, uvolnění, sbalení a 15 integraci AVV genomu. Bylo ukázáno, že vysoká hladina exprese z AAV přetrvává u myši alespoň 1,5 roku (viz Xiao, Li and Sanuilski (1996) Journal of Virology 70, 8089-8108). Jelikož nejsou žádné důkazy virové toxicity nebo buněčné imunitní reakce hostitele, tato omezení genové terapie zde nejsou. Fisher et al. (Nátuře Medicine (1997) 3, 306 312) popsali stálou genovou expresi u myší po injekci AAV do svalu. A opět byl virus bezpečný. Nebyla detekována žádná 2ύ buněčná či humorální imunitní reakce proti viru nebo cizorodému genovému produktu.

Zvířecí modely

Existence vhodných zvířecích modelů výše uvedených nemocí (jako je např. známý model EAE pro roztroušenou sklerózu) umožňuje testovat CD2 vazebná činidla podle vynálezu. Některé 25 zvířecí modely jsou také popsány v příkladech.

Deposit vzorků

Myší hybridomovc buňky a příklady anti-LFA-3 protilátky užitečné podle vynálezu byly 5.března 1991 v souladu s Budapešťskou smlouvou uloženy v Americké sbírce mikroorganismů 3o (Američan Type Culture Collection. Rockville, Maryland. U.S.A.) jako následující vzorky:

Označení:

1E6

HC-IB11

7A6

8B8

Číslo ATCC:

HB 10693

HB 10694

HB 10695

HB 10696

Bakteriofag nesoucí plazmid kódující transmembránový LFA 3 byl uložen 28. května 1987 v souladu s Budapešťskou smlouvou ve sbírce In Vitro International, lne.. Tinthicum. Maryland, 35 USA, jako vzorek č. IVI-10133. Tento depozit byl přenesen 20. června 1991 do Americké sbírky mikroorganismů (Američan Type Culture Collection. 10801 University Blvd., Manassas. Virginia 20110-2209. U.S.A.) jako vzorek:

Označení: ATCC číslo:

UHT16[Xgt I0/L1A-3] 75107

E. co/i transformované plazmidem kódujícím PÍ vázaný LFA-3 byly uloženy 22. července 1988 v souladu s Budapešťskou smlouvou vc sbírce In Vitro International, lne.. Linthicum, Maryland, USA, jako vzorek IV1-I0180. Tento depozit byl přenesen 20. června 1991 do Americké sbírky 45 mikroorganismů (Američan Type Culture Collection, 10801 University Blvd.. Manassas,

Virginia 20110-2209, U.S.A.) jako vzorek:

Označení: p24

ATCC číslo:

68788

C.7. 298238 B6

V následujícím seznamu sekvencí jsou popsány tyto sekvence:

Sekvence id. č. I: DNA sekvence transmembránového LFA-3

Sekvence id. č. 2: Aminokyselinová sekvence transmembránového LEA-3

Sekvence id. č. 3 DNA sekvence Pl-vázaného LFA-3

Sekvence id. č. 4 Aminokyselinová sekvence Pl-vázaného LFA-3

Sekvence id. č. 5 DNA. sekvence CD2

Sekvence id. č. 6 Aminokyselinová sekvence CD2 io Sekvence id. č. 7 DNA sekvence LFA3T1P

Sekvence id. č. 8 Aminokyselinová sekvence LFA3TIP

Pro lepší porozumění vynálezu jsou uvedeny následující příklady. Příklady jsou pouze ilustrační a v žádném případě nijak neomezují rozsah vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad i

2o Modulace paměťových cfektorových T lymfocytu

Tento příklad ilustruje, že konkrétní CD2 vazebné činidlo, a sice LFA3TIP (sekvence id. č. 8), selektivně moduluje paměťové efekt ořové T lymfocyty u savců s psoriázou.

Materiály a metody

Byla provedena klinická studie II. fáze, randomizovaná. dvojitě slepá, paralelní, se čtyřmi větvemi a placebo kontrolou, s LFA3TIP u pacientů s chronickou plakovou psoriázou. Primárním cílem studie bylo stanovení klinické reakce na dávky v rozmezí 0,025 až 0.15 mg/kg tělesné hmotnosti. Studie se uskutečnila na 22 místech V USA a účastnilo seji 229 subjektů ve věku 18 30 až 70 let. K vstupním kritériím patřila plaková psoriáza po dobu nejméně I roku, s rozsahem větším než 10% povrchového plochy a ncléčená topicky podávanými činidly. Průměrná délka nemoci byla 16 let (rozsah 1 až 62 let), Fototcrapie nebo systémová terapie byly přerušeny 1 měsíc před zahájením studie. LFA3TIP byl balen ve formě zmraženého roztoku v lahvičce obsahujícího 10 mg/ml fúzního proteinu a excipienty (chlorid sodný, hydrogenfosforečnan a 35 dihydrogensfosforečnan draselný). Lahvičky jsou skladovány v -70 °C a před použitím se ponechají roztát v lednici nebo při teplotě místnosti a naředí se užitím roztoku 0.9 % chloridu sodného na výsledný objem 5 ml pro použití jako IV bolus.

CD2 vazebné činidlo bylo podáváno jedenkrát týdně jako i.v. bolus po dobu 12 týdnů, subjekty •10 byly sledovány dalších 12 týdnů po poslední dávce. Závažnost onemocnění byla hodnocena celkovým fyzikálním vyšetřením a také užitím Indexu aktivity a závažnosti psoriázy (PAŠI), přičemž primární koncové hodnocení účinnosti bylo provedeno 2 týdny po poslední dávce studovaného léku,

Pacientům byla odebrána periferní krev a lymfocyty byly separovány centrifugací na gradientu fícoll-hypaque. Buňky (přibližně 3 x 10') byly testovány průtokovou cytometrií (FACSTAR PLUS, Becton Dickinson. San Jose. CA). Monitorováno by lo deset tisíc bodů.

Výsledky

5o Statisticky významné rozdíly byly patrné mezi LFA3T1P a placebcm v řadě koncových bodů, včetně redukce skóre PAS! při dvou nej vyšších dávkách LFA3TIP. Míra klinické reakce se zvyšovala s rostoucí koncentrací LFA3T1P (data nejsou uvedena). Kromě toho léčení tímto CD2 vazebným činidlem bylo spojeno s redukcí periferních lymfocytu CD4+ a CD8+ a NK buněk

- 22 CZ 298238 B6 (zabíjcčských nebo cytotoxických T lymfocytů). Byla pozorována selektivní redukce paměťových efektorových T lymfocytů CD45RO+ ve srovnání s naivními CD45RA* C’D4+ a CD8buňkami. Průtoková cytometrie specificky odhalila větší redukci u T buněk s vysokou hustotou s paměťovým/efektorovým fenotypem (CD4 -CD45RO a CD8-CD45RO) než u CD2 T buněk s naivním fenotypem (CD4-CD45RA a CD8-CD45RA). Na obr. 1 je ukázán graf demonstrující selektivní redukci paměťových efektorových 4' lymfocytů vzhledem k naivním I buňkám u pacientů s psoriázou. kteří byly léčeni LFA3TIP. Horizontální úsečky nad osou X představují trvání chronického léčení, které bylo zastaveno asi po 80 dnech. Křivky představující průměrnou hodnotu absolutního počtu subpopulacc lymfocytů u 57 pacientů v každé skupině. Bylo zde staticky významné, na dávce závislé, snížení paměťových efektorových Γ lymfocytů (CD45RO+). Bez ohledu na typ léčení, nebyly pozorovány žádné změny periferních naivních T buněk (CD45RA+). Počet T buněk při léčení různými CD2 vazebnými činidly vykazoval pokles, a v průběhu 80 denního léčení sc přiblížil určité relativně konstantní hodnotě. Po ukončení léčení se počet paměťových efektorových T lymfocytů začal opět zvyšovat.

I.FA3TIP byl dobře snášen bez vážných vedlejších účinků způsobených léčivem, U všech subjektů léčených LFA3TIP byla pozorována dočasná mírná a na dávce závislá redukce absolutního počtu periferních lymfocytů. Tato redukce se týkal celkově CD2. CD4 a CD8 lymfocytů, nikoliv však CD 19 lymfocytů.

Příklad 2

Léčení revmatoidní artritidy

Pacienti s revmatoidní artritidou (RA) byli vybráni pro léčení podáváním CD2 vazebného činidla, a sice LFA3T1P. Lék byl připraven a balen stejně jako v příkladu 1 a pacientům byl podáván v dávkách 7,5 až 10 mg týdně po dobu 12 až 24 týdnu. Pro stanovení optimální dávky a léčebného režimu byla provedena paralelní studie s různými režimy. Pacientům byla odebrána periferní krev a lymfocyty byly separovány centrifugací na gradientu ficoll-hypaque. Buňky (přibližně 3 x 10⁵) byly testovány průtokovou cytometrií (FACSTAR PLUS, Bccton Dickinson, San Jose. CA), jak bylo popsáno již výše. Pacienti byli sledováni takc na další kritéria jako např. otoky kloubů nebo skóre křehkosti, což jsou standardní součástí studií ACR 20 (viz Felson, D.T. et al., Američan Collcge of Rheumatology Core Set of Desease Activity Mcasuremcnt for Rheumatoid Arthritis Clinical Trials. Arth. Rheum. 26: 729-740, 1993.)

Příklad 3

Léčení zánětlivé nemoci střev (IBD). Crohnovy nemoci a kolitidy

Zánětlívá nemoc střev je generický termín týkající se skupiny chronických zánětlivých nemocí neznámé etiologie, postihujících trávicí trakt. Ulcerativní kolitida (UC) a Crohnova nemoc, dvě hlavní formy idiopatické zánětlivé nemoci střev (1BD) u lidí, jsou široce rozšířeny a přitom nedokonale poznány (viz Kirsner. J.B. et al., eds., [nflanimatory Bowel Discase, 3rd. ed., Lea and Febiger, Philadelphia. 1988, Goldner, F.H. et al.. Idiopatic Inflammatory Bowel Discase. in Stein, .I.H., ed.. Intcmal Medicine, Littlc Brown and Co., Boston, pp. 369-380, 18990, Cello, J.P. et al.. Uicerative Colitis. in Sleisenger, M.H. et al., eds.. Gastrointestinal Discase: Pathophysiology Diagnosis Management, W.B.Saunders Co.. Philadelphia, p. 1435. 1989). Přestože příčiny zánětlivé nemoci střev nejsou známy, k možným etiologickým faktorům patří infekce, imunita, rodinné nebo psychické faktory. Sekundární extraintestinální projevy jako je artritida nebo pericholangitida se často projevují v průběhu chronické zánětlivé nemoci střev, K lékové terapii zánětlivé nemoci střev patří podávání protizánětlivých léků, sulfasalzinu (účinnou látkou je zřejmě 5-ammosaIicyIát, s největší pravděpodobností inhibuje syntézu prostaglandinu) a glukokortikoidů.

Crohnova nemoc nebo regionální ileitida jsou termíny užívané v případě, žc se jedná o zánětlivé oblasti tenkého střeva. Ty jsou zpravidla doprovázeny břišními bolestmi jako při kolice.

-23CZ 298238 Β6 nepravidelností střev, ztrátou hmotnosti a slabými teplotami. Břicho je obecně zvětšené a jsou cítit hutnější vnitřnosti. Dochází k obstrukcím zúženého střevního kanálu, což vyžaduje okamžitou operaci. Příčina nemoci je neznámá. Primární lézí je hyperpiázie lymfatíckc tkáně v submukóze střev a lymfatických uzlinách. Crohnova nemoc je chronická nemoc gastrointestinálního traktu a postihuje obvy kle ileum, tračník nebo oboje. Diferenciální diagnostikou ji lze odlišit od ulcerativní kolitidy.

Onemocnění zvané ulcerativní kolitida se týká onemocnění povrchové mu kozy, na rozdíl od Crohnovy nemoci, která se týká hlubších oblastí, často s poškozením přesahujícím sliznici a fisurami (Riddei, R.1L, Pathology of Drug Induced and Toxic Deseascs. Churchill Livingstone. Nevv York. 1982, Morrison, B.C. et al.. eds., Gastrointcstinal Pathology. 2nd ed.. London 1979. Fenoglio-Preiser. C.M. et al.. eds., Gaslrointestinal Pathology: Antigen Atlas and Text. Raven Press, Nevv York. 1989, Gofdman, IL et al.. Hum. Pathol. 13: 981 1012, 1982. Ulcerativní kolitida typicky zasahuje rektum a šíří se proximálně. aniž by vznikala vynechaná místa, která jsou ty pickým znakem Crohnovy nemoci.

Dostupné zvířecí modely pro 1BD lze rozdělit na přirozené a experimentálně indukované zvířecí modely. Bohužel je k dispozici jen velmi málo spontánních a zřídka se vyskytujících modelu zánětlivq nemoci střev, která je důsledkem genetického defektu, přičemž mnohé z nich nejsou idiopatieke, ale jsou důsledkem bakteriální nebo jiné infekce (např. hyperpiázie. kryptický absces a vředy způsobené BaciUus psyliformis u myší nebo tyčinkovitými bakteriemi u křečků, víz Strober, W. Dig. Dis. Sci. 33, Suppl. 3S-10S. 1988). Vzácné formy spontánní ulcerativní kolitidy a granulomatózní enlerokolitidy se také objevují u potkanů a koní. Kromě toho se užívají dva druhy opic z čeledi kosmano vitých, Cullithricideue (marmoset a tamarin) jako spontánní modely ulcerativní kolitidy a adenokarcinomu tlustého střeva (Clapp. N.K. et al.. cds.. Dig. Dis. Sci. 33 Suppl. 1S-158S, 1988. Experimentálně indukované zvířecí modely ulcerativní kolitidy jsou obvykle vyvolány expozicí toxickým látkám potravy, farmakologickými přípravky a dalšími chemikáliemi zevního prostředí nebo podáváním materiálů pocházejících od pacientů nebo manipulaci imunitního systému zvířat (Strober, W„ Dig. Dis. Sci., 33,. suppl.: 3S-10S, 1988, Bcekan, W.L. Experimental inflammatory bowel disease, v: Kirsncr. J.B.. et al., vyd., Inflammatory Bowel Disease. Lea a Fcbiger, Philadelphia, ss. 37-49, 1988, Onderdonk, A.B., Dig. Dis. Sci., 33. suppl.: 40S 44S. 1988).

Lze vyšetřit potenciální terapeutickou účinnost a mechanismy působení CD2 vazebného činidla v léčbě Crohnovy nemoci s použitím modelu kosmanů (viz například J. Madara et al.. Characterization of Spontancous Colitis in Cotton-Top Tamarin (Saguinus oedipux) and Its Response to Sullasalazine. Gastroenterology, 88, ss. 13-19, 1985). Zásobní roztok CD2 vazebného činidla ve sterilním fyziologickém roztoku (např.-LFA3T|P) a placcbo kontrola (pouze fyziologický roztok) jsou připraveny pro podávání deseti kosmanům (CTI) projevujících příznaky spontánní kolitidy (tj. průjem apod., viz Madara ct al., výše). Pět opic dostalo CD2 vazebné činidlo a pěl dostalo placebo. intravenózní injekcí. CTT. které dostávaly CD2 vazebné činidlo, dostávaly injekce 1 mg činidla denně (tj. přibližně 2 mg/kg/den. založené na přibližné pul kilogramové hmotnosti CTT) po osm dnů (dny 0. 1, 2. 3, 4, 5, 6 a 7 pokusu). Vzorky tkáně tračníku získávané od zvířat byly odebírány pomocí biopsie každý druhý den (dny 0. 2, 4, 6. 8 a 10 pokusu) data z biopsií jsou používána k určení akutního zánětlivého indexu pro každé zvíře, dávající semikvantitativní analýzu průběhu kolitidy (viz Madara et al.. výše). Byla odebírána periferní krev a odděleny lymfocyiy s použitím ccntrifugacc na gradientu ficoll-hypaque. Buňky (přibližně 3 x I0⁵) byly testovány průtokovou cytometrií (FACSTAR PLUS, Becton Dickinson, San Jose, CA), jak již bylo uvedeno výše. Výsledky ukázaly selektivní snížení paměťových efektorových T buněk a prokázaly; že léčba CD2 vazebným činidlem má za následek významné (p < 0,01) snížení akutního zánětlivého indexu.

Pacienti s 1BD vybráni pro léčbu s použitím CD2 vazebným činidlem, jako například LFA3-T1P. Tento materiál je připraven a zabalen jak popsáno v přikladu 1 a byl podáván pacientům v dávkách přibližně 7,5 až 10 mg týdně po období 12 až 24 týdnů. Aby se určila optimální dávka

-24CZ 298238 B6 a schéma podávání, prováděla se paralelní studie s použitím výše uvedených odlišných režimů.

Pacientům je odebírána periferní krev a lymfocyty jsou separovány s použitím centrifugace na gradientu fícoll-hypaque. Buňky (přibližně 3 xl0^?) jsou testovány průtokovou cytometrií (FACSTAR PLUS. Becton Dickinson. San Jose, CA), jak bylo uvedeno výše. Pacienti jsou ? sledováni s použitím několika znaků, včetně indexu aktivity Crohnovy nemoci (Kjeldscn, J. a

Schaffalitzky de Muckadell. O.B.. Scand. J. Gastroenterol.. 28. 1-9. 1993).

Příklad 4 io Léčení uveitidy

Uveitida je onemocnění oka, které může být lokalizováno v oku včetně zadní a přední komory oční, jakož i v tělese sklivce. Uveitida, zánět uvey, je zodpovědná za přibližně 10% zhoršení zraku ve Spojených Státech. Panuveitidou se nazývá zánět celé uveální (veskulární) vrstvy oka. 15 Zadní uveitida sc obecně nazývá chorioretinitida a přední uveitida se nazývá iridocyklitida,

Zánctlivé produkty, tj. buňky, fibrin, nadměrný protein, těchto zánětů jsou obvykle nalézány v prostorech oka s tekutinou, včetně přední komory, zadní komory a prostoru sklivce. a také v tkáni zapojené do zánětlivé reakce. Uveitida může nastat po chirurgickém výkonu na oku nebo po traumatickém poranění oka, jako složka autoimunitní poruchy jako například revmatoidní 20 artritidy, Behcctovy nemoci, ankylozujicí spondylitidy. sarkoidózy. jako izolovaná imunitně zprostředkovaná oční choroba, tj. pars planitis, iridocyditis apod.. nespojená sc známými etiologiemi a následující určité systémové choroby, které způsobují komplexy antigen-protilátka ukládané do uvcálních tkání. Dohromady tyto choroby představují uveitidy ncinfekčního původu.

Léčení savců

Ve studii byly použity opice (makakovc). Zvířatům je podána anestézie s použitím ketaminu. (30 mg/kg) při všech procedurách. Zařízení obsahující 6 mg LFA3-TIP jsou implantována do pravého oka a kontrolní zařízení skládající sc ze samotného polymeru jsou implantována do levého oka, jak popsáno. Opice mají dobře vyvinutou pars plana. takže byla nezbytná kryopexie. 30 Všechna zařízení jsou implantována 3 mm postcriorně k limbu spodního temporálního kvadrantu.

Zvířatům jc podávána anestézie 1 týden, 2 týdny. 4 týdny, 2 měsíce. 4 měsíce a 6 měsíců po implantaci a podstupují vyšetření nepřímou oftalmoskopií a clektrorctinogratli. Llektroretinografie je prováděna tak, jak popsáno, s výjimkou, že průměry 5 odpovědí jsou získávány přístrojem pro klinické průměry (clinical averager” Nicolcl CA-1000. Madison, Wis.) a s přístrojem 35 CKA Ganzfeld Flash (Oaithcrsburg, Md.). V 6 měsících je analyzován vzorek krve prostřednictvím HPLC na cyclosporin (detekční limit 25 ng/ml). Po 6 měsících jsou zvířata utracena předávkováním pentobarbitalu a pak jsou okamžitě perfundována přes levou komoru 10 % pufrovaným formalinem. Oči jsou uloženy do fíxalivti a pak jsou zalita do parafinu, neřezána a vyšetřena anonymně na známky toxicity. Byla odebrána periferní krev a lymfocyty separovány 40 pomocí centrifugace na gradientu fícoll-hypaque. Buňky (přibližně 3 x Iθ'¹) jsou testovány průtokovou cytometrií (FACSTAR PLUS. Becton Dickinson, San Jose, CA).

Farmakokinetika

Bylo použito dvacet čtyři zvířat (skupina 1). CD2 vazebné činidlo je zamícháno do zásobních 45 roztoků v poměru 50 : 50 ethanoLvoda v koncentraci 1 pg/20 μΙ a 10 pg/20 μΐ. K zásobnímu roztoku bylo také přidáno CD2 vazebné činidlo s tritiem (1 pCi/20 ml). Zvířatům je podána anestézie ketaminem (60 mg) a xylaz.inem (20 mg) a zornice jsou dilatovány jednou kapkou fenylefrinhydrochloridu (2,5%) a tropikamidu (1%), Pak je podávána injekce do sklivce CD2 vazebného činidla přes musculus reclus superior přibližně 500 postcriorně k limbu s použitím 50 jehly o kalibru 30. Dvanáct zvířat dostalo dávku 1 pg ve 20 μΐ a 12 zvířat dostalo dávku 10 pg ve μΙ. Injekce je podávána doprostřed do dutiny sklivce a věnuje se pozornost tomu, aby se nepoškodila čočka. Ve skupině, která dostala 1 pg. jsou 3 zvířata usmrcena v 0,5, 3, 6 a 24 hodinách. Ve skupině, která dostala 10 pg, jsou 3 zvířata usmrcena v 0.5, 6, 24 a 48 hodinách. Oči jsou enukleovány a pak okamžitě zmraženy v -70 °C. Tkáně jsou připraveny pro test, jak je

-25 CZ 298238 B6 popsán níže. íntravitreální poločas a distribuční objem jsou určovány z grafu regresní analýzy l n koncentrace versus čas.

Léčení

Bylo použito jedenáct zvířat. CD2 vazebné činidlo obsažené v zařízení s prodlouženým uvolňováním je implantováno do pravého oka. Zařízení obsahující pouze polymery je implantováno do levého oka. Před implantací zařízení je provedeno vyšetření skládající se z oftalmoskopie a clktroretinografie (F.RG.). Z obou očí jsou zaznamenáván) skotopické a fotopieke elektroretinogramy (ERG) s použitím elektrod v kontaktních čočkách (ERG-Jet) s dvoukanálovým klinickým to přístrojem pro zprůměrování signálu (Cadwell 5200, Kcnnewick. Wash.) a přístrojem Ganzfeld Flash Unit (Cadwell VPA-10, Kennewick.--Wash.). ERG po adaptaci na tmu, prováděné po alespoň 30 minutách adaptace na tmu, jsou vyvolávány v 0,33 Hz a jsou průměry 20 prezentaci stimulu. ERG adaptované na světlo jsou prováděny ve 2,8 Hz po alespoň 5 minutách světelné adaptace a jsou také průměrem 20 stimulů. Výsledné v lny jsou hodnoceny na amplitudu a latenci.

Aby sc minimalizoval účinek individuální a denní variace (13-15). jsou ERG reakce vyhodnocovány s použitím poměru experimentální amplitudy (vpravo) ke kontrolní amplitudě (vlevo). Když jsou amplitudy experimentálního a kontrolního oka stejné, poměr se rovná L Snížení poměru odráží relativní pokles amplitudy experimentálního oka.

Vyšetření jsou opakována ve dnech 1, 7. 14 a pak každé dva týdny po dalších 6 měsíců. Tri zvířata jsou usmrcena v 6 týdnech a dvě zvířata jsou usmrcena v 16 týdnech. Aby se vyhodnotila revcrzibilní toxicita, jc zařízení 3 zvířatům odstraněno v 16 týdnech, lato zvířata jsou vyšetřována v týdenních intervalech dva měsíce a pak utracena. Zbývající dvě zvířata jsou utracena ve 26 týdnech. Po utracení jsou zvířata perfundována fíxatívcm (bud¹ 10- pufrovaným formalinem 25 nebo 6% glutaraldehydem pufrovaným fosfátem) přes levou komoru. Oči jsou cnukleovány a umístěny ve fíxativu. I ři 3 mm až 6 mm vzorky ze zadního pólu jsou pak zality buď do parafinu nebo do umělé hmoty a jsou nařezány. Jeden řez každého vzorku je vyšetřován anonymně na známky toxicity.

Příklad 5

Léčení psoriatické artritidy

Tento příklad poskytuje protokol pro testování klinických účinků a tkáňové odpovědi CD2 35 vazebného činidla u pacientů s psoriatickou artritidou.

Psoriatická artritida sc vyskytuje u 5 až 8 % pacientů s psoriázou a jc obecnou chronickou revmatickou nemocí, která může mít za následek značné poškození kloubů, když se ponechá nelečena. Současné klinické studie se zaměřily na identifikace faktorů špatné prognózy. Časná útočná léčba 40 je indikována u pacientů s významným zánětem kloubů a určitými antigeny HLA. Psoriáza a psoriatická artritida jsou považovány za typické nemoci zprostředkované T buňkami. Důkazy o imunopatogenitě ukazují na nemoc zprostředkovanou HLA třídy I. možná s důležitou úlohou UD8 · T buněk.

Návrh studie

Jednalo se o dvoufázovou pilotní studii na příkladu CD2 vazebného činidla u pacientů s psoriatickou artritidou.

Studie se skládala ze tříměsíčního období léčení s týdně podávanými injekcemi CD2 vazebného 5o činidla. Účinek na psoriatické kožní leze a na artritidu byl měřen klinickými a rutinními laboratorními metodami na začátku léčebného období, v jeho průběhu a po ukončení. Těsně před započetím období léčby, po čtyřech týdnech a po ukončení léčby byly odebírány synoviální biopsie pro imunohistologická vyšetření s použitím standardizovaných metod. Před léčbou, po 4

-26CZ 298238 B6 a 12 týdnech a po léčení na konci 3 měsíců byly odebírány kožní biopsic pro imunohistologická vyšetření s použitím standardizovaných metod.

Populace vc studii

Počet subjektů

Pacienti s psoriatickou artritidou byly vyšetřeni, aby se vybrali pacienti pro studii, kteří splnili všechna následující kritéria pro zahrnutí do studie:

1) pacienti mužského nebo ženského pohlaví mezi 18 a 70 lety věku včetně.

2) pacienti ženského pohlaví musí být v nereprodukčním stavu (chirurgicky sterilní nebo ίο alespoň jeden rok po menopauze) nebo měly negativní těhotenský test při provádění vyšetření a dodržovaly účinnou antikoncepční metodu alespoň jeden měsíc před studií s podáváním léku, během studie a v období 6 měsíců po podávání,

3) pacienti musí splnit kritéria pro diagnózu jednoznačné psoriatické artritidy.

4) pacienti musí mít klinicky zjevnou artritidu alespoň jednoho kolenního kloubu a 3 dalších kloubů, ranní ztuhlost alespoň 30 minut a rychlost sedimentace krvinek (T.SR) alespoň mm.

5) pacienti musí mít diagnózu psoriázy plakového typu delší než 12 měsíců před první dávkou studovaného léčiva.

6) pacienti musí mít skóre PAŠI 12 nebo větší,

7) pacienti musí přestat brát všechny imunomodulační léky, jako například metolrexát, cyklosporin a kortikosteroidy a všechny další sloučeniny používané k léčbě psoriázy a/nebo psoriatické artritidy kromě ncsteroidních protizánětlivých léků (NSAIDs), alespoň čtyři týdny před provedením vyšetření.

8) pacienti musí mít absolutní počet CD4+ lymfocytů na spodním limitu normálu nebo vyšší 25 14 dnů před podáním první dávky.

Léčebně schéma

CD2 vazebné činidlo bylo podáváno jako intravenózní bolus 7,5 mg fixní dávky, podávané jednou každý týden do celkem dvanácti dávek.

31)

Modifikace léčebného schématu

Aby pacient dostal další dávku studovaného léčiva, musí nastat následující:

absolutní počet periferních lymfocytů zjištěný pro každého pacienta v okamžiku do 24 po podávání musí být větší než 67% spodního limitu normálního OR a větší než 50% S5 naměřené výchozí hodnoty pacienta, absolutní počet CD4+ lymfocytů zjištěný před předcházející dávkou musí být vyšší než 300 buněk/mm \

Jestliže neby lo splněno jakékoliv z výše uvedených kritérií, byla pacientova dávka pozdržena a 4d pacient se vrátil následující týden pro opakované hodnocení. Jestliže některý' pacient prodělal setrvalé snížení absolutního počtu periferních lymfocytů po více než 28 dnů, bylo podávání studovaného léčiva trvale přerušeno.

Přerušení podávání studovaného léčiva a odvolání pacientů

Následující část popisuje kriteria pro přerušení podávání studovaného léčiva a kritéria pro odvolání pacientů zc studie.

-27CZ 298238 B6

Prováděcí schéma

Testy a hodnocení

Všechny krevní vzorky pro hematologickou analýzu a analýzu subpopulací lymfocytů byly odebírány ve stejnou denní dobu, aby se zabránilo artefaktům způsobeným denním kolísáním,

A

Následující testy a hodnocení byly prováděny v uvedených časových bodech před každou dávkou studovaného léčiva, pokud není jinak uvedeno:

kompletní fyzikální vyšetření bylo prováděno při návštěvách 5, 9 a 13.

měřeni vitálních příznaků bylo prováděno při návštěvách I až 13 a návštěvách 15 až 17.

io - zaznamenávání tělesné hmotnosti bylo prováděno při návštěvách 1 až 13 a návštěvách 15 až

17.

vyšetření moči bylo prováděno při návštěvách 5, 9. 13 a 17.

biochemické vyšetření krve bylo prováděno při návštěvách 5. 9. 13a 17.

hematologické vyšetření bylo prováděno při návštěvách 1 až 17. První laboratorní test byl i? prováděn během 48 hodin před podáním první dávky studovaného léčiva. Všechny další testy byly prováděny během 24 hodin před každou dávkou, analýza subpopulací lymfocytů byla prováděna při návštěvách 1 až 17.

těhotenský test (z moče) byl prováděn u žen při návštěvách 5. 13 a 17.

kvantitativní měření imunoglobulinů IgG. IgA a IgM bylo prováděno při návštěvě 13,

- skórování PAŠI bylo prováděno při návštěvách 1, 3. 5. 7. 9. 11 a 13 až 17, měření sIL-2R a sCD27 při návštěvách 1. 3, 5. 7. 9. 11 a 13 až 17.

kožní bodová biopsie postižené, necílcné léze z oblasti nevystavené slunečnímu světlu byla prováděna při návštěvách 1,5, 13 s volitelnou biopsií při návštěvě 17, test ACR Core Set” byl vyhodnocen při návštěvách 1,5,9, 13a 17,

- kritéria zlepšení ACR byla vyhodnocena při návštěvách 5, 9. 13 a 17, artroskopická biopsie synovie kolenního kloubu byla prováděna při návštěvách 1.5 a 13.

Hodnocení účinnosti

Klinické hodnocení účinnosti

Artritida

Všechna hodnocení účinnosti léčiva na artritidu byla prováděna stejným badatelem/rcvmatologem li každého pacienta:

test ACR Core Sel a vyšetření kritérií zlepšení.

Kožní léze

Všechna hodnocení účinnosti léčiva na kožní léze byla prováděna stejným badatelem/dermatologem u každého pacienta;

skóre PAŠI,

- vyšetření nehtů.

Laboratorní hodnocení účinnosti artroskopická biopsie synovie.

-28CZ 298238 B6 imunohistologické studie synovie.

sérové ukazatele aktivity nemoci u psoriázy, kožní biopsie, imunohistologické studie kůže.

Hodnocení bezpečnosti

Klinické hodnocení bezpečnosti fyzikální vyšetření.

vitální příznaky (teplota, srdeční frekvence, dechová frekvence a krevní tlak vleže na zádech), tělesná hmotnost.

sledování známek infekce, sledování vedlejších příznaku

Laboratorní hodnocení bezpečnosti hematologie: kompletní krevní obraz s diferenciálním rozpočtem krvinek a počtem trombocylu byl prováděn během 24 hodin po podání dávky a sledován badatelem v každém místě, profil biochemického vyšetření krve: sodík, draslík, chlorid, hvdrouhličitan. dusík močoviny v krvi, kreatinin, vápník, fosfát, albumin, celkový protein, alkalická fosfatáza, celkový bilirubin. ALAT, AS AT a gamma-glutamyltransferáza, vyšetření moči.

Specifické hodnocení bezpečnosti pro produkt/studie kvantifikace subpopulací periferních lymfocytů s použitím průtokové cytometrie s dobře definovanými markéry pro subpopulace T lymfocytů (C’D4, C'D8).

Statistické údaje a analytický plán

Hodnocení velikosti vzorku

Pilotní studie s 10 pacienty je považována za přiměřenou pro vyhodnocení bezpečnosti a účinnosti. Poslední zkušenost s CD2 vazebným činidlem, jako například s fúzním proteinem LFA3/IgGl, prokázala souhlasný účinek na celkové lymfocyty a subpopulace CD4 a CD8.

Popis koncových bodů

Primární koncové body klinické účinnosti pro artritidu a psoriázu se vztahuji k ukončení léčby po 12 týdnech. Náhradní koncové body klinické účinnosti se vztahují k léčbě trvající 4a 8 týdnů. Primární koncové body bezpečnosti sc vztahují k ukončení pozorovacího období 3 měsíce po léčbě. Náhradní koncové body imunohistologických změn v kůži a synovii se vztahují ke dvěma časovým bodům: po 4 týdnech a po 12 týdnech léčby.

Statistické metody používané v objektivních analýzách

Obecná metoda analýzy stanoví odlišnosti klinických a laboratorních parametrů mezi hodnotami výchozími a na konci léčby. To se provádělo například s použitím jednofaktorové analýzy variance nebo kovariance nebo logistické regrese. Před analýzou byly reakce eventuálně transformovány. Podle potřeby byly použity neparametrické metody.

-29C7. 298238 B6

Analýzy klinické účinnosti

Byl určen podíl pacientů vykazujících 20% zlepšení v testu ACR Core Set. Byl určen podíl pacientů s alespoň 50% snížením PAŠI skóre oproti výchozím hodnotám. Další míry účinnosti zahrnují minimální PAŠI skóre, celkové skóre erytcmu. celkové skóre indurace. celkové skóre 5 deskvamace a skóre postižení nehtů.

Analýzy laboratorní účinnosti

Imunohistologické studie synovie a kůže a sérové hladiny ukazatelů psoriatické aktivity poskytly data, která byla srovnána s výchozími hodnotami.

Zatímco původci popsali celou řadu provedení vynálezu, je zjevné, že základní provedení původců mohou být modifikována, aby poskytla další provedení, které jsou však založena na předkládaném vynálezu. Tudíž je zřejmé, že předmět vy nálezu zahrnuje všechna alternativní provedení a variace, které jsou definovány ve výše uvedeném popise a připojených patentových i? nárocích, a že vynález není nijak omezen specifickými provedeními, která zde byla uvedena formou příkladů.

-30CZ. 298238 B6

SEZNAM SEKVENCÍ <210> 1 <211> 753 <212> DNA <213> Homo sapier.s <4C0> 1

atggtogctg	ggagcgacgc	ggggcgggcc	ctgggggtac	tcagcgtggt	ctgcctgctg	62
'jactgctttg	gtrtcatcag	ctgttttrcq	caacaaaza t	atggtgttgt	gtatgggaat	120
gcaactttcc	atgtaccaag	caatgtgcct	t taaaagagg	tcctatggaa	aaaacaaaag	180
gataaagttg	cagaactgga	aaattctgaa	t tcagagctt	tctcatcrtt	taaaaatagg	240
gcrtattcag	acactgtgtc:	aggtagcctc	actatctaca	acttaacatc	atcagatgaa	300
gatgagtatg	aaatggaatc	gccaaatatt	actgatacca	tgaagttctt	tcottatgtg	360
cttaagtctc	ttcaatctcc	cacacraact	tgtgcar.tqa	ctaatgqaag	cattgaagtc	420
caatgcatga	taccagagca	ttacaacagc	catcgaggac	ttacaatgta	ctcatgggat	480
tgrcctacgg	aqcaatgtaa	acgtaactca	accag~atat	attttaagat	ggaaaatgat	540
c rtccacaaa	aaatacagtg	tactcttagc	astggč11 a t	ttaatacaac	atcatcaatc	600
a 11 l tgacaa	cctgtatccc	aagcagcggt	cattcaagac	acagatatgc	acttataccc	660
ataccactag	cagtaattac	aacatgtatt	gtgctgtata	tgaatggtat	tctgaaatgr.	720
gacagaaaac	cagacagaac	caactcaaat	tga			753

- 31 CZ 298238 B6 <400 2

Met Val Ala 1

Gly Ser 5

Asp

Ala Gly Arg

Ala Leu Gly 10

Val

Leu

Ser 15

Val

Val

Cys

Leu

Leu

His

Cys

Phe

Gly

Phe

Ile

Ser

Cys

Phe

ser

Gin

Gin

20

25

30

Ile

Gly

Val

Val

Tyr

Gly

Asn

Val

Thr

Phe

His

Val

Pro

Ser

Asn

Val

35

40

45

Pro

Leu

Lys

Glu

Val

Leu

Trp

Lys

Lys

Gin

Lys

Asp

Lys

Val

Ala

Glu

50

55

60

Leu

Glu

Asn

Ser

Glu

Phe

Arg

Ala

Phe

Ser

Ser

Phe

Lys

Asn

Arg

Val

65

70

75

80

Tyr

Leu

Asp

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Leu

Thr

Ile

Tyr

Asn

Leu

Thr

Ser

85

90

95

Ser

Asp

GlU

Asp

Glu

Tyr

Glu

Met

Glu

Ser

Pro

As n

Ile

Thr

Asp

Thr

100

105

110

Met

Lys

Phe

Phe

Leu

Tyr

Val

Leu

Glu

Ser

Leu

Pro

Ger

Pro

Thr

Leu

115

120

125

Thr

Cys

Ala

Leu

Thr

Asn

Gly

Ser

Ile

Glu

Val

Gin

Cys

Met

Ile

Pro

130

1 TR

140

Glu

His

Tyr

Asn

Ser

His

Arg

Gly

Leu

Ile

Met

Tyr

Ser

Trp

Asp

Cys

145

15 0

155

160

Pro

Met

Glu

Gin

Cvs

Lys

Arg

As n

Ser

Thr

Ser

Ile

Tyr

Phe

Lys

Met

165

170

175

Glu

Asn

Asp

Leu

Pro

Gin

Lys

Ile

Gin

Cys

Thr

Leu

Ser

Asn

Pro

Leu

íeo

185

190

Oc-

Asn

Thr

Thr

Ser

Ser

Ile

Ile

Leu

Thr

Thr

Cys

Ile

Pro

Ser

Ser

195

200

205

Cl y

His

Ser

Arg

His

Arg

Tyr

Ala

Le i

Ile

Pro

Ile

Pro

Leu

Ala

Val

210

215

220

Ile

Thr

Thr

Cys

Ile

Val

Leu

Tyr

Met

Asn

Gly

Ile

Leu

Lys

Cys

Asp

225

230

235

240

Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn

245 <210 3 <211> 723 <212> DNA <213> Homo sapiens <4 00 3

atggttgcrg	ggagcgacgc	ggggcgggcc	ctgggggtcc	tcagcgtggt	ctgcctgccg	60
cactgctttg	gtttcatcag	ctgrttttcc	caacaaatat	atggtattgt	gtatgggaat	120
gtaactttcc	atgtaccaag	caatgtgcct	ttaaaagagg	tcctatggaa	aaaacaaaag	180
□ataaagttg	cagaactgga	aaattctgaa	ttcagagctt	tctcatcttt	taaaaatagg	240
gtttatttag	acactgtgtc	aggtagcctc	actatctaca	acttaacatc	atcagatgaa	300
gatgagtatg	aaatggaacc	gccaaatart	actgatacca	tgaagtrctt	Ccrttaígrg	360
crtgagrctc	ttccatctcc	cacactaact	tgtgcattga	ctaatggaag	catrgaagtc	420
caatgcatga	taccagagca	ctacaacagc	catcgaggac	ttataatgta	c^cargggat	480
tgrcctatga	agcaatgtaa	acgtaactca	accagtataZ	atzttaagat	ggaaaacgat	540
cttccacaaa	aaatacagtg	tactcttagc	aatccattat	ttaatacaac	atcatcaatc	600
attctgacaa	cctgtstccc	aagcaccggr	car tcaagac	acagatatgc	acttanaocc	660
araccattag	cagtaattac	aacatgtatt	gtgctgtata	tgaatggcat	gtatgctttt	720
taa						72 3

<2 1.0
<21'1 >	2 4 0
<2 12>	PAT
<213>	ftcrco sapiens

- jj CZ 298238 B6 <40ϋ> 4

Met 1

Val

Ala

Gly Ser 5

Asp Ala

Gly

Arg

Ala Leu 10

Gly

Val

Leu

Ser 15

Val

Val

Cys

Leu

Leu

His

Cys

Phe

Gly

Phe

Ile

Ser

Cys

Phe

Ser

Gin

Gin

20

25

30

Ile

Tyr

G1 y

V a 1

Val

Tyr

Gly

Asn

Val

Thr

Phe

His

Val

Pro

Ser

Asn

3 5

4C

45

Val

Prs

Leu

Lys

Glu

Val

Leu

Trp

Lys

Lys

Gin

Lys

Asp

Lys

Val

Ala

50

55

60

Glu

Leu

Glu

Asn

Ser

Glu

Phe

Arg

Ala

Phe

Ser

Ser

Phe

Lys

Asn

Arg

£5

70

75

80

Val

Tyr

Leu

Asp

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Leu

Thr

Ile

Tyr

Asn

Leu

Thr

85

90

95

Ser

Ser

Asp

Glu

Asp

Glu

Tyr

Glu

Met

Glu

Ser

Pro

Asn

Ile

Thr

Asp

100

105

110

ΤΓιΣ

Met

Lys

Phe

Phe

[ic‘d

Tyr

T T _, 1 ναι

T * , . ucL

Glu

Ser

Leu

Pro

Ser

Fro

Thr

115

120

125

Leu

Thr

Cys

Ala

Leu

Thr

Asn

Gly

Ser

Ile

Glu

Val

Gin

Cys

Met

Ile

130

135

140

Pro

GLu

Eis

Tyr

Asn

Ser

His

Arg

Gly

Leu

Ile

Met

Tyr

Ser

Trp

Asp

145

15 0

155

160

Cys

Pro

Met

Glu

Gin

Cys

Lys

Arg

Asn

Ser

Thr

Ser

Ile

Tyr

Phe

Lys

1 c 5

170

175

Me t

Glu

As n

Asp

Leu

Prs

Gin

Lys

Ile

Gin

Cys

Thr

Leu

Ser

Asn

Pro

180

185

190

Ve u

Phe

Asn

Thr

Thr

Ser

Ser

Ile

Ile

Leu

Thr

Thr

Cys

Ile

Pro

Ser

195

200

205

Ser

G Ί y

His

Se r

Aru

-U L S

Arg

Tyr

Ai a

Leu

ILe

Pro

Ile

Pro

Leu

Ala

rs ·, r*

215

22 0

Va 1

Ile

Thr

Thr

Cys

Ile

Val

Leu

Tyr

Met

Asn

Gly

Met

Tyr

Ala

Phe

225

230

235

240

- 34 CZ 298238 B6

<210>	5
<211>	1056
<21?>	DMA
<213>	Α'ΟΰΐΟ
<4C0>	5

sapiens

atgagcttztc	catgqaaa’t	tgragccagc	ítcctrctga	ttttcaatgt	ttcttGcaaa	60
ggtgcagtcL	ccaaaqagat	tacgaatgcc	rtgcaaacct	ggagtgcctt	gggtcagaac	120
atcaacttgg	azaiAccíag	ttttcaaatg	agtgatgata	tígacgatat	aaaatgggaa	130
aaaacrtcac	a ca a g a a a a a	gattgcacaa	ttcagaaaag	agaaagagac	tttcaaggaa	240
aaaqaqacat	a_aaqccatt	taaaaatgga	actctgaaaa	ttaagcatct	gaaaaccgat	300
gatcaggata	tcqacaaggq	atcaatatag	gatacaaaag	gaaaaaatgt	gttggaaaaa	360
atatttgatt	tgaagaCtca	agagagggtc	tcaaaaocaa	agatctcctg	gacttgtatc	420
aaca caaccc	r,gacctgtga	ggt.aaEgaat	ggaactgacc	ccgaattaaa	cctgtatcaa	480
gatgggaaac	atcqaaaacc	ttctcagagg	gtcatcacac	acaagtggac	caccagcctg	540
agcg-aaaat	tóaactgcac	agcagggaac	aaagtcagca	aggaatccag	cgtcgagcct	600
gtcng.-ztg-a	cagag aa ag g	tccggacatc	tatctcatca	trgacatatg	tggaggaggc	660
agccqcttga	tggtcttzct	ggcacťgctc	gttatctata	tcaccaaaag	gaaaaaacag	720
aggaqtcgga	gaaatgatga	ggagctggag	aaaagagccc	acagagtagc	tactgaagaa	780
agcggccgga	agcccsacca	aa-rccagct	tcaacccctc	agaatccagc	aacttcccaa	340
catcctcc*cc	caccacctgg	tcatcgttcc	caggcaccta	gtcatcgtcc	cccgcctcct	900
ggacaccqtg	tícagzacca	gccrcagaag	aggcctcctg	ctccatcggg	cacacaagtt	960
c a c a a g a a g a 102 j	aaggaqcgci	catceccaga	Gctcgagtztc	agccaaaacc	tccccatggg
gcagcajaaa	acqcactgtc	cccctcctct	aatstaa		1056

- 35 CZ 298238 B6 <210> 6 <211> 351 <212> FRT <213> Hoino sapiens <400 6

Met 1	Ser	Phe	Pro	Cys 5	Lys	Phe	Val
Val	Ser	Ser	Lys 20	Gly	Ala	Val	Ser
Thr	7rri	Gly 35	Ala	Leu	Gly	Gin	Asp 40
Gin	Met 50	Ser	Asp	Asp	Ile	Asp 55	Asp
Lys 65	Lys	Lys	Ile	Ala	Gin 70	Phe	Arg
Lys	Asp	Thr	Tyr	Lys 3 5	Leu	Phe	Lys
Leu	Lys	Thr	Asp 100	Asp	Gin	Asp	Ile
Lys	Gly	Lys 115	Asr.	Val	Leu	Glu	Lys 120
Arg	Val 130	Ser	Lys	Prc	Lys	Ile 135	Ser
Thr 145	Cys	Glu	Val	Met	Asn 150	Gly	Thr
Asp	Gly	Lys	His	Leu 165	Lys	Leu	Ser
Thr	Thr	Se r	Leu 130	Ser	Ala	Lys	Phe
Ser	Lys	Glu 195	Ser	Ser	Val	Glu	Pro 200
Asp	Ile 210	Tyr	Leu	Ile	Ile	Gly 215	Ile

Ala	Ser 10	Phe	Leu	Leu	Ile	Phe 15	Asn
Lys 25	Glu	Ile	Thr	Asn	Ala 30	Leu	Glu
Ile	Asn	Leu	Asp	Ile 45	Pro	Ser	Phe
Ile	Lys	Trp	Glu 60	Lys	Thr	Ser	Asp
Lys	Glu	Lys 75	Glu	Thr	Phe	Lys	Glu 80
Asn	Gly 90	Thr	Leu	Lys	Ile	Lys 95	His
rpyr 105	Lys	Val	Ser	Ile	Tyr no	Asp	Thr
Ile	Phe	Asp	Leu	Lys 125	Ile	Gin	Glu
Trp	Thr	Cys	Ile 14C	Asn	Thr	Thr	Leu
Asp	Pro	Glu 155	Leu	Asn	Leu	Tyr	Gin 160
Gin	Arg 170	Val	Ile	Thr	His	Lys 175	Trp
Lys 185	Cys	Thr	Ala	Gly	Asn 190	Lys	Val
Val	Ser	Cys	Pro	Glu 205	Lys	Gly	Leu
Cys	Gly Gly Gly 220	Ser	Leu	Leu	Met

-36C7 298238 B6

Val 225

Phe

Val

Ala

Leu Leu Val 230

Phe Tyr

Ile

Thr 235

Lys

Arg

Lys

Lys

Gin 240

Arg

Ser

Arg

Arg

Asn

Asp

Glu

Glu

Leu

G1U

Thr

Arg

Ala

His

Arg

Val

245

250

255

Ala

Thr

Glu

Glu

Arg

Gly

A_rg

Lys

Pro

His

Gin

Ile

Pro

Ala

Ser

Thr

260

265

270

Pro

Gin

Asn

Pro

Ala

Thr

Ser

Gin

His

Pro

Pro

Pro

Pro

Pro

Gly

His

275

230

285

Arg

Ser

Gin

Ala

Pro

Ser

His

Arg

Pro

Pro

Pro

Pro

Gly

His

Arg

Val

290

295

300

Gin

His

Gin

Pro

G1 n

Lys

Arg

Pro

Pro

Ala

Pro

Ser

Gly

Thr

Gin

Val

305

310

315

32 0

His

Gin

Gin

Lys

Glv

Pro

Pro

Leu

Pro

Arg

Pro

Arg

Val

Gin

Pro

Lys

325

330

335

Pro

Pro

His

Gly

Ala

Ala

Glu

Asn

Ser

Leu

Ser

Pro

Ser

Ser

Asn

340

345

350

<210> 7

<211>	1050
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<400>	n /

atggtrgctg	ggagcgacgc	ggggcgggcc	ctgggggtcc	tcagcgtggt	ctgcctgctg	60
cactgctttg	gtttcatcag	ctgtttttcc	caacaaatat	atggtgttgt	gtatgggaar	120
gtaactttcc	aogtaocaag	caatgtgcco	ttaaaagagg	tccratggaa	aaaacaaaag	180
gataaagLtg	cagaactgga	aaattctgaa	ttcagagctt	tctcatcttt	taaaaatagg	240
gottatorag	acactgrgto	aggtaccotc	actatctaca	acttaaoatc	atcagatgaa	30 0
gatgagtatg	aaarggaatc	gccaaatatr	actgatacca	tgaagttctt	tcttLatgto	3 60
gacaaaaotc	acacatgccc	acegtgccca	gcacctgaac	tcctgggggg	accgtcagtc	420

-37CZ 298238 B6

ttcctcttcc	ccccaaaacc	caaggacacc	ctcatgatct	cccggacccc	tgaggtcaca	480
ogcgtggtgg	tggacgtgag	ccacgaagac	cctgaggtca	agttcaacíg	gtacgtgaae	540
ggcgtggagg	tgcataatgc	caagacaaag	ccgcgggagg	agcagtacaa	cagcacgtac	600
cgggtggtca	gcgtcctcac	cgtcctgcac	caggactggc	tgaatggcaa	ggagtacaag	660
tgcaaggtct	ccaacaaagc	cctccoagcc	cccatcgaga	aaaccatctc	caaagccaaa	720
gggcagcccc	gagaaccaca	ggrgtacacc	ctgcccccat	cccgagatga	gcxgaccaag	78 0
aaccaggíca	gcctgacctg	cctggtcaaa	ggcttctatc	ccagcgacar	cgccgtggag	8 40
cgggagagca	atzgggcaqcc	ggagaaoaac	tacaagacca	cgcctcccgt	gctggactcc	900
gacggctcct	tcttcctcta	cagcaagctc	accgtggaca	agagcaggtg	gcagcagagg	960
aačgtcttct 1020	catgctccgt	gatgcatgag	gctctgcaca	accactacac	gcagaagagc
ctcrccctgt	ctccgggtaa	algagtgcgg			1050

<210>	3
<211>	347
<212>	PRT
<213>	tiomo
<400>	Q

sapiens

Me- 1

Val

Ala

Cly

Sec R

Asp

Ala

Gly Are

Ala 10

Leu

Gly

Va 1

Leu

Ser 15

Val

v a 1.

Cys

Leu

Leu 20

Bis

Cys

Phe

Gly

Phe 25

Tle

Ser

Cys

Phe

Ser 30

Gin

Gin

Ue

T y r

Gly 35

V a 1

Val

Tyr

Gly

Asn 40

Val

Thr

Phe

His

Val 4 5

Pro

Ser

As r.

V a 1

Pro 5 0

Leu

Lys

Giu

v a ±

Leu 55

Trp

Lys

Lys

Gin

Lys 60

Asp

Lys

Val

Aia

Glu 65

Leu

Giu

Asn

Ser

Glu 70

Phe

Arg

Ala

Phe

Ser 75

Ser

Phe

Lys

Asn

Arg 80

-38CZ 298238 B6

Val·

Tyr

Leu Asp

Thr 85

Val

Ser

Gly Ser Leu 90

Thr

Ile Tyr

Asn

Leu 95

Thr

Ser

Ser

Asp

Glu

Asp

Glu

Tyr

Glu

Met

Glu

Ser

Pro

Asn

Ile

Thr

Asp

10C

105

110

Thr

Met

lys

Phe

Phe

Leu

Tyr

Val

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

115

120

125

Cys

Pro

ar a

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

130

135

140

Fro

L y s

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

145

150

155

160

Cys

Va 1

;/α 1

Val

As ρ

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

165

170

175

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

18 0

185

190

Glu

Glu

Glr.

Tyr

As n

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

195

200

205

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

210

215

220

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lvs

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

225

230

23 5

24Ό

G1 y

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

2 4 5

250

255

G1 '.i

Leu

'Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

260

265

270

T y r

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

275

280

285

Asr.

Asn

Tyr

LvS

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

ASp

Gly

Ser

Phe

2 91

295

300

?he

Leu

Ή . . v - / -

ser

Γ i- y

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

3 05

310

315

320

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

HÍS

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

325

330

335

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly Lys

340

345

-39CZ 298238 Β6

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (14)

1. Použití účinného množství CD2 vazebného činidla, které je vybráno ze skupiny sestávající z homologů protilátek anti-LFA-3. rozpustných polypeptidu LFA-3. rozpustných polypeptidu CD2, CD2 mimetických činidel a LFA-3 mimetických činidel, pro výrobu farmaceutické kompozice k selektivní modulaci CD45R()~pozitivních paměťových elektorových T lymťocytů pro léčení pacienta trpícího nemocí vybranou zc skupiny obsahující psoriatickou artritidu, roztroušenou sklerózu mozkomíšní. atopickou dermatitidu. uveitidu, zánětlivou nemoc střev, Crohnovu nemoc, ulcerativní kolitidu a kožní T buněčný lymfom.

2. Použití účinného množství CD2 vazebného činidla, které je vy bráno ze skupiny sestávající z homologů protilátek anti-LFA-3. rozpustných polypeptidu LFA-3. rozpustných polypeptidu CD2. CD2 mimetických činidel a LFA-3 mimetických činidel, a to v dávce 0,001 až 50 mg na 1 kg tělesné hmotnosti pacienta, pro výrobu farmaceutické kompozice k selektivní modulaci CD45RO-pozÍtÍvních paměťových e lektorových T lymťocytů pro léčení pacienta trpícího nemocí vybranou ze skupiny obsahující psoriatickou artritidu, revmatoidní artritidu, roztroušenou sklerózu mozkomíšní, atopickou dermatitidu. uveitidu. zánětlivou nemoc střev, Crohnovu nemoc, ulcerativní kolitidu a kožní T buněčný lymfom.

3. Použití podle nároku 1 nebo 2. kdy C'D2 vazebné činidlo je rozpustný polypeptid LFA-3.

4. Použití podle nároku 3, kdy CD2 vazebné činidlo je rozpustný polypeptid LFA-3 obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z:

a) aminokyselina 1 až aminokyselina 92 ze sekvence id. č. 2,

b) aminokyselina 1 až aminokyselina 80 ze sekvence id. č. 2,

c) aminokyselina 50 až aminokyselina 65 zc sekvence id. č. 2 a

d) aminokyselina 20 až aminokyselinu 80 ze sekvence id. č. 2.

5. Použití podle nároku 4, kdy rozpustný polypeptid LFA-3 je fúzní protein obsahující 92 aminokyselin amino-konce zralého LFA-3 a 10 aminokyselin C-konce kloubové oblasti lidského IgGÍ.

6. Použití podle nároku 5. kdy rozpustný fúzní protein LFA-3 dále obsahuje úseky CH2 a CH3 z konstantní domény těžkého řetězce lidského IgGÍ.

7. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, kdy nemoc je uveitida.

8. Použiti podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, kdy nemoc je zánětIivá nemoc střev.

9. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, kdy nemoc je kožní T buněčný ly mfom.

10. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, kdy nemoc je Crohnovu nemoc.

11. Použití podle kteréhokoliv z nároků I až 6, kdy nemoc je ulcerativní kolitidu.

12. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6. kdy nemoc je roztroušená skleróza mozkomíšní.

13. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, kdy nemoc je psoriatická artritida.

14. Použití podle kteréhokoliv z nároků I až 6. kdy nemoc je utopická dermatitidu.

-40*